WO2002008439A1 - Procede d'elaboration d'acides 2-amino - Google Patents

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WO2002008439A1
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general formula
producing
amino acid
substituent
group
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Inventor
Yoichi Kobayashi
Koichi Hayakawa
Original Assignee
Nippon Soda Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 2-amino acid by using 2-aminonitrile as a raw material and using a biocatalyst in the presence of a polybasic acid salt.
  • the 2-amino acid produced according to the present invention has a variety of uses, such as for agriculture, medicine, food, and feed addition, and is widely used. Background technology:
  • 2-aminonitrile When 2-aminonitrile is used as a raw material, 2-aminonitrile is generally unstable in aqueous solution, and has the property of releasing ammonia to change to cyanohydrin. Requires the use of extremely active biocatalysts. However, existing biocatalysts did not have sufficient catalytic activity, and it was difficult to obtain 2-amino acid in high yield. On the other hand, in the method using cyanohydrin as a raw material, it has been known that the yield can be improved by allowing a biocatalyst to act on cyanohydrin in the presence of ammonium or ammonium salts (Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-14).
  • An object of the present invention is to provide a method for producing 2-amino acids efficiently using 2-aminoditolyl as a raw material and using a biocatalyst. Disclosure of the invention:
  • a polybasic acid salt is effective in the course of screening for an activator that significantly enhances the hydrolytic activity of a biocatalyst for 2-aminonitrile.
  • the application concentration of polybasic acid salt in the hydrolysis activation was examined, the effect of improving the activity on the biocatalyst was unexpectedly strongly exhibited at a high concentration of polybasic acid salt.
  • a 3 M concentration close to the saturation concentration Maximum activity was obtained nearby.
  • biocatalysts often have the most efficient catalytic action in their natural physiological temperature, pH and salt concentration environment, so that maximum activity is obtained at a high salt concentration of 3 M in an extreme environment. It is amazing to be done.
  • the present inventors have found that a high concentration of a polybasic acid salt inhibits the biocatalytic hydrolysis activity of cyanohydrin. Therefore, by using a high concentration of polybasic acid salt, the hydrolysis of cyanohydrin mixed in the reaction system is suppressed, and the generation of 2-hydroxy acid, a by-product from cyanohydrin, is suppressed. It is suppressed and thus the yield of 2-amino acids is improved.
  • the same biocatalyst acting on cyanohydrin has completely different properties. What is shown is a phenomenon that is usually unpredictable.
  • the present invention provides a process for producing a 2-amino acid by the action of a biocatalyst using 2-aminonitrile as a direct raw material, and by coexisting a polybasic acid salt, the production rate is extremely high and the yield is high. It has been completed based on the above-mentioned finding that 2-amino acid can be obtained.
  • the present invention provides a compound represented by the general formula [I]: RCH (NH 2 ) CN (wherein, R is a hydrogen atom, a C 6 to C 6 alkyl group which may have a substituent, or a substituent.
  • alkenyl C 2 ⁇ C 6 good C ⁇ may have a substituent (6 alkoxyl group which may have a substituent Ariru group which may have a substituent Ariruokishi groups or substituents Represents a heterocyclic group which may have a substituent, and in the case where R is a C i to C 6 alkyl group which may have a substituent, even if the amino group and R are bonded to form a ring, 2-aminonitrile represented by the general formula [II]: RCH (NH 2 ) COOH, in an aqueous solution containing a polybasic acid salt, by hydrolysis with a biocatalyst having nitrile hydrolysis activity.
  • 2-A represented by the general formula [II] characterized in that it is converted into a 2-amino acid represented by the formula: Method for producing Amino Acids (claim 1), the alkyl group optionally C i to C 6 which may have a substituent, an alkyl Chio alkyl or C ⁇ C 6 hydroxycarboxylic alkyl group of C i to C 6
  • Claim 1 characterized in that there is 2.
  • a process for producing a 2-amino acid represented by the general formula [II] (claim 3), wherein the 2-aminononitrile is 2-amino-4-methylthiobutyronitrile.
  • a method for producing amino acid [II] (Claim 4), wherein the polybasic acid salt is a phosphate, a sulfate, a citrate, a tartrate, a glutamate or a mixture thereof. Item 5.
  • a method for producing a 2-amino acid represented by the general formula [II] according to any one of Items 1 to 4, wherein the polybasic acid salt is an ammonium salt of a polybasic acid The method for producing a 2-amino acid represented by the general formula [II] according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it is an alkaline earth metal salt or a mixture thereof.
  • Polybasic acid salts are ammonium phosphate, sodium phosphate, potassium phosphate 5.
  • the polybasic acid salt is ammonium citrate, sodium citrate, potassium citrate, ammonium tartrate, sodium tartrate, potassium tartaric acid, sodium potassium tartrate, ammonium glutamate 5.
  • the production of 2-amino acid represented by the general formula [II] according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it is sodium glutamate, potassium glutamate or a mixture thereof.
  • RCH (NH 2 ) C 00 H (wherein, R may be a hydrogen atom, may have a substituent, may have an alkyl group of 1 to 6 and may have a substituent.
  • C 2 -C 6 of ⁇ alkenyl group which may have a substituent an alkoxyl group of C i to C 6, optionally substituted Ariru group, which may Ariruokishi or substituted with a substituent
  • the biocatalyst used in the present invention is not particularly limited as long as it is a biocatalyst such as a microorganism having an activity of hydrolyzing nitrile in an aqueous solution containing a polybasic acid salt.
  • a biocatalyst such as a microorganism having an activity of hydrolyzing nitrile in an aqueous solution containing a polybasic acid salt.
  • microorganisms belonging to the genus Arthrobacter and the genus Variovorax can be mentioned, and among these, in particular, Arthrobacter sp. And Arthrobacter sp. NSSC 204 (FE RM BP-7662) and Variovorax paradoxus IAM123374.
  • Earthlobacta 1 NSSC 104 (FERM BP-5829) has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba-Higashi 1-1, Ibaraki, Japan, Central No. 6) on February 6, 1996. Its mycological properties are described in W 097/32030.
  • Earth Lobactor NSSC 204 (FERM BP-7662) was deposited on June 22, 2000 with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) on June 22, 2000. Have been. This strain was newly isolated by the mutation treatment of Earthlobacta NSSC104, and its bacteriological properties are as follows. Form Polymorphic bacilli
  • NSSC 204 strain was found to be A new strain belonging to the genus (Arthrobacter) was identified.
  • Variovorax paradoxus I AM I 2374 is readily available from the Institute for Molecular and Cellular Biology at the University of Tokyo, and its bacteriological properties are described in the International Journal of Systematic Bacteriology. ) Vol. 41, pages 445-450 (1991).
  • the cultivation of these microorganisms is carried out in a usual medium containing an enzyme inducer, a carbon source, a nitrogen source, an inorganic ion, and, if necessary, an organic nutrient which the microorganism can utilize.
  • an enzyme inducer nitrile compounds such as isoptyronitrile and 2-aminobenzonitrile, and cyclic amide compounds such as ⁇ -caprolactam are used. 2-aminobenzonitrile is preferred.
  • the carbon source carbohydrates such as glucose, alcohols such as ethanol, organic acids, and the like are appropriately used. Amino acids, nitrates, ammonium salts and the like are used as nitrogen sources.
  • inorganic ions phosphate ions, potassium ions, magnesium ions, sulfate ions, iron ions and others are used as required.
  • organic nutrients pitamine, amino acids and the like and corn steep liquor, yeast extract, polypeptide, meat extract and the like containing these are used as appropriate.
  • the culture may be performed under aerobic conditions while controlling the pH to an appropriate range of 6 to 9 and a temperature of 25 to 37 ° C.
  • biocatalyst used in the present invention examples include bacterial cells cultured as described above, immobilized bacterial cells prepared from the bacterial cells, and processed cells such as crude enzymes or immobilized enzymes.
  • immobilizing cells or enzymes commonly used immobilization techniques such as a carrier binding method and an inclusive method can be applied.
  • enzyme purification techniques such as ammonium sulfate precipitation and chromatography can be applied after crushing the cells with ultrasonic waves, a high-pressure homogenizer or the like.
  • the biocatalyst such as bacterial cells used in the reaction can be repeatedly used for the hydrolysis reaction without a substantial decrease in activity.
  • R represents a hydrogen atom, a C i -C 6 alkyl group which may have a substituent, a C 2 -C 6 alkenyl which may have a substituent.
  • Group, a C i -C 6 alkoxyl group which may have a substituent, an aryl group which may have a substituent, an aryloxy group which may have a substituent or a substituent which may be a hydroxy group, a mercapto group, an amino group, a cyano group, a carbamoyl group, a phenyl group which may have a substituent, an imidazole group, an indole And C 6 -C 6 alkylthio groups.
  • R is a CCS alkyl group which may have a substituent
  • the amino group and R may combine to form a ring.
  • a C to C 6 alkylthioalkyl group or a C! _ To C 6 hydroxyalkyl group may be substituted.
  • the aryl group include a phenyl group.
  • any nitrile compound corresponding to a known 2-amino acid can be used without particular limitation.
  • 2-amino-4-methylthiobutyronitrile methionine, a useful amino acid, can be obtained.
  • Examples of the acid group of the polybasic acid salt used in the present invention include: phosphoric acid, phosphorous acid, diphosphorous acid, diphosphoric acid, carbonic acid, sulfuric acid, sulfurous acid, thiosulfuric acid, cuenic acid, tartaric acid, Grape, linoleic, malonic, succinic, fumaric, maleic, phthalic, itaconic, citraconic, oxalic, glutaric, adipic, trimetic, glutamic,
  • Examples of the basic group include organic bases such as ammonium, alkylammonium, and pyridinum, and alkali metals such as lithium, sodium, and potassium. And alkaline earth metals such as magnesium, calcium and the like.
  • polybasic acid salts can be used as a normal salt, an acid salt or a mixture thereof in a combination of two or more.
  • polybasic acid salts it is easy to set pH conditions favorable for the biocatalyst to be used at the time of the reaction, relatively inexpensive, have high water solubility, and have low toxicity.
  • Ammonium phosphate, sodium phosphate, potassium phosphate, ammonium sulfate, sodium sulfate, potassium sulfate, ammonium citrate, sodium citrate, potassium taenate Ammonium, sodium tartrate, sodium tartrate, potassium tartrate, sodium calcium tartrate, ammonium glutamate, sodium glutamate, potassium glutamate, sulfate Magnesium or a mixture thereof is preferred.
  • These polybasic acid salts are used in the range of 0.01 M to the saturation concentration.
  • It can be used at a concentration of 1.0 M to saturation concentration for polybasic acid salts having a carboxylic acid as an acid group, and at a concentration of 1.5 M to saturation concentration for polybasic acid salts having an inorganic acid as an acid group. It is preferable in terms of the conversion efficiency of the acid.
  • the aqueous solution used in the present invention may contain an inorganic salt, an organic acid salt or an organic solvent as long as it contains the above-mentioned polybasic acid salt, or may be separated into two phases with water. good.
  • the hydrolysis reaction using the biocatalyst used in the present invention is carried out by reacting the above-mentioned biocatalyst with 2-aminonitrile represented by the general formula [I] in an aqueous solvent.
  • the biocatalyst is usually used at a concentration of 0.001 to 10% by weight in terms of dry weight, and after completion of the reaction, it is recovered by filtration, centrifugation or ultrafiltration membrane concentration method, and repeatedly subjected to the hydrolysis reaction. It can also be used for
  • the reaction pH in the hydrolysis reaction is not particularly limited, but may be maintained between 5 and 12 with a suitable buffer or acid or alkali.
  • the reaction temperature may be maintained at 4 to 80 ° C, preferably at 20 to 60 ° C.
  • Examples of the 2-amino acids represented by the general formula [ ⁇ ] include, for example, alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, and proline. Examples include phosphorus, glutamine, arginine, serine, threonine, norin, tritophan, tyrosine, norleucine, and phenylglycine. These 2-amino acids can be obtained as D-, L- or racemic amino acids depending on the optical selectivity of the biocatalyst. The produced 2-amino acid can be separated and purified by a conventional method such as filtration, concentration, extraction, and ion exchange resin. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Example 1 Production of DL-methionine by NSSC104 strain
  • the obtained culture solution of Arthrobacter NSSC104 was centrifuged, washed with ion-exchanged water, and then suspended in ion-exchanged water to 20 OD630 nm. Next, a 9-fold volume of 3.33M diammonium hydrogen phosphate aqueous solution (pH 8.1) was added and suspended to obtain a 3.0M diammonium hydrogen phosphate aqueous solution (pH 8.1). Finally, 2-amino-4-methylthiobutyronitrile was added to a final concentration of 100 mM, and the hydrolysis reaction was carried out at 35 ° C with gentle shaking.
  • Yeast extract 0.5%, glucose 5%, dicalcium hydrogen phosphate 0.1%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, salt 0.1%, magnesium sulfate heptahydrate 0.02 2 ml of a medium containing 0.1% ferrous sulfate and 0.001% of 2-aminobenzonitrile was placed in a test tube and sterilized at 121 ° C for 20 minutes.
  • Medium 20 with the following composition The m1 was placed in a 100 ml baffled Erlenmeyer flask.
  • the obtained culture solution of Arthrobacter NSSSC204 strain was centrifuged, washed with ion-exchanged water, and suspended in ion-exchanged water so as to have a OD of 630 nm.
  • a 9-fold volume of a 2.22 M aqueous solution of ammonium phosphite (pH 7.2) was added and suspended to obtain a 2.0 M aqueous solution of ammonium phosphite (pH 7.2).
  • the culture solution of the Arthrobacter NSSC 104 strain obtained in Example 1 was centrifuged, washed with ion-exchanged water, and then replaced with ion-exchanged water so as to be 4% (w / w) in terms of dry cells. Suspended in water. Next, a 9-fold volume of diammonium hydrogen phosphate aqueous solution (pH 8.1) at various concentrations was added and suspended to obtain an aqueous solution of diammonium hydrogen phosphate having the concentration shown in Table 1. Finally, 2-amino-4-methylthiobutyrate nitrile was added to a final concentration of 100 mM, and a hydrolysis reaction was performed at 35 with gentle shaking.
  • Example 5 (Relationship between ammonium sulfate concentration and DL-methionine production rate)
  • the culture solution of Arthrobacter NSSC 104 obtained in Example 1 was centrifuged, washed with ion-exchanged water, and dried.
  • the cells were suspended in 0.5 M potassium phosphate buffer (pH 7.2) to 4% (w / w) in terms of cells.
  • a 9-fold volume of aqueous ammonium sulfate solution of various concentrations was added and suspended to give a 0.05 M potassium phosphate buffer solution containing ammonium sulfate at the concentration shown in Table 2.
  • the culture solution of Arthrobacter NSSC 104 strain obtained in Example 1 was centrifuged, washed with ion-exchanged water, and then ion-exchanged to 4 ⁇ S (w / w) in terms of dry cells. Suspended in water. Next, a 9-fold volume of diammonium hydrogen phosphate aqueous solution having various concentrations (pH 8.1) was added and suspended to obtain an aqueous solution of diammonium hydrogen phosphate having the concentration shown in Table 3. Finally, 2-hydroxy-14-methylthiobutyronitrile was added to a final concentration of 150 mM, and the hydrolysis reaction was carried out at 35 ° C with gentle shaking.
  • the culture solution of the Arthrobacter NSSC 204 strain obtained in Example 2 was centrifuged, washed with ion-exchanged water, and suspended in ion-exchanged water to a density of 0.80D 63 () nm . . Then, 4 volumes of 1.25 M monosodium glutamate-0.125 M Tris-HCl buffer (pH 8) was added and suspended, and 1.0 M monosodium glutamate-glutamate-0.1 M Tris-HCl buffer was added. (PH 8). Finally, 2-aminophenylacetonitrile was added to a final concentration of 100 mM, and the hydrolysis reaction was carried out at 35 ° C with gentle shaking.
  • reaction solution is diluted with twice the volume of ion-exchanged water to dissolve the product, and then centrifuged to remove the cells, and the concentration of phenylglycine contained in the remaining reaction solution is measured by high-speed liquid chromatography.
  • Matography column: TSK ge 1 ODS-80TM, carrier: 10 mM dihydrogen phosphate, sodium 15 mM sodium phosphate 3 mM sodium hexanesulfonate-2.0 Mase
  • the accumulation of 31 mM vandalicin was confirmed.
  • Example 8 (Relationship between concentration of various polybasic acid salts and production rate of DL-methionine)
  • the culture solution of the Arthrobacter NSSC 204 strain obtained in Example 2 was centrifuged, washed with ion-exchanged water, and then dried at a concentration of 0.4% (w / v) on a dry cell basis as shown in Table 4.
  • the suspension was suspended in a 0.1 M sodium phosphate buffer (PH7.5) containing various polybasic acid salts at the concentrations shown in (1).
  • 2-amino-4-methylthiobutyronitrile was added to a final concentration of 2% (w / v), and a hydrolysis reaction was carried out at 35 ° C with gentle shaking.
  • polybasic acid salts having a carboxylic acid as an acid group triammonium citrate, sodium sodium citrate, sodium sodium aspartate, sodium sodium glutamate, sodium sodium maleate
  • concentration of DL-methionine is more than 1.0M for lithium potassium and more than 1.5M for polybasic acid salts having an inorganic acid as an acid group (a mixture of dihydrogen phosphate and sodium dihydrogen phosphate, sodium sulfate). It can be seen that this is preferable for the generation of
  • Example 9 (Relationship between mixed concentration of polybasic acid salt, formation rate of DL-methionine, and formation rate of by-product hydroxy acid)
  • the culture solution of the Arthrobacter NSSC 204 strain obtained in Example 2 was centrifuged, washed with ion-exchanged water, and then dried to 0.4% (w / v) on a dry cell basis.
  • the cells were suspended in a 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.5) containing triammonium citrate and monosodium glutamate at the concentrations shown in Table 5. Then 2 Monoamino-4-methylthiobutyronitrile was added to a final concentration of 2% (w / v), and the hydrolysis reaction was carried out at 35 ° C with gentle shaking.
  • Example 10 (Relationship between the concentration of diammonium hydrogen phosphate and the production rate of DL-alanine)
  • the culture solution of the Arthrobacter NSSC 204 strain obtained in Example 2 was centrifuged, washed with ion-exchanged water, and then adjusted to 0.2% (w / v) on a dry cell basis.
  • the cells were suspended in diammonium hydrogen phosphate (pH 8) at the concentrations shown in the table. Next, 2-aminopropionitrile was added to a final concentration of 2% (w / v), and a hydrolysis reaction was carried out at 35 ° C with gentle shaking.
  • the yield due to by-products of 2-hydroxy acid is obtained.
  • the desired 2-amino acid can be obtained at a high production rate without a decrease.

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Description

明 細 書
2—アミ ノ酸の製造方法 技術分野：
本発明は 2—アミノニトリルを原料として多塩基酸塩の存在下で生体触媒の作 用により 2—アミ ノ酸を製造する方法に関する。本発明により製造される 2—ァ ミノ酸は、 農医薬用 ·食品用 ·飼料添加用などの用途があり広汎に利用される。 背景技術：
生体触媒の二ト リル加水分解活性を用いた 2—ァミ ノ酸の製造方法としては、 2—ァミノ二トリルを原料とする方法 （特公昭 5 8 - 1 5 1 2 0号公報、 特表昭 6 3 - 5 0 0 0 0 4号公報、 特開平 2— 3 1 6 9 4号公報、 特表平 3 - 5 0 0 4 8 4号公報、 特公平 3 - 1 6 1 1 8号公報） およびシアンヒ ドリ ンを原料とする 方法 （特開平 9 - 1 4 0 3 9 1号公報） が知られている。
2—アミノニトリルを原料とする場合は、 2—アミ ノニトリルが一般に水溶液 中で不安定で、アンモニアが遊離してシアンヒ ドリ ンに変化する性質があるため、 収率良く 2—アミノ酸を得るためには極めて活性の高い生体触媒を用いることが 必要である。 ところが既存の生体触媒では触媒活性が十分ではなく高収率で 2— ァミノ酸を得ることは困難であつた。 一方シアンヒ ドリ ンを原料として用いる方 法では、 ァンモニァまたはアンモニゥム塩の存在下でシアンヒ ドリ ンに生体触媒 を作用させることにより収率は改善されることが知られていた （特開平 9 — 1 4 0 3 9 1号公報） ものの生産速度が遅く、 アンモニゥム塩の添加は実用的でない とされていた。 本発明の課題は、 2—ァミノ二ト リルを直接の原料として、 生体 触媒を用いて効率よく 2 -アミノ酸を製造する方法を提供することにある。 発明の開示 ：
本発明者らは生体触媒の 2—アミ ノニトリルに対する加水分解活性を著しく向 上させる活性化剤のスク リ一二ングの過程で、 多塩基酸塩が有効であることを見 い出した。 次いで、 加水分解活性化における多塩基酸塩の適用濃度について検討 したところ、 意外にも生体触媒に対する活性向上効果は高濃度の多塩基酸塩で強 く発現した。 例えばリ ン酸水素二アンモニゥム塩では飽和濃度に近い 3 M濃度付 近で最大活性が得られた。 一般に生体触媒はその本来の生理的な温度、 p H及び 塩濃度環境で最も効率的な触媒作用を有する場合が多いことからすると、 3 M濃 度という極限環境の高塩濃度で最大活性が得られたことは驚嘆に値する。
さらに本発明者らは、 高濃度の多塩基酸塩が生体触媒の有するシアンヒ ドリ ン に対する加水分解活性を阻害することを見い出した。 したがって、 高濃度の多塩 基酸塩を用いることにより、 反応系中に混在するシアンヒ ドリ ンの加水分解が抑 制され、 シアンヒ ドリ ンからの副生成物である 2—ヒ ドロキシ酸の生成が抑制さ れ、 ひいては 2—アミノ酸の収量が向上する。 このように、 2—ァミノ二ト リル に対する生体触媒活性が多塩基酸塩の存在下で著しく向上するにもかかわらず、 同一の生体触媒をシアンヒ ドリ ンに対して作用させる場合は全く異なる性質を示 すことは、 通常予想し得ない現象である。
本発明は、 2—ァミノ二トリルを直接の原料として生体触媒の作用により 2— アミノ酸を製造する際に、 多塩基酸塩を共存させることにより、 極めて生産速度 が高くかつ高収率で目的の 2 -ァミ ノ酸を得ることができるという上記知見に基 づいて完成に至ったものである。
すなわち本発明は、 一般式〔I〕 ： R C H ( N H 2 ) C N (式中、 Rは水素原子、 置換基を有しても良い C 〜じ 6のアルキル基、 置換基を有しても良い C 2〜 C 6 のアルケニル基、 置換基を有しても良い C 〜（： 6のアルコキシル基、 置換基を 有しても良いァリール基、 置換基を有しても良いァリールォキシ基または置換基 を有しても良い複素環基を示し、 Rが置換基を有しても良い C i〜 C 6のアルキ ル基の場合、 ァミ ノ基と Rが結合して環を形成してもよい。） で表わされる 2— アミノニトリルを多塩基酸塩を含む水溶液中で二トリル加水分解活性を有する生 体触媒によって加水分解して一般式〔II〕 ： R C H ( N H 2 ) C O O H (式中、 R は前記と同一の意味を表わす。） で表わされる 2—アミ ノ酸に変換することを特 徴とする一般式 [ II] で表わされる 2—アミ ノ酸の製造方法 （請求項 1 )、 置換 基を有してもよい C i〜 C 6のアルキル基が、 C i〜 C 6のアルキルチォアルキル 基又は C 〜 C 6のヒ ドロキシアルキル基であることを特徴とする請求項 1記載 の一般式 [ II] で表わされる 2—アミノ酸の製造方法 （請求項 2 )、 置換基を有 してもよいァリ一ル基が、 フヱニル基であることを特徴とする請求項 1記載の一 般式 [ II] で表わされる 2 —アミノ酸の製造方法 （請求項 3 )、 2—アミ ノニ ト リルが 2 —アミ ノー 4 —メチルチオプチロニトリルであることを特徴とする請求 項 1記載の 2 —アミノ酸 [ II] の製造方法 （請求項 4 )、 多塩基酸塩がリ ン酸塩、 硫酸塩、 クェン酸塩、 酒石酸塩、 グルタミ ン酸塩又はそれらの混合物であること を特徴とする請求項 1〜 4のいずれかに記載の一般式 [ II] で表わされる 2—ァ ミ ノ酸の製造方法 （請求項 5 )、 多塩基酸塩が多塩基酸のアンモニゥム塩、 アル 力リ金属塩、 アル力リ土類金属塩又はそれらの混合物であることを特徴とする請 求項 1〜 5のいずれかに記載の一般式 [ II] で表わされる 2—アミノ酸の製造方 法 （請求項 6 )、 多塩基酸塩が、 リ ン酸アンモニゥム、 リ ン酸ナトリウム、 リ ン 酸カリウム、 硫酸ァンモニゥム、 硫酸ナトリ ウム、 硫酸力リウム又はそれらの混 合物であることを特徴とする請求項 1 ~ 4のいずれかに記載の一般式〔II〕で表さ れる 2 —アミ ノ酸の製造方法 （請求項 7 )、 多塩基酸塩の濃度が、 1 . 5 M〜飽 和濃度であることを特徴とする請求項 7に記載の一般式〔II〕で表される 2 —アミ ノ酸の製造方法 （請求項 8 )、 多塩基酸塩が、 クェン酸アンモニゥム、 クェン酸 ナトリウム、 クェン酸力リゥム、 酒石酸アンモニゥム、 酒石酸ナトリウム、 酒石 酸力リゥム、 酒石酸ナト リウムカリウム、 グルタ ミ ン酸ァンモニゥム、 グルタ ミ ン酸ナト リウム、 グルタ ミ ン酸カリゥム又はそれらの混合物であることを特徴と する請求項 1〜 4のいずれかに記載の一般式〔II〕で表される 2—ァミノ酸の製造 方法 （請求項 9 )、 多塩基酸塩の濃度が、 1 . 0 M〜飽和濃度であることを特徴 とする請求項 9に記載の一般式〔II〕で表される 2 —アミノ酸の製造方法 （請求項 10 )、 二 ト リ ル加水分解活性を有す る 生体触媒がア ー ス ロバク タ一
(Arthrobacter) 属又はバリオボラクス （Variovorax) 属に属する微生物菌体、 該微生物の菌体処理物、 該微生物の抽出物または該微生物から単離された酵素で あることを特徴とする請求項 1〜10 のいずれかに記載の一般式〔II〕で表される 2—アミノ酸の製造方法 （請求項 11)、 アースロバクタ一 （Arthrobacter) 属又 はバリオボラクス （Variovorax) 属に属する微生物が、 アースロバクタ一 'エス ピ一 （Arthrobacter sp. ) N S S C 1 0 4若しく はアースロバクタ— 'エスピ 一 ( Arthrobacter sp. ) N S S C 2 0 4又はバリオボラタス ノ、。ラ ドキサス
(Variovorax paradoxus) I A M 1 2 3 7 4である請求項 11に記載の一般式〔II〕 で表される 2—アミノ酸の製造方法 （請求項 12) に関する。
本発明の一般式〔II〕 ： R C H (N H 2) C 00 H (式中、 Rは水素原子、 置換 基を有しても良いじ 〜じ 6のアルキル基、 置換基を有しても良い C 2〜C 6のァ ルケニル基、 置換基を有しても良い C i〜 C 6のアルコキシル基、 置換基を有し ても良いァリール基、 置換基を有しても良いァリールォキシ基または置換基を有 しても良い複素環基を示す。） で表わされる 2 —アミ ノ酸の製造方法としては、 一般式〔I〕 ： R C H (N H 2) C N (式中、 Rは水素原子、 置換基を有しても良 い C ~ C 6のアルキル基、 置換基を有しても良い C 2〜 C 6のアルケニル基、 置 換基を有しても良い C L〜C 6のアルコキシル基、 置換基を有しても良いァリ一 ル基、 置換基を有しても良いァリールォキシ基または置換基を有しても良い複素 環基を示す。） で表わされる 2—アミ ノニトリルを、 多塩基酸塩を含む水溶液中 で二トリル加水分解活性を有する生体触媒によって加水分解して一般式〔II〕で表 わされる 2—アミノ酸に変換する製造方法であれば特に制限されるものではない。 本発明で使用される生体触媒としては、 多塩基酸塩を含む水溶液中で二トリル を加水分解する活性を有する微生物等の生体の触媒であれば特に制限されるもの ではなく、 かかる生体としては例えばアースロバクタ一 （Arthrobacter) 属、 リオボラクス （Variovorax) 属に属する微生物が挙げることができ、 これらの中 でも特に、 アースロバクタ一 ' エスピー （Arthrobacter sp. ) N S S C 1 04 (F E RM B P— 5 8 2 9)、アースロバクタ一 'エスピー （Arthrobacter sp. ) N S S C 204 (F E RM B P— 7662 ) およびバリオボラクス ラ ドキ サス （Variovorax paradoxus) I A M 1 2 3 74を好適に例示することができる。 アースロバクタ一 N S S C 1 0 4 (FERM BP- 5829)は独立行政法人産業技術総合 研究所（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6) に 1996年 2月 6 日付 で寄託されており、 その菌学的性質については W 097/32030に記載されている。 アースロバクタ一 N S S C 2 0 4 (FERM BP-7662) も同様に、 独立行政法人産 業技術総合研究所 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に 2000 年 6月 22 日付で寄託されている。本菌株はアースロバクタ一 N S S C 1 0 4の変 異処理により新たに分離されたものであり、その菌学的性質は以下の通りである。 形態 多形桿菌
グラム染色性 陽性
R o d— C o c c u sサイクル 有
芽胞 無
運動性 無
細胞壁のジアミノ酸 リジン
酸素に対する態度 好気的
ォキシダーゼ 一
カタラーゼ +
DNAの分解 +
ゼラチンの液化 +
デンプンの分解 +
カゼイ ンの分解 +
栄養要求性 無
グリコリル試験 ―
キノ ン系 MK— 9 (H2)
以上の菌学的性質をバージーズ マニュアル ォブ システマティ ック バク テリォロジ一 (B e r g e y' s Ma n u a l o f S y s t e ma t i c B a c t e r i o l o g y) (1 986) に基づいて検索した結果、 N S S C 2 04株はアースロバクタ一 （Arthrobacter) 属に属する新菌株と同定された。 また、 バリオボラクス パラ ドキサス （Variovorax paradoxus) I AM I 23 74は東京大学分子細胞生物研究所より容易に入手でき、 その菌学的性質につい てはインターナショナル ジャーナル ォブ システマチック バクテリォロジ ― (International Journal of Systematic Bacteriology) 第 41卷ヽ 445 ~ 450ページ （19 9 1年） に記載されている。
また、 これらの微生物の培養は、 酵素誘導物質、 微生物が資化しうる炭素源、 窒素源、無機イオン、 さらに必要ならば有機栄養源を含む通常の培地で行われる。 酵素誘導物質としては、 イソプチロニトリル、 2—ァミ ノべンゾニト リル等の 二トリル化合物、 ε—力プロラクタムなどの環状ァミ ド化合物等が使用され、 特 に 2—アミノベンゾニトリルが好ましい。 炭素源としてはグルコース等の炭水化 物、 エタノール等のアルコール類、 有機酸その他が適宜用いられる。 窒素源とし ては、 アミノ酸、 硝酸塩、 アンモニゥム塩その他が用いられる。 無機イオンとし ては、 リ ン酸イオン、 カリウムイオン、 マグネシウムイオン、 硫酸イオン、 鉄ィ オン、 その他が必要に応じて使用される。 有機栄養源としては、 ピタミ ン、 アミ ノ酸など及びこれらを含有するコーンスチープリカー、 酵母エキス、 ポリぺプト ン、 肉エキス、 その他が適宜用いられる。 培養は好気的条件下に、 p H 6〜9、 温度 2 5〜3 7 °Cの適当な範囲に制御しつつ行えばよい。
本発明に用いられる生体触媒としては、 上記のように培養した菌体またはその 菌体から調製した固定化菌体、 粗酵素もしくは固定化酵素などの菌体処理物が挙 げられる。 菌体又は酵素を固定化する場合は担体結合法、 包括法等の通常行われ る固定化技術を適用できる。酵素または粗酵素を調製する場合は、菌体を超音波、 高圧ホモジナイザー等によって破砕した後に、 硫安塩析、 クロマ トグラフィー等 の通常行われる酵素精製技術が適用できる。 また反応に用いた菌体等の生体触媒 は実質的な活性低下なしに繰り返し加水分解反応に使用することができる。
本発明で用いられる一般式〔I〕において、 Rは水素原子、 置換基を有しても良 い C i〜 C 6のアルキル基、 置換基を有しても良い C 2〜 C 6のアルケニル基、 置 換基を有しても良い C i〜C 6のアルコキシル基、 置換基を有しても良いァリ一 ル基、 置換基を有しても良いァリールォキシ基または置換基を有しても良い複素 環基を表わし、 該置換基としては、 ヒ ドロキシル基、 メルカプト基、 アミノ基、 シァノ基、 力ルバモイル基、 置換基を有していてもよいフヱニル基、 イ ミダゾー ル基、 インドール基、 C 〜じ 6アルキルチオ基等を挙げることができる。
Rが置換基を有しても良い C C Sのアルキル基の場合、 ァミ ノ基と Rが結 合して環を形成してもよい。
置換基を有しても良い C i〜 C 6のアルキル基としては、 C 〜 C 6のアルキル チォアルキル基又は C !_〜 C 6のヒ ドロキシアルキル基を、 置換基を有しても良 ぃァリール基としてはフヱ二ル基を好適に例示することができる。
一般式〔I〕 で表わされる 2—アミ ノニトリルとしては、 公知の 2—アミノ酸に 対応する二トリル化合物であれば特に制限なく使用できる。 具体的には、 2—ァ ミ ノ 一ァセ トニ ト リル、 2—ァ ミ ノ 一プロピオ二 ト リル、 2 —ァミ ノ 一イソバレロ二 ト リル、 2 —ア ミ ノ ー 3 —ヒ ドロキシプロ ピオ二 ト リ ル、 2 —ア ミ ノ ー 3 —メチルバレロニ ト リル、 2 —ア ミ ノ ー 4 —メチルバレロニ ト リル、 2 —ア ミ ノ ー 3 —ヒ ドロキシプチロニト リル、 2 —ァミ ノ 一 3 —メルカ ブトプロ ピオ二 ト リル、 2 —ア ミ ノ ー 4ーメチルチオプチロニ ト リル、 2 —ア ミ ノ フエ二ルァセ トニ ト リル、 2 —ア ミ ノ ー 3 —フエニルプロ ピオ二 ト リル、 2— ピ口 リ ジンカルボニ ト リル等を挙げることができる。 例えば 2 —アミ ノ ー 4ーメ チルチオプチロニ ト リルを用いると、 有用なァミ ノ酸であるメ チォニンを得るこ とができる。
これらの 2—アミ ノニ ト リルは 0 . 0 1〜 5 0重量％の濃度で反応に使用され、 必要ならば反応の間、 逐次添加あるいは連続添加することができる。
本発明で使用される多塩基酸塩の酸基としては、 リ ン酸、 亜リ ン酸、 二亜リ ン 酸、 二リ ン酸、 炭酸、 硫酸、 亜硫酸、 チォ硫酸、 クェン酸、 酒石酸、 ブドウ酸、 リ ンゴ酸、 マロン酸、 コハク酸、 フマル酸、 マレイ ン酸、 フタル酸、 ィタコン酸、 シ トラコン酸、 シユウ酸、 グルタル酸、 ァジピン酸、 ト リ メ ト酸、 グルタ ミ ン酸、 ァスパラギン酸、 システィ ン酸等を挙げることができ、 塩基性基としては、 アン モニゥム、 アルキルアンモニゥム、 ピリ ジニゥム等の有機塩基類、 リ チウム、 ナ ト リ ウム、 カリ ウム等のアルカ リ金属、 マグネシウム、 カルシウム等のアルカ リ 土類金属等を挙げることができる。
これらの多塩基酸塩は、 いずれも正塩、 酸性塩またはそれらの混合物として 2 種類以上を組み合わせて使用できる。
これらの多塩基酸塩のうち、 使用される生体触媒にとって有利な p H条件を反 応時に設定することが容易であり、 かつ比較的安価で水溶解度が高く なおかつ低 毒性である点で、 リ ン酸アンモニゥム、 リ ン酸ナ ト リ ウム、 リ ン酸カ リ ウム、 硫 酸アンモニゥム、 硫酸ナ ト リ ウム、 硫酸カリ ウム、 クェン酸アンモニゥム、 クェ ン酸ナ ト リ ウム、 タエン酸カ リ ゥム、 酒石酸アンモニゥム、 酒石酸ナ ト リ ウム、 酒石酸カリ ウム、 酒石酸ナ ト リ ウムカ リ ウム、 グルタ ミ ン酸アンモニゥム、 グル 夕 ミ ン酸ナ ト リ ウム、 グル夕 ミ ン酸カ リ ゥム、 硫酸マグネシゥム又はそれらの混 合物が好ま しい。 また、 これらの多塩基酸塩は 0. 0 1 Mから飽和濃度の範囲で使 用できるが、 酸基としてカルボン酸を有する多塩基酸塩においては 1.0M〜飽和 濃度、 酸基として無機酸を有する多塩基酸塩においては 1.5M〜飽和濃度で使用 することが 2—ァミ ノ酸の変換効率の点で好ましい。
本発明で使用される水溶液としては上記の多塩基酸塩を含むものであれば、 他 に無機塩、 有機酸塩または有機溶媒を含んでいても良く、 あるいは水と 2相に分 離しても良い。
本発明に用いられる生体触媒による加水分解反応は、 水性溶媒中で上記の生体 触媒を一般式 [I] で表わされる 2—ァミ ノ二ト リルに作用させることによって 行われる。 生体触媒は乾燥重量に換算して、 通常 0. 0 0 1〜 1 0重量％の濃度 で使用され、 反応終了後は濾過、 遠心分離又は限外濾過膜濃縮法によって回収し て繰り返し加水分解反応に使用することもできる。 また、 加水分解反応における 反応 p Hは、 特に限定されるものではないが、 適当な緩衝剤または酸もしく はァ ルカリによって 5〜12 の間に保てばよい。 反応の温度は 4 ~ 8 0°C、 好ましく は 2 0〜6 0 °Cに保てばよい。 かかる加水分解反応により、 用いた 2—ァミ ノ二 トリルに対応する 2—ァミノ酸が反応液中に生成される。
一般式 [Π] で表わされる 2 -アミ ノ酸としては、 例えば、 ァラニン、 システ イン、 ァスパラギン酸、 グルタ ミ ン酸、 フヱニルァラニン、 グリシン、 ヒスチジ ン、 イソロイシン、 リ ジン、 ロイシン、 メチォニン、 ァスパラギン、 プロ リ ン、 グルタ ミ ン、 アルギニン、 セリ ン、 スレオニン、 ノ リ ン、 ト リブトファ ン、 チロ シン、 ノルロイシン、 フヱニルグリ シンなどが挙げられる。 これら 2—ア ミ ノ酸 は生体触媒の光学選択性によって D型、 L型あるいはラセミ体のアミ ノ酸として 得られる。 生成された 2—アミノ酸は、 濾過、 濃縮、 抽出、 イオン交換樹脂など の常法によつて分離精製することができる。 発明を実施するための最良の形態 ：
実施例 1 (N S S C 1 04株による DL—メチォニンの製造）
(N S S C 1 04株の培養）
酵母エキス 0. 5 %、 グルコース 5 %、 リ ン酸水素二カ リ ウム 0. 1 %、 リ ン酸二水素カリウム 0. 1 %、 食塩 0. 1 %、 硫酸マグネシウム 7水塩 0. 0
2%、 硫酸第一鉄 0. 0 0 1 %及び ε—力プロラクタム 0. 5 %を含む培地 2ml を試験管にとり 1 2 1 °Cで 20分間滅菌した。 下記の組成の培地 2 0 m 1を 1 0 0 m 1 容量のバ ッ フル付き三角 フ ラ ス コ に入れた。 アース ロバク タ 一 (Arthrobacter) N S S C 1 04株を前記の試験管に一白金耳植菌し、 33°Cで一 晚振！:培養した後、 その 0. 2m 1を前記のバッフル付き三角フラスコに植え継 ぎ、 さらに 4日間 33°Cで振盪培養した。 コーンスチープリカ一 2. 0 % (濾過滅菌）
スクロース 1. 0% (121°Cで 20分間滅菌） ε—力プロラクタム 0. 5% ( 1 2 1 °Cで 2 0分間滅菌）
Ρ Η 7. 2 (2 N苛性ソーダで調整）
(Dぃメチォニンの生成）
得られたアースロバクタ一 （Arthrobacter) N S S C 1 04株の培養液を遠心 分離し、 イオン交換水で洗浄した後、 20 OD630nm となるようにイオン交換水に 懸濁した。 次いで 9倍体積の 3.33Mリ ン酸水素二アンモニゥム水溶液 （p H 8. 1 ) を加えて懸濁し、 3.0Mリ ン酸水素二アンモニゥム水溶液 （p H 8. 1) と した。 最後に 2—アミノー 4ーメチルチオプチロニトリルを終濃度 100 mMに なるように添加し、 35 °Cで緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。 添加 6時間後に遠心分離して菌体を除去し、 残った反応液に含まれるメチォニンの濃 度を高速液体ク口マ トグラフィー （カラム ： T S K g e l O D S— 80 TM、 キャリア ： エタノ一ル z水 トリフルォロ酢酸 = 5/95Z0. 04) を用いて 定量した結果、 9 5 mMの DL-メチォニンの蓄積を確認した。 実施例 2 (N S S C 204株による DL—メチォニンの製造）
(N S S C 204株の培養）
酵母エキス 0. 5 %、 グルコース 5%、 リ ン酸水素二カ リ ウム 0. 1 %、 リ ン酸二水素カリウム 0. 1 %、 食塩 0. 1 %、 硫酸マグネシウム 7水塩 0. 0 2%、 硫酸第一鉄 0. 001%及び 2—ァミノべンゾニトリル 0. 03%を含む 培地 2 m 1を試験管にとり 1 21°Cで 20分間滅菌した。 下記の組成の培地 2 0 m 1を 1 0 0 m 1容量のバッフル付き三角フラスコに入れた。 アースロバクタ一 (Arthrobacter) N S S C 2 04株を前記の試験管に一白金耳植菌し、 33°Cで一 晚振盪培養した後、 その 0. 2 m 1を前記のバッフル付き三角フラスコに植え継 ぎ、 さらに 4日間 33°Cで振盪培養した。 コーンスチープリカー 2. 0 % (濾過滅菌）
スクロース 1. 0 % ( 1 2 1 °Cで 2 0分間滅菌）
2—ァミ ノベンゾニ ト リル 0. 0 3 % ( 1 2 1 °Cで 2 0分間滅菌） P H 7. 2 (2 N苛性ソーダで調整）
(D メチォニンの生成）
得られたアースロバクタ一 （Arthrobacter) N S S C 2 04株の培養液を遠心 分離し、 イオン交換水で洗浄した後、 2 0 OD630nm となるようにイオン交換水 に懸濁した。 次いで 9倍体積の 2.22M亜リ ン酸ァンモニゥム水溶液 （p H7.2) を加えて懸濁し、 2.0M亜リ ン酸アンモニゥム水溶液 （p H7.2) とした。 最後に
2—ァミ ノ一 4—メチルチオプチロニトリルを終濃度 1 0 O mMになるように添 加し、 3 5°Cで緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。 添加 6時間後に遠 心分離して菌体を除去し、 残った反応液に含まれるメチォニンの濃度を高速液体 ク ロマ トグラフィ ー （カラム ： T S K g e 1 O D S— 8 0 TM、 キャ リ ア ： ェ タノール 水 Zト リフルォロ酢酸 = 5/9 5/0. 04)を用いて定量した結果、 9 4 mMの DL-メチォニンの蓄積を確認した。 実施例 3 ( I AM 1 2 374株による DL—メチォニンの製造）
( I AM 1 2 3 74株の培養）
0. 3 %肉汁、 0. 5%ペプトン及び 0. 5 %食塩を含む培地 2 m 1 を試験管 に、 下記の組成の培地 2 0 m lを 1 0 0 m l容量のバッフル付き三角フラスコに 入れ、 各々 1 2 1 °Cで 1 5分間滅菌した。 'リオボラクス 。ラ キサス
(Variovorax paradoxus) I AM 1 2 374株を前記の試験管に一白金耳植菌し、
3 0°Cでー晚振盪培養した後、 その 0. 2 m lを前記のバッフル付き三角フラス コに植え継ぎ、 さらに 5 日間 3 0 °Cで振盪培養した。 酵母エキス 0. 5 %
グリセロール 0. 5 %
リ ン酸一力リウム 0. 1 %
リ ン酸ニ力リウム 0. 1 %
食塩 0. 0 2%
硫酸マグネシウム 7水塩 0. 0 2 %
ε—力プロラクタム 0. 5 %
υ Η 7. 2 (2 Ν苛性ソーダで調整）
(DL-メチォニンの生成）
得られたパ'リオボラクス ノヽ0ラ ドキサス (Variovorax paradoxus) I AM I 2 3 74株の培養液を遠心分離し、 イオン交換水で洗浄した後、 60 0D nm となる ようにイオン交換水に懸濁した。 次いで 7倍体積の 3.33Mリ ン酸水素二アンモ ニゥム水溶液及び 2倍体積の 3.33Mリ ン酸ニ水素アンモニゥム水溶液を加えて 懸濁し 3.0Mリ ン酸水素ニァンモニゥムーリ ン酸ニ水素アンモニゥム緩衝液 （p H7.2) とした。 最後に 2—アミノー 4ーメチルチオプチロニト リルを終濃度 5 0 m Mになるように添加し、 3 5 °Cで緩やかに振盪しながら加水分解反応を行つ た。 添加 10 時間後に遠心分離して菌体を除去し、 残った反応液に含まれるメチ ォニンの濃度を高速液体ク口マトグラフィー （カラム ： T S K g e 1 OD S— 8 0 TM、 キャリア ：ェタノール /水/トリフルォロ酢酸 = 5 / 9 5/ 0. 04) を用いて定量した結果、 49m Mの Dいメチォニンの蓄積を確認した。 実施例 4 (リ ン酸水素二アンモニゥム濃度と Dいメチォニンの生成速度の関 係）
実施例 1によって得られたアースロバクタ一 （Arthrobacter) N S S C 1 04 株の培養液を遠心分離し、 イオン交換水で洗浄した後、 乾燥菌体換算で 4%(w/w) なるようにィォン交換水に懸濁した。 次いで 9倍体積の各種濃度のリ ン酸水素二 アンモニゥム水溶液 （p H 8. 1 ) を加えて懸濁して第 1表に示した濃度のリ ン 酸水素二アンモニゥム水溶液とした。 最後に 2—アミノー 4—メチルチオプチ口 二トリルを終濃度 1 0 0 mMになるように添加し、 3 5でで緩やかに振盪しなが ら加水分解反応を行った。 添加 3 0分後に遠心分離して菌体を除去し、 残った反 応液に含まれるメチォニンの濃度を高速液体ク口マトグラフィー （カラム ： T S K g e 1 O D S— 8 0 TM、 キャ リ ア ： ェタノール /水/ト リ フルォロ酢酸 = 5 /9 5 / 0. 04) を用いて定量し、 乾燥菌体 1 g当たりの DL-メチォニン生 成速度（ mol/min/gdc)を計算した。 結果を第 1表に示す。 第 1表からリ ン酸水 素二アンモニゥム濃度が 1. 5 M以上、 特に 3. 0 Mが Dいメチォニンの生成に 好ましいことがわかる。
第 1表
リ ン酸水素二アンモニゥム濃度 Dぃメチォニン生成速度
(M) ^mol/min/gdc)
0. 5 134
1. 0 134
1. 5 185
2. 0 256
2. 5 334
3. 0 446
3. 5 438
3. 8 321 実施例 5 (硫酸ァンモニゥム濃度と DL-メチォニンの生成速度の関係） 実施例 1によって得られたアースロバクタ一 （Arthrobacter) N S S C 1 04 株の培養液を遠心分離し、 イオン交換水で洗浄した後、 乾燥菌体に換算して 4 %(w/w)なるように 0. 5 M リ ン酸カリゥム緩衝液 （p H7.2)に懸濁した。 次い で 9倍体積の各種濃度の硫酸アンモニゥム水溶液を加えて懸濁して第 2表に示し た濃度の硫酸ァンモニゥムを含む 0.05Mリ ン酸カリ ゥム緩衝液とした。 最後に 2—アミノー 4ーメチルチオプチロニトリルを終濃度 1 0 O mMになるように添 加し、 35°Cで緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。 添加 30 分後に遠 心分離して菌体を除去し、 残った反応液に含まれるメチォニンの濃度を高速液体 ク ロマ トグラフィ ー （カラム ： T S K g e l OD S— 80 TM、 キャ リア ： ェ タノールノ水/ト リフルォロ酢酸 = 5 / 95/0. 04) を用いて定量し、 乾燥 菌体 l g当たりの Dいメチォニン生成速度（ zmol/min/gdc)を計算した。 結果を 第 2表に示す。 第 2表から硫酸アンモニゥム濃度が 1. 5M以上、 特に 3. 0 M が DL-メチォニンの生成に好ましいことがわかる。 第 2表
Figure imgf000014_0001
実施例 6 (リ ン酸水素ニァンモニゥム濃度と 2—ヒ ドロキシ一 4ーメチルチオ 酪酸の生成速度の関係）
実施例 1によって得られたアースロバクタ一 （Arthrobacter) N S S C 104 株の培養液を遠心分離し、 イオン交換水で洗浄した後、 乾燥菌体に換算して 4¾S(w/w)なるようにイオン交換水に懸濁した。 次いで 9倍体積の各種濃度のリ ン 酸水素二アンモニゥム水溶液 （p H 8. 1 ) を加えて懸濁して第 3表に示した濃 度のリ ン酸水素ニァンモニゥム水溶液とした。 最後に 2—ヒ ドロキシ一 4ーメチ ルチオプチロニトリルを終濃度 150mMになるように添加し、 3 5 °Cで緩やかに 振盪しながら加水分解反応を行った。添加 30分後に遠心分離して菌体を除去し、 残った反応液に含まれる 2—ヒ ドロキシ— 4ーメチルチオ酪酸の濃度を高速液体 クロマ トグラフィー （カラム ： T S K g e 1 O D S— 8 0 TM、 キャリア ： ェ タノール /水ノトリ フルォロ酢酸 = 5Z95 / 0. 04) を用いて定量し、 乾燥 菌体 1 g当た り の 2 — ヒ ドロキシ— 4 —メ チルチオ酪酸の生成速度（ Z mol/min/gdc)を計算した。 結果を第 3表に示す。 第 3表から、 リ ン酸水素二アン モニゥム濃度が 3. 0 Mの場合は 0. 5 Mの場合に比べて、 副生成物である 2— ヒ ドロキシー 4ーメチルチオ酪酸の生成速度がおよそ 1/17に抑制されること がわかる。
第 3表
リ ン酸水素ニァンモニゥ 2—ヒ ドロキシ一 4—メチ
ム濃度 ルチオ酪酸の生成速度
( ) (^mol/min/gdc)
0. 5 260
3. 0 15 実施例 7 (N S S C 204株によるフヱニルダリ シンの製造）
(フヱニルダリ シンの生成）
実施例 2で得られたアースロバクタ— （Arthrobacter) N S S C 2 04株の培 養液を遠心分離し、 イオン交換水で洗浄した後、 0.8 0D63()nm となるようにイオン 交換水に懸濁した。 次いで 4倍体積の 1.25Mグルタ ミ ン酸モノナ ト リ ウム一 0.125Mトリス塩酸緩衝液 （p H 8) を加えて懸濁し、 1.0Mグルタミ ン酸モノナ ト リ ウム— 0.1Mト リス塩酸緩衝液 （p H 8) とした。 最後に 2—アミノ フヱ二 ルァセ トニト リルを終濃度 1 00 mMになるように添加し、 35 °Cで緩やかに振 盪しながら加水分解反応を行った。 添加 6時間後に反応液を 2倍体積のイオン交 換水で希釈して生成物を溶解した後に遠心分離して菌体を除去し、 残づた反応液 に含まれるフヱニルグリシンの濃度を高速液体ク口マトグラフィ一 （カラム ： T S K g e 1 O D S— 80 TM、 キャ リア ： 1 0 mMリ ン酸ニ水素力 リ ウム一 1 5 mMリ ン酸一 3 mMへキサンスルホン酸ナ ト リ ウム— 2.0Mァセ トニ ト リル水 溶液） を用いて定量した結果、 3 1 mMのフヱニルダリ シンの蓄積を確認した。 実施例 8 (各種多塩基酸塩の濃度と DL-メチォニンの生成速度の関係）
実施例 2によって得られたアースロバクタ一 （Arthrobacter) N S S C 2 04 株の培養液を遠心分離し、ィォン交換水で洗浄した後、乾燥菌体換算で 0.4¾(w/v) なるように第 4表に示した濃度の各種多塩基酸塩を含む 0.1M リ ン酸ナトリウム 緩衝液 （PH7.5) に懸濁した。 次いで 2—アミノー 4—メチルチオプチロニト リ ルを終濃度 2%(w/v)になるように添加し、 35 °Cで緩やかに振盪しながら加水分 解反応を行った。 添加 30 分後に遠心分離して菌体を除去し、 残った反応液に含 まれるメチォニンの濃度を高速液体ク口マトグラフィ一 （カラム ： T S K g e 1 OD S— 80 TM、 キャ リア ： 1 0 mMリ ン酸ニ水素力リ ウムー 15 mMリ ン酸 一 3 mMへキサンスルホン酸ナ ト リ ウムー 2.0Mァセ トニ ト リル水溶液） を用い て定量し、 乾燥菌体 1 g当たりの D メチォニン生成速度（//mol/min/gdc)を計 算した。 結果を第 4表に示す。 第 4表から酸基としてカルボン酸を有する多塩基 酸塩 （クェン酸三アンモニゥム、 クェン酸三ナト リウム、 ァスパラギン酸モノナ ト リ ウム、 グルタ ミ ン酸モノナ ト リ ウム、 マレイ ン酸ナ ト リ ウム、 レ酒石酸ナ ト リウムカリウム） では 1. 0M以上、 酸基として無機酸を有する多塩基酸塩 （リ ン 酸水素二力リウムーリ ン酸ニ水素ナトリゥム混合物、 硫酸ナトリウム） では 1. 5 M以上の濃度が DL-メチォニンの生成に好ましいことがわかる。
第 4表
多塩基酸塩濃度と Dぃメチォニン生成速度（/^ mol/min/gdc)の関係
Figure imgf000017_0001
実施例 9 (多塩基酸塩の混合濃度と DL-メチォニンの生成速度及び副生成ヒ ド ロキシ酸の生成速度の関係）
実施例 2によって得られたアースロバクタ— （Arthrobacter) N S S C 2 0 4 株の培養液を遠心分離し、ィォン交換水で洗浄した後、乾燥菌体換算で 0. 4% (w/v) なるように第 5表に示した濃度のクェン酸三アンモニゥムとグルタ ミ ン酸モノナ ト リゥムを含む 0. 1M リン酸ナトリゥム緩衝液 （p H7. 5) に懸濁した。 次いで 2 一アミノー 4ーメチルチオブチロニトリルを終濃度 2%(w/v)になるように添加し、 3 5 °Cで緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。 添加 30 分後に遠心分離 して菌体を除去し、 残った反応液に含まれるメチォニン及び 2—ヒ ドロキシ一 4 ―メチルチオ酪酸の濃度を高速液体ク口マトグラフィ一 (カラム ： T S K g e 1 O D S— 8 0 TM、 キャリア ： 1 0 mMリ ン酸ニ水素力リウム一 1 5 mMリ ン酸 一 3 mMへキサンスルホン酸ナト リウム一 2.0Mァセ トニト リル水溶液） を用い て定量し、 乾燥菌体 1 g当たりの Dぃメチォニン生成速度（ zmol/min/gdc)及び 2 —ヒ ドロキシー 4ーメチルチオ酪酸生成速度（ /mol/min/gdc)を計算した。 結果 を第 5表に示す。 第 5表から 2種類の多塩基酸塩を混合する場合においても、 そ れぞれの有する 2—アミノ酸生成活性向上効果及び副生物である 2—ヒ ドロキシ 酸低減効果が相加的に表われることがわかる。 すなわち、 個々の塩の濃度が必ず しも最適濃度に至らない場合であっても、 それらを 2種類以上組合わせて使用す ることにより Dぃメチォニンの生成に好ましい効果が表われることがわかる。
第 5表
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000018_0001
第 5表 （つづき）
Figure imgf000019_0001
実施例 1 0 (リ ン酸水素二アンモニゥム濃度と DL-ァラニンの生成速度の関 係）
実施例 2によって得られたアースロバクタ— （Arthrobacter) N S S C 2 0 4 株の培養液を遠心分離し、ィォン交換水で洗浄した後、乾燥菌体換算で 0.2%(w/v) なるように第 6表に示した濃度のリ ン酸水素二アンモニゥム （pH8) に懸濁し た。次いで 2—アミ ノープロピオ二トリルを終濃度 2%(w/v)になるように添加し、 3 5 °Cで緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。 添加 30 分後に遠心分離 して菌体を除去し、 残った反応液に含まれる DL-ァラニンの濃度を高速液体クロ マトグラフィ一 （カラム ： T S K g e 1 O D S— 8 0 TM、 キャリア ： 1 0 m Mリ ン酸ニ水素カリゥム一 1 5 mMリ ン酸ー 3mMヘプタンスルホン酸ナトリ ゥ ム— 2.0Mァセトニト リル水溶液） を用いて定量し、 乾燥菌体 1 g当たりの Dい ァラニン生成速度（ mol/min/gdc)を計算した。 結果を第 6表に示す。 第 6表か らリ ン酸水素二アンモニゥム濃度が 1. 5 M以上、 特に 3. 0 Mが DL-ァラニン の生成に好ましいことがわかる。
第 6表
リ ン酸水素ニァンモニゥム濃度 Dレアラニン生成速度
(M) t zmo丄 /min/gdc)
0. 5 760
1. 0 800
1. 5 1100
2. 0 1500
2. 5 1750
3. 0 1970
3. 5 1820 産業上の利用可能性 ：
本発明によれば、 2—アミ ノニトリルを直接の原料として二ト リル加水分解活 性を有する生体触媒を多塩基酸塩の存在下で用いることにより、 2—ヒ ドロキシ 酸の副成による収率低下を招く ことなく高い生産速度で目的の 2—ァミ ノ酸を得 ることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 一般式〔I〕 ： R C H (N H 2) C N (式中、 Rは水素原子、 置換基を有し ても良い C 〜 C 6のアルキル基、 置換基を有しても良い c2〜c6のアルケニル 基、 置換基を有しても良い Cェ〜 C 6のアルコキシル基、 置換基を有しても良い ァリ一ル基、 置換基を有しても良いァリールォキシ基または置換基を有しても良 い複素環基を示し、 Rが置換基を有しても良い C 〜 C 6のアルキル基の場合、 ァミノ基と Rが結合して環を形成してもよい。） で表わされる 2—アミ ノニト リ ルを多塩基酸塩を含む水溶液中で二トリル加水分解活性を有する生体触媒によつ て加水分解して、 一般式〔II〕 ： R C H (N H 2) C O O H (式中、 Rは前記と同 一の意味を表わす。） で表わされる 2—アミ ノ酸に変換することを特徴とする一 般式 〔11] で表わされる 2—アミ ノ酸の製造方法
2. 置換基を有してもよい C i〜 C 6のアルキル基が、 C i〜C 6のアルキルチ ォアルキル基又は C 〜 C 6のヒ ドロキシアルキル基であることを特徴とする請 求項 1記載の一般式 [Π] で表わされる 2—アミ ノ酸の製造方法
3. 置換基を有してもよいァリール基が、 フエニル基であることを特徴とする 請求項 1記載の一般式 [Π] で表わされる 2—アミノ酸の製造方法
4. 2—ァミノ二トリルが 2—アミノー 4—メチルチオプチロニト リルである ことを特徴とする請求項 1記載の 2—アミノ酸 [II] の製造方法
5. 多塩基酸塩がリ ン酸塩、 硫酸塩、 クェン酸塩、 酒石酸塩、 グルタ ミ ン酸塩 又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれかに記載の一 般式 [II] で表わされる 2—アミ ノ酸の製造方法
6. 多塩基酸塩が多塩基酸のアンモニゥム塩、 アルカリ金属塩、 アルカリ土類 金属塩又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項 1〜 5のいずれかに記 載の一般式 [II] で表わされる 2—アミノ酸の製造方法
7. 多塩基酸塩が、 リ ン酸アンモニゥム、 リ ン酸ナトリウム、 リ ン酸カリゥム、 硫酸アンモニゥム、 硫酸ナトリウム、 硫酸カリウム又はそれらの混合物であるこ とを特徴とする請求項 1〜4のいずれかに記載の一般式〔II〕で表される 2 —アミ ノ酸の製造方法
8 . 多塩基酸塩の濃度が、 1 . 5 M〜飽和濃度であることを特徴とする請求項 7に記載の一般式〔II〕で表される 2—アミノ酸の製造方法
9 . 多塩基酸塩が、 クェン酸アンモニゥム、 クェン酸ナ ト リ ウム、 クェン酸力 リ ゥム、 酒石酸アンモニゥム、 酒石酸ナ ト リ ウム、 酒石酸力 リ ゥム、 酒石酸ナ ト リ ウムカ リ ウム、 グルタ ミ ン酸アンモニゥム、 グルタ ミ ン酸ナ ト リ ウム、 グルタ ミ ン酸カリゥム又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項 1〜4のいず れかに記載の一般式〔II〕で表される 2—アミノ酸の製造方法
1 0 . 多塩基酸塩の濃度が、 1 . 0 M〜飽和濃度であることを特徴とする請求 項 9に記載の一般式〔II〕で表される 2—アミ ノ酸の製造方法
1 1 . ニ ト リ ル加水分解活性を有する生体触媒がアースロバク タ 一 (Arthrobacter) 属又はバリオボラクス （Variovorax) 属に属する微生物菌体、 該微生物の菌体処理物、 該微生物の抽出物又は該微生物から単離された酵素であ ることを特徴とする請求項 1〜10 のいずれかに記載の一般式〔II〕で表される 2 ーァミノ酸の製造方法
1 2 . アースロノ クタ一 (Arthrobacter) 属又はノ オボラクス (Variovorax) 属に属する微生物が、 アースロバクタ一 ' エスピー （Arthrobacter sp. ) N S S C I 0 4若しくはアースロバクタ一 'エスピー （Arthrobacter sp. ) N S S C 2 0 4又はバリオボラタス パラ ドキサス （Variovorax paradoxus) I A M 1 2 3 7 4であることを特徴とする請求項 11 に記載の一般式〔II〕で表される 2 ーァミノ酸の製造方法
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003062437A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-31 Nippon Soda Co.,Ltd. Procede de production de sel d'ammonium d'$g(a)-hydroxyacide
WO2004009829A1 (ja) * 2002-07-23 2004-01-29 Nippon Soda Co.,Ltd メチオニンの製造法
JP2004099506A (ja) * 2002-09-09 2004-04-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd アミノ酸アミドの製造方法
WO2005095626A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 Nippon Soda Co., Ltd. 固定化生体触媒およびそれを用いた有機酸塩の製造方法
CN102297913A (zh) * 2011-07-25 2011-12-28 浙江中一检测研究院有限公司 工作场所空气中有害物质己内酰胺的测定方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0187680A2 (en) * 1985-01-11 1986-07-16 Nitto Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Process for producing organic acids by use of microorganisms
EP0332379A2 (en) * 1988-03-08 1989-09-13 Japan Energy Corporation Production process of L-alpha-amino acids
EP0356912A2 (en) * 1988-08-29 1990-03-07 Idemitsu Kosan Company Limited A method for the preparation of an optically active 2-substituted carboxylic acid
EP0450885A2 (en) * 1990-03-30 1991-10-09 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Biological process for preparing glycine
JPH06319591A (ja) * 1993-05-10 1994-11-22 Asahi Chem Ind Co Ltd 光学活性なノルスタチン誘導体の製造法
JPH1042886A (ja) * 1996-07-30 1998-02-17 Mitsui Petrochem Ind Ltd 微生物によるβ−アラニンの製造法
JPH1042885A (ja) * 1996-08-02 1998-02-17 Mitsui Petrochem Ind Ltd 微生物によるアミド類及び、または有機酸類の製造法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0187680A2 (en) * 1985-01-11 1986-07-16 Nitto Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Process for producing organic acids by use of microorganisms
EP0332379A2 (en) * 1988-03-08 1989-09-13 Japan Energy Corporation Production process of L-alpha-amino acids
EP0356912A2 (en) * 1988-08-29 1990-03-07 Idemitsu Kosan Company Limited A method for the preparation of an optically active 2-substituted carboxylic acid
EP0450885A2 (en) * 1990-03-30 1991-10-09 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Biological process for preparing glycine
JPH06319591A (ja) * 1993-05-10 1994-11-22 Asahi Chem Ind Co Ltd 光学活性なノルスタチン誘導体の製造法
JPH1042886A (ja) * 1996-07-30 1998-02-17 Mitsui Petrochem Ind Ltd 微生物によるβ−アラニンの製造法
JPH1042885A (ja) * 1996-08-02 1998-02-17 Mitsui Petrochem Ind Ltd 微生物によるアミド類及び、または有機酸類の製造法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003062437A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-31 Nippon Soda Co.,Ltd. Procede de production de sel d'ammonium d'$g(a)-hydroxyacide
WO2004009829A1 (ja) * 2002-07-23 2004-01-29 Nippon Soda Co.,Ltd メチオニンの製造法
JP2004099506A (ja) * 2002-09-09 2004-04-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd アミノ酸アミドの製造方法
WO2005095626A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 Nippon Soda Co., Ltd. 固定化生体触媒およびそれを用いた有機酸塩の製造方法
CN102297913A (zh) * 2011-07-25 2011-12-28 浙江中一检测研究院有限公司 工作场所空气中有害物质己内酰胺的测定方法

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