WO2002004936A1

WO2002004936A1 - Probe for mass spectrometry of liquid sample

Info

Publication number: WO2002004936A1
Application number: PCT/JP2001/005961
Authority: WO
Inventors: Koji Suzuki; Yoshio Suzuki
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation; The Kanagawa Academy Of Science And Technology Foundation
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2001-07-10
Publication date: 2002-01-17
Also published as: US20040142378A1; US7301018B2; JP4212353B2; AU2001269491A1

Description

明細書

液状試料の質量分析用プローブ

技術分野

本発明は、液状試料の質量分析のためのプローブに関する。

^景技術

現在、最も高感度、高精度に検体中の試料を定量することができる方法として質量分析測定法が挙げられる。質量分析法を用いて液状試料を測定するにあたリ重要なことは、化合物の性質に合わせたイオン化法を選択することである。例えば化合物の不安定要因によって使い分ける場合、大きく分けてハードイオン化とソフトイオン化の 2種類に分けられる。前者の方法としては、電子イオン化法、化学イオン化法及び大気圧イオン化法が挙げられ、後者の方法としてはエレクトロスプレーイオン化法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法及び高速原子衝撃イオン化法が挙げられる。

一方、最近では高速液体クロマトグラフィ一で分離した試料をオンラインで質量分析を用いて同定を行う手法 (LG/MS)が化学、生物学の分野で頻繁に利用されている。この場合、液体クロマトグラフィーと相性の良いイオン化法は、キヤピラリー先端から流出する溶液試料を直接イオン化する方法であるため、先に記した方法のうち、後者の方法が該当する。中でもエレクトロスプレーイオン化質量分析装置と高速液体ク口マトグラフィーをオンラインで接続した装置は現在最も汎用されており、タンパク質、糖質をはじめとした生体に不可欠な物質から、近年問題とされている環境ホルモン物質の同定にその威力を十分に発揮している。エレクトロスプレーイオン化の場合、試料の分子イオンピークが検出されることは極めて低く、通常ナトリゥムなどが加算された擬分子イオンピークとして観察されるか、あるいは LG/MSでは移動相に酢酸アンモニゥム、ギ酸、酢酸などのプ口トン性溶媒を混入することにより、試料のイオン化を助ける方法が採られている。

液状試料の質量分析の際のイオン化を助ける手段として、液体クロマ卜グラフィ一の移動相にプロトン性溶媒を添加する手法が LG/MSでは一般的となっている。しかし、 i )酢酸アンモニゥムは負イオンモードの場合、試料のイオンとアンモニゥムイオンがペアとなって感度が低下する、 i i )トリフルォロ酢酸は正イオンモ —ドの場合、サンプルイオンとトリフルォロ酢酸イオンがペアとなって感度が低下し、負イオンモードの場合、一部例外を除きイオン化を妨害する、 i i i )ァセト二卜リルでは必ず酸を添加しなければならない、またこの際、酢酸アンモニゥ厶では溶解しないので用いることができない、等の欠点も指摘されている。

発明の開示

従って、本発明の目的は、液状試料の質量分析の際のイオン化法において、移動相にプロトン性溶媒を添加することなく、試料を効率的にイオン化する手段を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、溶媒中でイオン化する基と、試料化合物中の官能基と反応して共有結合する官能基を 1つの分子中に有する化合物をプロ一ブとして用い、該プローブを試料化合物と共有結合させることにより、試料化合物を効率的にイオン化することができることに想到し、かつ、このようなプロ一ブによリイォン化した試料化合物がェレクトロスプレー質量分析によリ高感度に定量できることを実験的に確認し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、一般式 [ I ]

R ²— A— R ¹ [ I ]

(但し、式中、 R ¹は溶媒中でイオンとなるイオン性官能基、 R ²は他の物質と結合し得る構造、 Aは任意のスぺーサ一部を示す）

で表される液状試料の質量分析用プローブを提供する。また、本発明は、上記本発明のプローブと、液状試料中の試料化合物とを結合させ、得られた結合物を質量分析にかけることを含む質量分析方法を提供する。さらに、本発明は、上記一般式 [ で表される化合物の、液状試料の質量分析用プローブを製造するための使用を提供する。

本発明のプローブを用いれば、エレクトロスプレーイオン化法において、移動相にプロトン性溶媒を添加することなく、試料を効率的にイオン化することができ、種々の試料について、高感度、高精度にエレクトロスプレーイオン化質量分析を行うことができる。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の実施例 1 1において実施した、エレクトロスプレーイオン化質量分析により得られた質量スぺクトルを示す。

図 2は、本発明の実施例 1 1において実施した、プローブのみの場合のエレクトロスプレーイオン化質量分析により得られた質量スぺクトルを示す。

図 3は、実施例 1 1において実施した質量分析に用いた質量分析計の構成を模式的に示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の液状試料のイオン化質量分析用プローブは、上記一般式 [ I ]で表されるものである。一般式 [ I ]において、 R ¹は溶媒中でイオン化するイオン化基である。 R ¹は、使用する溶媒中でイオン化される基であればいずれの基であってもよく、正に帯電するものでも負に帯電するものでもよい。 R ¹の例として、ァミン、カルボン酸若しくはその塩、スルホン酸若しくはその塩、

R'

I

一 B— R"

R'"

(但し、式中、、 '及び R' ' 'は同一又は異なる本発明の効果に悪影響を与えない任意の基、好ましくは、水素、ハロゲン、又は炭素数 1 〜 2 0の直鎖状若しくは分枝状アルキル基）等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない（なお、本明細書において、「ハロゲン j は、特に断りがない限りフッ素、塩素、臭素及びヨウ素のいずれであってもよい）。これらのうち、. ァミンが好ましく、とりわけ、下記一般式 [ M ]で表されるァミンが好ましい。

R³

~~ ⁺-R⁴ [ II ]

Rコ

(但し、式中、 R ³、 R ⁴及び R ⁵はそれぞれ独立に、本発明の効果に悪影響を与えない任意の基、好ましくは、水素、ハロゲン、又は炭素数 1 〜2 0の直鎖状若しくは分枝状アルキル基）上記一般式 [I]中において、 R²は、他の物質と結合し得る構造を示す。 R²の好ましい一群の例として試料化合物中の官能基と反応して共有結合し得る官能基を挙げることができる。この場合、 R²としては、試料化合物中の官能基と反応して共有結合し得る官能基であれば、いかなる官能基であってもよい。液状で質量分析により分析される試料は、タンパク質や糖等の生体物質である場合が多いので、これらに含まれることが多い官能基、すなわち、一 NH₂基、 _SH基、

— COOH基、一 OH基、一 CHO基等と反応して共有結合する官能基が好まししヽ。このような官能基の例として、 SCN―、 CI0₂S—、

B r H₂C―、 C I OC—、一 NH₂、 -NHNH₂. -CH -CH₂0NH₂ (-HG I) (塩酸塩であってもなくてもよい）、

を挙げることができる。これらの官能基と反応する試料化合物中の官能基 ( ）及び該反応の結果形成される結合を下記表 1に示す（なお、 R²がー NH₂の場合は、表 1に示される、試料化合物中の官能基 (R')がー NH₂の場合の R ²と表 1に記載のように結合できる）。

表 ί

官能基 (R2) 官能基 (R") 結合形成状態

SC — ■NH₂ - — C-N ~~

I IT I

H S H

CK¾S— NH₂

BrH₂0-- — COOH 一 1一

IH₂C— 一 COOH OOSHH

一 ⁰一 r

CIOC一一 OH T一

-CHO

NH₂

-N圆 ₂ —CHO 一 N— =0 -—

K H

また、 R²としては、 CH₃CH (NH₂) =CH—も好ましく採用することができる。この場合、 2分子のプローブが R— CHOで表される試料化合物と次のように反応する。

2x

好ましい R²として、さらに、一般式 [VI]

(ただし、 Xはハロゲンを示す）、

及び一般式 [VII]

^ (CH₂r-NH₂ [VII]

(ただし、 nは 1〜5の整数を示す）

で表される基を挙げることができる。一般式 [VI]中、ハロゲンとしては、好ましくは臭素である。

上記一般式 [VI]で示される R ²は、試料化合物中のシ卜シンと反応して次のように結合する。

(ただし、式中、 Rは、例えばヌクレオチドや核酸の糖部分のような任意の基を示す）この R ²は、試料化合物中のシトシン部分と結合することができるので、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸、デォキシシチジン一リン酸、デォキシシチジン二リン酸及びデォキシシチジン三リン酸並びにシトシンを含む D N A及び R N Aのような核酸と結合できる。

の場合は、試料化合物中のグァニンと反応して次のように結合する。

(ただし、式中、 Rは、例えばヌクレオチドや核酸の糖部分のような任意の基を示す）

この R ²は、試料化合物中のグァニン部分と結合することができるので、グァノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、デォキシグアノシンーリン酸、デォキシグアノシンニリン酸及びデォキシグアノシン三リン酸並びにグァニンを含む D N A及び R N Aのような核酸と結合できる。

R ²が上記一般式 [VI I ]で示される基である場合は、試料化合物中のリン酸ェステル部分と反応して次のように結合する（ただし、下記の例では nが 2の場合について示す）。

なお、この反応式では、試料化合物がデォキシアデノシン一リン酸（すなわち、ヌクレオチド中の塩基がアデニンで、糖がデォキシリポース）の場合を示しているが、 R ²は、リン酸エステル部分と結合するので、塩基は、シトシン、グァニン、チミン又はゥラシルのようなアデニン以外の他の塩基であってもよいし、糖はデォキシリポースでもリボースでもよい。また、リン酸エステルの数は、上記反応式では 1個であるが、 R ²は、末端のリン酸エステルと結合するので、縮合しているリン酸エステルの数は 1個〜 3個のいずれであってもよい。従って、 ― 般式 [VI I ]で示される R ²はあらゆる種類のヌクレオシドーリン酸、ヌクレオシドニリン酸及びヌクレオシド三リン酸と結合することが可能である。さらに、核酸の末端には遊離のリン酸エステルが存在するので、一般式 [VI I ]で示される R ²は D N Aや R N Aのような核酸と結合することも可能である。

また、 R ²が光学活性を有する基である場合には、光学活性を有する試料化合物と結合させることにより、特定の光学活性を有する試料化合物の測定が可能になり、また、試料化合物中の光学中心の絶対配置を決定することが可能になる。光学活性を有する R ²の好ましい例として、一般式 [VI I I ]で表される基を挙げることができる。

(ただし、 Xはハロゲン、 R ^{1 0}は炭素数 1 5のアルキル基を示す）

ハロゲンとしては、特に臭素が好ましい。一般式 [VI I I ]で表される R ²は、アミノ酸と反応して次のように結合する _c

(ただし、式中、 Rはアミノ酸の任意の側鎖を示す）

この場合、アミノ酸が、 D体と L体の混合物（ラセミ体）であると、形成された結合物は互いにジァステレオマーの関係になる。この状態で LG/MS分析を行うことにより、単に ES I等の質量分析法で高感度検出を行うことができるばかリでなくアミノ酸の絶対配置を決定することが可能となる。

なお、 R ²は、試料化合物の官能基と反応して共有結合し得る官能基に限定されるものではなく、試料化合物とインター力レー卜又は配位結合によリ結合する基や試料化合物を包接する環状構造を有する基も R ²として好ましく用いることができる。

すなわち、 R ²の好ましい例として、二本鎖核酸にインター力レートする構造を有するものを挙げることができる。このような R ²の具体例として下記一般式 [ I X]で表される基を挙げることができる。

同

(ただし、（^ ^{1 1}及ぴ ^{1 2}は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、炭素数 1 5 のアルキル基又は炭素数 1 5の N N-ジアルキルァミノ基を示す）

このような R ²は、二本鎖核酸にインター力レートして結合するので、このような R ²を有するプローブは二本鎖核酸の測定に好ましく用いることができる。試料化合物を包接する環状構造を有する基としては、下記一般式 [X]で示される基を挙げることができる。

(ただし、 R ^{1 3}は水酸基、カルボキシル基又は炭素数 1〜 5のアルキル基、 m は 5〜 9の整数を示す）

一般式 [X]で示されるシクロデキストリン構造は、環状のオリゴ糖で、外側に水酸基を向け、内側に炭素鎖を向けた円錐台状の構造を有している。シクロデキストリンの空孔は疎水場であるため、疎水性相互作用を利用して、有機分子をその空孔内に包接することが出来る。この現象を利用して、微少量の様々な有機分子を含んでいる水を浄化し、その含まれている物質が何であるかを同定するために、上記 R ²を有するプローブを利用することができる。該プローブを水試料に投与し、撹拌することにより、水試料中の有機分子はシクロデキス卜リンの空孔内に包接される。

試料化合物を包接する環状構造を有する基としては、さらに下記一般式 [X I ]で示される基を挙げることができる。

(ただし、 R ^{1 4}及び R ^{1 5}はそれぞれ独立に水素、ハロゲン又は炭素数 1 〜5のアルキル基、 R ^{1 6}は炭素数 1 〜 5のアルキル基、又は末端にカルボキシル基、エステル基若しくはアミド基を有する炭素数 1 〜 5のアルキル基、 pは 3 ~ 7の整数を示す）

一般式 [X I ]で示されるカリックスァレーンは、ベンゼン環からなる環状のオリゴマーである。力リックスァレーンのベンゼン環で囲まれた空孔は疎水場であるため、疎水性相互作用を利用して、有機分子をその空孔内に包接することが出来る。この現象を利用して、微少量の様々な有機分子を含んでいる水を浄化し、その含まれている物質が何であるかを同定するために、上記 R ²を有するプローブを利用することができる。該プローブを水試料に投与し、撹拌することにより、有機分子はカリックスァレーンの空孔内に包接される。

試料化合物を包接する環状構造を有する基は、上記のものに限定されるものではなく、例えば、クラウンエーテル等から水素原子が 1個離脱した基等も用いることができる。

さらに、 R²としては、試料化合物と配位結合する、例えば EDTAのような錯体形成性化合物から水素原子が 1個離脱した基等も用いることができる。

一般式 [I]中、 Aは任意のスぺーサ一部である。本発明のプローブは、 R²により試料化合物と結合し、 R¹によって結合後の化合物をイオン化するものであるから、 R¹と R²の間に位置する Aは、任意の構造をとリ得るものである。もつとも、 Aとして、疎水性部と親水性部を有するものを採用することにより、疎水性溶媒でも親水性溶媒でも用いることができ、汎用性が高まるので好ましい。疎水性部としては、ベンゼン環のような芳香環を挙げることができ、親水性部としては、エーテル、ァミン、ケトンを含む構造を挙げることができる。このような Aの好ましい例として、下記一般式 [III]で表されるものを挙げることができる。

— R⁶—

I [HI]

Ar

(式中、 R⁶は炭素数 1〜20のアルキレン基であり、その構成単位である

— CH₂—の 1個以上かつ半数以下が一 O—、一 CO—及び一 NH—から成る群より選ばれる 1又は 2以上の基であってもよく、 1又は 2以上の炭素数 1〜6のアルキル基で置換されていてもよく、 A rは、 1ないし 5個の炭素数 1 ~6のァルキル基で置換されていてもよい芳香環である）

さらに、一般式 [III]で表される Aの好ましい例として、下記一般式 [IV]

(但し、式中、 R⁷は存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数 1〜 6のアルキレン基を示し、 R⁸は、式中に示されるベンゼン環によって任意の水素が置換された炭素数 1〜6のアルキレン基を示す）

又は下記一般式 [V]

(ただし、式中、 ⁷及び ⁸は、式 [IV]と同じ意味を示し、 R⁹は、存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数 1〜 6のアルキレン基を示す）で表されるものを挙げることができる。

また、 Aとしては、上記一般式 [V]において、 R ⁹がフエ二レン基であるものも好ましく用いることができる。この Aは、特に R²が上記一般式 [VI]で表される構造を有する場合及び

である場合に好ましく用いることができる。

また、 Aとしては、一 R⁶— (ただし、 R⁶は、一般式 [III]における R³と同じ意味を示す）であるものも好ましく用いることができる。この Aは、特に R² が二本鎖核酸にインター力レートする構造を有する基（例えば、上記一般式 X] で表される基）であり試料化合物が二本鎖核酸である場合、及び R ²が他の化合物を包接する環状構造を有する基（例えば、上記一般式 [X]又は [XI]で表される基）である場合に好ましく用いることができる。さらに、 Aとしては、一 R⁶— A r— R⁶' — (ただし、 R ⁶及び A rは一般式 [III]における R⁶及び A rとそれぞれ同じ意味を示し、 R⁶'は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には一般式 [III]における R⁶と同じ意味を示す（ただし、式中の R⁶と R⁶'とは同一であっても異なっていてもよい））であるものも好ましく用いることができる。このような Aの好ましい例として、下記一般式 [XII] [XII]

(ただし、 1^¹⁷及ぴ1^^{1 8}は、互いに独立に炭素数"！〜 6のアルキレン基を示し、 R^{1 9}は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には炭素数 1 6のアルキレン基を示す）

又は下記一般式 [XI M]

(ただし、 R²⁰及び R²¹は、互いに独立に炭素数 1 6のアルキレン基を示し、 R ²²は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には炭素数 1 6のアルキレン基を示す）

で表されるものを挙げることができる。

Aの構造は任意のものでよいが、プローブ全体の分子量が余りに大きくなると、試料化合物一プローブ結合物における、プローブの占める割合が大きくなつて分析の感度が低下するので、プローブの分子量は 1 000以下であることが好ましい。

本発明のプローブは、当業者が、公知の方法に基づいて容易に合成することができる。下記実施例にも、複数の好ましいプローブの製造方法が具体的に記載されている。

試料化合物と、プローブとの反応は、プローブの R²と、試料化合物中の、 R ²と結合させるべき官能基の種類に応じて、公知の技術に基づき適宜の条件で行うことができる。下記実施例にも、好ましいプローブと試料化合物との結合反応の条件が具体的に記載されている。 R ²及ぴ該 R ²と結合する試料化合物中の官能基（R' ) の上記した具体的な組合せのそれぞれについて、具体的な結合反応条件の例を以下に記載する。もつとも、これらは単なる例示であり、他の反応条件でもこれらの官能基同士を結合させることは可能であるので、結合反応条件が下記のものに限定されるものではないことは当業者にとって明らかである。また、ここに記載されていない R²についても、当業者が化学常識に従って容易に結合反応を行うことができる。

(1) 1^²が301\1—、 R' が— N H ₂の場合

2〜3 mgの試料に 0.2 ml (エタノール：水：卜リエチルァミン = 2 : 2 : 1 v/v)を加え減圧乾固した後、 0.5 ml (エタノール：水：トリエチルァミン：プローブ = 7 : 7 : 1 : 1 vA/)を加え室温で 20分間反応させる。溶媒を減圧留去した後、溶離液に溶解し試料溶液とする（B. A. Bidl ingmeyer, et al， J. Ghro matogr. , 336, 93 (1984)参照）。

(2) R²が C I 0₂S—で、 R' がー N H ₂の場合

2〜3 mgの試料に 500 μΐの 1Μ NaHG0₃水溶液と 200 μ!_の 1 mg / mLプローブ

/アセトン溶液を加え、 60 °Gで 30分間加熱する。アセトンを留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Meffin, P. J. , et al, J. Pharm. Sci. , 66， 583 (197 7)参照) 。

(3) が

で、 R' が一 N H ₂の場合

1.5 mgの試料を THF5.0 mLに溶解し、 50 mgのプローブを加え、 60 °Gで 30 分間加熱する。 THFを留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Jupi l l, T. H. Am. Lab. , 8 (5)， 85 - 92 (1976)参照）。

(4) が

で、 R' が _SHの場合

2~3 mgの試料を 500 μΙ_の水に溶解後、 200 μしの 1 mg / mLプローブ/ァセトニトリル溶液を加え、 60 °Gで 30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする (Nakashima K. , et al, Talanta. , 32， 167 (1985)参照) 。

(5) R²が B r H ₂C—又は I H ₂C—で、 R' がー COO Hの場合

2〜3 mgの試料をァセトン 500 μ!_に溶解し、 200 μしの 1 mg / mLプローブ/ アセトン溶液および K2G031 m_gを加え、 60 °Gで 30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする (Dunges, W. , Anal. Ghem. , 49, 442 (1977 )参照）。

(6) ²が〇 I OC—で、 R' が— OHの場合

2〜3 m の試料を 0.5 mlのピリジンに溶解後、 0.2 mLの 1 mg / mLプローブ/ ピリジン溶液を加え、 40 °Gで 1時間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする (Suzuki, , et aに J. Biochem. , 82, 1185 (1977)参照）。

(7) R²が

で、 R' がー C HOの場合

2〜3 mgの試料をメタノール 1.0 mし酢酸 0.1 mし 0· 2 mLの 1 mg / mLプローブ /メタノール溶液を加え、 40 °Gで 30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。

(8) R²が

で、 R，が一 N H₂の場合

試料のエタノール溶液（10一⁴〜 1(Γ³ M) 0.1 mLに、 10 mg / mLのプローブ/ エタノール溶液 1.5 mLを加え、室温で 5分間〜 10分間撹袢する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする (Roth, M.， Anal. Chem. , 43, 880 (1971 )参照）。

(9) R²がー CH₂ONH₂ ■ HC Iで R' が

の場合

1 ~5 mgの試料、トリェチルァミン 2滴、プローブ 50 mgを 50 °Cで 30分間加熱する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Jupille, T. H. , Am. Lab. , 8 (5), 85-92 (1976)参照) 。

(10) 1¾²が一[\^ 1^1"1₂、 R' がー CHOの場合

1〜5 mgの試料を水 0.5 mlに溶解後、 30%HGI0₄水溶液に 20mg/mLの割合でプローブを溶かした溶液を加え、室温で 10分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Newberg, C. , et al. , Anal. Chim. Acta, 7， 23 8 (1952)参照) 。

0. 1〜5. 0 μ_§の試料を、 50μΙ_のリン酸緩衝溶液 (ρΗ7. 0)に溶解後、 200μΙ_の 1m _g / mLのプローブ/リン酸緩衝溶液 (_PH7. 0)を加え、室温で 5分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。

(12) R ²が

の場合

0. 1 ~5· 0 μ_§の試料を、 50μΙ_のリン酸緩衝溶液 (ρΗ7. 0)に溶解後、 200μίの 1m g / it!のプローブ/リン酸緩衝溶液 (pH7. 0)を加え、室温で 5分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。

Hクで、 R ' が

の場合

0. 1〜5. 0 μgの試料を、 50μしのリン酸緩衝溶液 (ρΗ7. 0)に溶解後、 200μΙ_の 1m g / mLのプローブ/リン酸緩衝溶液（pH7. 0)および 1 -ェチル- 3- (3-ジメチルァミノプロピル)カルポジイミドを加え、室温で 30分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。

本発明のプローブを用いた液状試料の質量分析は、試料化合物と本発明のプローブを反応、結合させた後、通常の液状試料の質量分析と全く同様にして行うことができる。本発明のプローブは、試料のイオン化を伴う、あらゆる液状試料の質量分析方法に適用可能である。好ましい液状試料の質量分析方法の例として、エレクトロスプレーイオン化質量分析、大気圧化学イオン化質量分析、サーモスプレーイオン化質量分析、パーティクルビーム質量分析、フリット高速原子衝撃質量分析等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、通常の質量分析のみならず、反応槽と一体化された分析装置中で行われる質量分析に適用することも可能である。例えば、ポストカラム反応方式の高速液体クロマトグラフィ装置や、フローインジェクション分析装置のように、分析装置に反応槽又は反応コイルが組み込まれた分析装置において、反応槽又は反応コイルの下流で行われる質量分析に本発明のプローブを適用することができる。この場合、プローブは、反応槽又は反応コイルの上流で試料と混合し、結合反応を反応槽又は反応コイル中で行うことができる。なお、質量分析自体は、市販の装置を用い、装置に添付された指示書に従って容易に行うことができる。

なお、「液状試料」とは、分析対象である試料化合物が液状である場合の試料化合物、及び試料化合物が固体である場合の該試料化合物の溶液の両者を包含する。

本発明のプローブを用いた場合には、試料化合物がプローブと結合することによって確実にイオン化されており、結合後のプローブ由来部分の質量も既知であるから、通常の質量分析により高感度、高精度に定量することができる。なお、観察されたピーク値 (m/_Z値）からプローブの分子量を差し引くことにより試料化合物の分子量を算出することができる。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例 1 プローブの合成（その 1 )

下記のスキームに従い、 R ¹として第四級ァミン、 R ²として S C N—を有する上記化合物を合成した。

ο¾/ί¾。

2- (2-トリメチルシロキシェトキシ) - 2-フエニル工タン二卜リルの合成

1 2

50 ml二口フラスコに 2-フエニル- 1,3-ジォキソラン（化合物 1) 3.0 g (19.9 mm ol)、トリメチルシリルシアノイド（TMSGN) 2.1 ml (21· 4 mmol)、 Znl₂ 0.3 g (0. 94 mmol)を加え、窒素気流下、室温で 2時間撹拌した。 TLG (Si0₂; CH2CI2 ： n- へキサン = 1 : 4 v/v)で原料消失を確認後、ジェチルエーテル 100 mlを加え水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し無色オイル状化合物を得た。同定は 1H-圖 R、 ES卜 T0F質量分析を用いて行った。

収率 93 %

1H-國 R (300 MHz, CDCI3, TMS, r.t. , δ / ppm) 0.12 (s, 9H, Si (GH₃) 3) , 3. 65 〜 3.84 (m, 4H， -OCH2CH2O-) , 5.42 (s, 1H, Ar-CH) , 7.40〜7.58 (m, 5H, ArH)

ESI-T0F [M + Na]⁺ = 272

(2) 2 -（2-ァミノ- 1-フエニルェトキシ）エタン -1-オールの合成

3

100 ml二口フラスコに化合物 2 2.0 g (8.0 mmmol) を加え脱気窒素置換後、氷浴下 1 M BH3■ THF溶液 50 mlを 30分間かけて滴下した。室温で 4時間撹拌後、 TLC (Si0₂; n-へキサン：酢酸ェチル = 4 ： 1 vA/)で原料消失を確認した。氷浴下、 6 N HGIを加え酸性にした後、溶媒の大部分を減圧留去した。 NaOH水溶液を加え p H 10にした後、酢酸ェチル 100 mlで 3回抽出し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、無色オイル状化合物を得た。同定は 1H-刚 R、 ESI- T0F質量分析を用いて行った。

収率 90 %

1H -剛 R (300 MHz, CDC 13, TMS, r. t. , δ / ppm) 2.55 (br s， 3H) , 2.83 (dd, 1 H), 3.15 (dd, 1H), 3.39〜3.62 (m, 2H) , 3.68〜3· 78 (m, 2H)， 5.00 (dd, 1H)_;

7.40 7.58 (m, 5H)

ESI-TOF [M]⁺ = 181

(3) ( e 卜ブトキシ) -N- (2- (2 -ヒドロキシエトキシ) -2 -フエニルェチル）フォルムアミドの合成

3 4

30 ml二口フラスコに化合物さ 0.50 g (2.76 mmol)を加え脱気窒素置換後、 THF 15 ml トリェチルァミン 0.28 ml (2.76 議 ol)、ジ- ieri -ブチル -ジカーポネート 0.60 g (2.76 mmol)を加え、室温で撹拌した。 2時間後、 TLG (Si0₂; n~へキサン：酢酸ェチル = 1 ： 1)で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー（Si0₂; /7~へキサン：酢酸ェチル = 1 ： 1)で精製し、無色オイル状化合物を得た。同定は 1H- R、 ES卜 T0F質量分析を用いて行った。

収率 90 %

1H-NMR (300 MHz, CDCI3, TMS, r.t. , δ / ppm) 1.37 (s, 9Η)， 3.10 (s, 3H) , 3.51 〜3.64 (m, 4Η)， 4.33〜4.37 (m, 2Η) , 4.98 (br s, 1H), 5.01 (dd, 1H), 7·41~7.58 (m, 5H)

ESI-TOF [M + Na]+ = 304

(4) (iertブトキシ） -N-(2- (2- (メチルスルフォ二口キシ）エトキシ） -2-フエ二ルェチルフオルムアミドの合成

5

30 ml二口フラスコに化合物 40.50 g (1.78 國 o I)を加え脱気窒素置換後、ジェチルエーテル 10.0 mしトリェチルァミン 0.23 g (2.31 mmol)を加えた。氷浴下、メタンスルホニルクロリド 0.22 g (1.96 瞧 ol)を加えた後、室温で撹袢した。一時間後、 TLG (Si0₂; へキサン：酢酸ェチル = 2 : 1) で原料消失を確認した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（Si0₂; Tへキサン：酢酸ェチル = 2 : 1) で精製し、白色固体を得た。同定は 1H-隱 R、 ES卜 T0F質量分析を用いて行った。

収率 88 %

1H-N R (300 MHz, GDGI3, TMS, r. t. , δ / ppm) 1.37 (s, 9Η) , 3.10 (s, 3Η) , 3.51 〜3·64 (m, 4Η) , 4.33 ~ 4.37 (m, 2Η) , 4.98 (br s， 1Η), 5.01 (dd, 1Η), 7.40 〜7.58 (m, 5Η)

ESI -TOF [ + Na]+ = 382

(5) tertづトキシ）- N- (2- (2-ョードエトキシ）- 2-フエニルェチル）フオルムァミドの合成

5 6

30 ml二口フラスコに化合物 0.50 g (1.39 mmol)を加え脱気窒素置換後、ァセトン 10.0 ml、ヨウ化ナトリウム 1.10 g (7.25 画 ol)を加え還流した。 2時間後、 TLG (Si 02; A "へキサン：酢酸ェチル = 1 : 1) で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー（Si02; n~へキサン：酢酸ェチル = 10

： 1)で精製後、赤色固体を得た。同定は 1H- NNlR、 ESI- T0F質量分析を用いて行つた。収率 85 %

!H- MR (300 MHz, GDGI3, TMS, r.t. , δ / ppm) 1.35 (s, 9H) , 3.22 (t, 2H) ,

3.38 〜3.66 (m, 4H) , 5.02 (br s, 1H), 5.06 (dd, 1H), 7.41〜 7.58 (m, 5H) ESI-TOF [M + Na]⁺ = 414

(6) 2 -（2-ョードエトキシ) - 2-フエニルェタンイソチオシァネー卜の合成

10 ml二口フラスコに化合物旦 0.20 g (0.51 mmol)を加え脱気窒素置換後、塩化メチレン 2.0 ι^、トリフルォロ酢酸 0.5 ml を加え室温で撹拌した。 30分後、 TLC (Si0₂; ヘキサン：酢酸ェチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、溶媒を減圧留去した。得られた化合物に塩化メチレン：水 = 1 _: 1 v/vの混合溶媒 5.0 ml を加えた後、炭酸水素ナトリウム 0.30 g、チォホスゲン 80.0 μΙ を加え、室温で撹拌した。 1時間後、 TLG (Si0₂; ^へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、塩化メチレン 50 mlで 3回抽出後、有機相を無水硫酸マグネシゥムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄橙色オイル状化合物を得た。同定は¹ H - NMR, ES卜 T0F質量分析を用いて行った。

収率 80 %

1H-NMR (300 MHz, CDCI3, TMS, r.t. , δ / ppm) 3.26〜3.33 (m, 2Η) , 3.36~3· 79 (m, 2Η), 3.80 (dd, 1Η), 3.95 (dd, 1H)， 5.24 (dd, 1H)， 7.40〜7.58 (m, 5H)

ESI-TOF [M + Na]+ = 355

(7) 2- (2- (トリエチルァミノ）エトキシ） -2 -フエニルェタンイソチオシァネー卜

ョーダイドの合成 S=C=N

8

30 mlなす型フラスコに化合物 20.20 g (0.60 mmol)、トルエン 5.0 mしトリェチルァミン 1.0 mlを加え、室温で撹袢した。 24時間後、 TLG (Si0₂; ~へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、析出した沈殿を分取後、トルェンで洗浄し、黄白色固体を得た。同定は 1H- NMR、 ESI- TOF質量分析を用いて行つた。

収率 92 %

1H—刚 R (300 MHz, D SO-ofe- TMS, r.t. , δ / ppm) 1.30 (t, 9H)， 3.04 (q, 6H) 3.75〜3.95 (m, 3H), 4.11 (dd, 1H), 4.10 ~ 4.16 (m, 1H), 4.33 (dd, 1H), 5.54 (dd, 1H), 7.40〜7.58 (m, 5H)

ESI -TOF [M]⁺ = 307

実施例 2 プローブの合成（その 2)

下記のスキームに従い、 R¹として第四級ァミン、 R²として B r H₂C—を有する上記化合物を合成した。

,,-^ ( 4433- OH TBDMSO TBDMSO TBDMSO

TBDMSCI MsCl Nal

DBU TEA Acetone

CH₃CN Ether

50 ml

(化合物 1 )

48 g (16. l 1

6.5 mmol) 認後、溶媒後、無水硫酸マトグラフ

(2) (メラペンチル

TBDMS

10 100 ml二口フラスコに化合物 2 2.0 g (6.75 mmmol) を加え脱気窒素置換後、ジェチルエーテル 20.0 mしトリェチルァミン 0.68 g (6.75 mttiol), メタンスル

TBDMSO

3 4

30 ml二口フラスコに化合物 3 0.50 g (1.25 mmo I)を加え脱気窒素置換後、ァセトン 15 (tiしヨウ化ナトリウム 1.49 g (10.0 mmol)を加え、 2時間還流した。溶媒を減圧留去後、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。

(4) 卜リエチル（2 - (3， 3， 4, 4-テトラメチル -1-フェニル- 3-シラペンチルォキシ

)ェチル）ァミンの合成

4 5

30 mlなす型フラスコに化合物 40.50 g (1.25 mmol)、トルエン 10.0 mしトリエチルァミン 1.0 ml を加え、室温で 24時間撹拌した。析出した沈殿を分取後、トルエンで洗浄した。減圧乾燥後、目的化合物を得た。

(5) 1- (メチルスルホニル) - 2-フエ二ル- 2- (2 -（トリェチルァミノ）ェトキシ）ェタンの合成

- 6

30 ml二口フラスコに化合物 0.50 g (1.37 瞧 ol)、酢酸：水： THF = 3 ：

1 ： 1 v/vの混合溶媒 10. 0 mlを加え室温で 2時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。得られた化合物に、ジェチルエーテル 10 0 rnl、トリエチルァミン、メタンスルホニルクロリドを加え、室温で 2時間撹拌した。水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲル力ラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。

(6) (2- (2-ョ一ド- 1-フエ二ルェ卜キシ）ェチル）トリェチルァミンの合成

50 mlなす型フラスコに化合物旦 0.20 g (0.58 mmol), アセトン 20.0 mし臭化リチウム 0.43 g (5.0 mmol)を加え 2時間還流した。溶媒を減圧留去後、エタノールを加えた。不溶物を濾別後、濾液を減圧濃縮し、目的化合物を得た。

実施例 3 プローブの合成（その 3)

9

下記のスキームに従い、 R¹として第四級ァミン、 R²として NH₂ を有する上記化合物を合成した。

(1 ) 2- (2-トリメチルシロキシェトキシ)- 2-フエニルェタン二トリルの合成

1 2

50 ml二口フラスコに 2-フエニル -1,3-ジォキソラン（化合物 1) 3.0 g (19.9 隱 ol)、 T SCN2.1 ml (21.4 瞻 l)、 Znl2 0.3 g (0.94 mmol)を加え、窒素気流下、室温で 2時間撹拌した。 TLG (Si 0₂; CH₂CI₂ ： n~へキサン = 1 : 4 v/v)で原料消失を確認後、ジェチルエーテル 100 mlを加え水で洗浄した。無水硫酸マグネシゥムで乾燥後、溶媒を減圧留去し無色オイル状化合物を得た。同定は 1H-刚 R ESI - T0F質量分析を用いて行った。

収率 93 %

1H-刚 R (300 MHz, CDCI3, TMS, r.t. , δ / ppm) 0.12 (s, 9H, Si (GH₃) 3) , 3. 65 3.84 (m 4H, -OCH2GH2O-) , 5.42 (s, 1H, Ar-CH) , 7.40 7.58 (m, 5H, Ar

H)

ESl-TOF [M + Na]⁺ = 272

(2) 2- (2-ァミノ- 1 -フエニルェトキシ）エタン- 1-オールの合成

100 ml二口フラスコに化合物 2.0 g (8.0 mmmol) を加え脱気窒素置換後、氷浴下 1 M BH3. THF溶液 50 mlを 30分間かけて滴下した。室温で 4時間撹拌後、 TL C (Si0₂; n-へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1 v/v)で原料消失を確認した。氷浴下、 6 N HGIを加え酸性にした後、溶媒の大部分を減圧留去した。 NaOH水溶液を加え pH 10にした後、酢酸ェチル 100 mlで 3回抽出し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、無色オイル状化合物を得た。同定は 1H-副 R ESI-T0F 質量分析を用いて行った。

収率 90 %

1H -剛 R (300 MHz, CDCI3, TMS, r. t. , δ / ppm) 2.55 (br s, 3H) , 2.83 (dd， 1

H), 3.15 (dd, 1H), 3.39 ~ 3.62 (m, 2H) , 3.68 ~ 3.78 (m, 2H)， 5.00 (dd, 1 H), 7.40〜7.58 (m, 5H)

ESI-TOF [ ]+ = 181

(3) 6/" ブトキシ） -（2-(2-ヒドロキシエトキシ） - 2-フエニルェチル）フォルムアミドの合成

3 4

30 ml二口フラスコに化合物さ 0.50 g (2.76 mmo I)を加え脱気窒素置換後、 THF 15 mU トリェチルァミン 0.28 ml (2.76 mmol), ジ- ieri-ブチル-ジカ一ポネ —卜 0.60 g (2.76 mmol)を加え、室温で撹拌した。 2時間後、 TLG (Si0₂; へキサン：酢酸ェチル = 1 ： 1)で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー（Si0₂; Tへキサン：酢酸ェチル = 1 ： 1)で精製し、無色オイル状化合物を得た。同定は - NMR、 ES卜 T0F質量分析を用いて行った。

収率 90 %

1H -剛 R (300 MHz, CDCI3, TMS, r.t. , δ / ppm) 1.37 (s, 9Η) , 3.10 (s, 3Η) , 3.51〜3.64 (m, 4Η) , 4.33 ~ 4.37 (m, 2Η)， 4.98 (br s, 1Η)， 5.01 (dd, 1Η)， 7.41~7.58 (m, 5Η)

ESI-T0F [Μ + Na]⁺ = 304

(4) (ie ブトキシ） -N - (2- (2 -（メチルスルフォ二口キシ）エトキシ） - 2-フエ二ルェチルフオル厶アミドの合成

4 ₅

30 ml二口フラスコに化合物 0.50 g (1.78 mtnol)を加え脱気窒素置換後、ジェチルエーテル 10.0 mU 卜リエチルァミン 0.23 g (2.31 mmol)を加えた。氷浴下、メタンスルホニルクロリド（MsGl)0.22 g (1.96 tnmol)を加えた後、室温で撹袢した。一時間後、 TLG (Si 0₂； n~へキサン：酢酸ェチル = 2 : 1) で原料消失を確認した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（Si0₂; n~へキサン：酢酸ェチル = 2 : 1) で精製し、白色固体を得た。同定は 1H-剛 ES卜 T0F質量分析を用いて行った。

収率 88 %

1H-NMR (300 MHz, CDCI3, TMS, r.t. , δ / ppm) 1.37 (s， 9H), 3.10 (s, 3H) , 3·51〜3, 64 (m, 4H) , 4.33 ~ 4.37 (m, 2H) , 4.98 (br s, 1H), 5.01 (dd， 1H), 7.40〜7.58 (m, 5H)

ESI-T0F [M + Na]⁺ = 382

(5) (iertブトキシ） - N- (2-(2-ョードエトキシ）- 2-フエニルェチル）フオル厶ァミドの合成

^ 6

30 ml二口フラスコに化合物互 0.50 g (1.39 mmo I)を加え脱気窒素置換後、ァセトン 10.0 mしヨウ化ナトリウム 1.10 g (7.25 mmol)を加え還流した。 2時間後、 TLC (Si0₂; へキサン：酢酸ェチル = 1 : 1) で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー（Si02; ~へキサン：酢酸ェチル = 10 ： 1)で精製後、赤色固体を得た。同定は 1H-剛 R、 ES卜 T0F質量分析を用いて行つた。

収率 85 %

¹H-NMR (300 MHz, CDC 13, TMS, r.t. , δ / ppm) 1.35 (s， 9H) , 3.22 (ΐ, 2H) , 3.38〜3.66 (m, 4H) , 5.02 ( r s， 1H), 5.06 (dd， 1H), 7.41 ~ 7.58 (m， 5H) ESI-TOF [M + Na]⁺ = 414

(6) N— (2 - (2-ョ一ドエトキシ） - 2-フエニルェチル)一 3-ォキソブタンアミドの合成

10 ml二口フラスコに化合物 0.20 g (0.51 mmol)を加え脱気窒素置換後、塩化メチレン 2.0 ml, トリフルォロ酢酸 0.5 mlを加え室温で撹拌した。 30分後、 TL C (Si0₂; T-へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、溶媒を減圧留去した。得られた化合物に塩化メチレン 5.0 mし卜リエチルァミン 0.05 g (0. 51 mrnol), ァセト酢酸 0.05 g (0.51 mmol)を加え、氷浴下 30分間撹拌した。 B0P( Benzotr 1 azo I— 1一 y I oxyt ris(di' metny I am / no) phosphon 1 urn hexaf I uorophosphate) 試薬 0.22 g (0.51 mmol)を添加後、氷浴下で 30分間、室温に戻した後 24時間撹拌した。 TLG (Si0₂; /7 "へキサン：'酢酸ェチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、塩化メチレン 50 mlで 3回抽出後、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、化合物を得た。

(フ） 3 -アミノ- N-(2- (2-ョードエ卜キシ） -2 -フエニルェチル) - 2-ブテンアミドの合成 montmorillonite K-10

8

10 mlなす型フラスコに化合物 20.20 g (0.60 mmol)、アンモニア水 5.0 mしモントモリロナイト K-10 0.1 gを加え、 24時間室温で撹拌した。塩化メチレンで抽出後、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリ力ゲルカラムク口マトグラフィ一で精製した。

(8) 3—ァミノ一 N— (2 -フェニル -2 - (2 -（卜リエチルァミノ）エトキシ）ェチル)一 2— ブテンアミドの合成

TEA

toluene

8 9

10 mlなす型フラスコに化合物 0.20 g (0.58 議 ol)、トルエン 5.0 mしトリェチルァミン 1.0 mlを加え、室温で 24時間撹拌した。析出した沈殿を分取後、卜ルェンで洗浄し減圧乾燥した。

実施例 4 プローブの合成（その 4)

8

下記のスキームに従い、 R¹ して第四級ァミン、として- C0CH₂Brを有する上記化合物を合成した。

スキーム

(1 ) フエニル-（2 -トリメチルシラニルォキシ-エトキシ) -ァセトニトリノレ（化合物 2) の合成

1 2

30 mlナス型フラスコに 2 -フエ二ル- 1,3-ペンタジオン（化合物 1 ) 3.0 g (1 9.9 mmol) を加え氷浴につけた後、 TMSCN 2.1ml (21.43 mmol), Znl₂ 0.3 g (0. 94mm₀l)を加え、室温で 2 時間攪拌した。反応溶液にジェチルエーテルを加え、水で洗浄後、 MgS0₄を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質 (4.17g, 収率 83.2 %)を得た。

!H-NMR (270MHZ, CDC 13, T S, r. t. , 5/ppm) 0.15(s, 9H, S1CH3), 3.80 (t, 2 H, -0CH^ ₂0S\~) , 4.11 (t, 2H, -0CH₂i? ?0Si-) , 5.39(s, 1H, ArGH) , 7.45 (m,

5H, ArH) ESI-TOF (+)： [ + Na]⁺ = 272.0

(2) 2- (2 -アミノ- 1-フエ二ル-ェ卜キシ) -エタノール（ィ匕合物 )の合成

100 ml 三口フラスコに、化合物 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて 1 M BH₃■ THF溶液 30ml をゆっくりと加えた。氷浴中で 30分間、室温で 4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、 1 N HCI 水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水 20ml を加え、 NaOH水溶液を加え pH 10とした。酢酸ェチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナ卜リゥムで乾燥後、無色オイル状の化合物（650mg, 収率 89.5 %)を得た。

1H -剛 R (300MHz, CDCI3, TMS, r. t. , <5/ppm) 2.95 (d, 2H， ₂-CH2) , 3.65 (t, 2H, -0Gf/^ ₂0 ) ， 3.75 (t, 2H, -00Η₂β¾0Η) , 4.46 (t, 1H, ArGH) , 7.32 (m, 5H, ArH) ESI-TOF (+) ： [M + H]⁺ = 182.0 (3) [2- (2-ヒドロキシ -ェトキシ) -2-フエ二ル-ェチル] -力ルバミン酸 tert-ブチルエステル（化合物の合成

3 4

100 ml二口フラスコに、化合物 3 1.40 g (7.70 隱 o I)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥 THF 55 ml 、 TEA 0.78 g (7.69 mmol)、 D i -tert-buty I -d i carbonate

1.68 g (7.70 mmol)を加え、室温で 2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、カラ厶クロマトグラフィー（Si0₂、クロ口ホルム）で精製し、黄色油状化合物（1.30g, 収率 59.9 %)を得た。

H-NMR (300MHz, GDGI₃, TMS, r.t. , <5 /ppm) 1.48(s, 9H, i-Bu) ， 3.24 (d, 2H, m-CHj) , 3.49 (t, 2H， -0C〃 H₂0H) , 3.73 (ΐ, 2H, -00H₂CH^)i) ， 4.42 (t,

1H, ArCH) ， 7.33 (m, 5H， ArH)

ESI-T0F (+) ：. [ + Na ]⁺ = 304.0

(4) メタンスルホン酸 2- (2- tert -ブトキシカルボニルァミノ- 1 -フ: c二ル-ェトキシ) -ェチルエステル（化合物 5)の合成

50 mlナス型フラスコに、化合物 500 mg (1.78 瞧 ol) を加え窒素置換後、乾燥 THF 16 ml 、 TEA 0.5 ml (4.55 mmol) を加えて氷浴につけた。 MsCI 440 m g -(3.84 mmol) を加え、室温で一時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、クロ口ホルムを加えて析出した沈殿をろ別後，ろ液を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー (Si0₂, 酢酸ェチル： Tへキサン = 2 : 1 v/v) で精製し、黄色油状物質 (4 91 mg, 収率 77.0 %)を得た。

1H-刚 R (300MHz, GDGI3, TMS, r.t. , 5 /ppm) 1.44(s, 9H， i-Bu) , 3.24 (d, 2 H, m-CH₂) ， 3.44 (t, 2H, -OCH^OS-) , 3.62 (t, 2H, -Ο0Η₂β¾θε-) ， 4.34 ( t, N ArCH) ， 7.33(m, 5H, ArH)

ESI-TOF (+) ： [ + Na ]⁺ = 382.2

(5) [2- (2-ョード-ェトキシ)- 2-フヱニル-ェチル] -力ルバミン酸 tert-ブチルエステル（化合物）の合成

50 mlナス型フラスコに、化合物互 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン 10 ml、 Nal 1.0 g (6.67 mmol)を加えて 2時間還流した。 Nal をろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (Si0₂， /7"^キサン：酢酸ェチル = 1 ： 1 v/v) で精製し、黄色油状化合物（104mg, 収率 93.99 %)を得た。

1H-NMR (270MHz, CDCI₃, TMS, r. t. , 5/ppm) 1.45 (s, 9H, i^Bu) , 3.22 (t, 2 H， I二 CH₂) ， 3.49 (d, 2H, m-CH₂) , 3.67 (t, 2H， -0CH₂) , 4.43 (t, 1H, ArCH) , 7.34 (m, 5H, ArH) ESI-TOF (+) ： [M + Na]⁺ = 413.9

(6) [2- (2- tert-ブトキシカルポニルァミノ- 1-フエ二ル-ェトキシ） -ェチル]-卜リエチル -アンモニゥ厶ヨウ化物（化合物 7)の合成

Boc、八

6

50 mlナス型フラスコに、化合物 350 mg (0.90 mmol)、トルエン 8.75 mし TEA 1.75 ml (17.33 mmol)を加えて、 80 °Cで 24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー（Si 0₂，クロ口ホルム：メタノール =7： 1 vA で精製し、赤黄色固体物質 (383mg, 収率 66.70%)を得た。

1H-NMR (300MHz, CDC 13, TMS, r. t. , <5/ppm) 1.42 (t, 9H, QW₂-GH) , 1.48 (s, 9H, i-Bu), 3.53 (q, 6H， NR₃— C〃， 3.70 (t, 2H, -00Η₂β¾Ν-) , 3.72 (d, 2H， N W-GH2) , 3.95 (t, 2H, -QCH^ -) , 4.63 (t, 1H， ArCH) , 7.35 (m, 5H, ArH) ESI-TOF (+) ： [ M ]⁺ = 365.2

(7) 化合物 8の合成

8

30 mlナス型フラスコに化合物 20.50 g (1.02 國 ol)、 TFA ( トリフルォロ酢酸） 0.50 mし塩化メチレン 10.0 ml を加え、室温で 30分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、 THF 20.0 mU TEA 0.10 g (1.0

2 國 ol)、 BOP 0, 10 g (1.02 mmol)、 4 -プロモメチルァセチル安息香酸 0.25 g (

1.02 mmol)を加え室温で 24 時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィ一で精製し、目的化合物を得た。

実施例 5 プローブの合成（その 5)

下記のスキームに従い、 R として第四級ァミン、 R²として -G0GH0 を有する上記化合物を合成した。

スキーム

(1) フエニル-（2-トリメチルシラニルォキシ-ェトキシ)-ァセトニトリル (化合物 2) の合成

1 2

30 mlナス型フラスコに 2-フエニル -1,3-ペンタジオン（化合物 1) 3.0 g (19. 9 mmol) を加え氷浴につけた後、 TMSCN 2.1ml (21.43 mmol), Znl₂ 0.3 g (0.94 國 ol)を加え、室温で 2 時間攪拌した。反応溶液にジェチルエーテルを加え、水で洗浄後、 MgS0₄を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質 (4.17g，収率 83.2 %)を得た。

¹H-NMR (270MHz, CDC 13, TMS, r. ΐ. , 5/ppm) 0.15 (s, 9H， SiCH₃) , 3.80 (t, 2H， -OC/Z^OSi-) , 4.11 (t, 2H, -OCH₂C iOSi-) , 5.39 (s, 1H, ArCH) , 7.45 (m, 5H, ArH) ESI-T0F (+) ： [ + Na ]⁺ = 272.0

(2) 2- (2-ァミノ- 1-フエ二ル-ェトキシ)-エタノール（化合物さ)の合成

100 ml三口フラスコに、化合物 2 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて 1 M BH₃ ' THF溶液 30ml をゆっくりと加えた。氷浴中で 30分間、室温で 4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、 1N HGI水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水 20ml を加え、 NaOH水溶液を加え pH 10とした。酢酸ェチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無色オイル状の化合物 (650mg，収率 89.5 %)を得た。

1 H-NMR (300MHz, CDCI3, TMS, r. t. , δ /ppm) 2.95 (d, 2H, ΝΗ₂-β¾») , 3.65 (t, 2Η, -0C/iCH20H) , 3.75 (t, 2H, -00Η₂β¾ΟΗ) , 4.46 (t, 1Η, ArCH) , 7.32 (m, 5H, ArH) ESI-T0F (+) ： [ M + H ]+ = 182.0

(3) [2- (2-ヒドロキシ-ェトキシ）- 2-フエ二ル-ェチル] -力ルバミン酸 tert-ブチルエステル（化合物 4)の合成

100 ml二口フラスコに、化合物 3 1.40 g (7.70 國 ol)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥 THF 55 ml 、 TEA 0.78 g (7.69 mmol), ジ -tert -プチル-ジ力一ボネ一卜 1.68 _g (7.70 mmol)を加え、室温で 2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（Si0₂、クロ口ホルム）で精製し、黄色油状化合物（1. 30g, 収率 59.9 %)を得た。

¹H—剛 R (300MHz, CDCI₃, TMS, に t.， S/ppm) 1.48 (s, 9H, ί-Bu) , 3.24 (d, 2H， N -C/j) ， 3.49 (t, 2H, -0β¾0Η₂0Η) , 3.73 (t, 2H, -OCH₂i7 iOH) , 4.42 (t,

1H， ArCH) , 7.33 (m, 5H, ArH)

ESI-T0F (+) ： [ M + Na ]⁺ = 304.0

(4) メタンスルホン酸 2 - (2-tert -ブトキシカルボニルァミノ- 1 -フヱニル-ェ卜キシ) -ェチルエステル（化合物互)の合成

50 mlナス型フラスコに、化合物 500 itig (1.78 mmol) を加え窒素置換後、乾燥 THF 16 ml 、 TEA 0.5 ml (4.55 圆 ol) を加えて氷浴につけた。 MsGI 440 m g (3.84 mmol) を加え、室温で一時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、クロ口ホルムを加えて析出した沈殿をろ別後，ろ液を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィ一 (Si0₂, 酢酸ェチル： /7"へキサン = 2 : 1 v/v) で精製し、黄色油状物質 (4 91mg, 収率 77.0 %)を得た。

¹H-N R (300MHz, CDGI3, TMS, r. t. , δ /ppm) 1.44 (s, 9H, 卜 Bu) , 3.24 (d, 2 H,

， 4.34 ( t， 1H, ArCH) ， 7.33 (m, 5H, ArH)

ESI-TOF (+) ： [ M + Na ]+ = 382.2

(5) [2- (2-ョード -ェトキシ）- 2-フ： c二ル-ェチル] -力ルバミン酸 tert-ブチルエステル（化合物 6)の合成

50 mlナス型フラスコに、化合物 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン 10 ml、 Nal 1.0 g (6.67 mmol)を加えて 2時間還流した。 Nalをろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (Si0₂， /7" ^キサン：酢酸ェチル = 1 ： 1 v/v) で精製し、黄色油状化合物（104mg，収率 93.99 %)を得た。

1H-NMR (270MHz, CDC 13, TMS, r. t. , <5 /ppm) 1.45(s, 9H, Bu) , 3.22 (t, 2 H, l-GH₂) , 3.49 (d, 2H, \~0Η₂) , 3.67 (t, 2H, — 0CH₂) , 4.43 (t, 1H, ArCH) ， 7.34 (m, 5H, ArH) ESI-TOF (+) ： [ M + Na ]⁺ = 413.9

(6) [2-(2- tert-ブトキシカルボニルァミノ- 1-フエ二ル-ェトキシ)-ェチル] -トリエチルアンモニゥムヨウ化物（化合物 7)の合成

Boc、八

6 7

50 mlナス型フラスコに、化合物旦 350 mg (0.90 mmol), トルエン 8.75 ml、 TEA 1.75 ml (17.33 mmol)を加えて、 80 °Cで 24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー（S i 0₂，クロ口ホルム：メタノ一ル =7： 1 v/v)で精製し、赤黄色固体物質 (383mg, 収率 66.70%)を得た。

1H-NMR (300MHz, CDC 13, TMS, r. t. , <5/ppm) 1.42 (t, 9H, GH₂- β¾¾ ， 1.48 (s, 9H, ^Bu), 3.53 (q, 6H, NR₃ - C〃， 3.70 (t, 2H, -00H₂CH^i-) , 3.72(d, 2H, N H-CH₂) , 3.95 (t, 2H, -0β¾0Η₂Ν-), 4.63 (t, 1H, ArCH) , 7.35 (m, 5H， · ArH) ESI-TOF (+) ： [ M ]⁺ = 365.2

(7) 化合物 8の合成

8

30 mlナス型フラスコに化合物 20.50 g (1.02 画 ol)、 TFA 0.50 mし塩化メチレン 10.0 ml を加え、室温で 30分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、 THF 20.0 mk TEA 0.10 g (1.02 mmol), BOP 0.10 g (1.02 mmol), 4 -プロモメチルァセチル安息香酸 0.25 g (1.02 mmol)を加え室温で 24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。

(8) 化合物の合成

20 mlナス型フラスコに化合物 0.25 g (0.41 画 ol)、 D S0 5.0 ml を加え、室温で 2時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し目的化合物を得た。実施例 6 プローブの合成（その 6)

下記のスキームに従い、 R¹として第四級ァミン、 R²として- CH₂CH₂NH₂ を有する上記化合物を合成した。

4

(1) フエニル -(2-トリメチルシラニルォキシ-ェトキシ)-ァセトニ卜リル（化合物 2) の合成

1 2

30 mlナス型フラスコに 2-フエニル- 1，3-ペンタジオン（化合物 1) 3.0 g (19. 9 mmol) を加え氷浴につけた後、 TMSCN 2.1ml (21.43 mmol)、 Znl₂ 0.3 g (0.94 nrniol)を加え、室温で 2 時間攪拌した。反応溶液にジェチルエーテルを加え、水で洗浄後、 M_gS0₄を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質 (4.17g, 収率 83· 2 %)を得た。

¹H—圖 R (270MHz, GDCI₃, TMS, t. , (5/ppm) 0.15(s, 9H, S1CH3) , 3.80 (t, 2Η， -OCZ^OSi-) , 4.11 (t, 2Η， -OCH₂i7 iOSi-) , 5.39(s, 1Η, ArCH) ， 7.45 (m, 5H, ArH) ESI-T0F (+) ： [ M + Na ]⁺ = 272.0

(2) 2 - (2-ァミノ- 1-フエ二ル-ェトキシ) -エタノール（化合物さ）の合成

100 ml 三口フラスコに、 .化合物 2 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて 1 M BH₃ - THF 溶液 30ml をゆつくりと加えた。氷浴中で 30分間、室温で 4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、 1N HGI水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水 20ml を加え、 NaOH水溶液を加え pH 10とした。酢酸ェチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリゥムで乾燥後、無色オイル状の化合物 (650mg，収率 89.5 %)を得た。

¹H-剛 R (300MHz, CDCI3, TMS, t, , <5/ppm) 2.95 (d, 2H, ΝΗ₂-ύ^, ?) , 3.65 (t, 2H, -0fi¾CH₂0H) , 3.75 (t, 2H, — OGH₂i5¾OH) , 4.46 (t, 1H, ArCH) , 7.32 (m, 5H， ArH) ESI-T0F (+) ： [ M + H ]⁺ = 182.0

(3) [2- (2-ヒドロキシ -ェトキシ)- 2-フエ二ル-ェチル] -力ルバミン酸 tert-ブチルエステル（化合物 4)の合成

、

Hゥ N OH Boc-HN OH di-ierf-butyl aicarbonate

TEA, THF さ 4

100 ml二口フラスコに、化合物 3 1.40 g (7.70 mmol)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥 THF 55 ml 、 TEA 0.78 g (7.69 謹 ol)、ジ- tert-ブチル-ジカーポネート 1.68 g (7.70 mmol)を加え、室温で 2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（Si0₂、クロ口ホルム）で精製し、黄色油状化合物（1. 30g, 収率 59.9 %)を得た。

¹ H-NMR (300MHz, CDCI3, TMS, r. t. , δ /ppm) 1.48(s, 9Η, t-Bu) , 3.24 (d, 2H， m-GH₃) , 3.49 (t, 2H， -0^Η₂0Η) , 3.73 (t, 2H, -OCH₂i7 iOH) , 4.42 (t,

1H， ArCH) ， 7.33 (m, 5H， ArH)

ESI-T0F (+) ： [ M + Na ]+ = 304.0

(4) メタンスルホン酸 2 -（2-tert -ブトキシカルボニルァミノ- 1-フエ二ル-ェトキシ) -ェチルエステル（化合物 5)の合成

50 mlナス型フラスコに、化合物 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン 10 mU Nal 1.0 g (6.67 mmol)を加えて 2時間還流した。 Nal をろ別後, 溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (Si0₂， ""^キサン：酢酸ェチル = 1 ： 1 v/v) で精製し、黄色油状化合物（104tng, 収率 93.99 %)を得た。

1H-NMR (270MHz, CDC 13, TMS, r. t. , <5/ppm) 1.45 (s, 9H, i^Bu) , 3.22 (t, 2 H，卜 GH₂) ， 3.49 (d, 2H, NH-C J ， 3.67 (t, 2H， -0CH₂) , 4.43 (t, 1H, ArCH) , 7.34 (m, 5H, ArH) ESI-T0F (+) ： [ M + Na ]⁺ = 413.9

(5) [2- (2-ョード-ェトキシ) -2-フエ二ル-ェチル] -力ルバミン酸 tert-ブチルエステル（化合物 )の合成

5 6

50 mlナス型フラスコに、化合物 100 mg (0.28 tranol)を加え、窒素置換後、アセトン 10 mし Nal 1.0 g (6.67 mtnol)を加えて 2時間還流した。 Nal をろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (Si0₂， A7" ^キサン：酢酸ェチル = 1 ： 1 v/v) で精製し、黄色油状化合物（104mg, 収率 93.99 %)を得た。

¹H -剛 R (270MHz, CDCI₃, TMS, r. t. , ά/ppm) 1.45 (s, 9Η, Z-Bu) , 3.22 (t, 2 H, I-CH2) ， 3.49 (d, 2H, m-0H₂) , 3.67 (t, 2H, 一 0GH₂) , 4.43 (t, 1H, ArCH) , 7.34 (m, 5H, ArH) ESI-T0F (+) ： [ M + Na ]⁺ = 413.9

(6) [2- (2- tert-ブトキシカルポニルァミノ-卜フエ二ル-ェトキシ）-ェチル] -トリエチルアンモニゥ厶ヨウ化物（化合物 7)の合成

6 7

50 mlナス型フラスコに、化合物 6 350 mg (0.90 mmol)、トルエン 8.75 ml、 TEA 1.75 ml (17.33 mtnol)を加えて、 80 °Cで 24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー（Si 0₂, クロ口ホルム：メタノール =7： 1 v/v)で精製し、赤黄色固体物質 (383mg，収率 66.70%)を得た。

¹H -關 R (300MHz, GDGI3, TMS, r. t. , δ /ppm) 1.42 (t, 9H, GH₂ - β¾)， 1.48 (s,

9H， i-Bu), 3.53 (q, 6H, NR₃— i ^)， 3.70 (t, 2H, -00Η₂^-) , 3.72(d, 2H, N

W-CH₂) , 3.95 (t, 2H, — 0fl¾CH₂N— ), 4.63 (t, 1H， ArGH) , 7.35 (m, 5H， ArH)

ESI-T0F (+) ： [ M ]+ = 365.2

(7) 化合物 8の合成

30 ml ナス型フラスコに化合物 20.50 g (1.02 mmol)、 TFA 0.50 ml、塩化メチレン〗 0.0 ml を加え、室温で 30分間撹袢した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、 THF 20.0 mU TEA 0.10 g (1.02 mmol)、 BOP 0.10 g (1.02 iranol)_N ? "ァラニン 0.10 g (1.02 議 o I〉を加え室温で 24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。実施例 7 プローブの合成（その 7)

8

下記のスキームに従い R¹として第四級ァミン、 R²として

を有する上記化合物を合成した。

(1 ) フエニノレー (2—トリメチルシラニルォキシ―ェトキシ)ーァセトニトリル（化合物 2) の合成

1 2

30 mlナス型フラスコに 2-フエニル- 1,3-ペンタジオン（化合物 1) 3.0 g (19. 9 mmol) を加え氷浴につけた後、 TMSCN 2.1ml (21.43 画 ol)、 Znl₂ 0.3 g (0.94 画 ol)を加え、室温で 2 時間攪拌した。反応溶液にジェチルエーテルを加え、水で洗浄後、 MgS0₄を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質 (4.17_g, 収率 83.2 %)を得た。

¹H-NMR (270MHz, CDC 13, T S, r. t. , <5/ppm) 0.15(s, 9H, S1GH3) , 3.80 (t,

2H, — 0 〃 ^GH₂0Si-) ， 4.11 (t, 2H, -0CH₂C i0Si-) ， 5.39 (s, 1H, ArGH) , 7.45

(m, 5H， ArH) ESI-TOF (+) ： [ M + Na ]+ = 272.0

(2) 2- (2-ァミノ- 1-フエ二ル-ェトキシ) -エタノール（化合物さ)の合成

NCゝ丫丫 O OTTMSS 八 O へ

人 BH₃-THF

" 入

2

3

100 ml三口フラスコに、化合物 2 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて 1 M BH₃■ THF溶液 30ml をゆつくリと加えた。氷浴中で 30分間、室温で 4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、 1N HCI水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水 20ml を加え、 NaOH水溶液を加え pH 10とした。酢酸ェチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無色オイル状の化合物 (650mg，収率 89.5 %)を得た。

¹H-刚 R (300MHz, CDCI3, TMS, r. t. , δ /pp ) 2.95 (d, 2H, \₂-0Η₂) ' 3.65 (t, 2H, -0CH^ ₂0H) , 3.75 (t, 2H， — 0GH₂i?〃OH) , 4.46 (t, 1H， ArGH) ， 7.32(m, 5H, ArH) ESI-TOF (+) ： [ M + H ]⁺ = 182.0

(3) [2- (2-ヒドロキシ-エトキシ) -2-フエ二ル-ェチル] -力ルバミン酸 tert-ブチルエステル（化合物）の合成

100 ml 二口フラスコに、化合物 1.40 g (7.70 mmol)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥 THF 55 ml 、 TEA 0.78 g (7.69 mmol)_s ジ- tert-ブチルジカーボネート 1.68 g (7.70 画 ol)を加え、室温で 2 時間攪袢した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（Si0₂、クロ口ホルム）で精製し、黄色油状化合物（1. 30g, 収率 59.9 %)を得た。

¹H-刚 R (300MHz, GDCI3, TMS, r. t. , δ/ppm) 1.48 (s, 9Η, ^Bu) , 3.24 (d, 2H, H -CHj) , 3.49 (t, 2H, -0CH^H₂0]) , 3.73 (t, 2H, -00Η₂^Η) , 4.42 (t,

1H， ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)

ESI-T0F (+) ： [ M + Na ]⁺ = 304.0

(4) メタンスルホン酸 2 - (2-tert-ブトキシカルボニルァミノ- 1-フエ二ル-ェトキシ) -ェチルエステル（化合物 )の合成

50 mlナス型フラスコに、化合物 4500 mg (1.78 隱 ol) を加え窒素置換後、乾燥 THF 16 ml 、 TEA 0.5 ml (4.55 mmol) を加えて氷浴につけた。 MsCI 440 m g (3.84 mmol) を加え、室温で一時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、クロ口ホルムを加えて析出した沈殿をろ別後，ろ液を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー (Si0₂, 酢酸ェチル： n~へキサン = 2 : 1 v/v) で精製し、黄色油状物質 (4

91 mg, 収率 77.0 %)を得た。

¹H-NMR (300MHz, CDC 13, TMS, r.t. , (5/ppm) 1.44 (s, 9H, 卜 Bu) ， 3.24 (d, 2 H, m-CH₂) ， 3.44 (ΐ, 2H, -QGH^H₂0S-) , 3.62 (t, 2H， -OG^CH^S-) ， 4.34 ( t, 1H, ArCH) , 7.33 (m, 5H, ArH)

ESI-TOF (+) ： [ M + Na ]+ 二 382.2

(5) [2- (2-ョード -エトキシ） -2-フエ二ル-ェチル] -力ルバミン酸 tert -ブチルエステル（化合物の合成

50 mlナス型フラスコに、化合物互 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン 10 mし al 1.0 g (6.67 隱 ol)を加えて 2時間還流した。 Nal をろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (Si0₂， " キサン：酢酸ェチル = 1 ： 1 v/v) で精製し、黄色油状化合物（10½g, 収率 93· 99 %)を得た。

1H-NMR (270MHz, CDC 13, TMS, r. t. , <5/ppm) 1.45 (s, 9H, 卜 Bu) ， 3.22 (t, 2 H，卜 GH₂) ， 3.49 (d, 2H, NH-C/Z) , 3.67 (t, 2H, -0CH₂) ， 4.43 (t, 1H, ArGH) , 7.34 (m, 5H, ArH) ESI-TOF (+) ： [ M + Na ]⁺ = 413.9

(6) [2-(2-tert-ブトキシカルポニルァミノ- 1-フエ二ル-ェトキシ) -ェチル]-トリェチルアンモニゥムョゥ化物（化合物 7)の合成

6

50 mlナス型フラスコに、化合物 350 mg (0.90 mmol)、トルエン 8.75 mし TEA 1.75 ml (17.33 隱 ol)を加えて、 80 °Cで 24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー (Si0₂，クロ口ホルム：メタノール =7： 1 vA/)で精製し、赤黄色固体物質 (383mg，収率 66.70%)を得た。

1H-NMR (300MHz, CDC 13, TMS, t. , 5/ppm) 1.42 (t, 9H, GH2-CH3) , 1.48 (s, 9H, t-B ) , 3.53 (q, 6H， NR₃ - 6"〃）， 3.70 (t, 2H, -00Η₂β¾ -) ， 3.72(d， 2H, NH-C , 3.95 (t, 2Η, -0β¾ΟΗ₂ -) , 4.63 (t, 1Η, ArCH) , 7.35 (m, 5Η， ArH) ESI-TOF (+) ： [ M ]⁺ = 365.2

(7) 化合物 8の合成

8

30 mlナス型フラスコに化合物 20.50 g (1.02 國 ol)、 TFA 0.50 ml、塩化メチレン 10.0 ml を加え、室温で 30分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、 THF 20.0 ml、 TEA 0.10 g (1.02 mmol), BOP 0.10 g (1.02 謹 ol)、 2-ブロモ -4-メチルペンタン酸 0.20 g (1.02 mmol)を加え室温で 24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。

実施例 8 プローブの合成（その 8)

4

下記のスキームに従い、 R¹として第四級ァミン、 R²としてシクロデキストリン（ダルコビラノース単位の数 7) を有する上記化合物を合成した。 Ac2。， Pyridine

Ac₂0, Pyridine

2

100 mlナス型フラスコにモノ- 6 -デォキシ- 6 -ァミノ- β-シクロデキストリン（1

) 2.0 g (1.59画 ol)、無水酢酸 20.0 mしピリジン 10.0 ml を加え、室温で 24 時間撹拌した。反応溶液を冷水にあけ、エーテルで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、目的化合物を得た。

(2) 化合物の合成

2

3

100 ml三口フラスコに化合物 2 1.0 g (0.37 mmol)、ヨウ化メチル 0.26 g (1.85 陽 l)、トリェチルァミン 0.05 g (0.40 隱 ol)、乾燥 DMF 20.0 ml を加え、窒素気流下、室温で 24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、再沈殿操作を行い目的化合物を得た。

(3) 化合物 £の合成

3

4

50 mlナス型フラスコに化合物 3 1.0 g (0.35 mmol) 、 1.0 M NaOH水溶液 5· 0 ml、エタノール 20.0 ml を加え、 5時間還流した。溶媒の大部分を減圧留去後、水 20 ml を加え、 1N HCIで酸性にした。溶媒を減圧留去後、再沈殿操作により精製し、目的化合物を得た。

実施例 9 プローブの合成（その 9)

下記のスキームに従い、 R¹として第四級ァミン、 R²として一 ONH₂を有する上記化合物を合成した。 -CI, TEA

HOOC ONH₂-1/2HCI

H₂0， Ether HOOC ONH-2

2

(1) 化合物 2の合成

Z-CI, TEA

HOOC ONH₂-1/2HCI

H₂0， Ether HOOC ONH-Z

1 2

100 mlナス型フラスコに、化合物 13.0 g (27.5 闘 ₀|)、水 30.0 mしトリェチルァミン 3.46 g (34.3 mmol)を加え、氷浴につけた。 Zクロリド 4.8 g (27.5 mmol)をジェチルエーテル 10.0 mlに溶解し、滴下ロートを用いて加えた。氷浴下で 30分間、室温に戻して 7時間撹拌した。酢酸ェチルで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、カラムクロマトグラフィー (Si0₂， CHCI₃ ：酢酸ェチル = 2 ： 3 v/v)で精製し、目的化合物を得た。

(2) 化合物 3の合成

100 ml三口フラスコに、化合物 2 2.0 g (10.3 mmol)、乾燥塩化メチレン 50. 0 mし卜リエチルァミン 1.1 g(11.0 議 ol)を加え、氷浴につけた。；0"キシリレンジァミン 1.4 g (11.0 國 ol)及び BOP試薬 4.8 g(11.0 画 ol)を加え、氷浴下で 30分間、室温に戻して 12時間撹拌した。水を加えて反応を停止後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィ一 (Si0₂, CHCI3 ：酢酸ェチル = 1 : 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。

(3) 化合物 4の合成

100 mlナス型フラスコに化合物 2.0 g (6.0 國 ol)、トルエン 50.0 mlおよびヨウ化メチル 8.5 g (60.0 mmol)を加え 80 °Gで加熱撹拌した。析出した沈殿を分取後、トルエンで洗浄し、目的化合物を得た。 (4) 化合物 5の合成

100 mlナス型フラスコに化合物 42.0 g (5.0 mmol)、エタノールを加え窒素置換、および水素置換した。パラジウムカーボン 0.1 gを加え、室温で 5時間撹拌した。パラジウムカーボンを濾別後、溶媒を減圧留去し、目的化合物を得た。実施例 1 0 プローブの合成（その 1 0)

3

下記のスキームに従い、 R¹として第四級ァミン、 R²として一 NH N H₂を有する上記化合物を合成した。

(1) 化合物の合成

100 mlナス型フラスコに化合物 13.0 g (19.8 瞧 ol)、アセトン 50.0 ml、ョゥ化メチル 14.1 g (100.0 隱 ol)、炭酸カリウム 6.9 g (50· 0 mmol)を加え、窒素気流下、 24時間還流した。炭酸カリウムを濾別後、溶媒を減圧留去した。反応混合物にクロロホルムを加え、析出した沈殿を分取した。クロロホルムで洗浄し、目的化合物を得た。

(2) 化合物 3の合成

100 mlナス型フラスコに化合物 2.0 g (6.25 mmol)、エタノール 30.0 mしヒドラジン 0.22 g (7.0 mttiol)を加え、室温で 5時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、目的化合物を得た。

実施例 1 1 エレクトロスプレーイオン化質量分析

(1) 試料化合物とプローブの結合

下記反応式に示すように、実施例 1で合成したプローブ（化合物丄）と、試料化合物（化合物）とを結合した。この反応は、試験管に 10.0 _mMの化合物: Lおよび化合物のァセトニトリル（または THF)溶液をとり、両者を混合後、室温で 30分間撹拌することにより行った。

2

(2) エレクトロスプレーイオン化質量分析

(1)で得られた反応産物を 1.0 Mに希釈後、 Appl ied Biosystems社製の ESI - T0F質量分析計 (Mariner) を用いて測定した。用いた質量分析計の構成を図 3に示す。シリンジポンプより 10.0 μΐ / minの流速で、常時移動溶媒 (Me0H、水等 )を流した。試料溶液はマイクロシリンジを用いて、インジェクターから導入した。試料溶液は移動溶媒の流れに沿って、質量分析計に向かう。質量分析計の設定条件は以下の通りであった。

スプレーチップ電位（Spray tip potential) ： 3450 V

ノズル電位（Nozzle Potential) ： 184 V

Quad RF電圧（Quad RF voltage) ： 1000 V

噴霧器ガス流速（Flow rate of Nebulizer gas) (N₂) ： 0.25 し/分

補助ガス流速（Flow rate of Auxi I iary gas) ( ) : 1.0 L/分

カウンタ一流温度 (Temperature of the counter stream) ： 160 °G

測定結果を図 1に示す。なお、比較のため、プローブのみを 1.0/ Mに希釈後、同様にして質量分析を行った。結果を図 2に示す。

図 1及び図 2から明らかなように、試料化合物とプローブとの結合物は、プローブ単独の場合とは異なる位置に鋭いピークを示した。これにより、上記方法により、エレクトロスプレーイオン化質量分析が高感度、高精度に行うことができることが明らかになった。

Claims

請求の範囲

1. 一般式 [I]

R²— A— R¹ [I]

(但し、式中、 R¹は溶媒中でイオンとなるイオン性官能基、 R²は他の物質と結合し得る構造、 Aは任意のスぺーサ一部を示す）

で表される液状試料の質量分析用プローブ。

2. R²は、他の官能基と反応して共有結合し得る官能基である請求項 1記載のプローブ。

3. R¹は、ァミン、カルボン酸若しぐはその塩、スルホン酸若しくはその塩、又は

(伹し、式中、 R'、 '及び ' 'は同一又は異なる任意の基）

である請求項 2記載のプロ一ブ。

4. R¹は、一般式 [II]

(但し、式中、 R³、 R⁴及び R⁵はそれぞれ独立に、水素又は任意の基を示す )

で表されるァミンである請求項 3記載のプローブ。

5. 前記一般式 [II]中、 R³、 R ⁴及び R ⁵はそれぞれ独立に、水素、ハロゲン又は炭素数 1〜 20の直鎖状若しくは分枝状アルキル基を示す）

で表される請求項 4記載のプローブ。

6. R²は SCN—、 CIOpS-, NOCOCH₂-

B r H₂C―、 C I OC—、 CH₃CH (N H ₂) 二 CH―、 - GH₂0NH₂- HG I . _NHゥ、一 NHNH₂、一 CH₂ I、

である請求項 2ないし 5のいずれか 1項に記載のプローブ。

7. Aは、疎水性部と親水性部を有する請求項 2ないし 6のいずれか 1項に記載のプローブ。

8. Aは下記一般式 [III]

-R⁶—

[ill]

Ar

(式中、 R⁶は炭素数 1〜20のアルキレン基であり、その構成単位である — CH₂—の 1個以上かつ半数以下が一 0—、一 CO—及び一 N H—から成る群より選ばれる 1又は 2以上の基であってもよく、 1又は 2以上の炭素数 1〜20 のアルキル基で置換されていてもよく、 A rは、 1ないし 5個の炭素数 1〜20 のアルキル基で置換されていてもよい芳香環である）

で表される請求項 7記載のプローブ。

9. Aは、下記一般式 [IV]

(但し、式中、 R⁷は存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数 1〜

6のアルキレン基を示し、 R⁸は、式中に示されるベンゼン環によって任意の水素が置換された炭素数 1〜 6のアルキレン基を示す）

又は下記一般式 [V]

(ただし、式中、 R⁷及び R⁸は、式 [IV]と同じ意味を示し、 R⁹は、存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数 1〜6のアルキレン基を示す）で表される請求項 8記載のプローブ。

1 0. 分子量が 1 000以下である請求項 2ないし 9のいずれか 1項に記載のプローブ。

1 1. エレクトロスプレーイオン化質量分析用プローブである請求項 2ないし 1 0のいずれか 1項に記載のプローブ。

1 2. R²は、一般式 [VI]

(ただし、 Xはハロゲンを示す）、

又は、一般式 [VI I]

-fCH₂)^NH₂ [νπ]

(ただし、 ηは 1 5の整数を示す）

で表される基である請求項 2記載のプローブ。

1 3. R²は、光学活性を有する基である請求項 2記載のプロ一'

1 4. R²は、一般式 [VI II]

(ただし、 Xはハロゲン、 R ¹⁰は炭素数 1〜 5のアルキル基を示す）で表される基である請求項 2記載のプローブ。

1 5. R²は、二本鎖核酸にインター力レートする構造を有する請求項 1記載のプローブ。

1 6. R²は、一般式 [IX]

(ただし、 ^{1 1}及び ^{1 2}は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、炭素数 1 ~5 のアルキル基又は炭素数 1〜 5の Ν， Ν-ジアルキルァミノ基を示す）

で表される請求項 1 5記載のプローブ。

1 7. R²は、他の物質を包接し得る環状構造を有する請求項 1記載のプロ一ブ。

1 8. R²は、一般式 [X]

(ただし、 R¹³は水酸基、カルボキシル基又は炭素数 1〜 5のアルキル基、 m は 5〜 9の整数を示す）

で表される請求項 1 7記載のプローブ。

1 9. R²は、一般式 [XI]

(ただし、 R¹⁴及び R¹⁵はそれぞれ独立に水素、ハロゲン又は炭素数 1〜5のアルキル基、 R¹⁶は炭素数 1〜 5のアルキル基、又は末端にカルボキシル基、エステル基若しくはアミド基を有する炭素数 1〜 5のアルキル基、 pは 3〜7の整数を示す）

で表される請求項 1 7記載のプローブ。

20. R¹は、ァミン、カルボン酸若しくはその塩、スルホン酸若しくはその塩、又は

R'

I

一 B— R"

(但し、式中、、 R' '及び R'''は同一又は異なる任意の基）

である請求項 1 2ないし 1 9のいずれか 1項に記載のプローブ。

21. R¹は、一般式 [II] R³

~ N⁺-R⁴ [ II ]

R⁵

(但し、式中、 R³、 R⁴及び R⁵はそれぞれ独立に、水素又は任意の基を示す

)

で表されるァミンである請求項 20記載のプローブ。

22. 前記一般式 [II]中、 R³、 R ⁴及び R ⁵はそれぞれ独立に、水素、ハロゲン又は炭素数 1〜 20の直鎖状若しくは分枝状アルキル基を示す）

で表される請求項 21記載のプローブ。

23. Aは、疎水性部と親水性部を有する請求項 1 2ないし 22のいずれか 1 項に記載のプローブ。

24. Aは下記一般式 [III]

—— R⁶—

| 【川〗

Ar

(式中、 R⁶は炭素数 1〜20のアルキレン基であり、その構成単位である — CH₂—の 1個以上かつ半数以下が— 0—、 —CO—及び一 NH—から成る群より選ばれる 1又は 2以上の基であってもよく、 1又は 2以上の炭素数 1〜20 のアルキル基で置換されていてもよく、 A「は、 1ないし 5個の炭素数 1〜20 のアルキル基で置換されていてもよい芳香環である）

で表される請求項 23記載のプローブ。

25. Aは、下記一般式 [IV]

(但し、式中、 R⁷は存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数 1〜 6のアルキレン基を示し、 R⁸は、式中に示されるベンゼン環によって任意の水素が置換された炭素数 1〜 6のアルキレン基を示す）

又は下記一般式【V〕

(ただし、式中、 R⁷及び R⁸は、式 [IV]と同じ意味を示し、 R⁹は、存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数 1 ~ 6のアルキレン基又はフエ二レン基を示す）

で表される請求項 24記載のプローブ。

26. Aは、一 R⁶— （ただし、 R⁶は、一般式 [III]における R⁶と同じ意味を示す）又は一 R⁶— A r— R⁶'— （ただし、 R⁶及び A rは一般式 [III]における R⁶及び A rとそれぞれ同じ意味を示し、 R⁶'は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には一般式 [III]における R⁶と同じ意味を示す（ただし、式中の R⁶と R⁶'とは同一であっても異なっていてもよい））

である請求項 1ないし 22のいずれか 1項に記載のプローブ。

27. Aは、下記一般式 [XII]

― R

(ただし、 1¾^{1 7}及び1^^{1 8}は、互いに独立に炭素数 1〜6のアルキレン基を示し, R¹⁹は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には炭素数 1〜6のアルキレン基を示す）

又は下記一般式 [XI II]

(ただし、 R²⁰及び R²¹は、互いに独立に炭素数 1〜6のアルキレン基を示し、 R ²²は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には炭素数 1〜 6のアルキレン基を示す）

で表される請求項 26記載のプローブ。

28. 分子量が 1 000以下である請求項 1 2ないし 27のいずれか 1項に記載のプローブ。

2 9 . エレクトロスプレーイオン化質量分析用プローブである請求項 1 2ないし 2 8のいずれか 1項に記載のプローブ。

3 0 . 請求項 1ないし 2 9に記載のプローブと、液状試料中の試料化合物とを結合させ、得られた結合物を質量分析にかけることを含む質量分析方法。

3 1 . 請求項 1ないし 2 9に記載の化合物の、液状試料の質量分析用プローブを製造するための使用。