JP4212353B2 - 液状試料の質量分析用プローブ - Google Patents
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、液状試料の質量分析のためのプローブに関する。
【０００２】
背景技術
現在、最も高感度、高精度に検体中の試料を定量することができる方法として質量分析測定法が挙げられる。質量分析法を用いて液状試料を測定するにあたり重要なことは、化合物の性質に合わせたイオン化法を選択することである。例えば化合物の不安定要因によって使い分ける場合、大きく分けてハードイオン化とソフトイオン化の２種類に分けられる。前者の方法としては、電子イオン化法、化学イオン化法及び大気圧イオン化法が挙げられ、後者の方法としてはエレクトロスプレーイオン化法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法及び高速原子衝撃イオン化法が挙げられる。
【０００３】
一方、最近では高速液体クロマトグラフィーで分離した試料をオンラインで質量分析を用いて同定を行う手法(LC/MS)が化学、生物学の分野で頻繁に利用されている。この場合、液体クロマトグラフィーと相性の良いイオン化法は、キャピラリー先端から流出する溶液試料を直接イオン化する方法であるため、先に記した方法のうち、後者の方法が該当する。中でもエレクトロスプレーイオン化質量分析装置と高速液体クロマトグラフィーをオンラインで接続した装置は現在最も汎用されており、タンパク質、糖質をはじめとした生体に不可欠な物質から、近年問題とされている環境ホルモン物質の同定にその威力を十分に発揮している。エレクトロスプレーイオン化の場合、試料の分子イオンピークが検出されることは極めて低く、通常ナトリウムなどが加算された擬分子イオンピークとして観察されるか、あるいはLC/MSでは移動相に酢酸アンモニウム、ギ酸、酢酸などのプロトン性溶媒を混入することにより、試料のイオン化を助ける方法が採られている。
【０００４】
液状試料の質量分析の際のイオン化を助ける手段として、液体クロマトグラフィーの移動相にプロトン性溶媒を添加する手法がLC/MSでは一般的となっている。しかし、i)酢酸アンモニウムは負イオンモードの場合、試料のイオンとアンモニウムイオンがペアとなって感度が低下する、ii)トリフルオロ酢酸は正イオンモードの場合、サンプルイオンとトリフルオロ酢酸イオンがペアとなって感度が低下し、負イオンモードの場合、一部例外を除きイオン化を妨害する、iii)アセトニトリルでは必ず酸を添加しなければならない、またこの際、酢酸アンモニウムでは溶解しないので用いることができない、等の欠点も指摘されている。
【０００５】
発明の開示
従って、本発明の目的は、液状試料の質量分析の際のイオン化法において、移動相にプロトン性溶媒を添加することなく、試料を効率的にイオン化する手段を提供することである。
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、溶媒中でイオン化する基と、試料化合物中の官能基と反応して共有結合する官能基を１つの分子中に有する化合物をプローブとして用い、該プローブを試料化合物と共有結合させることにより、試料化合物を効率的にイオン化することができることに想到し、かつ、このようなプローブによりイオン化した試料化合物がエレクトロスプレー質量分析により高感度に定量できることを実験的に確認し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、 一般式[I]
Ｒ２−Ａ−Ｒ１ [I]
（但し、式中、Ｒ１は溶媒中でイオンとなるイオン性官能基、Ｒ２は他の官能基と反応して共有結合し得る官能基、Ａは下記一般式 [III]
【化２２−２】
（式中、Ｒ ６ は炭素数１〜２０のアルキレン基であり、その構成単位である
−ＣＨ ２ −の１個以上かつ半数以下が−Ｏ−、−ＣＯ−及び−ＮＨ−から成る群より選ばれる１又は２以上の基であり、１又は２以上の炭素数１〜２０のアルキル基で置換されていてもよく、Ａｒは、１ないし５個の炭素数１〜２０のアルキル基で置換されていてもよい芳香環である）
で表されるスペーサー部を示す）
で表される液状試料の質量分析用プローブと、液状試料中の試料化合物とを結合させ、得られた結合物を質量分析にかけることを含む質量分析方法（ただし、還元性オリゴ糖の還元末端にトリアルキル(p-アミノフェニル）アンモニウム塩を作用させて得られうるオリゴ糖を大気圧イオン化法によってイオン化する方法を除く）を提供する。
【０００８】
本発明のプローブを用いれば、エレクトロスプレーイオン化法において、移動相にプロトン性溶媒を添加することなく、試料を効率的にイオン化することができ、種々の試料について、高感度、高精度にエレクトロスプレーイオン化質量分析を行うことができる。
【０００９】
発明を実施するための最良の形態
本発明の液状試料のイオン化質量分析用プローブは、上記一般式[I]で表されるものである。一般式[I]において、Ｒ１は溶媒中でイオン化するイオン化基である。Ｒ１は、使用する溶媒中でイオン化される基であればいずれの基であってもよく、正に帯電するものでも負に帯電するものでもよい。Ｒ１の例として、アミン、カルボン酸若しくはその塩、スルホン酸若しくはその塩、
【００１０】
【化２３】
【００１１】
（但し、式中、R'、R''及びR'''は同一又は異なる本発明の効果に悪影響を与えない任意の基、好ましくは、水素、ハロゲン、又は炭素数１〜２０の直鎖状若しくは分枝状アルキル基）等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない（なお、本明細書において、「ハロゲン」は、特に断りがない限りフッ素、塩素、臭素及びヨウ素のいずれであってもよい）。これらのうち、アミンが好ましく、とりわけ、下記一般式[II]で表されるアミンが好ましい。
【００１２】
【化２４】
【００１３】
（但し、式中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に、本発明の効果に悪影響を与えない任意の基、好ましくは、水素、ハロゲン、又は炭素数１〜２０の直鎖状若しくは分枝状アルキル基）
【００１４】
上記一般式[I]中において、Ｒ２は、他の物質と結合し得る構造を示す。Ｒ２の好ましい一群の例として試料化合物中の官能基と反応して共有結合し得る官能基を挙げることができる。この場合、Ｒ２としては、試料化合物中の官能基と反応して共有結合し得る官能基であれば、いかなる官能基であってもよい。液状で質量分析により分析される試料は、タンパク質や糖等の生体物質である場合が多いので、これらに含まれることが多い官能基、すなわち、−ＮＨ２基、−ＳＨ基、−ＣＯＯＨ基、−ＯＨ基、−ＣＨＯ基等と反応して共有結合する官能基が好ましい。このような官能基の例として、ＳＣＮ−、ＣlＯ２Ｓ−、
【００１５】
【化２５】
【００１６】
【化２６】
【００１７】
ＢｒＨ２Ｃ−、ＣｌＯＣ−、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＣＨ２Ｉ、-CH2ONH2(-HCl)（塩酸塩であってもなくてもよい）、
【００１８】
【化２７】
【００１９】
【化２８】
【００２０】
を挙げることができる。これらの官能基と反応する試料化合物中の官能基(R') 及び該反応の結果形成される結合を下記表１に示す（なお、Ｒ２が−ＮＨ２の場合は、表１に示される、試料化合物中の官能基(R')が−ＮＨ２の場合のＲ２と表１に記載のように結合できる）。
【００２１】
【表１】
【００２２】
また、Ｒ２としては、ＣＨ３ＣＨ（ＮＨ２）＝ＣＨ−も好ましく採用することができる。この場合、２分子のプローブがＲ−ＣＨＯで表される試料化合物と次のように反応する。
【００２３】
【化２９】
【００２４】
好ましいＲ２として、さらに、一般式[VI]
【００２５】
【化３０】
（ただし、Ｘはハロゲンを示す）、
【００２６】
【化３１】
【００２７】
及び一般式[VII]
【００２８】
【化３２】
（ただし、ｎは１〜５の整数を示す）
で表される基を挙げることができる。一般式[VI]中、ハロゲンとしては、好ましくは臭素である。
【００２９】
上記一般式[VI]で示されるＲ２は、試料化合物中のシトシンと反応して次のように結合する。
【００３０】
【化３３】
【００３１】
（ただし、式中、Ｒは、例えばヌクレオチドや核酸の糖部分のような任意の基を示す）
【００３２】
このＲ２は、試料化合物中のシトシン部分と結合することができるので、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン二リン酸及びデオキシシチジン三リン酸並びにシトシンを含むＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸と結合できる。
【００３３】
Ｒ２が上記
【００３４】
【化３４】
【００３５】
の場合は、試料化合物中のグアニンと反応して次のように結合する。
【００３６】
【化３５】
【００３７】
（ただし、式中、Ｒは、例えばヌクレオチドや核酸の糖部分のような任意の基を示す）
【００３８】
このＲ２は、試料化合物中のグアニン部分と結合することができるので、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン二リン酸及びデオキシグアノシン三リン酸並びにグアニンを含むＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸と結合できる。
【００３９】
Ｒ２が上記一般式[VII]で示される基である場合は、試料化合物中のリン酸エステル部分と反応して次のように結合する（ただし、下記の例ではｎが２の場合について示す）。
【００４０】
【化３６】
【００４１】
なお、この反応式では、試料化合物がデオキシアデノシン一リン酸（すなわち、ヌクレオチド中の塩基がアデニンで、糖がデオキシリボース）の場合を示しているが、Ｒ２は、リン酸エステル部分と結合するので、塩基は、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルのようなアデニン以外の他の塩基であってもよいし、糖はデオキシリボースでもリボースでもよい。また、リン酸エステルの数は、上記反応式では１個であるが、Ｒ２は、末端のリン酸エステルと結合するので、縮合しているリン酸エステルの数は１個〜３個のいずれであってもよい。従って、一般式[VII]で示されるＲ２はあらゆる種類のヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸及びヌクレオシド三リン酸と結合することが可能である。さらに、核酸の末端には遊離のリン酸エステルが存在するので、一般式[VII]で示されるＲ２はＤＮＡやＲＮＡのような核酸と結合することも可能である。
【００４２】
また、Ｒ２が光学活性を有する基である場合には、光学活性を有する試料化合物と結合させることにより、特定の光学活性を有する試料化合物の測定が可能になり、また、試料化合物中の光学中心の絶対配置を決定することが可能になる。
【００４３】
光学活性を有するＲ２の好ましい例として、一般式[VIII]で表される基を挙げることができる。
【００４４】
【化３７】
【００４５】
（ただし、Ｘはハロゲン、Ｒ１０は炭素数１〜５のアルキル基を示す）
ハロゲンとしては、特に臭素が好ましい。
【００４６】
一般式[VIII]で表されるＲ２は、アミノ酸と反応して次のように結合する。
【００４７】
【化３８】
【００４８】
（ただし、式中、Ｒはアミノ酸の任意の側鎖を示す）
【００４９】
この場合、アミノ酸が、Ｄ体とＬ体の混合物（ラセミ体）であると、形成された結合物は互いにジアステレオマーの関係になる。この状態でLC/MS分析を行うことにより、単にESI等の質量分析法で高感度検出を行うことができるばかりでなくアミノ酸の絶対配置を決定することが可能となる。
【００６５】
一般式[I]中、Ａはスペーサー部である。Ａとして、疎水性部と親水性部を有するものを採用することにより、疎水性溶媒でも親水性溶媒でも用いることができ、汎用性が高まる。疎水性部としては、ベンゼン環のような芳香環を挙げることができ、親水性部としては、エーテル、アミン、ケトンを含む構造を挙げることができる。このようなＡは、下記一般式[III]で表される。
【００６６】
【化４２】
【００６７】
（式中、Ｒ６は炭素数１〜２０のアルキレン基であり、その構成単位である
−ＣＨ２−の１個以上かつ半数以下が−Ｏ−、−ＣＯ−及び−ＮＨ−から成る群より選ばれる１又は２以上の基であり、１又は２以上の炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよく、Ａｒは、１ないし５個の炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよい芳香環である）
【００６８】
さらに、一般式[III]で表されるＡの好ましい例として、下記一般式[IV]
【００６９】
【化４３】
【００７０】
（但し、式中、Ｒ７は存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ８は、式中に示されるベンゼン環によって任意の水素が置換された炭素数１〜６のアルキレン基を示す）
又は下記一般式[V]
【００７１】
【化４４】
【００７２】
（ただし、式中、Ｒ７及びＲ８は、式[IV]と同じ意味を示し、Ｒ９は、存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数１〜６のアルキレン基を示す）
で表されるものを挙げることができる。
【００７３】
また、Ａとしては、上記一般式[V]において、Ｒ９がフェニレン基であるものも好ましく用いることができる。このＡは、特にＲ２が上記一般式[VI]で表される構造を有する場合及び
【００７４】
【化４５】
【００７５】
である場合に好ましく用いることができる。
【００７６】
また、Ａとしては、−Ｒ６−（ただし、Ｒ６は、一般式[III]におけるＲ３と同じ意味を示す）であるものも好ましく用いることができる。このＡは、特にＲ２が二本鎖核酸にインターカレートする構造を有する基（例えば、上記一般式[IX]で表される基）であり試料化合物が二本鎖核酸である場合、及びＲ２が他の化合物を包接する環状構造を有する基（例えば、上記一般式[X]又は[XI]で表される基）である場合に好ましく用いることができる。
【００７７】
さらに、Ａとしては、−Ｒ６−Ａｒ−Ｒ６’−（ただし、Ｒ６及びＡｒは一般式[III]におけるＲ６及びＡｒとそれぞれ同じ意味を示し、Ｒ６ 'は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には一般式[III]におけるＲ６と同じ意味を示す（ただし、式中のＲ６とＲ６ 'とは同一であっても異なっていてもよい））であるものも好ましく用いることができる。このようなＡの好ましい例として、下記一般式[XII]
【００７８】
【化４６】
【００７９】
（ただし、Ｒ１７及びＲ１８は、互いに独立に炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ１９は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には炭素数１〜６のアルキレン基を示す）
又は下記一般式[XIII]
【００８０】
【化４７】
【００８１】
（ただし、Ｒ２０及びＲ２１は、互いに独立に炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ２２は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には炭素数１〜６のアルキレン基を示す）
で表されるものを挙げることができる。
【００８２】
Ａの構造は任意のものでよいが、プローブ全体の分子量が余りに大きくなると、試料化合物−プローブ結合物における、プローブの占める割合が大きくなって分析の感度が低下するので、プローブの分子量は１０００以下であることが好ましい。
【００８３】
本発明のプローブは、当業者が、公知の方法に基づいて容易に合成することができる。下記実施例にも、複数の好ましいプローブの製造方法が具体的に記載されている。
【００８４】
試料化合物と、プローブとの反応は、プローブのＲ２と、試料化合物中の、Ｒ２と結合させるべき官能基の種類に応じて、公知の技術に基づき適宜の条件で行うことができる。下記実施例にも、好ましいプローブと試料化合物との結合反応の条件が具体的に記載されている。
【００８５】
Ｒ２及び該Ｒ２と結合する試料化合物中の官能基（Ｒ’）の上記した具体的な組合せのそれぞれについて、具体的な結合反応条件の例を以下に記載する。もっとも、これらは単なる例示であり、他の反応条件でもこれらの官能基同士を結合させることは可能であるので、結合反応条件が下記のものに限定されるものではないことは当業者にとって明らかである。また、ここに記載されていないＲ２についても、当業者が化学常識に従って容易に結合反応を行うことができる。
【００８６】
(1) Ｒ２がＳＣＮ−、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
2〜3 mgの試料に0.2 ml (エタノール : 水 :トリエチルアミン = 2 : 2 : 1 v/v)を加え減圧乾固した後、0.5 ml (エタノール : 水 :トリエチルアミン : プローブ = 7 : 7 : 1 : 1 v/v)を加え室温で20分間反応させる。溶媒を減圧留去した後、溶離液に溶解し試料溶液とする（B. A. Bidlingmeyer, et al, J. Chromatogr., 336, 93 (1984)参照）。
【００８７】
(2) Ｒ２がＣｌＯ２Ｓ−で、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
2〜3 mgの試料に500μLの1M NaHCO3水溶液と200 μLの1 mg / mLプローブ/アセトン溶液を加え、60℃で30分間加熱する。アセトンを留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Meffin, P. J., et al, J. Pharm. Sci., 66, 583 (1977)参照）。
【００８８】
(3) Ｒ２が
【００８９】
【化４８】
【００９０】
で、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
【００９１】
1.5 mgの試料をTHF5.0 mLに溶解し、50 mgのプローブを加え、60℃30分間加熱する。THFを留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Jupill, T. H., Am. Lab., 8 (5), 85-92 (1976)参照）。
【００９２】
(4) Ｒ２が
【００９３】
【化４９】
【００９４】
で、Ｒ’が−ＳＨの場合
【００９５】
2〜3 mgの試料を500μLの水に溶解後、200μLの1 mg / mLプローブ/アセトニトリル溶液を加え、60℃で30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Nakashima K., et al, Talanta., 32, 167 (1985)参照）。
【００９６】
(5) Ｒ２がＢｒＨ２Ｃ−又はＩＨ２Ｃ−で、Ｒ’が−ＣＯＯＨの場合
2〜3 mgの試料をアセトン500 μLに溶解し、200μLの1 mg / mLプローブ/アセトン溶液およびK2CO3 1 mgを加え、60℃ で30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Dunges, W., Anal. Chem., 49, 442 (1977)参照）。
【００９７】
(6) Ｒ２がＣｌＯＣ−で、Ｒ’が−ＯＨの場合
2〜3 mgの試料を0.5 mlのピリジンに溶解後、0.2 mLの1 mg / mLプローブ/ピリジン溶液を加え、40℃で1時間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Suzuki, A., et al., J. Biochem., 82, 1185 (1977)参照）。
【００９８】
(7) Ｒ２が
【００９９】
【化５０】
【０１００】
で、Ｒ’が−ＣＨＯの場合
【０１０１】
2〜3 mgの試料をメタノール1.0 ml、酢酸0.1 ml、0.2 mLの1 mg / mLプローブ/メタノール溶液を加え、40℃で30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【０１０２】
(8) Ｒ２が
【０１０３】
【化５１】
【０１０４】
で、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
【０１０５】
試料のエタノール溶液(10-4 〜 10-3 M) 0.1 mLに、10 mg / mLのプローブ/エタノール溶液1.5 mLを加え、室温で5分間〜10分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Roth, M., Anal. Chem., 43, 880 (1971)参照）。
【０１０６】
(9) Ｒ２が−ＣＨ２ＯＮＨ２・ＨＣｌでＲ’が
【０１０７】
【化５２】
【０１０８】
の場合
【０１０９】
1〜5 mgの試料、トリエチルアミン2滴、プローブ50 mgを50℃で30分間加熱する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Jupille, T. H., Am. Lab., 8 (5), 85-92 (1976)参照）。
【０１１０】
(10) Ｒ２が−ＮＨＮＨ２、Ｒ’が−ＣＨＯの場合
1〜5 mgの試料を水0.5 mlに溶解後、30%HClO4水溶液に20mg/mLの割合でプローブを溶かした溶液を加え、室温で10分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Newberg, C., et al., Anal. Chim. Acta, 7, 238 (1952)参照）。
【０１１１】
(11) Ｒ２が
【０１１２】
【化５３】
【０１１３】
で、Ｒ’が
【０１１４】
【化５４】
【０１１５】
の場合
【０１１６】
0.1〜5.0μgの試料を、50μLのリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解後、200μLの1mg / mLのプローブ/リン酸緩衝溶液(pH7.0)を加え、室温で5分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【０１１７】
(12) Ｒ２が
【０１１８】
【化５５】
【０１１９】
で、Ｒ’が
【０１２０】
【化５６】
【０１２１】
の場合
【０１２２】
0.1〜5.0 μgの試料を、50μLのリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解後、200μLの1mg / mLのプローブ/リン酸緩衝溶液(pH7.0)を加え、室温で5分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【０１２３】
(13) Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２で、Ｒ’が
【０１２４】
【化５７】
【０１２５】
の場合
【０１２６】
0.1〜5.0μgの試料を、50μLのリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解後、200μLの1mg / mLのプローブ/リン酸緩衝溶液(pH7.0)および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを加え、室温で30分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【０１２７】
本発明のプローブを用いた液状試料の質量分析は、試料化合物と本発明のプローブを反応、結合させた後、通常の液状試料の質量分析と全く同様にして行うことができる。本発明のプローブは、試料のイオン化を伴う、あらゆる液状試料の質量分析方法に適用可能である。好ましい液状試料の質量分析方法の例として、エレクトロスプレーイオン化質量分析、大気圧化学イオン化質量分析、サーモスプレーイオン化質量分析、パーティクルビーム質量分析、フリット高速原子衝撃質量分析等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、通常の質量分析のみならず、反応槽と一体化された分析装置中で行われる質量分析に適用することも可能である。例えば、ポストカラム反応方式の高速液体クロマトグラフィ装置や、フローインジェクション分析装置のように、分析装置に反応槽又は反応コイルが組み込まれた分析装置において、反応槽又は反応コイルの下流で行われる質量分析に本発明のプローブを適用することができる。この場合、プローブは、反応槽又は反応コイルの上流で試料と混合し、結合反応を反応槽又は反応コイル中で行うことができる。なお、質量分析自体は、市販の装置を用い、装置に添付された指示書に従って容易に行うことができる。
【０１２８】
なお、「液状試料」とは、分析対象である試料化合物が液状である場合の試料化合物、及び試料化合物が固体である場合の該試料化合物の溶液の両者を包含する。
【０１２９】
本発明のプローブを用いた場合には、試料化合物がプローブと結合することによって確実にイオン化されており、結合後のプローブ由来部分の質量も既知であるから、通常の質量分析により高感度、高精度に定量することができる。なお、観察されたピーク値(m/z値）からプローブの分子量を差し引くことにより試料化合物の分子量を算出することができる。
【０１３０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【０１３１】
実施例１ プローブの合成（その１）
【０１３２】
【化５８】
【０１３３】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２としてＳＣＮ−を有する上記化合物を合成した。
【０１３４】
【化５９】
【０１３５】
（１）2-(2-トリメチルシロキシエトキシ)-2-フェニルエタンニトリルの合成
【０１３６】
【化６０】
【０１３７】
50 ml二口フラスコに2-フェニル-1,3-ジオキソラン(化合物1) 3.0 g (19.9 mmol)、トリメチルシリルシアノイド(TMSCN)2.1 ml (21.4 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94 mmol)を加え、窒素気流下、室温で2時間撹拌した。TLC (SiO2; CH2Cl2 : n-ヘキサン = 1 : 4 v/v)で原料消失を確認後、ジエチルエーテル100 mlを加え水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１３８】
収率 93 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 0.12 (s, 9H, Si (CH3)3), 3.65 〜 3.84 (m, 4H, -OCH2CH2O-), 5.42 (s, 1H, Ar-CH), 7.40〜7.58 (m, 5H, ArH)
ESI-TOF [M + Na]+ = 272
【０１３９】
（２）2-(2-アミノ-1-フェニルエトキシ)エタン-1-オールの合成
【０１４０】
【化６１】
【０１４１】
100 ml二口フラスコに化合物2 2.0 g (8.0 mmmol) を加え脱気窒素置換後、氷浴下1 M BH3・THF溶液50 mlを30分間かけて滴下した。室温で4時間撹拌後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1 v/v)で原料消失を確認した。氷浴下、6 N HClを加え酸性にした後、溶媒の大部分を減圧留去した。NaOH水溶液を加えpH 10にした後、酢酸エチル100 mlで3回抽出し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１４２】
収率 90 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 2.55 (br s, 3H), 2.83 (dd, 1H), 3.15 (dd, 1H), 3.39〜3.62 (m, 2H), 3.68〜3.78 (m, 2H), 5.00 (dd, 1H), 7.40 7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M]+ = 181
【０１４３】
（３）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-フェニルエチル)フォルムアミドの合成
【０１４４】
【化６２】
【０１４５】
30 ml二口フラスコに化合物3 0.50 g (2.76 mmol)を加え脱気窒素置換後、THF 15 ml、トリエチルアミン 0.28 ml (2.76 mmol)、ジ-tert-ブチル-ジカーボネート0.60 g (2.76 mmol)を加え、室温で撹拌した。2時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1)で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1)で精製し、無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１４６】
収率 90 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.37 (s, 9H), 3.10 (s, 3H), 3.51 〜3.64 (m, 4H), 4.33〜4.37 (m, 2H), 4.98 (br s, 1H), 5.01 (dd, 1H), 7.41〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 304
【０１４７】
（４）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-(メチルスルフォニロキシ)エトキシ)-2-フェニルエチルフォルムアミドの合成
【０１４８】
【化６３】
【０１４９】
30 ml二口フラスコに化合物4 0.50 g (1.78 mmol)を加え脱気窒素置換後、ジエチルエーテル10.0 ml、トリエチルアミン0.23 g (2.31 mmol)を加えた。氷浴下、メタンスルホニルクロリド0.22 g (1.96 mmol)を加えた後、室温で撹拌した。一時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で原料消失を確認した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で精製し、白色固体を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１５０】
収率88 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.37 (s, 9H), 3.10 (s, 3H), 3.51 〜3.64 (m, 4H), 4.33 ~ 4.37 (m, 2H), 4.98 (br s, 1H), 5.01 (dd, 1H), 7.40 〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 382
【０１５１】
（５）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-ヨードエトキシ)-2-フェニルエチル)フォルムアミドの合成
【０１５２】
【化６４】
【０１５３】
30 ml二口フラスコに化合物5 0.50 g (1.39 mmol)を加え脱気窒素置換後、アセトン10.0 ml、ヨウ化ナトリウム1.10 g (7.25 mmol)を加え還流した。2時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1) で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 10 : 1)で精製後、赤色固体を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１５４】
収率85 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.35 (s, 9H), 3.22 (t, 2H), 3.38 〜3.66 (m, 4H), 5.02 (br s, 1H), 5.06 (dd, 1H), 7.41〜 7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 414
【０１５５】
（６）2-(2-ヨードエトキシ)-2-フェニルエタンイソチオシアネートの合成
【０１５６】
【化６５】
【０１５７】
10 ml二口フラスコに化合物6 0.20 g (0.51 mmol)を加え脱気窒素置換後、塩化メチレン2.0 ml、トリフルオロ酢酸0.5 mlを加え室温で撹拌した。30分後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、溶媒を減圧留去した。得られた化合物に塩化メチレン : 水 = 1 : 1 v/vの混合溶媒5.0 mlを加えた後、炭酸水素ナトリウム0.30 g、チオホスゲン80.0 μLを加え、室温で撹拌した。1時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、塩化メチレン50 mlで3回抽出後、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄橙色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１５８】
収率80 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 3.26〜3.33 (m, 2H), 3.36〜3.79 (m, 2H), 3.80 (dd, 1H), 3.95 (dd, 1H), 5.24 (dd, 1H), 7.40〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 355
【０１５９】
（７）2-(2-(トリエチルアミノ)エトキシ)-2-フェニルエタンイソチオシアネートヨーダイドの合成
【０１６０】
【化６６】
【０１６１】
30 mlなす型フラスコに化合物7 0.20 g (0.60 mmol)、トルエン5.0 ml、トリエチルアミン1.0 mlを加え、室温で撹拌した。24時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、析出した沈殿を分取後、トルエンで洗浄し、黄白色固体を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１６２】
収率92 %
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, TMS, r.t., δ / ppm) 1.30 (t, 9H), 3.04 (q, 6H), 3.75〜3.95 (m, 3H), 4.11 (dd, 1H), 4.10 ~ 4.16 (m, 1H), 4.33 (dd, 1H), 5.54 (dd, 1H), 7.40〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M]+ = 307
【０１６３】
実施例２ プローブの合成（その２）
【０１６４】
【化６７】
【０１６５】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２としてＢｒＨ２Ｃ−を有する上記化合物を合成した。
【０１６６】
【化６８】
【０１６７】
（１）2-(3,3,4,4-テトラメチル-1-フェニル-3-シラペンチルオキシ)エタン-1-オールの合成
【０１６８】
【化６９】
【０１６９】
50 ml二口フラスコに2-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-フェニルエタン-1-オール(化合物1) 3.0 g (16.5 mmol)、t-ブチルジメチルシリルクロリド (TBDMSCl) 2.48 g (16.5 mmol)、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン (DBU) 2.51 ml 16.5 mmol)を加え、窒素気流下、室温で24時間撹拌した。TLCで原料消失を確認後、溶媒を減圧留去し、得られた化合物を塩化メチレンに溶解した。水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０１７０】
（２）(メチルスルホニル)オキシ(2-(3,3,4,4-テトラメチル-1-フェニル-3-シラペンチルオキシ)エタンの合成
【０１７１】
【化７０】
【０１７２】
100 ml二口フラスコに化合物2 2.0 g (6.75 mmmol) を加え脱気窒素置換後、ジエチルエーテル20.0 ml、トリエチルアミン0.68 g (6.75 mmol)、メタンスルホニルクロリド0.77 g (6.75 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０１７３】
（３）2-ヨード-1-(3,3,4,4-テトラメチル-1-フェニル-3-シラペンチルオキシ)エタンの合成
【０１７４】
【化７１】
【０１７５】
30 ml二口フラスコに化合物3 0.50 g (1.25 mmol)を加え脱気窒素置換後、アセトン 15 ml、ヨウ化ナトリウム 1.49 g (10.0 mmol)を加え、2時間還流した。溶媒を減圧留去後、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０１７６】
（４）トリエチル(2-(3,3,4,4-テトラメチル-1-フェニル-3-シラペンチルオキシ)エチル)アミンの合成
【０１７７】
【化７２】
【０１７８】
30 mlなす型フラスコに化合物4 0.50 g (1.25 mmol)、トルエン10.0 ml、トリエチルアミン1.0 mlを加え、室温で24時間撹拌した。析出した沈殿を分取後、トルエンで洗浄した。減圧乾燥後、目的化合物を得た。
【０１７９】
（５）1-(メチルスルホニル)-2-フェニル-2-(2-(トリエチルアミノ)エトキシ)エタンの合成
【０１８０】
【化７３】
【０１８１】
30 ml二口フラスコに化合物5 0.50 g (1.37 mmol)、酢酸 : 水 : THF = 3 : 1 : 1 v/vの混合溶媒10. 0 mlを加え室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。得られた化合物に、ジエチルエーテル10 0 ml、トリエチルアミン、メタンスルホニルクロリドを加え、室温で2時間撹拌した。水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０１８２】
（６）(2-(2-ヨード-1-フェニルエトキシ)エチル)トリエチルアミンの合成
【０１８３】
【化７４】
【０１８４】
50 mlなす型フラスコに化合物6 0.20 g (0.58 mmol)、アセトン20.0 ml、臭化リチウム0.43 g (5.0 mmol)を加え2時間還流した。溶媒を減圧留去後、エタノールを加えた。不溶物を濾別後、濾液を減圧濃縮し、目的化合物を得た。
【０１８５】
実施例３ プローブの合成（その３）
【０１８６】
【化７５】
【０１８７】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２としてＮＨ２−を有する上記化合物を合成した。
【０１８８】
【化７６】
【０１８９】
（１）2-(2-トリメチルシロキシエトキシ)-2-フェニルエタンニトリルの合成
【０１９０】
【化７７】
【０１９１】
50 ml二口フラスコに2-フェニル-1,3-ジオキソラン(化合物1) 3.0 g (19.9 mmol)、TMSCN2.1 ml (21.4 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94 mmol)を加え、窒素気流下、室温で2時間撹拌した。TLC (SiO2; CH2Cl2 : n-ヘキサン = 1 : 4 v/v)で原料消失を確認後、ジエチルエーテル100 mlを加え水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１９２】
収率 93 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 0.12 (s, 9H, Si (CH3)3), 3.65〜3.84 (m, 4H, -OCH2CH2O-), 5.42 (s, 1H, Ar-CH), 7.40〜7.58 (m, 5H, ArH)
ESI-TOF [M + Na]+ = 272
【０１９３】
（２）2-(2-アミノ-1-フェニルエトキシ)エタン-1-オールの合成
【０１９４】
【化７８】
【０１９５】
100 ml二口フラスコに化合物2 2.0 g (8.0 mmmol) を加え脱気窒素置換後、氷浴下1 M BH3・THF溶液50 mlを30分間かけて滴下した。室温で4時間撹拌後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1 v/v)で原料消失を確認した。氷浴下、6 N HClを加え酸性にした後、溶媒の大部分を減圧留去した。NaOH水溶液を加えpH 10にした後、酢酸エチル100 mlで3回抽出し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１９６】
収率 90 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 2.55 (br s, 3H), 2.83 (dd, 1H), 3.15 (dd, 1H), 3.39 ~ 3.62 (m, 2H), 3.68 ~ 3.78 (m, 2H), 5.00 (dd, 1H), 7.40〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M]+ = 181
【０１９７】
（３）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-フェニルエチル)フォルムアミドの合成
【０１９８】
【化７９】
【０１９９】
30 ml二口フラスコに化合物3 0.50 g (2.76 mmol)を加え脱気窒素置換後、THF 15 ml、トリエチルアミン 0.28 ml (2.76 mmol)、ジ-tert-ブチル-ジカーボネート0.60 g (2.76 mmol)を加え、室温で撹拌した。2時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1)で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1)で精製し、無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０２００】
収率 90 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.37 (s, 9H), 3.10 (s, 3H), 3.51〜3.64 (m, 4H), 4.33 ~ 4.37 (m, 2H), 4.98 (br s, 1H), 5.01 (dd, 1H), 7.41〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 304
【０２０１】
（４）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-(メチルスルフォニロキシ)エトキシ)-2-フェニルエチルフォルムアミドの合成
【０２０２】
【化８０】
【０２０３】
30 ml二口フラスコに化合物4 0.50 g (1.78 mmol)を加え脱気窒素置換後、ジエチルエーテル10.0 ml、トリエチルアミン0.23 g (2.31 mmol)を加えた。氷浴下、メタンスルホニルクロリド(MsCl)0.22 g (1.96 mmol)を加えた後、室温で撹拌した。一時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で原料消失を確認した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で精製し、白色固体を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０２０４】
収率88 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.37 (s, 9H), 3.10 (s, 3H), 3.51〜3.64 (m, 4H), 4.33 ~ 4.37 (m, 2H), 4.98 (br s, 1H), 5.01 (dd, 1H), 7.40〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 382
【０２０５】
（５）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-ヨードエトキシ)-2-フェニルエチル)フォルムアミドの合成
【０２０６】
【化８１】
【０２０７】
30 ml二口フラスコに化合物5 0.50 g (1.39 mmol)を加え脱気窒素置換後、アセトン10.0 ml、ヨウ化ナトリウム1.10 g (7.25 mmol)を加え還流した。2時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1) で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 10 : 1)で精製後、赤色固体を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０２０８】
収率85 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.35 (s, 9H), 3.22 (t, 2H), 3.38〜3.66 (m, 4H), 5.02 (br s, 1H), 5.06 (dd, 1H), 7.41 ~ 7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 414
【０２０９】
（６）N-(2-(2-ヨードエトキシ)-2-フェニルエチル)-3-オキソブタンアミドの合成
【０２１０】
【化８２】
【０２１１】
10 ml二口フラスコに化合物6 0.20 g (0.51 mmol)を加え脱気窒素置換後、塩化メチレン2.0 ml、トリフルオロ酢酸0.5 mlを加え室温で撹拌した。30分後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、溶媒を減圧留去した。得られた化合物に塩化メチレン5.0 ml、トリエチルアミン0.05 g (0.51 mmol)、アセト酢酸0.05 g (0.51 mmol)を加え、氷浴下30分間撹拌した。BOP(Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate)試薬0.22 g (0.51 mmol)を添加後、氷浴下で30分間、室温に戻した後24時間撹拌した。TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、塩化メチレン50 mlで3回抽出後、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、化合物を得た。
【０２１２】
（７）3-アミノ-N-(2-(2-ヨードエトキシ)-2-フェニルエチル)-2-ブテンアミドの合成
【０２１３】
【化８３】
【０２１４】
10 mlなす型フラスコに化合物7 0.20 g (0.60 mmol)、アンモニア水 5.0 ml、モントモリロナイトK-10 0.1 gを加え、24時間室温で撹拌した。塩化メチレンで抽出後、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２１５】
（８）3-アミノ-N-(2-フェニル-2-(2-(トリエチルアミノ)エトキシ)エチル)-2-ブテンアミドの合成
【０２１６】
【化８４】
【０２１７】
10 mlなす型フラスコに化合物8 0.20 g (0.58 mmol)、トルエン5.0 ml、トリエチルアミン1.0 mlを加え、室温で24時間撹拌した。析出した沈殿を分取後、トルエンで洗浄し減圧乾燥した。
【０２１８】
実施例４ プローブの合成（その４）
【０２１９】
【化８５】
【０２２０】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として-COCH2Brを有する上記化合物を合成した。
スキーム
【０２２１】
【化８６】
【０２２２】
(1) フェニル-(2-トリメチルシラニルオキシ-エトキシ)-アセトニトリル（化合物2）の合成
【０２２３】
【化８７】
【０２２４】
30 mlナス型フラスコに2-フェニル-1,3-ペンタジオン(化合物 1 ) 3.0 g (19.9 mmol) を加え氷浴につけた後、TMSCN 2.1ml (21.43 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94mmol)を加え、室温で2 時間攪拌した。反応溶液にジエチルエーテルを加え、水で洗浄後、MgSO4を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質(4.17g, 収率83.2 %)を得た。
【０２２５】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 0.15(s, 9H, SiCH3), 3.80(t, 2H, -OCH2CH2OSi-), 4.11(t, 2H, -OCH2CH2OSi-), 5.39(s, 1H, ArCH) , 7.45(m, 5H, ArH)
ESI-TOF(+): [M + Na]+ = 272.0
【０２２６】
(2) 2-(2-アミノ-1-フェニル-エトキシ)-エタノール(化合物3)の合成
【０２２７】
【化８８】
【０２２８】
100 ml三口フラスコに、化合物2 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて１M BH3・THF溶液 30mlをゆっくりと加えた。氷浴中で30分間、室温で4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、1N HCl水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水20mlを加え、NaOH水溶液を加えpH 10とした。酢酸エチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無色オイル状の化合物(650mg, 収率89.5 %)を得た。
【０２２９】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 2.95(d, 2H, NH2-CH2) , 3.65(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.75(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.46(t, 1H, ArCH) , 7.32(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [M + H]+ = 182.0
【０２３０】
(3) [2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物4)の合成
【０２３１】
【化８９】
【０２３２】
100 ml二口フラスコに、化合物3 1.40 g (7.70 mmol)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥THF 55 ml 、TEA 0.78 g (7.69 mmol)、Di-tert-butyl-dicarbonate 1.68 g (7.70 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（SiO2、クロロホルム）で精製し、黄色油状化合物(1.30g, 収率59.9 %)を得た。
【０２３３】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.48(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH3) , 3.49(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.73(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.42(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 304.0
【０２３４】
(4) メタンスルホン酸2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチルエステル(化合物5)の合成
【０２３５】
【化９０】
【０２３６】
50 mlナス型フラスコに、化合物4 500 mg (1.78 mmol) を加え窒素置換後、乾燥THF 16 ml 、TEA 0.5 ml (4.55 mmol) を加えて氷浴につけた。MsCl 440 mg (3.84 mmol) を加え、室温で一時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、クロロホルムを加えて析出した沈殿をろ別後，ろ液を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, 酢酸エチル : n-ヘキサン = 2 : 1 v/v) で精製し、黄色油状物質(491mg, 収率77.0 %)を得た。
【０２３７】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.44(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH2) , 3.44(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 3.62(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 4.34(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 382.2
【０２３８】
(5) [2-(2-ヨード-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物6)の合成
【０２３９】
【化９１】
【０２４０】
50 mlナス型フラスコに、化合物5 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン10 ml、NaI 1.0 g (6.67 mmol)を加えて2時間還流した。NaIをろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, n-ヘキサン：酢酸エチル = 1：1 v/v) で精製し、黄色油状化合物(104mg, 収率93.99 %)を得た。
【０２４１】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.45(s, 9H, t-Bu) , 3.22(t, 2H, I-CH2) , 3.49(d, 2H, NH-CH2), 3.67(t, 2H, -OCH2), 4.43(t, 1H, ArCH), 7.34(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [M + Na]+ = 413.9
【０２４２】
(6) [2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチル]-トリエチル-アンモニウム ヨウ化物(化合物7)の合成
【０２４３】
【化９２】
【０２４４】
50 mlナス型フラスコに、化合物6 350 mg (0.90 mmol)、トルエン8.75 ml、TEA 1.75 ml (17.33 mmol)を加えて、80 ℃で24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー(SiO2, クロロホルム：メタノール=7：1 v/v)で精製し、赤黄色固体物質(383mg, 収率66.70%)を得た。
【０２４５】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.42(t, 9H, CH2-CH3), 1.48(s, 9H, t-Bu), 3.53(q, 6H, NR3-CH2), 3.70(t, 2H, -OCH2CH2N-), 3.72(d, 2H, NH-CH2), 3.95(t, 2H, -OCH2CH2N-), 4.63(t, 1H, ArCH), 7.35(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M ]+ = 365.2
【０２４６】
(7) 化合物8の合成
【０２４７】
【化９３】
【０２４８】
30 mlナス型フラスコに化合物7 0.50 g (1.02 mmol)、TFA （トリフルオロ酢酸）0.50 ml、塩化メチレン10.0 mlを加え、室温で30分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、THF 20.0 ml、TEA 0.10 g (1.02 mmol)、BOP 0.10 g (1.02 mmol)、4-ブロモメチルアセチル安息香酸0.25 g (1.02 mmol)を加え室温で24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０２４９】
実施例５ プローブの合成（その５）
【０２５０】
【化９４】
【０２５１】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として-COCHOを有する上記化合物を合成した。
スキーム
【０２５２】
【化９５】
【０２５３】
(1) フェニル-(2-トリメチルシラニルオキシ-エトキシ)-アセトニトリル(化合物2) の合成
【０２５４】
【化９６】
【０２５５】
30 mlナス型フラスコに2-フェニル-1,3-ペンタジオン(化合物1) 3.0 g (19.9 mmol) を加え氷浴につけた後、TMSCN 2.1ml (21.43 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94mmol)を加え、室温で2 時間攪拌した。反応溶液にジエチルエーテルを加え、水で洗浄後、MgSO4を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質(4.17g, 収率83.2 %)を得た。
【０２５６】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 0.15(s, 9H, SiCH3) , 3.80(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 4.11(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 5.39(s, 1H, ArCH) , 7.45(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 272.0
【０２５７】
(2) 2-(2-アミノ-1-フェニル-エトキシ)-エタノール(化合物3)の合成
【０２５８】
【化９７】
【０２５９】
100 ml三口フラスコに、化合物2 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて１M BH3・THF溶液 30ml をゆっくりと加えた。氷浴中で30分間、室温で4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、1N HCl水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水20mlを加え、NaOH水溶液を加えpH 10とした。酢酸エチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無色オイル状の化合物(650mg, 収率89.5 %)を得た。
【０２６０】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 2.95(d, 2H, NH2-CH2) , 3.65(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.75(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.46(t, 1H, ArCH) , 7.32(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + H ]+ = 182.0
【０２６１】
(3) [2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物4)の合成
【０２６２】
【化９８】
【０２６３】
100 ml二口フラスコに、化合物3 1.40 g (7.70 mmol)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥THF 55 ml 、TEA 0.78 g (7.69 mmol)、ジ-tert-ブチル-ジカーボネート1.68 g (7.70 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（SiO2、クロロホルム）で精製し、黄色油状化合物(1.30g, 収率59.9 %)を得た。
【０２６４】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.48(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH3) , 3.49(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.73(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.42(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 304.0
【０２６５】
(4) メタンスルホン酸2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチルエステル(化合物5)の合成
【０２６６】
【化９９】
【０２６７】
50 mlナス型フラスコに、化合物4 500 mg (1.78 mmol) を加え窒素置換後、乾燥THF 16 ml 、TEA 0.5 ml (4.55 mmol) を加えて氷浴につけた。MsCl 440 mg (3.84 mmol) を加え、室温で一時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、クロロホルムを加えて析出した沈殿をろ別後，ろ液を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, 酢酸エチル : n-ヘキサン = 2 : 1 v/v) で精製し、黄色油状物質(491mg, 収率77.0 %)を得た。
【０２６８】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.44(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH2) , 3.44(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 3.62(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 4.34(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 382.2
【０２６９】
(5) [2-(2-ヨード-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物6)の合成
【０２７０】
【化１００】
【０２７１】
50 mlナス型フラスコに、化合物5 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン10 ml、NaI 1.0 g (6.67 mmol)を加えて2時間還流した。NaIをろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, n-ヘキサン：酢酸エチル = 1：1 v/v) で精製し、黄色油状化合物(104mg, 収率93.99 %)を得た。
【０２７２】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.45(s, 9H, t-Bu) , 3.22(t, 2H, I-CH2) , 3.49(d, 2H, NH-CH2) , 3.67(t, 2H, -OCH2) , 4.43(t, 1H, ArCH) , 7.34(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 413.9
【０２７３】
(6) [2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチル]-トリエチルアンモニウム ヨウ化物(化合物7)の合成
【０２７４】
【化１０１】
【０２７５】
50 mlナス型フラスコに、化合物6 350 mg (0.90 mmol)、トルエン8.75 ml、TEA 1.75 ml (17.33 mmol)を加えて、80 ℃で24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー(SiO2, クロロホルム：メタノール=7：1 v/v)で精製し、赤黄色固体物質(383mg, 収率66.70%)を得た。
【０２７６】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.42(t, 9H, CH2-CH3) , 1.48(s, 9H, t-Bu), 3.53(q, 6H, NR3-CH2), 3.70(t, 2H, -OCH2CH2N-), 3.72(d, 2H, NH-CH2), 3.95(t, 2H, -OCH2CH2N-), 4.63(t, 1H, ArCH), 7.35(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M ]+ = 365.2
【０２７７】
(7) 化合物8の合成
【０２７８】
【化１０２】
【０２７９】
30 mlナス型フラスコに化合物7 0.50 g (1.02 mmol)、TFA 0.50 ml、塩化メチレン10.0 mlを加え、室温で30分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、THF 20.0 ml、TEA 0.10 g (1.02 mmol)、BOP 0.10 g (1.02 mmol)、4-ブロモメチルアセチル安息香酸0.25 g (1.02 mmol)を加え室温で24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０２８０】
(8) 化合物9の合成
【０２８１】
【化１０３】
【０２８２】
20 mlナス型フラスコに化合物8 0.25 g (0.41 mmol)、DMSO 5.0 mlを加え、室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し目的化合物を得た。
【０２８３】
実施例６ プローブの合成（その６）
【０２８４】
【化１０４】
【０２８５】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として-CH2CH2NH2 を有する上記化合物を合成した。
【０２８６】
【化１０５】
【０２８７】
(1) フェニル-(2-トリメチルシラニルオキシ-エトキシ)-アセトニトリル(化合物2) の合成
【０２８８】
【化１０６】
【０２８９】
30 mlナス型フラスコに2-フェニル-1,3-ペンタジオン(化合物1) 3.0 g (19.9 mmol) を加え氷浴につけた後、TMSCN 2.1ml (21.43 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94mmol)を加え、室温で2 時間攪拌した。反応溶液にジエチルエーテルを加え、水で洗浄後、MgSO4を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質(4.17g, 収率83.2 %)を得た。
【０２９０】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 0.15(s, 9H, SiCH3) , 3.80(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 4.11(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 5.39(s, 1H, ArCH) , 7.45(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 272.0
【０２９１】
(2) 2-(2-アミノ-1-フェニル-エトキシ)-エタノール(化合物3)の合成
【０２９２】
【化１０７】
【０２９３】
100 ml三口フラスコに、化合物2 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて１M BH3・THF溶液 30ml をゆっくりと加えた。氷浴中で30分間、室温で4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、1N HCl水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水20mlを加え、NaOH水溶液を加えpH 10とした。酢酸エチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無色オイル状の化合物(650mg, 収率89.5 %)を得た。
【０２９４】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 2.95(d, 2H, NH2-CH2) , 3.65(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.75(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.46(t, 1H, ArCH) , 7.32(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + H ]+ = 182.0
【０２９５】
(3) [2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物4)の合成
【０２９６】
【化１０８】
【０２９７】
100 ml二口フラスコに、化合物3 1.40 g (7.70 mmol)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥THF 55 ml 、TEA 0.78 g (7.69 mmol)、ジ-tert-ブチル-ジカーボネート1.68 g (7.70 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（SiO2、クロロホルム）で精製し、黄色油状化合物(1.30g, 収率59.9 %)を得た。
【０２９８】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.48(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH3) , 3.49(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.73(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.42(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 304.0
【０２９９】
(4) メタンスルホン酸2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチルエステル(化合物5)の合成
【０３００】
【化１０９】
【０３０１】
50 mlナス型フラスコに、化合物5 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン10 ml、NaI 1.0 g (6.67 mmol)を加えて2時間還流した。NaIをろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, n-ヘキサン：酢酸エチル = 1：1 v/v) で精製し、黄色油状化合物(104mg, 収率93.99 %)を得た。
【０３０２】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.45(s, 9H, t-Bu) , 3.22(t, 2H, I-CH2) , 3.49(d, 2H, NH-CH2) , 3.67(t, 2H, -OCH2) , 4.43(t, 1H, ArCH) , 7.34(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 413.9
【０３０３】
(5) [2-(2-ヨード-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物6)の合成
【０３０４】
【化１１０】
【０３０５】
50 mlナス型フラスコに、化合物5 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン10 ml、NaI 1.0 g (6.67 mmol)を加えて2時間還流した。NaIをろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, n-ヘキサン：酢酸エチル = 1：1 v/v) で精製し、黄色油状化合物(104mg, 収率93.99 %)を得た。
【０３０６】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.45(s, 9H, t-Bu) , 3.22(t, 2H, I-CH2) , 3.49(d, 2H, NH-CH2) , 3.67(t, 2H, -OCH2) , 4.43(t, 1H, ArCH) , 7.34(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 413.9
【０３０７】
(6) [2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチル]-トリエチルアンモニウム ヨウ化物(化合物7)の合成
【０３０８】
【化１１１】
【０３０９】
50 mlナス型フラスコに、化合物6 350 mg (0.90 mmol)、トルエン8.75 ml、TEA 1.75 ml (17.33 mmol)を加えて、80 ℃で24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー(SiO2, クロロホルム：メタノール=7：1 v/v)で精製し、赤黄色固体物質(383mg, 収率66.70%)を得た。
【０３１０】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.42(t, 9H, CH2-CH3), 1.48(s, 9H, t-Bu), 3.53(q, 6H, NR3-CH2), 3.70(t, 2H, -OCH2CH2N-), 3.72(d, 2H, NH-CH2), 3.95(t, 2H, -OCH2CH2N-), 4.63(t, 1H, ArCH), 7.35(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M ]+ = 365.2
【０３１１】
(7) 化合物8の合成
【０３１２】
【化１１２】
【０３１３】
30 mlナス型フラスコに化合物7 0.50 g (1.02 mmol)、TFA 0.50 ml、塩化メチレン10.0 mlを加え、室温で30分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、THF 20.0 ml、TEA 0.10 g (1.02 mmol)、BOP 0.10 g (1.02 mmol)、β-アラニン0.10 g (1.02 mmol)を加え室温で24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０３１４】
実施例７ プローブの合成（その７）
【０３１５】
【化１１３】
【０３１６】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として
【０３１７】
【化１１４】
【０３１８】
を有する上記化合物を合成した。
【０３１９】
【化１１５】
【０３２０】
(1) フェニル-(2-トリメチルシラニルオキシ-エトキシ)-アセトニトリル(化合物2) の合成
【０３２１】
【化１１６】
【０３２２】
30 mlナス型フラスコに2-フェニル-1,3-ペンタジオン(化合物1) 3.0 g (19.9 mmol) を加え氷浴につけた後、TMSCN 2.1ml (21.43 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94mmol)を加え、室温で2 時間攪拌した。反応溶液にジエチルエーテルを加え、水で洗浄後、MgSO4を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質(4.17g, 収率83.2 %)を得た。
【０３２３】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 0.15(s, 9H, SiCH3) , 3.80(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 4.11(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 5.39(s, 1H, ArCH) , 7.45(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 272.0
【０３２４】
(2) 2-(2-アミノ-1-フェニル-エトキシ)-エタノール(化合物3)の合成
【０３２５】
【化１１７】
【０３２６】
100 ml三口フラスコに、化合物2 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて１M BH3・THF溶液 30ml をゆっくりと加えた。氷浴中で30分間、室温で4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、1N HCl水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水20mlを加え、NaOH水溶液を加えpH 10とした。酢酸エチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無色オイル状の化合物(650mg, 収率89.5 %)を得た。
【０３２７】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 2.95(d, 2H, NH2-CH2) , 3.65(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.75(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.46(t, 1H, ArCH) , 7.32(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + H ]+ = 182.0
【０３２８】
(3) [2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物4)の合成
【０３２９】
【化１１８】
【０３３０】
100 ml二口フラスコに、化合物3 1.40 g (7.70 mmol)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥THF 55 ml 、TEA 0.78 g (7.69 mmol)、ジ-tert-ブチルジカーボネート1.68 g (7.70 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（SiO2、クロロホルム）で精製し、黄色油状化合物(1.30g, 収率59.9 %)を得た。
【０３３１】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.48(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH3) , 3.49(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.73(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.42(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 304.0
【０３３２】
(4) メタンスルホン酸2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチルエステル(化合物5)の合成
【０３３３】
【化１１９】
【０３３４】
50 mlナス型フラスコに、化合物4 500 mg (1.78 mmol) を加え窒素置換後、乾燥THF 16 ml 、TEA 0.5 ml (4.55 mmol) を加えて氷浴につけた。MsCl 440 mg (3.84 mmol) を加え、室温で一時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、クロロホルムを加えて析出した沈殿をろ別後，ろ液を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, 酢酸エチル : n-ヘキサン = 2 : 1 v/v) で精製し、黄色油状物質(491mg, 収率77.0 %)を得た。
【０３３５】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.44(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH2) , 3.44(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 3.62(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 4.34(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 382.2
【０３３６】
(5) [2-(2-ヨード-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物6)の合成
【０３３７】
【化１２０】
【０３３８】
50 mlナス型フラスコに、化合物5 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン10 ml、NaI 1.0 g (6.67 mmol)を加えて2時間還流した。NaIをろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, n-ヘキサン：酢酸エチル = 1：1 v/v) で精製し、黄色油状化合物(104mg, 収率93.99 %)を得た。
【０３３９】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.45(s, 9H, t-Bu) , 3.22(t, 2H, I-CH2) , 3.49(d, 2H, NH-CH2) , 3.67(t, 2H, -OCH2) , 4.43(t, 1H, ArCH), 7.34(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 413.9
【０３４０】
(6) [2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチル]-トリエチルアンモニウム ヨウ化物(化合物7)の合成
【０３４１】
【化１２１】
【０３４２】
50 mlナス型フラスコに、化合物6 350 mg (0.90 mmol)、トルエン8.75 ml、TEA 1.75 ml (17.33 mmol)を加えて、80 ℃で24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー(SiO2, クロロホルム：メタノール=7：1 v/v)で精製し、赤黄色固体物質(383mg, 収率66.70%)を得た。
【０３４３】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.42(t, 9H, CH2-CH3) , 1.48(s, 9H, t-Bu) , 3.53(q, 6H, NR3-CH2) , 3.70(t, 2H, -OCH2CH2N-) , 3.72(d, 2H, NH-CH2) , 3.95(t, 2H, -OCH2CH2N-), 4.63(t, 1H, ArCH), 7.35(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M ]+ = 365.2
【０３４４】
(7) 化合物8の合成
【０３４５】
【化１２２】
【０３４６】
30 mlナス型フラスコに化合物7 0.50 g (1.02 mmol)、TFA 0.50 ml、塩化メチレン10.0 mlを加え、室温で30分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、THF 20.0 ml、TEA 0.10 g (1.02 mmol)、BOP 0.10 g (1.02 mmol)、2-ブロモ-4-メチルペンタン酸0.20 g (1.02 mmol)を加え室温で24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０３４７】
参考例８ プローブの合成（その８）
【０３４８】
【化１２３】
【０３４９】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２としてシクロデキストリン（グルコピラノース単位の数７）を有する上記化合物を合成した。
【０３５０】
【化１２４】
【０３５１】
(1) 化合物2の合成
【０３５２】
【化１２５】
【０３５３】
100 mlナス型フラスコにモノ-6-デオキシ-6-アミノ-β-シクロデキストリン(1) 2.0 g (1.59 mmol)、無水酢酸20.0 ml、ピリジン10.0 mlを加え、室温で24時間撹拌した。反応溶液を冷水にあけ、エーテルで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、目的化合物を得た。
【０３５４】
(2) 化合物3の合成
【０３５５】
【化１２６】
【０３５６】
100 ml三口フラスコに化合物2 1.0 g (0.37 mmol)、ヨウ化メチル 0.26 g (1.85 mmol)、トリエチルアミン 0.05 g (0.40 mmol)、乾燥DMF 20.0 mlを加え、窒素気流下、室温で24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、再沈殿操作を行い目的化合物を得た。
【０３５７】
(3) 化合物4の合成
【０３５８】
【化１２７】
【０３５９】
50 mlナス型フラスコに化合物3 1.0 g (0.35 mmol) 、1.0 M NaOH水溶液5.0 ml、エタノール20.0 mlを加え、5時間還流した。溶媒の大部分を減圧留去後、水20 mlを加え、1N HClで酸性にした。溶媒を減圧留去後、再沈殿操作により精製し、目的化合物を得た。
【０３６０】
実施例９ プローブの合成（その９）
【０３６１】
【化１２８】
【０３６２】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として−ＯＮＨ２を有する上記化合物を合成した。
【０３６３】
【化１２９】
【０３６４】
(1) 化合物2の合成
【０３６５】
【化１３０】
【０３６６】
100 mlナス型フラスコに、化合物1 3.0 g (27.5 mmol)、水30.0 ml、トリエチルアミン3.46 g (34.3 mmol)を加え、氷浴につけた。Zクロリド4.8 g (27.5 mmol)をジエチルエーテル10.0 mlに溶解し、滴下ロートを用いて加えた。氷浴下で30分間、室温に戻して7時間撹拌した。酢酸エチルで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、カラムクロマトグラフィー(SiO2, CHCl3 : 酢酸エチル= 2 : 3 v/v)で精製し、目的化合物を得た。
【０３６７】
(2) 化合物3の合成
【０３６８】
【化１３１】
【０３６９】
100 ml三口フラスコに、化合物2 2.0 g (10.3 mmol)、乾燥塩化メチレン50.0 ml、トリエチルアミン1.1 g(11.0 mmol)を加え、氷浴につけた。p-キシリレンジアミン1.4 g (11.0 mmol)及びBOP試薬4.8 g(11.0 mmol)を加え、氷浴下で30分間、室温に戻して12時間撹拌した。水を加えて反応を停止後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー(SiO2, CHCl3 : 酢酸エチル = 1 : 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。
【０３７０】
(3) 化合物4の合成
【０３７１】
【化１３２】
【０３７２】
100 mlナス型フラスコに化合物3 2.0 g (6.0 mmol)、トルエン50.0 mlおよびヨウ化メチル8.5 g (60.0 mmol)を加え80 ℃で加熱撹拌した。析出した沈殿を分取後、トルエンで洗浄し、目的化合物を得た。
【０３７３】
(4) 化合物5の合成
【０３７４】
【化１３３】
【０３７５】
100 mlナス型フラスコに化合物4 2.0 g (5.0 mmol)、エタノールを加え窒素置換、および水素置換した。パラジウムカーボン0.1 gを加え、室温で5時間撹拌した。パラジウムカーボンを濾別後、溶媒を減圧留去し、目的化合物を得た。
【０３７６】
実施例１０ プローブの合成（その１０）
【０３７７】
【化１３４】
【０３７８】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として-NHNH2を有する上記化合物を合成した。
【０３７９】
(1) 化合物2の合成
【０３８０】
【化１３５】
【０３８１】
100 mlナス型フラスコに化合物1 3.0 g (19.8 mmol)、アセトン50.0 ml、ヨウ化メチル14.1 g (100.0 mmol)、炭酸カリウム6.9 g (50.0 mmol)を加え、窒素気流下、24時間還流した。炭酸カリウムを濾別後、溶媒を減圧留去した。反応混合物にクロロホルムを加え、析出した沈殿を分取した。クロロホルムで洗浄し、目的化合物を得た。
【０３８２】
(2) 化合物3の合成
【０３８３】
【化１３６】
【０３８４】
100 mlナス型フラスコに化合物2 2.0 g (6.25 mmol)、エタノール30.0 ml、ヒドラジン0.22 g (7.0 mmol)を加え、室温で5時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、目的化合物を得た。
【０３８５】
実施例１１ エレクトロスプレーイオン化質量分析
(1) 試料化合物とプローブの結合
下記反応式に示すように、実施例１で合成したプローブ（化合物１）と、試料化合物（化合物２）とを結合した。この反応は、試験管に10.0 mMの化合物1および化合物2のアセトニトリル(またはTHF)溶液をとり、両者を混合後、室温で30分間撹拌することにより行った。
【０３８６】
【化１３７】
【０３８７】
(2) エレクトロスプレーイオン化質量分析
(1)で得られた反応産物を1.0μＭに希釈後、Applied Biosystems社製のESI-TOF質量分析計(Mariner）を用いて測定した。用いた質量分析計の構成を図３に示す。シリンジポンプより10.0 μL / minの流速で、常時移動溶媒(MeOH、水等)を流した。試料溶液はマイクロシリンジを用いて、インジェクターから導入した。試料溶液は移動溶媒の流れに沿って、質量分析計に向かう。
【０３８８】
質量分析計の設定条件は以下の通りであった。
スプレーチップ電位(Spray tip potential) : 3450 V
ノズル電位(Nozzle Potential) : 184 V
Quad RF電圧(Quad RF voltage) : 1000 V
噴霧器ガス流速(Flow rate of Nebulizer gas) (N2) : 0.25 L/分
補助ガス流速(Flow rate of Auxiliary gas) (N2) : 1.0 L/分
カウンター流温度(Temperature of the counter stream) : 160℃
【０３８９】
測定結果を図１に示す。なお、比較のため、プローブのみを1.0μＭに希釈後、同様にして質量分析を行った。結果を図２に示す。
【０３９０】
図１及び図２から明らかなように、試料化合物とプローブとの結合物は、プローブ単独の場合とは異なる位置に鋭いピークを示した。これにより、上記方法により、エレクトロスプレーイオン化質量分析が高感度、高精度に行うことができることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の実施例１１において実施した、エレクトロスプレーイオン化質量分析により得られた質量スペクトルを示す。
図２は、本発明の実施例１１において実施した、プローブのみの場合のエレクトロスプレーイオン化質量分析により得られた質量スペクトルを示す。
図３は、実施例１１において実施した質量分析に用いた質量分析計の構成を模式的に示す図である。
技術分野
本発明は、液状試料の質量分析のためのプローブに関する。
【０００２】
背景技術
現在、最も高感度、高精度に検体中の試料を定量することができる方法として質量分析測定法が挙げられる。質量分析法を用いて液状試料を測定するにあたり重要なことは、化合物の性質に合わせたイオン化法を選択することである。例えば化合物の不安定要因によって使い分ける場合、大きく分けてハードイオン化とソフトイオン化の２種類に分けられる。前者の方法としては、電子イオン化法、化学イオン化法及び大気圧イオン化法が挙げられ、後者の方法としてはエレクトロスプレーイオン化法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法及び高速原子衝撃イオン化法が挙げられる。
【０００３】
一方、最近では高速液体クロマトグラフィーで分離した試料をオンラインで質量分析を用いて同定を行う手法(LC/MS)が化学、生物学の分野で頻繁に利用されている。この場合、液体クロマトグラフィーと相性の良いイオン化法は、キャピラリー先端から流出する溶液試料を直接イオン化する方法であるため、先に記した方法のうち、後者の方法が該当する。中でもエレクトロスプレーイオン化質量分析装置と高速液体クロマトグラフィーをオンラインで接続した装置は現在最も汎用されており、タンパク質、糖質をはじめとした生体に不可欠な物質から、近年問題とされている環境ホルモン物質の同定にその威力を十分に発揮している。エレクトロスプレーイオン化の場合、試料の分子イオンピークが検出されることは極めて低く、通常ナトリウムなどが加算された擬分子イオンピークとして観察されるか、あるいはLC/MSでは移動相に酢酸アンモニウム、ギ酸、酢酸などのプロトン性溶媒を混入することにより、試料のイオン化を助ける方法が採られている。
【０００４】
液状試料の質量分析の際のイオン化を助ける手段として、液体クロマトグラフィーの移動相にプロトン性溶媒を添加する手法がLC/MSでは一般的となっている。しかし、i)酢酸アンモニウムは負イオンモードの場合、試料のイオンとアンモニウムイオンがペアとなって感度が低下する、ii)トリフルオロ酢酸は正イオンモードの場合、サンプルイオンとトリフルオロ酢酸イオンがペアとなって感度が低下し、負イオンモードの場合、一部例外を除きイオン化を妨害する、iii)アセトニトリルでは必ず酸を添加しなければならない、またこの際、酢酸アンモニウムでは溶解しないので用いることができない、等の欠点も指摘されている。
【０００５】
発明の開示
従って、本発明の目的は、液状試料の質量分析の際のイオン化法において、移動相にプロトン性溶媒を添加することなく、試料を効率的にイオン化する手段を提供することである。
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、溶媒中でイオン化する基と、試料化合物中の官能基と反応して共有結合する官能基を１つの分子中に有する化合物をプローブとして用い、該プローブを試料化合物と共有結合させることにより、試料化合物を効率的にイオン化することができることに想到し、かつ、このようなプローブによりイオン化した試料化合物がエレクトロスプレー質量分析により高感度に定量できることを実験的に確認し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、 一般式[I]
Ｒ２−Ａ−Ｒ１ [I]
（但し、式中、Ｒ１は溶媒中でイオンとなるイオン性官能基、Ｒ２は他の官能基と反応して共有結合し得る官能基、Ａは下記一般式 [III]
【化２２−２】
−ＣＨ ２ −の１個以上かつ半数以下が−Ｏ−、−ＣＯ−及び−ＮＨ−から成る群より選ばれる１又は２以上の基であり、１又は２以上の炭素数１〜２０のアルキル基で置換されていてもよく、Ａｒは、１ないし５個の炭素数１〜２０のアルキル基で置換されていてもよい芳香環である）
で表されるスペーサー部を示す）
で表される液状試料の質量分析用プローブと、液状試料中の試料化合物とを結合させ、得られた結合物を質量分析にかけることを含む質量分析方法（ただし、還元性オリゴ糖の還元末端にトリアルキル(p-アミノフェニル）アンモニウム塩を作用させて得られうるオリゴ糖を大気圧イオン化法によってイオン化する方法を除く）を提供する。
【０００８】
本発明のプローブを用いれば、エレクトロスプレーイオン化法において、移動相にプロトン性溶媒を添加することなく、試料を効率的にイオン化することができ、種々の試料について、高感度、高精度にエレクトロスプレーイオン化質量分析を行うことができる。
【０００９】
発明を実施するための最良の形態
本発明の液状試料のイオン化質量分析用プローブは、上記一般式[I]で表されるものである。一般式[I]において、Ｒ１は溶媒中でイオン化するイオン化基である。Ｒ１は、使用する溶媒中でイオン化される基であればいずれの基であってもよく、正に帯電するものでも負に帯電するものでもよい。Ｒ１の例として、アミン、カルボン酸若しくはその塩、スルホン酸若しくはその塩、
【００１０】
【化２３】
（但し、式中、R'、R''及びR'''は同一又は異なる本発明の効果に悪影響を与えない任意の基、好ましくは、水素、ハロゲン、又は炭素数１〜２０の直鎖状若しくは分枝状アルキル基）等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない（なお、本明細書において、「ハロゲン」は、特に断りがない限りフッ素、塩素、臭素及びヨウ素のいずれであってもよい）。これらのうち、アミンが好ましく、とりわけ、下記一般式[II]で表されるアミンが好ましい。
【００１２】
【化２４】
（但し、式中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に、本発明の効果に悪影響を与えない任意の基、好ましくは、水素、ハロゲン、又は炭素数１〜２０の直鎖状若しくは分枝状アルキル基）
【００１４】
上記一般式[I]中において、Ｒ２は、他の物質と結合し得る構造を示す。Ｒ２の好ましい一群の例として試料化合物中の官能基と反応して共有結合し得る官能基を挙げることができる。この場合、Ｒ２としては、試料化合物中の官能基と反応して共有結合し得る官能基であれば、いかなる官能基であってもよい。液状で質量分析により分析される試料は、タンパク質や糖等の生体物質である場合が多いので、これらに含まれることが多い官能基、すなわち、−ＮＨ２基、−ＳＨ基、−ＣＯＯＨ基、−ＯＨ基、−ＣＨＯ基等と反応して共有結合する官能基が好ましい。このような官能基の例として、ＳＣＮ−、ＣlＯ２Ｓ−、
【００１５】
【化２５】
【化２６】
ＢｒＨ２Ｃ−、ＣｌＯＣ−、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＣＨ２Ｉ、-CH2ONH2(-HCl)（塩酸塩であってもなくてもよい）、
【００１８】
【化２７】
【化２８】
を挙げることができる。これらの官能基と反応する試料化合物中の官能基(R') 及び該反応の結果形成される結合を下記表１に示す（なお、Ｒ２が−ＮＨ２の場合は、表１に示される、試料化合物中の官能基(R')が−ＮＨ２の場合のＲ２と表１に記載のように結合できる）。
【００２１】
【表１】
また、Ｒ２としては、ＣＨ３ＣＨ（ＮＨ２）＝ＣＨ−も好ましく採用することができる。この場合、２分子のプローブがＲ−ＣＨＯで表される試料化合物と次のように反応する。
【００２３】
【化２９】
好ましいＲ２として、さらに、一般式[VI]
【００２５】
【化３０】
【００２６】
【化３１】
及び一般式[VII]
【００２８】
【化３２】
で表される基を挙げることができる。一般式[VI]中、ハロゲンとしては、好ましくは臭素である。
【００２９】
上記一般式[VI]で示されるＲ２は、試料化合物中のシトシンと反応して次のように結合する。
【００３０】
【化３３】
（ただし、式中、Ｒは、例えばヌクレオチドや核酸の糖部分のような任意の基を示す）
【００３２】
このＲ２は、試料化合物中のシトシン部分と結合することができるので、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン二リン酸及びデオキシシチジン三リン酸並びにシトシンを含むＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸と結合できる。
【００３３】
Ｒ２が上記
【００３４】
【化３４】
の場合は、試料化合物中のグアニンと反応して次のように結合する。
【００３６】
【化３５】
（ただし、式中、Ｒは、例えばヌクレオチドや核酸の糖部分のような任意の基を示す）
【００３８】
このＲ２は、試料化合物中のグアニン部分と結合することができるので、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン二リン酸及びデオキシグアノシン三リン酸並びにグアニンを含むＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸と結合できる。
【００３９】
Ｒ２が上記一般式[VII]で示される基である場合は、試料化合物中のリン酸エステル部分と反応して次のように結合する（ただし、下記の例ではｎが２の場合について示す）。
【００４０】
【化３６】
なお、この反応式では、試料化合物がデオキシアデノシン一リン酸（すなわち、ヌクレオチド中の塩基がアデニンで、糖がデオキシリボース）の場合を示しているが、Ｒ２は、リン酸エステル部分と結合するので、塩基は、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルのようなアデニン以外の他の塩基であってもよいし、糖はデオキシリボースでもリボースでもよい。また、リン酸エステルの数は、上記反応式では１個であるが、Ｒ２は、末端のリン酸エステルと結合するので、縮合しているリン酸エステルの数は１個〜３個のいずれであってもよい。従って、一般式[VII]で示されるＲ２はあらゆる種類のヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸及びヌクレオシド三リン酸と結合することが可能である。さらに、核酸の末端には遊離のリン酸エステルが存在するので、一般式[VII]で示されるＲ２はＤＮＡやＲＮＡのような核酸と結合することも可能である。
【００４２】
また、Ｒ２が光学活性を有する基である場合には、光学活性を有する試料化合物と結合させることにより、特定の光学活性を有する試料化合物の測定が可能になり、また、試料化合物中の光学中心の絶対配置を決定することが可能になる。
【００４３】
光学活性を有するＲ２の好ましい例として、一般式[VIII]で表される基を挙げることができる。
【００４４】
【００４５】
（ただし、Ｘはハロゲン、Ｒ１０は炭素数１〜５のアルキル基を示す）
ハロゲンとしては、特に臭素が好ましい。
【００４６】
一般式[VIII]で表されるＲ２は、アミノ酸と反応して次のように結合する。
【００４７】
【化３８】
（ただし、式中、Ｒはアミノ酸の任意の側鎖を示す）
【００４９】
この場合、アミノ酸が、Ｄ体とＬ体の混合物（ラセミ体）であると、形成された結合物は互いにジアステレオマーの関係になる。この状態でLC/MS分析を行うことにより、単にESI等の質量分析法で高感度検出を行うことができるばかりでなくアミノ酸の絶対配置を決定することが可能となる。
【００６５】
一般式[I]中、Ａはスペーサー部である。Ａとして、疎水性部と親水性部を有するものを採用することにより、疎水性溶媒でも親水性溶媒でも用いることができ、汎用性が高まる。疎水性部としては、ベンゼン環のような芳香環を挙げることができ、親水性部としては、エーテル、アミン、ケトンを含む構造を挙げることができる。このようなＡは、下記一般式[III]で表される。
【００６６】
【化４２】
（式中、Ｒ６は炭素数１〜２０のアルキレン基であり、その構成単位である
−ＣＨ２−の１個以上かつ半数以下が−Ｏ−、−ＣＯ−及び−ＮＨ−から成る群より選ばれる１又は２以上の基であり、１又は２以上の炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよく、Ａｒは、１ないし５個の炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよい芳香環である）
【００６８】
さらに、一般式[III]で表されるＡの好ましい例として、下記一般式[IV]
【００６９】
【化４３】
（但し、式中、Ｒ７は存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ８は、式中に示されるベンゼン環によって任意の水素が置換された炭素数１〜６のアルキレン基を示す）
又は下記一般式[V]
【００７１】
【化４４】
（ただし、式中、Ｒ７及びＲ８は、式[IV]と同じ意味を示し、Ｒ９は、存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数１〜６のアルキレン基を示す）
で表されるものを挙げることができる。
【００７３】
また、Ａとしては、上記一般式[V]において、Ｒ９がフェニレン基であるものも好ましく用いることができる。このＡは、特にＲ２が上記一般式[VI]で表される構造を有する場合及び
【００７４】
【化４５】
である場合に好ましく用いることができる。
【００７６】
また、Ａとしては、−Ｒ６−（ただし、Ｒ６は、一般式[III]におけるＲ３と同じ意味を示す）であるものも好ましく用いることができる。このＡは、特にＲ２が二本鎖核酸にインターカレートする構造を有する基（例えば、上記一般式[IX]で表される基）であり試料化合物が二本鎖核酸である場合、及びＲ２が他の化合物を包接する環状構造を有する基（例えば、上記一般式[X]又は[XI]で表される基）である場合に好ましく用いることができる。
【００７７】
さらに、Ａとしては、−Ｒ６−Ａｒ−Ｒ６’−（ただし、Ｒ６及びＡｒは一般式[III]におけるＲ６及びＡｒとそれぞれ同じ意味を示し、Ｒ６ 'は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には一般式[III]におけるＲ６と同じ意味を示す（ただし、式中のＲ６とＲ６ 'とは同一であっても異なっていてもよい））であるものも好ましく用いることができる。このようなＡの好ましい例として、下記一般式[XII]
【００７８】
【化４６】
（ただし、Ｒ１７及びＲ１８は、互いに独立に炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ１９は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には炭素数１〜６のアルキレン基を示す）
又は下記一般式[XIII]
【００８０】
【化４７】
（ただし、Ｒ２０及びＲ２１は、互いに独立に炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ２２は存在していてもいなくてもよく、存在している場合には炭素数１〜６のアルキレン基を示す）
で表されるものを挙げることができる。
【００８２】
Ａの構造は任意のものでよいが、プローブ全体の分子量が余りに大きくなると、試料化合物−プローブ結合物における、プローブの占める割合が大きくなって分析の感度が低下するので、プローブの分子量は１０００以下であることが好ましい。
【００８３】
本発明のプローブは、当業者が、公知の方法に基づいて容易に合成することができる。下記実施例にも、複数の好ましいプローブの製造方法が具体的に記載されている。
【００８４】
試料化合物と、プローブとの反応は、プローブのＲ２と、試料化合物中の、Ｒ２と結合させるべき官能基の種類に応じて、公知の技術に基づき適宜の条件で行うことができる。下記実施例にも、好ましいプローブと試料化合物との結合反応の条件が具体的に記載されている。
【００８５】
Ｒ２及び該Ｒ２と結合する試料化合物中の官能基（Ｒ’）の上記した具体的な組合せのそれぞれについて、具体的な結合反応条件の例を以下に記載する。もっとも、これらは単なる例示であり、他の反応条件でもこれらの官能基同士を結合させることは可能であるので、結合反応条件が下記のものに限定されるものではないことは当業者にとって明らかである。また、ここに記載されていないＲ２についても、当業者が化学常識に従って容易に結合反応を行うことができる。
【００８６】
(1) Ｒ２がＳＣＮ−、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
2〜3 mgの試料に0.2 ml (エタノール : 水 :トリエチルアミン = 2 : 2 : 1 v/v)を加え減圧乾固した後、0.5 ml (エタノール : 水 :トリエチルアミン : プローブ = 7 : 7 : 1 : 1 v/v)を加え室温で20分間反応させる。溶媒を減圧留去した後、溶離液に溶解し試料溶液とする（B. A. Bidlingmeyer, et al, J. Chromatogr., 336, 93 (1984)参照）。
【００８７】
(2) Ｒ２がＣｌＯ２Ｓ−で、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
2〜3 mgの試料に500μLの1M NaHCO3水溶液と200 μLの1 mg / mLプローブ/アセトン溶液を加え、60℃で30分間加熱する。アセトンを留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Meffin, P. J., et al, J. Pharm. Sci., 66, 583 (1977)参照）。
【００８８】
(3) Ｒ２が
【００８９】
【化４８】
で、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
【００９１】
1.5 mgの試料をTHF5.0 mLに溶解し、50 mgのプローブを加え、60℃30分間加熱する。THFを留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Jupill, T. H., Am. Lab., 8 (5), 85-92 (1976)参照）。
【００９２】
(4) Ｒ２が
【００９３】
【化４９】
で、Ｒ’が−ＳＨの場合
【００９５】
2〜3 mgの試料を500μLの水に溶解後、200μLの1 mg / mLプローブ/アセトニトリル溶液を加え、60℃で30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Nakashima K., et al, Talanta., 32, 167 (1985)参照）。
【００９６】
(5) Ｒ２がＢｒＨ２Ｃ−又はＩＨ２Ｃ−で、Ｒ’が−ＣＯＯＨの場合
2〜3 mgの試料をアセトン500 μLに溶解し、200μLの1 mg / mLプローブ/アセトン溶液およびK2CO3 1 mgを加え、60℃ で30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Dunges, W., Anal. Chem., 49, 442 (1977)参照）。
【００９７】
(6) Ｒ２がＣｌＯＣ−で、Ｒ’が−ＯＨの場合
2〜3 mgの試料を0.5 mlのピリジンに溶解後、0.2 mLの1 mg / mLプローブ/ピリジン溶液を加え、40℃で1時間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Suzuki, A., et al., J. Biochem., 82, 1185 (1977)参照）。
【００９８】
(7) Ｒ２が
【００９９】
【化５０】
で、Ｒ’が−ＣＨＯの場合
【０１０１】
2〜3 mgの試料をメタノール1.0 ml、酢酸0.1 ml、0.2 mLの1 mg / mLプローブ/メタノール溶液を加え、40℃で30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【０１０２】
(8) Ｒ２が
【０１０３】
【化５１】
で、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
【０１０５】
試料のエタノール溶液(10-4 〜 10-3 M) 0.1 mLに、10 mg / mLのプローブ/エタノール溶液1.5 mLを加え、室温で5分間〜10分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Roth, M., Anal. Chem., 43, 880 (1971)参照）。
【０１０６】
(9) Ｒ２が−ＣＨ２ＯＮＨ２・ＨＣｌでＲ’が
【０１０７】
【化５２】
の場合
【０１０９】
1〜5 mgの試料、トリエチルアミン2滴、プローブ50 mgを50℃で30分間加熱する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Jupille, T. H., Am. Lab., 8 (5), 85-92 (1976)参照）。
【０１１０】
(10) Ｒ２が−ＮＨＮＨ２、Ｒ’が−ＣＨＯの場合
1〜5 mgの試料を水0.5 mlに溶解後、30%HClO4水溶液に20mg/mLの割合でプローブを溶かした溶液を加え、室温で10分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Newberg, C., et al., Anal. Chim. Acta, 7, 238 (1952)参照）。
【０１１１】
(11) Ｒ２が
【０１１２】
【化５３】
で、Ｒ’が
【０１１４】
【化５４】
の場合
【０１１６】
0.1〜5.0μgの試料を、50μLのリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解後、200μLの1mg / mLのプローブ/リン酸緩衝溶液(pH7.0)を加え、室温で5分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【０１１７】
(12) Ｒ２が
【０１１８】
【化５５】
で、Ｒ’が
【０１２０】
【化５６】
の場合
【０１２２】
0.1〜5.0 μgの試料を、50μLのリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解後、200μLの1mg / mLのプローブ/リン酸緩衝溶液(pH7.0)を加え、室温で5分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【０１２３】
(13) Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２で、Ｒ’が
【０１２４】
【化５７】
の場合
【０１２６】
0.1〜5.0μgの試料を、50μLのリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解後、200μLの1mg / mLのプローブ/リン酸緩衝溶液(pH7.0)および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを加え、室温で30分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【０１２７】
本発明のプローブを用いた液状試料の質量分析は、試料化合物と本発明のプローブを反応、結合させた後、通常の液状試料の質量分析と全く同様にして行うことができる。本発明のプローブは、試料のイオン化を伴う、あらゆる液状試料の質量分析方法に適用可能である。好ましい液状試料の質量分析方法の例として、エレクトロスプレーイオン化質量分析、大気圧化学イオン化質量分析、サーモスプレーイオン化質量分析、パーティクルビーム質量分析、フリット高速原子衝撃質量分析等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、通常の質量分析のみならず、反応槽と一体化された分析装置中で行われる質量分析に適用することも可能である。例えば、ポストカラム反応方式の高速液体クロマトグラフィ装置や、フローインジェクション分析装置のように、分析装置に反応槽又は反応コイルが組み込まれた分析装置において、反応槽又は反応コイルの下流で行われる質量分析に本発明のプローブを適用することができる。この場合、プローブは、反応槽又は反応コイルの上流で試料と混合し、結合反応を反応槽又は反応コイル中で行うことができる。なお、質量分析自体は、市販の装置を用い、装置に添付された指示書に従って容易に行うことができる。
【０１２８】
なお、「液状試料」とは、分析対象である試料化合物が液状である場合の試料化合物、及び試料化合物が固体である場合の該試料化合物の溶液の両者を包含する。
【０１２９】
本発明のプローブを用いた場合には、試料化合物がプローブと結合することによって確実にイオン化されており、結合後のプローブ由来部分の質量も既知であるから、通常の質量分析により高感度、高精度に定量することができる。なお、観察されたピーク値(m/z値）からプローブの分子量を差し引くことにより試料化合物の分子量を算出することができる。
【０１３０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【０１３１】
実施例１ プローブの合成（その１）
【０１３２】
【化５８】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２としてＳＣＮ−を有する上記化合物を合成した。
【０１３４】
【化５９】
（１）2-(2-トリメチルシロキシエトキシ)-2-フェニルエタンニトリルの合成
【０１３６】
【化６０】
50 ml二口フラスコに2-フェニル-1,3-ジオキソラン(化合物1) 3.0 g (19.9 mmol)、トリメチルシリルシアノイド(TMSCN)2.1 ml (21.4 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94 mmol)を加え、窒素気流下、室温で2時間撹拌した。TLC (SiO2; CH2Cl2 : n-ヘキサン = 1 : 4 v/v)で原料消失を確認後、ジエチルエーテル100 mlを加え水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１３８】
収率 93 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 0.12 (s, 9H, Si (CH3)3), 3.65 〜 3.84 (m, 4H, -OCH2CH2O-), 5.42 (s, 1H, Ar-CH), 7.40〜7.58 (m, 5H, ArH)
ESI-TOF [M + Na]+ = 272
【０１３９】
（２）2-(2-アミノ-1-フェニルエトキシ)エタン-1-オールの合成
【０１４０】
【化６１】
100 ml二口フラスコに化合物2 2.0 g (8.0 mmmol) を加え脱気窒素置換後、氷浴下1 M BH3・THF溶液50 mlを30分間かけて滴下した。室温で4時間撹拌後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1 v/v)で原料消失を確認した。氷浴下、6 N HClを加え酸性にした後、溶媒の大部分を減圧留去した。NaOH水溶液を加えpH 10にした後、酢酸エチル100 mlで3回抽出し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１４２】
収率 90 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 2.55 (br s, 3H), 2.83 (dd, 1H), 3.15 (dd, 1H), 3.39〜3.62 (m, 2H), 3.68〜3.78 (m, 2H), 5.00 (dd, 1H), 7.40 7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M]+ = 181
【０１４３】
（３）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-フェニルエチル)フォルムアミドの合成
【０１４４】
【化６２】
30 ml二口フラスコに化合物3 0.50 g (2.76 mmol)を加え脱気窒素置換後、THF 15 ml、トリエチルアミン 0.28 ml (2.76 mmol)、ジ-tert-ブチル-ジカーボネート0.60 g (2.76 mmol)を加え、室温で撹拌した。2時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1)で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1)で精製し、無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１４６】
収率 90 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.37 (s, 9H), 3.10 (s, 3H), 3.51 〜3.64 (m, 4H), 4.33〜4.37 (m, 2H), 4.98 (br s, 1H), 5.01 (dd, 1H), 7.41〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 304
【０１４７】
（４）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-(メチルスルフォニロキシ)エトキシ)-2-フェニルエチルフォルムアミドの合成
【０１４８】
【化６３】
30 ml二口フラスコに化合物4 0.50 g (1.78 mmol)を加え脱気窒素置換後、ジエチルエーテル10.0 ml、トリエチルアミン0.23 g (2.31 mmol)を加えた。氷浴下、メタンスルホニルクロリド0.22 g (1.96 mmol)を加えた後、室温で撹拌した。一時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で原料消失を確認した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で精製し、白色固体を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１５０】
収率88 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.37 (s, 9H), 3.10 (s, 3H), 3.51 〜3.64 (m, 4H), 4.33 ~ 4.37 (m, 2H), 4.98 (br s, 1H), 5.01 (dd, 1H), 7.40 〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 382
【０１５１】
（５）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-ヨードエトキシ)-2-フェニルエチル)フォルムアミドの合成
【０１５２】
【化６４】
30 ml二口フラスコに化合物5 0.50 g (1.39 mmol)を加え脱気窒素置換後、アセトン10.0 ml、ヨウ化ナトリウム1.10 g (7.25 mmol)を加え還流した。2時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1) で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 10 : 1)で精製後、赤色固体を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１５４】
収率85 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.35 (s, 9H), 3.22 (t, 2H), 3.38 〜3.66 (m, 4H), 5.02 (br s, 1H), 5.06 (dd, 1H), 7.41〜 7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 414
【０１５５】
（６）2-(2-ヨードエトキシ)-2-フェニルエタンイソチオシアネートの合成
【０１５６】
【化６５】
10 ml二口フラスコに化合物6 0.20 g (0.51 mmol)を加え脱気窒素置換後、塩化メチレン2.0 ml、トリフルオロ酢酸0.5 mlを加え室温で撹拌した。30分後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、溶媒を減圧留去した。得られた化合物に塩化メチレン : 水 = 1 : 1 v/vの混合溶媒5.0 mlを加えた後、炭酸水素ナトリウム0.30 g、チオホスゲン80.0 μLを加え、室温で撹拌した。1時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、塩化メチレン50 mlで3回抽出後、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄橙色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１５８】
収率80 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 3.26〜3.33 (m, 2H), 3.36〜3.79 (m, 2H), 3.80 (dd, 1H), 3.95 (dd, 1H), 5.24 (dd, 1H), 7.40〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 355
【０１５９】
（７）2-(2-(トリエチルアミノ)エトキシ)-2-フェニルエタンイソチオシアネートヨーダイドの合成
【０１６０】
【化６６】
30 mlなす型フラスコに化合物7 0.20 g (0.60 mmol)、トルエン5.0 ml、トリエチルアミン1.0 mlを加え、室温で撹拌した。24時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、析出した沈殿を分取後、トルエンで洗浄し、黄白色固体を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１６２】
収率92 %
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, TMS, r.t., δ / ppm) 1.30 (t, 9H), 3.04 (q, 6H), 3.75〜3.95 (m, 3H), 4.11 (dd, 1H), 4.10 ~ 4.16 (m, 1H), 4.33 (dd, 1H), 5.54 (dd, 1H), 7.40〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M]+ = 307
【０１６３】
実施例２ プローブの合成（その２）
【０１６４】
【化６７】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２としてＢｒＨ２Ｃ−を有する上記化合物を合成した。
【０１６６】
【化６８】
（１）2-(3,3,4,4-テトラメチル-1-フェニル-3-シラペンチルオキシ)エタン-1-オールの合成
【０１６８】
【化６９】
50 ml二口フラスコに2-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-フェニルエタン-1-オール(化合物1) 3.0 g (16.5 mmol)、t-ブチルジメチルシリルクロリド (TBDMSCl) 2.48 g (16.5 mmol)、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン (DBU) 2.51 ml 16.5 mmol)を加え、窒素気流下、室温で24時間撹拌した。TLCで原料消失を確認後、溶媒を減圧留去し、得られた化合物を塩化メチレンに溶解した。水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０１７０】
（２）(メチルスルホニル)オキシ(2-(3,3,4,4-テトラメチル-1-フェニル-3-シラペンチルオキシ)エタンの合成
【０１７１】
【化７０】
100 ml二口フラスコに化合物2 2.0 g (6.75 mmmol) を加え脱気窒素置換後、ジエチルエーテル20.0 ml、トリエチルアミン0.68 g (6.75 mmol)、メタンスルホニルクロリド0.77 g (6.75 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０１７３】
（３）2-ヨード-1-(3,3,4,4-テトラメチル-1-フェニル-3-シラペンチルオキシ)エタンの合成
【０１７４】
【化７１】
30 ml二口フラスコに化合物3 0.50 g (1.25 mmol)を加え脱気窒素置換後、アセトン 15 ml、ヨウ化ナトリウム 1.49 g (10.0 mmol)を加え、2時間還流した。溶媒を減圧留去後、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０１７６】
（４）トリエチル(2-(3,3,4,4-テトラメチル-1-フェニル-3-シラペンチルオキシ)エチル)アミンの合成
【０１７７】
【化７２】
30 mlなす型フラスコに化合物4 0.50 g (1.25 mmol)、トルエン10.0 ml、トリエチルアミン1.0 mlを加え、室温で24時間撹拌した。析出した沈殿を分取後、トルエンで洗浄した。減圧乾燥後、目的化合物を得た。
【０１７９】
（５）1-(メチルスルホニル)-2-フェニル-2-(2-(トリエチルアミノ)エトキシ)エタンの合成
【０１８０】
【化７３】
30 ml二口フラスコに化合物5 0.50 g (1.37 mmol)、酢酸 : 水 : THF = 3 : 1 : 1 v/vの混合溶媒10. 0 mlを加え室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。得られた化合物に、ジエチルエーテル10 0 ml、トリエチルアミン、メタンスルホニルクロリドを加え、室温で2時間撹拌した。水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０１８２】
（６）(2-(2-ヨード-1-フェニルエトキシ)エチル)トリエチルアミンの合成
【０１８３】
【化７４】
50 mlなす型フラスコに化合物6 0.20 g (0.58 mmol)、アセトン20.0 ml、臭化リチウム0.43 g (5.0 mmol)を加え2時間還流した。溶媒を減圧留去後、エタノールを加えた。不溶物を濾別後、濾液を減圧濃縮し、目的化合物を得た。
【０１８５】
実施例３ プローブの合成（その３）
【０１８６】
【化７５】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２としてＮＨ２−を有する上記化合物を合成した。
【０１８８】
【化７６】
（１）2-(2-トリメチルシロキシエトキシ)-2-フェニルエタンニトリルの合成
【０１９０】
【化７７】
50 ml二口フラスコに2-フェニル-1,3-ジオキソラン(化合物1) 3.0 g (19.9 mmol)、TMSCN2.1 ml (21.4 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94 mmol)を加え、窒素気流下、室温で2時間撹拌した。TLC (SiO2; CH2Cl2 : n-ヘキサン = 1 : 4 v/v)で原料消失を確認後、ジエチルエーテル100 mlを加え水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１９２】
収率 93 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 0.12 (s, 9H, Si (CH3)3), 3.65〜3.84 (m, 4H, -OCH2CH2O-), 5.42 (s, 1H, Ar-CH), 7.40〜7.58 (m, 5H, ArH)
ESI-TOF [M + Na]+ = 272
【０１９３】
（２）2-(2-アミノ-1-フェニルエトキシ)エタン-1-オールの合成
【０１９４】
【化７８】
100 ml二口フラスコに化合物2 2.0 g (8.0 mmmol) を加え脱気窒素置換後、氷浴下1 M BH3・THF溶液50 mlを30分間かけて滴下した。室温で4時間撹拌後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1 v/v)で原料消失を確認した。氷浴下、6 N HClを加え酸性にした後、溶媒の大部分を減圧留去した。NaOH水溶液を加えpH 10にした後、酢酸エチル100 mlで3回抽出し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０１９６】
収率 90 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 2.55 (br s, 3H), 2.83 (dd, 1H), 3.15 (dd, 1H), 3.39 ~ 3.62 (m, 2H), 3.68 ~ 3.78 (m, 2H), 5.00 (dd, 1H), 7.40〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M]+ = 181
【０１９７】
（３）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-フェニルエチル)フォルムアミドの合成
【０１９８】
【化７９】
30 ml二口フラスコに化合物3 0.50 g (2.76 mmol)を加え脱気窒素置換後、THF 15 ml、トリエチルアミン 0.28 ml (2.76 mmol)、ジ-tert-ブチル-ジカーボネート0.60 g (2.76 mmol)を加え、室温で撹拌した。2時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1)で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1)で精製し、無色オイル状化合物を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０２００】
収率 90 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.37 (s, 9H), 3.10 (s, 3H), 3.51〜3.64 (m, 4H), 4.33 ~ 4.37 (m, 2H), 4.98 (br s, 1H), 5.01 (dd, 1H), 7.41〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 304
【０２０１】
（４）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-(メチルスルフォニロキシ)エトキシ)-2-フェニルエチルフォルムアミドの合成
【０２０２】
【化８０】
30 ml二口フラスコに化合物4 0.50 g (1.78 mmol)を加え脱気窒素置換後、ジエチルエーテル10.0 ml、トリエチルアミン0.23 g (2.31 mmol)を加えた。氷浴下、メタンスルホニルクロリド(MsCl)0.22 g (1.96 mmol)を加えた後、室温で撹拌した。一時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で原料消失を確認した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で精製し、白色固体を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０２０４】
収率88 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.37 (s, 9H), 3.10 (s, 3H), 3.51〜3.64 (m, 4H), 4.33 ~ 4.37 (m, 2H), 4.98 (br s, 1H), 5.01 (dd, 1H), 7.40〜7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 382
【０２０５】
（５）(tert-ブトキシ)-N-(2-(2-ヨードエトキシ)-2-フェニルエチル)フォルムアミドの合成
【０２０６】
【化８１】
30 ml二口フラスコに化合物5 0.50 g (1.39 mmol)を加え脱気窒素置換後、アセトン10.0 ml、ヨウ化ナトリウム1.10 g (7.25 mmol)を加え還流した。2時間後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1) で原料消失を確認後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 10 : 1)で精製後、赤色固体を得た。同定は1H-NMR、ESI-TOF質量分析を用いて行った。
【０２０８】
収率85 %
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ / ppm) 1.35 (s, 9H), 3.22 (t, 2H), 3.38〜3.66 (m, 4H), 5.02 (br s, 1H), 5.06 (dd, 1H), 7.41 ~ 7.58 (m, 5H)
ESI-TOF [M + Na]+ = 414
【０２０９】
（６）N-(2-(2-ヨードエトキシ)-2-フェニルエチル)-3-オキソブタンアミドの合成
【０２１０】
【化８２】
10 ml二口フラスコに化合物6 0.20 g (0.51 mmol)を加え脱気窒素置換後、塩化メチレン2.0 ml、トリフルオロ酢酸0.5 mlを加え室温で撹拌した。30分後、TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、溶媒を減圧留去した。得られた化合物に塩化メチレン5.0 ml、トリエチルアミン0.05 g (0.51 mmol)、アセト酢酸0.05 g (0.51 mmol)を加え、氷浴下30分間撹拌した。BOP(Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate)試薬0.22 g (0.51 mmol)を添加後、氷浴下で30分間、室温に戻した後24時間撹拌した。TLC (SiO2; n-ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1) で原料消失を確認し、塩化メチレン50 mlで3回抽出後、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、化合物を得た。
【０２１２】
（７）3-アミノ-N-(2-(2-ヨードエトキシ)-2-フェニルエチル)-2-ブテンアミドの合成
【０２１３】
【化８３】
10 mlなす型フラスコに化合物7 0.20 g (0.60 mmol)、アンモニア水 5.0 ml、モントモリロナイトK-10 0.1 gを加え、24時間室温で撹拌した。塩化メチレンで抽出後、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２１５】
（８）3-アミノ-N-(2-フェニル-2-(2-(トリエチルアミノ)エトキシ)エチル)-2-ブテンアミドの合成
【０２１６】
【化８４】
10 mlなす型フラスコに化合物8 0.20 g (0.58 mmol)、トルエン5.0 ml、トリエチルアミン1.0 mlを加え、室温で24時間撹拌した。析出した沈殿を分取後、トルエンで洗浄し減圧乾燥した。
【０２１８】
実施例４ プローブの合成（その４）
【０２１９】
【化８５】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として-COCH2Brを有する上記化合物を合成した。
スキーム
【０２２１】
【化８６】
(1) フェニル-(2-トリメチルシラニルオキシ-エトキシ)-アセトニトリル（化合物2）の合成
【０２２３】
【化８７】
30 mlナス型フラスコに2-フェニル-1,3-ペンタジオン(化合物 1 ) 3.0 g (19.9 mmol) を加え氷浴につけた後、TMSCN 2.1ml (21.43 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94mmol)を加え、室温で2 時間攪拌した。反応溶液にジエチルエーテルを加え、水で洗浄後、MgSO4を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質(4.17g, 収率83.2 %)を得た。
【０２２５】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 0.15(s, 9H, SiCH3), 3.80(t, 2H, -OCH2CH2OSi-), 4.11(t, 2H, -OCH2CH2OSi-), 5.39(s, 1H, ArCH) , 7.45(m, 5H, ArH)
ESI-TOF(+): [M + Na]+ = 272.0
【０２２６】
(2) 2-(2-アミノ-1-フェニル-エトキシ)-エタノール(化合物3)の合成
【０２２７】
【化８８】
100 ml三口フラスコに、化合物2 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて１M BH3・THF溶液 30mlをゆっくりと加えた。氷浴中で30分間、室温で4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、1N HCl水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水20mlを加え、NaOH水溶液を加えpH 10とした。酢酸エチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無色オイル状の化合物(650mg, 収率89.5 %)を得た。
【０２２９】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 2.95(d, 2H, NH2-CH2) , 3.65(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.75(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.46(t, 1H, ArCH) , 7.32(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [M + H]+ = 182.0
【０２３０】
(3) [2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物4)の合成
【０２３１】
【化８９】
100 ml二口フラスコに、化合物3 1.40 g (7.70 mmol)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥THF 55 ml 、TEA 0.78 g (7.69 mmol)、Di-tert-butyl-dicarbonate 1.68 g (7.70 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（SiO2、クロロホルム）で精製し、黄色油状化合物(1.30g, 収率59.9 %)を得た。
【０２３３】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.48(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH3) , 3.49(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.73(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.42(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 304.0
【０２３４】
(4) メタンスルホン酸2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチルエステル(化合物5)の合成
【０２３５】
【化９０】
50 mlナス型フラスコに、化合物4 500 mg (1.78 mmol) を加え窒素置換後、乾燥THF 16 ml 、TEA 0.5 ml (4.55 mmol) を加えて氷浴につけた。MsCl 440 mg (3.84 mmol) を加え、室温で一時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、クロロホルムを加えて析出した沈殿をろ別後，ろ液を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, 酢酸エチル : n-ヘキサン = 2 : 1 v/v) で精製し、黄色油状物質(491mg, 収率77.0 %)を得た。
【０２３７】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.44(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH2) , 3.44(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 3.62(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 4.34(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 382.2
【０２３８】
(5) [2-(2-ヨード-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物6)の合成
【０２３９】
【化９１】
50 mlナス型フラスコに、化合物5 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン10 ml、NaI 1.0 g (6.67 mmol)を加えて2時間還流した。NaIをろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, n-ヘキサン：酢酸エチル = 1：1 v/v) で精製し、黄色油状化合物(104mg, 収率93.99 %)を得た。
【０２４１】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.45(s, 9H, t-Bu) , 3.22(t, 2H, I-CH2) , 3.49(d, 2H, NH-CH2), 3.67(t, 2H, -OCH2), 4.43(t, 1H, ArCH), 7.34(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [M + Na]+ = 413.9
【０２４２】
(6) [2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチル]-トリエチル-アンモニウム ヨウ化物(化合物7)の合成
【０２４３】
【化９２】
50 mlナス型フラスコに、化合物6 350 mg (0.90 mmol)、トルエン8.75 ml、TEA 1.75 ml (17.33 mmol)を加えて、80 ℃で24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー(SiO2, クロロホルム：メタノール=7：1 v/v)で精製し、赤黄色固体物質(383mg, 収率66.70%)を得た。
【０２４５】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.42(t, 9H, CH2-CH3), 1.48(s, 9H, t-Bu), 3.53(q, 6H, NR3-CH2), 3.70(t, 2H, -OCH2CH2N-), 3.72(d, 2H, NH-CH2), 3.95(t, 2H, -OCH2CH2N-), 4.63(t, 1H, ArCH), 7.35(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M ]+ = 365.2
【０２４６】
(7) 化合物8の合成
【０２４７】
【化９３】
30 mlナス型フラスコに化合物7 0.50 g (1.02 mmol)、TFA （トリフルオロ酢酸）0.50 ml、塩化メチレン10.0 mlを加え、室温で30分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、THF 20.0 ml、TEA 0.10 g (1.02 mmol)、BOP 0.10 g (1.02 mmol)、4-ブロモメチルアセチル安息香酸0.25 g (1.02 mmol)を加え室温で24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０２４９】
実施例５ プローブの合成（その５）
【０２５０】
【化９４】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として-COCHOを有する上記化合物を合成した。
スキーム
【０２５２】
【化９５】
(1) フェニル-(2-トリメチルシラニルオキシ-エトキシ)-アセトニトリル(化合物2) の合成
【０２５４】
【化９６】
30 mlナス型フラスコに2-フェニル-1,3-ペンタジオン(化合物1) 3.0 g (19.9 mmol) を加え氷浴につけた後、TMSCN 2.1ml (21.43 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94mmol)を加え、室温で2 時間攪拌した。反応溶液にジエチルエーテルを加え、水で洗浄後、MgSO4を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質(4.17g, 収率83.2 %)を得た。
【０２５６】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 0.15(s, 9H, SiCH3) , 3.80(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 4.11(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 5.39(s, 1H, ArCH) , 7.45(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 272.0
【０２５７】
(2) 2-(2-アミノ-1-フェニル-エトキシ)-エタノール(化合物3)の合成
【０２５８】
【化９７】
100 ml三口フラスコに、化合物2 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて１M BH3・THF溶液 30ml をゆっくりと加えた。氷浴中で30分間、室温で4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、1N HCl水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水20mlを加え、NaOH水溶液を加えpH 10とした。酢酸エチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無色オイル状の化合物(650mg, 収率89.5 %)を得た。
【０２６０】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 2.95(d, 2H, NH2-CH2) , 3.65(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.75(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.46(t, 1H, ArCH) , 7.32(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + H ]+ = 182.0
【０２６１】
(3) [2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物4)の合成
【０２６２】
【化９８】
100 ml二口フラスコに、化合物3 1.40 g (7.70 mmol)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥THF 55 ml 、TEA 0.78 g (7.69 mmol)、ジ-tert-ブチル-ジカーボネート1.68 g (7.70 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（SiO2、クロロホルム）で精製し、黄色油状化合物(1.30g, 収率59.9 %)を得た。
【０２６４】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.48(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH3) , 3.49(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.73(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.42(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 304.0
【０２６５】
(4) メタンスルホン酸2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチルエステル(化合物5)の合成
【０２６６】
【化９９】
50 mlナス型フラスコに、化合物4 500 mg (1.78 mmol) を加え窒素置換後、乾燥THF 16 ml 、TEA 0.5 ml (4.55 mmol) を加えて氷浴につけた。MsCl 440 mg (3.84 mmol) を加え、室温で一時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、クロロホルムを加えて析出した沈殿をろ別後，ろ液を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, 酢酸エチル : n-ヘキサン = 2 : 1 v/v) で精製し、黄色油状物質(491mg, 収率77.0 %)を得た。
【０２６８】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.44(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH2) , 3.44(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 3.62(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 4.34(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 382.2
【０２６９】
(5) [2-(2-ヨード-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物6)の合成
【０２７０】
【化１００】
50 mlナス型フラスコに、化合物5 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン10 ml、NaI 1.0 g (6.67 mmol)を加えて2時間還流した。NaIをろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, n-ヘキサン：酢酸エチル = 1：1 v/v) で精製し、黄色油状化合物(104mg, 収率93.99 %)を得た。
【０２７２】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.45(s, 9H, t-Bu) , 3.22(t, 2H, I-CH2) , 3.49(d, 2H, NH-CH2) , 3.67(t, 2H, -OCH2) , 4.43(t, 1H, ArCH) , 7.34(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 413.9
【０２７３】
(6) [2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチル]-トリエチルアンモニウム ヨウ化物(化合物7)の合成
【０２７４】
【化１０１】
50 mlナス型フラスコに、化合物6 350 mg (0.90 mmol)、トルエン8.75 ml、TEA 1.75 ml (17.33 mmol)を加えて、80 ℃で24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー(SiO2, クロロホルム：メタノール=7：1 v/v)で精製し、赤黄色固体物質(383mg, 収率66.70%)を得た。
【０２７６】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.42(t, 9H, CH2-CH3) , 1.48(s, 9H, t-Bu), 3.53(q, 6H, NR3-CH2), 3.70(t, 2H, -OCH2CH2N-), 3.72(d, 2H, NH-CH2), 3.95(t, 2H, -OCH2CH2N-), 4.63(t, 1H, ArCH), 7.35(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M ]+ = 365.2
【０２７７】
(7) 化合物8の合成
【０２７８】
【化１０２】
30 mlナス型フラスコに化合物7 0.50 g (1.02 mmol)、TFA 0.50 ml、塩化メチレン10.0 mlを加え、室温で30分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、THF 20.0 ml、TEA 0.10 g (1.02 mmol)、BOP 0.10 g (1.02 mmol)、4-ブロモメチルアセチル安息香酸0.25 g (1.02 mmol)を加え室温で24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０２８０】
(8) 化合物9の合成
【０２８１】
【化１０３】
20 mlナス型フラスコに化合物8 0.25 g (0.41 mmol)、DMSO 5.0 mlを加え、室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し目的化合物を得た。
【０２８３】
実施例６ プローブの合成（その６）
【０２８４】
【化１０４】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として-CH2CH2NH2 を有する上記化合物を合成した。
【０２８６】
【化１０５】
(1) フェニル-(2-トリメチルシラニルオキシ-エトキシ)-アセトニトリル(化合物2) の合成
【０２８８】
【化１０６】
30 mlナス型フラスコに2-フェニル-1,3-ペンタジオン(化合物1) 3.0 g (19.9 mmol) を加え氷浴につけた後、TMSCN 2.1ml (21.43 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94mmol)を加え、室温で2 時間攪拌した。反応溶液にジエチルエーテルを加え、水で洗浄後、MgSO4を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質(4.17g, 収率83.2 %)を得た。
【０２９０】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 0.15(s, 9H, SiCH3) , 3.80(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 4.11(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 5.39(s, 1H, ArCH) , 7.45(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 272.0
【０２９１】
(2) 2-(2-アミノ-1-フェニル-エトキシ)-エタノール(化合物3)の合成
【０２９２】
【化１０７】
100 ml三口フラスコに、化合物2 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて１M BH3・THF溶液 30ml をゆっくりと加えた。氷浴中で30分間、室温で4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、1N HCl水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水20mlを加え、NaOH水溶液を加えpH 10とした。酢酸エチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無色オイル状の化合物(650mg, 収率89.5 %)を得た。
【０２９４】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 2.95(d, 2H, NH2-CH2) , 3.65(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.75(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.46(t, 1H, ArCH) , 7.32(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + H ]+ = 182.0
【０２９５】
(3) [2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物4)の合成
【０２９６】
【化１０８】
100 ml二口フラスコに、化合物3 1.40 g (7.70 mmol)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥THF 55 ml 、TEA 0.78 g (7.69 mmol)、ジ-tert-ブチル-ジカーボネート1.68 g (7.70 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（SiO2、クロロホルム）で精製し、黄色油状化合物(1.30g, 収率59.9 %)を得た。
【０２９８】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.48(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH3) , 3.49(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.73(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.42(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 304.0
【０２９９】
(4) メタンスルホン酸2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチルエステル(化合物5)の合成
【０３００】
【化１０９】
50 mlナス型フラスコに、化合物5 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン10 ml、NaI 1.0 g (6.67 mmol)を加えて2時間還流した。NaIをろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, n-ヘキサン：酢酸エチル = 1：1 v/v) で精製し、黄色油状化合物(104mg, 収率93.99 %)を得た。
【０３０２】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.45(s, 9H, t-Bu) , 3.22(t, 2H, I-CH2) , 3.49(d, 2H, NH-CH2) , 3.67(t, 2H, -OCH2) , 4.43(t, 1H, ArCH) , 7.34(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 413.9
【０３０３】
(5) [2-(2-ヨード-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物6)の合成
【０３０４】
【化１１０】
50 mlナス型フラスコに、化合物5 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン10 ml、NaI 1.0 g (6.67 mmol)を加えて2時間還流した。NaIをろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, n-ヘキサン：酢酸エチル = 1：1 v/v) で精製し、黄色油状化合物(104mg, 収率93.99 %)を得た。
【０３０６】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.45(s, 9H, t-Bu) , 3.22(t, 2H, I-CH2) , 3.49(d, 2H, NH-CH2) , 3.67(t, 2H, -OCH2) , 4.43(t, 1H, ArCH) , 7.34(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 413.9
【０３０７】
(6) [2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチル]-トリエチルアンモニウム ヨウ化物(化合物7)の合成
【０３０８】
【化１１１】
50 mlナス型フラスコに、化合物6 350 mg (0.90 mmol)、トルエン8.75 ml、TEA 1.75 ml (17.33 mmol)を加えて、80 ℃で24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー(SiO2, クロロホルム：メタノール=7：1 v/v)で精製し、赤黄色固体物質(383mg, 収率66.70%)を得た。
【０３１０】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.42(t, 9H, CH2-CH3), 1.48(s, 9H, t-Bu), 3.53(q, 6H, NR3-CH2), 3.70(t, 2H, -OCH2CH2N-), 3.72(d, 2H, NH-CH2), 3.95(t, 2H, -OCH2CH2N-), 4.63(t, 1H, ArCH), 7.35(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M ]+ = 365.2
【０３１１】
(7) 化合物8の合成
【０３１２】
【化１１２】
30 mlナス型フラスコに化合物7 0.50 g (1.02 mmol)、TFA 0.50 ml、塩化メチレン10.0 mlを加え、室温で30分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、THF 20.0 ml、TEA 0.10 g (1.02 mmol)、BOP 0.10 g (1.02 mmol)、β-アラニン0.10 g (1.02 mmol)を加え室温で24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０３１４】
実施例７ プローブの合成（その７）
【０３１５】
【化１１３】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として
【０３１７】
【化１１４】
を有する上記化合物を合成した。
【０３１９】
【化１１５】
(1) フェニル-(2-トリメチルシラニルオキシ-エトキシ)-アセトニトリル(化合物2) の合成
【０３２１】
【化１１６】
30 mlナス型フラスコに2-フェニル-1,3-ペンタジオン(化合物1) 3.0 g (19.9 mmol) を加え氷浴につけた後、TMSCN 2.1ml (21.43 mmol)、ZnI2 0.3 g (0.94mmol)を加え、室温で2 時間攪拌した。反応溶液にジエチルエーテルを加え、水で洗浄後、MgSO4を用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、黄色油状物質(4.17g, 収率83.2 %)を得た。
【０３２３】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 0.15(s, 9H, SiCH3) , 3.80(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 4.11(t, 2H, -OCH2CH2OSi-) , 5.39(s, 1H, ArCH) , 7.45(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 272.0
【０３２４】
(2) 2-(2-アミノ-1-フェニル-エトキシ)-エタノール(化合物3)の合成
【０３２５】
【化１１７】
100 ml三口フラスコに、化合物2 1.0 g (4.01 mmol)を反応容器に加え、脱気窒素置換後、氷浴につけて１M BH3・THF溶液 30ml をゆっくりと加えた。氷浴中で30分間、室温で4時間攪拌させた。反応終了後、反応容器を氷浴につけ、1N HCl水溶液を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、水20mlを加え、NaOH水溶液を加えpH 10とした。酢酸エチルを加えて抽出した後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無色オイル状の化合物(650mg, 収率89.5 %)を得た。
【０３２７】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 2.95(d, 2H, NH2-CH2) , 3.65(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.75(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.46(t, 1H, ArCH) , 7.32(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + H ]+ = 182.0
【０３２８】
(3) [2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物4)の合成
【０３２９】
【化１１８】
100 ml二口フラスコに、化合物3 1.40 g (7.70 mmol)を入れ窒素置換後、氷浴中で乾燥THF 55 ml 、TEA 0.78 g (7.69 mmol)、ジ-tert-ブチルジカーボネート1.68 g (7.70 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（SiO2、クロロホルム）で精製し、黄色油状化合物(1.30g, 収率59.9 %)を得た。
【０３３１】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.48(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH3) , 3.49(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 3.73(t, 2H, -OCH2CH2OH) , 4.42(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 304.0
【０３３２】
(4) メタンスルホン酸2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチルエステル(化合物5)の合成
【０３３３】
【化１１９】
50 mlナス型フラスコに、化合物4 500 mg (1.78 mmol) を加え窒素置換後、乾燥THF 16 ml 、TEA 0.5 ml (4.55 mmol) を加えて氷浴につけた。MsCl 440 mg (3.84 mmol) を加え、室温で一時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、クロロホルムを加えて析出した沈殿をろ別後，ろ液を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, 酢酸エチル : n-ヘキサン = 2 : 1 v/v) で精製し、黄色油状物質(491mg, 収率77.0 %)を得た。
【０３３５】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.44(s, 9H, t-Bu) , 3.24(d, 2H, NH-CH2) , 3.44(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 3.62(t, 2H, -OCH2CH2OS-) , 4.34(t, 1H, ArCH) , 7.33(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 382.2
【０３３６】
(5) [2-(2-ヨード-エトキシ)-2-フェニル-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(化合物6)の合成
【０３３７】
【化１２０】
50 mlナス型フラスコに、化合物5 100 mg (0.28 mmol)を加え、窒素置換後、アセトン10 ml、NaI 1.0 g (6.67 mmol)を加えて2時間還流した。NaIをろ別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー(SiO2, n-ヘキサン：酢酸エチル = 1：1 v/v) で精製し、黄色油状化合物(104mg, 収率93.99 %)を得た。
【０３３９】
1H-NMR (270MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.45(s, 9H, t-Bu) , 3.22(t, 2H, I-CH2) , 3.49(d, 2H, NH-CH2) , 3.67(t, 2H, -OCH2) , 4.43(t, 1H, ArCH), 7.34(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M + Na ]+ = 413.9
【０３４０】
(6) [2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-フェニル-エトキシ)-エチル]-トリエチルアンモニウム ヨウ化物(化合物7)の合成
【０３４１】
【化１２１】
50 mlナス型フラスコに、化合物6 350 mg (0.90 mmol)、トルエン8.75 ml、TEA 1.75 ml (17.33 mmol)を加えて、80 ℃で24時間反応を行なった。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー(SiO2, クロロホルム：メタノール=7：1 v/v)で精製し、赤黄色固体物質(383mg, 収率66.70%)を得た。
【０３４３】
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t., δ/ppm) 1.42(t, 9H, CH2-CH3) , 1.48(s, 9H, t-Bu) , 3.53(q, 6H, NR3-CH2) , 3.70(t, 2H, -OCH2CH2N-) , 3.72(d, 2H, NH-CH2) , 3.95(t, 2H, -OCH2CH2N-), 4.63(t, 1H, ArCH), 7.35(m, 5H, ArH)
ESI-TOF (+) : [ M ]+ = 365.2
【０３４４】
(7) 化合物8の合成
【０３４５】
【化１２２】
30 mlナス型フラスコに化合物7 0.50 g (1.02 mmol)、TFA 0.50 ml、塩化メチレン10.0 mlを加え、室温で30分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。窒素置換後、THF 20.0 ml、TEA 0.10 g (1.02 mmol)、BOP 0.10 g (1.02 mmol)、2-ブロモ-4-メチルペンタン酸0.20 g (1.02 mmol)を加え室温で24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。
【０３４７】
参考例８ プローブの合成（その８）
【０３４８】
【化１２３】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２としてシクロデキストリン（グルコピラノース単位の数７）を有する上記化合物を合成した。
【０３５０】
【化１２４】
(1) 化合物2の合成
【０３５２】
【化１２５】
100 mlナス型フラスコにモノ-6-デオキシ-6-アミノ-β-シクロデキストリン(1) 2.0 g (1.59 mmol)、無水酢酸20.0 ml、ピリジン10.0 mlを加え、室温で24時間撹拌した。反応溶液を冷水にあけ、エーテルで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、目的化合物を得た。
【０３５４】
(2) 化合物3の合成
【０３５５】
【化１２６】
100 ml三口フラスコに化合物2 1.0 g (0.37 mmol)、ヨウ化メチル 0.26 g (1.85 mmol)、トリエチルアミン 0.05 g (0.40 mmol)、乾燥DMF 20.0 mlを加え、窒素気流下、室温で24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、再沈殿操作を行い目的化合物を得た。
【０３５７】
(3) 化合物4の合成
【０３５８】
【化１２７】
50 mlナス型フラスコに化合物3 1.0 g (0.35 mmol) 、1.0 M NaOH水溶液5.0 ml、エタノール20.0 mlを加え、5時間還流した。溶媒の大部分を減圧留去後、水20 mlを加え、1N HClで酸性にした。溶媒を減圧留去後、再沈殿操作により精製し、目的化合物を得た。
【０３６０】
実施例９ プローブの合成（その９）
【０３６１】
【化１２８】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として−ＯＮＨ２を有する上記化合物を合成した。
【０３６３】
【化１２９】
(1) 化合物2の合成
【０３６５】
【化１３０】
100 mlナス型フラスコに、化合物1 3.0 g (27.5 mmol)、水30.0 ml、トリエチルアミン3.46 g (34.3 mmol)を加え、氷浴につけた。Zクロリド4.8 g (27.5 mmol)をジエチルエーテル10.0 mlに溶解し、滴下ロートを用いて加えた。氷浴下で30分間、室温に戻して7時間撹拌した。酢酸エチルで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、カラムクロマトグラフィー(SiO2, CHCl3 : 酢酸エチル= 2 : 3 v/v)で精製し、目的化合物を得た。
【０３６７】
(2) 化合物3の合成
【０３６８】
【化１３１】
100 ml三口フラスコに、化合物2 2.0 g (10.3 mmol)、乾燥塩化メチレン50.0 ml、トリエチルアミン1.1 g(11.0 mmol)を加え、氷浴につけた。p-キシリレンジアミン1.4 g (11.0 mmol)及びBOP試薬4.8 g(11.0 mmol)を加え、氷浴下で30分間、室温に戻して12時間撹拌した。水を加えて反応を停止後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー(SiO2, CHCl3 : 酢酸エチル = 1 : 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。
【０３７０】
(3) 化合物4の合成
【０３７１】
【化１３２】
100 mlナス型フラスコに化合物3 2.0 g (6.0 mmol)、トルエン50.0 mlおよびヨウ化メチル8.5 g (60.0 mmol)を加え80 ℃で加熱撹拌した。析出した沈殿を分取後、トルエンで洗浄し、目的化合物を得た。
【０３７３】
(4) 化合物5の合成
【０３７４】
【化１３３】
100 mlナス型フラスコに化合物4 2.0 g (5.0 mmol)、エタノールを加え窒素置換、および水素置換した。パラジウムカーボン0.1 gを加え、室温で5時間撹拌した。パラジウムカーボンを濾別後、溶媒を減圧留去し、目的化合物を得た。
【０３７６】
実施例１０ プローブの合成（その１０）
【０３７７】
【化１３４】
下記のスキームに従い、Ｒ１として第四級アミン、Ｒ２として-NHNH2を有する上記化合物を合成した。
【０３７９】
(1) 化合物2の合成
【０３８０】
【化１３５】
100 mlナス型フラスコに化合物1 3.0 g (19.8 mmol)、アセトン50.0 ml、ヨウ化メチル14.1 g (100.0 mmol)、炭酸カリウム6.9 g (50.0 mmol)を加え、窒素気流下、24時間還流した。炭酸カリウムを濾別後、溶媒を減圧留去した。反応混合物にクロロホルムを加え、析出した沈殿を分取した。クロロホルムで洗浄し、目的化合物を得た。
【０３８２】
(2) 化合物3の合成
【０３８３】
【化１３６】
100 mlナス型フラスコに化合物2 2.0 g (6.25 mmol)、エタノール30.0 ml、ヒドラジン0.22 g (7.0 mmol)を加え、室温で5時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、目的化合物を得た。
【０３８５】
実施例１１ エレクトロスプレーイオン化質量分析
(1) 試料化合物とプローブの結合
下記反応式に示すように、実施例１で合成したプローブ（化合物１）と、試料化合物（化合物２）とを結合した。この反応は、試験管に10.0 mMの化合物1および化合物2のアセトニトリル(またはTHF)溶液をとり、両者を混合後、室温で30分間撹拌することにより行った。
【０３８６】
【化１３７】
(2) エレクトロスプレーイオン化質量分析
(1)で得られた反応産物を1.0μＭに希釈後、Applied Biosystems社製のESI-TOF質量分析計(Mariner）を用いて測定した。用いた質量分析計の構成を図３に示す。シリンジポンプより10.0 μL / minの流速で、常時移動溶媒(MeOH、水等)を流した。試料溶液はマイクロシリンジを用いて、インジェクターから導入した。試料溶液は移動溶媒の流れに沿って、質量分析計に向かう。
【０３８８】
質量分析計の設定条件は以下の通りであった。
スプレーチップ電位(Spray tip potential) : 3450 V
ノズル電位(Nozzle Potential) : 184 V
Quad RF電圧(Quad RF voltage) : 1000 V
噴霧器ガス流速(Flow rate of Nebulizer gas) (N2) : 0.25 L/分
補助ガス流速(Flow rate of Auxiliary gas) (N2) : 1.0 L/分
カウンター流温度(Temperature of the counter stream) : 160℃
【０３８９】
測定結果を図１に示す。なお、比較のため、プローブのみを1.0μＭに希釈後、同様にして質量分析を行った。結果を図２に示す。
【０３９０】
図１及び図２から明らかなように、試料化合物とプローブとの結合物は、プローブ単独の場合とは異なる位置に鋭いピークを示した。これにより、上記方法により、エレクトロスプレーイオン化質量分析が高感度、高精度に行うことができることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の実施例１１において実施した、エレクトロスプレーイオン化質量分析により得られた質量スペクトルを示す。
図２は、本発明の実施例１１において実施した、プローブのみの場合のエレクトロスプレーイオン化質量分析により得られた質量スペクトルを示す。
図３は、実施例１１において実施した質量分析に用いた質量分析計の構成を模式的に示す図である。
Claims (11)
- 一般式[I]
Ｒ２−Ａ−Ｒ１ [I]
（但し、式中、Ｒ１は溶媒中でイオンとなるイオン性官能基、Ｒ２は他の官能基と反応して共有結合し得る官能基、Ａは下記一般式 [III]
−ＣＨ ２ −の１個以上かつ半数以下が−Ｏ−、−ＣＯ−及び−ＮＨ−から成る群より選ばれる１又は２以上の基であり、１又は２以上の炭素数１〜２０のアルキル基で置換されていてもよく、Ａｒは、１ないし５個の炭素数１〜２０のアルキル基で置換されていてもよい芳香環である）
で表されるスペーサー部を示す）
で表される液状試料の質量分析用プローブと、液状試料中の試料化合物とを結合させ、得られた結合物を質量分析にかけることを含む質量分析方法（ただし、還元性オリゴ糖の還元末端にトリアルキル(p-アミノフェニル）アンモニウム塩を作用させて得られうるオリゴ糖を大気圧イオン化法によってイオン化する方法を除く）。 - Ｒ１は、アミン、カルボン酸若しくはその塩、スルホン酸若しくはその塩、又は
である請求項１記載の方法。 - Ｒ１は、一般式[II]
で表されるアミンである請求項２記載の方法。 - 前記一般式[II]中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に、水素、ハロゲン又は炭素数１〜２０の直鎖状若しくは分枝状アルキル基を示す）
で表される請求項３記載の方法。 - Ｒ２はＳＣＮ−、ＣlＯ２Ｓ−、
−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＣＨ２Ｉ、
- Ａは、下記一般式[IV]
又は下記一般式[V]
で表される請求項１記載の方法。 - 前記プローブの分子量が１０００以下である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
- エレクトロスプレーイオン化質量分析法により行なう請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
- Ｒ２は、
【化１１】
（ただし、ｎは１〜５の整数を示す）
で表される基である請求項１記載の方法。 - Ｒ２は、光学活性を有する基である請求項１記載の方法。
- Ｒ２は、一般式[VIII]
で表される基である請求項１記載の方法。
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