JP2006038745A - ペプチド類の質量分析方法及びフラーレン誘導体、並びにフラーレン−ペプチド類複合体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ネガティブモードで高感度に質量分析を行なうことが可能なペプチド類の質量分析方法を提供する。
【解決手段】 ペプチド類を、下記式（１）で表わされる官能基を有するフラーレン誘導体と反応させて得られた生成物を用いて、質量分析を行なう。

（式（１）中、Ｘは、下記式（ａ）で表わされる構造を有する炭素数３以上、１０以下の有機基を表わす。

但し、Ｘは式（ａ）の窒素原子において、式（１）のカルボキシル基に結合する。）
【選択図】 なし

Description

本発明は、フラーレン誘導体を用いてペプチド類の分子量、ペプチド類の構成単位であるアミノ酸の配列及びアミノ酸を修飾するリン酸基、硫酸基、糖鎖などの修飾基の位置と数とを特定するための方法と、それに好適に用いられる新規なフラーレン誘導体、並びにフラーレン−ペプチド類複合体及びその製造方法に関する。

１９９０年にフラーレンＣ₆₀の大量合成法が確立されて以来、フラーレンに関する研究が精力的に展開されている。その結果、数多くのフラーレン誘導体が合成され、その多様な機能が明らかにされてきた。それに伴い、フラーレン誘導体を用いた電子伝導材料、半導体、生理活性物質等の各種用途の開発が進められている（非特許文献１〜３）。

一方、ペプチド類は生体内で重要な役割を果たしており、その同定技術は極めて重要である。ペプチド類は基本的にアミノ酸から構成された分子であり、ペプチド類の分子量、アミノ酸の種類及び配列、アミノ酸への修飾基の種類及びその位置を特定することが重要な技術となっている（非特許文献４、特許文献１）。例えば、特許文献１には、質量分析が困難であったペプチド類の分子量を測定する際、分解イオンの発生を容易に行なうために、電荷を有するアミノ酸をペプチド類のＮ末端に結合させ、これを分離検出して測定することにより、元の分子量を求める方法が報告されている。しかしながら、何れの方法においても、ポジティブモードにより測定を行なっている。

一方、ペプチド類とフラーレン誘導体との複合体はすでに報告されており、主に生理活性の興味から、種々のフラーレン誘導体部位をペプチド類に導入された複合体が報告されている（総説として非特許文献５、非特許文献６参照）。これらは生理活性の他、例えば自己集合体としてイオンチャンネルとしての用途が研究されている（非特許文献７）。しかしながら、ペプチド類の質量分析への適用については殆ど記載がない。

その製造方法として、例えば非特許文献８では、−ＣＯ₂ ^tＢｕ基（ここで「^tＢｕ」はｔｅｒｔ−ブチル基を表わす。）を有するフラーレン誘導体を、一旦カルボン酸とした後に酸クロリドとし、ペプチド類と反応させる方法が開示されている。また、非特許文献９には、ジシクロヘキシルカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを脱水縮合剤として用い、カルボン酸部位を有するフラーレン誘導体とペプチド類とを反応させて、フラーレン−ペプチド類複合体を製造する方法が開示されている。

特開平１０−９０２２６号公報 現代化学１９９２年４月号１２頁 現代化学２０００年６月号４６頁 Chemical Reviews 1998, 98, 2527 Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 1493 Fullerene Sci. Technol. 7, 973 (1999). J. Peptide Sci. 7, 208 (2001). J. Peptide Sci. 9, 784 (2003). J. Org. Chem. 1993, 58, 5578. J. Med. Chem. 1994, 37, 4558.

しかしながら、非特許文献８，９記載の方法でペプチド類にフラーレン部位を導入する場合、反応が複数の段階からなり、かつ複数の試薬を用いる必要があるなど、導入の際の手法が煩雑である。また、反応時間が長く、ペプチド類にフラーレン部位を導入して即座に質量分析に供することは困難である。更に、リン酸化ペプチド類や硫酸化ペプチド類といった反応性基で修飾されたペプチド類を壊さずにフラーレン部位を導入するのは、これらの反応条件では困難であり、かつペプチド類へのフラーレン部位の導入効率は十分とは言えなかった。従って、より操作が簡便で、高活性であり、かつ穏和な条件で用いることができるフラーレン部位導入試薬が求められていた。

一方、生体内に存在するペプチド類の単離及び同定を迅速に正確に行なうことは極めて重要になってきており、その実用的な分析方法が求められている。特に、ペプチド類の質量分析ではポジティブモードでのイオン化が一般的であり、ネガティブモードでのイオン化は行なわれていない。このため、ネガティブモードでのイオン化が可能なペプチド類の質量分析方法が求められていた。

本発明は、上記の課題に鑑みて創案されたもので、その目的は、ネガティブモードで高感度に質量分析を行なうことが可能なペプチド類の質量分析方法を提供するとともに、ペプチド類に効率的にフラーレン部位を導入することが可能なフラーレン誘導体を提供することに存する。

本発明者らは、ペプチド類の質量分析方法について鋭意検討した結果、Ｃ₆₀に代表されるフラーレンの骨格をペプチド類に結合することにより、特に従来困難であったネガティブモードでの質量分析を高感度に行なうことができ、特に分子量の特定に有用であることを見出した。また、この用途に対して実用的に簡便なフラーレン誘導体を探索したところ、カルボキシル基にイミドが結合した構造の官能基を有するフラーレン誘導体を用いることで、ペプチド類の質量分析が簡便な手法で行なえることを見出した。更に、ペプチド類に対し効果的にフラーレン骨格を導入できるフラーレン誘導体を探索した結果、上記官能基がある程度以上の長さを有する連結基を介してフラーレン骨格に結合しているフラーレン誘導体が特に有用であることを見出し、本発明に至った。

即ち、本発明の要旨は、下記式（１）で表わされる官能基を有するフラーレン誘導体をペプチド類と反応させて得られた生成物を用いて、ネガティブモードで質量分析を行なうことを特徴とする、ペプチド類の質量分析方法に存する（請求項１）。

（式（１）中、Ｘは、下記式（ａ）で表わされる構造を有する炭素数３以上、１０以下の有機基を表わす。

但し、Ｘは、式（ａ）の窒素原子において、式（１）のカルボキシル基に結合する。）
ここで、フラーレン誘導体が、フラーレン骨格上に下記式（２）で表わされる構造を有することが好ましい（請求項２）。

（式（２）中、２つのＣｆは、フラーレン骨格上の隣接する２つの炭素原子を表わし、Ｒは、炭素数１以上２０以下の有機基を表わし、Ａは、２価の有機基を表わし、Ｘは、下記式（ａ）で表わされる構造を有する炭素数３以上、１０以下の有機基を表わす。

但し、Ｘは、式（ａ）の窒素原子において、式（２）のカルボキシル基に結合する。）
また、本発明の別の要旨は、フラーレン骨格上に、下記式（２）で表わされる構造を有することを特徴とする、フラーレン誘導体に存する（請求項３）。

（式（２）中、２つのＣｆは、フラーレン骨格上の隣接する２つの炭素原子を表わし、Ｒは、炭素数１以上２０以下の有機基を表わし、Ａは、２価の有機基を表わし、Ｘは、下記式（ａ）で表わされる構造を有する炭素数３以上、１０以下の有機基を表わす。

但し、Ｘは、式（ａ）の窒素原子において、式（２）のカルボキシル基に結合する。）
式（２）中、Ｒは、置換されていてもよい炭素数６以上１４以下の芳香族基であることが好ましい（請求項４）。
また、本発明の別の要旨は、上述のフラーレン誘導体と、ペプチド類とを反応させることを特徴とする、フラーレン−ペプチド類複合体の製造方法に存する（請求項５）。
また、本発明の別の要旨は、上述の方法で製造されることを特徴とする、フラーレン−ペプチド類複合体に存する（請求項６）。
また、本発明の別の要旨は、フラーレン骨格上に、下記式（３）で表わされる構造を有することを特徴とする、フラーレン−ペプチド類複合体に存する（請求項７）。

（式（３）中、２つのＣｆは、フラーレン骨格上の隣接する２つの炭素原子を表わし、Ｒは、炭素数１以上２０以下の有機基を表わし、Ａは、２価の有機基を表わし、−ＮＨ−［Ｐｅｐｔｉｄｅ］は、Ｎ末端においてカルボニル基と結合するペプチド類を表わす。）

本発明のペプチド類の質量分析方法によれば、ペプチド類を特定構造のフラーレン誘導体と反応させて得られた生成物を質量分析に供することにより、ネガティブモードで高感度に質量分析を行なうことが可能となる。
また、本発明の新規なフラーレン誘導体によれば、ペプチド類のＮ末端に効果的にフラーレン部位を導入することができることから、上述した本発明のペプチド類の質量分析方法に有用である他、フラーレン−ペプチド類複合体の製造にも好適に用いられる。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の説明に制限されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、任意に変形して実施することができる。

本発明のペプチド類の質量分析方法（以下、適宜「本発明の質量分析方法」という。）は、特定の官能基を有するフラーレン誘導体をペプチド類と反応させて得られた生成物（フラーレン−ペプチド類複合体）を用いて質量分析を行なうものである。以下の記載では、まず本発明の質量分析方法において用いられるフラーレン誘導体について説明した上で、そのフラーレン誘導体を用いた質量分析の手順について説明する。

〔Ｉ．フラーレン誘導体〕
本明細書において「フラーレン」とは、炭素原子が球状又はラグビーボール状に配置して形成される閉殻状の骨格（以下、「フラーレン骨格」という。）を有する炭素クラスターを指す。その炭素数は通常６０以上、１２０以下である。具体例としては、Ｃ₆₀（いわゆるバックミンスター・フラーレン）、Ｃ₇₀、Ｃ₇₆、Ｃ₇₈、Ｃ₈₂、Ｃ₈₄、Ｃ₉₀、Ｃ₉₄、Ｃ₉₆及びより高次の炭素クラスターが挙げられる。本発明の質量分析方法で用いられるフラーレン誘導体のフラーレン骨格は特に制限されないが、製造時における反応原料の入手の容易さから、Ｃ₆₀又はＣ₇₀が好ましく、特にＣ₆₀が好ましい。

本発明の質量分析方法で用いられるフラーレン誘導体は、上述のフラーレン骨格に、下記式（１）で表わされる官能基が連結基を介して結合したフラーレン誘導体（以下、適宜「フラーレン誘導体（Ｉ）」という。）である。

式（１）中、Ｘは、下記式（ａ）で表わされる構造を有する、炭素数が通常３以上、１０以下の有機基を表わす。

但し、Ｘは、（ａ）の窒素原子において、式（１）のカルボキシル基に結合する。

言い換えると、Ｘは、環式又は非環式のイミド化合物の有するイミド結合（−ＣＯＮＨＣＯ−）から、その窒素原子に結合する水素原子を外して得られる一価の基である。Ｘの元となるイミド化合物としては、環式であっても非環式であってもよいが、より安定な環式であることが好ましい。環式イミド化合物の例としては、コハク酸イミド（スクシンイミド）、グルタルイミド、マレイミド、フタルイミド及びこれらの化合物が置換基を有しているもの等が挙げられるが、製造の容易性や構造の安定性の面からは、コハク酸イミドが好ましい。

即ち、式（１）の官能基としては、コハク酸イミドから誘導される基をＸとして有する、下記式（ｂ）で表される構造の官能基が特に好ましい。

フラーレン誘導体（Ｉ）における、上記式（１）の官能基の数は、フラーレン骨格１個について通常１個以上、また、通常６個以下、好ましくは２個以下の範囲である。特に、式（１）の官能基を１個有することが、質量分析を行なう上で好ましい。官能基の数が多過ぎると、フラーレン部位特有の電子授受能力が小さくなり、ペプチド類と結合を形成してもそのイオン化に効果を示さなくなる傾向にある。

フラーレン骨格と式（１）の官能基とは、任意の連結基（リンカー）を介して互いに結合していればよい。連結基の構造は特に制限されないが、合成の容易さ及び安定性の観点から、フラーレン骨格の（６，６）結合部位においてシクロプロパン環を形成しているものが好ましい。
即ち、フラーレン誘導体（Ｉ）としては、フラーレン骨格上に下記式（２）で表わされる構造を有するもの（以下、適宜「フラーレン誘導体（II）」という。）が好ましい。

式（２）中、Ｘは、上記式（１）と同様の定義を表わす。

２つのＣｆは、フラーレン骨格上の隣接する２つの炭素原子を表わす。この２つのＣｆは、通常は、フラーレン骨格上の隣接する２つの６員環の間で（６，６）結合を形成する２つの炭素原子である。

Ａは、２価の有機基を表わす。中でも、合成の容易さの観点から、無置換のアルキレン基が好ましい。即ち、Ａとしては、−（ＣＨ₂）_n−で表わされるものが好ましい。ここでｎは、通常１以上、また、通常１０以下、好ましくは８以下の整数を表わす。後述する好ましい形態の様に、Ｒが芳香族基である場合においては、反応試薬となるケトエステルの合成原料である酸クロリドＣｌＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ₂Ｒ’（Ｒ’は通常、炭素数１〜１０の有機基である。）の入手の容易さから、ｎ＝１，２，３、６，８のものが特に好ましく、中でもｎ＝３のものがより好ましい。分析対象とするペプチド類が、採用する質量分析条件によって適切にイオン化されるように、ｎを選択することができる。

Ｒは、一価の炭素数１以上、２０以下の有機基を表わす。中でも、置換されていても良い炭素数６以上、１４以下の芳香族基であることが好ましい。

芳香族基の有する芳香環は、炭化水素環であっても複素環であってもよく、また、単環であっても、複数の環が縮環したものであってもよい。芳香族基の例としては、フェニル基、ナフチル基、アントラニル基などの芳香族炭化水素基、ピリジル基、フリル基、ピロール基、チオフェン基などの芳香族複素環基等があげられる。中でも芳香族炭化水素基が好ましく、特にフェニル基が好ましい。

芳香族基は置換基を有していてもいなくてもよいが、置換基を有する場合には、その種類を変えることによってフラーレン骨格の電子的性質を変化させることができ、分析したいペプチド類の種類に対応してイオン化に与える影響を制御できるので好ましい。置換基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基などのアルキル基；フェニル基、ナフチル基などのアリール基；メトキシ基、フェノキシ基などのアルコキシ基；水酸基、ジメチルアミノ基などのアミノ基；アセチル基などのアシル基；塩素、臭素、フッ素などのハロゲン原子；メチルチオ基などのチオエーテル基などが挙げられる。これらの置換基は一個のみでもよいが、同一又は互いに異なる複数個の置換基を有していてもよい。特に、臭素原子は２種類の同位体がほぼ１：１の比率で存在するので、臭素原子を１個含む化合物では、その骨格を有するフラーレン−ペプチド類誘導体の質量分析の際にほぼ同じ強度の２本ピークが分子量２の差で観測され、特に高分解能での質量分析の際にその同定が容易になることから、Ｒとしては、臭素原子を１個有する芳香族基が特に好ましい。

上述のフラーレン誘導体（Ｉ）の製造方法は特に制限されないが、例としては、カルボン酸部位を有するフラーレン誘導体とＮ−ヒドロキシイミド化合物とを反応させる方法が挙げられる。具体的に、フラーレン誘導体（II）を製造する場合には、フラーレン骨格上に下記式（ｉ）で表わされる構造を有するフラーレン誘導体（以下、適宜「フラーレン誘導体（II’）」という。）を原料として、そのカルボン酸部位に、下記式（ii）で表わされる化合物を反応させることにより、製造することができる。

式（ｉ）中、Ｃｆ、Ａ及びＲは、上記式（２）と同様の定義を表わす。この式（ｉ）の構造を有するフラーレン誘導体（II’）としては、目的とするフラーレン誘導体（II）の構造に応じて、適切なものを選択すればよい。

式（ii）中、Ｘは、式（２）と同様の定義を表わす。即ち、式（ii）の化合物は、式（２）の官能基Ｘに対応するイミド化合物において、イミド結合部位の窒素原子に結合する水素原子が、水酸基で置き換えられた化合物（即ち、Ｎ−ヒドロキシイミド化合物）を意味する。このＮ−ヒドロキシイミド化合物としては、目的とするフラーレン誘導体（II）の構造に応じて、適切なものを選択すればよい。中でも、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドが好ましい。

フラーレン誘導体（II’）に対して、モル比で１〜１０倍のＮ−ヒドロキシイミド化合物を作用させる。この際、いわゆる脱水縮合剤を同時に使用することで、反応をより迅速に、より低温で進めることができる。具体的な縮合剤としては、無水酢酸、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１，１’−カルボニルジイミダゾール、塩酸（１−（３−ジメチルアミノ）プロピル）−３−エチルカルボジイミドなどが挙げられるが、これらは反応において必ずしも用いなくてよい。

反応を行なう際には、通常、フラーレン誘導体（II’）と、Ｎ−ヒドロキシイミド化合物と、必要に応じて用いられる脱水縮合剤とを、適当な溶媒中で混合撹拌して行なう。用いられる溶媒の例としては、テトラヒドロフラン、トルエン、キシレン、トリメチルベンゼン、二硫化炭素などの有機溶媒が挙げられる。反応時の温度・圧力・時間等の条件は特に制限されない。具体的に、反応温度は通常０℃以上、６０℃以下であるが、室温が好ましい。反応時間は通常、数時間〜数日の範囲で任意に選択できる。目的物は通常シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより単離され、その構造はプロトン核磁気共鳴法（¹Ｈ−ＮＭＲ）等で確認される。その収率は通常４０〜９９％である。

以上説明したフラーレン誘導体（Ｉ）は、適当な溶媒中でペプチド類と単に混合するだけで、ペプチド類の有するアミノ部位に選択的にフラーレン部位を結合させることができる。よって、従来の技術（例えば、非特許文献７，８等）と比較して、温和な条件下で、簡便な操作によりペプチド類にフラーレン部位を導入することができ、実用性の観点で有用である。また、反応性が高いため、高分子量のペプチド類や立体的に不利な反応部位を有するペプチド類にも、効率的にフラーレン部位を導入することができる。更に、従来の技術と異なり、リン酸部位や硫酸部位等の修飾部位を有するペプチド類に対しても、これらの修飾部位に影響することなくペプチド類のＮ末端にフラーレン部位を導入し、ネガティブモードでの質量分析に供することができる。

特に、新規な構造を有する上述のフラーレン誘導体（II）（本発明のフラーレン誘導体）は、上記式（１）の官能基がフラーレン骨格から適度な距離を持って存在するために、ペプチド類との反応性が高いと考えられ、特に立体障害が大きいペプチド類や反応性の低いペプチド類へのフラーレン部位の導入に極めて有用である。また、その合成時において例えばＲの芳香族基等に容易に置換基を導入、変換することができるため、質量分析を行なう際にイオン化の状態を最適にするように置換基を制御することも可能である。更に、ペプチド類と反応するだけではなく、一般的な１級又は２級のアミン化合物とも効果的に反応して、新たなフラーレン誘導体へと誘導することが可能であり、フラーレン骨格を有する様々な誘導体を合成する試薬としても好適な物質群である。

よって、上述したフラーレン誘導体（Ｉ）（II）は、以下に説明するペプチド類の質量分析方法において好適に用いられる他、ペプチド類のＮ末端にフラーレン部位を導入してフラーレン−ペプチド類複合体を製造するための試薬等としても用いることができる。

〔II．ペプチド類の質量分析方法〕
本発明のペプチド類の質量分析方法は、分析対象となるペプチド類を、上述のフラーレン誘導体（Ｉ）と反応させて得られた生成物を用いて、質量分析を行なうことを特徴としている。

本明細書において「ペプチド類」とは、同種又は異種の２以上のα−アミノ酸がペプチド結合によって連結された狭義のペプチドの他、そのアミノ酸残基やペプチド鎖が各種の修飾を受けて得られる修飾ペプチドや、ペプチドから誘導される各種のペプチド誘導体等をも含む概念である。本発明において分析可能なペプチド類の種類に特に制限は無い。通常の鎖状ペプチドでも、２次構造（α−へリックス構造、β−シート構造、Ｓ−Ｓ結合等）や３次構造を形成したものでも良い。また、フラーレン部位は通常、ペプチド類のＮ末端に導入されるので、Ｎ末端が残存しているものであれば、環状ペプチドや修飾ペプチド、ペプチド誘導体についても分析の対象とすることができる。分析可能なペプチド類の具体例として、グルタチオン（glutathione）、ロイシンエンケファリン、ブラディキニン（Bradykinin）等を挙げることができる。

特に、本発明の質量分析方法では、上述のフラーレン誘導体（Ｉ）、特に、フラーレン誘導体（Ｉ’）（本発明のフラーレン誘導体）を用いることにより、Ｎ末端の反応性が低いペプチド類であっても、フラーレン部位を導入することが可能となる。また、リン酸部位や硫酸部位等の修飾部位を有するペプチド類についても、これらの修飾部位を損なうことなくフラーレン部位をペプチド類のＮ末端に導入し、質量分析に供することができる。よって、本発明の質量分析方法は、これらのＮ末端の反応性が低いペプチド類や、修飾ペプチド類の分析に特に有用である。

分析対象のペプチド類を上述のフラーレン誘導体（Ｉ）と反応させる手法は特に制限されないが、通常はペプチド類とフラーレン誘導体（Ｉ）とを、ともに適切な溶媒に溶解又は分散させることにより、互いに接触させればよい。溶媒としては、ペプチド類とフラーレン誘導体（Ｉ）とをともに溶解又は分散させることができるものであれば、その種類は特に制限されないが、好適な例としては、水や、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の極性有機溶媒が挙げられる。ペプチド類とフラーレン誘導体との比率は、ペプチド類に対するフラーレン誘導体のモル比の値で、通常１倍以上、好ましくは２倍以上、また、通常１００倍以下、好ましくは２０倍以下の範囲である。反応時の温度・圧力等は特に制限されないが、通常は室温、常圧下で反応を行なえばよい。反応時間は、通常５分以上、好ましくは１５分以上、また、通常１日以下、好ましくは１時間以下の範囲である。また、反応系に撹拌を加えることが好ましい。

こうしてペプチド類とフラーレン誘導体（Ｉ）とを反応させることにより、ペプチド類とフラーレン誘導体（Ｉ）とが複合体を形成する。この複合体（これを以下適宜「フラーレン−ペプチド類複合体」という。）の構造は明らかではないが、例えばフラーレン誘導体（II）をペプチド類と反応させた場合、フラーレン骨格上に下記式（３）で表わされる構造を有するフラーレン−ペプチド類複合体が形成されるものと推測される。

上記式（３）中、各符号は上記式（１）と同じ定義を表わす。

続いて、上述の反応により得られた生成物（フラーレン−ペプチド類複合体）について質量分析を行なう。質量分析の手法としては、これに限定されないが、ペプチド類の質量分析に一般的に用いられている、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry；マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析）法などを採用することができる。

質量分析の際のイオン化法は、ポジティブモードでもネガティブモードでもよい。上述のフラーレン−ペプチド類誘導体は、分子内にフラーレン骨格を有する効果によって、一般のペプチド類とは異なり、ネガティブモードでの測定が可能であることが特徴である。ネガティブモードで測定することによって、従来ポジティブモードで課題となっていた、ナトリウムイオンやカリウムイオン等がペプチド類に結合した形のイオンピークの出現を無くすことができ、分析結果の解析が容易になる。よって、ネガティブモードで測定を行なうことが好ましい。

質量分析の際のマトリックスは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで一般に用いられるニコチン酸、２，５−ジヒドロ安息香酸、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、コハク酸などの有機酸や、５−（トリフルオロメチル）ウラシル、グリセリン等の中から、適宜選択して使用することができる。

質量分析の具体的な手順は特に制限されないが、例を挙げると以下の通りである。
まず、質量分析用のサンプルとして、分析対象のペプチド類とフラーレン誘導体（Ｉ）とが反応した生成物（フラーレン−ペプチド類複合体）を用意する。通常は反応の際にＮ−ヒドロキシイミド化合物が副生するが、このＮ−ヒドロキシイミド化合物は通常、目的とするフラーレン−ペプチド類誘導体の分子量よりも十分に小さい分子量を有する（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの場合、その分子量は１１５．０９である）ので、特に除去する必要はなく、上述の反応により得られた反応液をそのまま分析用サンプルとして用いることができる。

続いて、分析用サンプルとして用意した上述の反応液を、サンプルプレート上でマトリックスと混ぜ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析を行なう。分析用サンプルとマトリックスとの比率は、分析用サンプル：マトリックスの重量比で通常１０：１〜１：１００の範囲である。

以上の手順によって、分析対象のペプチド類とフラーレン誘導体（Ｉ）とから得られるフラーレン−ペプチド類複合体について、質量分析のデータを得ることができる。ここで、反応に使用したフラーレン誘導体（Ｉ）の構造等のデータと、反応によって得られたフラーレン−ペプチド類複合体のデータをそれぞれ参酌することにより、ペプチド類の質量分析のデータを得ることができる。

本発明の質量分析方法により分析可能なペプチド類のアミノ酸残基数は、特に制限されないが、通常２以上、好ましくは３以上、また、通常２０以下、好ましくは１０以下の範囲である。また、分析可能なペプチド類の分子量も特に制限されないが、通常１５０以上、好ましくは１８０以上、また、通常３０００以下、好ましくは２０００以下の範囲である。ペプチド類のアミノ酸数や分子量が大き過ぎると、質量測定機器の可能な測定範囲を超えてしまうため、測定が困難になる傾向にある。

なお、ペプチド類とフラーレン誘導体（Ｉ）とを反応させる工程（反応工程）と、反応により得られた生成物について質量分析を行なう工程（質量分析工程）とは、連続的に行なってもよく、間隔をおいて行なっても良い。また、各工程の前後や最中に、各種の前処理や後処理、中間処理等を加えても良い。更には、ペプチド類とフラーレン誘導体（Ｉ）とを反応させて得られた生成物を予め用意しておいて、それを用いて質量分析工程のみを行なっても良い。

また、本発明の質量分析方法を、その他の分析手法と組み合わせて実施するのも好ましい。他の分析手法の例としては、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等が挙げられる。これらを組み合わせた具体的な分析の態様としては種々のものが考え得るが、例えば本発明の質量分析方法をＨＰＬＣと組み合わせて実施する場合には、ペプチド類を含むサンプルをＨＰＬＣで分離した後、得られたペプチド類含有画分を用いてフラーレン誘導体（Ｉ）との反応工程及び質量分析工程を行なう態様や、ペプチド類を含むサンプルをフラーレン誘導体（Ｉ）と反応させた後、得られた反応液をＨＰＬＣによって分離し、得られたフラーレン−ペプチド類複合体含有画分を用いて質量分析工程を行なう態様などが挙げられる。勿論これらはあくまでも例示であり、本発明の質量分析方法を他の分析方法と組み合わせて実施する態様は、これらの例に限定されるものではない。

以上説明した本発明のペプチド類の質量分析方法によれば、ペプチド類を特定構造のフラーレン誘導体（上記フラーレン誘導体（Ｉ））と反応させてペプチド類にフラーレン部位を導入し、得られた生成物（フラーレン−ペプチド類複合体）を質量分析に供することにより、ネガティブモードで高感度に質量分析を行なうことができる。従って、元のペプチド類の分子量が正確に測定できるとともに、従来難しかったペプチド類の構造に関する情報も得ることができる。

また、従来の方法と異なり、リン酸部位や硫酸部位等の修飾部位を有するペプチド類についても、上述のフラーレン誘導体（Ｉ）を用いることによって、これらの修飾部位に影響することなくペプチド類のＮ末端に選択的にフラーレン部位を導入し、質量分析に供することができる。よって、本発明の質量分析方法は、修飾ペプチド類の分析に特に有用である。

〔III．その他〕
上述のフラーレン誘導体（II）（本発明のフラーレン誘導体）は、先に説明した本発明のペプチド類の質量分析方法に好適に用いられる他、フラーレン骨格をペプチド類のＮ末端に選択的に導入し、フラーレン−ペプチド類複合体を製造するための試薬としても、好適に用いることが可能である。

フラーレン誘導体（II）を用いてフラーレン−ペプチド類複合体を製造するためには、フラーレン誘導体（II）をペプチド類と反応させればよい（本発明のフラーレン−ペプチド類複合体の製造方法）。その手順は特に制限されないが、通常は適当な溶媒の存在下、フラーレン誘導体（II）と対象となるペプチド類とを単に接触させればよい。使用可能な溶媒や反応条件の詳細は、〔II．ペプチド類の質量分析方法〕の欄で説明した通りである。この反応によって、上述したように、フラーレン骨格上に下記式（３）で表わされる構造を有するフラーレン−ペプチド類複合体フラーレン−ペプチド類複合体（本発明のフラーレン−ペプチド類複合体）が形成される。

次に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。なお、本明細書において「部」とは、特に断り書きの無い場合「重量部」を表わすものとする。また、「Ｐｈ」はフェニル基を、「Ｍｅ」はメチル基を、「ｔ−Ｂｕ」はｔｅｒｔ−ブチル基を、「Ａｃ」はアセチル基を、「Ｔｓ」はトルエンスルホン酸をそれぞれ表わす。また、大括弧［］内の数字は、反応式中の対応する化学式の番号を示している。

〔実施例１：Ｃ₆₀ＣＨ−ＣＯ₂−succinimide（１）の合成〕

・［１−２］の合成：
ジメチルスルフィド（３．４８ｇ、０．０６ｍｏｌ）とブロモ酢酸ｔ−ブチル［１−１］（９．７７ｇ、０．０５ｍｏｌ）の混合物を室温で１８時間撹拌した。得られた生成物にヘキサンを加え、沈殿した白色固体を濾別し、減圧乾燥することで、８．６８ｇの［１−２］を白色固体として得た（収率６８％）。得られた固体をプロトンＮＭＲ（¹Ｈ−ＮＭＲ）及び高速原子衝突イオン化質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）で分析した。その結果を以下に示す。

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz, δ; ppm) 5.09 (2H, s, -CH₂-), 3.48 (6H, s, CH₃×2), 1.51 (9H, s, CH₃×3)
FAB-MS m/z: 177 (M⁺-Br^-)

・［１−３］の合成：
Ｃ₆₀（５１２．９ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）の乾燥トルエン（５００ｍＬ）溶液に、スルホニウム塩［１−２］（４９７．７ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）、臭化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ、１２１．７ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）及び無水炭酸カリウム（１０５６．０ｍｇ、７．６ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下で１６時間室温で撹拌した。得られた反応液を濾過して固体を除去し、得られた濾液を減圧で濃縮した。シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（溶離液：トルエン／ヘキサン）により精製を行ない、３１７．６ｍｇの［１−３］（Ｒｆ＝０．６、トルエン／ヘキサン＝１／１）を暗茶色の固体として得た（収率５４％）。得られた固体を¹Ｈ−ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。その結果を以下に示す。

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz, δ; ppm) 4.71 (1H, s), 1.71 (9H, s, CH₃×3)
MALDI-TOF-MS (reflectron negative) m/z: 834.0 (M^-, 100%), 720.0 (C₆₀ ^-, 13%)

・［１−４］の合成：
［１−３］（３１２．３ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸・１水和物（ｐ−Ｔｓ・Ｈ₂Ｏ）（１５０．９ｍｇ）のトルエン（４００ｍＬ）溶液を８時間加熱還流した。冷却後４００ｍＬの水を加え、３０分撹拌した後、濾別により茶色の固体を取得した。得られた固体を水とエタノールで洗浄し、減圧乾燥することで、１５６．３ｍｇの［１−４］を暗茶色の固体として得た（収率５４％）。得られた固体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。その結果を以下に示す。

MALDI-TOF-MS (reflectron negative) m/z: 778.0 (M^-, 100%), 720.0 (C₆₀ ^-, 25%)

・［１］の合成：
［１−４］（１７５．５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（３００ｍＬ）溶液に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ、４８．０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）と、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣｌ、９４．７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下室温で３日間撹拌した。得られた溶液を減圧濃縮したあと、２００ｍＬのトルエンを加え、再度およそ５０ｍＬまで減圧濃縮した。得られたトルエン溶液を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した後濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：トルエン／酢酸エチル＝１９／１）で精製を行ない、１１３．４ｍｇの［１］を暗茶色固体として得た（収率５６％）。これをフラーレン誘導体［１］とする。得られた固体を¹Ｈ−ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。その結果を以下に示す。

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz, δ; ppm) 4.99 (1H, s), 2.99 (4H, s, CH₃×3)
MALDI-TOF-MS (reflectron positive) m/z: 874.9 (M⁺, 49%), 733.0 (C₆₀CH⁺, 30%)

〔実施例２：Ｃ₆₀ＣＰｈ−（ＣＨ₂）₃ＣＯ₂−succinimide（２）の合成〕

・［２−２］の合成：
４−ベンゾイル酪酸（［２−１］、１９２３．４ｍｇ、９．６ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）溶液に濃硫酸（１ｍＬ）を加え、この溶液を１２時間加熱還流した。得られた溶液を減圧濃縮して黄色のオイルを得、これを４０ｍＬの酢酸エチルに再溶解した。この溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ×３）及び飽和食塩水（２０ｍＬ×３）で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮することで、１７８８．８ｍｇの［２−２］を黄色のオイルとして得た（収率９０％、Ｒｆ＝０．２、酢酸エチル／トルエン＝１／９）。得られたオイルを¹Ｈ−ＮＭＲ及び電子衝撃イオン化法−質量分析法（ＥＩ−ＭＳ）で分析した。その結果を以下に示す。

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz, δ; ppm) 7.96 (2H, m), 7.56 (1H, m), 7.46 (2H, m), 3.68 (3H, s), 3.06 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.45 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.08 (2H, m)
EI-MS m/z: 206 (M⁺)

・［２−３］の合成：
［２−２］（１４８４．７ｍｇ、７．２ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホニルヒドラジド（１５７６．１ｍｇ、８．０ｍｍｏｌ）のメタノール（３０ｍＬ）溶液を１４時間加熱還流した。反応液をゆっくり冷却した後室温で４時間、０℃で１時間撹拌した。生成した白色固体を濾別し、メタノールで洗浄後減圧乾燥して、２２５７．１ｍｇの［２−３］を白色固体として得た（収率８４％）。得られた固体を¹Ｈ−ＮＭＲ及びＥＩ−ＭＳで分析した。その結果を以下に示す。

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz, δ; ppm) 9.18 (1H, s, NH), 7.92 (2H, d, J = 8.3 Hz, ortho-H ArSO₂-), 7.65 (2H, m, ortho-H Ph), 7.34 (3H, m), 7.30 (2H, d, J = 8.3 Hz, meta-H ArSO₂-), 3.81 (3H, s, OCH₃), 2.63 (2H, m), 2.41 (3H, s, ArCH₃), 2.33 (2H, m), 1.69 (2H, m, CH₂)
EI-MS m/z: 374 (M⁺)

・［２−４］の合成：
［２−３］（１５１．０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（５ｍＬ）溶液にナトリウムメトキシド（２７．７ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下室温で１５時間撹拌した。Ｃ₆₀（１４８．０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）のトルエン（１２０ｍＬ）溶液を加え、７０℃で１１時間撹拌後、１３時間加熱還流した。反応液をゆっくり室温まで冷却後、濾過により固体を除去した。濾液を希塩酸（２ｍｏｌ／Ｌ、３０ｍＬ×３）次いで飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後３０ｍＬまで濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：トルエン／ヘキサン＝１／１〜トルエンのみ）により精製し、４８．８ｍｇの［２−４］（異性体混合物、Ｒｆ＝０．３、トルエン／ヘキサン＝１／１）を茶色固体として得た（収率２６％）。得られた固体を¹Ｈ−ＮＭＲ及びレーザー脱離型飛行時間質量分析法（ＬＤ−ＴＯＦ−ＭＳ）で分析した。その結果を以下に示す。

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz, δ; ppm) major isomer (about 86 %): 7.97 (2H, m, o-H arom), 7.57 (2H, m, m-H, arom), 7.44 (1H, m, m-H, arom), 3.62 (3H, s, OCH₃), 2.14 (2H, t, J = 7.6 Hz, PhCCH₂), 1.64 (2H, m, CH₂COOMe), 1.49 (2H, m, CH₂CH₂COOMe). Minor isomer (about 14 %): 7.93 (2H, m, o-H arom), 3.68 (3H, s, OCH₃), 2.91 (2H, t, J = 7.6 Hz, PhCCH₂), 2.53 (2H, m, CH₂COOMe), 2.19 (2H, m, CH₂CH₂COOMe).
LD-TOF-MS (reflectron negative) m/z: 910.0 (M^-, 100%), 720.0 (C₆₀ ^-, 48%).

・［２−５］の合成：
［２−４］（異性体混合物、４３．０ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロベンゼン（１０ｍＬ）溶液を５日間加熱還流した。得られた溶液をゆっくり室温まで冷却し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：トルエン／ヘキサン）で精製することで、４０．６ｍｇの［２−５］を茶色の固体として得た（収率９４％）。得られた固体を¹Ｈ−ＮＭＲ、カーボンＮＭＲ（¹³Ｃ−ＮＭＲ）、及びＬＤ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。その結果を以下に示す。

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz, δ; ppm) 7.93 (2H, d, J = 7.8 Hz, o-H, arom), 7.56 (2H, t, J = 7.6 Hz, m-H arom), 7.47 (1H, m, p-H arom), 3.68 (3H, s, OCH₃), 2.91 (2H, t, J = 8.1 Hz, PhCCH₂), 2.53 (2H, t, J = 7.6 Hz, CH₂COOMe), 2.19 (2H, m, CH₂CH₂COOMe)
¹³C-NMR (CDCl₃, 125 MHz, δ; ppm) 173.50 (CO₂Me), 148.81, 147.81, 145.86, 145.20, 145.16, 145.08, 145.04, 144.79, 144.67, 144.51, 144.43, 144.01, 143.76, 143.13, 143.04, 143.00, 142.94, 142.23, 142.18, 142.13, 142.12, 141.00, 140.75, 138.04, 137.57, 136.73, 132.10 (Ph), 128.44 (ph), 128.55 (Ph), 79.86 (bridgehead C), 51.85 (OCH₃), 51.70 (PhCCH₂), 33.89, 33.67 (PhCCH₂ and CH₂CO₂Me), 22.37 (CH₂CH₂CO₂Me)
LD-TOF-MS (reflectron negative) m/z: 910.0 (M^-, 73%), 720.0 (C₆₀ ^-, 100%)

・［２−６］の合成：
［２−５］（１１．４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）のトルエン（５ｍＬ）溶液に、酢酸（５ｍＬ）及び濃塩酸（２ｍＬ）を加え、４０時間加熱還流した。得られた反応液を減圧濃縮し、メタノールを加えた。生成した固体を濾別し、トルエンで洗浄した。得られた茶色の固体を二硫化炭素（８０ｍＬ）に溶解し、減圧濃縮後真空乾燥して、１１．７ｍｇの［２−６］を茶色固体として得た（収率８０％）。得られた固体を¹Ｈ−ＮＭＲ及びＬＤ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。その結果を以下に示す。

¹H-NMR (CDCl₃/CS₂, 400 MHz, δ; ppm) 7.88 (2H, d, J = 7.1 Hz, o-H arom), 7.51 (2H, m, m-H arom), 7.44 (1H, m, p-H arom), 2.90 (2H, m, PhCCH₂), 2.53 (2H, t, J = 7.3 Hz, CH₂CO₂H), 2.17 (2H, m, CH₂CH₂CO₂H)
LD-TOF-MS (reflectron negative) m/z: 896.0 (M^-, 100%), 720.0 (C₆₀ ^-, 18%)

・［２］の合成：
［２−６］（１３．６ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）の二硫化炭素（２０ｍＬ）溶液に、ＥＤＣｌ（６．０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１ｍＬ）溶液とＮＨＳ（６．８ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下室温で４日間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、そこへトルエン（２０ｍＬ）を加えて再度減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：トルエンのみ〜トルエン／酢酸エチル＝１／９）で精製して、１０．７ｍｇの［２］（Ｒｆ＝０．４、トルエン・酢酸エチル＝９／１）を茶色固体として得た（収率７２％）。これをフラーレン誘導体［２］とする。得られた固体を¹Ｈ−ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。その結果を以下に示す。

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz, δ; ppm) 7.94 (2H, m, o-H arom), 7.58-7.49 (3H, m, m- and p-H, arom), 3.00 (2H, m, PhCCH₂), 2.85-2.81 (6H, m, CH₂CO₂ and CH₂×2), 2.31 (2H, m, CH₂CH₂CO₂)
MALDI-TOF-MS (reflectron negative) m/z: 993.0 (M^-, 100%)), 720.1 (C₆₀ ^-, 6%)

〔実施例３：Ｃ₆₀Ｃ（Ｃ₆Ｈ₄Ｂｒ）−（ＣＨ₂）₃−ＣＯ₂−succinimide（３）の合成〕

・［３−２］の合成：
５−クロロ−５−オキソ吉草酸（１．７４ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）のブロモベンゼン（１０．３ｇ、６５．８ｍｍｏｌ）溶液に無水塩化アルミニウム（２．９２ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）をアルゴン下、−５℃で一気に加えた。反応温度を−５℃に維持しながら３時間撹拌後、室温まで昇温し、２２時間撹拌した（反応の完結は、ＨＣｌガスの発生が停止することで確認した。）。

反応溶液を、撹拌されている０℃の希塩酸に注ぎ、更に３０分撹拌しながら室温まで昇温した。この水相をトルエン抽出し、得られたトルエン溶液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／ヘキサン＝１／９）により精製し、２．５９０ｇの［３−２］を黄白色の固体として得た（収率８８％）。得られた固体の融点（ｍｐ）の測定と、¹Ｈ−ＮＭＲ分析、ＭＳ分析、及び元素分析（重量％）を行なった。その結果を以下に示す。

mp 38〜40 ℃.
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz, δ; ppm) 7.83 (2H, d, J = 8.5 Hz, o-H), 7.60 (2H, d, J = 8.5 Hz, m-H), 3.68 (3H, s, OCH₃), 3.02 (2H, t, J = 7.0 Hz, CH₂CH₂CH₂COOMe), 2.45 (2H, t, J = 7.0 Hz, CH₂CH₂CH₂COOMe), 2.07 (2H, quint, J = 7.0 Hz, CH₂CH₂CH₂COOMe)
MS (EI): m/z 286 (M⁺+2), 284 (M⁺)
Anal. Calcd for C₁₂H₁₃BrO₃: C, 50.55; H, 4.60; N, 0. Found: C, 50.79; H, 4.54; N, 0

・［３−３］の合成：
［３−２］（５７３．１ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホニルヒドラジド（４３３．４ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）のメタノール（３０ｍＬ）溶液を２０．５時間加熱還流した。ゆっくり室温まで冷却した後、更に０℃に冷やして９０分撹拌した。生成した白色固体を濾別し、冷メタノールで洗浄後減圧乾燥し、９２７．１ｍｇの［３−３］を白色固体として得た（収率８８％）。得られた固体のｍｐの測定と、¹Ｈ−ＮＭＲ分析、ＭＳ分析、及び元素分析（重量％）を行なった。その結果を以下に示す。

mp 151〜155 ℃
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz, δ; ppm) 9.24 (1H, s, NH), 7.90 (2H, d, J = 8.5 Hz, o-H Ts), 7.52 (2H, d, J = 8.5Hz, o-H), 7.46 (2H, d, J = 8.5 Hz, m-H), 7.30 (2H, d, J = 8.5 Hz, m-H Ts), 3.81 (3H, s, OCH₃), 2.59 (2H, t, J = 8.2 Hz, CH₂CH₂CH₂COOMe), 2.41 (3H, s, SO₂PhCH₃), 2.33 (2H, t, J = 6.1 Hz, CH₂CH₂CH₂COOMe), 1.69-1.64 (2H, m, CH₂CH₂CH₂COOMe)
MS (EI): m/z 454 (M⁺+2), 452 (M⁺)
Anal. Calcd for C₁₉H₂₁BrN₂O₄S: C, 50.34; H, 4.67; N, 6.18. Found: C, 50.36; H, 4.71; N, 6.08.

・［３−４］の合成：
［３−３］（１８１．２ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（１０ｍＬ）溶液に、ナトリウムメトキシド（２３．８８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下室温で１５分撹拌した。Ｃ₆₀（１４４．０ｍｇ、０．２００ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロベンゼン（５０ｍＬ）溶液を加え、１９時間加熱還流した。ゆっくり室温まで冷却した後、反応液を２ｍｏｌ／Ｌ塩酸（３０ｍＬ×２）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：トルエン／ヘキサン＝１／１〜トルエンのみ）で精製し、４０．８ｍｇの［３−４］を茶色固体として得た（収率２１％）。得られた固体を¹Ｈ−ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。その結果を以下に示す。

¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz, δ; ppm) 7.82 (2H, d, J = 8.5 Hz, o-H), 7.68 (2H, d, J = 8.5 Hz, m-H), 3.69 (3H, s, OCH₃), 2.89 (2H, t, J = 8.5 Hz, CH₂CH₂CH₂COOMe), 2.54 (2H, t, J = 7.6 Hz, CH₂CH₂CH₂COOMe), 2.17 (2H, m, CH₂CH₂CH₂COOMe)
MALDI-TOF-MS (reflectron negative) m/z: 989.9 (M^-+2), 987.9 (M^-), 719.9 (C₆₀ ^-)

・［３−５］の合成：
［３−４］（４０．０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）のトルエン（１５ｍＬ）溶液に酢酸（１０ｍＬ）と濃塩酸（４ｍＬ）を加え、２１時間加熱還流した。反応液を減圧濃縮し、メタノールを加えた。生成した固体を濾別し、トルエンで洗浄した。得られた茶色固体を二硫化炭素（２０ｍＬ）に溶解し、再度減圧濃縮、減圧乾燥して、２５．４ｍｇの［３−５］を茶色固体として得た（収率６５％）。得られた固体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。その結果を以下に示す。
MALDI-TOF-MS (reflectron negative) m/z: 976.0 (M^-+2), 974.0 (M^-)

・［３］の合成
［３−５］（２３ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）の二硫化炭素（２０ｍＬ）溶液に、ＮＨＳ（３．２ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）とＥＤＣｌ（６．７ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下室温で２１時間撹拌した。更にＮＨＳ（４．５ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）とＥＤＣｌ（１３ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を追加し、アルゴン下室温で２３時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエン３５ｍＬを加えて再度減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：トルエンのみ〜トルエン／酢酸エチル＝９／１）により精製し、１０．５ｍｇの［３］を茶色固体として得た（収率４２％）。これをフラーレン誘導体［３］とする。得られた固体を¹Ｈ−ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。その結果を以下に示す。

¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz, δ; ppm) 7.75 (2H, d, J = 8.5 Hz, o-H), 7.61 (2H, d, J = 8.5 Hz, m-H), 2.90 (2H, m), 2.78-2.75 (6H, m, CH₂CO₂ and CH₂×2), 2.22 (2H, m, CH₂CH₂CO₂)
MALDI-TOF-MS (reflectron negative) m/z: 1073.0 (M^-+2), 1071.0 (M^-)

なお、合成例１〜３で得られたフラーレン誘導体［１］［２］［３］は、何れも上述のフラーレン誘導体（Ｉ）に該当する。また、フラーレン誘導体［２］［３］は、上述のフラーレン誘導体（II）にも該当する。

〔実施例４：フラーレン誘導体［２］を用いたBradykininの分析〕
・ペプチド類とフラーレン誘導体との反応：
１．４ｍｇのフラーレン誘導体［２］を１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、１ｍＭ濃度の溶液Ａを調製した。別途、ペプチド類であるBradykinin（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）の１ｍＭ溶液Ｂを調製した。９０μＬのＡと１０μＬのＢとを混合し、室温で１時間放置した。得られた反応液を分析サンプルとして用いた。

・反応液の分析：
上述の分析サンプルについて、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法）を行なった。質量分析装置としては、AXIMA-CFR plus（Shimadzu/Kratos, Manchester, UK）を用いた。分析条件は以下の通りとした。
nitrogen laser (337nm)
linear mode
detection of negative mode

マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を用い、エタノール（６０体積％）／アセトニトリル（３６体積％）／水（４体積％）の溶媒に対する飽和溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）として用いた。

分析サンプル０．５μＬと上記マトリックス溶液０．５μＬをターゲットプレ−ト上で混ぜ、十分に乾燥して分析に供した。得られたＭＳチャートを図１に示す。Bradykininとフラーレン誘導体［２］との複合体（フラーレン−ペプチド類複合体）の分子量に対応する１８２１のピークが、最大ピークとして観測されていることが分かる。

〔実施例５〜１０〕
用いるペプチド類とフラーレン誘導体の種類を下記表１に記載のものに替えた以外は、実施例４と同様に分析を行なった。それぞれの実施例で用いたペプチド類の種類、フラーレン誘導体の種類、反応により得られたフラーレン−ペプチド類複合体の分子量（各原子の主な同位体の原子量から計算された値及び、全ての同位体の原子量とその存在比率を元に計算された値）、ＭＳチャートの番号を以下の表１に示す。また、各実施例に対応するＭＳチャートを図２〜７に示す。

これらの結果から、以下のことが分かる。
・実施例４〜６から、本発明の方法によるBradykininのネガティブモードでの質量分析では、フラーレン誘導体［１］、［２］、［３］の何れを用いてもフラーレン−ペプチド類複合体の親ピークが観測され、本発明の質量分析方法が有効であることが分かる。
・実施例７〜９から、ＳＯ₃Ｈ化ペプチドのネガティブモードでの質量分析では、フラーレン誘導体［１］、［２］、［３］の何れを用いてもフラーレン−ペプチド類複合体の親ピークが観測され、スルホン化ペプチド類で本発明の質量分析方法が有効であることが分かる。特にこの中でフラーレン−ペプチド類複合体の親ピークが最もきれいに観測できるのは、フラーレン誘導体［２］を用いた場合であり、次いでフラーレン誘導体［３］がよく、フラーレン誘導体［１］を用いた場合は目的とする親ピークが最大ピークとして観測されておらず、フラーレン誘導体［２］、［３］と比較するとイオン化における機能が若干劣っている。
・実施例１０では、リン酸化ペプチド類のネガティブモードでの質量分析においても、目的とするフラーレン−ペプチド類複合体の親ピークが観測され、この場合にも本発明の質量分析方法が有効であることが分かる。

本発明のペプチド類の質量分析方法によれば、ペプチド類を特定構造のフラーレン誘導体と反応させて得られた生成物を質量分析に供することにより、ネガティブモードで高感度に質量分析を行なうことが可能となる。従って、本発明は、様々なペプチド類の質量分析が求められる各種の分野において、好適に利用することが可能である。

また、本発明の新規なフラーレン誘導体は、ペプチド類のＮ末端にフラーレン部位を導入し、フラーレン−ペプチド類複合体を製造することができる。従って、本発明の新規なフラーレン誘導体は、上述したペプチド類の質量分析方法での使用に加えて、各種の誘導体や生理活性物質の開発への応用、更には自己集合体を形成させてイオンチャンネルとして利用する等、様々な好適に利用することが可能である。

実施例４において得られたフラーレン−ペプチド類複合体のＭＳチャートである。 実施例５において得られたフラーレン−ペプチド類複合体のＭＳチャートである。 実施例６において得られたフラーレン−ペプチド類複合体のＭＳチャートである。 実施例７において得られたフラーレン−ペプチド類複合体のＭＳチャートである。 実施例８において得られたフラーレン−ペプチド類複合体のＭＳチャートである。 実施例９において得られたフラーレン−ペプチド類複合体のＭＳチャートである。 実施例１０において得られたフラーレン−ペプチド類複合体のＭＳチャートである。

Claims (7)

1. ペプチド類を、下記式（１）で表わされる官能基を有するフラーレン誘導体と反応させて得られた生成物を用いて、質量分析を行なう
   ことを特徴とする、ペプチド類の質量分析方法。
   

   

   （式（１）中、Ｘは、下記式（ａ）で表わされる構造を有する炭素数３以上、１０以下の有機基を表わす。
   

   

   但し、Ｘは、式（ａ）の窒素原子において、式（１）のカルボキシル基に結合する。）
2. 該フラーレン誘導体が、フラーレン骨格上に下記式（２）で表わされる構造を有する
   ことを特徴とする、請求項１記載のペプチド類の質量分析方法。
   

   

   （式（２）中、２つのＣｆは、フラーレン骨格上の隣接する２つの炭素原子を表わし、Ｒは、炭素数１以上２０以下の有機基を表わし、Ａは、２価の有機基を表わし、Ｘは、下記式（ａ）で表わされる構造を有する炭素数３以上、１０以下の有機基を表わす。
   

   

   但し、Ｘは、式（ａ）の窒素原子において、式（２）のカルボキシル基に結合する。）
3. フラーレン骨格上に、下記式（２）で表わされる構造を有する
   ことを特徴とする、フラーレン誘導体。
   

   

   （式（２）中、２つのＣｆは、フラーレン骨格上の隣接する２つの炭素原子を表わし、Ｒは、炭素数１以上２０以下の有機基を表わし、Ａは、２価の有機基を表わし、Ｘは、下記式（ａ）で表わされる構造を有する炭素数３以上、１０以下の有機基を表わす。
   

   

   但し、Ｘは、式（ａ）の窒素原子において、式（２）のカルボキシル基に結合する。）
4. 式（２）中、Ｒが、置換されていてもよい炭素数６以上１４以下の芳香族基である
   ことを特徴とする、請求項３記載のフラーレン誘導体。
5. 請求項３又は請求項４に記載のフラーレン誘導体と、ペプチド類とを反応させる
   ことを特徴とする、フラーレン−ペプチド類複合体の製造方法。
6. 請求項５記載の方法で製造される
   ことを特徴とする、フラーレン−ペプチド類複合体。
7. フラーレン骨格上に、下記式（３）で表わされる構造を有する
   ことを特徴とする、フラーレン−ペプチド類複合体。
   

   

   （式（３）中、２つのＣｆは、フラーレン骨格上の隣接する２つの炭素原子を表わし、Ｒは、炭素数１以上２０以下の有機基を表わし、Ａは、２価の有機基を表わし、−ＮＨ−［Ｐｅｐｔｉｄｅ］は、Ｎ末端においてカルボニル基と結合するペプチド類を表わす。）

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