WO2001080838A2 - VERWENDUNG VON N2-SUBSTITUIERTEN BENZ[f]INDAZOL-4,9-CHINONEN ALS ANTIPARASITIKA - Google Patents

VERWENDUNG VON N2-SUBSTITUIERTEN BENZ[f]INDAZOL-4,9-CHINONEN ALS ANTIPARASITIKA Download PDF

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to pharmaceutical compositions, characterized by the content of at least one of the compounds of the general formula (1)
  • the invention thus relates to a group of chemically defined substances of the same basic structure, which have specific antiparasitic effects in vitro and in vivo (animal, human).
  • the basic structures belong to the naphthoquinone and related anthraquinone and phenanthrenequinone types.
  • antiprotozoal compounds are pentamidine isethionate, melarsoprol and glucantime. Taken as a whole, they are highly toxic with little therapeutic benefit. According to current understanding and legal requirements, approval of these medicinal products that are more than 70 years old would no longer be conceivable.
  • the present invention is therefore based on the object of compounds for the prophylactic administration or therapeutic treatment of a parasitic infection caused by Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii or Pneumocystis spp. to provide and to provide pharmaceutical compositions which contain at least one of the prophylactic administration or therapeutic treatment of a parasitic infection caused by Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii or Pneumocystis spp. used compounds included.
  • this object is achieved by using the compounds of the general formula (I)
  • R 1 is hydrogen or a group
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 independently of one another are hydrogen or the groups
  • Benzene ring forms a further condensed benzene or naphthalene ring which optionally carries further functional groups, these functional groups being fluorine, chlorine, bromine, iodine, nitro, cyano, amino, hydroxy, trifluoromethyl groups Alkyl groups with 1 to 5 carbon atoms, alkoxy or haloalkoxy groups with 1 to 5 carbon atoms or alkylthio or haloalkylthio groups with 1 to 5 carbon atoms,
  • R and / or R represent a carbon, oxygen or nitrogen atom and this further heterocycle optionally is substituted by fluorine, chlorine, chromium, iodine or alkyl radicals having 1 to 4 carbon atoms,
  • Benzene ring forms a further condensed benzene or naphthalene ring which optionally carries further functional groups, these functional groups being fluorine, chlorine, bromine, iodine, nitro, cyano, amino, hydroxy; Trifluoromethyl groups, alkyl groups with 1 to 5 carbon atoms, alkoxy or haloalkoxy groups with 1 to 5 carbon atoms or alkylthio or haloalkylthio groups with 1 to 5 carbon atoms,
  • Benzene ring forms a further condensed five- or six-membered heterocycle, where R 4 and R 5 are each independently a carbon,
  • Benzene ring forms another condensed benzene or naphthalene ring, which optionally carries further functional groups, these functional groups being fluorine, chlorine, bromine, iodine, nitro, cyano, amino, hydroxyl, trifluoromethyl groups, alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms, alkoxy groups or haloalkoxy groups with 1 to 5 carbon atoms or alkylthio or haloalkylthio groups with 1 to 5 carbon atoms,
  • R and R each independently represent a carbon, oxygen or nitrogen atom and this further heterocycle is optionally substituted by fluorine, chlorine, bromine, iodine or alkyl radicals having 1 to 4 carbon atoms,
  • R 7 stands for -R 12 , -OR 8 or -SR 8 ,
  • R and R independently of one another represent an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • R 9 represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a group of the structure
  • R 10 stands for -R 12 , -R 8 or -OR 8 ,
  • R 11 stands for -R 8 , -NH 2 , -NHR 8 , -NR 8 R 8 ' , -OH, -OR 8 ,
  • R 12 , -R 12 ' , -R 12 ", -R 12 ", -R 12 “" independently of one another stand for -H, -F, -Cl, -Br or -I
  • R 13 stands for -R 8 , - R 12 or a group of the following structure
  • R 14 stands for -CH 3l -R 7 , -SH,
  • R 15 , -R 15 ' , -R 15 " , -R 15"' , -R 15 "" independently of each other for -R 7 , -R 8 , -NO 2 , -NH 2I -NHR 8 , -NR 8 R 8 ' , -CN or
  • R and R independently of one another denote -H or -R,
  • R 17 represents -R 7 , -CF 3) -NO 2l -CN, -SH, -OH or -NH 2 ,
  • n 1 to 10
  • o 1 to 5
  • p 0 to 4
  • Preferred for use in the prophylactic administration or therapeutic treatment of a parasitic infection caused by Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii or Pneumocystis spp. are the compounds of general formula (I), wherein
  • R 7 stands for -R 12 , -OR 8 or -SR 8 ,
  • R and R 8 independently of one another represent an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • R 12 , -R 12 ' , -R 12 " , -R 12" , -R 12 "" independently of one another represent -H, -F, -Cl, -Br or -I, R 15 , -R 15' , -R 15 ", -R 15 '” , -R 15 "" independently of each other for
  • R 1 for hydrogen, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec.-butyl, tert-butyl, n-pentyl, tert.-amyl, n-hexyl, pent-3-yI, 1, 2 -DimethyIpropyl 1,3-dimethylbutyl, 1-ethyl-2-methylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 2-methylhept-5-yl, allyl, methallyl crotyl, 2-ethyl-2-hexenyI, 5-hexenyl, 2 -Methyl-2-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 1-buten-3-yl, 2-methyl-1-buten-4-yl, 2-methyl-2-buten-4-yl, 3-
  • Naphthindazole-4,9-quinones is carried out according to the synthesis scheme described in German patent DE 38 31 332. All compounds were structurally characterized using spectroscopic methods (H / C-NMR, mass spectroscopy, UV, IR spectroscopy). In the above-mentioned publication, as in the following communications, the author or authors did not report that the described naphthindazole-4,9-quinones show anti-parasitic effects. It is known that naphthoquinones form a structural class with a biological effect. A disadvantage of the naphthoquinones investigated was their high toxicity to cells and mammals.
  • R, R, R, R, R and R have the meaning given above, have high antiparasitic activity with very low toxicity.
  • the high antiparasitic effect and the very low toxicity could be demonstrated in the animal using the mouse as an example.
  • the naphthindazole-4,9-chlorones of the general formula (I) are notable for excellent activity against a broad spectrum of veterinary and human-pathogenic parasites, in particular against Leishmania and Cryptosporidia. They show high tolerance in the in vivo mouse model and can be used in antiparasitics for therapeutic use.
  • the antiparasitic compounds of the general formula (I) are used therapeutically for infection prophylaxis and / or for the treatment of an existing infection.
  • the compounds of general formula (I) can be administered by themselves or in the form of a pharmacologically acceptable salt.
  • Suitable examples of these salts of the compounds of the general formula (I) include acid addition salts with organic or inorganic acids.
  • the following acids can be mentioned as acids which form an acid addition salt of the compounds of the general formula (I): sulfuric acid, sulfonic acid, phosphoric acid, nitric acid, perchloric acid, hydrobromic acid, hydrochloric acid, formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, succinic acid, oxalic acid, glucolic acid, Lactic acid, malic acid, tartaric acid, fumaric acid, citric acid, ascorbic acid, maleic acid, hydroxymaleic acid, pyruvic acid, phenylacetic acid, benzoic acid, p-aminobenzoic acid, p-hydroxybenzoic acid, salicylic acid, p-aminosalicylic acid, am
  • the compounds of the general formula (1) and their pharmacologically acceptable salts can be applied alone or in a known manner by stretching at least one of the compounds of the general formula (I) with solvents, carriers and / or animal feed, optionally using emulsifiers and / or dispersants , are converted into the usual formulations.
  • the pharmaceutical compositions can be used in the form of solutions, suspensions, dispersions, emulsions, creams, ointments, pastes, powders, granules, tablets, suppositories, capsules or dragees.
  • the application depends on the parasite to be treated and is intended to kill or at least limit the multiplication or growth of the parasite.
  • corresponding formulations are obtained by mixing at least one compound of the general formula (I) with solvents, carriers and / or animal feed, if appropriate using emulsifiers and / or dispersants, and if organic water is used as the diluent, other organic solvents can also be used.
  • Aromatics chlorinated aromatics, paraffins, alcohols, water, ketones, amines, ethanolamine, dimethylformamide and / or dimethyl sulfoxide are used as solvents for the formulations according to the invention.
  • Natural rock powders such as kaolin, clays, talc, chalk, or synthetic rock powders, such as highly disperse silica or silicates, are used as carriers.
  • Nonionic and ionogenic emulsifiers such as polyoxyethylene fatty alcohol ethers, alkyl sulfonates or aryl sulfonates, are used as emulsifiers.
  • the anti-parasitic pharmaceutical compositions according to the invention contain at least one of the compounds of the general formula (I) in an amount between 0.1 and 99% by weight.
  • the antiparasitic pharmaceutical compositions according to the invention preferably contain at least one of the compounds of the general formula (I) in an amount between 50 and 99% by weight.
  • the patient is administered a daily dose of between 0.5 and 1500 mg of the pharmaceutical compositions according to the invention, based on the compounds of the general formula (I).
  • the compounds of the general formula (I) are applied by being administered systemically or locally to the organism. According to Forth, W. Henschler, D., Rummel, W., Starke, R. (1996) General and Special Pharmacology and Toxicology, Spektrum Verlag, oral, cutaneous, nasal, parenteral, buccal or anal administration and cutaneous application means application to the skin and / or mucous membranes without achieving systemic effects.
  • compositions according to the invention in which the compounds of the general formula (I) are processed for systemic and local application to give particular pharmaceutical forms.
  • Nanosuspensions, solid liquid nanoparticles (SLN) or liposomes with an average particle diameter of 0.1 to 3 ⁇ m are pharmaceutical compositions which are referred to as particulate pharmaceutical forms.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are used for therapeutic treatment or prophylactic administration in the case of parasitic infections.
  • compositions according to the invention or the compounds of the general formula (I) can furthermore be used for the prophylaxis of infections of blood and blood products.
  • the compounds of the general formula (I) and their pharmaceutical compositions according to the invention are particularly important for combating the gastrointestinal infection of HIV-suppressed patients. There is currently no effective drug for this indication area.
  • the use in veterinary terms should also be emphasized, since there is a high need for effective and non-toxic medicaments in the treatment of coccodose in poultry farming and trypanosomiasis in breeding cattle.
  • N 2 -substituted naphthindazole-4,9-quinones of the general formula (I) are obtained by reacting corresponding quinones with excess diazoalkane, the N 2 -substituted alkyl derivatives also being produced in a significant yield in addition to the N 1 -substituted alkyl derivatives.
  • Non-alkylated naphthindazole-4,9-quinones can be alkylated in significant yield by reaction with alkylating agents such as dimethyl sulfate, N 1 -substituted naphthindazole-4,9-quinones and N 2 -substituted naphthindazole-4,9-quinones in a ratio of 2: 1 to 1: 1.
  • alkylating agents such as dimethyl sulfate, N 1 -substituted naphthindazole-4,9-quinones and N 2 -substituted naphthindazole-4,9-quinones in a ratio of 2: 1 to 1: 1.
  • the quantitative ratio of N 1 -alkylated to N 2 -alkylated naphthindazole-4,9-quinones is strongly influenced by the choice of the alkylating agent.
  • Example 7 describes the provision of nanosuspensions to improve the in vivo bioavailability of the compounds of the general formula (I).
  • Example 8 deals with the improvement of the in vivo bioavailability by incorporating the compounds of the general formula (I) into solid lipid nanoparticles (SLN).
  • Leishmania parasites live in their vector (elongated-flagellated) form in their vector (butterfly mosquitoes; Phlebotomidae) and in cell culture media. Living cells metabolize the yellow dye MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] to blue formazan crystals, which are colorimetrically quantified. Compared to untreated samples (controls), lower MTT sales indicate directly effective antiparasitic effects. This test allows screening of substances. However, since Leishmania parasites are almost exclusively intracellular and in their amastigotic form after infection, its informative value is less than an intracellular cytotoxicity test (see there).
  • the parasites are incubated at 25 ° C for 96 h.
  • Formazan formed is dissolved in sodium (sodium) dodecyl sulfate (SDS) and quantified in an automatic ELISA device by absorbance measurement at 570 nm.
  • Leishmanicidal effects are calculated as EC S0 (active ingredient concentration with 50% reduced MTT conversion compared to the untreated control).
  • Leishmania parasites are taken up by their obligatory host cells (macrophages, monocytes) by phagocytosis. Some succeed in establishing themselves in the parasitophoric vacuoles by converting them into the physiologically adapted amastigote form, which multiplies intracellularly and with the
  • Anti-Leishmania agents must also enter the parasitophore vacuole and, under the conditions prevailing there, act as specifically as possible against amastigote Leishmania parasites.
  • Macrophages already parasitized with Leishmania are exposed to active substances and reference substances.
  • the host cells are dissolved after 96 hours.
  • Surviving Leishmanias transform back into Promastigote and multiply.
  • Living cells metabolize the yellow dye MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] to formazan blue crystals, which be quantified colorimetrically.
  • MTT yellow dye
  • Murine bone marrow culture macrophages are incubated with promastigote Leishmania (L. donovani, L. major, L. enriettii).
  • test and reference substances are added in dilution series.
  • M ⁇ are selectively lysed using SDS.
  • the lysate is incubated for 72 hours in Leishmania growth medium at 25 ° C. 6. MTT solution is present for the last 6 hours.
  • Formazan formed is dissolved in SDS and quantified in the automatic ELISA device by absorbance measurement at 570 nm.
  • Leishmanicidal effects are calculated as EC 50 (active substance concentration with 50% reduced MTT conversion compared to the untreated control).
  • Tab. 1 Leishmanicidal activity of exemplary naphthindazole-4,9-quinones against different Le / shman / a species, specification of the EC 50 in ⁇ g / ml
  • the trypanozidic effectiveness is determined according to WHO recommendations, which were described by Croft and Kaminsky (Croft, S.L., Kaminsky, R. (1997a), Standardization of Drug Screening, Communication on COST ACTION 815 Acrival, Louvain).
  • the test is based on the LILI test (Low Inoculum Long Incubation Test) described by Brun and Lun (Brun R, Lun (1994), Vet. Parasitol. 52, 37-46)).
  • test substances are linearly titrated 1: 2 in medium in a 96-microtiter plate (250 ⁇ l).
  • T. brucei (4x10 3 / ml) 50 ul courtship medium / hole are added, the plates are incubated at 37 ° C for 72 h.
  • the trypanozidic effectiveness is determined according to WHO recommendations, which were described by Croft and Kaminsky, 1997, (Croft, S. L, Kaminsky, R. (1997a), Standardization of Drug Screening, Communication on COST ACTION 815 Acrival, Louvain).
  • BALB7c mice are used as host cells after induction with 2% starch solution, i.p. 24 h before lavage, peritoneal macrophages obtained.
  • the infection is caused by Trypomastigote, obtained from the overiay of infected WI-38, Vero cells or L6 myoblasts.
  • the infection ratio host: parasite is 1: 5.
  • Dilution series can be diluted.
  • Tab. 2 Trypanozide effect of exemplary naphthindazole-4,9-quinones against Trypanosoma b. brucei, specification of the EC 50 in ⁇ g / ml
  • the erythrocytic cycle of human pathogenic P. faiciparum can be fully understood in vitro.
  • the developmental stages within the erythrocytes can be followed and quantified using colored, microscopic specimens.
  • the proportion of parasitized erythrocytes in comparison to the untreated control suggests the inhibition of intracellular proliferation, while the relative proportions of the individual development stages allow first conclusions to be drawn about the mode of action of a substance.
  • Cryptosporidium parvum (C. parvum) strains KSU-1 and Iowa were developed by Dr. M. V. Nesterenko (Kansas State University) provided. Oocysts were cleaned with CsCI solution or by centrifugation in a sucrose gradient, placed in Chlorox® solution for 5 min for sterilization and then washed with sterile water. For in vivo excitation, purified oocysts were incubated at 37 ° C for 1 hour in PBS buffer with 0.25% trypsin and 0.75% taurodeoxycholate. Free sporozoites were isolated by centrifugation in the Percoll® gradient.
  • the method is based on the regulation by Nesterenko, MV, Upton, SJ (1996) J. Microbiol. Meth., 25: 87-89.
  • the anti-cryptosporidia activity is investigated according to the regulations of Woods, KM, Nesterenko, MV (1995) FEMS Microbiol. Lett., 128: 89-94.
  • the compounds of the general formula (I), the naphthindazole-4,9-quinones, were tested as follows:
  • oocysts are given ä 3.0 x 10 4/100 ul medium in 96-Loch.Mikrotiterplatten in which 4,0x10 B HCT-8 cells were seeded (ATCC CGI 244). 2. Plates are incubated at 37 ° C for 90 min and washed twice.
  • the parasites are incubated for 48 hours at 37 ° C, 5% CO 2 , 95% humidity. 5. Detection is carried out by ELISA measurement with rat anti-cryptosporidial antiserum.
  • the optical density at 630 nm is quantified in the automatic ELISA device.
  • Anti-Cryptosporidium effects are calculated as EC 50 .
  • C. parvum is a widespread and important causative agent of diarrhea in calves and the most serious diarrheal diseases in immunocompromised people worldwide.
  • CD4 + T line-defective (TCR- deficient) mice cannot spontaneously eliminate the pathogen.
  • At least one of the compounds of the general formula (I) is administered orally. They have to withstand the conditions and the duration of the gastric passage and have to be effective on the intestinal epithelium. C. parvum sporozoite are counted on a defined area of the small intestine epithelium. The reduction in colonization (in%) compared to untreated control animals is given.
  • mice are orally infected with C. parvum oocysts. 2. Test and reference substances are administered orally.
  • Test and reference substances are added as dilution series in 100 ⁇ l / well. 3. Incubation time 48 h or 72 h, of which the last 6 h in the presence of MTT solution.
  • Formazan formed is dissolved using SDS and quantified in an automatic ELISA device by determining the relative absorbance at 570 nm.
  • Cytotoxic effects are calculated as EC 50 (drug concentration with 50% reduced MTT conversion compared to the untreated sample.
  • mice are given oral test or reference substances.
  • Leishmania donovani are obligate intracellular parasites of the monocyte-macrophage system. They cause visceralizing infections involving all organs, including the bone marrow. As a rule, it is a zoonosis, with rodents serving as a reservoir. The infection of the mouse thus offers a common infection model with symptoms similar to those in humans (visceralization of the pathogen, hepatosplenomegaly, etc.) with genetically determined, i.e. Mouse strain-dependent tendency towards self-healing or chronicity.
  • Leishmania donovani strain MHOM / ET / 67 / L82 (HU3 or LV9) or Leishmania donovani strain LRC-1233 (WHO Reference Center Jerusalem) mouse strain
  • Test substances are usually taken up in 100% DMSO or ethanol (10 mM stocks produced). Before use, fresh dilution series of these stocks (90 ⁇ M) are prepared in culture medium or PBS.
  • mice are infected either with metacyclic promastigotes (from in vitro cultures) intraperitoneally (i.p.) or amastigotes (from infected hamsters) intravenously (i.v.) à 1 X 107 parasites / mouse.
  • Treatment with test substances or therapy standards begins 7-10 d p.i. with one dose per day for the next 4-5 days.
  • nanosuspensions aim at the spontaneous readiness of the cells described above to absorb foreign bodies
  • nanosuspensions as a particulate form of administration, represent effective "drug targeting" against pathogens which persist within phagocytes (macrophages).
  • phagocytes phagocytes
  • high concentrations of active substances around the pathogen can be achieved selectively and the burden on the rest of the organism are minimized and they also have the great advantage of improving the low solubility of the compounds of the general formula (I), the naphthindazole-4,9-quinones, by particle size reduction and surface enlargement.
  • Nanosuspensions of the compounds of the general formula (I) are produced with the aid of a high-pressure homogenizer LAB 40 under pressure between 200 and a maximum of 1500 bar and using different numbers of cycles (usually 4-8 cycles) [MÜLLER and PETERS., 1997].
  • the average particle diameter is in the range of approximately 50 to 999 nm.
  • Sterilization is carried out by autoclaving.
  • aseptic production using laminar air flow (LAF) can also be carried out.
  • the particle size is determined with the help of the photon correlation spectroscopy PCS (Malvern Zetasizer), a laser diffractometer LD and a Coulter counter with 30 ⁇ m capillary (Coulter Electronics) determined.
  • the particle size for characterizing the nanosuspension is given by its diameter (D50%, D90% and D99%). To determine the saturation concentration in the supernatant, it is separated off in a high-speed centrifuge and then the compound of the general formula (I), naphthindazole-4,9-quinone, is measured using UV spectroscopy.
  • a sufficient bioavailability and optimized release of the compound of the general formula (I) into infected macrophages in the animal model can be achieved by converting poorly water-soluble compounds of the general formula (I) into nanosuspensions.
  • the physical stability, the release of the compound of the general formula (I) and the saturation solubility are checked by repeated particle size determination and UV spectroscopic investigations (possibly HPLC) in a defined time interval.
  • the compound of the general formula (1) is dissolved or suspended in a fat base layer which, after cooling, is homogenized with the aid of high-pressure homogenization, as described in Example 7, to give particles with an average size of 100-900 nm.
  • the advantage over pure nanosuspensions is that defined particles are produced which, for example, have higher cell affinity, reduce the toxicity of active substances, allow active substance release according to defined kinetics and are suitable for gastrointestinal and cellular targeting.
  • the naphthoquinone SLN is produced using the cold homogenization technique: the fat base (for example Compritol ATO 888, Poloxamer 188) is melted, the compound of the general formula (I), the naphthindazole-4,9-quinone, in given the melt and stirred cold.
  • the solidified melt which contains the compound of general formula (I) dissolved or suspended, is comminuted with the addition of, for example, Tween 80 and Span with an Ultra-Thurax. This solution or presuspension is then homogenized directly with a LAB-40 homogenizer in order to obtain particles in the range 100-900 nm. These particles are called Solid Lipid Nanoparticle (SLN).
  • the particle size is determined with the aid of PCS photon correlation spectroscopy (Malvern Zetasizer), an LD laser diffractometer and a Coulter Counter with 30 ⁇ m capillary (Coulter Electronics).
  • the particle size for characterizing the nanosuspension is indicated by its diameter (D50%, D90% and D99%).
  • the separation is carried out in a high-speed centrifuge and the compound of the general formula (I), naphthindazole-4,9-quinone, is measured with the aid of UV spectroscopy.

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Abstract

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, gekennzeichnet durch den Gehalt mindestens einer der Verbindungen der allgemeinen Formel (I), und deren pharmakologisch verträgliche Salze sowie die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder deren pharmakologisch verträgliche Salze zur prophylaktischen Gabe oder therapeutischen Behandlung einer parasitären Infektion verursacht durch Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii oder Pneumocystis spp.

Description

Beschreibung
Verwendung von N2-substituierten Benz[f]indazol-4,9-chinonen als Antiparasitika
Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, gekennzeichnet durch den Gehalt an mindestens einer der Verbindungen der allgemeinen Formel (1)
Figure imgf000002_0001
und deren pharmakologisch verträgliche Salze sowie die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder pharmakologisch verträgliche Salze zur prophylaktischen Gabe oder therapeutischen Behandlung einer parasitären Infektion verursacht durch Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii oder Pneumocystis spp.
Somit betrifft die Erfindung eine Gruppe chemisch definierter Stoffe gleichen Grundgerüstes, welche spezifische antiparasitäre Wirkungen in-vitro und in-vivo (Tier, Mensch) haben. Die Grundgerüste zählen zu den Naphthochinon- und verwandter Anthrachinon- und Phenanthrenchinon-Typen.
Der humanpharmakologische Gebrauch bisher untersuchter Naphthochinone ist durch die hohe Toxizität stark limitiert, welche eine in-vivo Anwendung am Menschen nahezu unmöglich machte.
Bisher eingesetzte Naphthochinone wurden als Zytostatika experimentell untersucht. Lediglich das Naphthochinon „Atovaquone,, (Wellvone®) wurde in der Monotherapie zur Behandlung von Pneumocystis carinii (PcP = Pneumocystis carinii Pneumonie) Infektionen und in der Kombinationstherapie mit Proguanil zur Behandlung von Plasmodien-Infektionen eingesetzt. Atovaquone zeigt bei der Monotherapie der Pneumocystis carinii (PcP) Infektionen bei HIV-Koinfektionen gute Effekte, ist jedoch bei längeren Therapien aufgrund der schnellen Resistenzentwicklung der Erreger nur bedingt einsetzbar. Eine Monotherapie bei Malaria ist aufgrund der schnellen Resistenzentwicklung der Erreger nicht möglich. Als nachteilig zeigt sich ferner die sehr schlechte Bioverfügbarkeit und die hohe Tagesdosis von 3 mal 750 mg pro Tag.
Sonstige antiprotozoische Verbindungen sind Pentamidin-isethionat, Melarsoprol und Glucantime. In ihrer Gesamtheit weisen sie eine hohe Toxizität bei nur geringem therapeutischen Nutzen auf. Nach heutigem Verständnis und Rechtsauflagen wäre eine Zulassung dieser mehr als 70 Jahre alten Arzneimittel nicht mehr denkbar.
Somit besteht dringender Bedarf, neue Wirkstoffe und Medikamente zur Behandlung oder Prophylaxe von parasitären Infektionen zur Verfügung zu stellen. Vor allem mangelt es an pharmazeutischen Zusammensetzungen zur prophylaktischen Gabe oder therapeutischen Behandlung einer parasitären Infektion verursacht durch Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii oder Pneumocystis spp.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Verbindungen zur prophylaktischen Gabe oder therapeutischen Behandlung einer parasitären Infektion verursacht durch Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii oder Pneumocystis spp. zur Verfügung zu stellen sowie pharmazeutische Zusammensetzungen zu schaffen, welche mindestens eine der zur prophylaktischen Gabe oder therapeutischen Behandlung einer parasitären Infektion verursacht durch Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii oder Pneumocystis spp. verwendeten Verbindungen enthalten. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000004_0001
wobei R1 Wasserstoff oder eine Gruppe
~(CH2)m~CH— CH — (CH2)8-m H ,
"( H2)m~C=C (CH2)δ-m H
— (CH2)n-R7
Figure imgf000004_0002
O — (CH2)p-OC-R9 ,
Figure imgf000004_0003
O
-(CH2)p— C-R11 7
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0003
— C2H4-C≡C-R12 5
— CH2-C≡C-CH2— R12 3
— C≡C-C2H4— R12 j
bedeutet und
R2, R3, R4, R5 und R6 unabhängig voneinander Wasserstoff oder die Gruppen
-R7, -NO2, -NH2, -NHR8, -NR8R8', -CN, -OH, — (CH2)0-R14 ,
— O— (CH2)0-R12 ^
— S— (CH2)0-R12
O O O II II II -C— R16 -OC— R16 -CO— R16 ,
O H O II I II -OC— (CH2)0-R12 -N— C— R16
O H O R16' II I II I -C— — R16 -C— N— R16
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
R3 zusammen mit R4 und den beiden Kohlenstoffatomen C-5 und C-6 des
Benzolringes einen weiteren kondensierten Benzol- oder Naphthalinring ausbildet, der gegebenenfalls weitere funktionelle Gruppen trägt, wobei es sich bei diesen funktioneilen Gruppen um Fluor-, Chlor-, Brom-, lod-, Nitro-, Cyano-, Amino-, Hydroxy-, Trifluormethylgruppen, Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy- oder Halogenalkoxygruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder um Alkylthio- oder Halogenalkylthiogruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen handelt,
-R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-5 und C-6 des Benzol- ringes einen weiteren kondensierten fünf- oder sechsgliedrigen Heterocyclus ausbildet, wobei R und/oder R ein Kohlenstoff-, Sauerstoff- oder Stickstoffatom darstellen und dieser weitere Heterocyclus gegebenenfalls durch Fluor-, Chlor-, ßrom-, lod- oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-6 und C-7 des
Benzolringes einen weiteren kondensierten Benzol- oder Naphthalinring ausbildet, der gegebenenfalls weitere funktionelle Gruppen trägt, wobei es sich bei diesen funktioneilen Gruppen um Fluor-, Chlor-, Brom-, lod-, Nitro-, Cyano-, Amino-, Hydroxy-; Trifluormethylgruppen, Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy- oder Halogenalkoxygruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder um Alkylthio- oder Halogenalkylthiogruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen handelt,
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-6 und C-7 des
Benzolringes einen weiteren kondensierten fünf- oder sechsgliedrigen Heterocyclus ausbildet, wobei R4 und R5 unabhängig voneinander jeweils ein Kohlenstoff-,
Sauerstoff- oder Stickstoffatom darstellen und dieser weitere Heterocyclus gegebenenfalls durch Fluor-, Chlor-, Brom-, lod- oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-7 und C-8 des
Benzolringes einen weiteren kondensierten Benzol- oder Naphthalinring ausbildet, der gegebenenfalls weitere funktionelle Gruppen trägt, wobei es sich bei diesen funktionellen Gruppen um Fluor-, Chlor-, Brom-, lod-, Nitro-, Cyano-, Amino-, Hydroxy-, Trifluormethylgruppen, Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy- oder Halogenalkoxygruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder um Alkylthio- oder Halogenalkylthiogruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen handelt,
5 6
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-7 und C-8 des Benzolringes einen weiteren kondensierten fünf- oder sechsgliedrigen Heterocyclus
5 6 ausbildet, wobei R und R unabhängig voneinander jeweils ein Kohlenstoff-, Sauerstoff- oder Stickstoffatom darstellen und dieser weitere Heterocyclus gegebenenfalls durch Fluor-, Chlor-, Brom-, lod- oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
R7 für -R12, -OR8 oder -SR8 steht,
R und R unabhängig voneinander eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, R9 eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Gruppe der Struktur
darstellt,
Figure imgf000008_0001
R10für -R12, -R8oder -OR8 steht,
R11 für -R8, -NH2, -NHR8, -NR8R8', -OH, -OR8, steht,
R12, -R12' , -R12" , -R12 " , -R12 "" unabhängig voneinander für -H, -F, -Cl, -Br oder -I stehen, R13für -R8, -R12 oder eine Gruppe der folgenden Struktur steht
— C2H4— C≡≡C-R12 j — CH2---_C≡C--_CH2-_R12 ^ _ C≡5C_C2H4-_ 12
R14für -CH3l -R7, -SH steht,
R15, -R15' , -R15" , -R15"' , -R15 "" unabhängig voneinander für -R7, -R8, -NO2, -NH2I -NHR8, -NR8R8', -CN oder
— O— (CH2)0-R12 , — s— (CH2)0-R12 , — (CH2)0-R12 stehen,
1ß iß' ft
R und R unabhängig voneinander -H oder -R bedeuten,
R17 für -R7, -CF3) -NO2l -CN, -SH, -OH oder -NH2 steht,
m für 0 bis 8, n für l bis 10, o für 1 bis 5 und p für 0 bis 4 steht,
und deren pharmakologisch verträgliche Salze sowie Dimere oder Trimere der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder der pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder deren pharmakologisch verträgliche Salze oder Dimere oder Trimere der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) enthalten, zur prophylaktischen Gabe oder therapeutischen Behandlung einer parasitären Infektion verursacht durch Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii oder Pneumocystis spp. gelöst.
Bevorzugt für die Verwendung zur prophylaktischen Gabe oder therapeutischen Behandlung einer parasitären Infektion verursacht durch Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii oder Pneumocystis spp. sind die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin
R1 für Wasserstoff oder eine Gruppe — (CH2)m-CH=CH— (CH2)2.m— H ,
— (CH2)m-C≡C-(CH2)2-m— H ,
— (CH2)n-R7 f
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
steht,
R7 für -R12, -OR8oder -SR8 steht,
R und R8 unabhängig voneinander eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R12, -R12' , -R12" , -R12 " , -R12 "" unabhängig voneinander für -H, -F, -Cl, -Br oder -I stehen, R15, -R15' , -R15" , -R15'" , -R15"" unabhängig voneinander für
-R7, -R8, -NO2, -NH2, -NHR8, -NR8R8' oder -CN stehen und m für 0 bis 2 und n für 1 bis 4 steht.
Insbesondere bevorzugt für die Verwendung zur prophylaktischen Gabe oder therapeutischen Behandlung einer parasitären Infektion verursacht durch Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii oder Pneumocystis spp. sind die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin R1 für Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl, tert.-Amyl, n-Hexyl, Pent-3-yI, 1 ,2-DimethyIpropyl 1,3- Dimethylbutyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 2-Methylhept-5-yl, Allyl, Methallyl Crotyl, 2-Ethyl-2-hexenyI, 5-Hexenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 2- Methyl-3-butenyl, 1-Buten-3-yl, 2-Methyl-1-buten-4-yI, 2-Methyl-2-buten-4-yl, 3-
Methyl-1-buten-3-yl, Propargyl, 1-Butin-3-yl, 2-Butinyl, 2-Chlorethyl 2- Chiorpropyl, 3-Chlorpropyi, 2-Chlorbut-2-yl, 2-Chlor-2-methylpropyl, 2-Fluorbut-2- yl, 2-Fluor-2-methylpropyl, 1-Fluorprop-2-yl, 1-Chlor-2-methylprop-2-yl, 2,2,2- Trifluorethyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, 3-Hydroxypropyl, 1-Hydroxyprop-2- yl, 2-Hydroxybutyl, 3-Hydroxybutyl, 4-Hydroxybutyl, 2-Hydroxy-2-methylpropyl, 2-
Methoxyethyl, 2-Ethoxyethyl, 3-Methoxypropyl, 1-Methoxyprop-2-yl, 3- Methoxybutyl, 1-Methoxybut-2-yl, 1-Methoxy-2-methylprop-2-yl, 1-Ethoxy-2- methylprop-2-yl, 2-Methoxybutyl, 4-Methoxy butyl, Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, 2-Methylmercaptoethyl, 2-Ethylmercaptoethyl, 3- Methylmercaptopropyl, 3-Methylmercaptobutyl, 1-Methylmercaptobut-2-yl, 1-
Methylmercapto-2-methylprop-2-yl, 2-Methylmercaptobutyl, Phenyl, 4- Chlorphenyl, 3,4-Dichlorphenyl, o-tert.-Butylphenyl, m-tert.-Butylphenyl, p-tert.- Butylphenyl, o-Methoxyphenyl, m-Methoxyphenyl, p-Methoxyphenyl, o- Methylphenyl, m-Methylphenyl, p-Methylphenyl, 4-Methoxy-3-chlorphenyl, 2- Methyl-4-chlorphenyl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, 2-Chlor-6-fluorbenzyl, 2,6-
Difluorbenzyl, o-Chlorbenzyl, m-Chlorbenzyl oder p-Chlorbenzyl steht.
Die Naphthindazol-4,9-chinone wurden durch H. Laatsch synthetisiert und strukturell aufgeklärt (Laatsch, H. Liebigs Ann. Chem. 1985, 251-274). Die Synthese der
Naphthindazol-4,9-chinone erfolgt nach dem in dem deutschen Patent DE 38 31 332 beschriebenen Syntheseschema. Alle Verbindungen wurden mit Hilfe spektroskopischer Methoden (H/C-NMR, Massenspektroskopie, UV-, IR- Spektroskopie) strukturell charakterisiert. In der oben genannten Publikation wie auch in den nachfolgenden Mitteilungen berichteten der oder die Autoren nicht, daß die beschriebenen Naphthindazol-4,9-chinone antiparasitäre Wirkungen zeigen. Es ist bekannt, daß Naphthochinone eine Strukturklasse mit biologischer Wirkung bilden. Nachteilig bei den untersuchten Naphthochinonen war ihre hohe Toxizität gegenüber Zellen und Säugetieren. Die hohe Toxizität wurde bei Tierversuchen an Ratten und Mäusen nachgewiesen (Sepύvelda-Boza, S., Cassels, B.K. Plant metabolites active against Trypanosoma cruzi. Planta Med 1996, 62, 98-105). Für die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), den Naphthindazol-4,9-chinonen, wurden weder antiparasitäre noch toxikologische Wirkungen beschrieben. Einzig herbizide Wirkungen gegenüber pflanzenpathogene Pilze wurden durch H. Laatsch beschrieben (Offenlegungsschrift DE-A 21 07 053).
Es konnte unerwarteterweise gefunden werden, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000012_0001
sowie deren pharmakologisch verträgliche Salze oder Dimere oder Trimere, worin *y *3. A C ß
R , R , R , R , R und R die oben angegebene Bedeutung haben, hohe antiparasitäre Wirkung mit sehr geringer Toxizität aufweisen.
Die hohe antiparasitäre Wirkung sowie die sehr geringe Toxizität konnte im Tier am Beispiel der Maus nachgewiesen werden.
Die folgende Tabelle listet die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) auf, welche bei den pharmakologischen Untersuchungen eingesetzt wurden.
Figure imgf000013_0001
Die Naphthindazol-4,9-chlnone der allgemeinen Formel (I) zeichnen sich durch eine hervorragende Wirksamkeit gegen ein breites Spektrum Veterinär- und humanpathogener Parasiten aus, insbesondere gegen Leishmanien und Crypto- sporidien. Sie zeigen hohe Verträglichkeit im in-vivo Maus Modell und können in Antiparasitika zum therapeutischen Gebrauch eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß werden die antiparasitären Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur Infektionsprophylaxe und/oder zur Behandlung einer bestehenden Infektion therapeutisch genutzt.
Die folgende Tabelle listet die mikrobiellen Erreger auf, gegen die die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) eingesetzt werden und verdeutlicht, welche Krankheiten durch diese mikrobiellen Erreger verursacht werden.
Erkrankung Mikrobieller Erreger a) Afrikanische Humane Trypanosomiasis Trypanosoma spp. b) Südamerikanische Trypanosomiasis Trypanosoma spp. c) Viszerale Leishmaniose Leishmania spp. d) Kutane und Mucokutane Leishmaniose Leishmania spp. e) Canine Leishmaniose Leishmania spp. f) Malaria Plasmodium spp. g) Babesiose Bahesia spp. h) Neosporidose Neospora caninum i) Sarcocystose Sarcocystis spp. j) Cryptosporidiose Cryptosporidium spp. k) Coccidiose Eimeria spp., Isospora spp.
I) Humane Toxoplasmose Toxoplasma gondii m) Feline Toxoplasmose Toxoplasma spp. n) Pneumocystose Pneumocystis carinii Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Bereitstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche mindestens eine der Verbindungen der allgemeinen Forme! (I) enthalten,
Figure imgf000014_0001
A A C ß worin R , R , R , R , R und R die oben angegebenen Bedeutungen haben.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können selbst oder in Form eines pharmakologisch verträglichen Salzes verabreicht werden. Geeignete Beispiele dieser Salze der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) umschließen Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren. Als Säuren, welche ein Säureadditionssalz der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bilden, können die folgenden genannt werden: Schwefelsäure, Sulfonsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Bromwasserstoffsäure, Chlorwasserstoffsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Bernsteinsäure, Oxalsäure, Glucolsäure, Milchsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Brenztraubensäure, Phenylessigsäure, Benzoesäure, p- Aminobenzoesäure, p-Hydroxybenzoesäure, Salicylsäure, p-Aminosalicylsäure, Ambonsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Hydroxyethansulfonsäure, Ethylensulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naphthylsulfonsäure, Sulfanilsäure, Camphersulfonsäure, Chinasäure, o-Methylmandelsäure, Hydrogenbenzolsulfon- säure, Methionin, Tryptophan, Lysin, Arginin, Pikrinsäure, Adipinsäure oder d-o- Tolylweinsäure. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (1) sowie deren pharmakologisch verträgliche Salze können alleine appliziert oder in bekannter Weise durch Verstrecken mindestens einer der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit Lösungsmitteln, Trägerstoffen und/oder Tierfutter, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln, in die üblichen Formulierungen überführt werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Dispersionen, Emulsionen, Cremes, Salben, Pasten, Pulver, Granulate, Tabletten, Zäpfchen, Kapseln oder Dragees verwendet werden.
Die Anwendung richtet sich nach dem zu therapierenden Parasiten und soll die Abtötung oder zumindest eine Vermehrungs- oder Wachstumsbeschränkung des Parasiten bewirken.
Beispielsweise erhält man entsprechende Formulierungen durch Mischen mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit Lösungsmitteln, Trägerstoffen und/oder Tierfutter, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln, wobei im Falle von Wasser als Verdünnungsmittel auch andere organische Lösungsmittel verwendet werden können.
Als Lösungsmittel für die erfindungsgemäßen Formulierungen dienen Aromaten, chlorierte Aromaten, Paraffine, Alkohole, Wasser, Ketone, Amine, Ethanolamin, Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxid. Als Trägerstoffe werden natürliche Gesteinsmehle, wie beispielsweise Kaolin, Tonerden, Talkum, Kreide oder synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure oder Silikate eingesetzt. Als Emulgiermittel finden nichtionogene und ionöge Emulgatoren, wie Polyoxyethylen-Fettalkohol-Ether, Alkylsulfonate oder Arylsulfonate Verwendung. Als Dispergiermittel kommen Lignin, Sulfitablaugen, Methylcellulose und als Kapselgrundstoffe für Tabletten Ethylcellulose, Stärke, Lactose, Erdalkali-Fettsäuren oder Magnesiumstearat in Frage. Die erfindungsgemäßen antiparasitären pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten mindestens eine der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in einer Menge zwischen 0,1 und 99 Gew%.
Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen antiparasitären pharmazeutischen Zusammensetzungen mindestens eine der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in einer Menge zwischen 50 und 99 Gew%.
Von den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden dem Patienten je nach Krankheitsbild und seiner physischen Statur eine Tagesdosis zwischen 0,5 und 1500 mg bezogen auf die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) verabreicht.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden angewendet, indem sie systemisch oder lokal dem Organismus appliziert werden. Nach Forth, W. Henschler, D., Rummel, W., Starke, R. (1996) Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, Spektrum Verlag, wird unter systemischer Applikation die orale, kutane, nasale, parenterale, buccale oder anale Gabe und unter kutaner Applikation das Auftragen auf die Haut und/oder die Schleimhäute ohne systemische Wirkungen zu erzielen verstanden.
Von besonderem Interesse sind erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen, bei denen die Verarbeitung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) für die systemische und lokale Applikation zu partikulären Arzneimittelformen erfolgt.
Neben den üblichen Formulierungen ist gesondert die Verarbeitung zu Nanosuspensionen zu nennen, welche die systemische und lokale Applikation der Wirkstoffe optimiert.
Bei Nanosuspensionen, Solid Liquid Nanoparticles (SLN) oder Liposomen mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 0,1 bis 3 μm handelt es sich um pharmazeutische Zusammensetzungen, welche als partikuläre Arzneimittelformen bezeichnet werden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutische Zusammensetzungen werden zur therapeutischen Behandlung oder prophylaktischen Gabe bei parasitären Infektionen eingesetzt werden.
Dabei handelt es sich um parasitäre Infektionen, welche durch die opportunistischen Erreger Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii oder Pneumocystis spp. ausgelöst werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen oder die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können des weiteren zur Infektionsprophylaxe von Blut und Blutprodukten eingesetzt werden.
Besondere Bedeutung haben die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sowie deren erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen zur Bekämpfung der gastrointestinalen Infektion HlV-immunsupprimierter Patienten. Zur Zeit existiert kein effektives Arzneimittel für diesen Indikationsbereich. Ferner ist der Einsatz in veterinärmedizinischer Hinsicht hervorzuheben, da bei der Behandlung der Cocciodose in der Geflügelzucht und der Trypanosomiasis bei Zuchtrindern ein hoher Bedarf an wirksamen und nicht-toxischen Arzneimitteln besteht.
Synthese der N2-substituierten Naphthindazol-4,9-chinone
Die Synthese der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) erfolgt nach den von H. Laatsch (H. Laatsch. Angew. Chem. 1985, 251-274) oder von R. Ott und E. Pinter (Monatshefte der Chemie 1992, 123, 713-729) beschriebenen Syntheseschemata. Die synthetisierten Verbindungen wurden ebenfalls von H. Laatsch strukturell aufgeklärt. Die Strukturaufklärung erfolgte mit Hilfe spektroskopischer Methoden (H/C-NMR, Massenspektroskopie, UV-, IR-Spektroskopie). In den oben genannten Publikation wie auch in nachfolgenden Mitteilungen berichten die Autoren nicht, daß die beschrieben Naphthindazol-4,9-chinone antiparasitäre Wirkungen aufweisen. Man erhält grundsätzlich N2-substituierte Naphthindazol-4,9-chinone der allgemeinen Formel (I), indem man entsprechende Chinone mit überschüssigem Diazoalkan umsetzt, wobei neben den N1-substituierten Alkylderivaten in signifikanter Ausbeute auch die N2-substituierten Alkylderivate entstehen.
In besserer Ausbeute entstehen die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) auf den folgenden zwei Wegen:
1. Umsetzung der nicht alkylierten Naphthindazol-4,9-chinone mit Alkylierungs- mittein:
In signifikanter Ausbeute lassen sich nicht alkylierte Naphthindazol-4,9-chinone durch Umsetzung mit Alkylierungsmitteln, wie beispielsweise Dimethylsulfat, alkylieren, wobei N1-substituierte Naphthindazol-4,9-chinone und N2-substituierte Naphthindazol-4,9-chinone in einem Mengenverhältnis von 2:1 bis 1:1 entstehen. Das Mengenverhältnis von N1-alkylierten zu N2-alkylierten Naphthindazol-4,9- chinonen wird stark durch die Wahl des Alkylierungsmittels beeinflußt.
Figure imgf000018_0001
Anstelle der Verwendung von Alkylierungsmitteln ist auch der Einsatz von
Acylierungsmitteln, wie Säureanhydride oder Säurehalogenide möglich (R. Ott und E. Pinter in Monatshefte der Chemie, 125 (1994) 945-954):.
2. Umsetzung von Chinonen mit Sydnonen: Andererseits können die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) durch
Umsetzung der entsprechend substituierten Chinone (II) mit Sydnonen (III) gemäß dem von H. Brockmann und T. Reschke beschriebenen Syntheseschema hergestellt werden (Tetrahedron Letters 1965, 50, 4593). Die Sydnone sind einfach zugänglich und in hohen Ausbeuten zugänglich.
Figure imgf000019_0001
Die Substituenten R , R , R , R , R und R haben die oben angegebene Bedeutungen.
Die folgenden Beispiele 1 bis 6 beschreiben die Untersuchung der leishmam'ziden und trypanoziden Wirkung, der anti-Malaria-Wϊrkung, der Cryptσsporidiziden-Wirkung sowie der zytotoxischen Wirkung in-vitro und in-vivo.
Beispiel 7 beschreibt die Bereitstellung von Nanosuspensionen zur Verbesserung der in-vivo Bioverfügbarkeit der Verbindungen der allgemeinen Formel (I).
Beispiel 8 behandelt die Verbesserung der in-vivo Bioverfügbarkeit durch Inkorporation der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Solid Lipid Nanoparticles (SLN).
Beispiel 1
Untersuchungen der leishmaniziden Wirkung
EXTRAZELLULÄRE ZYTOTOXIZITÄT GEGEN LEISHMANIA spec.
In ihrem Vector (Schmetterlingsmücken; Phlebotomidae) und in Zellkulturmedien leben Leishmania Parasiten in ihrer promastigoten (langgestreckt-gegeißelten) Form. Lebende Zellen metabolisieren den gelben Farbstoff MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] zu blauen Formazankristallen, welche colorimetrisch quantifiziert werden. Im Vergleich zu unbehandelten Proben (Kontrollen) deuten geringere MTT-Umsätze auf direkt wirksame antiparasitäre Effekte hin. Dieser Test erlaubt ein Screening von Substanzen. Da jedoch im Säugetier Leishmania Parasiten nach der Infektion fast ausschließlich intrazellulär und in ihrer amastigoten Form vorliegen, ist seine Aussagekraft geringer als ein intrazellulärer Zytotoxizitätstest (s. dort).
Durchführung
1. Promastigote Leishmania (L. donovani, L. ajor, L enriettii) werden ä 1 x 104/ 100 μl Medium in 96-Loch Mikrotiterplatten eingesät. 2. Test- und Referenzsubstanzen werden in Verdünnungsserien zugegeben.
3. Die Parasiten werden 96 h bei 25 °C inkubiert.
4. Während der letzten 6 h wird MTT-Lösung zugegeben.
5. Gebildetes Formazan wird in Natrium (Sodium)-Dodecylsulfat (SDS) gelöst und im automatischen ELISA-Gerät durch Extinktionsmessung bei 570 nm quantifiziert.
6. Leishmanizide Effekte werden als ECS0 berechnet (Wirkstoffkonzentration bei 50% verringertem MTT Umsatz im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle).
INTRAZELLULÄRE ZYTOTOXIZITÄT GEGEN LEISHMANIA spec.
Leishmania Parasiten werden von ihren obligatorischen Wirtszellen (Makrophagen, Monozyten) durch Phagozytose aufgenommen. Einigen gelingt die Etablierung in den parasitophoren Vakuolen unter Umwandlung in die physiologisch adaptierte amastigote Form, welche sich intrazellulär vermehrt und mit dem
Krankheitsgeschehen ursächlich in Verbindung steht. Anti-Leishmania Mittel müssen gleichfalls in die parasitophore Vakuole gelangen und unter den dort herrschenden Bedingungen möglichst spezifisch gegen amastigote Leishmania Parasiten wirken.
Bereits mit Leishmanien parasitierte Makrophagen werden Wirkstoffen und Referenzsubstanzen ausgesetzt. Nach 96 Stunden werden die Wirtszellen aufgelöst. Überlebende Leishmanien wandeln sich in Promastigote zurück und vermehren sich. Lebende Zellen metabolisieren den gelben Farbstoff MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] zu blauen Formazankristallen, welche colorimetrisch quantifiziert werden. Im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen deuten geringere MTT-Umsätze auf intrazellulär wirksame antiparasitäre Effekte.
Durchführung
1. Murine Knochenmarkkultur-Makrophagen (MΦ) werden mit promastigoten Leishmania (L. donovani, L. major, L. enriettii) inkubiert.
2. Nach 1 h werden extrazelluläre Leishmania durch Zentrifugation entfernt, die parasitierten MΦ in Mikrotiterplatten eingesät und bei 37°C inkubiert.
3. Nach 24 h werden Test- und Referenzsubstanzen in Verdünnungsserien zugegeben.
4. Nach 96 h werden MΦ selektiv mittels SDS lysiert.
5. Das Lysat wird 72 h in Leishmania Wachstumsmedium bei 25°C inkubiert. 6. Den letzten 6 h wird MTT-Lösung zugegenen.
7. Gebildetes Formazan wird in SDS gelöst und im automatischen ELISA-Gerät durch Extinktionsmessung bei 570 nm quantifiziert.
8. Leishmanizide Effekte werden als EC50 berechnet (Wirkstoffkonzentration bei 50% verringertem MTT Umsatz im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle).
Ergebnisse
Tab. 1: Leishmanizide Wirkung beispielhafter Naphthindazol-4,9-chinone gegen unterschiedliche Le/shman/a-Spezies, Angabe der EC50 in μg/ml
Figure imgf000021_0001
*ED50 in μg/kg KG n.d.: nicht bestimmt (not determined) Beispiel 2
Untersuchungen der trypanoziden Wirkung
Die Bestimmung der trypanoziden Wirksamkeit erfolgt nach WHO Empfehlungen, die durch Croft und Kaminsky (Croft, S. L., Kaminsky, R. (1997a), Standardization of Drug Screening, Mitteilung zu COST ACTION 815 Acrival, Louvain) beschrieben wurden.
Durchfühung
In-vitro Bestimmung der Wirkung gegen Trypanosoma b. brucei
Figure imgf000022_0001
1. Die Bestimmung der Wirkung erfolgt im in-vitro Testmodell mit 2 unterschiedlichen Ttypanoso a-Stämmen. Die Stoffe wurden wie oben angegeben gelöst.
2. Der Test basiert auf dem von Brun und Lun (Brun R, Lun (1994), Vet. Parasitol. 52, 37-46)) beschriebenen LILI-Test (Low Inocuϊum Long Incubation Test).
3. Ausgehend von 30 mg/ ml werden Testsubstanzen in einer 96-Mikrotiterplatte (250 μl) 1 : 2 linear in Medium titriert.
4. T. brucei werden (4x103/ ml) werden 50 μl Balz Medium/ Loch zugegeben die Platten 72 h bei 37 °C inkubiert.
5. Für die letzten 5 h wird MTT-Lösung zugegeben. Bestimmung des relativen Parasitenwachstums erfolgt nach visueller Kontrolle des MTT-Umsatzes durch überlebende Trypanosomen. In-vitro Bestimmung der Wirkung gegen Trypanosoma cruzi
Die Bestimmung der trypanoziden Wirksamkeit erfolgt nach WHO Empfehlungen, die durch Croft und Kaminsky, 1997, (Croft, S. L, Kaminsky, R. (1997a), Standardization ofDrug Screening, Mitteilung zu COST ACTION 815 Acrival, Louvain) beschrieben wurden.
Durchführung
Figure imgf000023_0001
1. Als Wirtszellen werden aus BALB7c Mäusen nach Induktion mit 2% Stärkelösung, i.p. 24 h vor Lavage, Peritonealmakrophagen gewonnen.
2. Die Infektion erfolgt durch Trypomastigote, gewonnen aus dem Overiay infizierter WI-38-, Vero-Zellen oder L6-Myoblasten. Das Infektionsverhältnis Wirt: Parasit beträgt 1:5.
3. Die infizierten Zellen in einer 24er Mikrotiterplatte werden einer Wirkstoffkonzentration von 30 μmol ausgestzt, die in einer dreifachen
Verdünnungreihe dilutiert werden.
4. Die Inkubation erfolgt 3 - 6 Tage.
5. Die Bestimmung trypanozider Effekte erfolgt visuelle mit Hilfe eines Inversmikroskops. Ergebnisse
Tab. 2: Trypanozide Wirkung beispielhafter Naphthindazol-4,9-chinone gegen Trypanosoma b. brucei, Angabe der EC50 in μg/ml
Figure imgf000024_0001
Beispiel 3 Untersuchungen zur anti-Malaria-Wirkung
Frisch übertragene Plasmodium spec. durchlaufen zuerst ein kurzes intra- hepatozytäres Stadium und anschließend fortlaufende intra-erythrozytäre Zyklen. Der erythrozytäre Zyklus humanpathogener P. faiciparum läßt sich in-vitro vollständig nachvollziehen.
Die Entwicklungsstadien innerhalb der Erythrozyten können anhand gefärbter, mirkroskopischer Präparate verfolgt und quantifiziert werden. Der Anteil parasitierter Erythrozyten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle läßt auf die Inhibition der intrazellulären Vermehrung schließen, während die relativen Anteile der einzelne Entwicklungsstadien erste Rückschlüsse auf die Wirkungsweise einer Substanzen erlauben.
Durchfühung
1. 7 Tage alte P. faiciparum Blutkulturen werden zu frischem Spenderblut geben und in Mikrotiterplatten eingesät.
2. Zugabe unterschiedlichen Konzentrationen von Test- und Referenzsubstanzen.
3. Inkubation 24 h und 48 h bei 37 °C.
4. Zu beiden Zeiten. Herstellung von mikroskopischen Präparaten/ Probe; Färbung nach Giemsa.
5. Auszählung von 4 Gesichtsfeldern/ Präparat. 6. Auswertung nach:
- % parasititierter Erythrozyten
- Anteil Ringstadium, Trophozoite, Schizonten
Ergebnisse
Tab. 3: Antiplamosdiale Wirkung beispielhafter Naphthindazol-4,9-chinone gegen Plasmodium faiciparum, Angabe der EC50 in μg/ml
Plasmodium faiciparum
Nr. EC50 (ug/ml)
6,56
Beispiel 4 Untersuchung zur Hemmung der Cryptosporidiose
In-vitro Aktivität gegen Cryptosporidium parvum
Cryptosporidium parvum (C. parvum) Stämme KSU-1 und Iowa wurden durch Dr. M.V. Nesterenko (Kansas State University) zur Verfügung gestellt. Oocysten wurden mit CsCI-Lösung oder durch Zentrifugation im Sucrosegradienten aufgereinigt, zur Sterilisation 5 min in Chlorox®-Lösung eingelegt und anschließend mit sterilem Wasser gewaschen. Für in-vivo Excystation wurden aufgereinigte Oocysten bei 37°C für 1 Stunde in PBS-Puffer mit 0,25% Trypsin und 0,75% Taurodeoxycholate inkubiert. Freie Sporozoiten wurden durch Zentrifugation im Percoll®-Gradienten isoliert. Das Verfahren lehnt sich an die Vorschrift von Nesterenko, MV, Upton, SJ (1996) J. Microbiol. Meth., 25:87-89 an. Die Untersuchung der anti-Cryptosporidien- Wirkung erfolgt nach den Vorschriften von Woods, KM, Nesterenko, MV (1995) FEMS Microbiol. Lett., 128: 89-94. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), die Naphthindazol-4,9-chinone, wurden wie folgt getestet:
Durchführung
1. Oocysten werden ä 3,0 x 104/ 100 μl Medium in 96-Loch.Mikrotiterplatten gegeben, in denen 4,0x10B HCT-8 Zellen (ATCC CGI 244) eingesät wurden. 2. Platten werden 90 min bei 37°C inkubiert und 2x gewaschen.
3. Neues Nährmedium und Test- wie Referenzsubstanzen werden in Verdünnungsserien zugegeben.
4. Die Parasiten werden 48 h bei 37 °C, 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. 5. Detektion erfolgt durch ELISA Messung mit Ratten-anti-Cryptosporidien- Antiserum.
6. Nach Zugabe von S.S'.δ.δ'-Tetramethylbenzidin wird die optische Dichte bei 630 nm im automatischen ELISA-Gerät durch quantifiziert.
7. Anti-Cryptosporidium-Effekte werden als EC50 berechnet .
In-vivo Aktivität gegen Cryptosporidium parvum
C. parvum ist ein weltweit verbreiteter und bedeutender Erreger von Durchfällen bei Kälbern und schwersten Durchfallerkrankungen bei immunkompromittierten Menschen. CD4+ T Zeil-defekte (TCR- -defiziente) Mäuse vermögen den Erreger spontan nicht zu eliminiem.
Mindestens eine der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wird oral verabreicht. Sie müssen den Bedingungen und die Dauer der Magen-Passage widerstehen und am Darmepithel ihre Wirksamkeit entfalten. Gezählt werden C. parvum Sporozoite auf einer definierten Fläche Dünndarmepithels. Angegeben wird die Reduktion der Besiedlung (in %) verglichen mit unbehandelten Kontrolltieren.
Durchführung
1. C. para/m-sensitive TCR-α-defiziente Mäuse werden oral mit C. parvum Oocysten infiziert. 2. Test- und Referenzsubstanzen werden oral verabreicht.
3. Tiere werden getötet; das Dünndarmepithel herauspräpariert.
4. C. parvum Sporozoite werden gezählt. Ergebnisse
Tab. 4: Wirkung beispielhafter Naphthindazol-4,9-chinone gegen Cryptosporidium parvum, Angabe der EC50 in μg/ml
Cryptosporidium p rvum Cryptosporidium parvum
Nr. ICJO (ug/ml) Infectivity Score
1 50 n.d.
2 14,4 0,2
3 45,4 n.d.
4 >100,0 n.d. n.d.: nicht bestimmt (not determined)
Beispiel 5
Untersuchungen zur zytotoxischen Wirkung in-vitro und in-vivo
In-vitro Untersuchungen
Gesucht werden Wirkstoffe mit möglichst hoher Toxizität für einzelne - oder Gruppen von - Krankheitserregern und gleichzeitig geringer Toxizität für Zellen des Wirtsorganismus.
Lebende Zellen metabolisieren den gelben Farbstoff MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] zu blauen Formazankristallen, welche colorimetrisch quantifiziert werden. Im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen geringere MTT-Umsätze deutet auf zytotoxische Effekte.
Untersucht wurden:
Maus Knochenmarkkultur-Makrophagen
Maus Monozytenlinie RAW
Mensch Melanomalinie SK-Mel Mensch Linie Heia
Durchfühung 1. Zellen werden zu 1 x 105/ 100 μl Medium/ Loch in 96-Loch Mikrotiterplatten eingesät und 1 h bei 37 °C inkubiert.
2. Test- und Referenzsubstanzen werden als Verdünnungsreihen in 100 μl/ Loch zugegeben. 3. Inkubationszeit 48 h oder 72 h, davon die letzten 6 h in Gegenwart von MTT- Lösung.
4. Gebildetes Formazan wird mittels SDS gelöst und in einem automatischen ELISA-Gerät durch Bestimmung der relativen Extinktion bei 570 nm quantifiziert.
5. Zytotoxische Effekte werden als EC50 berechnet (Wirkstoffkonzentration bei 50% verringertem MTT Umsatz im Vergleich zur unbehandelten Probe.
In-vivo Untersuchungen
Parallel zu den Untersuchungen zur Wirksamkeit von Testsubstanzen in-vivo gegen Cryptosporidium parvum (R. Waters) oder L. donovani (S. Croft) wurden jeweils nicht infizierte Tiere auf gleichem Wege (oral bzw. intravenös) behandelt, um einen ersten Eindruck von möglichen Nebenwirkungen der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) am Gesamtorganismus zu bekommen.
Durchfühung
1. Mäuse bekommen oral Test- oder Referenzsubstanzen verabreicht.
2. Tiere werden beobachtet hinsichtlich:
- Mortalität - Haltung - Verhalten
- äußerer Erscheinung (Zustand des Fells; Nahrungsannahme)
Ergebnisse Tab. 5: In-vitro Zytotoxizitätsbestimmung von Naphthindazol-4,9-chinone, EC50 = μg/ml
Figure imgf000028_0001
n.d.: nicht bestimmt (not determined)
Maus 1 : siehe in-vivo Testung gegen Cryptosporidium parvum
Maus 2: siehe in-vivo Testung gegen Leishmania donovani Beispiel 6
Untersuchungen zur in-vivo Aktivität gegen Leishmania donovani
Leishmania donovani sind obligat intrazelluläre Parasiten des Monozyten- Makrophagen-systems. Sie verursachen viszeralisierende Infektionen unter Beteiligung sämtlicher Organe einschließlich des Knochenmarks. In der Regel handelt es sich um eine Zoonose, wobei unter anderem Nagetiere als Reservoir dienen. Die Infektion der Maus bietet somit ein verbreitetes Infektionsmodell mit ähnlicher Symptomatik wie beim Menschen (Viszeralisierung des Erregers, Hepatosplenomegalie, u.a.m.) mit genetisch determinierter, d.h. Mausstamm- abhängiger Tendenz zur Selbstheilung oder Chronizität.
Durchführung
1. Leishmania donovani Stamm MHOM/ET/67/L82 (HU3 oder LV9) oder Leishmania donovani Stamm LRC-1233 (WHO Reference Centre Jerusalem) Maus Stamm
BALB/c, weiblich, 18-20g
2. Therapie Standards: Natrium Stibogluconat (Pentostamä, Glexo-Wellcome), Meglumin Antimonat (Glucantimeä, Rhone-Poulenc Rover)
3. Test Substanzen werden in der Regel in 100% DMSO oder Ethanol aufgenommen (Stocks ä 10 mM hergestellt). Vor Anwendung werden jeweils frische Verdünnungsreihen dieser Stocks (90 μM) in Kulturmedium oder PBS hergestellt.
4. Mäuse werden entweder mit metazyklischen Promastigoten (aus in-vitro Kulturen) intraperitoneal (i.p.) oder Amastigoten (aus infizierten Hamstern) intravenös (i.v.) ä 1 X 107 Parasiten / Maus infiziert.
5. Behandlung mit Testsubstanzen oder Therapie Standards beginnt 7-10 d p.i. mit einer Gabe pro Tag über die nächsten 4-5 Tage.
6. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten werden die Tiere getötet, Milz und Leber gewogen und von jedem Organ Tupfpräparate angefertigt, welche in Methanol (100%) fixiert und nach Giemsa (10%, 45 min) gefärbt werden. 7. Gezählt wird die Anzahl Amastigoten pro Leberzellen und die Gesamtzahl Parasiten / Organ berechnet nach der Formel:
Anzahl Amastigoten / 500 Zellen X Organgewicht [mg] X 200.000 (Konstante)
Ergebnisse
Die entsprechenden Versuchsergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Beispiel 7
Verbesserung der in-vivo Bioverfügbarkeit durch Überführung in Nanosuspensionen
Indem Nanosuspensionen auf die spontane Bereitschaft der oben beschriebenen Zellen zur Aufnahme von Fremdkörpern zielen, stellen Nanosuspensionen als partikuläre Darreichungsform ein effektives „drug-targeting" gegen Erreger dar, welche innerhalb von Phagozyten (Makrophagen) persistieren. So können selektiv hohe Wirkstoffkonzentrationen um den Erreger erzielt und die Belastung des übrigen Organismus minimiert werden. Ferner zeigen sie den großen Vorteil, durch Teilchenzerkleinerung und Oberflächenvergrößerung die geringe Löslichkeit der Verbindungen der allgemeinen Formel (I), der Naphthindazol-4,9-chinone, zu verbessern.
Durchführung
Die Herstellung von Nanosuspensionen der Verbindungen der allgemeinen Formel (I), erfolgt mit Hilfe eines Hochdruckhomogenisators LAB 40 unter Druck zwischen 200 bis maximal 1500 bar und Verwendung unterschiedlicher Zyklenzahlen (i.d.R. 4- 8 Zyklen) [MÜLLER und PETERS., 1997]. Der mittlere Teilchendurchmesser liegt dabei im Bereich von circa 50 bis 999 nm. Die Sterilisation erfolgt durch Autoklavierung. Alternativ kann auch eine aseptische Herstellung unter Laminar-Air- Flow (LAF) erfolgen. Die Partikelgröße wird mit Hilfe der Photonkorrelations- Spektroskopie PCS (Malvern Zetasizer), einem Laserdiffraktometer LD und einem Coulter Counter mit 30 μm Kapillare (Coulter Electronics) bestimmt. Angegeben wird die Partikelgröße zur Charakterisierung der Nanosuspension durch ihre Durchmesser (D50%, D90% und D99%). Zur Bestimmung der Sättigungskonzentration im Überstand erfolgt die Abtrennung in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge und danach die Vermessung der Verbindung der allgemeinen Formel (I), des Naphthindazol-4,9-chinons, mit Hilfe der UV- Spektroskopie.
Zur Einstellung einer möglichst hohen physikalischen Lagerstabilität (Abwesenheit von Partikelaggregation) ist es günstig, die Partikel möglichst hoch gleichsinnig aufzuladen (hohes Zetapotential). Die Aufladung wird durch Auswahl optimierter, geladener Tenside vorgenommen, die erzielte Ladung mittels Elektrophoresemessungen bestimmt (Einsatz von Laserdoppleranemometrie - LDA). Die geringe Löslichkeit in biologischen Medien der Verbindungen der allgemeinen. Formel (I), der Naphthindazol-4,9-chinone, erweist sich als Vorteil für die systemische Applikation als Nanosuspension. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden durch Hochdruckhomogenisation in eine Nanosuspension überführt und somit intravenös applizierbar gemacht. Durch Überführung schwer-wasserlöslicher Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Nanosuspensionen kann eine ausreichende Bioverfügbarkeit und optimierte Abgabe der Verbindung der allgemeinen Formel (I) in infizierte Makrophagen im Tiermodell erzielt werden. Die Prüfung auf physikalische Stabilität, Freisetzung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) und Überprüfung der Sättigungslöslichkeit erfolgt durch wiederholte Partikelgrößenbestimmung und UV- spektroskopische Untersuchungen (ggf. HPLC) in einem definierten Zeitintervall.
Ergebnisse
Tab. 6. Verbesserung der in-vivo Wirkung von Substanz 22 durch Formulierung als Nanosuspenion
Figure imgf000031_0001
Beispiel 8
Verbesserung der in-vivo Bioverfügbarkeit durch Formulierung als Solid Lipid Nanoparticles (SLN)
Die Verbindung der allgemeinen Formel (1) wird in einer Fettgruπdlage gelöst oder suspendiert, welche nach Erkalten mit Hilfe der Hochdruckhomogenisation, wie unter Beispiel 7 beschrieben, zu Partikeln mit einer durchschnittlichen Größe von 100 - 900 nm homogenisiert wird. Von Vorteil gegenüber der reinen Nanosuspensionen ist, daß definierte Partikel erzeugt werden, die beispielsweise höhere Zellaffinität aufweisen, die Toxizität von Wirkstoffen reduzieren, eine Wirkstoffreisetzung nach definierter Kinetik erlauben und für gastrointestinales wie zelluläres Targeting geeignet sind.
Durchführung Die Herstellung der Naphthochinon-SLN erfolgt durch die Kalt-Homogenisations- technik: Die Fettgrundlage (zum Beispiel Compritol ATO 888, Poloxamer 188) wird geschmolzen, die Verbindung der allgemeinen Formel (I), das Naphthindazol-4,9- chinone, in die Schmelze gegeben und kalt gerührt. Die erstarrte Schmelze, welche die Verbindung der allgemeinen Formel (I) gelöst oder suspendiert enthält, wird mit Zusatz von zum Beispiel Tween 80 und Span mit einem Ultra-Thurax zerkleinert. Diese Lösung oder Präsuspension wird anschließend mit einem LAB-40 Homogenisator direkt homogenisiert, um Partikel im Bereich 100 - 900 nm zu erhalten. Diese Partikel werden Solid Lipid Nanoparticle (SLN) genannt. Die Partikelgröße wird mit Hilfe der Photonkorrelations-Spektroskopie PCS (Malvern Zetasizer), einem Laserdiffraktometer LD und einem Coulter Counter mit 30 μm Kapillare (Coulter Electronics) bestimmt. Angegeben wird die Partikelgröße zur Charakterisierung der Nanosuspension durch ihre Durchmesser (D50%, D90% und D99%). Zur Bestimmung der Sättigungskonzentration im Überstand erfolgt die Abtrennung in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge und die Vermessung der Verbindung der allgemeinen Formel (I), des Naphthindazol-4,9-chinons, mit Hilfe der UV-Spektroskopie.

Claims

Patentansprüche
1. Pharmazeutische Zusammensetzungen, gekennzeichnet durch den Gehalt an mindestens einer der Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000033_0001
wobei R ,1 e -i_n Wasserstoffatom oder eine Gruppe
"(CH2)m"~ CH— CH (CH2)β-m — H ,
Figure imgf000033_0002
— (CH2)n-R7
Figure imgf000033_0003
O — (CH2)p-OC— R9 ,
Figure imgf000033_0004
O
II
-(CH2)p— C-R11 t
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000034_0002
Figure imgf000034_0003
— C2H4-C≡C-R12 ,
— CH2-C≡C-CH2— R12 ,
— C≡C-C2H4— R12 ?
bedeutet und n A C G
R , R , R , R und R unabhängig voneinander jeweils ein Wasserstoffatom oder einen der Reste
-R7, -NO2, -NH2, -NHR8, -NR8R8', -CN, -OH, — (CH2)0-R14 ,
— O— (CH2)0-R12 }
— S— (CH2)o-R12 ,
O O O II II II -C— R16 -OC— R 6 , -CO— R16 ,
O H O
II I ιι
-OC— (CH2)0-R12 — N-C— R16
O H O R161 II I -C— N-R16 -C— N— R16 ,
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000035_0002
darstellen,
3 4
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-5 und C-6 des
Benzolringes einen weiteren kondensierten Benzol- oder Naphthalinring ausbildet, der gegebenenfalls weitere funktionelle Gruppen trägt, wobei es sich bei diesen funktionellen Gruppen um Fluor-, Chlor-, Brom-, lod-, Nitro-, Cyano-, Amino-, Hydroxy-, Trifluormethylgruppen, Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy- oder Halogenalkoxygruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder um Alkylthio- oder Halogenalkylthiogruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen handelt,
R3 zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-5 und C-6 des
Benzolringes einen weiteren kondensierten fünf- oder sechsgliedrigen
Heterocyclus ausbildet, wobei R und R unabhängig voneinander jeweils ein
Kohlenstoff-, Sauerstoff- oder Stickstoffatom darstellen und dieser weitere Heterocyclus gegebenenfalls durch Fluor-, Chlor-, Brom-, lod- oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
4 5
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-6 und C-7 des
Benzolringes einen weiteren kondensierten Benzol- oder Naphthalinring ausbildet, der gegebenenfalls weitere funktionelle Gruppen trägt, wobei es sich bei diesen funktioneilen Gruppen um Fluor-, Chlor-, Brom-, lod-, Nitro-, Cyano-, Amino-, Hydroxy-, Trifluormethylgruppen, Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy- oder Halogenalkoxygruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder um Alkylthio- oder Halogenalkylthiogruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen handelt,
R4 zusammen mit R5 und den beiden Kohlenstoffatomen C-6 und C-7 des Benzolringes einen weiteren kondensierten fünf- oder sechsgliedrigen Heterocyclus ausbildet, wobei R und R5 unabhängig voneinander jeweils ein Kohlenstoff-, Sauerstoff- oder Stickstoffatom darstellen und dieser weitere Heterocyclus gegebenenfalls durch Fluor-, Chlor-, Brom-, lod- oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
R5 zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-7 und C-8 des Benzolringes einen weiteren kondensierten Benzol- oder Naphthalinring ausbildet, der gegebenenfalls weitere funktionelle Gruppen trägt, wobei es sich bei diesen funktioneilen Gruppen um Fluor-, Chlor-, Brom-, lod-, Nitro-, Cyano-, Amino-, Hydroxy-, Trifluormethylgruppen, Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy- oder Halogenalkoxygruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder um Alkylthio- oder Halogenalkylthiogruppen mit 1 bis
5 Kohlenstoffatomen handelt,
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-7 und C-8 des
Benzolringes einen weiteren kondensierten fünf- oder sechsgliedrigen Heterocyclus bildet, wobei R und R unabhängig voneinander jeweils ein
Kohlenstoff-, Sauerstoff- oder Stickstoffatom darstellen und dieser weitere Heterocyclus gegebenenfalls durch Fluor-, Chlor-, Brom-, lod- oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
R7 für -R12, -OR8 oder -SR8 steht,
R und R unabhängig voneinander eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, g
R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Gruppe der Struktur
darstellt,
Figure imgf000037_0001
R10 für -R12, -R8oder -OR8 steht,
R11 für -R8, -NH2, -NHR8, -NR8R8', -OH, -OR8, steht, R12, -R12' , -R12" , -R12"' , -R12"" unabhängig voneinander für -H, -F, -Cl, -Br oder
-I stehen,
R13 für -R8, -R12 oder eine Gruppe der folgenden Struktur steht
— C2H4— C≡C— R 2 t — CH2-C≡C-CH2— R12 , — C≡C-C2H4— R12
R14 für -CH3, -R7oder -SH steht,
R , -R , -R , -R , -R unabhängig voneinander für
-R7, -R8, -NO2, -NH2, -NHR8, -NR8R8', -CN oder
— O— (CH2)0-R12 , — S— (CH2)o-R1 , — (CH2)0-R12 stehen, R und R unabhängig voneinander -H oder -R bedeuten,
R17 für -R7, -CF3, -NO2, -CN, -SH, -OH oder -NH2 steht, m für 0 bis 8, n für 1 bis 10,
0 für 1 bis 5 und p für 0 bis 4 steht,
sowie deren pharmakologisch verträgliche Salze und deren Dimere und Trimere.
2. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie alleine appliziert oder in bekannter Weise durch
Verstrecken des Wirkstoffs mit Lösungsmitteln, Trägerstoffen und/oder Tierfutter, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln, in die üblichen Formulierungen überführt werden und als Lösungen, Suspensionen, Dispersionen, Emulsionen, Cremes, Salben, Pasten, Pulver, Granulate, Tabletten, Zäpfchen, Kapseln oder Dragees verwendet werden.
3. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach mindestens einem der Ansprüche
1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel Aromaten, chlorierte Aromaten, Paraffine, Alkohole, Wasser, Ketone, Amine, Ethanolamin, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, als Trägerstoffe natürliche Gesteinsmehle, Kaolin, Tonerden, Talkum, Kreide oder synthetische Gesteinsmehle, hochdisperse Kieselsäure oder Silikate, als Emulgiermittel nichtionogene und ionoge Emulgatoren, Polyoxyethylen-Fettalkohol-Ether, Alkylsulfonate, Arylsulfonate, als Dispergiermittel Lignin, Sulfitablaugen, Methylcellulose und als Kapselgrundstoffe für Tabletten Ethylcellulose, Stärke, Lactose, Erdalkali-
Fettsäuren oder Magnesiumstearat verwendet werden.
4. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die antiparasitären pharmazeutischen Zusammensetzungen zwischen 0,1 und 99 Gew% mindestens einer der
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) enthalten.
5. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die antiparasitären pharmazeutischen Zusammensetzungen zwischen 50 und 99 Gew% mindestens einer der
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) enthalten.
6. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß diese pharmazeutischen Zusammen- Setzungen dem Patienten in Abhängigkeit vom Krankheitsbild und der physischen Statur des Patienten mit einer Tagesdosis zwischen 0,5 und 1500 mg bezogen auf die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) verabreicht werden.
7. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verarbeitung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) für die systemische und lokale Applikation zu partikulären Arzneimittelformen erfolgt.
8. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den partikulären Arzneimitteiformen um
Nanosuspensionen, Solid Liquid Nanoparticles (SLN) oder Liposomen mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 0,1 bis 3 μm handelt. Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000040_0001
zur prophylaktischen Gabe oder therapeutischen Behandlung einer parasitären Infektion verursacht durch Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Cryptosporidium parvum, Eimeria spp., Toxoplasma gondii oder Pneumocystis spp.,
wobei R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe
— (CH2)m-CH=CH— (CH2)8.m— H ,
(CH2)m— C≡≡C (CH2)8-m H ,
-(CH2)n-R7
Figure imgf000040_0002
O
II — (CH2)P— OC— R9
Figure imgf000041_0001
O
II
-(CH2)P— C-R11 f
Figure imgf000041_0002
Figure imgf000041_0003
Figure imgf000041_0004
— C2H4-C≡C— R12 ^
— CH2-C≡C-CH2— R12 ,
— C≡C-C2H4— R12 j
bedeutet und
C £Z
R , R , R , R und R unabhängig voneinander jeweils ein Wasserstoffatom oder einen der Reste
-R7, -NO2, -NH2, -NHR8, -NR8R8', -CN, -OH,
Figure imgf000042_0001
— O— (CH2)o-R12
— S— (CH2)o-R12
O O O II II II -C— R16 . -OC— R16 -CO— R16
O H O
" ,„ ι "
-OC— (CH2)0-R12 — N-C— R16
O H O Riff
II I II I
-C— N-R16 _C_N_R16
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0002
darstellen,
3 4
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-5 und C-6 des Benzolringes einen weiteren kondensierten Benzol- oder Naphthalinring ausbildet, der gegebenenfalls weitere funktionelle Gruppen trägt, wobei es sich bei diesen funktionelJen Gruppen um Fluor-, Chlor-, Brom-, lod-, Nitro-, Cyano-, Amino-, Hydroxy-, Trifluormethylgruppen, Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy- oder Halogenalkoxygruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder um Alkylthio- oder Halogenalkylthiogruppen mit 1 bis
5 Kohlenstoffatomen handelt,
3 4
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-5 und C-6 des Benzolringes einen weiteren kondensierten fünf- oder sechsgliedrigen Heterocyclus ausbildet, wobei R und R unabhängig voneinander jeweils ein
Kohlenstoff-, Sauerstoff- oder Stickstoffatom darstellen und dieser weitere Heterocyclus gegebenenfalls durch Fluor-, Chlor-, Brom-, lod- oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
R4 zusammen mit R5 und den beiden Kohlenstoffatomen C-6 und C-7 des Benzolringes einen weiteren kondensierten Benzol- oder Naphthalinring ausbildet, der gegebenenfalls weitere funktionelle Gruppen trägt, wobei es sich bei diesen funktionellen Gruppen um Fluor-, Chlor-, Brom-, lod-, Nitro-, Cyano-, Amino-, Hydroxy-, Trifluormethylgruppen, Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy- oder Halogenalkoxygruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder um Alkylthio- oder Halogenalkylthiogruppen mit 1 bis
5 Kohlenstoffatomen handelt,
4 5
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-6 und C-7 des Benzolringes einen weiteren kondensierten fünf- oder sechsgliedrigen
4 5 Heterocyclus ausbildet, wobei R und R unabhängig voneinander jeweils ein
Kohlenstoff-, Sauerstoff- oder Stickstoffatom darstellen und dieser weitere Heterocyclus gegebenenfalls durch Fluor-, Chlor-, Brom-, lod- oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-7 und C-8 des
Benzolringes einen weiteren kondensierten Benzol- oder Naphthalinring ausbildet, der gegebenenfalls weitere funktionelle Gruppen trägt, wobei es sich bei diesen funktioneilen Gruppen um Fluor-, Chlor-, Brom-, lod-, Nitro-, Cyano-, Amino-, Hydroxy-, Trifluormethylgruppen, Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy- oder Halogenalkoxygruppen mit 1 bis 5
Kohlenstoffatomen oder um Alkylthio- oder Halogenalkylthiogruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen handelt,
R zusammen mit R und den beiden Kohlenstoffatomen C-7 und C-8 des Benzolringes einen weiteren kondensierten fünf- oder sechsgliedrigen
Heterocyclus ausbildet, wobei R und R unabhängig voneinander jeweils ein Kohlenstoff-, Sauerstoff- oder Stickstoffatom darstellen und dieser weitere Heterocyclus gegebenenfalls durch Fluor-, Chlor-, Brom-, lod- oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
R7 für -R12, -OR8oder -SR8 steht,
R und R unabhängig voneinander eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Gruppe der Struktur
darstellt,
Figure imgf000045_0001
R10 für -R12, -R8oder -OR8 steht,
R11 für -R8, -NH2, -NHR8, -NR8R8', -OH, -OR8, steht,
R12, -R12' , -R12" , -R12 " , -R12 "" unabhängig voneinander für -H, -F, -Cl, -Br oder
-I stehen,
R13 für -R8, -R12 oder eine Gruppe der folgenden Struktur steht
— C2H4-C≡C-R12 j — CH2-C≡C-CH2— R12 j — C≡C-C2H4— R12
R14 für -CH3, -R7 oder -SH steht,
R15, -R15' , -R15" , -R15"' , -R15"" unabhängig voneinander für
-R7, -R8, -NO2, -NH2, -NHR8, -NR8R8', -CN oder
— O— (CH2)0-R12 , — S— (CH2)0-R12 , (CH2)0-R12 stehen,
1fi 1 fi' R
R und R unabhängig voneinander -H oder -R bedeuten,
R17 für -R7, -CF3l -NO2, -CN, -SH, -OH oder -NH2 steht, m für 0 bis 8, n für 1 bis 10, o für 1 bis 5 und p für 0 bis 4 steht,
sowie deren pharmakologisch verträgliche Salze und deren Dimere und Trimere.
10. Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (l) zur prophylaktischen Gabe oder therapeutischen Behandlung einer parasitären Infektion nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
R1 für Wasserstoff oder eine Gruppe
-(CH2)m-CH=CH— (CH2)2.m-H ,
-(CH2)m-C≡C-(CH2)2.m-H ,
— (CH2)n-R7 f
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000046_0002
steht,
R7 für -R12, -OR8oder -SR8 steht,
R8 und R8 unabhängig voneinander eine Alkylgruppe mit 1 bis 4
Kohlenstoffatomen bedeuten,
R12, -R12' , -R12" , -R12 " , -R12"" unabhängig voneinander für -H, -F, -Cl, -Br oder -I stehen,
R15, -R15' , -R15" , -R15 " , -R15"" unabhängig voneinander für -R7, -R8, -NO2, -NH2, -NHR8, -NR8R8' oder -CN stehen und m für 0 bis 2 und n für 1 bis 4 steht.
11. Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur prophylaktischen Gabe oder therapeutischen Behandlung einer parasitären Infektion nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
R1 für Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl, tert-Amyl, n-Hexyl, Pent-3-yl, 1 ,2-Dimethylpropyl 1,3-Dimethylbutyl,
1-Ethyl-2-methylpropyl, 1 ,2,2-Trimethyipropyl, 2-Methylhept-5-yl, Allyl, Methallyl Crotyl, 2-Ethyl-2-hexenyi, 5-Hexenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 1-Buten-3-yl, 2- Methyl-1-buten-4-yl, 2-Methyl-2-buten-4-yl, 3-Methyl-1-buten-3-yl, Propargyl, 1-Butin-3- yl, 2-Butinyl, 2-Chlorethyl 2-Chlorpropyl, 3-Ch!orpropyl, 2-Chlorbut-2-yl, 2-Chlor-2- methylpropyl, 2-Fluorbut-2-yl, 2-Fluor-2-methylpropyl, 1-Fluorprop-2-yl, 1-Chlor-2- methylprop-2-yl, 2,2,2-Trifluorethyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, 3-Hydroxypropyl, 1- Hydroxyprop-2-yl, 2-Hydroxybutyl, 3-Hydroxybutyl, 4-Hydroxybutyl, 2-Hydroxy-2- methylpropyl, 2-MethoxyethyI, 2-Ethoxyethyl, 3-MethoxypropyI, 1-Methoxyprop-2-yl, 3- Methoxybutyl, 1-Methoxybut-2-yl, 1-Methoxy-2-methylprop-2-yl, 1-Ethoxy-2-methylprop- 2-yl, 2-Methoxybutyl, 4-Methoxybutyl, Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, 2-
Methylmercaptoethyl, 2-Ethylmercaptoethyl, 3-Methylmercaptopropyl, 3- Methylmercaptobutyl, 1 -Methylmercaptobut-2-yl, 1 -Methylmercapto-2-methylprop-2-yl, 2-Methylmercaptobutyl, Phenyl, 4-Chlorphenyl, 3,4-Dichlorphenyl, o-tert.-Butylphenyl, m-tert.-Butylphenyl, p-tert.-Butylphenyl, o-Methoxyphenyl, m-Methoxyphenyl, p- Methoxyphenyl, o-Methylphenyl, m-Methylphenyl, p-Methylphenyl, 4-Methoxy-3- chlorphenyl, 2-Methyl-4-chlorphenyl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, 2-Chlor-6-fluorbenzyl, 2,6-Difluorbenzyl, o-Chlorbenzyl, m-Chlorbenzyl oder p-Chlorbenzyl steht.
12. Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) nach einem der Ansprüche 9 bis 11 zur Infektionsprophylaxe von Blut und Blutprodukten.
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