WO2001071021A1 - Procede de production d'acide l-amine via un procede de fermentation - Google Patents

Procede de production d'acide l-amine via un procede de fermentation Download PDF

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WO2001071021A1
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microorganism
amino acid
transaminase
alanine
strain
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PCT/JP2001/002334
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Masato Ikeda
Makoto Yagasaki
Jun-Ichi Takano
Yayoi Abe
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an L-amino acid by a fermentation method.
  • Branched-chain amino acids such as L-leucine and L-isoleucine are used in foods, feed additives and synthetic raw materials for pharmaceuticals and agricultural chemicals.
  • the production of L-leucine includes genus Escherichia, genus Serratia, genus Coryn ⁇ bacterium, genus Arthrobacter, etc.
  • Methods using microorganisms are known.
  • a method for producing L-leucine using a microorganism belonging to the genus Escherichia a method using a microorganism having resistance to ⁇ -2-cherilalanine (JP-A-56-726695), a method for producing L-leucine, A method using a microorganism having resistance to 2-ketobutyric acid (Japanese Unexamined Patent Application Publication No.
  • a method for producing L-isoleucine a method using a microorganism belonging to the genus Escherichia, Serratia, Corynepacterium, or Arthrobacter is known.
  • a method for producing L-isoleucine using a microorganism belonging to the genus Escherichia a method using a microorganism having resistance to thiisoleucine, isoleucine hydroxamate, arginine hydroxamate, DL-ethionine and the like (Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 5-1308882) ), A method using a microorganism having resistance to 2-ketobutyric acid (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 8-99882), a method using a microorganism that grows rapidly in a medium containing L-homoserine as the sole nitrogen source (particularly, Kaihei 8-3 2 2 5 8 3) I have.
  • Alanine-parin 'transaminase catalyzes the reversible conjugate transamination reaction between L-alanine and pyruvate and 2-oxoisovalerate and L-valin as shown below. It is an enzyme.
  • Escherichia coli lacking i1vE which encodes the branched-chain amino acid transaminase (transaminase B), shows a complete requirement for L-isoleucine, but not for L-parin. Not completely required (leaky), alanine-valine transaminase is involved in the conversion of 2-oxoisovalerate to L-valine as a second transaminase replacing branched-chain amino acid transaminase [Eschericha coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, DC, (1987)].
  • An object of the present invention is to provide an industrially advantageous method for producing L-amino acid which is efficient and industrially advantageous by reducing by-product amino acids in a method for producing L-amino acid by fermentation.
  • the present inventors have conducted intensive studies with the aim of reducing the amount of by-product amino acid in the production of L-amino acid by fermentation, and as a result, found that the target L-amino acid-producing strain, alanine-valine-transaminase, was produced. It has been found that the amount of by-product amino acid produced is reduced by increasing the activity of, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to the following (1) to (11).
  • Microorganisms whose alanine-parin 'transaminase activity was higher than that of the parent strain A microorganism having the ability to produce L-amino acid in a culture medium, producing and accumulating L-amino acid in the culture solution, and collecting the L-amino acid. Law.
  • microorganism is a microorganism selected from the group consisting of a mutant strain, a cell fusion strain, a transduced strain, and a recombinant strain created using recombinant DNA technology. Manufacturing method.
  • microorganism is a microorganism selected from the group consisting of the genus Escherichia, the genus Serratia, the genus Corynebacterium or the genus Arthrobacter.
  • the microorganism is Escherichia coli H—8719 / p AD27 (FERM BP-7063) or Escherichia coli H—9156 / p AD27; the L-amino acid of (1) to (3); Manufacturing method.
  • a microorganism which is a microorganism having an alanine-palin 'transaminase activity higher than that of a parent strain and capable of producing L-amino acid.
  • microorganism selected from the group consisting of a mutant strain, a cell fusion strain, a transduced strain, and a recombinant strain created using recombinant DNA technology.
  • the microorganism is of the genus Escherichia, Serratia, or Corynebacterium. And the microorganism according to (8) or (9), which is a microorganism selected from the group consisting of the genus Arthrobacter.
  • microorganism according to any one of (8) to (10), wherein the microorganism is Escherichia coli 'H- 8719 / pAD27 (FER M BP-7063) or Escherichia coli' H-9156 / pAD27. Microorganisms.
  • the microorganism used in the present invention may be any microorganism as long as it has higher alanine-parin 'transaminase activity than the parent strain and has L-amino acid-producing ability.
  • the parent strain is a microorganism used as a source when constructing a mutant strain, a cell fusion strain, a transduced strain or a recombinant strain.
  • the microorganism in which alanine-valine 'transaminase activity is higher than that of the parent strain may be any of a mutant strain, a cell fusion strain, a transduced strain, or a recombinant strain.
  • microorganisms selected from microorganisms belonging to the genera Escherichia, Serratia, Corynebacterium, and Arthrobacter.
  • Preferable examples include so-called coryneform glutamate-producing bacteria such as Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium lactofamentum, which are used for amino acid fermentation.
  • the parent strain examples include an L-mouth isine-producing strain derived from a Escherichia coli H-8719 CFERM BP-4704 strain capable of producing L-leucine by a 4-azaleucine resistance mutation] and L-isomouth Escherichia coli H-9156 (FERM BP-5056), which has isin-producing ability, can be mentioned.
  • Means for increasing the activity of alanine-valine transaminase in these microorganisms include, for example,
  • a mutation is introduced in vitro into the alanine-parin 'transaminase gene, and a gene encoding an alanine-valine-transaminase having an increased activity compared to the alanine-valine' transaminase before the mutation is selected from the mutation-introduced genes.
  • a region involved in the expression of a gene coding for peranine-valine transaminase is modified in vitro to increase the expression level of the gene, and the modified gene is replaced with alanine-valine in host chromosome.
  • Methods for selecting a mutant strain having increased alanine-parin 'transaminase activity from a microorganism obtained by treating a microorganism having the alanine-valine transaminase gene with a mutagen include, for example, N-methyl-N, It is obtained by inducing a sudden mutation in a microorganism having an alanine-valine 'transaminase gene by a well-known method using a mutagen such as two-row N-nitrosoguanidine and treating with a mutagen.
  • a method of selecting a microorganism having an increased alanine-valine 'transaminase activity from the parent strain subjected to the mutation treatment includes, for example, culturing the microorganism in an appropriate medium, and disrupting the cells obtained by centrifugation by a known method.
  • a mutation is introduced in vitro into the alanine-palin transaminase gene, and the alanine-valine transamin before transfection is selected from the mutation-introduced genes.
  • -A a method for selecting a gene that encodes alanine-valine transaminase with increased activity over
  • Means for increasing the copy number of a gene coding for alanine-valine transaminase include, for example, cloning a gene coding for alanine-parin 'transaminase,
  • a recombinant DNA containing a gene encoding alanine-valine transaminase is transferred to the chromosome of the strain used as a host by homologous recombination or phage or phage transfer.
  • a region involved in the expression of a gene encoding alanine-valine-transaminase is modified in vitro to increase the expression level, and the modified gene is transformed into alanine-paline-transaminase in the host chromosome.
  • the gene encoding alanine-valine transaminase used in the present invention may be a gene derived from any cell, but is preferably a microorganism, more preferably a microorganism belonging to the genus Escherichia or Salmonella. Originated genes.
  • Examples of a method for obtaining a gene encoding alanine-valine-transaminase include the following methods.
  • the chromosomal DNA of the microorganism is type III based on the nucleotide sequence.
  • alanine-valine-transa from Escherichia coli or Salmonella typhimurium may be used.
  • Analysis of genes having a nucleotide sequence highly homologous to the nucleotide sequence of the minase gene by BLAST CJ. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] or FASTA (Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)) A method in which the target gene is obtained by PCR, by identifying the entire base sequence using software.
  • a specific example is shown below as a method for cloning the ⁇ ⁇ ⁇ , ⁇ tA gene, which is a gene encoding alanine-parin transaminase of Escherichia coli.
  • aVtA gene derived from a microorganism belonging to the genus Escherichia and surrounding sequences [Genbank, Accession No. AE00434 (1998)] 'Two types of primer DNA that can be synthesized, for example, represented by SEQ ID NO: 1 Avt A gene was obtained by PCR using the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 as a primer set and the chromosomal DNA of the microorganism as type III. Amplify a region of about 1.9 kb containing the promoter and its promoter sequence.
  • the obtained avtA gene is ligated to a plasmid vector capable of autonomous replication in a microbial cell into which the gene is to be introduced, and the recombinant vector is introduced into the microbial cell by a conventional method.
  • the gene can be cloned.
  • the plasmid vector used in the present invention any plasmid capable of autonomous replication in a microbial cell into which a gene encoding alanine-valine transaminase is introduced can be used.
  • any plasmid capable of autonomous replication in Escherichia coli cells can be used.
  • ZAP Express (Stratagene, Strategies, 5 , 58 (1992)), pBluescript II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)), human zap II (Stratagene), human gtlO, human gtll CDNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)], ⁇ TriplEx (Clontech), ⁇ BlueMid (Clontech), Human ExCell (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia), pcD2 CMol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)], pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)], pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], and derivatives thereof.
  • DNA obtained by ligating a VtA gene downstream of a promoter that functions in a microbial cell into which the gene is introduced is used.
  • any promoter may be used as long as it functions in the host cell.
  • Is a said promoter Isseki one for example, trp promoter Isseki one (P trp), lac promoter Isseki one, P L promoter Isseki one, P R promoter Isseki one, T7 promoter of evening one such as E.
  • promoters derived from phage and the like. It is also possible to use promoters that have been artificially designed and modified, such as a promoter in which two P trps are connected in series (P trp x 2), a tac promoter, a lacT7 promoter, and a let I promoter. it can. It is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a drug resistance acquired by the microorganism using a drug resistance gene retained on the plasmid can be used as an index. Can be done.
  • the recombinant microorganism is the target recombinant microorganism. It can be performed.
  • L-amino acid production using an L-amino acid-producing strain in which the activity of alanine-parin-transaminase obtained by the above method is higher than that of the host strain is used for the production of L-amino acids by the fermentation method. It can be carried out by the usual culture method used. That is, cultivation in a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, vitamins, and other components required for growth under aerobic conditions while appropriately controlling the temperature, pH, etc. Just do it.
  • various carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and lactose and molasses, cellulose hydrolyzate, crude sugar hydrolyzate, starch hydrolyzate and the like containing these can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and acetic acid.
  • Ammonium, ammonium salts such as ammonium phosphate, ammonium salts of various inorganic and organic acids, amines, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soy protein hydrolyzate, large It is possible to use soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells and digests thereof.
  • potassium (I) phosphate potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like are used.
  • Cultivation is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture.
  • the culture temperature is preferably from 20 to 40 ° C.
  • the pH of the medium is kept in the range of 5 to 9, preferably around neutral.
  • the pH of the medium is adjusted with calcium carbonate, an inorganic or organic acid, an alkaline solution, ammonia, a pH buffer, or the like.
  • L-amino acid is produced and accumulated in the culture solution after culturing for 1 to 7 days.
  • L-amino acids can be collected from the culture solution by known methods such as the ion exchange resin method, the concentration method, the salting-out method, and the precipitation method [Chemical Engineering Society (ed.) “Handbook of Bioseparation Processes”, Kyoritsu Shuppan (19) 9 6)].
  • the ion exchange resin method concentration method
  • the salting-out method concentration method
  • the precipitation method [Chemical Engineering Society (ed.) “Handbook of Bioseparation Processes”, Kyoritsu Shuppan (19) 9 6)].
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of plasmid pAD27.
  • V t A Gene coding for alanine-valine transaminase from Escherichia coli
  • Example 1 Acquisition of a VtA gene of Escherichia coli Escherichia coli K—12 strain derived from W3110 strain (ATCC 273325) was transferred to an LB agar plate [trypton / peptone (Difco) 10 g / L, Extract 5 g ZL, sodium chloride 10 g / L, agar 15 g / L, pH 7.5] and cultured at 37 ° C for 24 hours.
  • trypton / peptone (Difco) 10 g / L, Extract 5 g ZL, sodium chloride 10 g / L, agar 15 g / L, pH 7.5 was cultured at 37 ° C for 24 hours.
  • the culture solution was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and after the cells were collected, the cells were treated with TE buffer [1 Ommo 1 / L Tris (hydroxymethyl) aminoaminomethane, 1 mmol / L ethylenediamine 3
  • TE buffer 1 Ommo 1 / L Tris (hydroxymethyl) aminoaminomethane, 1 mmol / L ethylenediamine 3
  • the cells were washed with monosodium acetate, pH 7.5], collected, and the chromosome DNA was isolated from the collected cells according to the method of Saito-Miura [Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)]. Isolated.
  • oligonucleotide primers having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 were synthesized.
  • DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is upstream of the avtA gene including the promoter, and DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a sequence homologous or complementary to the downstream of the avtA gene. Primer.
  • a gene was amplified. The reaction was carried out 30 times at 94 ° C for 1 minute, 55 for 2 minutes, and 72 for 2 minutes.
  • the alanine-parin 'transaminase activity of these transformants was further measured as follows. Cultured cells cultured in a LB medium at 30 ° C for 24 hours with shaking (reciprocal shaking 300 rpm) were washed twice with a 8.5 g / L aqueous solution of sodium chloride in buffer A (25 mmo 1 / L potassium phosphate).
  • Buffer pH 7.0, glycerin 50 ml / L, ethylenediamine tetrasodium triacetate 0.1 mmol / L, dithiothreitol 0.2 mmol / L, pyridoxal phosphate 0.2 mmol 1 / L
  • the cells were resuspended in the same buffer to a wet cell weight of 100 g / L. After the suspension cells were disrupted by sonication, a crude enzyme solution was prepared by centrifugation.
  • Mobile phase 2.94 g / 1 trisodium citrate, 1.42 g / l sodium sulfate, 63 ml / ln-propanol, 3 g / 1 sodium dodecyl sulfate, pH 3.75 (with 2 mo 1 / L sulfuric acid) Adjustment) Mobile phase flow rate: 2 ml / min
  • Plasmid pAD27 was prepared from cultured cells of Escherichia coli H—8719 / pAD27, and Escherichia coli H—9156 having L-isoleucine productivity was prepared by electroporation using this plasmid. Was transformed.
  • Example 2 Production test of L-single ischine L-leucine production test for Escherichia coli H-8719, H-8719 / pAD27 carrying plasmid pAD27 containing the avtA gene, and H-8719 / pUC19 carrying plasmid vector pUC19 was performed as follows.
  • H-8719 / pAD27 and H-8719 / pUC19 were applied to LB agar plates containing 10 Omg / L of ampicillin, and H-8719 was applied to LB agar plates without ampicillin, and incubated at 30 ° C for 24 hours. Cultured.
  • One loopful of cultured cells 6 ml of seed medium (20 g / L of glucose, 10 g / L of peptone, 10 g / L of extract extract, 2.5 g / L of sodium chloride, 10 g / L of calcium carbonate, The cells were inoculated at pH 7.4) and cultured in a large test tube (diameter 25 mm, length 200 mm) with shaking (reciprocal shaking 300 rpm) at 30 ° C for 17 hours.
  • 0.1 ml of this culture was converted to 6 ml of production medium (glucose 65 g / L, corn steep liquor 2 g / L, ammonium sulfate 16 g / L, monobasic potassium phosphate 2 g / L, phosphoric acid Transplanted in 40 g / L magnesium, 10 g / L calcium carbonate, pH 7.0), and cultured in a large test tube (25 mm in diameter, 200 mm in length) at 30 ° for 48 hours with shaking (reciprocal shaking at 300 rpm). .
  • production medium glucose 65 g / L, corn steep liquor 2 g / L, ammonium sulfate 16 g / L, monobasic potassium phosphate 2 g / L, phosphoric acid Transplanted in 40 g / L magnesium, 10 g / L calcium carbonate, pH 7.0
  • L-mouth isine Production and accumulation of L-mouth isine was observed in all three strains.
  • the ratio of by-produced L-norin to L-mouth isine decreased in the reproducibility of H-8719 / pAD27 in which a-VtA gene expression was increased compared to the host H-8719.
  • the rate of decline was about 54%.
  • Escherichia coli H—91 56 containing the aVtA gene, H—91 56 / pAD 27 containing the plasmid pAD27, and H—91 1 containing the plasmid vector pUC 19
  • an L-isoleucine production test was performed as follows.
  • LB agar plate containing H_ 9156 / pAD 27 and H- 9156 / pUC 19 in ampicillin 10 Omg / L and LB agar plate without H- 9156 in ampicillin Each was applied to the medium and cultured at 30 ° C for 24 hours.
  • 0.1 ml of this culture was converted to 6 ml of a production medium (glucose 65 g / L, corn steep liquor 2 g / L, ammonium sulfate 16 g / L, potassium monophosphate 2 g / L, DL-methionine 0.1 g). 1 gZL, magnesium phosphate 40 g / L, calcium carbonate 10 g / L, pH 7.0), and shaken in a large test tube (25 mm in diameter, 200 mm in length) at 30 ° C for 48 hours. The culture was performed with shaking (reciprocal shaking 300 rpm).
  • the amount of L-isoleucine produced and accumulated in the culture solution and the amount of L-valin by-produced were determined by high performance liquid chromatography.
  • the measurement conditions are as described in Example 2 above.

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Description

明 細 書
発酵法による L—ァミノ酸の製造方法 技術分野
本発明は、 発酵法による L-アミノ酸の製造法に関する。 L—ロイシン、 L— イソロイシンなどの分岐鎖ァミノ酸は食品、 飼料添加物及び医薬品、 農薬の合 成原料などに用いられる。
背景技術
直接発酵による L—アミノ酸の製造法において、 例えば L—ロイシンの製造 法としては、 ェシエリヒア (Escherichia) 属、 セラチア (Serratia) 属、 コリ ネバクテリゥム （Coryn§bacterium) 属、 アースロバクタ一 （Arthrobacter) 属 などの微生物を用いる方法が知られている。 ェシエリヒア属の微生物を用いる L—ロイシンの製造法としては、 β—2—チェ二ルァラニンに耐性を有する微 生物を用いる方法 （特開昭 5 6— 7 2 6 9 5 ) 、 L—ェチォニンに耐性を有す る微生物を用いる方法 （特開昭 5 9— 5 5 1 9 4 ) 、 2—ケト酪酸に耐性を有 する微生物を用いる方法 （特閧平 8— 9 9 8 2 ) 、 4—ァザロイシンまたは 5， 5 , 5—トリフルォロロイシンに耐性を有する微生物を用いる方法 （特開平 8 - 7 0 8 7 9 ) などが知られている。
L—イソロイシンの製造法についても同様に、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 コリネパクテリゥム属、 アースロバクタ一属に属する微生物を用いる方法が知 られている。 ェシエリヒア属に属する微生物を用いる L—イソロイシンの製造 法としては、 チアイソロイシン、 イソロイシンハイ ドロキサメート、 アルギニ ンハイ ドロキサメート、 D L—ェチォニンなどに耐性を有する微生物を用いる 方法 （特開平 5— 1 3 0 8 8 2 ) 、 2—ケト酪酸に耐性を有する微生物を用い る方法 （特開平 8— 9 9 8 2 )、 L -ホモセリンを唯一の窒素源とする培地で速 やかに生育する微生物を用いる方法 （特開平 8 - 3 2 2 5 8 3 ) などが知られて いる。
しかしながら、 これらの方法では目的とする L—アミノ酸以外に他の Lーァ ミノ酸が少なからず副生する問題があつた。 特に L—ロイシンや L—イソロイ シンの製造における L一バリンの副生は、 その精製工程での分離除去が容易で はないため、 製造原価の上昇を招いたり、 精製収率や製品純度を下げる原因と なっていた。
ァラニン一パリン ' トランスアミナ一ゼ （トランスアミナーゼ C ) は、 下記 に示すように Lーァラニンとピルビン酸及び 2—ォキソィソ吉草酸と L—バリ ンとの間の可逆的な共役アミノ基転移反応を触媒する酵素である。
L—ァラニン + 2—ォキソイソ吉草酸 → ピルビン酸 + L—バリン 本酵素は、 また、 下記に示す L—ァラニンとピルビン酸及び 2—ォキソ酪酸 と 2—ァミノ酪酸との間の可逆的な共役ァミノ基転移反応も触媒することが知 られている。
L—ァラニン + 2—ォキソ酪酸 ピノレビン酸 + 2—ァミノ酪酸 ァラニン一バリン ' トランスアミナ一ゼをコードする遺伝子は、 ェシエリヒ ァ 'コリ (Escherichia coli) やサルモネラ ·ティフィムリウム ( almonella typhimurium) などの微生物に見出されている。 ェシエリヒア ·コリ由来のァラ ニン—パリン ' トランスアミナーゼについては、 本酵素をコードする遺伝子 （ a v t A) のクローニング、 該遺伝子の塩基配列が報告されている 〔J.
Bacteriol .， 169, 4228 ( 1987)、 Gene, 65, 195 ( 1988)、 Science, 277, 1356 ( 1997) 、 Genbank, Accession No. AE00434 ( 1998)〕 。 また、 a v t A遺伝子の増幅に よりァラニン一バリン · トランスアミナーゼの活性が上昇することも報告され ている 〔J. Bacteriol . , 169, 5610 ( 1987)〕 。
ァラニン—バリン · トランスアミナーゼの生理的役割に関する報告としては 以下のようなものがある。
分岐鎖アミノ酸トランスアミナ一ゼ （トランスアミナ一ゼ B ) をコードする i 1 v Eを欠損したェシエリヒア ·コリは L—イソロイシンに対して完全な要 求性を示すが、 L一パリンに対しては完全な要求性を示さず （リーキー性） 、 2—ォキソイソ吉草酸から Lーバリンの変換にァラニン一バリン · トランスァ ミナ一ゼが分岐鎖ァミノ酸トランスアミナーゼに代わる第 2のトランスァミナ ーゼとして関与していることが知られている 〔Eschericha coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D. C. , ( 1987 ) 〕 。 さらに、 同変異株で a v t A遺伝子を増幅させると L—バリンの部分要 求性 （リーキー性） が回復することが知られている 〔Eschericha coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D. C , ( 1987) 〕 。
しかしながら、 ァラニン一バリン ' トランスアミナーゼの活性を高めること により、 L—バリンの生成を低下させることができるとの知見はない。
発明の開示
本発明は、 発酵法による L—アミノ酸の製造法において、 副生アミノ酸を低 減することにより、 効率の良い工業的に有利な Lーァミノ酸の製造法を提供す ることを課題とする。
本発明者らは、 発酵法による L—アミノ酸の生産において副生ァミノ酸の低 減を目的として鋭意検討した結果、 目的とする L—アミノ酸の生産菌株のァラ ニン—バリン · トランスアミナ一ゼの活性を上昇させることで副生アミノ酸の 生成量が減少することを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 下記、 （ 1 ) 〜 （ 1 1 ) に関する。
( 1 ) ァラニン一パリン ' トランスアミナ一ゼ活性が親株より上昇した微生 物であり、 かつ L一アミノ酸生産能を有する微生物を培地中に培養し、 培養液 中に L—アミノ酸を生成蓄積させ、 該 L—アミノ酸を採取することを特徴とす る L—アミノ酸の製造法。
(2) 微生物が、 変異株、 細胞融合株、 形質導入株および組換え DN A技術 を用いて造成した組換え株からなる群から選ばれる微生物である、 （1) に記 載の L—アミノ酸の製造法。
(3) 微生物が、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 コリネバクテリゥム属また はアースロバクタ一属からなる群から選ばれる微生物である、 （ 1) または （ 2) に記載の L—アミノ酸の製造法。
(4) 微生物が、ェシエリヒア 'コリ H— 8719/p AD 27 (FERM B P- 7063) またはェシエリヒア ·コリ H— 9156/p AD 27である （ 1) 〜 （3) に記載の L—アミノ酸の製造法。
(5) L—アミノ酸が、 L—ロイシンおよび L—イソロイシンからなる群か ら選ばれるアミノ酸である （ 1) に記載の L—アミノ酸の製造法。
(6) 微生物のァラニン一パリン ' トランスアミナ一ゼの活性を上昇させる 手段が、 微生物細胞内のァラニン—パリン ' トランスアミナ一ゼ遺伝子の発現 量を上昇させるものである （1) に記載の L—アミノ酸の製造法。
(7) 微生物のァラニン—パリン ' トランスアミナ一ゼの活性を上昇させる 手段が、 微生物細胞内のァラニン—パリン ' トランスアミナーゼ遺伝子のコピ —数を上昇させるものである （ 1) に記載の L—アミノ酸の製造法。
(8) ァラニン一パリン ' トランスアミナーゼ活性が親株より上昇した微生 物であり、 かつ L一アミノ酸の生産能を有する微生物。
(9) 微生物が、 変異株、 細胞融合株、 形質導入株および組換え DN A技術 を用いて造成した組換え株からなる群から選ばれる微生物である、 （8) に記 載の微生物。
( 10) 微生物が、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 コリネバクテリウム属ぉ よびアースロバクタ一属からなる群から選ばれる微生物である、 （8) または (9) に記載の微生物。
( 1 1) 微生物が、 ェシエリヒア 'コリ H— 8719/pAD 27 (FER M BP— 7063) またはェシエリヒア 'コリ H— 9 156/pAD27で ある （8) 〜 （ 10) のいずれか 1項に記載の微生物。
以下に、 本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられる微生物としては、 ァラニン一パリン ' トランスアミナー ゼ活性が親株より上昇した微生物であり、 かつ L-アミノ酸生産能を有する微生 物であればいずれでも良い。 ここで親株とは、 変異株、 細胞融合株、 形質導入 株または組換え株を造成する際、 その元として用いた微生物である。 ァラニン 一バリン ' トランスアミナーゼ活性が親株より上昇した微生物は、 変異株、 細 胞融合株、 形質導入株あるいは組換え株のいずれであっても良い。 該微生物と しては、 例えばェシエリヒア属、 セラチア属、 コリネバクテリウム属、 アース ロバクター属に属する微生物から選ばれる微生物をあげることができる。 好適 には、 アミノ酸発酵に用いられている、 コリネバクテリウム ·グル夕ミクムや コリネバクテリゥム ·ラクトフアーメンタムなどのいわゆるコリネ型グルタミ ン酸生産菌ゃェシヱリヒア ·コリ等をあげることができる。
親株の具体例としては、 L—ロイシンの生産能を有するェシエリヒア ·コリ H— 8719 CFERM B P— 4704株から 4—ァザロイシン耐性変異に より誘導された L—口イシン生産性菌株〕 や L—イソ口イシン生産能を有する ェシエリヒア ·コリ H— 9 156 (FERM BP— 5056) をあげること ができる。
これらの微生物のァラニン一バリン · トランスアミナーゼの活性を上昇させ る手段としては、 例えば
①ァラニン一バリン · トランスアミナ一ゼ遺伝子を保有する微生物を変異誘発 物質で処理して得られる微生物から、 ァラニン一バリン， トランスアミナーゼ 活性が上昇した突然変異株を選択する方法、
②ァラニン一パリン ' トランスアミナーゼ遺伝子に、 試験管内で変異を導入し、 該変異導入遺伝子の中から、 変異導入前のァラニンーバリン ' トランスァミナ —ゼより活性の上昇したァラニン一バリン · トランスアミナーゼをコードする 遺伝子を選択する方法、
③細胞内のァラニン一バリン · トランスアミナ一ゼをコ一ドする遺伝子のコピ 一数を上昇させる方法、 または
④ァラニン一バリン · トランスアミナ一ゼをコ一ドする遺伝子の発現に関与す る領域を試験管内にて該遺伝子の発現量を高めるように改変し、 該改変遺伝子 を宿主染色体のァラニン一バリン · トランスアミナ一ゼをコ一ドする遺伝子と 置換する方法、
などをあげることができる。
ァラニン一バリン · トランスアミナーゼ遺伝子を保有する微生物を変異誘発 物質で処理して得られる微生物から、 ァラニン一パリン ' トランスアミナーゼ 活性が上昇した突然変異株を選択する方法としては、 例えば、 N—メチルー N ， 一二トロー N—ニトロソグァ二ジン等の変異誘発物質を用いた周知の方法に より、 ァラニン—バリン ' トランスアミナ一ゼ遺伝子を保有する微生物に突然 変異を誘発し、 該変異剤で処理して得られる微生物の中から、 該変異処理に供 した親株よりァラニン—バリン ' トランスアミナーゼ活性が上昇した微生物を 選択する方法をあげることができる。 微生物の有するァラニン—パリン ' トラ ンスアミナーゼ活性を測定する方法としては、 例えば、 該微生物を適当な培地 中で培養した後、 遠心分離により得られる菌体を周知の方法により破砕するこ とで粗酵素液を調製し、 該粗酵素液を用いて Lーァラニンを基質として酵素反 応を行った際に生成する L—バリン量を測定する方法をあげることができる。 ァラニン—パリン · トランスアミナ一ゼ遺伝子に、 試験管内で変異を導入し、 該変異導入遺伝子の中から、 変異導入前のァラニン—バリン ' トランスァミナ —ゼより活性の上昇したァラニン一バリン · トランスアミナーゼをコ一ドする 遺伝子を選択する方法としては、
1) ァラニン—パリン · トランスアミナーゼ遺伝子に部位特異的変異導入法 〔 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81,5662 (1984) 、 Science, 224, 1431 (1984)、 PCT W085/00817(1985)、 Nature, 316, 601 (1985)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)〕 により塩基の欠失、 置換若しくは付加の変異を導入し、 変異導入前のァラニン—パリン ' トランス アミナ一ゼより活性の上昇したァラニン一バリン · トランスアミナーゼをコ一 ドする遺伝子を得る方法、 または
2)エラ一 'プローン ポリメラ一ゼ 'チェーン 'リアクション〔Bio/Technol.， 9, 1073 (1991) (以下、 ポリメラ一ゼ 'チェーン ' リアクションは PC Rと略 す） 〕 によりァラニン ·バリントランスアミナ一ゼ遺伝子にランダムに塩基置 換等の変異を導入し、 該変異導入遺伝子から変異導入前のァラニン，バリント ランスアミナ一ゼより活性の上昇したァラニン ·バリントランスアミナ一ゼを コードする遺伝子を選択する方法、
などがあげられる。
ァラニン一バリン · トランスァミナ一ゼをコ一ドする遺伝子のコピー数を上 昇させる手段としては、 例えばァラニン一パリン ' トランスアミナーゼをコー ドする遺伝子をクローニングし、
1) ァラニン一バリン ' トランスアミナーゼをコードする遺伝子を含む DNA 断片を目的微生物の細胞内で自律複製可能なプラスミ ドベクターに連結して該 微生物に導入する方法、 または
2) アラニン—バリン · トランスァミナ一ゼをコ一ドする遺伝子を含む組換え 体 D N Aを、 宿主として用いる菌株の染色体に相同組換え法やファージまたは トランスポゾンを用いて組み込ませる方法、
などがあげられる。
ァラニン一バリン · トランスアミナ一ゼをコ一ドする遺伝子の発現に関与す る領域を試験管内で改変して発現量を高め、 該改変遺伝子を宿主染色体のァラ ニン一パリン · トランスアミナ一ゼをコードする遺伝子と置換する方法として は、
1 ) 該遺伝子の発現に関与する領域を、 該遺伝子を導入 ·発現させる微生物内 で強いプロモーター活性を有する既知のプロモーターと置換する方法、 または
2 ) 該遺伝子の発現に関与する塩基配列を有する D N Aに、 上記の部位特異的 変異導入法、 またはエラー 'プロ一ン P C R法により、 塩基の欠失、 置換、 若 しくは付加して得られる D N Aから、 変異導入前のァラニン一バリン · トラン スァミナ一ゼをコードする遺伝子より該遺伝子の発現が上昇した D N Aを選択 する方法等、
をあげることができる。
本発明で用いられるァラニン一バリン · トランスァミナ一ゼをコ一ドする遺 伝子は、 いかなる細胞由来の遺伝子であってもよいが、 好ましくは微生物、 よ り好ましくはェシエリヒア属またはサルモネラ属に属する微生物由来の遺伝子 があげられる。
ァラニン一バリン · トランスァミナ一ゼをコ一ドする遺伝子を取得する方法 としては、 例えば以下の方法をあげることができる。
①ェシエリヒア ·コリゃサルモネラ 'ティフィムリゥムのように該微生物が保 有するァラニン一バリン · トランスアミナーゼをコードする遺伝子の塩基配列 が公知である場合には、 該塩基配列に基づき、 該微生物の染色体 D N Aを錶型 とした P C R 〔P C R Protocols, Academic Press ( 1990)〕 により該遺伝子を 取得する方法、
②ァラニン一バリン ' トランスアミナーゼ活性を有する細胞で、 ァラニン一バ リン · トランスアミナーゼをコードする遺伝子の塩基配列が公知でない場合に は、 該細胞由来の cDN Aライブラリー、 または染色体 DN Aライブラリーを '吊'法 CMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition. (1989) 以下、 モレキュラー 'クローニング第 2版と略す） 〕 に従って作製し、
1) ライブラリ一を構成する各々の細胞のァラニン一バリン ' トランスァミナ —ゼ活性を測定し、 該細胞の中からァラニン一パリン ' トランスアミナーゼを コードする遺伝子を含有する細胞を選択する方法、 または
2) ェシエリヒア ·コリゃサルモネラ 'ティフィムリゥムのァラニン一バリン • トランスアミナーゼ遺伝子をプローブとしたコローハイブリダイゼーション またはプラークハイブリダィゼ一シヨン法 （モレキュラー ·クローニング第 2 版） により、 ライブラリーを構成する細胞の中からァラニン一パリン ' トラン スァミナーゼをコードする遺伝子を含有する細胞を選択する方法、
③染色体 DN Aの全塩基配列は公知であるが、 ァラニン一パリン ， トランスァ ミナ一ゼをコードする遺伝子が特定されていない場合には、 ェシエリヒア .コ リまたはサルモネラ 'ティフィムリゥム由来のァラニン一バリン · トランスァ ミナ一ゼ遺伝子の塩基配列と相同性の高い塩基配列を有する遺伝子を BLAST CJ. Mol. Biol., 215, 403 (1990)〕 や FASTA (Methods in Enzymology, 183, 63 (1990) 〕 等の解析ソフ トを用いて該全塩基配列中から特定し、 PCRによって目的と する遺伝子を取得する方法。
大腸菌のァラニン一パリン · トランスアミナーゼをコードする遺伝子である ά,ν t A遺伝子をクローニングする方法と'して、 具体例を以下に示す。
ェシヱリヒア属に属する微生物由来である a V t A遺伝子及び周辺の配列 〔 Genbank, Accession No. AE00434 (1998)〕 に基づいて設計 '合成できる 2種類 のプライマ一 DNA、 例えば、 配列番号 1で表される塩基配列を有する DNA および配列番号 2で表される塩基配列を有する D N Aをプライマーセットとし て用いた、 該微生物の染色体 DNAを鎵型とした PCRにより、 avt A遺伝 子及びそのプロモータ一配列を含む約 1 . 9 k bの領域を増幅する。
取得された a v t A遺伝子を、 該遺伝子を導入する微生物細胞内で自律複製 が可能なプラスミ ドベクタ一に連結し、 該組換えべクタ一を該微生物細胞に常 法により導入することで、 a v t A遺伝子をクローニングすることができる。 本発明で用いるプラスミ ドベクターはァラニン一バリン · トランスアミナー ゼをコードする遺伝子が導入される微生物細胞内で自律複製が可能なプラスミ ドであればいずれも用いることができる。 遺伝子が導入される微生物がェシェ リヒア 'コリの場合は、 ェシヱリヒア 'コリ細胞内で自律複製が可能なブラス ミ ドであればいずれも用いることができ、 例えば ZAP Express 〔Stratagene社製 、 Strategies, 5, 58 ( 1992))、 pBluescript I I SK ( + ) (Nucleic Acids Research, 17, 9494 ( 1989)〕、 人 zap I I (Stratagene社製)、 人 gtlO、人 gtll CDNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 ( 1985 )〕 、 Λ TriplEx (クロ一ンテック社製） 、 λ BlueMid (クローンテック社製）、 人 ExCell (フアルマシア社製）、 pT7T318U (フアルマシア社製） 、 pcD2 CMol . Cell. Biol . , 3, 280 ( 1983)〕 、 pUC18 〔 Gene, 33, 103 ( 1985)〕 、 pUC19 〔Gene, 33, 103 ( 1985)〕 及びこれらの誘導体 などがあげられる。
ァラニン—バリン · トランスアミナ一ゼをコ一ドする遺伝子の発現量を上昇 させる手段として、 該遺伝子が導入される微生物細胞内で機能するプロモー夕 一の下流に a V t A遺伝子を連結した D N Aを用いる方法もある。 遺伝子が導 入される微生物がェシエリヒア 'コリの場合には、 プロモー夕一としては、 該 宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。 該プロモ一夕一と しては、 例えば、 trpプロモ一夕一 （Ptrp) 、 lacプロモ一夕一、 PLプロモ一夕一、 PRプロモ一夕一、 T7プロモー夕一等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモ一 夕一をあげることができる。 また Ptrpを 2つ直列させたプロモーター （Ptrp x 2 ) 、 tacプロモー夕一、 lacT7プロモー夕一、 let Iプロモー夕一のように人為的に 設計改変されたプロモー夕一等も用いることができる。 リボゾーム結合配列であるシャイン—ダルガノ （Shine-Dalgarno) 配列と閧 始コドンとの間を適当な距離 （例えば 6〜18塩基） に調節したプラスミ ドを用 いることが好ましい。
遺伝子が導入される微生物細胞にプラスミ ドを導入する方法としては、 高電 圧の電気パルスによって細胞内に D N Aを取り込ませるエレクトロポレーショ ン法 Qiucleic Acids Res. , 16, 6127 ( 1988)〕 、 プロトプラス卜法 （特開昭 63-248394) があげられる。 ェシエリヒア ·コリにプラスミ ドを導入する場合に は、 塩化カルシウムを用いて D N Aの透過性を高める方法も利用できる （モレ キユラ一 ·クロ一ニング第 2版） 。
ァラニン一バリン · トランスアミナーゼをコ一ドする遺伝子を含むプラスミ ドが導入された微生物を選択する手段として、 プラスミ ド上に保持される薬剤 耐性遺伝子により該微生物が獲得した薬剤耐性を指標として選択するこができ る。 このようにして取得された形質転換株のァラニンーバリン ' トランスアミ ナーゼ活性、 プラスミ ドに揷入された D N A断片の制限酵素地図あるいは塩基 配列を調べることによって、 目的とする組換え微生物であることの確認を行う ことができる。
上記方法にて取得できるァラニン一パリン · トランスアミナ一ゼの活性が宿 主菌株に比べ上昇した L—ァミノ酸生産菌株を用いる L—ァミノ酸の生産は、 発酵法による L—アミノ酸の製造に用いられる通常の培養方法にて実施が可能 である。 すなわち、 炭素源、 窒素源、 無機塩、 ビタミン類、 および生育に必要 とされるその他の成分を含有する培地で、 好気的条件下、 温度、 p Hなどを適 度に調節しつつ培養を行えばよい。
炭素源としては、 グルコース、 フラクトース、 シュクロース、 ラクト一スな どの各種の炭水化物及びこれらを含有する糖蜜、 セルロース加水分解物、 粗糖 加水分解物、 デンプン加水分解物などを用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸 アンモニゥム、 リン酸アンモニゥムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニゥム 塩、 アミン類、 その他含窒素化合物、 並びにペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチープリカー、 カゼイン加水分解物、 大豆蛋白質加水分解物、 大豆粕 加水分解物、 各種発酵菌体及びその消化物などを用いることができる。
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫 酸銅、 炭酸カルシウムなどを用いる。
培養は、 振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下に行う。 培養温度 は 2 0〜4 0 °Cが好適である。 培地の p Hは 5〜9の範囲で、 好ましくは中性 付近に保持する。 培地の p H調整は、 炭酸カルシウム、 無機あるいは有機の酸、 アルカリ溶液、 アンモニア、 p H緩衝液などによって行う。 通常、 1〜7日間 の培養により、 培養液中に L一アミノ酸が生成蓄積する。
培養液からの L—アミノ酸の採取は、 イオン交換樹脂法、 濃縮法、 塩析法、 沈殿法などの公知の方法 〔化学工学会 （編） 「バイオセパレーシヨンプロセス 便覧」 、 共立出版 （ 1 9 9 6 ) 〕 を用いることにより実施することができる。 以下に、 本発明の実施例を示すが、 本発明はこれらの実施例に限定されるも のではない。
図面の簡単な説明 '
第 1図 プラスミ ド p A D 2 7の構造を示す図である。
第 1図における符号の意味は以下の通りである。
Am pr： アンピシリン耐性遺伝子
o r i ：大腸菌内で機能する複製起点
a V t A ：大腸菌由来のァラニン一バリン · トランスアミナーゼをコードする 遺伝子
発明を実施するための最良の形態
実施例 1 ェシエリヒア 'コリの a V t A遺伝子の取得 ェシエリヒア ·コリ K— 1 2株由来の W3 1 1 0株 （AT C C 2 7 3 2 5 ) を、 L B寒天平板培地 〔トリプトン ·ペプトン （D i f c o社製） 1 0 g/ L、ィ一スト 'エキストラクト 5 gZL、塩化ナトリウム 1 0 g/L、寒天 1 5 g/L、 pH 7. 5〕 に塗布し、 3 7 °Cで 24時間培養した。 培養菌体を 1 白金耳、 8mlの LB培地 〔トリプトン 'ペプトン （D i f c o社製） 1 0 g /L、 ィ一スト ·エキストラクト 5 g/L、 塩化ナトリウム 1 0 g/L、 p H 7. 5〕 に植菌し、 大型試験管 （直径 2 5mm、 長さ 200 mm) 中で 3 7 °C、 24時間、 振盪培養 （往復振盪 300 r pm) した。 この培養液 1. 2 5 mlを 2 50 mlの LB培地に移植し、 2リットル三角フラスコ中で 3 7°C、 24時間、 振盪培養 （回転振盪 20 0 r pm) した。
培養液を 4°C、 5, 00 0 r pm, 1 0分間遠心分離し、 集菌後、 菌体を T E緩衝液 〔 1 Ommo 1/L トリス （ヒロドキシメチル） ァミノメタン、 1 mmo l/L エチレンジァミン 3酢酸一 2ナトリウム、 pH 7. 5〕 にて洗 浄、 集菌し、 集菌した菌体から斉藤—三浦の方法〔Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)〕 に従って、 染色体 DN Aを単離した。
一方、 av t A遺伝子を P C R法により染色体 DN Aから増幅するために、 公知の a V t A遺伝子及びその周辺の塩基配列 〔Genbank, Accession No.
AE00434 (1998)〕 に基づいて配列番号 1および 2で表される塩基配列を有する ォリゴヌクレオチド ·プライマーを合成した。 配列番号 1で表される塩基配列 を有する DNAはプロモー夕一を含む avt A遺伝子の上流、 配列番号 2で表 される塩基配列を有する DNAは av t A遺伝子の下流に相同あるいは相補の 配列からなるプライマーである。
上記の染色体 DN A及びプライマ一セットを用いて、 P CR法により av t
A遺伝子を増幅した。 反応条件は 94 °Cで 1分間、 5 5 で 2分間、 72 で 2分間で 1サイクルとする反応を 3 0回繰り返した。
P CRにより増幅した 1. 9 kbの DNA断片を T 4DNAポリメラ一ゼで 平滑末端化した後、 制限酵素 E c oR Iと P s t Iで切断した後 T 4 D N Aポ リメラーゼで平滑末端化したプラスミ ドベクター pUC 19に T 4DNAリガ ーゼを用いて連結した。 この反応物を用いて、 エレクト口ポレーシヨン法によ りェシエリヒア ·コリ H— 8719株を形質転換した。 この菌液をアンピシリ ン 10 Omg/Lを含む LB寒天平板培地に塗布し、 37°Cで 24時間培養し た。 寒天平板培地上に生育したコロニーを選択し、 これらの形質転換株の保持 するプラスミ ドの挿入 DN A断片を各種制限酵素を用いて解析した結果、 挿入 DN A断片上には a vt A遺伝子が存在することを構造的に確認した。
これらの形質転換株について、 さらにァラニン一パリン ' トランスアミナー ゼ活性を、 以下のようにして測定した。 LB培地にて 30°C、 24時間、 振盪 培養 （往復振盪 300 r pm) した培養菌体を塩化ナトリウム 8. 5 g/L水 溶液で 2回、 緩衝液 A (25mmo 1/Lリン酸カリウム緩衝液、 pH7. 0、 グリセリン 50ml/L、 エチレンジァミン 4酢酸一 3ナトリウム 0. 1mm o l/L、 ジチオトレイ 卜一ル 0. 2mmo l/L、 ピリ ドキサルリン酸 0. 2mmo 1/L) で 1回、 懸濁—遠心分離により洗浄した後、 同緩衝液に湿菌 体重量 100 g/Lになるように再懸濁した。 該懸濁菌体を超音波処理にて破 砕した後、 遠心分離により粗酵素液を調製した。 この粗酵素液 20〃1を緩衝 液 A中に 1 Ommo 1/Lのピルビン酸と 1 Ommo 1/Lの L—バリンを含 む反応液 980〃 1に添カ卩して 37°Cにて 30分間反応し、 生成した L—ァラ ニンを高速液体クロマトグラフィー法 （HPLC法） により定量してァラニン ーノ リン · トランスアミナーゼ活性を求めた。 HP L C法の条件は以下の通り である。
カラム ： YMC ODS—AQ312カラム
移動相： 2. 94 g/1 クェン酸三ナトリウム、 1. 42g/l 硫酸ナト リウム、 63ml/l n—プロパノール、 3 g/1 ドデシル硫酸ナトリウ ム、 pH3. 75 (2 mo 1/L 硫酸にて調整） 移動相流速： 2 ml/分
反応液： 18. 5 g/1 ホウ酸、 水酸化ナトリウム、 3ml/ 1 Br ig— 35、 0. 6 g/1 o—フ夕ルアルデヒド、 2 m 1/1 メ ルカプトエタノール
反応液流速： 1ml 分
蛍光検出：励起波長 345 nm、 検出波長 455 nm その結果、 ェシエリヒア 'コリ H— 8719のァラニン一バリン ' トランス ァミナーゼ活性を 1としたときの形質転換株の同活性は 10倍以上に高まつて いた。 このようにして得たプラスミ ドを pAD 27と命名した （第 1図） 。 以上のようにして取得した組換え体ェシエリヒア 'コリ H— 8719 /p A D27は、 ブタペスト条約に基づいて、 平成 12年 3月 2日付けで経済産業省 産業技術総合研究所 生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つくば巿東 1丁 目 1番 3号 郵便番号 305— 0046) に受託番号 FERM BP- 706 3として寄託されている。
ェシエリヒア 'コリ H— 8719/p AD 27の培養菌体からプラスミ ド p AD 27を調製し、 このプラスミ ドを用いてエレク卜ロボレ一シヨン法により L一イソロイシン生産性を有するェシエリヒア 'コリ H— 9156を形質転換 した。
前記と同様にしてアンピシリンに耐性となつた形質転換株を選択することに より、 pAD27を有する組換え体ェシエリヒア 'コリ H— 9156/pAD 27を取得した。 このようにして得た形質転換株のァラニン一パリン ' トラン スァミナ一ゼ活性を上記と同様な方法で測定した。 その結果、 ェシヱリヒア ' コリ H— 9156のァラニン一バリン · トランスアミナ一ゼ活性を 1としたと きの形質転換株の同活性は 10倍以上に高まっていた。
実施例 2 L一口イシンの生産試験 ェシエリヒア 'コリ H— 8719、 a v t A遺伝子を含むプラスミ ド p AD 27を保持する H— 8719/pAD 27、 およびプラスミ ドベクタ一 pUC 19を保持する H— 8719/pUC 19について、 L—ロイシンの生産試験 を下記のように行った。
H— 8719/pAD27と H— 8719/pUC 19をアンピシリン 10 Omg/Lを含む LB寒天平板培地に、 H— 8719をアンピシリンを含まな い LB寒天平板培地にそれぞれ塗布し、 30°Cで 24時間培養した。 培養菌体 を 1白金耳、 6mlのシード培地 （グルコース 20g/L、 ペプトン 10 g/L、 ィ一スト ·エキストラクト 10 g/L、 塩化ナトリウム 2. 5 g /L、 炭酸カルシウム 10g/L、 pH7. 4) に植菌し、 大型試験管 （直 径 25 mm、 長さ 200 mm) 中で 30 ° 17時間、 振盪培養 （往復振盪 3 00 r pm) した。 この培養液 0. 1 m 1を 6 m 1の生産培地（グルコース 6 5 g/L、 コーンスティ一プリカ一 2 g/L、 硫酸アンモニゥム 16g/ L、 リン酸第一カリウム 2g/L、 リン酸マグネシウム 40 g/L、 炭酸 カルシウム 10g/L、 pH7. 0) に移植し、 大型試験管 （直径 25mm、 長さ 200 mm) 中で 30 ° (、 48時間、 振盪培養 （往復振盪 300 r p m) した。
培養後、 培養液中に生成蓄積した L _ロイシンおよび副生した L—パリンの 量を、 HPLC法 （上記実施例 1に記載した L—ァラニンの測定方法と同じ） により定量した。
上記の培養試験を独立に 20回実施し、 得られた結果の平均値を第 1表に示 した。 第 1表
菌株 Leu [g/1] Val [g/i] Val 1 Leu [%]
H-8719 12.1 0. 17 1.40
H-8719/pUC19 12.4 0. 18 1.44
H-8719 /pAD27 12.6 0. 08 0.65
(数値は n = 20の平均値）
3菌株ともに同等の L—口イシンの生成蓄積が認められた。 副生した L—ノ リンの L一口イシンに対する比率は、 a V t A遺伝子の発現が上昇した H— 8 7 1 9/pAD 2 7では宿主の H— 8 7 1 9よりも再現性よく低下しており、 その低下率は約 54%であった。
以上の結果は、 L—口イシン生産菌株の a V t A遺伝子にコードされるァラ ニン一バリン ' トランスアミナーゼの活性を上昇させることにより、 L—ロイ シンの発酵生産において精製上問題となる L—バリンの副生量を有意に低減す ることができることを示している。
実施例 3 L—イソロイシンの生産試験
ェシエリヒア ·コリ H— 9 1 56、 a V t A遺伝子を含 ¾プラスミ ド pAD 2 7を保持する H— 9 1 5 6/pAD 2 7、 およびプラスミ ドベクタ一 pUC 1 9を保持する H— 9 1 5 6/pUC 1 9について、 L—イソロイシンの生産 試験を下記のように行った。
H_ 9 1 5 6/pAD 2 7と H— 9 1 5 6/pUC 1 9をアンピシリン 1 0 Omg/Lを含む LB寒天平板培地に、 H— 9 1 5 6をアンピシリンを含まな い L B寒天平板培地にそれぞれ塗布し、 30 °Cで 24時間培養した。 培養菌体 を 1白金耳、 6mlのシード培地 （グルコース 2 0 g/L、 ペプトン 1 0 g/L、 イースト 'エキストラクト 1 0 g/L、 塩化ナトリウム 2. 5 g /L、 炭酸カルシウム 10g/L、 pH7. 4) に植菌し、 大型試験管 （直 径 25mm、 長さ 200 mm) 中で 30°C、 17時間、 振盪培養 （往復振盪 3 00 r pm) した。 この培養液 0. 1 m 1を 6 m 1の生産培地（グルコース 6 5g/L、 コーンスチープリカー 2 g/L、 硫酸アンモニゥム 16g/L、 リン酸第一カリウム 2g/L、 DL—メチォニン 0. 1 gZL、 リン酸マ グネシゥム 40 g/L、 炭酸カルシウム 10 g/L、 pH 7. 0) に移植 し、 大型試験管 （直径 25mm、 長さ 200 mm) 中で 30°C、 48時間、 振 盪培養 （往復振盪 300 r pm) した。
培養後、 培養液中に生成蓄積した L—イソロイシンおよび副生した L—バリ ンの量を、 高速液体クロマトグラフィー法により定量した。 測定条件は上記実 施例 2に記載した通りである。
上記の培養試験を独立に 20回実施し、 得られた結果の平均値を第 2表に示 した。 °
第 2表 菌株 He [g/1] Val [g/1] Val/Ile[%]
H-9156 13.4 3.6 26.6
H-9156/pUC19 13.4 3.4 25.7
H-9156 /pAD27 13.0 1.8 13.9
(数 は 11=20の平均^
3菌株ともに同等の L—イソ口イシンの生成蓄積が認められた。 副生した L —ノ リンの L—イソロイシンに対する比率は、 a V t A遺伝子の発現が上昇し た H— 9156/pAD 27では宿主の H— 9156よりも再現性よく低下し ており、 その低下率は約 48%であった。
以上の結果は、 L—ィソロイシン生産菌株の a V t A遺伝子にコ一ドされる ァラニン一パリン · トランスアミナ一ゼの活性を上昇させることにより、 L— イソロイシンの発酵生産において精製上問題となる L一バリンの副生量を有意 に低減することができることを示している。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 ァラニン一バリン ' トランスアミナ一ゼ （トランスァミナ —ゼ C ) の活性が上昇した微生物であり、 かつ L—アミノ酸生産能を有する微 生物を用いた、 L—アミノ酸の発酵生産において精製上問題となる副生ァミノ 酸を低減することができ、 ；工業的に有利な L—ァミノ酸の製造法を提供するこ とができる。
「配列フリーテキスト」
配列番号 1一人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 2—人工配列の説明：合成 D N A

Claims

請求の範囲
1. ァラニン一バリン · トランスアミナーゼ活性が親株より上昇した微生物で あり、 かつ L一アミノ酸生産能を有する微生物を培地中に培養し、 培養液中に L—アミノ酸を生成蓄積させ、 該 L—アミノ酸を採取することを特徴とする L 一アミノ酸の製造法。
2. 微生物が、 変異株、 細胞融合株、 形質導入株および組換え DNA技術を用 いて造成した組換え株からなる群から選ばれる微生物である、 請求項 1に記載 の L—アミノ酸の製造法。
3. 微生物が、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 コリネバクテリゥム属およびァ ースロバクター属からなる群から選ばれる微生物である、 請求項 1または 2に 記載の L—アミノ酸の製造法。
4. 微生物が、 ェシエリヒア 'コリ H— 8719/pAD 27 (FERM B P- 7063) またはェシエリヒア 'コリ H— 9 156/pAD 27である請 求項 1〜 3に記載の Lーァミノ酸の'製造法。
5. L—アミノ酸が、 L—ロイシンおよび L—イソロイシンからなる群から選 ばれるァミノ酸である請求項 1に記載の L—ァミノ酸の製造法。
6. 微生物のァラニン—パリン ' トランスアミナ一ゼの活性を上昇させる手段 が、 微生物細胞内のァラニン—パリン ' トランスアミナーゼ遺伝子の発現量を 上昇させるものである請求項 1に記載の L—アミノ酸の製造法。
7. 微生物のァラニン—バリン ' トランスアミナーゼの活性を上昇させる手段 が、 微生物細胞内のァラニン—パリン ' トランスアミナーゼ遺伝子のコピー数 を上昇させるものである請求項 1に記載の L—ァミノ酸の製造法。
8. ァラニン—バリン ' トランスアミナーゼ活性が親株より上昇した微生物で あり、 かつ L一アミノ酸の生産能を有する微生物。
9. 微生物が、 変異株、 細胞融合株、 形質導入株および組換え DN A技術を用 いて造成した組換え株からなる群から選ばれる微生物である、 請求項 8に記載 の微生物。
10. 微生物が、 ェシヱリヒア属、 セラチア属、 コリネパクテリゥム属または アースロバクタ一属からなる群から選ばれる微生物である、 請求項 8または 9 に記載の微生物。
11. 微生物が、 ェシエリヒア 'コリ H— 8719/pAD 27 (FERM B P- 7063) またはェシェリヒア 'コリ H— 9 156/ AD 27である請 求項 8〜 10のいずれか 1項に記載の微生物。
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