KR100869687B1 - 발효법에 의한 ｌ-아미노산의 제조방법 - Google Patents

발효법에 의한 ｌ-아미노산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

알라닌-발린 트랜스아미나아제 (트랜스아미나아제 C) 를 코딩하는 avtA 유전자를 보유하고, 이의 모 균주와 비교하여 상기 효소의 상승된 활성을 갖는 L-아미노산을 생산하는 능력을 가진 미생물을 이용하여, 발효법을 통해 생산된 L-아미노산의 정제시 문제를 야기하는 부산물 아미노산의 양을 감소시키는 발효법을 통한 산업적으로 유리한 L-아미노산 생산방법.

Description

발효법에 의한 Ｌ-아미노산의 제조방법{PROCESS FOR PRODUCING L-AMINO ACID VIA FERMENTATION METHOD}
본 발명은 발효법에 의한 L-아미노산의 제조방법에 관한 것이다. L-루이신 및 L-이소루이신과 같은 분지쇄 아미노산은 식품, 사료첨가물, 의약품 및 농약의 합성원료 등에 사용된다.
직접 발효법에 의한 L-아미노산의 제조법으로서, 에쉐리히아 (Escherichia), 세라티아 (Serratia), 코리네박테리윰 (Corynebacterium) 또는 아르트로박터 (Arthrobacter)속에 속하는 미생물을 이용하여 L-루이신을 제조하는 일부의 방법이 공지되어 있다. 에쉐리히아속에 속하는 미생물을 이용한 L-루이신의 공지된 제조방법에는 하기의 것들이 포함된다 : β-2-티에닐알라닌에 내성인 미생물을 이용한 방법 (일본공개특허출원 No. 72695/81); L-에티오닌에 내성인 미생물을 이용한 방법(일본공개특허출원 No. 55194/84); 2-케토부티르산에 내성인 미생물을 이용한 방법 (일본공개특허출원 No. 9982/96); 및 4-아자루이신 또는 5,5,5-트리플루오로루이신에 내성인 미생물을 이용한 방법 (일본공개특허출원 No.70879/96).
마찬가지로, 에쉐리히아, 세라티아, 코리네박테리윰 또는 아르트로박터속에 속하는 미생물을 이용한 L-이소루이신의 공지된 제조방법이 있다. 에쉐리히아 속 에 속하는 미생물을 이용한 L-이소루이신의 공지의 제조방법에는 하기의 것들이 포함된다 : 티아이소루이신, 이소루이신 히드록사메이트, 아르기닌 히드록사메이트, DL-에티오닌, 등에 내성인 미생물을 이용한 방법 (일본공개특허출원 No. 130882/93); 2-케토부티르산에 내성인 미생물을 이용한 방법 (일본공개특허출원 No. 9982/96); 및 유일의 질소원으로 L-호모세린을 함유하는 배지에서 속성으로 자라는 미생물을 이용한 방법 (일본공개특허출원 No. 322583/96).
그러나, 이러한 방법들은 목적하는 L-아미노산 외의 L-아미노산이 부산물로서 상당량 형성되는 문제점이 있다. 특히, L­루이신 또는 L-이소루이신의 제조방법에서 L-발린의 형성은 제조원가의 상승을 초래하거나, 정제 공정에서의 L-발린의 분리 및 제거가 용이하지 않기 때문에 정제수율 및 제품순도의 저하를 유발한다.
알라닌-발린 트랜스아미나아제 (트랜스아미나아제 C)는 하기에 나타낸 바와 같이 L-알라닌과 피루브산 및 2-옥소이소발레르산과 L-발린 사이의 가역적 공역 아미노기전이반응을 촉진하는 효소이다.
L-알라닌 + 2-옥소이소발레르산 ↔피루브산 + L-발린
상기 효소는 또한 하기에 나타낸 바와 같이 L-알라닌과 피루브산 및 2-옥소부티르산과 2-아미노부티르산 사이의 가역적 공역 아미노기전이반응을 촉진하는 것으로 공지되어 있다.
L-알라닌 + 2-옥소부티르산 ↔피루브산 + 2-아미노부티르산
알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자는 에쉐리히아 콜리 ( Escherichia coli) 및 살모넬라 티피무리윰 (Salmonella typhimurium)과 같은 미생물에서 발견된다. 에쉐리히아 콜리로부터 유래된 알라닌-발린 트랜스아미나아제에 있어서는, 효소를 코딩하는 유전자 (avtA)의 클로닝 및 이 유전자의 염기 서열에 대하여 보고되어 있다 [J.Bacteriol., 169, 4228 (1987); Gene, 65, 195 (1988); Science, 277, 1453 (1997); Genbank, Accession No. AE00434 (1998)]. 또한 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성은 avtA 유전자의 증폭에 의해서 상승됨이 보고되었다 [J. Bacteriol., 169, 5610 (1987)].
알라닌-발린 트랜스아미나아제의 생리적 역활에 대하여 하기와 같이 보고되어 있다.
분지쇄 아미노산 트랜스아미나아제(트랜스아미나아제 B)를 코딩하는 ilvE 가 결핍된 에쉐리히아 콜리는 L-이소루이신에 대하여 완전한 요구성을 나타내나, L-발린에 대해서는 완전한 요구성을 보이지 않으며 (리키성 (the leaky phenotype)), 이는 알라닌-발린 트랜스아미나아제는 분지쇄 아미노산 트랜스아미나아제를 대신하는 제 2 트랜스아미나아제로서 2-옥소이소부티르산의 L-발린으로의 전환에 관여함을 나타낸다. [Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1987)]. 또한 상기의 변이주의 L-발린에 대한 부분적 요구성 (리키성)은 avtA 유전자를 증폭시킴으로써 회복된다 [Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1987)].
그러나, L-발린의 형성은 알라닌-발린 트랜스아미나아제의 활성을 상승시킴 으로서 감소시킬 수 있음은 보고되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 부산물로서 기타 아미노산의 형성을 감소시켜 L-아미노산을 효율적이고 산업적으로 유리한 발효법을 제공하는 것이다.
본 발명자는 발효법에 의한 L-아미노산의 제조시 부산물로서 목적하지 않는 아미노산의 형성을 감소시킬 목적으로 예의 연구하였다. 그 결과, 본 발명자는 목적하지 않는 아미노산의 형성은 목적하는 L-아미노산을 생산하는 균주의 알라닌-발린 트랜스아미나아제의 활성을 상승시킴으로써 감소시킬 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 하기의 (1) 내지 (11)에 관한 것이다.
(1) 모 균주와 비교하여 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성이 상승된, L-아미노산을 생산하는 능력을 가진 미생물을 배지에서 배양하고, L-아미노산을 배양액내 형성 및 축적시켜, 배양액으로부터 L-아미노산을 회수하는 L-아미노산의 제조방법.
(2) 미생물은 변이주, 세포융합주, 형질도입주 및 재조합 DNA 기술에 의해 구축된 재조합주로 이루어진 군으로부터 선택되는, (1) 에 기재된 방법.
(3) 미생물은 에쉐리히아, 세라티아, 코리네박테리윰 및 아르트로박터 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는, (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.
(4) 미생물이 에쉐리히아 콜리 H-8719/pAD27 (FERM BP-7063) 또는 에쉐리히아 콜리 H-9156/pAD27 인, (1) 내지 (3)에 기재된 방법.
(5) L-아미노산은 L-루이신 및 L-이소루이신으로 이루어진 군으로 부터 선택되는, (1) 에 기재된 방법.
(6) 미생물의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성은 미생물의 세포내 알라닌-발린 트랜스아미나아제의 발현수준을 증가시킴으로써 상승시키는, (1) 에 기재된 방법.
(7) 미생물의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성은 미생물의 세포내 알라닌-발린 트랜스아미나아제 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 상승시키는, (1)에 기재된 방법.
(8) 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성이 모 균주와 비교하여 상승된 L-아미노산의 생산 능력을 가진 미생물.
(9) 변이주, 세포융합주, 형질도입주 및 재조합 DNA 기술에 의해 구축된 재조합주로 이루어진 군으로부터 선택되는, (8) 에 기재된 미생물.
(10) 에쉐리히아, 세라티아, 코리네박테리윰 및 아르트로박터 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는, (8) 또는 (9) 에 기재된 미생물.
(11) 에쉐리히아 콜리 H-8719/pAD27 (FERM BP-7063) 또는 에쉐리히아 콜리 H-9156/pAD27 인, (8) 내지 (10)에 기재된 미생물.
본 발명은 이하에 상술한다.
본 발명에 있어서, 모 균주와 비교하여 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성이 상승되고, L-아미노산의 생산 능력은 갖는 것이면 어느 미생물도 사용할 수 있다. 여기에서 사용하는 "모 균주"라는 용어는 변이주, 세포융합주, 형질도입주 및 재조합주를 구축하기 위한 출발 미생물로서 사용되는 미생물을 의미한다. 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성이 이의 모 균주와 비교하여 상승된 미생물은 변이주, 세포융합주, 형질도입주 및 재조합주중 임의의 것일 수 있다. 이러한 미생물의 예에는 에쉐리히아, 세라티아, 코리네박테리윰 및 아르트로박터 속에 속하는 미생물로부터 선택된 것들이 포함된다. 바람직한 예는 아미노산 발효에 사용되는, 코리네박테리윰 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리윰 락토퍼멘툼(Corynebacterium lactofermentum)과 같은 소위 코리네펌 글루탐산 생산주 및 에쉐리히아 콜리이다.
모 균주의 특별한 예는 L-루이신의 생산 능력을 갖춘 에쉐리히아 콜리 H-8719 (FERM BP­4704 주로부터 유도된 4-아자루이신에 내성인 L-루이신생산주) 및 L-이소루이신의 생산 능력을 갖춘 에쉐리히아 콜리 H-9156 (FERM BP-5056) 이다.
이러한 미생물의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성은, 예컨대, 하기의 방법에 의해서 상승될 수 있다.
I. 알라닌-발린 트랜스아미나아제 유전자를 보유하는 미생물을 뮤타젠으로 처리하여 수득한 미생물로부터 상승된 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성을 갖는 변이주를 선택하는 방법.
II. 돌연변이를 실험관에서 알라닌-발린 트랜스아미나아제 유전자에 도입하고, 돌연변이 도입전보다 활성이 더 높은 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자를 돌연변이된 유전자로부터 선택하고, 선택된 상기 유전자를 숙주 미생물로 도입하는 방법.
III. 세포내에서 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 카피수를 증가시키는 방법.
IV. 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현에 관여하는 영역을 시험관에서 개변시켜 유전자의 발현수준을 증가시키고, 개변된 유전자를 숙주 염색체의 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자와 치환하는 방법.
상승된 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성을 갖는 변이주는 알라닌-발린 트랜스아미나아제 유전자를 보유한 미생물을 뮤타젠으로 처리하여 수득한 미생물로부터 선택하는 상기 방법은, 예컨대, 하기의 방식으로 수행할 수 있다. 알라닌-발린 트랜스아미나아제 유전자를 보유한 미생물은 N-메틸-N’-니트로-N-니트로소구아니딘과 같은 뮤타젠을 이용한 공지의 방법으로 돌연변이시키고, 돌연변이를 거친 모 균주와 비교하여 상승된 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성을 가진 미생물을 뮤타젠처리된 미생물로부터 선택한다. 미생물의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성은, 예컨대, 적당한 배지에 상기 미생물을 배양하고, 배양된 세포를 원심분리시키고, 수득된 세포를 공지의 방법에 따라 파쇄하여 조 효소 용액을 제조하고, 조효소 용액 및, 기질로서, L-알라닌 또는 피루브산 및 L-발린을 이용하여 효소반응을 수행하고, 효소 반응으로 형성된 L-발린 또는 L-알라닌의 양을 측정하여 구할 수 있다.
돌연변이를 시험관에서 알라닌-발린 트랜스아미나아제 유전자에 도입하고, 활성이 돌연변이 도입 전보다 높은 알라닌-발린 트랜스아미나아제 유전자를 코딩하는 유전자를 돌연변이된 유전자로부터 선택하는 방법의 예에는 하기의 것들이 포함된다 :
1) 염기의 결실, 치환 또는 부가를 부위-특이적 돌연변이로 알라닌-발린 트랜스아미나아제 유전자에 도입하여 [Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sd., USA, 79, 6409 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5662 (1984); Science, 224, 1431 (1984); PCT WO85/00817 (1985); Nature, 316, 601 (1985); Gene, 34, 315 (1985); Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)] 돌연변이전 보다 활성이 높은 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자를 수득하는 방법.
2) 염기 치환과 같은 돌연변이를 무작위로 에러-프론(error-prone) 폴리머라아제 연쇄 반응 [Bio/Technol., 9, 1073 (1991) (이후, 폴리머라아제 연쇄반응을 PCR 로 칭함)]으로 알라닌-발린 트랜스아미나아제 유전자에 도입하고, 활성이 돌연변이전 보다 높은 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자를 돌연변이된 유전자로부터 선택하는 방법.
알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 카피수는, 예컨대, 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자를 클로닝한 후,
1) 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 목적한 미생물의 세포에서 자율복제가능한 플라스미드 벡터에 연결시키고, 생성된 플라스미드를 미생물에 도입하거나; 또는
2) 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA 를 상동재조합법으로 또는 파아지 또는 트랜스포존을 이용하여 숙주로 사용할 균주의 염색체에 통합시켜 증가시킬 수 있다.
알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현에 관여하는 영역을 시험관에서 개변시켜 유전자의 발현수준을 증가시키고, 개변된 유전자를 숙주 염색체의 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자와 치환하는 방법의 예에는 하기의 것들이 포함된다 :
1) 유전자의 발현에 관여하는 영역을 유전자의 도입 및 발현용 숙주로서 사용할 미생물에서 강력한 프로모터 활성을 가진 공지의 프로모터로 치환시키는 방법 ; 및
2) 염기의 결실, 치환 또는 부가를 전술한 부위-특이적 돌연변이 또는 에러-프론 PCR 로 유전자의 발현에 관여하는 염기서열을 갖는 DNA 에 도입하고, 돌연변이전과 비교하여 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현수준을 증가시키는 DNA 를 돌연변이된 DNA 로부터 선택하는 방법.
본 발명에서 유용한 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자는 임의 세포, 바람직하게는 미생물, 좀더 바람직하게는 에쉐리히아 또는 살모넬라속에 속하는 미생물로부터 유래할 수 있다.
알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자는 예컨대 하기의 방법으로 수득할 수 있다.
I. 에쉐리히아 콜리 또는 살모넬라 티피무리윰의 경우에서와 같이, 미생물의 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 염기 서열이 공지되어 있는 경우, 유전자는 주형으로 미생물의 염색체 DNA 를 이용하여 염기서열에 기초한 PCR 로 수득할 수 있다 [PCR Protocols, Academic Press (1990)].
II. 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성을 갖는 세포의 알라닌-발린 트랜 스아미나아제를 코딩하는 유전자의 염기서열이 공지되어 있지 않는 경우에는, 상기 세포로부터 유래된 염색체 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리는 통상의 방법에 따라 제조하고 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (이후, Molecular Cloning, 2nd ed.로 축약)], 이어서,
1) 라이브러리를 구성하는 각각의 세포의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성을 측정하고, 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 세포를 상기의 세포로부터 선택하거나,
2) 프로브로서 에쉐리히아 콜리 또는 살모넬라 티피무리윰의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 유전자를 이용하여 콜로니 하이브리다이제이션 또는 플라크 하이브리다이제이션 (Molecular Cloning, 2nd ed.) 으로 라이브러리를 구성하는 세포로부터 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 세포를 선택한다.
III. 염색체 DNA 의 완전한 염기서열이 공지되어 있으나 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자가 특정되어 있지 않는 경우, 에쉐리히아 콜리 또는 살모넬라 티피무리윰으로부터 유래된 알라닌-발린 트랜스아미나아제 유전자의 염기서열에 상당히 상동적인 염기 서열을 갖는 유전자는 BLAST [J. Mel. Bid., 215, 403 (1990)] 또는 FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)] 와 같은 분석 소프트웨어를 사용하여 상기의 완전한 염기서열에서 특정하고, 목적하는 유전자를 PCR 로 수득한다.
에쉐리히아 콜리의 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자인 avtA 유전자의 클로닝은, 예컨대, 하기의 방식으로 수행할 수 있다.
처음에, avtA 유전자 및 이의 프로모터 서열을 포함하는 영역 (약 1.9 kb) 은 프라이머 세트로서, 에쉐리히아 속에 속하는 미생물로부터 유래된 avtA 유전자의 서열 및 이의 이웃 서열에 기초하여 디자인 및 합성된 두 종류의 프라이머 DNA [Genbank, Accession No. AE00434 (1998)], 예컨대, 각각 SEQ ID NO: 1 및 2 에 나타낸 염기서열을 갖는 DNA를 이용하고, 주형으로서 미생물의 염색체 DNA 를 이용하여 PCR 로 증폭시킨다.
수득된 avtA 유전자는 유전자가 도입된 미생물의 세포에서 자율복제가능한 플라스미드 벡터에 연결시키고, 재조합 벡터는 통상의 방법으로 미생물의 세포에 도입시켜, avtA 유전자를 클로닝시킬 수 있다.
알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물의 세포에서 자율복제가능한 임의의 플라스미드는 본 발명에서 플라스미드 벡터로서 사용할 수 있다. 상기 유전자가 도입된 미생물이 에쉐리히아 콜리인 경우, 에쉐리히아 콜리의 세포에서 자율복제가능한 임의의 플라스미드를 사용할 수 있다. 적합한 플라스미드에는 ZAP Express [Stratagene; Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], λzap II (Stratagene), λgtlO, λgt11 [DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)], λTriplEx (Clontech Laboratories,Inc.), λBlueMid (Clontech Laboratories, Inc.), λExCe11 (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)], pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)], pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)] 및 이의 유도체가 포함된다.
상기 유전자가 도입된 미생물의 세포내에서 기능하는 프로모터의 하류위치에 avtA 유전자를 연결시켜 제조한 DNA 를 이용하여 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현수준을 증가시키는 것이 가능하다. 상기 유전자가 도입된미생물이 에쉐리히아 콜리인 경우, 숙주 세포에서 기능할 수 있는 임의의 프로모터를 사용할 수 있다. 적합한 프로모터에는 trp 프로모터 (Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 및 T7 프로모터와 같은 에쉐리히아 콜리, 파아지 등으로부터 유래된 것들이 포함된다. 두 개의 Ptrp이 앞 뒤로 일렬로 결합된 프로모터 (Ptrp x 2), tac 프로모터, lacT7 프로모터 및 letI 프로모터와 같은 인공적으로 디자인 및 개변된 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
샤인-달가노(Shine-Dalgarno)서열 (리보좀 결합 서열) 및 개시 코돈사이의 거리가 적당한 길이 (예, 6 - 18 염기)로 조정된 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
플라스미드를 상기 유전자가 도입된 미생물의 세포로 도입시키는 방법의 예에는 고압의 전기펄스를 가하여 세포로의 DNA 의 혼입을 유발하는 일렉트로포레이숀법 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] 및 프로토플라스트법 (일본공개특허출원 No. 248394/88)이 포함된다. 플라스미드를 에쉐리히아 콜리 세포로 도입하는 경우, DNA 의 투과성을 염화칼슘을 이용하여 증가시키는 방법이 또한 유용할 수 있다 (Molecular Cloning, 2nd ed.).
알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 도입된 플라스미드를 보유한 미생물은 인디케이터로서 플라스미드에 대한 약제내성유전자로 획득된 미생물의 약제내성을 이용하여 선택할 수 있다. 이렇게 수득한 형질전환체는 이의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성, 플라스미드로 삽입된 DNA 단편의 제한효소맵 또는 이의 염기서열을 조사하여 목적하는 재조합 미생물임을 동정할 수 있다.
숙주 균주와 비교하여 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성이 상승된 상기에서 수득된 L-아미노산 생산 균주를 이용한 L-아미노산의 생산은 발효법으로 L-아미노산을 제조하기 위해 사용하는 통상의 배양법으로 수행할 수 있다. 즉, 배양은 탄소원, 질소원, 무기염, 비타민 및 균주의 성장에 필요한 기타 성분을 함유하는 배지에서 호기조건하 적절히 조정된 온도 및 pH 에서 수행한다.
탄소원의 예에는 글리코오스, 프룩토오스, 수크로오스 및 락토오스와 같은 다양한 탄수화물, 이들을 함유하는 당밀, 셀루로오스 가수분해물, 조 당가수분해물 및 전분 가수분해물이 포함된다.
질소원의 예에는 암모니아, 다양한 무기 또는 유기 산의 암모늄 염, 예컨대, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄 및 인산암모늄, 아민류 및 기타 질소함유 화합물, 펩톤, 육즙, 효모 추출물, 콘스팁 리퀴어, 카제인 가수분해물, 대두단백질 가수분해물, 대두 케이크 가수분해물 및 다양한 발효 미생물 세포 및 이의 소화물이 포함된다.
무기염의 예에는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리 및 탄산칼슘이 포함된다.
배양은 호기의 조건하, 예컨대 진탕배양 또는 통기교반배양하여 수행한다. 배양온도는 바람직하게는 20 내지 40℃ 이다. 배지의 pH 범위는 5 내지 9 이고, 바람직하게는 중성부위에서 유지시킨다. pH 조정은 탄산칼슘, 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 암모니아, pH 버퍼 등을 이용하여 수행한다. L-아미노산은 통상 1 내지 7 일간 배양하여 배양액 내에 형성 및 축적시킨다.
L-아미노산은 이온교환수지법, 농축법, 염석법 및 침전법과 같은 공지의 방법으로 배양액으로부터 회수할 수 있다 [The Society of Chemical Engineers, Japan (ed.), Handbook of Bioseparation Process, Kyoritsu Shuppan (1996)].
본 발명의 예는 하기에 나타내었다, 이러한 예는 본 발명의 범위를 제한 하는 것은 아니다.
도 1 은 플라스미드 pAD27 의 구조를 보여준다.
도 1 에서 사용된 기호는 하기와 같다.
Ampr: 암피실린내성유전자
ori: 에쉐리히아 콜리에서 기능하는 복제 오리진
avtA: 에쉐리히아 콜리에서 유래된 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자
실시예
실시예 1 에쉐리히아 콜리의 avtA 유전자의 클로닝
에쉐리히아 콜리 K-12 로부터 유래된 W3110 균주(ATCC 27325)를 LB 아가평판배지 [10 g/l 트립톤 펩톤 (Difco Laboratories Inc.), 5 g/l 효소 추출물, 10 g/l 염화나트륨 및 15 g/l 아가, pH 7.5]에 도포한 후, 37℃ 에서 24 시간동안 배양하였다. 1 백금이의 배양된 세포를 8 ml 의 LB 배지 [10 g/l 트립톤 펩톤 (Difco Laboratories Inc.), 5 g/l 효소 추출물 및 10 g/l 염화 나트륨, pH 7.5] 에 접종시키고, 이어서 대형시험관 (직경: 25 mm, 길이: 200 mm)중에서, 37℃, 24 시간동안 진탕배양 (왕복진탕: 300 rpm) 시켰다. 생성된 배양액 (1.25 ml) 를 250 ml 의 LB 배지에 옮겨 2-L 삼각 플라스크중에서, 37℃, 24 시간동안 진탕배양 (회전 진탕: 200 rpm)시켰다.
수득된 배양액을 5,000 rpm 으로 4℃에서 10 분간 윈심분리시키고, 세포를 수거하였다. 수득된 세포를 TE 버퍼 [10 mmol/l 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 1 mmol/l 디소듐 에틸렌디아민트리아세테이트, pH 7.5]로 세정한 후 수거하였다. 염색체 DNA 를 Saito-Miura 법 [Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)] 에 따라 수거된 세포로부터 단리시켰다.
주형으로 염색체 DNA 를 이용하여 PCR 로 avtA 유전자를 증폭시키기 위하여, 각각 SEQ ID NO: 1 및 2 에 나타낸 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 공지의 avtA 유전자 및 이의 주변의 염기서열 [Genbank, Accession No. AE00434 (1998)]을 기초로 하여 합성하였다. SEQ ID NO : 1 및 2 에 나타낸 염기서열을 갖는 DNA 는 각각 프로모터를 포함하는 avtA 유전자의 상류 서열 및 avtA 유전자의 하류 서열에 상동이거나 상보적인 서열을 포함하는 프라이머이다.
전술한 염색체 DNA 및 프라이머 세트를 이용한 PCR 로 avtA 유전자를 증폭시켰다. PCR 은 94℃ 에서 1 분, 55℃ 에서 2 분 및 72℃ 에서 2 분간 반응을 수행하는 것을 1 주기로 하여 30 회 반복하여 수행하였다.
PCR 로 증폭된 DNA 단편 (1.9 kb) 를 T4 DNA 폴리머라아제로 평활말단화시킨후, 제한 효소 EcoRI 및 PstI 로 절단된 플라스미드 벡터 pUC19 에 연결시키고, T4 DNA 리가아제를 이용하여 T4 DNA 폴리머라아제로 평활말단화시켰다. 이 반응 생성물을 일렉트로포레이숀법으로 에쉐리히아 콜리 H-8719 의 형질전환에 이용하였다. 생성된 세포 현탁액을 100 mg/l 암피실린이 함유된 LB 아가 평판배지상에 도포한 후, 37℃ 에서 24 시간동안 배양시켰다. 아가 평판배지상에서 성장하는 콜로니를 선별하고, 상기 형질전환체에 의해서 운반되는 플라스미드에 삽입된 DNA 단편의 구조를 다양한 제한효소로 분석하여, avtA 유전자가 삽입된 DNA 단편상에 존재하는 것을 확인하였다.
이러한 형질전환체의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성은 하기의 방식으로 측정하였다. LB 배지에서 30℃ 로 24 시간동안 진탕배양 (왕복 진탕 :300rpm) 후, 배양된 세포를 8.5 g/l 염화 나트륨 수용액으로 2 회 및 버퍼 A (25 mmol/l 인산칼륨 버퍼, pH 7.0, 50 ml/l 글리세린, 0.1 mmol/l 트리소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트, 0.2 mmol/l 디티오트레이톨 및 0.2 mmol/l 피리독살 포스페이트)로 1 회 현탁 및 원심분리하여 세정하였다. 이어서 세포를 100 g 습균체중량/l 의 밀도로 동일한 버퍼에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포는 초음파로 분쇄한후, 원심분리하여 조 효소 용액을 제조하였다. 수득한 조 효소 용액 (20 ㎕) 을 10 mmol/l 피루브산 및 10 mmol/l L­발린을 버퍼 A 에 첨가하여 제조한 980㎕ 의 반응용액에 첨가한 후, 37℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 형성된 L-알라닌을 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 정량하여 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성을 구하였다. HPLC 분석에 대한 조건은 하기와 같다.
컬럼 : YMC ODS-AQ312 컬럼
이동상: 2.94 g/l 트리소듐 시트레이트, 1.42 g/l 황산나트륨, 63 ml/l n-프로판올, 3 g/l 소듐 도데실 술페이트, pH 3.75 (2 mol/l 황산으로 조정)
이동상 유동속도 : 2 ml/분
반응용액 : 18.5 g/l 붕산, 11 g/l 수산화나트륨, 3 ml/l Brig-35, 0.6 g/l o-프탈알데히드, 2 ml/l 머캅토에탄올
반응용액 유동속도 : 1 ml/분
형광검출 : 여기파장 345 nm
검출 파장 455 nm
그 결과, 형질전환체의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성은 에쉐리히아 콜리 H-8719 을 1 로 했을때 이보다 10 배 이상 높음이 발견되었다. 이렇게 수득한 플라스미드는 pAD27 로 명명하였다 (도. 1).
전술한 바와 같이 수득한 재조합 에쉐리히아 콜리 H-8719/pAD27 는 부다페스트조약하 2000.3.2 일자로 경제산업성산업기술종합연구소 생명공학공업기술연구소 (1-3, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, 305-0046 Japan) 에 수탁번호 FERM BP-7063 로 기탁하였다.
플라스미드 pAD27 는 에쉐리히아 콜리 H-8719/pAD27 의 배양 세포로부터 제조하였고, L-이소루이신 생산성을 갖는 에쉐리히아 콜리 H-9156 는 일렉트로포레이숀법으로 수득한 플라스미드를 이용하여 형질전환시켰다.
pAD27 를 보유한 재조합 에쉐리히아 콜리 H-9156/pAD27 은 전술한 것과 동일한 방식으로 암피실린-내성 형질전환체를 선별하여 수득하였다. 이렇게 수득한 형질전환체의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성은 전술한 것과 동일한 방식을 측정하였다. 그 결과, 형질전환체의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성은 에쉐리히아 콜리 H-9156 를 1 로 하였을 때 이보다 10 배 이상 높음이 확인되었다.
실시예 2 L-루이신 생산 시험
에쉐리히아 콜리 H-8719, avtA 유전자를 포함하는 플라스미드 pAD27 를 보유한 H-8719/pAD27 및 플라스미드 벡터 pUC19 를 보유한 H-8719/pUC19 에 대한 L-루이신 생산 시험을 하기의 방식으로 수행하였다.
H-8719/pAD27 및 H-8719/pUC19 를 개별적으로 100mg/l 암피실린을 함유한 LB 아가 평판배지에 도포하고, H-8719 를 무(無)암피실린의 LB 아가평판배지에 도포하였다. 각각의 균주를 30℃ 에서 24 시간동안 배양시켰다. 1 백금이의 배양된 세포를 6 ml 의 시드배지 (20 g/l 글루코오스, 10 g/l 펩톤, 10 g/l 효소 추출물, 2.5 g/l 염화 나트륨 및 10 g/l 탄산칼슘, pH 7.4) 에 접종시킨 후, 대형시험관 (직경: 25 mm, 길이: 200 mm) 중에서, 30℃, 17 시간동안 진탕배양 (왕복 진탕 : 300 rpm) 시켰다. 수득한 배양액 (0.1 ml) 을 6 ml 의 생산배지 (65 g/l 글루코오스, 2 g/l 콘스팁 리퀴어, 16 g/l 황산암모늄, 2 g/l 인산제1칼륨, 40 g/l 인산마그네슘 및 10 g/l 탄산칼슘, pH 7.0)에 옮긴 후, 대형시험관 (직경: 25 mm, 길이: 200 mm)중에서, 30℃, 48 시간동안 진탕배양 (왕복진탕: 300 rpm) 시켰다.
배양 종결후, 배양액내 형성 및 축적된 L-루이신 및 부산물로 형성된 L-발린의 양을 HPLC 로 측정하였다 ( 실시예 1 에 기재된 L-알라닌의 측정과 동일한 방법).
전술한 배양 시험은 각각 20 회 수행하였고, 수득된 결과의 평균값은 표 1 에 나타내었다.
균주 Leu [g/l] Val [g/l] Val/Leu [%]
H-8719 12.1 0.17 1.40
H-8719/pUC19 12.4 0.18 1.44
H-8719/pAD27 12.6 0.08 0.65
평균값 (n=20)
세개의 균주가 거의 동등한 L-루이신 생산성을 보였다. avtA 유전자의 발현 수준이 상승된 H-8719/pAD27 에서의 부산물로서의 L-발린 대 L-루이신의 비율은 숙주 H-8719 와 비교하여 항상 저하되었으며, 저하률은 약 54% 이었다.
상기 결과는 발효법에 의한 L-루이신 생산에서 정제를 방해하는 부산물로서의 L-발린의 형성은 L-루이신 생산주의 avtA 유전자에 의해 코딩되는 알라닌-발린 트랜스아미나아제의 활성을 상승시켜 현저하게 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 3 L-이소루이신 생산 시험
에쉐리히아 콜리 H-9156, avtA 유전자를 포함하는 플라스미드 pAD27 를 보유한 H-9156/pAD27 및 플라스미드 벡터 pUC19 를 보유한 H-9156/pUC19 에 대한 L-이 소루이신 생산 시험은 하기의 방식으로 수행하였다.
H-9156/pAD27 및 H-9156/pUC19 를 개별적으로 100mg/l 암피실린을 함유한 LB 아가 평판배지에 도포하고, H-9156 를 무암피실린의 LB 아가평판배지에 도포하였다. 각각의 균주를 30℃ 에서 24 시간동안 배양시켰다. 1 백금이의 배양된 세포를 6 ml 의 시드배지 (20 g/l 글루코오스, 10 g/l 펩톤, 10 g/l 효소 추출물, 2.5 g/l 염화 나트륨 및 10 g/l 탄산칼슘, pH 7.4) 에 접종시킨 후, 대형시험관 (직경: 25 mm, 길이: 200 mm) 중에서, 30℃, 17 시간동안 진탕배양 (왕복 진탕 : 300 rpm) 시켰다. 수득한 배양액 (0.1 ml) 을 6 ml 의 생산배지 (65 g/l 글루코오스, 2 g/l 콘스팁리퀴어, 16 g/l 황산암모늄, 2 g/l 인산제1칼륨, 0.1 g/l DL-메티오닌, 40 g/l 인산마그네슘 및 10 g/l 탄산칼슘, pH 7.0)에 옮긴 후, 대형시험관 (직경: 25 mm, 길이: 200 mm)중에서, 30℃, 48 시간동안 진탕배양 (왕복진탕: 300 rpm) 시켰다.
배양 종결후, 배양액내 형성 및 축적된 L-이소루이신 및 부산물로 형성된 L-발린의 양을 HPLC 로 측정하였다. 측정 조건은 실시예 2 에 기재된 것과 동일하다.
전술한 배양 시험은 각각 20 회 수행하였고, 수득된 결과의 평균값은 표 2 에 나타내었다.
균주 Ile [g/l] Val [g/l] Val/Ile [%]
H-9156 13.4 3.6 26.6
H-9156/pUC19 13.4 3.4 25.7
H-9156/pAD27 13.0 1.8 13.9
평균값 (n=20)
세개의 균주가 거의 동등한 L-이소루이신 생산성을 보였다. avtA 유전자의 발현수준이 상승된 H-9156/pAD27 에서의 부산물로서의 L-발린 대 L-이소루이신의 비율은 숙주 H-9156 과 비교하여 항상 저하되었으며, 저하률은 약 48% 이었다.
상기 결과는 발효법에 의한 L-이소루이신 생산에서 정제를 방해하는 부산물로서의 L-발린의 형성은 L-이소루이신 생산주의 avtA 유전자에 의해 코딩되는 알라닌-발린 트랜스아미나아제의 활성을 상승시켜 현저하게 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
본 발명에 따라, 알라닌-발린 트랜스아미나아제 (트랜스아미나아제 C) 활성이 상승된 L-아미노산을 생산하는 능력을 가진 미생물을 이용하여, 발효법에 의한 L-아미노산 생산에서 정제를 방해하는 부산물 아미노산의 생산을 감소시킬 수 있으며, 산업적으로 유리한 L-아미노산 생산방법을 제공할 수 있다.
서열 텍스트
SEQ ID NO: 1- 인공서열의 설명 : 합성 DNA
SEQ ID NO: 2- 인공서열의 설명 : 합성 DNA
SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD <120> Process for producing L-amino acid <130> 11290WO1 <140> <141> <150> JP 00/83648 <151> 2000-3-24 <160> 2 <170> PatentIn Ver.2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 1 tcgactgtct ggcgcagatg gatacgacct 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 2 cctgataagc gtagcgcatc aggcaatttt 30

Claims (13)

  1. L-루이신 또는 L-이소루이신의 제조방법으로서,
    에쉐리히아 콜리에 속하고 L-루이신 또는 L-이소루이신을 생산하는 능력을 가지며 미생물의 세포에서 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 에쉐리히아 콜리 DNA 의 카피수를 증가시킴으로써 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성이 상승된 미생물 재조합주를 배지에서 배양하고, L-루이신 또는 L-이소루이신을 배양액 내 형성 및 축적시키고, 배양액으로부터 L-루이신 또는 L-이소루이신을 회수하는 것을 포함하며,
    미생물 재조합주의 부산물 L-발린 대 L-루이신 또는 L-이소루이신의 비가 비(非)변이 미생물과 비교하여 감소된,
    L-루이신 또는 L-이소루이신의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 미생물 재조합주가 에쉐리히아 콜리 H-8719/pAD27 (FERM BP-7063) 인 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 미생물 재조합주로서,
    에쉐리히아 콜리에 속하고 L-루이신 또는 L-이소루이신을 생산하는 능력을 가지고 미생물의 세포에서 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 코딩하는 에쉐리히아 콜리 DNA 의 카피수를 증가시킴으로써 알라닌-발린 트랜스아미나아제 활성이 상승되며,
    미생물 재조합주의 부산물 L-발린 대 L-루이신 또는 L-이소루이신의 비가 비(非)변이 미생물과 비교하여 감소된,
    미생물 재조합주.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 8 항에 있어서, 에쉐리히아 콜리 H-8719/pAD27 (FERM BP-7063) 인 미생물 재조합주.
  12. 제 8 항에 있어서, 에쉐리히아 콜리 H-9156/pAD27 인 미생물 재조합주.
  13. 제 1 항에 있어서, 미생물 재조합주가 에쉐리히아 콜리 H-9156/pAD27 인 방법.
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