WO2001060984A1 - Lignee cellulaire adventitielle vasculaire, immortalisee - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an immortalized vascular pericyte cell line.
  • brain capillary cells of a transgenic rat transfected with the large T antigen gene of a temperature-sensitive mutant tsA58 of SV40 are subcultured.
  • An immortalized pericyte cell line expressing PDGF (platelet-derived growth factor) receptor 0 and angiopoietin-11 that can be established.
  • immortalized cells that have survived cell senescence and have acquired the ability to grow indefinitely have stable and uniform characteristics.
  • many of such immortalized cells lose some or all of the morphology and functions originally possessed by the living body, so tests using such immortalized cell lines It has been difficult to accurately reflect the original characteristics of the tissue from which the cell line originated.
  • cells were introduced into primary cells by introducing oncogenes such as the ras gene and c-myc gene, the adenovirus ElA gene, the large T antigen gene of the SV40 virus, and the HPVI6 gene of the human papillomavirus. Attempts have been made to establish an immortalized cell which transforms E.
  • 5-292958 by the present inventors discloses that a temperature-sensitive mutant SV40 large T antigen gene is introduced into a totipotent cell of a mammal, and that the normal It describes a method of collecting tissue cells from various organs of a transgenic animal obtained by production, for example, hepatocytes and bone marrow cells, and subculturing them to establish an immortalized cell line.
  • the temperature-sensitive mutant strain of SV40 t s Immortalized cells obtained from the organs of transgenic mice into which the large T antigen gene of A58 has been introduced can be manipulated by changing the temperature to control their growth and expression of differentiation traits. (Noble M et al. (1995) Transgenic Research 4, 215-225; Obinata M. (1997) Genes to Cells 2, 235-244).
  • Capillary pericytes have been regarded as important in the study of vascular wall degenerative diseases, and methods of using primary cells of capillary pericytes instead of animal tests have been attempted from the viewpoint of animal welfare. I have. In this case, it is difficult to obtain sufficient cells for the test from a small experimental animal, and the number of capillary pericytes varies depending on the tissue. Nevertheless, since it is difficult for large-scale livestock such as sea bream to return the information obtained from cultured cells to the living body, it has been desired to provide an effective alternative capillary pericyte cell line.
  • An object of the present invention is to provide an immortalized vascular pericyte cell line that retains its original function and characteristics in a tissue derived from the cell line, a method for establishing the same, and a useful substance using the immortalized vascular pericyte cell line. It is to provide a screening method. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above-mentioned problems, and when culturing cells derived from micro-organs such as brain capillary pericardial cells, they weigh about 10 times as much as mice.
  • a large T antigen gene of tsA58, a temperature-sensitive mutant of SV40 was introduced as an immortalizing gene.
  • Establish capillary pericyte cell line And found that the present invention was completed.
  • the present invention relates to an immortalized vascular pericyte cell line (claim 1) characterized in that it has the ability to express PDGF receptor] 3 and angiopoietin-1,
  • a method for producing an immortalized vascular pericyte cell line which comprises establishing immortalized cells that express 1 (claim 8).
  • the present invention relates to a method for producing an immortalized vascular pericyte cell line according to claim 8, wherein the method has an ability.
  • the present invention provides a method for culturing the immortalized vascular pericyte cell line according to any one of claims 1 to 7 in the presence of a test substance, and measuring the activity and Z or the degree of expression of the marker protein in the cell.
  • Immortalized blood vessels characterized by evaluating the method of screening for substances that promote or inhibit the expression of differentiation traits in pericytes 10.
  • the immortalized vascular pericyte according to claim 10, wherein the marker protein is PDGF receptor, Thy-1, ICAM-1, or angiopoietin-11.
  • a method for screening for a substance that promotes or suppresses differentiation phenotype in (Claim 11), and culturing the immortalized vascular pericyte cell line according to any one of Claims 1 to 7 in the presence of a test substance.
  • a method for screening a substance that promotes or inhibits proliferation in immortalized vascular pericytes characterized by measuring and evaluating the degree of proliferation of the cells (Claim 12); Item 8.
  • An immortalized vascular pericyte comprising culturing the immortalized vascular pericyte cell line according to any one of Items 1 to 7 at a high density, and detecting and evaluating the degree of force deposited on a matrix mass in the cells. Matrix mass calcium deposition in cells
  • the invention relates to a method of screening for a substance that promotes or suppresses (claim 13).
  • the present invention provides a differentiation trait expression promoting substance in immortalized vascular pericytes obtained by the screening method according to claim 10 or 11 (claim 14), and the screening method according to claim 12.
  • a substance promoting proliferation in immortalized blood vessel pericytes obtained by the method (Claim 15) and a substance promoting matrix deposition of calcium in the immortalized blood vessel pericytes obtained by the screening method according to Claim 13 (Claim 16), a substance for inhibiting the expression of differentiation in immortalized vascular pericytes obtained by the screening method according to claim 10 or 11 (Claim 17), and Claim 12 A growth inhibitory substance in immortalized vascular pericytes obtained by the screening method according to claim 18 (claim 18), and a matrix in immortalized vascular pericytes obtained by the screening method according to claim 13.
  • the immortalized vascular pericyte cell line of the present invention may be any established cell that retains the ability to express the PDGF receptor ⁇ and angiopoietin-1 (Angiopoietin-1). Derived from capillary pericytes, expressed a large T antigen gene of SV40 temperature-sensitive mutant tsA58, or capable of depositing calcium on matrix lumps by high concentration culture Can be mentioned. Also, a specific example of such an immortalized vascular pericyte cell line is the TR-PCT1 line (FERMBP-7024).
  • the immortalized vascular pericyte cell line of the present invention can be obtained from animals such as rodents such as rats, and is particularly useful for preparing cells to be used for cell line establishment from various organs.
  • animals such as rodents such as rats
  • rats are preferably used because primary organs can be easily obtained by separating the organs.
  • a method for producing an immortalized vascular pericyte cell line will be described using a rat method as an example.
  • the cerebral tissue of a transgenic rat transfected with the large T antigen gene of the temperature sensitive mutant tsA58 of SV40 is homogenized to separate cerebral capillaries, and the resulting cerebral capillaries are used as collagenase or the like.
  • Cerebral capillary pericytes are subcultured to express PDGF receptor 0, a surface marker of pericytes, and angiopoietin 11 specific to vascular wall cells Immortalized cells can be established.
  • the transgenic rat into which the large T antigen gene of the temperature sensitive mutant tsA58 of SV40 has been introduced can be prepared as follows. For example, a plasmid obtained by opening the entire DNA of tsA58ori (-)-2 from which the replication origin (ori) of SV40 has been deleted with the restriction oxygen BamHI and introducing it into pBR322 p SV ts A 5 8 (-)-2 (OhnoT.
  • transgenic rats ie, transgenic rats, having the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant tsA58 of SV40 in all cells can be produced.
  • the transgenic rat expresses the tsA58 large T antigen gene in all its somatic cells, and the totipotent cells include fertilized eggs, early embryos, and multipotent ES cells. Specific cells As a method for introducing DNA into totipotent cells, a known gene transfer method such as a mouth injection method, an electric pulse method, a liposome method, and a calcium phosphate method is used. be able to.
  • the nuclei of totipotent cells (cultured cells) from rodents and other animals such as the above-mentioned rats are transplanted into enucleated fertilized eggs and initialized (nuclear transfer), and the temperature sensitivity of SV40 to the eggs is suddenly reduced.
  • the large T antigen gene of the mutant tsA58 can be introduced.
  • the immortalized vascular pericytes of the present invention can be obtained by removing the cerebrum of the transgenic rat produced above, washing the cerebrum well with a buffer solution, and slicing the cerebrum.
  • a pellet can be obtained by adding a buffer to the slurry obtained by grinding the tissue with a mogenizer and centrifuging. The obtained pellet is suspended in an enzyme (protease) solution, subjected to an enzyme treatment with shaking, to separate capillaries from unnecessary tissues, and then centrifuged again to obtain a pellet of 20%. Suspend the cells in DMEM containing fetal serum and inoculate the suspension into a culture dish.After two subcultures, perform colony formation.
  • Colonies are formed again, and colonies with a relatively high growth rate can be isolated from surrounding cells using a penicillin force.
  • the immortalized vascular pericytes isolated above maintain a permanent growth potential at 33-37 ° C and control the expression of cell-specific differentiation traits to stop proliferation at 39 ° C. It has the characteristic that it can be done.
  • the isolated immortalized vascular pericytes were detected by detecting the expression of temperature-sensitive SV40 large T antigen, PDGF receptor] 3, and angiopoietin-1 by RT-PCR and Z or Western blotting. Can be identified.
  • This immortalized vascular pericyte cell line shows good proliferation at 33 ° C. even after 50 subcultures, and retains the function as a brain capillary pericyte.
  • the immortalized vascular pericyte cell line of the present invention can be used for the study of vascular wall degenerative diseases, the study of autoimmune diseases in the brain, the study of diseases related to impaired nutrient metabolism and homeostasis in the brain, It is useful for studying diseases involving angiogenesis such as tumors and arteriosclerosis, and for studying the development of diagnostic and therapeutic methods for these diseases at the cellular level.
  • the immortalized vascular pericyte cell line of the present invention retains the expression of a large number of cells, and when cultured on a high-density petri dish, shows a matrix mass structure rich in calcium components. As shown in, screening of useful substances such as pharmaceuticals targeting vascular pericytes Can be used.
  • the immortalized vascular pericyte cell line is cultured in the presence of a test substance, and the PDGF receptor
  • 6, Thy-1, ICAM-1, or angiopoietin-1 in the cell is cultured.
  • the vascular pericyte cell line is cultured, and the degree of proliferation of the cell is measured and evaluated.
  • the method for screening for a substance that promotes or suppresses the proliferation of immortalized vascular pericytes and the method for immortalized blood vessels in the presence of a test substance, Culture the pericyte cell line at high density and detect and evaluate the degree of calcium deposited on the matrix mass in the cells. Matrix mass in immortalized vascular pericytes And a screening method for a substance that promotes or suppresses the deposition of calcium.
  • the screening for a substance that promotes or suppresses the expression of differentiation phenotype in immortalized vascular pericytes is performed by culturing the immortalized vascular pericyte cell line in the presence of various concentrations of a test substance, and expressing the marker expressed after culturing for a certain time This is done by detecting and measuring the amount of protein and comparing and evaluating that of a control cultured in the absence of the test substance.
  • PDGF receptor and Thy-1 which are surface markers of vascular pericytes, can be measured by immunochemical detection using a specific antibody by a conventional method.
  • Angiopoietin-11 and ICAM-1 specific to vascular wall cells can be measured by detecting the expression level of the corresponding mRNA by a conventional method.
  • the screening for the substance that promotes or suppresses proliferation in the immortalized vascular pericytes is performed by culturing the immortalized vascular pericyte cell line in the presence of various concentrations of the test substance, and after culturing for a certain period of time, the cell number or cell Morphology is measured and analyzed, and compared and evaluated with that of a control cultured in the absence of the test substance.
  • Done by Screening for a substance that promotes or inhibits matrix deposition of calcium in the immortalized vascular pericytes is performed by culturing the immortalized vascular pericyte cell lines in the presence of various concentrations of the test substance, and After cultivation for a period of time, calcium deposition in the matrix mass is detected with a microscope or the like, and is compared and evaluated with a control cultured in the absence of the test substance.
  • a substance that promotes or suppresses the expression of differentiation phenotype in immortalized pericytes obtained by these screening methods a substance that promotes or suppresses proliferation in immortalized pericytes, and matrices in immortalized pericytes
  • a substance that promotes or inhibits lumpy calcium deposition is used to treat patients with vascular wall degenerative diseases, angiogenesis diseases, autoimmune diseases in the brain, diseases related to cerebral nutritional metabolism and homeostatic dysfunction, etc. It may be useful as a therapeutic, prophylactic and / or symptom-ameliorating agent and is useful.
  • the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • Transgenic rats into which the DNA of the temperature-sensitive mutant strain tSA58 of SV40 was introduced were prepared by the following procedure.
  • the genomic DNA of an SV40 temperature-sensitive mutant strain tsA58 was used.
  • the tsA58 genomic DNA is opened with the restriction enzyme BamHI, introduced into the BamHI site of pBR322, the SfiI sequence is converted to Saell, and the SV40 DNA clone with ori (-) deletion of the replication origin (ori) p SV ts A58 ori (-) 1-2 (Ohno T. et al "Cytotechnology, 165-172, 1991; see Fig. 1) DNA for preparation was prepared according to the standard method from E. coli.
  • This DNA solution was diluted with an injection buffer (10 mM Tris-HC1 containing 0.1 mM EDTA; pH 7.6) to 5 g / m 1, and the DNA for injection was diluted. A solution was prepared. The prepared DNA solution was stored at -20 ° C until the injection operation.
  • the microinjection of the prepared DNA solution for injection into rat pronuclear stage fertilized eggs was performed as follows. Sex-matured 8-week-old wis x-yi rats are bred under a light-dark cycle of 12 hours (4: 00 to 16: 00, light hours), a temperature of 23 ⁇ 2 ° C, and a humidity of 55 ⁇ 5%. The female sexual cycle was observed by vaginal smear, and the hormone treatment day was selected.
  • the collected fertilized eggs contain 0.1% hyaluronidase (Sigma; Hyaluronidase Typel-S). After removal of the 3 7 ⁇ 0, 5 minutes of enzyme treatment was carried out cumulus cells 8 solution, the enzyme was removed by washing three times with MKR B solution, CO 2 one incubator within one to DNA injection operation (5 % CO 2 —95% Air, 37 ° C, saturated humidity). The DNA solution was injected into the male pronucleus of the rat fertilized eggs prepared in this manner. The injected 228 eggs were transplanted into 9 foster parents and delivered to give birth to 80 offspring.
  • the transfection of the injected DNA into rats was performed by PCR using DNA prepared from tails obtained by cutting immediately after weaning. [Primer used: tsA58_lA, 5'-TCC TAATGTGCAG T CAGGTG—3 ′ (corresponding to 13365 to 1384 site), tsA58-IB, 5′-ATGAC GAGCTTTGGCACTTG-3 ′ (corresponding to 1571 to 159 site)]].
  • tsA58_lA 5'-TCC TAATGTGCAG T CAGGTG—3 ′ (corresponding to 13365 to 1384 site), tsA58-IB, 5′-ATGAC GAGCTTTGGCACTTG-3 ′ (corresponding to 1571 to 159 site)]
  • tsA58_lA 5'-TCC TAATGTGCAG T CAGGTG—3 ′ (corresponding to 13365 to 1384 site)
  • tsA58-IB 5′-ATGAC GAGCTTTGGCACTTG-3 ′ (corresponding to 15
  • Transgenic rats male lines: # 07-7, # 07-7, # 09-9-6, # 12-3, # 19-3, female lines: # 09-9, # 11) — 6, # 1 2—5, # 1 2—7, # 18-5, # 1 9—8). These G. Cross-generation transgenic rats and Wistar rats were crossed to produce two lines of male huunder (# 07-2, # 07-5) and three lines of female huunder (# 09-7,, # 11-). In 6, 19-18), gene transfer to the next generation and beyond was confirmed.
  • the brain was isolated from one transgenic rat into which the large T ⁇ protogene was introduced. After removing the mesencephalon, cerebral canals, etc. other than the cerebrum, the excised brain was cooled in a clean bench with ice-cold preparation buffer (122 mM NaC1, 3 mM KC1, 1.4 mM C a C l 2, 1. 2mM of Mg S 0 4 - 7 H 2 0, 0. 4mM of K 2 HP 0 4, 1 0 mM of G 1 ucose, 1 of 0m M H epes; p H 7. 4) Well washed. The washed cerebrum was minced into 1-2 mm 2 of tissue.
  • Three Colonies with relatively high growth rate of forming an isolated from the surrounding cells with a pair Nishirinkappu was Tane ⁇ 1 0 3 cells again 1 0 Omicron Paiiotaiotaitafai culture dish obtained 3 3 ° Colonies were formed by culturing in a carbon dioxide incubator of C. Colonies with a relatively high growth rate were isolated from surrounding cells using a benicillin cup, and two cell lines (TR-PCT1, TR-PCT2) were obtained.
  • this TR-PCT1 strain is based on the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) and the Institute of Biotechnology and Industrial Technology (Tsukuba, Ibaraki, Japan). It has been deposited as a deposit number "NI BH F ERM BP-7 02 4" at 1-3, Higashi 1-chome, Postal code 3 05—8 5 6 6).
  • the large T antigen proteins of the two cell lines obtained in Experimental Example 2 were analyzed by the Western blot method (Experimental Medicine Separate Volume Manual, UP Series, “Molecular Biology Aroche Cancer Research Protocol” 108-115) Page, Yodosha, published in 1995). After washing each of the two cell lines with PBS, solubilize with 1 mL of solubilization solution (1% SDS, 10 mM Tris, ImM EDTA, 10% glycerin) After heating at 10 ° C for 10 minutes, centrifugation (10,000 rpm for 10 minutes) was performed to remove insoluble fractions, and then a flood feed method (PICA CE BCA Proteinase) was used. (Using Reagent A).
  • the obtained cell line was cultured in a monolayer, immunostained for PDGF receptor / 3 and Thy-1 expressed on the cell membrane, and confirmed using a microscope.
  • the cell line TR-PCT1 obtained in Example 2 was cultured on a 24-welldish (Falcon) cover. After removing the culture solution and washing the cells with PBS, 0.5 mL of a fixative (3.6% paraformaldehyde) was added, and the mixture was left at 4 ° C for 20 minutes, and then thoroughly washed with PBS.
  • the obtained cell line was cultured in a monolayer, and angiopoietin expressed in the cells was detected.
  • the cell line TR-PCT1 obtained in Example 2 was cultured in a 10 ⁇ culture dish (Falcon). After removing the culture solution and washing the cells with PBS, the cells were scraped with a cell scraper (manufactured by Iwaki) and total RNA was extracted with an RNA extraction reagent (Trizo1; manufactured by Gibco). Using reverse transcriptase (RevTraAce: manufactured by TOYOBO), cDNA was synthesized from the extracted total RNA 1 / g, and the expression was confirmed by PCR method (exTaq; manufactured by Takara Shuzo).
  • the PCR amplification product was confirmed by electrophoresis of 5% acrylamide gel. As a result, expression of angiopoetin-11, osteopoietin, and ICAM-1 in the cell line TR-PCT1 was confirmed. Similar results were obtained for TR-PCT2.
  • Example 6 (Confirmation of calcium deposit in matrix mass by high-density culture) The obtained cell line was cultured in a monolayer, and calcium deposited in the matrix mass was confirmed by vonkossa staining. 1 0 6 cell lines TR- PCT 1 obtained in Example 2, 1 0 0 mm at DMEM ⁇
  • vascular wall degenerative diseases research on nutritional metabolism of the brain
  • research on vascular neogenesis research on autoimmune diseases in the brain
  • screening of drugs targeting vascular pericytes, nutritional metabolism and homeostasis of the brain screening of drugs targeting vascular pericytes, nutritional metabolism and homeostasis of the brain. It is possible to provide an immortalized vascular pericyte cell line that is useful for studying at the cellular level the diagnosis of a disease associated with sexual dysfunction or the development of a method for treating it.

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Description

明 細 書 不死化血管周皮細胞株 技術分野
本発明は不死化血管周皮細胞株に関し、 詳しくは S V 4 0の温度感受 性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子を導入したトランスジェ ニックラットの脳毛細血管細胞を継代培養して樹立することができる、 P D G F (血小板由来増殖因子） 受容体 0及びアンギオポェチン一 1を 発現する不死化血管周皮細胞株に関する。 背景技術
従来、 医薬品の安全性や有効性に関する試験研究には主として動物が 用いられていたが、 動物愛護の点から動物を使用する代わりに、 培養細 胞等を用いてインビトロで医薬品の有効性や安全性を試験研究する技術 の実用化レベルでの研究が行われている。 例えば、 生体組織から採取し た初代培養細胞や無限増殖する不死化細胞 （樹立細胞） 系を用いる方法 で予め試験した後に動物試験を行うことが行われている。 しかし、 初代 細胞は初期段階ではよく増殖するが、 継代培養とともに次第に増殖が停 止し、 やがては死滅する （この現象を細胞老化という）。 さらに、 初代細 胞は、 その特性が生体組織から採取する度に異なるという危惧に加え、 継代とともに変化することが指摘されている。 特に、 増殖速度が非常に 遅い場合や微小器官に由来する場合には、 試験に供するに足る初代細胞 を得ることは非常に困難であるとされている。
—方、 初代培養の継代を重ねるなかで、 細胞老化を免れて無限増殖す る能力を獲得した不死化細胞では、 安定して均一の特性を有することに なるが、 このような不死化細胞の多くは、 その細胞が生体において本来 有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失するため、 このような 不死化細胞株を用いた試験では、 その細胞株の由来する組織での本来の 特性を正確に反映することは難しいとされていた。 そこで、 初代細胞に ras遺伝子や c-myc遺伝子などの発癌遺伝子、 アデノウイルスの E l A 遺伝子、 S V 4 0ウィルスのラージ T抗原遺伝子、 ヒトパピ口一マウイ ルスの H P V I 6遺伝子等を導入して細胞を形質転換し、 初代細胞の有 する活発な増殖能を継続的に保持し、 しかも継代することによつてもそ の細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞を樹立する試みがなされてい る。 ところが、 このような不死化細胞においても、 対象とする臓器によ つては、 その初代細胞を調製し、 これらの癌遺伝子やラージ T抗原遺伝 子を導入する時点で、 すでに幾つかの機能を喪失するため、 本来の機能 を保持する厳密な意味での不死化細胞の取得は困難であった。 特に、 増 殖速度が非常に遅い場合や微少器官に由来する場合の初代細胞を調製し て株化することは極めて困難であった。
これに対し、 近年確立された動物個体への遺伝子導入技術を用いて、 個々の細胞に癌遺伝子やラージ T抗原遺伝子を導入するかわりに、 これ らの遺伝子を安定的に染色体に組み込んだ遺伝子導入動物を作出して、 個体の発生時点において既に癌遺伝子やラージ τ抗原遺伝子を細胞の中 に保有する動物の臓器から初代細胞を調製して、 これを継代することに より不死化細胞を樹立する方法が報告されている。 例えば、 本発明者ら による特開平 5 - 2 9 2 9 5 8号公報には、 温度感受性突然変異 S V 4 0ラージ T抗原遺伝子を哺乳動物の全能性細胞に導入し、 この動物の正 常な産出によって得られる遺伝子導入動物の各種臓器の組織細胞、 例え ば、 肝細胞や骨髄細胞を採取し、 これを継代培養して不死化細胞株を樹 立する方法が記載されている。 特に S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子を導入したトランスジエニックマウスの 臓器から得られる不死化細胞は、 その増殖や分化形質の発現を温度を変 えることによって操作することができるため非常に有効であるとされて レ ^る（Noble M et al.(1995) Transgenic Research 4, 215-225； Obinata M.(1997) Genes to Cells 2, 235-244)。
毛細血管周皮細胞は血管壁変性疾患の研究において重要視されてきて おり、 動物愛護の観点から動物試験に代えて毛細血管周皮細胞の初代細 胞を用いる方法が試みられるようになってきている。 この場合に、 試験 に供するに足る細胞を小型の実験動物から得ることが難しく、 組織によ つて毛細血管周皮細胞の数が異なるため、 ゥシ等の大型家畜の組織を使 用しなければならないが、 ゥシ等の大型家畜では培養細胞から得た情報 を生体に還元することが困難であることから、 これに代わる有効な毛細 血管周皮細胞株の提供が切望されていた。 本発明の課題は、 当該細胞株 の由来する組織における本来の機能 ·特性を保持する不死化血管周皮細 胞株及びその樹立方法並びに当該不死化血管周皮細胞株を用いた有用物 質のスクリーニング方法を提供することにある。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究し、 脳毛細血管周 皮細胞のような微少器官に由来する細胞を株化する場合には、 マウスに 比べ体重が約 1 0倍あるラッ トが不死化細胞株樹立に供する細胞を調製 する上で有利であるとの知見に基づき、 不死化遺伝子としての S V 4 0 の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子を導入したト ランスジエニックラットを作製し、 その大脳組織をホモジナイズして脳 毛細血管を分離し、 得られた脳毛細血管をプロテア一ゼ処理し、 得られ る細胞を継代培養することによって不死化毛細血管周皮細胞株を樹立す ることができることを見い出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 PDGF受容体 ]3及びアンギオポェチン— 1の発 現能を保持したことを特徴とする不死化血管周皮細胞株（請求項 1)や、 脳毛細血管周皮細胞に由来することを特徴とする請求項 1記載の不死化 血管周皮細胞株 （請求項 2) や、 SV40の温度感受性突然変異株 t s A 58のラージ T抗原遺伝子を発現することを特徴とする請求項 1又は 2記載の不死化血管周皮細胞株 （請求項 3) や、 高濃度培養によるマト リックス塊カルシウム沈着能を有することを特徴とする請求項 1〜 3の いずれか記載の不死化血管周皮細胞株 （請求項 4) や、 齧歯類起源であ ることを特徴とする請求項 1〜4のいずれか記載の不死化血管周皮細胞 株 （請求項 5) や、 齧歯類がラットであることを特徴とする請求項 5記 載の不死化血管周皮細胞株 （請求項 6) や、 不死化脳毛細血管周皮細胞 株 T R— P C Τ 1株（F E RM BP— 7024) (請求項 7)に関する < また本発明は、 S V 40の温度感受性突然変異株 t s A 58のラージ T抗原遺伝子を導入したトランスジエニックラットの大脳組織をホモジ ナイズして得られる脳毛細血管をプロテアーゼ処理し、 得られる脳毛細 血管細胞を継代培養して、 温度感受性 S V40ラージ T抗原、 PDGF 受容体 及びアンギオポェチン一 1を発現する不死化細胞を樹立するこ とを特徴とする不死化血管周皮細胞株の製造方法 （請求項 8) や、 不死 化血管周皮細胞株が、 高濃度培養によるマトリックス塊カルシウム沈着 能を有することを特徴とする請求項 8記載の不死化血管周皮細胞株の製 造方法 （請求項 9) に関する。
また本発明は、 被検物質の存在下、 請求項 1〜 7のいずれか記載の不 死化血管周皮細胞株を培養し、 該細胞におけるマーカータンパク質の活 性及び Z又は発現の程度を測定 ·評価することを特徴とする不死化血管 周皮細胞における分化形質発現の促進又は抑制物質のスクリーニング方 法 （請求項 1 0 ) や、 マーカ一タンパク質が、 P D G F受容体 、 T h y— 1、 I C A M— 1、 又はアンギオポェチン一 1であることを特徴と する請求項 1 0記載の不死化血管周皮細胞における分化形質発現の促進 又は抑制物質のスクリーニング方法 （請求項 1 1 ) や、 被検物質の存在 下、 請求項 1〜 7のいずれか記載の不死化血管周皮細胞株を培養し、 該 細胞の増殖の程度を測定 ·評価することを特徴とする不死化血管周皮細 胞における増殖の促進又は抑制物質のスクリ一二ング方法（請求項 1 2 ) や、 被検物質の存在下、 請求項 1〜 7のいずれか記載の不死化血管周皮 細胞株を高密度で培養し、 該細胞におけるマトリックス塊に沈着した力 ルシゥムの程度を検出 ·評価することを特徴とする不死化血管周皮細胞 におけるマトリックス塊カルシウム沈着の促進又は抑制物質のスクリ一 ニング方法 （請求項 1 3 ) に関する。
また本発明は、 請求項 1 0又は 1 1記載のスクリ一二ング方法により 得られる不死化血管周皮細胞における分化形質発現促進物質 （請求項 1 4 ) や、 請求項 1 2記載のスクリーニング方法により得られる不死化血 管周皮細胞における増殖促進物質 （請求項 1 5 ) や、 請求項 1 3記載の スクリ一ニング方法により得られる不死化血管周皮細胞におけるマトリ ックス塊カルシウム沈着の促進物質 （請求項 1 6 ) や、 請求項 1 0又は 1 1記載のスクリ一ニング方法により得られる不死化血管周皮細胞にお ける分化形質発現抑制物質 （請求項 1 7 ) や、 請求項 1 2記載のスクリ 一二ング方法により得られる不死化血管周皮細胞における増殖抑制物質 (請求項 1 8 ) や、 請求項 1 3記載のスクリーニング方法により得られ る不死化血管周皮細胞におけるマトリックス塊カルシウム沈着の抑制物 質 （請求項 1 9 ) に関する。 発明を実施するための最良の形態 本発明の不死化血管周皮細胞株としては、 P D G F受容体 β及びァン ギオポェチン— 1 (Angiopoietin-1) の発現能を保持した樹立細胞であ ればどのようなものでもよく、 例えば、 脳毛細血管周皮細胞に由来する ものや、 S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺 伝子を発現するものや、 高濃度培養によるマトリックス塊カルシウム沈 着能を有するものを挙げることができる。 また、 このような不死化血管 周皮細胞株の具体例として、 T R— P C T 1株 （F E R M B P— 7 0 2 4 ) を挙げることができる。 そして、 本発明の不死化血管周皮細胞株 は、 ラッ ト等の齧歯類などの動物から得ることができるが、 各種臓器か らの細胞株樹立に供する細胞を調製する上で、 特に、 脳毛細血管周皮細 胞のような微少器官に由来する細胞を株化する場合には、 器官を分離し て初代細胞を容易に得ることができることから、 ラットを用いることが 好ましい。 以下に、 不死化血管周皮細胞株の製造方法を、 ラットを用い た方法を例にとって説明する。
例えば、 S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原 遺伝子を導入したトランスジエニックラットの大脳組織をホモジナイズ して脳毛細血管を分離し、 得られた脳毛細血管をコラゲナーゼ等のプロ テア一ゼにより処理し、 得られる脳毛細血管周皮細胞を継代培養して、 周皮細胞の表面マーカーである P D G F受容体 0及び血管壁細胞に特異 的なアンギオポェチン一 1を発現する不死化細胞を樹立することができ る。
上記 S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝 子を導入したトランスジエニックラッ トは、 以下のようにして作製する ことができる。 例えば、 S V 4 0の複製起点 （o r i ) を欠失させた t s A 5 8 o r i ( - ) - 2の全 D N Aを制限酸素 B a m H Iで開環して p B R 3 2 2に導入したプラスミ ド p S V t s A 5 8 ( - ) - 2 (OhnoT. et al" Cytotechnology 7, 165-172, 1991) を常法に従い大腸菌内で大量 に増幅させ、 この増幅したプラスミ ドを制限酵素 B a m H Iで切断して ベクタ一部位を除去し、 t s A 5 8のラ一ジ T抗原遺伝子を有する D N A断片を調製する。 このラージ T抗原遺伝子のプロモーターが内在する D N A断片を常法に従いラッ ト等の齧歯類などの動物の全能性細胞に遺 伝子導入することにより、 S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8 のラージ T抗原遺伝子を全ての細胞内に有する遺伝子導入ラット、 すな わちトランスジェニックラットを作出することができる。 かかるトラン スジェニックラッ トは、 その全ての体細胞において t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子が発現することになる。そして、上記全能性細胞としては、 受精卵や初期胚のほか、 多分化能を有する E S細胞などを具体的に挙げ ることができる。 また、 全能性細胞への D N Aの導入方法としては、 マ イク口インジェクション法、 電気パルス法、 リポソ一ム法、 リン酸カル シゥム法等の公知の遺伝子導入法を用いることができる。
上記ラッ ト等の齧歯類などの動物の全能性細胞 （培養細胞） の核を、 除核末受精卵に移植して初期化すること （核移植） で卵子に S V 4 0の 温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子を導入すること ができる。 また、 前核期受精卵の雄生前核に S V 4 0の温度感受性突然 変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子をマイクロインジェクションし て得られる卵子を仮親の卵管に移植して産仔を得た後、 注入した遺伝子 を持つ産仔を選出し、 安定的にかかる遺伝子が組み込まれた個体を得る ことで、 個体発生時にすでに t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子が各組織 の細胞の染色体に組み込まれた遺伝子導入ラッ ト、 すなわちトランスジ エニックラットを効率よく作出することができる。
本発明の不死化血管周皮細胞は、 上記作出したトランスジエニックラ ットの大脳を摘出して緩衝液でよく洗浄し、 この大脳を細切りにし、 ホ モゲナイザ一で組織をすりつぶして得られたスラリーに緩衝液を加え、 遠心分離することによってペレツ トを得ることができる。 この得られた ペレッ トを酵素 （プロテアーゼ） 溶液に懸濁して振盪しながら酵素処理 し、 毛細血管を不要な組織から分離させた後、 再び遠心分離して得られ たペレットを 2 0 %のゥシ胎児血清を含む D M E Mに懸濁し、 この懸濁 液を培養シャーレに播種して 2回の継代培養の後、コロニー形成を行い、 増殖速度の比較的速いコロニーをべニシリンカップを用いて周囲の細胞 から単離し、 再びコロニ一形成を行い、 増殖速度の比較的速いコロニー をペニシリン力ップを用いて周囲の細胞から単離することができる。 上記単離した不死化血管周皮細胞は、 3 3〜 3 7 °Cにおいて永久的増 殖能を保持し、 3 9 °Cにおいては増殖を停止するための細胞固有の分化 形質の発現を制御することができるという特色を有している。 また、 単 離された不死化血管周皮細胞は温度感受性 S V 4 0ラージ T抗原、 P D G F受容体 ]3、 及びアンギオポェチン— 1の発現を R T— P C R及び Z 又はウェスタンプロッティング法で検出することにより同定することが できる。 この不死化血管周皮細胞株は、 5 0回の継代培養後においても 3 3 °Cで良好な増殖性を示し、 脳毛細血管周皮細胞としての機能を保持 している。
本発明の不死化血管周皮細胞株は、 血管壁変性疾患の研究や、 脳にお ける自己免疫疾患の研究や、 脳の栄養代謝及び恒常性機能障害に関連す る疾患の研究や、 固形腫瘍、 動脈硬化等の血管新生の関与する疾患の研 究ゃ、 これら疾患等の診断や治療方法の開発を細胞レベルで研究するの に有用である。 また、 本発明の不死化血管周皮細胞株は、 多くの細胞マ 一力一の発現を保持し、 高密度シャーレ上で培養するとカルシウム成分 を豊富に含むマトリックス塊構造が認められることから、 以下に示すよ うに、 血管周皮細胞を標的とした医薬品等の有用物質のスクリ一ニング に用いることができる。
本発明におけるスクリーニング方法としては、 被検物質の存在下、 上 記不死化血管周皮細胞株を培養し、 該細胞における P D G F受容体 |6 、 T h y— 1 、 I C A M— 1、 又はアンギオポェチン一 1等のマーカー夕 ンパク質の活性及びノ又は発現の程度を測定 ·評価する、 不死化血管周 皮細胞における分化形質発現の促進又は抑制物質のスクリーニング方法 や、 被検物質の存在下、 上記不死化血管周皮細胞株を培養し、 該細胞の 増殖の程度を測定 ·評価する、 不死化血管周皮細胞における増殖の促進 又は抑制物質のスクリーニング方法や、 被検物質の存在下、 上記不死化 血管周皮細胞株を高密度で培養し、 該細胞におけるマトリックス塊に沈 着したカルシウムの程度を検出 ·評価する、 不死化血管周皮細胞におけ るマトリックス塊カルシウム沈着の促進又は抑制物質のスクリーニング 方法等を挙げることができる。
上記不死化血管周皮細胞における分化形質発現の促進又は抑制物質の スクリーニングは、 不死化血管周皮細胞株を種々の濃度の被検物質の存 在下でそれぞれ培養し、 一定時間培養後に発現したマーカータンパク質 の量を検出'測定し、被検物質の不存在下に培養した対照のものと比較 · 評価することにより行われる。 例えば、 血管周皮細胞の表面マーカ一で ある P D G F受容体 や T h y— 1は、 それぞれ特異抗体を用いて常法 により免疫化学的に検出することにより測定することができる。 また、 血管壁細胞に特異的なアンギオポェチン一 1や I C A M— 1は、 相当す る m R N Aの発現量を常法により検出することにより測定することがで きる。 上記不死化血管周皮細胞における増殖の促進又は抑制物質のスク リーニングは、 不死化血管周皮細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下 でそれぞれ培養し、 一定時間培養後に細胞数や細胞の形態を測定，解析 し、 被検物質の不存在下に培養した対照のものと比較 ·評価することに より行われる。 また、 上記不死化血管周皮細胞におけるマトリックス塊 カルシウム沈着の促進又は抑制物質のスクリーニングは、 不死化血管周 皮細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ高密度培養し、 一 定時間培養後にマトリックス塊におけるカルシウム沈着を顕微鏡等によ り検出し、 被検物質の不存在下に培養した対照のものと比較 ·評価する ことにより行われる。
そして、 これらスクリーニング方法により得られる不死化血管周皮細 胞における分化形質発現の促進又は抑制物質や、 不死化血管周皮細胞に おける増殖の促進又は抑制物質や、 不死化血管周皮細胞におけるマトリ ックス塊カルシウム沈着の促進又は抑制物質は、 血管壁変性疾患、 血管 新生疾患、 脳における自己免疫疾患、 脳の栄養代謝及び恒常性機能障害 に関連する疾患などを有する患者を治療するのに用いられる治療薬、 予 防及び 又は症状改善剤として使用できる可能性があり、 有用である。 以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれ ら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例 1 (トランスジエニックラットの作出）
S V 40の温度感受性突然変異株 t S A 5 8の DNAを導入したトラ ンスジエニックラッ トは、 下記の手順で作出した。
(導入遺伝子の調製）
マイクロインジェクションには S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のゲノム DNAを使用した。 t s A 5 8のゲノム DNAを制限酵 素 B amH Iで開環し、 p B R 3 2 2の B a mH I部位に導入し、 S f i I配列を S a ellに変換して S V 4 0の複製起点 （o r i ) を欠失す る o r i (—） とした DNAクローン p S V t s A 5 8 o r i (—） 一 2 (Ohno T. et al" Cytotechnology, 165-172, 1991； 図 1参照） 力 ら常 法に従い導入用 DNAを調製した。 すなわち、 大腸菌内で大量に増幅さ
0 せることにより得られたプラスミ ド DNAの p S V t s A 5 8 o r i (一） 一 2を制限酵素 B amH I (宝酒造社製） で消化した後、 ァガロ ース電気泳動法 （ 1 %ゲル； ベーリンガー社製） により分離し、 ゲルを 溶解した後、 フエノール · クロ口ホルム処理及びエタノール沈殿処理を 行い DN Aを回収した。 回収した精製 DN Aを T Eバッファ一 （ 1 mM の E D T Aを含む 1 0 mMの T r i s —HC l ； H 7. 6 ) に溶解し て 1 7 0 g/m 1の精製 DN Aを含む溶液を得た。 この DN A溶液を 注入用バッファー （ 0. 1 mMの ED T Aを含む 1 0 mMの T r i s— H C 1 ； p H 7. 6) で 5 g/m 1 となるように希釈して注入用 D N A溶液を調製した。 なお、 調製した DNA溶液は注入操作まで— 2 0°C で保存した。
(トランスジエニックラットの作出）
ラット前核期受精卵への上記調製した注入用 DN A溶液のマイクロイ ンジェクションは下記の要領で行った。 性成熟した 8週齢のウイス夕一 ラットを明暗サイクル 1 2時間 （4 ： 0 0〜 1 6 ： 0 0を明時間）、 温度 2 3 ± 2°C、 湿度 5 5 ± 5 %で飼育し、 膣スメァにより雌の性周期を観 察して、 ホルモン処理日を選択した。 まず、 雌ラットにより 1 5 0 I U Zk gの妊馬血清性性腺刺激ホルモン （日本ゼンャク社製； PMS全薬 (pregnant mare serum gonadotropin： P S ) ) 腹腔内投 し、 その 48時間後に 7 5 I UZk gのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン （三共 臓 ¾社製； フべ口一ケノ (human chorionic gonadotropin： h C G ) ) を投与して過剰排卵処理を行った後、 雄との同居により交配を行った. h CG投与 3 2時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。 卵管 灌流及び卵の培養には mK R B液 （Toyoda Y. and Chang M.C,， J. Reprod. Fertil., 36, 9-22, 1974) を使用した。採取した受精卵を 0. 1 % のヒアルロニダーゼ （シグマ社製； Hyaluronidase Typel-S) を含む m 8液中で 3 7<0、 5分間の酵素処理を行い卵丘細胞を除去した後、 mKR B液で 3回洗浄して酵素を除去し、 D N A注入操作まで C O 2一 インキュベータ一内 （ 5 %の C O 2— 9 5 %の A i r , 3 7°C、 飽和湿 度） に保存した。 この様にして準備したラッ ト受精卵の雄性前核に前記 DNA溶液を注入した。 注入した 2 2 8個の卵を 9匹の仮親に移植して 出産させ 8 0匹の産仔を得た。 注入 DNAのラットへの導入は、 離乳直 後に断尾して得た尾より調製した DN Aを P CR法により検定した [使 用プライマー ； t s A 5 8 _ l A, 5 ' 一 TC C TAATGTGCAG T CAGGTG— 3 ' ( 1 3 6 5〜 1 3 84部位に相当）、 t s A 5 8 - I B, 5 ' -ATGAC GAGCTTTGGCACTTG- 3 ' ( 1 5 7 1〜1 5 9 0部位に相当）]。 その結果、 遺伝子導入の認められた 2 0 匹 （雄 6匹、 雌 8匹、 生別不明 6匹） の産仔の中から性成熟期間を経過 する 1 2週齢まで生存した 1 1ラインのトランスジエニックラット （雄 ライン： # 0 7— 2， # 0 7— 5 , # 0 9— 6， # 1 2— 3 , # 1 9— 5， 雌ライン： # 0 9— 7， # 1 1— 6, # 1 2— 5， # 1 2— 7 , # 1 8 - 5 , # 1 9— 8) を得た。 これらの G。世代のトランスジェニッ クラットとウィスターラットを交配し、 雄フアウンダ一の 2ライン （# 0 7 - 2, # 0 7— 5) と雌フアウンダ一の 3ライン （# 0 9— 7 , # 1 1— 6， # 1 9一 8) において次世代以降への遺伝子の伝達を確認し た。
実施例 2 (脳毛細血管周皮細胞の分離）
大脳からの脳毛細血管周皮細胞の分離は I c h i k aw aらの方法 (Ichikawa N et al" (1996) J. Pharmacol. Toxicol. Method., 36, 45-52)， C a p e t a n d e s らの方法 （Capetandes A and Gerristen ME (1990) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci" 31, 1738-1744) を改良して行つ た。 実施例 1で得られた S V 40の温度感受性突然変異株 t s A 5 8の
2 ラージ T扰原遺伝子を導入したトランスジエニックラッ ト （ 1匹） から 脳を摘出した。 摘出した脳は、 大脳以外の間脳、 脳管などを取り除いた 後、 クリーンベンチ内で氷冷した調製用緩衝液（ 1 2 2mMの N a C 1、 3mMの KC 1、 1. 4mMの C a C l 2、 1. 2mMの Mg S 04 - 7 H20、 0. 4mMの K2HP 04、 1 0 mMの G 1 u c o s e、 1 0m Mの H e p e s ； p H 7. 4) でよく洗浄した。 洗浄した大脳は、 組織 を 1〜 2 mm2に細切した。細切した組織を 1 0 mL用 Pottei'-Elvehjem ホモゲナイザー （東京理化器械社製） に移し、 大脳の 4倍量の氷冷した 調製用緩衝液を加え、 1 0回のアツプダウンのストロークを行い組織を ホモゲナイズし、 3 2 %のデキストランを含む P B Sを等量加え、 3回 のアップダウンのストロ一クを行いスラリーを得た。 このスリラーを遠 心 （4°C下、 45 0 0 gで 1 5分間） して得られるペレットを 2. 4m !Lの酵素溶液 [ 0 . 0 6 6 %の collagenase/dispase ( Boehringer Mannheim 社製）、 0. 0 3 3 %の B S A (シグマ社製） を含む P B S] に懸濁し、 振盪を加えた水溶中で酵素処理 （3 7 、 3時間） を行い、 不要な細胞外マトリックスを分離し、 遠心 （4°C下、 6 0 0 gで 5分間） してペレツ トを得た。 得られたペレツ トを 1 OmLの培養液 （ 1 0 0 U / m L の enzylpenicillin potassium、 1 0 0 /x g Z m L の streptomycin sulfate ¾ Δ . の amphotericin β、 2 0 % の F C Sを添加した DMEM) に分散して 4枚の 3 5 mm φ培養シヤー レ （Falcon社製） に種播した。 3 3での炭酸ガス培養器 （ 5 %の C02 — 9 5 %の A i r、 飽和湿度） 内で培養 （初代培養） した。 培地を 1週 間に 2回交換し、 継代はトリプシン液 （ 0. 0 5 %の Trypsin, 0. 5 31!11^の£0丁八 ； GibcoBRL社製） を用いておよそ 1週間隔で行った。 2回の継代の後、 1 04個の細胞を 1 0 0 mm φ培養シャーレ （Falcon 社製） に種播した。 培地を 1週間に 2回交換し、 7〜 1 0日後にコロニ
3 一を形成した増殖速度の比較的速いコロニーをぺニシリンカップを用い て周囲の細胞から単離し、 得られた 1 03個の細胞を再び 1 0 Ο πιιηφ 培養シャーレに種播して 3 3 °Cの炭酸ガス培養器内で培養してコロニー 形成を行った。 ベニシリンカップを用いて増殖速度の比較的速いコロニ —を周囲の細胞から単離して 2種の細胞株 （TR— P CT 1， TR- P C T 2 ) を得た。
この TR— P CT 1株は、 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に 関するブタぺスト条約に基づいて、 経済産業省産業技術総合研究所生命 工学工業技術研究所 （日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号 郵便番 号 3 0 5— 8 5 6 6 ) に受託番号 「N I BH F ERM B P— 7 0 2 4」 として寄託されている。
実施例 3 (ラージ T抗原タンパク質の確認）
実験例 2で得られた 2種の細胞株のラージ T抗原蛋白質を、 ウェス夕 ンブロッ ト法 （実験医学別冊マニュアル UPシリーズ 「分子生物学的ァ ブローチによる癌研究プロトコール」 1 0 8〜 1 1 5頁、 羊土社、 1 9 9 5年発行） により検出した。 2種の細胞株をそれぞれ P B Sで洗浄後、 1 mLの可溶化溶液 （ 1 %の S D S、 1 0mMの T r i s、 I mMの E DTA、 1 0 %の glycerin) で可溶化し、 1 0 0 °Cで 1 0分間加熱した 後、 遠心 （ 1 0 0 0 0 r pmで 1 0分間） して不溶画分を除去した後、 フラッ ドフォ一ド法 （P I ER C E社製 B C Aプロティンァッセィ試薬 Aを使用） で総蛋白質量を定量した。 それぞれ 1 O A gの蛋白質を S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で分離後、 ニトロセルロース膜に転 写した。 3 %のスキムミルク溶液でブロッキングした二トロセルロース 膜に 1次抗体として抗 S V 4 0ラージ T抗原マウス抗体 （D P 0 2— C ； CALBIOCHEM社製） を、 2次抗体として H R P標識抗マウス I g G抗体 （Amersham社製） を反応させ、 ラージ T抗原特異的な反応をァ
1 糞丁正ざれた用紙'^ !!9ϋ マシャム社製 E C Lウエスタンブロティング検出システム （R P N 2
14/1
訂正され 用紙 («Ι9ί》 0 6 M 1 ) を用いて検出した。 結果を表 1に示す。 この結果、 得られた 2種の細胞株全てにおいてラージ T抗原蛋白質を確認した。
Figure imgf000018_0001
実施例 4 (P DGF受容体 と T h y— 1の確認）
得られた細胞株を単層培養し、 細胞膜に発現された P DGF受容体 /3 と Th y— 1を免疫染色し、 顕微鏡を用いて確認した。 実施例 2で得ら れた細胞株 TR— P C T 1を 24 welldish (Falcon社製） のカバ一ダラ ス上で培養した。 培養液を除去し、 細胞を P B Sで洗浄した後、 0. 5 mLの固定液 （ 3. 6 %のパラホルムアルデヒド） を加え、 4°Cで 2 0 分間放置後、 P B Sでよく洗浄した。 0. 5mLの 3 %B SA— P B S を加え、 室温で 2時間放置してブロッキングした後、 1次抗体 （抗 PD GF受容体 j3ャギ抗体； Santacruze社製、 F I T C標識抗 Th y— 1マ ウス抗体； Phai'mingen社製） を室温で 1時間反応させた。 0. 1 %の B SA - P B Sで 5回洗浄後、 2次抗体 （F I T C標識抗ャギ I g G ； シグマ社製（PD GF受容体 3検出のみ使用）） を室温で 1時間反応させ. 0. 1 %の B S A— P B Sで 5回洗浄した。 最後に標識した細胞をグリ セリン封入液 （ 9 0 %の glycerol、 1 m g /mLの p-phenylendiainine, 0. 0 1 Mの N a 2H P〇4 ; p H 8. 5 ) で封入した。 観察は顕微鏡で 行った。 この結果、 細胞株 TR— P CT 1では細胞膜上に PDGF受容 体 j8、及び Th y— 1の発現を認めた。 また PD GF受容体 )3の発現は、 ウェスタンブロッ ト、 RT— P C Rにおいても確認した。 なお、 TR— P CT 2についても同様の結果が得られた。
実施例 5 (アンギオポェチン一 1 とォステオポェチン、 I CAM— 1の
5 確認）
得られた細胞株を単層培養し、 細胞に発現されたアンギオポェチン一
1とォステオポェチン （Osteopontin)、 I CAM— 1を RT— P CRに て検出した。 実施例 2で得られた細胞株 TR— P CT 1を 1 0 Οΐϊΐπιφ 培養シャーレ （Falcon社製） に培養した。 培養液を除去し、 細胞を P B Sで洗浄した後、 セルスクレーパー （Iwaki社製） にて細胞をかき集め、 RNA抽出試薬 （T r i z o 1 ； Gibco社製） にて全 RN Aを抽出した。 逆転写酵素 （RevTraAce： TOYOBO社製） を用いて、 抽出した全 RN A 1 / gから c DN Aを合成し、 P CR法 （ e xT a q ；宝酒造社製） にて発現を確認した。 P CR増幅産物の確認は、 5 %アクリルアミドゲ ルの電気泳動にて行った。 この結果、 細胞株 TR— P C T 1においてァ ンギオポェチン一 1 とォステオポェチン及び I CAM— 1の発現を確認 した。 なお、 T R— P CT 2についても同様の結果が得られた。
実施例 6 (高密度培養によるマトリックス塊カルシウム沈着の確認） 得られた細胞株を単層培養し、 マトリックス塊に沈着したカルシウム を v o n k o s s a染色にて確認した。 実施例 2で得られた 1 06個の 細胞株 T R— P C T 1 を、 DMEMにて 1 0 0 mm <|)培養シヤーレ (Falcon 社製） 及び 1 0 Οπιπιφ I型コラーゲンコ一ト培養シャーレ (Iwaki社製） に培養した。 1 0 ΟπΐΓηφ I型コラーゲンコート培養シ ヤーレの培養液には 1 0 mMの ]3—グリセ口リン酸を添加した。 3日後 培養液を除去し、細胞を P B Sで洗浄した後、 8 mLの固定液（ 0. 1 % のダルタールアルデヒドを含む P B S) を加え、 室温で 1 5分放置後、 蒸留水で 2回洗浄した。 8mLの 5 %の硝酸銀水溶液 （Wako 社製） を 加え遮光し、 室温で 3 0分放置した後、 5 %の硝酸銀水溶液を除去し、 蒸留水で 2回洗浄した。 シャーレは室温で 3 0分露光させ、 観察は顕微 鏡で行った。 この結果、 細胞株 TR— P C T 1ではマトリック塊にカル
6 シゥムの沈着を認め、 コラーゲンコート培養シャーレではカルシウム沈 着の増加を確認した。 なお、 T R—； P C T 2についても同様の結果が得 られた。 産業上の利用可能性
本発明によると、 血管壁変性疾患の研究、 脳の栄養代謝研究、 血管新 生研究、 脳における自己免疫疾患の研究、 血管周皮細胞を標的とした医 薬品のスクリーニング、 脳の栄養代謝及び恒常性機能障害に関連する疾 患の診断、 あるいはその治療方法の開発を細胞レベルで研究するのに有 用である不死化血管周皮細胞株を提供することができる。
1 7

Claims

請 求 の 範 囲
1. P D G F受容体 /3及びアンギオポェチン一 1の発現能を保持したこ とを特徴とする不死化血管周皮細胞株。
2. 脳毛細血管周皮細胞に由来することを特徴とする請求項 1記載の不 死化血管周皮細胞株。
3. S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子 を発現することを特徴とする請求項 1又は 2記載の不死化血管周皮細胞 株。
4. 高濃度培養によるマトリックス塊カルシウム沈着能を有することを 特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載の不死化血管周皮細胞株。
5. 齧歯類起源であることを特徴とする請求項 1〜4のいずれか記載の 不死化血管周皮細胞株。
6. 齧歯類がラットであることを特徴とする請求項 5記載の不死化血管 周皮細胞株。
7. 不死化脳毛細血管周皮細胞株 TR— P CT 1株 （FE RM B P—
7 0 24)。
8. S V 40の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子 を導入したトランスジエニックラットの大脳組織をホモジナイズして得 られる脳毛細血管をプロテアーゼ処理し、 得られる脳毛細血管細胞を継 代培養して、 温度感受性 S V 40ラージ Τ抗原、 PDGF受容体 3及び アンギオポェチン一 1を発現する不死化細胞を樹立することを特徵とす る不死化血管周皮細胞株の製造方法。
9. 不死化血管周皮細胞株が、 高濃度培養によるマトリックス塊カルシ ゥム沈着能を有することを特徴とする請求項 8記載の不死化血管周皮細 胞株の製造方法。
8
1 0 . 被検物質の存在下、 請求項 1〜 7のいずれか記載の不死化血管周 皮細胞株を培養し、 該細胞におけるマ一力一タンパク質の活性及び/ "又 は発現の程度を測定 ·評価することを特徵とする不死化血管周皮細胞に おける分化形質発現の促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
1 1 . マーカータンパク質が、 P D G F受容体JS、 T h y— 1、 I C A M— 1、 又はアンギオポェチン一 1であることを特徴とする請求項 1 0 記載の不死化血管周皮細胞における分化形質発現の促進又は抑制物質の スクリ一ニング方法。
1 2 . 被検物質の存在下、 請求項 1〜 7のいずれか記載の不死化血管周 皮細胞株を培養し、 該細胞の増殖の程度を測定 ·評価することを特徴と する不死化血管周皮細胞における増殖の促進又は抑制物質のスクリー二 ング方法。
1 3 . 被検物質の存在下、 請求項 1〜 7のいずれか記載の不死化血管周 皮細胞株を高密度で培養し、 該細胞におけるマトリックス塊に沈着した カルシウムの程度を検出 ·評価することを特徴とする不死化血管周皮細 胞におけるマトリックス塊カルシウム沈着の促進又は抑制物質のスクリ 一二ング方法。
1 4 . 請求項 1 0又は 1 1記載のスクリ一二ング方法により得られる不 死化血管周皮細胞における分化形質発現促進物質。
1 5 . 請求項 1 2記載のスクリーニング方法により得られる不死化血管 周皮細胞における増殖促進物質。
1 6 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法により得られる不死化血管 周皮細胞におけるマトリックス塊カルシウム沈着の促進物質。
1 7 . 請求項 1 0又は 1 1記載のスクリ一ニング方法により得られる不 死化血管周皮細胞における分化形質発現抑制物質。
1 8 . 請求項 1 2記載のスクリーニング方法により得られる不死化血管
9 周皮細胞における増殖抑制物質。
1 9 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法により得られる不死化血管 周皮細胞におけるマトリックス塊カルシウム沈着の抑制物質。
2 0
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