WO2001059454A1 - Procede de detection d'une substance - Google Patents

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WO2001059454A1
WO2001059454A1 PCT/JP2001/000833 JP0100833W WO0159454A1 WO 2001059454 A1 WO2001059454 A1 WO 2001059454A1 JP 0100833 W JP0100833 W JP 0100833W WO 0159454 A1 WO0159454 A1 WO 0159454A1
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carrier
signal
substance
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compound
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PCT/JP2001/000833
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French (fr)
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Akira Miike
Hideharu Mori
Original Assignee
Kyowa Medex Co., Ltd.
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    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a specific substance, a reagent for detecting a specific substance, and an apparatus for detecting a specific substance.
  • Landscape technology a method for detecting a specific substance, a reagent for detecting a specific substance, and an apparatus for detecting a specific substance.
  • the method of confirming the function of a protein is to start by searching for a substance having an affinity for the protein, and then to infer the role of the protein by genetically controlling the expression of the protein using an organism.
  • the protein to be purified is immobilized on a carrier, packed into a column, and substances that are presumed to have various affinities are passed through the column, and whether the substance passes through or is adsorbed on the column is detected. There is a way.
  • This chip uses a semiconductor technology to bind a specific protein to a specific location on the chip, contact a sample with this to bind a substance to the protein, and detect this bond with a label.
  • a semiconductor chip is used or fine processing is always required, and proteins immobilized on the chip bind to each other via something, detection is impossible. Atsushi.
  • gene mutations are being tested for use in diagnosing diseases and suppressing the effects and side effects of drugs.
  • gene mutations are diverse, it is necessary to prepare various types of DNA sequences and detect DNA that hybridizes in each case. You.
  • the DNA chip is used to solve this problem, but has the same problem as above.
  • beads of several ⁇ m in size are impregnated with various types of fluorescent dyes in various ratios, and the fluorescence emitted by these is analyzed at two wavelengths and the two wavelengths are analyzed.
  • the ratio of the fluorescence intensities is used as a means of discriminating individual beads, and the substance to be detected, such as protein or DNA sequence, is matched.
  • the beads are trapped in a small bottle and analyzed by fluorescence intensity.
  • An object of the present invention is to provide an inexpensive and highly versatile method for detecting a specific substance, a reagent for detecting a specific substance, and a device for detecting a specific substance.
  • the inventors of the present invention attached a signal A that can be read from the outside to a minute carrier, and bound a substance having a binding ability (hereinafter, referred to as a connector) to a substance to be detected such as protein or DNA.
  • a substance to be detected such as protein or DNA.
  • the carrier with the signal A and the detection device The same result as a protein or DNA chip can be obtained by binding a substance having a binding ability to a substance to be detected to a carrier even without a sophisticated protein or DNA chip technology. According to the present invention, it is easy to prepare a large number of carriers having a signal corresponding to the kind of the substance even when many completely different substances are similarly detected, and the experimenter can freely combine the signal and the sequence. Has the characteristic that it can be determined In the case of a protein or DNA chip, it is necessary to recreate a protein or DNA chip when changing the type of specimen, etc., and it is not versatile, but the carrier of the present invention has a substance such as protein or DNA bound thereto. It can be prepared by binding a desired protein or a substance such as DNA to a non-supporting carrier by a conventional method, and can easily cope with a variety of inexpensive substances.
  • the present invention relates to the following (1) to (36).
  • a carrier that has a shape that does not bind to the substance to be detected and that can bind to the substance to be detected (hereinafter abbreviated as a conjugate) via a spacer or without a discriminating signal.
  • a carrier having A and a sample containing the substance to be detected are mixed in a solution, the substance to be detected is bound to the connector, and the signal B is formed on the carrier by the binding.
  • a sample characterized in that the carrier suspension flows through the hollow tube by a solution supply means communicating with an empty pipe, and the signal A and the signal B are detected by the signal detection means, and the signal A and the signal B are associated with each other. Of the substance to be detected.
  • the signal B on the carrier is formed by binding a compound having a label capable of recognizing the hybridization between the base sequence of the connector and the base sequence of the substance to be detected (3) to (3).
  • a compound having a label capable of recognizing iv hybridization is labeled with a compound having a base sequence complementary to the remaining base sequence other than the complementary sequence to the base sequence of the connector of the substance to be detected.
  • the compound is a compound obtained by bonding with a compound
  • the compound having a base sequence complementary to the remaining base sequence other than the complementary sequence to the base sequence of the connector of the substance to be detected is a DNA having 5 to 500 bases: RNA or PNA The method described in the above statement 3 (8).
  • the compound having a label capable of recognizing the hybridization is a compound obtained by binding the labeling compound to the in-one-one-one-one-one-one-recognition reagent for recognizing the hybridization.
  • the labeling compound is a fluorescent substance, a luminescent substance, an enzyme, or a compound that emits fluorescence or luminescence by an enzyme.
  • the hollow tube has a cylindrical shape and the carrier has a cylindrical shape having an outer shape smaller than the inner diameter of the hollow tube, and the length of the cylindrical shape is larger than the inner diameter of the hollow tube.
  • the carrier is cylindrical and the outer diameter is 1 ⁇ !
  • Signal detectors A and B capable of detecting at least two types of signals A and B on a carrier coupled with or without a spacer, wherein the signal detectors A and B flow through the carrier.
  • the signal A on the carrier is associated with the specific substance, and the associated data is Equipped with a function to output to output means Characterized in that, the detection device of a specific substance.
  • the signal A and the signal B overlap with the cross section of the hollow tube.
  • Carrier that has a shape that does not move and that has an identifiable signal A in which a substance (conjugate) capable of binding to the substance to be detected is bound with or without a spacer. Is used.
  • the carrier used in the present invention is insoluble in a solution.
  • the signal A on the carrier may be any signal as long as it can be discriminated and identified, but a digital signal is preferred.
  • the digital signal is not particularly limited as long as it is a digitized signal, and may be a signal represented by a combination of bar codes, fine dots, fine lines, and the like, and a bar code is preferable.
  • the method of attaching the signal A to the carrier is not particularly limited.
  • a method using a printing device capable of printing fine barcodes, fine dots, fine lines, or the like A method of changing the reflectance or refractive index into a linear dot shape, using a lens, etc., to optically finely reduce the pattern consisting of barcodes, lines, and dots, A method of changing the properties and then applying a bar code by a physical treatment such as chemical treatment or adsorption of toner, etc., and a photosensitive polymer that cures or decomposes with light, including dyes, pigments, carbon
  • a method of applying a signal to the surface after coating and coating the surface, and then applying a signal by etching a method of composing the entire carrier with a photosensitive resin, an electromagnetic recording method And a method of causing a magnetic carrier on which a signal is recorded to be included.
  • the shape of the carrier is not particularly limited as long as the applied digital signal can be read from the outside.
  • the material does not move so as to overlap with the cross section of the hollow tube when flowing through the hollow tube.
  • a fine material is preferable in terms of operability and a large surface area per unit area.
  • the shape of a specific carrier used in a detection method using a hollow tube described later depends on the shape of the hollow tube, and includes a sphere, a polygonal column, a column, and the like. preferable.
  • the signal A can be read from any position by attaching a plurality of signals ⁇ such as a two-dimensional bar code to the surface of the sphere, or magnetic particles in the carrier In the detection, the carrier can be stopped by the magnetic force for a short time, and the specific surface of the sphere can be directed to the detection direction by the magnetic force.
  • a plurality of signals ⁇ such as a two-dimensional bar code
  • the diameter of the carrier for example, in the case of a cylindrical shape, the diameter is 1 ⁇ !
  • the length is preferably about 10 mm to about 2 cm.
  • the diameter is preferably about 1 m to 2 mm.
  • the specific gravity of the carrier is preferably about 0.8 to 2, more preferably 0.85 to 1.5, and particularly preferably 0.9 to 1.1.
  • the difference in specific gravity between the carrier suspension solution and the carrier is preferably 0.1 or less, more preferably 0.05 or less, and particularly preferably 0.3 or less.
  • Examples of the method of forming the carrier include a method of molding a polymer into a polygonal or cylindrical mold, and a method of cutting a polygonal or cylindrical fibrous material by various methods.
  • a particulate carrier is manufactured by a suspension polymerization method using a polymer monomer, an emulsion polymerization method, etc. You can also.
  • a film of a material that shrinks in one direction due to heat and a film of a material with little shrinkage are laminated, and after applying signal A and heating (with or without cutting), only one side is formed.
  • signal A and heating with or without cutting
  • Materials that shrink by heat include, for example, TFE shrink tubing, TOF shrink tubing, and Teflon shrink as described in Yamato Rika Co., Ltd.'s 2000 Plastic Scientific Instruments Integrated Power and Plastics edition. Examples include a fine or fibrous tube, a FEP shrink tube, and a nylon shrink tube.
  • the carrier or the surface thereof is preferably made of a substance that hardly adsorbs a substance to be detected, such as at least a protein or a compound having a base sequence.
  • the carrier is preferably hydrophilic, but even if it is a carrier, it is used because the surface can be finally physically treated or coated to reduce adsorption on the carrier surface. be able to.
  • the natural polymer to be coated include chitosan, protein, hyaluronic acid and the like.
  • the material of the carrier is not particularly limited, but is preferably a synthetic compound.
  • Synthetic polymers generally used as plastic fiber materials are inexpensive and preferred.
  • synthetic polymer compound used for the carrier for example, a synthetic polymer compound containing a hydroxyl group, an ester group, a carboxylamide group, an amino group, an imino group, a hydroxysuccinylester group, a maleimide group, a glycidyl group, or the like in a side chain is preferable.
  • Examples of the monomers constituting these synthetic polymer conjugates include acrylic anhydride, methyl acrylate, ethyl acrylate, methyl methacrylate, and ethyl methacrylate (the above is hydrolyzed after polymerization), Ethylene oxide-containing (meth) acrylates such as hydroxystyrene, ethylene glycol (meth) acrylate, and triethylene glycol (meth) acrylate, and (meth) acrylate hydrochloride Hydroxyl group-containing (meth) acrylic acid ester, glycidyl (meth) acrylate, etc.
  • Epoxy group-containing (meth) acrylate, methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) Monoethylenic compounds such as alkyl (meth) acrylates such as acrylates, acrylamide, methylacrylamide, diacetoacrylamide, N-hydroxymethylacrylamide, ethyleneimine, and hydroxysuccinyl acrylate. .
  • the synthetic polymer compound examples include a polymer composed of one of these monomers and a copolymer polymer composed of two or more of these monomers. These synthetic polymer compounds may form at least the surface layer of the carrier, and the inside may be a hydrophobic polymer such as polystyrene, polyacrylate, polyamide, or polyvinyl.
  • the surface to which the binder is bound, with or without a spacer, is preferably prepared to contain functional groups. Further, a high molecular compound obtained by making these polymers hydrophilic by a reaction is also used.
  • suitable polymer compounds include, for example, polymers of glycidyl methacrylate.
  • the synthesis of the polymer compound varies depending on the type of the monomer and the type of the polymer compound, but can be synthesized by a known method.
  • the spacer binds the carrier and the connector.
  • the spacer include polyethylene glycol diglycidyl ether chain, single-stranded DNA chain, single-stranded RNA chain, and single-stranded peptide nucleic acid (abbreviated as PNA) peptide. Chains and the like can be given.
  • the length of the polyethylene glycol diglycidyl ether chain is preferably 1 to 10 ethylene units, and more preferably 1 to 5.
  • the base sequence of the strand may be any, but it has an amino group at the base, adenine (A) or guar.
  • the length of the single-stranded DNA chain and the single-stranded RNA chain is preferably from 3 to 40 (Cmer), more preferably from 5 to 207- (mer).
  • the number of peptide chains is preferably 1 to 50 mer, and more preferably 2 to 30 mer.
  • the conjugate is not particularly limited as long as it is a substance capable of binding to the substance to be detected. Examples thereof include a substance having a base sequence complementary to the base sequence of the substance to be detected or a partial sequence thereof in the sample, a protein capable of binding to the substance to be detected, and a peptide.
  • the nucleotide sequence to be detected or its partial sequence is not particularly limited for detection as long as it has a nucleotide sequence, but nucleotide sequences derived from genes involved in various traits, genes involved in diseases, etc. Is preferred. Examples include the HCV gene, tumor suppressor gene sequence, WT-1, Klotho gene, Gyr B gene, drug resistance gene, obesity gene and the like.
  • proteins capable of binding to the substance to be detected include various receptors, antibodies against various antigens, and lectin proteins.
  • a ligand or an antigen that binds to the receptor or the antibody can be used.
  • the reception evening include a VEGF reception evening, an IL-2 reception evening, an Fc reception evening, and the like.
  • Antibodies include, for example, anti-HCV antibodies, anti-HBs antibodies, anti-HBe antibodies, anti-GAD antibodies, anti-CRP antibodies, anti-CEA antibodies, and anti-HCV antibodies.
  • the protein may be a protein extract from a tissue extract, a cell extract, or a gene obtained by introducing a gene for a required protein into a cell or the like and expressing the protein. Can be introduced to form a connector.
  • the binder is a low molecular weight compound
  • the low molecular weight compound can be used as it is as long as it is a substance having a functional group. It can be.
  • DNA and RNA DNA, RNA and the like having a functional group introduced into the terminal can be used as the conjugate.
  • the number of bases of the substance having a base sequence to be detected or a base sequence complementary to a partial sequence thereof in the sample is 5 to 500 bases, more preferably 10 to 300 bases, and particularly preferably 15 to 200 bases. It is a DNA, RNA or PNA having a base sequence complementary to the base sequence to be detected normally.
  • the base sequence of the substance can be designed based on these known sequences.
  • the substance having the base sequence include: For example, a single-stranded DNA chain, a single-stranded RNA chain, a single-stranded DNA and the like can be mentioned.
  • a nucleotide sequence of the substance to be detected in the present invention a nucleotide sequence of a gene known to have an internal point mutation of a known sequence can also be applied.
  • the position of the base complementary to the mutation-causing base in the bond is preferably three or more bases at both ends of the bond, and particularly preferably the center of the bond.
  • a conjugate having a base sequence complementary to the base sequence of the substance to be detected in the sample or a partial sequence thereof for example, when the conjugate is DNA, use a carrier such as a sily force to perform a chemical synthesis reaction of DNA. It can be synthesized by using a solid phase method or the like which has been automated by the solid phase method.
  • a reaction substrate a nucleotide derivative obtained by protecting the amino group of base and 5'-OH of ribose with a protecting group and bonding diisopropylphosphoramidite to 3'- ⁇ H of ribose is used.
  • the protecting group for the amino group of the base examples include a benzoyl group and an isobutyl group
  • examples of the protecting group for 5′-OH of ribose include a dimethoxytrityl group.
  • the starting material is a column in which a nucleotide of any of adenine, thymidine (T), cytosine, and guanine, whose amino and 5'-OH groups are protected, is fixed to the support via 3'-OH.
  • T thymidine
  • cytosine cytosine
  • guanine whose amino and 5'-OH groups are protected
  • both bonds are converted into stable phosphotriester bonds with iodine and water.
  • the cycle of the detritylation and the condensation reaction is repeated, and finally, the deprotection group and cleavage from the support are performed by ammonia treatment.
  • DNA as a target connector can be synthesized.
  • the primer is a single-stranded DNA
  • the sequence may be further synthesized continuously, and its length is preferably 3 bases or more, and thereby the DNA spacer is synthesized. Can be synthesized.
  • a method of binding a protein as a binder to the carrier surface includes a side chain or terminal carboxyl group amino group, glycidyl group, thiol group, hydroxyl group, amide group, imino group, hydroxysuccinyl ester group, and maleimide group. , Such, 2 It is desirable to have a group that can react and chemically bond, but if there is no such group, a method of exposing these groups that can be reacted by physical or badly treatment such as UV or radiation may be used. It is possible. It is also possible to coat the surface with another polymer to create a functional group.
  • a generally known chemical method for example, a method of binding an amino group to a carboxyl group of a protein with a functional group on the carrier is known. Condensation with carbodiimide, etc., or the reaction of a carboxyl group with an active ester to react with an amino group, or a method in which a thiol or maleimide is attached to a carrier, and then reacted with the maleimide dithiol group of the binder.
  • any method can be used, such as a method in which an isothiocyanate group, a glycidyl group, or an N-hydrosuccinimide group is added to this, and this is reacted with an amino group of a connector.
  • the carrier thus prepared may be treated with BSA or the like to suppress nonspecific adsorption or reaction, and then subjected to blocking.
  • the binding between the protein and the carrier can be performed, for example, as follows. Ammonium hydroxide or hexamethylene diamine hydrochloride is added to the carrier particles in an amount of 10 to 100 times the molar amount of the epoxy group, and 0.5 to 2 at 60 to 70 ° C and a pH of 10 to 12. After reacting for days, the surface of the particles is aminated. After the reaction, the mixture is washed by centrifugation, and if necessary, dialyzed with ion-exchanged water to remove unreacted hydroxylamine or hexamethylenediamine hydrochloride.
  • a polyethylene glycol diglycidyl of 50 to 200 times the molar amount of the amino group is added, and the pH is adjusted to 10 to 12 at a temperature of 2,0 to 40 ° C.
  • the spacer and the carrier are bound.
  • the bonding between the epoxy group of the spacer and the protein is performed according to the method described above.
  • the carrier used to bind DNA or the like to the carrier surface includes a carboxyl group, a amino group, a glycidyl group, a thiol group, a hydroxyl group, an amide group, an imino group, and a hydroxysuccinyl ester group having a side chain or a terminal on the carrier surface.
  • a compound having a group that can react and chemically bond, such as a maleimide group or the like, can be used as it is. However, even if there is no such group, such a group can be obtained by physical or chemical treatment such as UV or radiation. 3 It can be used by exposing the available groups.
  • the surface can also be coated with another polymer to create functional groups.
  • a generally known chemical method for example, a carbodiimide known as a method of binding DNA or the like to an amino group ⁇ carboxyl group on the surface of the carrier is used.
  • a carbodiimide known as a method of binding DNA or the like to an amino group ⁇ carboxyl group on the surface of the carrier is used.
  • condensation with a carboxyl group as an active ester and reaction with an amino group or attaching a thiol or maleimide to a carrier and reacting it with DNA having a maleimidothiol group or isothiocyanate on the carrier.
  • Any method can be used, such as a method in which a mono-, glycidyl, or N-hydrosuccinimide group is added and reacted with an amino group.
  • a method of synthesizing DNA or the like by successively polymerizing nucleic acid bases on the carrier surface using a method known as DNA synthesis method or the like can also be used.
  • the bonding method of the carrier, the spacer, and the connector can be determined according to the type of the spacer, the type of the carrier, and the type of the connector.
  • the carrier is generally obtained by bonding the amino group of the base at the terminal of the DNA connector to the epoxy group, carboxyl group, aldehyde group, hydroxyl group, etc. of the carrier or spacer.
  • the connector is DNA
  • the carrier is generally obtained by bonding the amino group of the base at the terminal of the DNA connector to the epoxy group, carboxyl group, aldehyde group, hydroxyl group, etc. of the carrier or spacer.
  • the connector is DNA
  • the binding between the DNA binder and the carrier is performed, for example, as follows.
  • a DNA connector having a spacer of DNA and a single-stranded DNA having a sequence complementary to the connector and having no spacer sequence are synthesized.
  • the two are hybridized to form a double strand, the amino group in the base having the base sequence to be detected is protected, and the amino group in the base of a part of the free spacer (an amino group is introduced into the terminal as necessary) Is bonded to the epoxy group of the carrier.
  • the single-stranded DNA having a sequence complementary to the binder and having no spacer sequence can be released to prepare the desired carrier-bound DNA binder.
  • the carrier prepared in this manner can be treated with BSA or the like in order to suppress nonspecific adsorption or reaction, and then subjected to blocking.
  • Hybridization requires formamide, salt, protein, stabilizer, buffer as required And so on.
  • this solution is referred to as a hybridization solution.
  • the formamide concentration is 0-60%.
  • the salt include inorganic salts such as sodium chloride and potassium chloride, and organic acid salts such as sodium citrate and sodium oxalate.
  • the salt concentration is 0 to 2.0 M, preferably 0.15 to 1 M. .0 M.
  • proteins include serum albumin and the like.
  • stabilizer include ficoll.
  • the buffer include a phosphate buffer and the like, and the concentration is preferably 1 to 10 O mM.
  • single-stranded DNAs synthesized in a hybridization solution are added at an equimolar concentration, and the mixture is added at 50 to 90 ° C. It can be done by heating for a minute to 6 hours and then gradually cooling.
  • the carrier particles having an epoxy group are washed with 1 to 100 mM phosphate buffer solution, and after equilibration of the particles, the carrier particles are mixed with the carrier in the same solution as the buffer solution used for washing. This is performed by mixing the double-stranded DNA having a spacer of the single-stranded DNA prepared by the method described above, and keeping the mixture at 20 to 50 ° C for 5 to 50 hours. After removing unreacted DNA by washing with an aqueous solution containing 1 to 3 M salts such as sodium chloride, unreacted epoxy groups present on the carrier are added to a Tris-HCl buffer solution at room temperature for 5 to 5 minutes. Keep the ring warm for 50 hours. Thus, double-stranded DNA bound to the carrier is prepared.
  • washing is performed by using a hybridization solution at 50 to 90 ° C. and centrifuging 1,000 to 100,000 g several times.
  • the spacer is polyethylene glycol diglycidyl
  • the binder is a DNA chain
  • the carrier has an epoxy group on the surface
  • the binding between the DNA binder and the carrier is performed by the aforementioned spacer and the binder. This can be performed in the same manner as in the case where the carrier is single-stranded DNA and the carrier has an epoxy group on the surface.
  • the specific connector S 1 When coupling the connector to the carrier having the signal A described above, the specific connector S 1 is coupled to the carrier having the signal A 1. Similarly, another connector S 2 is bound to the carrier with A 2 of signal A. For example, a specific connector S1 is coupled to a carrier to which a barcode signal 01 is allocated, and another specific connector S2 is coupled to a carrier to which a barcode number 02 is allocated.
  • the types of the binders that can be detected in one reaction as long as the specific binder can be associated with the signal A and identified.
  • the biopsy sample used for the detection is prepared as it is from various organs, tissues, blood, etc. or by a method for extracting and purifying nucleic acid molecules such as low molecular compounds, proteins, DNA, RNA and the like.
  • the sample used for detection is DNA or RNA
  • it can be prepared by a known DNA or RNA extraction method from various organs, fibres, blood, and the like.
  • the isolated DNA or RNA is cleaved with a specific restriction enzyme or the like and contains a specific base sequence to be detected.A single strand having a length of 5 to 500 mers, preferably 10 to 300 mers.
  • the base sequence of DNA or the like in the sample those amplified by PCR, TMA or NA SBA can also be used.
  • TMA or NA SBA can also be used as the base sequence of DNA or the like in the sample.
  • Invention of the present application In the above, when a base sequence in a biological sample is detected, it is only necessary to fragment DNA and the like. Not only biological samples but also compounds having a base sequence produced by synthesis or the like can be used as samples.
  • the binding between the substance to be detected and the conjugate in the sample is performed with an aqueous solution containing salts, proteins, stabilizers, buffers, surfactants, and the like, as necessary.
  • the salt include inorganic salts such as sodium chloride and sodium chloride, and organic acid salts such as sodium citrate and sodium oxalate.
  • the salt concentration is 0 to 2.0 M.
  • the protein include serum albumin.
  • the buffer include a phosphate buffer and the like, and the concentration is preferably 1 to 10 O mM.
  • the binding can be carried out by heating at 10 to 70 ° C .:! To 60 minutes, and then cooling if necessary.
  • a carrier having an identifiable signal A in which a connector is bound with or without a spacer and a sample containing a substance to be detected are mixed in a solution, and the substance to be detected and the carrier are mixed.
  • the following describes a method for combining the above-mentioned connectors to form a new signal B on the carrier.
  • the connector when the connector is a protein, it can be carried out as follows.
  • the signal B may be any signal as long as it is a signal resulting from the binding between a substance such as a protein to be detected and a substance such as a protein on the carrier (one of them is a protein).
  • the increase in weight may be measured directly using the resonance phenomenon, but a method in which a labeled compound is bound to an antibody that recognizes the substance to be detected and the label is used as signal B, or an antibody that recognizes the connector
  • the connectors are linked via a substance to be detected such as a protein, the signal A of one of the connectors can be detected as the signal B.
  • the conditions for binding the protein to be detected and the conjugate are usually performed in an aqueous solution under conditions that do not alter the protein.
  • an aqueous solution having a buffer capacity of about PH 3-11 which may contain a surfactant or an auxiliary agent for maintaining the function of the protein
  • the temperature is preferably 1 to 90 ° C. Is about 5 to 60 ° C.
  • the labeled compound not bound to the conjugate and the remaining substances in the sample are then Separation and removal are performed by centrifugation or filtration.
  • the labeling compound examples include a fluorescent substance, a luminescent substance, an enzyme, and a compound which emits or emits fluorescence by the enzyme.
  • the fluorescent substance examples include fluorescein isothiocyanate (hereinafter abbreviated as FTC), Texas Red (Texas Red), and the like.
  • Examples of the luminescent label include an acridinium derivative and a ruthenium complex compound.
  • U.S. Pat.Nos. 4,918,192, 4,946,58, 4,950,613 and Clin.Chem. 29 (8), 1474-1479 ( 1983) are preferred.
  • the ruthenium complex compound is preferably the one shown in Clin. Chem. 37 (9), 1534-1539 (1991), and this compound emits electrochemical light with an electron donor.
  • Examples of the substrate that is a compound that emits fluorescence or light by an enzyme include, for example, a substrate for peroxidase, such as a lumino-irradiated compound and a lucigenin compound.
  • a substrate for peroxidase such as a lumino-irradiated compound and a lucigenin compound.
  • Akurin two ⁇ beam phosphate Derivatives such as APS 2, APS 3, and APS 5 are listed above [Lumigen Inc's luminescent compound, H. AMiavan-Tafti'Z. Arghavaiii et al John Wileyana Sons, Cnichester, 497-500 (1997)].
  • the labeling compound is a fluorescent substance
  • the fluorescent substance is also bound to the carrier, and when exposed to light, the phenomenon in which the other fluorescent substance bound by energy transfer from one fluorescent substance emits fluorescence. It can also be used for labeling.
  • a small hollow tube through which the solution containing the carrier passes is placed in the detection section of the fluorescence detector.
  • Methods such as those currently used all over Celso can also be suitably used.
  • a light source is not required, but if necessary, a reagent for starting light emission or a device for applying energy is preferably provided.
  • a photon counter with high sensitivity is suitable, but if the luminescence is strong, the optical section of a fluorescence detector can also be used.
  • a signal having an identifiable signal A in which a conjugate having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence to be detected or a partial sequence thereof is bound with or without a spacer.
  • the carrier and the sample containing the base sequence to be detected are mixed in a solution, and the base sequence to be detected and the base sequence having a complementary base sequence on the carrier are hybridized, whereby a new The method for forming the signal B on the carrier is described below.
  • the signal B may be any signal as long as it is formed by hybridization between the base sequence to be detected and a base sequence having a complementary base sequence on the carrier and is caused by a double strand. May be measured, but a method of binding a compound having a label capable of recognizing hybridization forming a duplex is preferable.
  • the compound having a marker capable of recognizing hybridization between the base sequence of the connector and the base sequence of the sample include, for example, a residue other than the complementary sequence to the bond between the labeled compound and the specific base sequence in the sample.
  • a compound in which a base sequence complementary to a base sequence is bonded (hereinafter abbreviated as a labeled conjugate), and a labeled compound is bound to an antibody that recognizes hybridization between the base sequence of the conjugate and the base sequence of the sample
  • a labeled conjugate A compound in which a compound, a labeled compound, and an intercalator that recognizes hybridization between the base sequence of the connector and the base sequence of the sample are combined.
  • Hybridization is performed under stringent conditions using the above-mentioned hybridization solution.
  • a sample containing a DNA binder-binding carrier and a DNA fragment is added to the hybridization solution, and the mixture is added at 50 to 90 ° C, preferably 60 to 75 ° C, for 1 minute to 24 hours.
  • a compound that has not hybridized to the connector has a base sequence that is complementary to the intermediate bond in the sample, and a compound that does not form a complex with the carrier that has signal A.
  • Recognition of hybridization between the labeled compound, the base sequence of the binder and the base sequence of the sample, and the compound in which the base sequence complementary to the remaining base sequence other than the complementary sequence to the base sequence If necessary, centrifuge the compound that binds to the antibody, or to the compound that binds the labeled compound, the base sequence of the conjugate and the base sequence of the sample, and the compound that recognizes the hybridization. Alternatively, they are separated by a filtration operation or the like.
  • the detection of a compound or the like that has been combined with a curry or the like can be performed according to the type of label of the compound.
  • Examples of the labeling compound include the compounds described above, for example, a fluorescent substance, a luminescent substance, or a compound which emits fluorescence or light by an enzyme.
  • a compound such as ethidium diamide or 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochlonden n-Hydcate (DAPI) SYBR Green (produced by oleculai' Probe), Pico Green (produced by Molecular Probe 2-methyl-4,6-bis- (4- —, ⁇ -dimethylaminophenyl) pyrylium (manufactured by Canon Inc.), 2-methyl-4,6-bis-1 (4- ⁇ , ⁇ - Examples include dimethylaminophenyl) thiopyrylium (manufactured by Canon Inc.).
  • a light-emitting compound such as acrylidium ester which can decompose and emit no light under alkaline conditions if not hybridized can be suitably used.
  • a DNA conjugate having a sequence complementary to the sequence near the hybridization site is separately added and hybridized, and then the unhybridized labeled conjugate is removed. It is preferable that the labeling conjugate is bound to only the hybridized product.
  • a method using a centrifugal separation filter is preferable. No, instead of removing the labeled conjugate that has not been hybridized, the labeled conjugate that has not been hybridized may be inactivated.
  • the labeling compound is a fluorescent substance
  • the fluorescent substance is also bound to the carrier, and when exposed to light, the phenomenon that one fluorescent substance that is hybridized by energy transfer from one fluorescent substance emits fluorescence is used It can also be labeled.
  • D ⁇ ⁇ in the sample or the hybridization portion of RNA A label to which a fluorescent substance of DNA having a sequence complementary to the sequence of the close part is bound is added and hybridized. When light is applied, energy is transferred from one fluorescent substance to the other fluorescent substance, and only the hybridized substance emits fluorescence, so if there is no complementary DNA sequence or RNA on the carrier, the fluorescence is weak or no, Those with complementary DNA or RNA sequences on the carrier will be or will have strong fluorescence.
  • the part of a small hollow tube through which the solution containing the carrier passes is placed in the detection part of the fluorescence detector.
  • Methods such as those currently used all over Celso can also be suitably used.
  • a light source is not required, but it is preferable to provide a reagent for starting light emission or a device for applying energy.
  • a photon counter with high sensitivity is suitable, but if the luminescence is strong, the optical unit of a fluorescence detector can also be used.
  • the hollow tube is formed of a thin tube and has a cylindrical shape
  • the hollow tube has a shape that allows the carriers to pass through the cylindrical shape one by one in the longitudinal direction.
  • the solution supply means connected to the hollow tube preferably has a hollow tube portion which gradually narrows and continues to the minute empty tube. It is preferable to use a method in which the carrier is finally communicated with a hollow tube having a diameter set so that two carriers cannot pass at a time through the tube of the solution supply means that gradually narrows. Carriers can be prevented from being clogged by loosely narrowing. .
  • a carrier hybridized with DNA or RNA or a non-hybridized carrier is allowed to pass through the hollow tube.
  • the hybridized carrier emits or emits light, or ⁇ ⁇ indicates the emission intensity.
  • the carrier signal is related to the corresponding base sequence, and the presence or absence of the DNA or RNA sequence to be detected is displayed. As a result, it is possible to detect the presence of a base sequence corresponding to the signal shown in the carrier having fluorescence or luminescence (or strong fluorescence or luminescence intensity) in the sample.
  • the detector If it takes a long time for the entire carrier to pass because the detector is small, use multiple detectors for signal and fluorescence or luminescence. In addition, they can be installed in parallel in the flow channel, and the information detected by each detection unit can be accumulated in the data processing means and analyzed.
  • This solution is passed through a tube with a small hollow tube through which the above-mentioned carrier passes one by one.
  • the signal A of the carrier and the carrier when the base sequence to be detected is present in the sample
  • the signal B formed above can be detected almost simultaneously, but may be detected separately as long as it can be determined that the signals A and B originate from the same carrier.
  • many devices have been developed to read digital signals accurately, but any device that can read minute signals can be used as long as it has the ability to read minute signals.
  • a method of reading a minute digital signal there is a method of optically enlarging, for example, a method of reading with a principle such as no-code evening scan, or a method of once capturing an image with a CCD camera or the like and enlarging or directly reading it with a reading device. And a method of irradiating a carrier with a minute laser and reading with reflected light or transmitted light.
  • a method of optically reading with a laser is preferable as in the case of CD and the like.
  • the concentration of a substance to be detected, such as DNA, in a sample can also be determined by preparing a calibration curve using a known amount of a substance to be detected, such as sample DNA, in advance.
  • a lysate of a certain cell as a sample various proteins or low-molecular compounds are bound to the carrier, and a fluorescently labeled compound or a luminescent labeled compound is bound to an antibody against the various proteins or low-molecular compounds bound to the carrier as a label. If you use something, If a substance having an affinity for various bound proteins or low-molecular-weight compounds is present in the sample, the labeled antibody cannot react, and the conjugate corresponds to a carrier to which no fluorescently labeled compound or luminescently labeled compound is bound. This means that a substance with high affinity exists in the sample, and the search for the substance in the cells can be found in one operation.
  • DNA when DNA is bound to the carrier, it is possible to detect the presence of a protein having affinity for the DNA, for example, a protein that binds to the DNA expression promoter. Further, in this case, when a substance capable of binding the proteins attached to the carriers is present in the sample, the two carriers associate with the surface where the binder is present facing each other. At the time of detection, the substance can be detected by adjusting the direction of a bar code or the like and the time interval of detection so that this association can also be determined.
  • the present invention can also be applied to elucidating the function of a protein encoding such a sequence of unknown function.
  • the gene fragment is located 5 ′ upstream, and a gene sequence encoding a green fluorescent protein (hereinafter referred to as GFP) is ligated to the 3rd and downstream sites, and the protein encoded by the gene is fused to GFP.
  • GFP green fluorescent protein
  • the labeling compound used in the above examples is not necessarily GFP, and any protein can be used as long as it can express a protein from a gene by genetic engineering and has a certain signal itself.
  • aequorin and luciferase Enzymes such as can also be used in the detection system.
  • a certain protein and a protein or a low-molecular substance that binds to the protein or a substance that acts on the protein such as Promote interact and bind in a solution that is close to the conditions in the living body.
  • the protein is attached to a carrier, an interacting substance is added thereto, and the mixture is incubated to form a complex of the protein and the substance interacting with the protein on the carrier.
  • the surfaces bound by the two carriers face each other and associate.
  • a labeled compound that binds to the complex and reveals its type is further reacted to detect the presence or absence of the label. In this way, it can be determined whether or not there is a protein and a substance that interacts with the protein.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the device of the present invention.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the device of the present invention.
  • Fifty carriers having barcode 01 are dispersed in 10 ml of HEPES buffer, and have a base sequence of SEQ ID NO: 1 consisting of 15 bases having an amino group at the 5 ′ end.
  • the carrier to which the oligo DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is bound is blocked in a 1% BSA solution, washed with distilled water, and a barcode 01 to which the oligo DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is bound.
  • the terminal 5 AAA in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is inserted as a spacer.
  • oligo DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 consisting of 15 bases having an amino group at the terminal is bound to 50 carriers having barcode 02, and the same treatment is performed.
  • a carrier having a barcode 02 to which an oligo DNA having a sequence was bound was prepared.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • An oligo DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 having a sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 was prepared, and TE buffer solution (lOmmo 1 / L Tris, 1 mmo 1 / L EDTA) was dissolved at a concentration of 1 nmo 1 / ml to prepare a test solution.
  • Oligo DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 that has a sequence that is not complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, and dissolve it in TE buffer at a concentration of 1 nmo1 / m1. To prepare a specimen.
  • the detection apparatus shown in FIG. 1 was prepared, and barcode and fluorescence were detected while passing each solution prepared in ⁇ 13 (5) through a hollow tube in the signal detection means.
  • the barcode reader uses a hand laser scanner SL-114 manufactured by Niei Intec Co., Ltd.
  • the c- fluorescence detector uses a Hitachi F-4000 fluorescence spectrophotometer and emits light at an excitation light wavelength of 495 nm and an emission wavelength of 520 nm. The strength was measured.
  • the hollow tube was a quartz glass tube with an inner diameter of 2 mm and a flow rate of 0.6 cm / sec. Since the time difference between the barcode signal and the fluorescence signal detection was 36 seconds, the fluorescence signal on the carrier with the specific barcode was matched according to the time difference. '
  • the maximum value of the fluorescence intensity monitored while taking noise into account was defined as the fluorescence intensity
  • the average of the fluorescence intensities of the five barcode 02 carriers having the same base sequence was defined as 1.
  • the fluorescence value corresponding to the barcode 01 carrier was remarkably high.
  • the fluorescence value corresponding to the carrier having any of the barcode signals is not obtained.
  • the low level indicates that the specific sequence can be specifically detected by the method of the present invention.
  • Example 1 the average of the fluorescence intensities of the carriers of the five barcodes 02 having the same base sequence was indicated as 1, as in Example 1.
  • Acrydinium I (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) is bound to oligo DNA having an amino group at the 6th guanine from the 5 'end of the oligo DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 3, to prepare a 2 nmo 1 / ml solution. (Hereinafter acridinium labeling conjugate Abbreviated).
  • Sample DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 4 prepared in (4) of Example 1 in 500 ⁇ L of sulf at e, 0.4 mol L LiCl, 2 Ommo 1 / L EGTA, 2 Ommo 1 / L EDTA Then, add 10 ⁇ L of the sample DNA or TE solution having the base sequence of SEQ ID NO: 5, and further add the above-mentioned acridinium-labeled conjugate solution to 0.1 lpmol / L, and slowly add each at 60 ° C.
  • the detection was performed using an apparatus in which the signal detecting means in FIG. 1 was changed to FIG.
  • the sample after the reaction was passed through a Ju part, after detecting a signal at barcode one drill one da one further second figure 2mo 1 LN a OH solution containing 0. 03% H 2 0 2
  • the mixture was introduced into the sample from the reagent supply means shown in (1) and mixed with the sample in a tube.
  • the luminescence intensity was measured using the detection unit of a Lumicounter 2500 luminescence detector (Microtech Nichion). A clear chemiluminescence count could be detected only in the sample that had reacted with DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 on the carrier with the barcode.
  • a carrier having signal A was produced in the same manner as in Example 1 (1).
  • WSC water soluble carbodiimide
  • the sil group was succinimidated, the carrier was once washed with the same buffer, and immediately thereafter, 10 ml of a buffer containing anti-human immunoglobulin chain antibody l ⁇ mo1 / ml was added to immobilize the antibody.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the fluorescent binding source solution prepared in (3) above was added to 10 ml of 0.05mo 1 / L HEPES buffer (pH7) containing 5 each of the carriers having the barcodes 01 and 02 prepared in (2) above.
  • A, 100 L and solution B, 100 ⁇ L were added to the mixture and heated at 37 ° C. for 30 minutes under slow stirring. '
  • the carrier prepared in (3) above was added to 10 ml of 0.05mo1 / L HEPES buffer (pH7) containing 5 carriers each having the barcodes of 01 and 02 produced in (2) above.
  • the combined i solution 100 / L and solution B, 100 ⁇ L was added, and the mixture was heated at 37 ° C for 30 minutes under slow stirring.
  • a detector as shown in Fig. 1 and Fig. 2 was prepared, and the barcode and fluorescence were detected while passing the X and Y solutions prepared in (4) above through the hollow tubes in the detector.
  • Bar code reader is Nichiei Intec's laser scanner S L-11
  • Hitachi F-40000 type fluorescence spectrophotometer was used to measure at an excitation light wavelength of 495 nm and a fluorescence wavelength of 5200 nm.
  • the hollow tube was a quartz glass tube with an inner diameter of 2 mm and a flow rate of 0.6 cm / sec. Since the difference between the barcode signal and the fluorescence signal detection was 36 seconds, the fluorescence signal on the carrier having a specific barcode was matched according to the time difference.
  • the maximum value of the fluorescence intensity monitored while considering the noise was defined as the fluorescence intensity, and the average of the fluorescence intensities of the five barcode 02 carriers was indicated as 1.
  • the fluorescence value corresponding to the carrier of the barcode 01 was remarkably high. That is, in the sample X having human IgG reacting with the anti-human IgG of barcode 01, the fluorescence corresponding to the carrier of barcode 01 is strongly detected, and in the case of sample Y, the barcode 0 is detected.
  • the fluorescence values corresponding to the two carriers were remarkably high. That is, in sample Y having human IgM reacting with anti-human IgM of barcode 02, fluorescence corresponding to the carrier of barcode 02 was strongly detected.
  • the fluorescence value did not increase, so that the method of the present invention was able to specifically detect a protein ( ⁇ 3 ⁇ 4) that reacts with a specific protein (antibody).
  • a FITC-labeled polypeptide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 consisting of 15 amino acids containing an avidin-binding peptide sequence having FITC at the amino terminus was synthesized, and a concentration of 2 nmol / ml in PBS containing 0.1% BSA. was dissolved in to prepare a food solution.
  • FITC-labeled polypeptide having a base sequence of SEQ ID NO: 15 consisting of 15 amino acids and excluding an avidin-binding peptide sequence having FITC at the amino terminus was synthesized, and 0.1 mM BSA / PBS was added to 2 nmol. Specimens were prepared by dissolving at a concentration of 1 / ml.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 prepared in (2) above was added to 10 ml of 0.05mo 1ZL HEPES buffer solution (pH 7) containing 5 carriers each having the barcodes of 01 and 02 produced in (1) above.
  • the sample, the sample having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or the polypeptide-free 0.1% BSA / PBS was added in an amount of 100 zL, and the mixture was heated at 37 ° C for 30 minutes with gentle stirring.
  • the mixture was filtered through a cellulose acetate 0.8 ⁇ m membrane filter (C080A047A, manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.), washed twice with 0.05 mol / L HEPES buffer (pH 7), and washed again with the same buffer.
  • the carrier was dispersed in 10 ml.
  • the detection devices shown in FIGS. 1 and 2 were prepared, and the barcode and the fluorescence were detected while passing each solution prepared in the above (3) through the hollow tube in the detection device.
  • the barcode reader uses a hand laser scanner SL-114 manufactured by Niei Intec Co., Ltd.
  • the fluorescence detector uses a Hitachi F-400 fluorescence spectrophotometer, and the excitation light wavelength is 495 nm and a fluorescence wavelength of 520 nm.
  • the hollow tube was a quartz glass tube with an inner diameter of 2 mm and a flow rate of 0.6 cmZ seconds. Since the difference between the barcode signal and the fluorescence signal detection was 36 seconds, the fluorescence signal on the carrier with a specific barcode was matched according to the time difference.
  • the fluorescence intensity is shown as the maximum value of the fluorescence intensity monitored while taking noise into consideration, and the average of the fluorescence intensities of the five barcode 02 carriers when there is no sample is shown as 1. .
  • the fluorescence value corresponding to the barcode 01 carrier was remarkably high. That is, in the sample of SEQ ID NO: 1 having a peptide sequence that reacts with avidin of barcode 01, the fluorescence corresponding to the carrier of barcode 01 is strongly detected, while in the case of the sample of SEQ ID NO: 2 and no sample, Since the corresponding fluorescence value of the carrier having any of the barcode signals did not increase, the polypeptide sequence specifically reacting with a specific protein (avidin) could be detected by the method of the present invention.
  • the present invention provides an inexpensive and highly versatile method for detecting a specific base sequence, a reagent for detecting a specific base sequence, and a method for detecting a specific base sequence.
  • SEQ ID NO: 1 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 2 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 3 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 4—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 5—Artificial Sequence Description: Synthetic DNA SEQ ID NO: 6 Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide SEQ ID NO: 7 Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide

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Description

物質の検出方法
技術分野
本願発明は、 特定の物質を検出する方法、 特定の物質を検出する試薬および特 定物質を検出する機器に関する。 景技術 明
近年、 人や動物、 植物、 菌類おょび«田物等の遺伝子情報が解読されて、 次々 に新規な遺伝子が発見されている。 しかし、 その新規な造伝子が作る蛋白質の機 能についてはほとんど未解明であり、 この機能が確認されるまでには長い時間と 労力が必要である。従って、 効率的な蛋白質の機能解析方法の開発が非常に緊急 な課題になっている。
蛋白質の機能を確認する方法としては、 蛋白質に親和性のある物質を探ること から始められ、 .その後生物を利用し遺伝子的にその蛋白質の発現をコントロール して蛋白質の役割を推測することが行われるが、 蛋白質と物質の親和性を検出す ることが重要なことである。 その方法としては、 精製される蛋白を担体に固定化 してカラムに充填し、 これに種々の親和性のあると推測された物質を通過させ、 通過するかあるいはカラムに吸着するかを検出する方法がある。
近年この効率的な方法として、 蛋白質を固定ィ匕しこチップが開発されている
[BioEssays, 21,781 (1999) ] 。 このチップは半導体の技術を使用し、 チップ 上の特定の場所に特定の蛋白質を結合させておき、 これに試料を接触させて蛋白 質に物質を結合させ、 この結合を標識によって検出する方法であるが、 半導体の チップを使用することや、 常に微細な加工が必要であり、 また、 チップに固定化 された蛋白質が、 何かを介して互いに結合するような場合には検出が不可能であ つた。 さらに一旦チヅプを作成すると別の種類の蛋白質などを容易に追加するこ とも不可能であり、 チップを再製造する必要があった。
また、 遺伝子の変異を検査し、 病気の診断や薬の効果や副作用の抑制に利用す ることが行われつつある。 しかし遺伝子の変異は多種多様であるため、 多種類の D N A配列を用意し、 おのおのにハイプリダイズする D NAを検出する必要があ る。 D NAチップは、 これを解決する目的で使用されているが上記と同様の問題 があった。
また、 ビ一ズアレイと言って、 数〃 mの大きさのビーズに 2〜 3種の蛍光色素 を種々の割合で含浸させておき、 このものが発する蛍光を 2波長で解析してその 2波長における蛍光強度の比を個々のビーズの判別手段にして、 蛋白質、 D NA 配列等の検出すべき物質を対応させ、 結合またはハイブリダィズ後、 微小なボケ ヅトにビーズをトラヅプして蛍光強度で解析を行う方法 [米国特許第 5 8 4 3 7 6 7号、 Analytical Chemistry, Q(7)， 1242 (1998)] などが知られている。 しか しながらこの方法は微小な穴があけられた特殊なデバイスを使用するため、 測定 には高度なテクニックが必要であり、 また、 2波長の蛍光強度比の微妙な違いで 識別するため、 判別能が低く、 多くの種類の蛋白質もしくは何万もの多くの種類 の D N Aに対応できないこと、 微小な検出用マイク口ゥェルにビーズが取り込ま れる際に、 検体からくるゴミゃ周りの環境から落ちてくるゴミなどが混入した場 合ノイズになるなどの問題点を有する。 また、 これらの方法では、 何かを介して または介さず直接に蛋白同士が親和性を持っていても検出することが出来ないと いう欠点がある。
従って、 安価で汎用性の高 ヽ特定物質の検出方法の開発が望まれている。 発明の開示
本願発明の目的は、 安価で汎用性の高い特定の物質を検出する方法、 特定の物. 質を検出する試薬および特定物質を検出する機器を提供することである。
本願発明者らは微小な担体に外部より読みとり可能な信号 Aを付け、 これに蛋 白もしくは D NA等の検出すべき物質に結合能を有する物質 （以下、 結合子とい う）を結合させたものを多種類用意し、 これを混合し、検体中の物質と結合させ、 新たな信号 Bを形成させ、 比較的簡単な装置でこの信号 Aと Bをほぼ同時に検出 し、 対比させて解析すれば蛋白もしくは D NAチップなど高価なものを使用しな くても、 多様な蛋白質および D N A配列等の検出すべき特定物質を検出すること ができることを見いだし本願発明を完成させた。
すなわち、 本願発明方法によれば、 信号 Aの付された担体と検出装置により、 高虔な蛋白質もしくは D N Aチップ技術がなくとも検出すべき物質と結合能を有 する物質を担体に結合させることで蛋白質もしくは D NAチップと同様の結果を 得ることができる。 本願発明は多くの全く違つた物質を同様に検出する場合でも 'その物質の種類に相当する信号を持った担体を多数用意することが簡単であり、 信号と配列の組合わせは実験者が自由に決定できるという特徴を有する。蛋白質 もしくは D N Aチヅプの場合は検体の種類等を代える場合蛋白質もしくは D N A チップを改めて作成し直すことが必要で、 汎用性がないが、 本願発明の担体は蛋 白質もしくは D N A等の物質が結合していない担体に、 所望の蛋白質もしくは; D NA等の物質を従来の方法で結合させることで作製でき、 安価で多様な物質に簡 単に対応できるものである。
本願発明は、 以下 （1 ) 〜 （3 6 ) に関する。
( 1 ) 溶液に懸濁しかつ信号 Aおよび信号 Bを検出可能な信号検出手段中に 形成された信号検出用中空管に貫流させたとき該中空管の横断面に対して重複し て移動することのない形状を有する担体であって、 検出すべき物質に結合能を有 する物質 （以下、 結合子と略記する） をスぺ一サ一を介しまたは介さず結合させ た識別可能な信号 Aをもつ担体と、 検出すべき物質を含有する試料とを溶液中で 混合し、 検出すべき物質と該結合子を結合させ、 該結合により信号 Bを担体上に 形成せしめた後、 該中空管に連通する溶液供給手段により該担体懸濁液を該中空 管に貫流させ、 該信号検出手段により信号 Aおよび信号 Bを検出し、 信号 Aと信 号 Bを関連づけることを特徴とする試料中の検出すべき物質の検出方法。
( 2 ) 検出すべき物質が、 特定の塩基配列を有する物質であり、 結合子が検 出すべき物質の塩基 ΐ己列もしくはその部分配列と相補的塩基配列を有する物質で ある上記 ( 1 )記載の検出方法。
( 3 ) 検出すべき物質と結合子との結合が、 相補的塩基配列によるハイプリ ダイズにより行われる上記 ( 2 )記載の検出方法。
( 4 ) 識別可能な信号 Αが、 結合子の塩基配列と閧連づけられたものである 上記（3 )記載の方法。
( 5 ) 担体が、 結合子の塩基配列と関連づけられた相互に識別可能な信号 A を有し、 相互に異なる信号 Aを有する複数の担体の混合物である上記 （3 )記載 の方法。 ，，
(6) 結合子が、 塩基数 5〜500の DNA、 RNAまたは P NAである上 記（2)〜 （5)のいずれかに記載の方法。
(7) 担体上の信号 Bの形成が、 結合子の塩基配列と検出すべき物質の塩基 配列とのハイプリダイゼ一シヨンを認識可能な標識を有する化合物を結合させる ことにより行われる上記 （3)〜 （6)のいずれかに記載の方法。
(8) ノ、イブリダィゼ一シヨンを認識可能な標識を有する化合物が、 検出す べき物質が有する、 結合子の塩基配列に対する相補配列以外の残余の塩基配列に 相補的な塩基配列を有する化合物と標識化合物とを結合させた化合物である上記
(7)記載の方法。 '
(9) 検出すべき物質が有する、 結合子の塩基配列に対する相補配列以外の 残余の塩基配列に相補的な塩基配列を有する化合物が、 塩基数 5〜500の DN A、 ： RNAまたは PNAである上言 3 (8)記載の方法。
(10) ノ、イブリダィゼ一シヨンを認識可能な標識を有する化合物が、 該ハ イブリダィゼーシヨンを認識する抗体と標識化合物とを結合させた化合物である ±13 (7)記載の方法。
(11) ハイプリダイゼ一ションを認識可能な標識を有する化合物が、 該ハ ィプリダイゼ一シヨンを認識するイン夕一カレ一夕一と標識化合物とを結合させ た化合物である上記 ( 7 )記載の方法。
(12) 担体と結合していない標識を有する化合物を担体から分離する工程 を含む上記（11)記載の方法。
(13) 標識化合物が、 蛍光物質、 発光物質、 酵素または酵素により蛍光も しくは発光を発する化合物である上記（7)〜（12)のいずれかに記載の方法。
(14) 担体が蛍光を発する物質を結合させたものであり、 標識化合物がェ ネルギートランスファーにより蛍光を発する化合物である、 上記 (13)記載の 方法。 ,
(15) ノ、ィプリダイゼ一シヨンを認識可能な標識を有する化合物が、 イン 夕一力レーシヨンにより信号: Bを生成する化合物である上記 7記載の方法。
(16) 結合子が検出すべき物質と結合能を有する蛋白質である上記 ( 1 ) 記載の方法。
(17) 識別可能な信号 Aがデジタル信号である上記 （ 1 )〜 （ 16 ) のい ずれかに記載の方法。
(18) デジタル信号 Aが、 磁気的または光学的である上記 （17)記載の 方法。 '
(19) デジタル信号 Aが、 バーコ一ドである上記 （17)記載の方法。 (20) 中空管の形状が円柱形でありかつ、 担体が該中空管の内径よりも小 さい外形を有する円柱形であって、 該円柱形の長さが該中空管の内径よりも大き いものである上記 （1)〜 （19)のいずれかに記載の方法。
(21) 担体が、 円柱形または球形である上記（1)〜 （20)のいずれか に記載の方法。
(22) 担体が磁性粒子を内在するものである上記 （21)記載の方法。 (23) 担体が円柱形であり、 外径が直径 1〃11！〜 2 mmであり、 長さが 1
0〃m〜2 cmである上記 (1)〜 （22)のいずれかに記載の方法。
(24) 担体の比重が、 0. 8〜2. 0である上記 (1)〜 （23)のいず れかに記載の方法。
(25) 担体の表面が、 樹脂でコ一ティングされたものである上記 （ 1 ) 〜 (24)のいずれかに記載の方法。
(26) 検出すべき物質に結合能を有する結合子をスぺ一サ一を介しまたは 介さず結合させた識別可能な信号 Aを有する担体。 、
(27) 結合子が検出すべき塩基配列もしくはその部分配列と相補的塩基配 列を有するものである上記 (26)記載の担体。
(28) 結合子が検出すべき物質に結合能を有する蛋白質である上記（26) の担体。
(29) 磁性粒子を内在する担体である上記 （ 26 )〜 （ 28 ) のいずれか に記載の担体。
(30) 信号 Aがデジタル信号である上記（ 26 )〜 （ 29 ) のいずれかに 記載の担体。
(31) デジタル信号が、 バーコ一ドである上記 (30)記載の担体 (32) 担体が、 円柱形または球形である上言己 (26) 〜 （31) のいずれ かに記載の担体。
(33) 担体が円柱形であり、 外径が直径 1〃π！〜 2 mmであり、 長さが 1 0〃m〜2 cmである上記 （26) 〜 （32) のいずれかに記載の担体。
(34) 担体の比重が 0. 8〜2. 0のである上記 （26) 〜 （33)のい ずれかに記載の担体。
(35) 担体の表面が樹脂でコーティングされている上記 (26) - (34) のいずれかに記載の担体。
(36) 信号検出手段、 デ一夕入力手段、 データ処理手段およびデータ出力 手段を有し、 該信号検出手段は、 検出すべき塩基配列もしくはその部分配列と相 補的塩基配列を有する結合子をスぺーサーを介しまたは介さず結合させた担体上 にある少なくとも二種類の信号 Aおよび Bを検知可能な信号検出器 Aおよび Bを 備え、 該信号検出器 Aおよび Bは、 該担体を貫流させる中空管を有し、 該担体は 該中空管の横断面に対して重複して移動しない構造を有し、該デ一夕処理手段は、 データ入力手段から入力される担体上の信号 Aと関連づけられた検出すべき特定 物質を特定するデ一夕と信号検出手段により検出された信号 Aおよび Bとから、 担体上の信号 Aと該特定物質を関連づけ、 該閧連づけたデータをデータ出力手段 に出力する機能を備えることを特徴とする、 特定物質の検出装置。
以下、 本願発明について詳細に説明する。
本願発明では、 溶液に懸濁しかつ信号 Aおよび信号 Bを検出可能な信号検出手 段中に形成された信号検出用中空管に貫流させたとき該中空管の横断面に対して 重複して移動することのない形状を有する担体であって、 検出すべき物質に結合 能を有する物質 （結合子） をスぺ一サ一を介しまたは介さず結合させた識別可能 な信号 Aをもつ担体を用いる。
本願発明において用いる担体は、 溶液に不溶性のものである。
担体上の信号 Aとしては、 分別して識別可能であればいかなる信号でもよいが デジタル信号が好ましい。 デジタル信号としては、 デジタル化された信号であれ ば特に制限がなく、 バーコ一ド、 微小なドット、 微細な線などのあるなしの組合 せで表された信号等があげられ、 バーコードが好ましい。 担体に信号 Aを付ける方法としては、 特に制限がないが、 例えば微細なバーコ —ド、 微小なドット、 微細な線などを印刷することができる印刷機器を使用する 方法、 微細なレーザー光線によって表面の反射率や屈折率を線ゃドッ卜の形に変 える方法、 レンズなどを使用してバーコードや線、 ドットからなるパターンを光 学的に微細に縮小し、 光の当たった部分の表面の性質を変化させ、 その後化学処 理ゃトナ一などを吸着させる等の物理的な処理でバーコ一ドを付ける方法、 光に よって硬化または分解する光感受性のポリマーに色素や顔料、 カーボンなどを含 有させて表面をコ一トしたのち信号を表す形に光を照射し、 その後エッチングを 行って信号を付する方法、 担体全体を光感受性樹脂で構成する方法、 電磁気的な 記録法によつて信号が記録された磁気担体を内在させる方法等があげられる。 担体の形状としては、 付与されたデジタル信号が外部から読みとれる开狱であ れば特に制限がない。特に中空管に貫流させた時に該中空管の横断面に対して重 複して移動する开狱でないものが好ましい。操作性、 ί«あたりの表面積が大き い点で微小なものが好ましい。特に、 後述する中空管を使用する検出方法に使用 する具体的担体の形状としては、 該中空管の形状にもよるが、 球形、 多角柱形、 円柱形等があげられ、 円柱形が好ましい。形状が球形であっても、 例えば 2次元 のバーコ一ド等の信号 Αを球の表面に複数付すことにより信号 Aがどの位置から も読みとれる様なものである場合、 あるいは担体中に磁性微粒子を内在させて検 出時、 短時間磁力により担体の移動を止め、 磁力によって球の特定の面を検出方 向に向かせることなどすることにより使用することができる。
担体の大きさとしては、 例えば円柱形の場合、 直径 1〃π！〜 2 mm程度が好ま しく、 円柱形の長さは 1 0〃m〜 2 c m程度が ましい。球状の場合、 直径 1〃 m〜 2 mm程度が好ましい。 '
また担体の比重は、 0 . 8〜2程度が好ましく、 0 . 8 5〜1 . 5がより好ま しく、 0 . 9〜1 . 1が特に好ましい。担体懸濁溶液と該担体の比重差は、 0 . 1以下が好ましく、 0 . 0 5以下がより好ましく、 0 . 0 3以下が特に好ましい。 該担体を形作る方法としでは、 多角形、 円柱形の型に高分子を成形する方法、 多角形、円柱形の繊維状のものを種々の方法で切断する方法があげられる。また、 高分子のモノマーを用いる懸濁重合法、 乳化重合法等により粒子状の担体を製造 することもできる。 中空の円筒形の場合は熱によって一方向に収縮する素材と収 縮の少ない素材のフィルムを積層し、 信号 Aを付けた後 （裁断もしくは裁断なし に）加熱を行うことによつて一面のみが収縮することによって円筒形が形成でき る。
熱によって収縮する素材としては、 例えば山登理科 （株） の 2 0 0 0年プラス チック科学機器総合力夕口グ、 プラスチヅク編に記載されている T F E収縮チュ —ブ、 T O F収縮チューブ、 テフロン収縮チューブ、 F E P収縮チューブ等を細 かくまたは繊維状にしたものや、 ナイロンシユリンカプルチューブなどがあげら れる。
特に担体または'その表面は少なくとも蛋白質や塩基配列を有する化合物等検出 すべき物質を吸着しにくい物質からなるものが好ましい。 担体は親水性のものが 好ましいが、 担体カ 泳性のものであっても、 最終的に表面を物理的に処理また は被覆処理して担体表面の吸着を少なくすることも可能であるため用いることが できる。 被覆する天然高分子としては、 例えばキトサン、 蛋白質、 ヒアルロン酸 等があげられる。
担体の素材としては、 特に制限はないが合成化合物が好ましい。 例えば、 ポリ ァクリル酸またはそのエステル類、 ポリメタァクリル酸またはそのエステル類、 ホリエ一テル類、 ポリカーボネート類、 ポリエステル類、 ポリアミド類、 ポリウ レ夕ン類、 ポリイミド類、 ポリスチレン類、、 ポリブタジエン、 ポリクロ口プレン や、 これらの共重合体、 これらの混合物があげられる。 一般にプラスチックゃ繊 維材料として使用されている合成高分子が安価で好ましい。
担体に使用する合成高分子化合物としては、例えば側鎖に水酸基やエステル基、 カルボキシル アミド基、 アミノ基、 イミノ基、 ヒドロキシサクシニルエステ ル基、 マレイミド基、 グリシジル基などを含む合成高分子化合物が好ましい。 こ れら合成高分子ィ匕合物を構成するモノマーとしては、 例えばァクリル酸無水物、 アクリル酸メチル、 アクリル酸ェチル、 メタアクリル酸メチル、 メタアクリル酸 ェチル （以上は重合後加水分解する） 、 ヒドロキシスチレン、 エチレングリコ一 ル (メタ) ァクリレート、 トリエチレングリコ一ル (メタ) ァクリレート等のェ チレンォキサイド含有 （メタ） アクリル酸エステル、 （メタ） アクリル酸ヒドロ キシメチル、 （メタ）ァクリル酸ヒドロキシプロビル等のヒドロキシル基含有（メ 夕） アクリル酸エステル、 グリシジル （メタ） ァクリレート等のエポキシ基含有 (メタ) ァクリル酸エステル、 メチル (メタ) ァクリレート、 ェチル (メタ) ァ クリ'レート等のアルキル （メタ） アクリル酸エステル、 アクリルアミド、 メ夕ク リルアミド、 ジァセトアクリルアミド、 N—ヒドロキシメチルアクリルアミ ド、 エチレンィミン、 ァクリル酸ヒドロキシサクシニルエステル等のモノエチレン性 化合物があげられる。
該合成高分子化合物としては、 これらのモノマ一 1種からなるポリマ一及び 2 種以上からなる共重合体ポリマーがあげられる。 これら合成高分子化合物は担体 の少なくとも表面の層を形成すればよく、 内部は例えばポリスチレン、 ポリアク リル酸エステル、 ポリアミド、 ポリビニル等の疎水性高分子であってもよい。 ス ぺーサ—を介しまたは介さずに結合子を結合させる表面は、 官能基を含むように 調製されることが好ましい。 また、 これらポリマーを反応により親水化させた高 分子化合物も用いられる。 具体的に好適な高分子化合物の例としては、 例えばグ リシジルメ夕クリレートのポリマーがあげられる。
該高分子化合物の合成は、 モノマーの種類及び高分子化合物の種類によって異 なるが、 公知の方法で合成できる。
スぺーサ—とは、担体と結合子を結合するものである。該スぺ一サ一としては、 例えばポリエチレングリコールジグリシジルエーテル鎖、 一本鎖 D NA鎖、 一本 鎖 R NA鎖、 一本鎖ペプチド核酸 （peptide nucleic acidヽ P NAと略す）ヽ ぺプ チド鎖等をあげることができる。 ポリエチレングリコールジグリシジルェ一テル 鎖の長さとしては、ェチレン単位が 1〜 1 0が好ましく、 1〜 5がより好ましい。 また、 一本鎖 D'N A鎖及び一本鎖 R N A鎖をスぺ一ザに用いる場合の該鎖の塩基 配列はいかなるものでもよいが、 塩基にアミノ基をもつ、 アデニン （A) 、 グァ ニン （G) 、 シトシン （C) を末端に有するものが好ましい。 これらの一本鎖 D N A鎖及び一本鎖 R N A鎖の長さとしては、 3〜 4 0マ一 Cm e r )が好ましく、 5〜2 07— (m e r ) がより好ましい。 ペプチド鎖数としては、 1〜5 0マ一 (m e r ) のものが好ましく、 2〜3 0マ一 （m e r ) のものがより好ましい。 結合子としては、 検出すべき物質に結合能を有する物質で有れば特に制限が無 0 く、 例えば試料中の検出すべき物質が有する塩基配列もしくはその部分配列と相 補的塩基配列を有する物質、 検出すべき物質に結合能を有する蛋白質、 へプチド 等があげられる。
検出すべき塩基配列もしくはその部分配列としては、 塩基配列を有するもので あれば検出のために特に制限がないが、 各種の形質に関与する遺伝子、 疾患に関 与する遺伝子等に由来する塩基配列が好ましい。例えば、 HCV遺伝子、 癌抑制 遺伝子配列、 WT-1, Klotho遺伝子、 Gyr B遺伝子、薬剤耐性遺伝子、 肥満遺伝子等があげられる。
検出すべき物質に結合能を有する蛋白質としては、 各種レセプ夕一、各種抗原 に対する抗体、 レクチン蛋白質等があげられる。 また、 結合子としては、 該レセ プ夕一または抗体に結合するリガンドまたは抗原を用いることができる。 レセプ 夕一としては例えば、 VEGFレセプ夕一、 IL-2レセプ夕一、 Fcレセプ夕一 等があげられる。 抗体としては、 例えば抗 HCV抗体、 抗 HBs抗体、 抗 HBe 抗体、 抗 GAD抗体、 抗 CRP抗体、 抗 CEA抗体、 抗。ペプチド抗体、 抗イン シュリン抗体、 抗 BNP抗体、 抗トロポニン T抗体、 抗酸化 LDL抗体、 抗 TB G L抗体、 抗 M P B 64抗体、 抗テロメラ一ゼ抗体等があげられる
結合子は蛋白の場合は組織の抽出液、 菌体抽出液、 または必要な蛋白質の遺伝 子を菌体ゃ細胞などに導入し、 発現させたものなどから、 精製した蛋白質をその ままあるいは官能基を導入して結合子とすることができる。 また結合子が低分子 ィ匕合物の場合は低分子化合物が官能基を有する物質であればそのまま結合子とす ることができるが、 官能基を有しないものは官能基を付けて結合子とすることが できる。 DNA、 RNAの場合は末端に官能基を導入した DNA、 RNA等を結 合子とすることができる。
試料中の検出すべき塩基配列もしくはその部分配列と相補的塩基配列を有する 物質の塩基数としては、 5〜500塩基、 より好ましくは 10〜300塩基、 特 に好ましくは 15〜 200塩基である。通常検出する塩基配列に相補的塩基配列 を持つ DNA、 RNAまたは PNA等である。
結合子が塩基配列を有する物質である場合、 当該物質の塩基配列はこれら公知 の配列に基づいて設計することができる。該塩基配列を有する物質としては、 例 1 えば一本鎖 D NA鎖、 一本鎖 RNA鎖、 一本鎖 P NA等があげられる。 また、 本 願発明で検出すべき物質が有する塩基配列としては、 既知配列の内点突然変異を 起こしていることが知られている遺伝子の塩基配列も適応できる。 この場合、 変 異を起こしている塩基と相補的な塩基の結合子中の位置としては、 結合子の両端 の 3塩基以上内側であることが好ましく、 結合子の中央部であることが特に好ま しい。
試料中の検出すべき物質が有する塩基配列もしくはその部分配列と相補的塩基 配列を有する結合子は、 例えば該結合子が D N Aの場合は、 D N Aの化学合成反 応をシリ力等の担体を用いた固相法により自動ィ匕した 0 八合«等を用いて合 成できる。 反応基質には、 塩基のアミノ基及びリボースの 5 ' — O Hを保護基で 保護し、 リボースの 3 ' —〇Hにジイソプロピルホスホアミダイトを結合させた ヌクレオチド誘導体を用いる。 塩基のァミノ基の保護基としては、 ベンゾィル基 又はイソブチル基等が、 リボースの 5 ' —O Hの保護基としては、 ジメトキシト リチル基等があげられる。 塩基配列に従って、 アミノ基及び 5 ' — O H基を保護 されたアデニン、 チミジン （T) 、 シトシン、 グァニンのいずれかのヌクレオチ ドを 3 ' —O Hを介して支持体に固定したカラムを出発材料とし、 酸によるトリ チル基の除去 （5， —〇Hの形成） 後、 3， 末端にホスホアミダイト基を持つ上 述のヌクレオチド誘導体をテトラゾールなど適当な縮合剤のもとに付加する。 さ らに両者の結合をヨウ素と水で安定なリン酸トリエステル結合に変換する。 この 脱トリチルイ匕と縮合反応のサイクルを繰り返し、 最後にアンモニア処理により脱 保護基及び支持体からの切断を行う。 以上の操作で目的の結合子としての D N A を合成できる。 また、 スぺ一サ一がー本鎖 D NAの場合は更にその配列を連続し て合成すればよく、 その長さは好ましくは 3塩基以上であり、 これにより、 D N Aのスぺ一サ一を持つ D N A結合子が合成できる。
結合子をスぺーサ一を介しまたは介さず結合させた識別可能な信号 Aをもつ担 体の調製法について以下説明する。
担体表面に結合子として例えば蛋白質を結合させる方法としては、 担 面に 側鎖や末端のカルボキシル基ゃァミノ基、 グリシジル基、 チオール基、 水酸基、 アミド基、 イミノ基、 ヒドロキシサクシニルエステル基、 マレイミド基、 など、 2 反応して化学的に結合できる基があるものが望ましいが、 この様なものがない場 合には UV、 放射線など物理的またはィ匕学的な処理によってこれら反応できる基 を露出させる方法も可能である。 また表面に別のポリマーをコーティングし、 官 能基を作ることも可能である,。
この担体の反応可能な基に蛋白質などを結合させる方法としては、 一般に知ら れている化学的な方法、 例えば蛋白質のアミノ基ゃカルボキシル基を担体上の官 能基と結合させる方法として知られているカルボジィミドなどによる縮合やカル ボキシル基を活性エステルにしてアミノ基と反応させる方法、 またチオールまた はマレイミ ドを担体に付けておき、 これに結合子のマレイミドゃチオール基と反 応させる方法や担体にィソチォシアナ一ト基、 グリシジル基、 N—ヒドロサクシ イミド基をつけておき、 これと結合子のァミノ基と反応させる方法など、 いずれ も用いることができる。 また、 この様にして作成した担体は非特異的な吸着や反 応を抑制するために B S Aなどで処理してプロヅキングを行っても良い。
スぺ—サ一がポリェチレングリコールジグリシジル、 結合子が蛋白質であり、 担体が表面にエポキシ基を有する場合、 蛋白質と担体の結合は、 例えば以下のよ うに行うことができる。 担体粒子に水酸化アンモニゥム又はへキサメチレンジァ ミン塩酸塩をエポキシ基の 1 0〜： L 0 0倍モル量加え、 6 0〜7 0 °C、 p H '1 0 〜1 2で 0 . 5〜2日間反応させ、 粒子表面をァミノ化する。 反応後、 遠心分離 により洗浄し、 必要に応じてイオン交換水により透析をおこない未反応の水酸ィ匕 アンモニゥム又はへキサメチレンジァミン塩酸塩を除く。 アミノ基を導入した担 体に、 ァミノ基の 5 0〜2 0 0倍モル量のポリエチレングリコ一ルジグリシジル を加え p H 1 0〜1 2、 温度 2, 0〜4 0 °Cで 0 . 5〜2日間反応させることでス ぺーサ一と担体とを結合させる。 スぺ一サ一のもつエポキシ基と蛋白質の結合は 前述の方法に従って行う。
担体表面に D NAなどを結合させるために用いる担体としては、 担 ί 面に側 鎖や末端のカルボキシル基ゃァミノ基、 グリシジル基、 チオール基、 水酸基、 ァ ミド基、 イミノ基、 ヒドロキシサクシニルエステル基、 マレイミド基など、 反応 して化学的に結合できる基があるものはそのまま使用できるが、 この様な基がな いものであっても UV、 放射線など物理的または化学的な処理によってこれら反 3 応できる基を露出させる方法により使用することができる。 また表面に別のポリ マーをコーティングし、 官能基を作ることもできる。
この担体の反応可能な基に D N Aなどを結合させる方法としては、 一般に知ら れている化学的な方法、 例えば担体表面のアミノ基ゃカルボキシル基に D N Aな どを結合させる方法として知られているカルボジィミドなどによる縮合やカルボ キシル基を活性エステルにしてアミノ基と反応させる方法、 また、 チオールまた はマレイミドを担体に付けておき、 マレイミドゃチオール基を持った D NAなど と反応させる方法や担体にイソチオシアナ一ト基、 グリシジル基、 N—ヒドロサ クシイミド基をつけて置き、 これとァミノ基と反応させる方法など、 いずれの方 法も用いることが出来る。 または担体表面に核酸の塩基を D N A合成法として知 られている方法などを使って次々に重合させて D N Aなどを合成する方法も用い ることができる。
具体的には、 スぺ一サ一の種類、担体の種類および結合子の種類により、担体、 スぺ—サ—および結合子の各結合方法を決定できる。 例えば結合子が D N Aの場 合、 一般的には D NA結合子末端の塩基がもつアミノ基と担体又はスぺーサ一の エポキシ基、 カルボキシル基、 アルデヒド基、，水酸基等を結合させることにより 担体と結合子を結合させることができる。
スぺーサ一および結合子が一本鎖 D NAであり、 担体が表面にエポキシ基を有 する場合、 該 D N A結合子と担体の結合は、 例えば以下のように行う。
前述の D N A合成法に従い、 D N Aのスぺーサ一を持つ D N A結合子及び該結 合子と相補的配列を有し、 スぺ一サ一配列は有しない一本鎖 D N Aを合成する。 次いで両者をハイブリダイズさせ二本鎖にし、 検出すべき塩基配列を有する塩基 中のアミノ基を保護し、 遊離のスぺーサ一部分の塩基中のアミノ基 （必要に応じ て末端にアミノ基を導入する） と担体のエポキシ基を結合させる。 担体に結合さ せた後、 結合子と相補的配列を有しスぺーサー配列を有しない一本鎖 D N Aを解 離させ、 目的の担体結合 D N A結合子を調製することができる。
また、 この様にして作成した担体は非特異的な吸着や反応を抑制するために B S Aなどで処理してブロヅキングを行うことができる。
ハイブリダィズは、 必要に応じてホルムアミド、 塩、 蛋白質、 安定剤、 緩衝剤 等を含む水溶液中で行う。 以下この溶液をハイブリダイゼ一シヨン溶液という。 ホルムアミド濃度は 0〜6 0 %、 である。 塩としては塩化ナトリウム、 塩化カリ ゥム等の無機塩、 クェン酸ナトリウム、 シユウ酸ナトリウム等の有機酸塩があげ られ、 塩濃度としては 0〜2 . 0 M、 好ましくは 0 . 1 5〜 1 . 0 Mである。 蛋 白質としては血清アルブミン等があげられる。 安定剤としてはフイコール等があ げられる。 緩衝剤としては、 リン酸緩衝剤等があげられ、 濃度としては 1〜 1 0 O mMが好ましい。 前述の相補的な 2種の D N Aのハイプリダイゼ一シヨンは、 ハイブリダイゼ一ショ'ン溶液中にそれぞれ合成した一本鎖 D N Aを等モル濃度と なるように添加し、 5 0〜 9 0 °Cで 1分間〜 6時間加温した後、 徐々に冷却する ことでできる。
こうして、 一本鎖ポリヌクレオチドのスぺ一サ一を持つ部分 2本鎖 D N Aが調 製される。
担体との結合は、 エポキシ基を有する担体粒子を 1〜： L 0 0 mMのリン酸緩衝 液で洗浄し、 粒子を平衡化した後、 洗浄に用いた緩衝液と同じ溶液中で担体と上 述の方法で作成した一本鎖 D N Aのスぺーサーを持つ部分 2本鎖 D N Aを混合し、 5〜 5 0時間、 2 0〜 5 0 °Cに保温することにより行う。 未反応の D N Aを 1〜 3 Mの塩化ナトリゥム等の塩類を含む水溶液で洗浄することにより取り除いた後、 担体上に存在する未反応のエポキシ基を、 トリス一塩酸緩衝液を加え室温で 5〜 5 0時間保温し開環させる。 このようにして担体に結合した二本鎖 D NAが調製 される。
この担体結合二本鎖 D N Aをハイブリダイゼ一ション用溶液中で洗浄すること により、 スぺーサー配列を有しない一本鎖 D NAを解離させ担体結合一本鎖 D N Aを調製できる。 洗浄はハイブリダィゼーシヨン溶液を用い、 5 0〜9 0 °Cで、 千〜 1 0万 gの遠心分離で数回行うことにより行う。
スぺ—サ—がポリエチレングリコ—ルジグリシジル、結合子が D N A鎖であり、 担体が表面にエポキシ基を有する場合、 D N A結合子と担体との結合は、 前述の スぺ一サーおよび結合子が一本鎖 D N Aであり、 担体が表面にエポキシ基を有す る場合と同様に行うことができる。
また、 このような合成高分子を用いた化学的な固定法以外に、 ハウン （Ha皿、 5
M) とヮシ （Wasi、 S )の方法 [An a l . Biochem., 191， 337(1990)〗により担 体にストレプトアビジンを固定ィ匕した後、 ピオチンを含有するスぺーサ一、 ある いは末端がピオチン標識された結合子自身を、 ストレプトアビジンとピオチンと のァフィ二ティ一を利用して固定することもできる。 さらには、 生物学的にァフ ィニティ一を有するような 2種類の物質を、 それぞれ担体とスぺーサ一、 または 担体と結合子自身に結合させたのち、 その両者のァフィ二ティ一を利用して結合 させる方法も利用できる。
上述した信号 Aが付けられ 担体に、 結合子を結合させるに際しては、 特定の 結合子 S 1を信号 Aの A 1をもつ担体に結合させる。 同様に別の結合子 S 2を信 号 Aの A 2をもつ担体に結合させる。例えば、 特定の結合子 S 1を、 バーコード 信号 0 1を割り振った担体に結合させ、 他の特定の結合子 S 2を、 バーコード番 号 0 2を割り振った担体に結合させる。 本願発明では、 特定の結合子と信号 Aを 対応させ識別できれば、 一回の反応で検出できる結合子の種類の上限には特に制 限がない。
本願発明では、 特定の塩基配列 S l、 S 2、 · · · S nを有する結合子をスぺ —サ一を介しまたは介さず信号 Aの A 1、 Α 2、 · · · Anをもつ担体をそれぞ れ結合させた担体を複数用いることにより特定の塩基配列 Sと信号 Aを対応させ 識別できるので、 一回の反応で検出できる塩基配列の種類の上限には特に制限が ない。
次に、 検出すべき物質の調製方法について説明する。検出に用いる生体検査試 料は、 各種臓器、 組織、 血液等からそのままあるいは低分子化合物、 蛋白質、 D NA、 RNA等の核酸分子の抽出 ·精製方法を用いて調製される。
次に検出すべき塩基配列を有する試料の調製方法について説明する。
例えば検出に用いる試料が D NAまたは RNAである場合は、各種臓器、糸纖、 血液等から公知の D NAまたは RNA抽出方法により調製できる。単離した D N Aまたは RN Aは特定の制限酵素等で切断し検出すべき特定塩基配列を含む 5〜 5 0 0 me r、 好ましくは 1 0〜3 0 0 me rの長さを有する一本鎖 D N A断片 または一本鎖 RNA断片に調製する。試料中の D N A等の塩基配列は P C R、 T MAまたは NA S B A法により増幅されたものを用いることもできる。本願発明 においては生体試料中の塩基配列を検出する場合は D N A等を断片化するだけで よい。生体試料のみならず、 合成等により製造した塩基配列を有する化合物も試 料として使用することができる。
試料中の検出すべき物質と結合子の結合は、必要に応じて塩、蛋白質、安定剤、 緩衝剤、 界面活性剤等を含む水溶液で行う。 塩としては塩化ナトリウム、 塩化力 リゥム等の無機塩、 クェン酸ナトリゥム、 シユウ酸ナトリゥム等の有機酸塩があ げられ、 塩濃度としては 0〜2 . 0 Mである。蛋白質としては血清アルブミン等 があげられる。緩衝剤としては、 リン酸緩衝剤等があげられ、 濃度としては 1〜 1 0 O mMが好ましい。 結合の条件としては 1 0〜7 0 °Cで:!〜 6 0分間加温し た後、 必要に応じて冷却することにより行うことができる。
結合子をスぺーサ一を介しまたは介さず結合させた識別可能な信号 Aをもつ担 体と、 検出すべき物質を含有する試料とを溶液中で混合し、 検出すべき物質と該 担体上の結合子を結合させ、 これにより新たな信号 Bを担体上に形成する方法に ついて述べる。
例えば結合子が蛋白質の場合は以下のようにして行うことができる。信号 Bは、 検出すべき蛋白質等の物質と該担体上の蛋白質等の物質 (どちらか一方は蛋白質） との結合に起因する信号であれば ヽかなる信号でもよく、 振動子などの振動との 共鳴現象を利用した重量の増加を直接測定してもよいが、 検出すべき物質を認識 する抗体などに標識化合物を結合させ、 その標識を信号 Bとする方法や、 結合子 を認識する抗体等に標識化合物を結合させ、 検出すべき物質が結合子に結合した 場合、 該抗体が結合子に結合できない様にし、 結合していない抗体の標識を信号 Bとして検出することも可能である。 また、 結合子同士が蛋白などの検出すべき 物質を介して連結された様な場合は、 片方の結合子の有する信号 Aを信号 Bとし て検出することができる。
検出すべき蛋白と結合子を結合させる条件としては通常水溶液中にて蛋白の変 性のない条件下で行う。例えば、 P H 3 - 1 1程度の緩衝能を持つ水溶液 (界面活 性剤や蛋白の機能を保っための補助剤を含有することも良い)中にて、温度は 1〜 9 0 °C好適には 5〜 6 0 °C程度である。
次いで結合子に結合していない、 標識化合物と試料中の残余の物質は、 必要に より遠心分離操作または濾過操作等により分離除去する。
標識化合物としては、例えば蛍光物質、発光物質、酵素、 または酵素により蛍光、 発光する化合物等あげられる。 蛍光物質としては、 例えばフルォレセインイソチ オシアナ一ト （以下、 Fェ T Cと略記する） やテキサスレヅド （Texas Red)等 があげられる。
発光標識としては、 ァクリジニゥム誘導体やルテニウム錯体化合物があげられ る。 具体的には、 米国特許第 4 9 1 8 1 9 2号、 同 4 9 4 6 9 5 8号、 同 4 9 5 0 6 1 3号または Clin. Chem. 29(8), 1474- 1479(1983)に示されているァクリジ ニゥム類が好ましい。 またルテニウム錯体化合物は Clin. Chem. 37(9), 1534- 1539(1991)に示されたものが好ましく本化合物は電子供与体と共に電気化学的 に発光する。
酵素により蛍光、 発光する化合物を基質としては、 例えばパーォキシダーゼの 基質として、 例えばルミノ一ルイ匕合物、 ルシゲニン化合物などがあげられる。 あ るいはアルカリフォスファタ一ゼの基質として、 例えば 3-(2， -adamantyl)-4- methoxy-4-(35 phosphoryloxy)pnenyl- 1,2-dioxetane ±ks ァクリン二ゥムのリン 酸誘導体である A P S 2 , A P S 3 , A P S 5など [以上 Lumigen Incの発光ィ匕 合物、 H.AMiavan-Tafti'Z.Arghavaiii et al John Wiley ana Sons, Cnichester, 497-500(1997)] があげられる。
標識化合物が蛍光物質である場合は、 担体にも蛍光物質を結合させ、 光を当て たとき、 一方の蛍光物質からエネルギートランスファ一によって結合しているも う一方の蛍光物質が蛍光を発する現象を利用して標識することもできる。
信号 Bの検出には、 蛍光の場合、 担体を含む溶液が通過する微小な空管の部分 を蛍光検出機の検出部に置く。現在セルソ一夕一に使用されている様な方法も好 適に使用できる。 発光を検出する場合には光源が必要でないが、 必要で有れば発 光を開始させる試薬やエネルギーを加える装置を付けることが好ましい。発光の 検出装置としては高感度なフオトンカウン夕一が好適であるが、 発光が強い場合 には蛍光検出機の光学部も使用することができる。
次に例えば、 検出すべき塩基配列もしくはその部分配列と相補的塩基配列を有 する結合子をスぺーサ一を介しまたは介さず結合させた識別可能な信号 Aをもつ 8 担体と、 検出すべき塩基配列を含有する試料とを溶液中で混合し、 検出すべき塩 基配列と該担体上の相補的塩基配列を有する塩基配列とをハイプリダイズさせ、 これにより新たな信号 Bを担体上に形成する方法について以下に述べる。
信号 Bは、 検出すべき塩基配列と該担体上の相補的塩基配列を有する塩基配列 とのハイプリダイズにより形成され二重鎖に起因する信号であればいかなる信号 でもよく、 直接二重鎖の吸収を測定してもよいが、 二重鎖を形成するハイブリダ ィゼーションを認識可能な標識を有する化合物を結合させる方法が好ましい。該 結合子の塩基配列と試料の塩基配列とのハイプリダイゼーシヨンを認識可能な標 識を有する化合物としては、 例えば、 標識化合物と試料中の特定の塩基配列の結 合子に対する相補配列以外の残余塩基配列に相補的な塩基配列とを結合した化合 物 （以下標識結合子と略記する） 、 標識化合物と結合子の塩基配列と試料の塩基 配列とのハイブリダイゼーションを認識する抗体とを結合させた化合物、 標識化 合物と、 結合子の塩基配列と試料の塩基配列とのハイプリダイゼ一シヨンを認識 するインターカレ一夕一とを結合させた化合物等があげられる。
ハイプリダイズは、 前述のハイブリダイゼーション溶液を用いてストリンジェ ントな条件下で行う。例えば、 D NA結合子結合担体と D NA断片を含む試料を 該ハイブリダイゼ一ション溶液に添加し、 5 0〜 9 0 °C、 好ましくは 6 0〜 7 5 °Cで 1分間〜 2 4時間、 好ましくは 5〜： L 5分間加熱する。
次いで結合子にハイプリダイズしていない、 試料中め結合子と相補的な塩基配 列を有する化合物、 並びに、 信号 Aを有する担体と複合体を形成していない、 標 識化合物と試料中の特定の塩基配列の結合子に対する相補配列以外の残余塩基配 列に相補的な塩基配列とを結合した化合物、 標識化合物と結合子の塩基配列と試 料の塩基配列とのハイプリダイゼーシヨンを認識する抗体とを結合させた化合物、 標識化合物と結合子の塩基配列と試料の塩基配列とのハイプリダイゼーシヨンを 認識するィン夕ーカレ一夕一とを結合させた化合物を、 必要により遠心分離操作 または濾過操作等により分離する。
標識化合物と試料中の標識結合子、 標識化^と結合子塩基配列と試料塩基配 列とのハイプリダイゼ一シヨンを認識する抗体とを結合させた化合物、 標識化合 物と結合子の塩基配列と試料の塩基配列とのハイプリダイゼーシヨンを認識する 9 ィン夕一カレー夕一とを結合させた化合物等の検出は、 該化合物の標識の種類に 応じて行うことができる。
標識化合物としては、 前述の、 例えば蛍光物質、 発光物質、 または酵素により 蛍光、 発光する化合物等があげられる。
また、 ハイブリダィズした部分は 2重鎖になっているので、 例えばインタ一力 レーターを添加し、 イン夕一力レートさせることができる。 この時イン夕一カレ
—シヨンによつて蛍光を発する化合物であればハイブリダイズしたものが存在し たときのみ蛍光を発するので、 相補な塩基配列が担体表面になかった塩基配列は 蛍光を示さず、 残ったィン夕一力レー夕一やハイプリダイズしていないものなど を除く必要がないので特に好ましい。
ィンタ一力レ一夕一にはェチジゥムブ口ミドなどの化合物や 4',6-Diamidino- 2-phenylindole Dihydrochlonde n-Hydcate(DAPI) SYBR Green l( oleculai' Probe社製)、 Pico Green(Molecular Probe社製)、 2-メチル— 4 , 6—ビス— （ 4 — Ν、 Ν—ジメチルァミノフエニル） ピリリウム （ΜΒΡキャノン社製）、 2-メチ ルー 4， 6—ビス一（4一 Ν、 Ν—ジメチルァミノフエニル）チォピリリウム（キ ヤノン社製） などのイン夕一カレー夕一があげられる。 また、 ハイブリダィズし ていないとアルカリ条件下で、 分解して発光することができなくなるァクリジ二 ゥムエステル等の発光化合物も好適に使用できる。
標識結合子を使用する場合は、 ハイブリダイゼ一ション部位に近い部分の配列 に相補な配列を有する D N.A標識体を別途、 添加してハイプリダイズさせ、 次に ハイプリダイズしていない標識結合子を除去して標識結合子がハイプリダイズし たもののみに結合している状態とするのが好ましい。 除去する方法としては、 遠 心分離ゃフィルターを使用する方法が好ましい。 ノ、ィプリダイズしていない標識 結合子を除去する代わりに、 ノ、ィプリダイズしていない標識結合子を不活ィ匕して もよい。
標識化合物が蛍光物質である場合、 担体にも蛍光物質を結合させ、 光を当てた とき、 一方の蛍光物質からエネルギートランスファ一によってハイプリダイズし ているもう一方の蛍光物質が蛍光を発する現象を利用して標識することもできる。 この場合には、 検体中の D Ν Αもしくは R N Aのハイプリダイゼ一シヨン部分に 近い部分の配列に相補な配列を有する D N Aの蛍光物が結合した標識体を添加し ハイプリダイズさせる。 光を当てると一方の蛍光物質から他方の蛍光物質にエネ ルギ一がトランスファーされ、 ハイプリダイズしたもののみ蛍光を発するため、 相補な D N A配列または R N Aが担体上になければ蛍光が弱いもしくは無く、 相 補的な D N Aまたは RN A配列が担体上にあるものは蛍光が強いもしくはあるこ とになる。
信号 Bの検出には、 蛍光の場合、 担体を含む溶液が通過する微小な中空管の部 分を蛍光検出機の検出部に置く。現在セルソ一夕一に使用されている様な方法も 好適に使用できる。 発光を検出する場合には光源が必要でないが、 発光を開始さ せる試薬やエネルギーを加える装置を付けることが好ましい。発光の検出装置と しては高感度なフオトンカウン夕一が好適であるが、 発光が強い場合には蛍光検 出機の光学部も使用することができる。
中空管は、 細い管から形成されており円柱形の場合には、 担体が 1つずつ円柱 形の長さ方向に通過することができる形状のものが好ましい。 また該中空管に接 続する溶液供給手段は、 緩やかに狭まって微小空管に続いている中空管部を持つ ことが好ましい。.ゆつくりと狭まっていく溶液供給手段の管の中を通して最終的 には一度に 2個の担体が通過できない範囲の径に設定された中空管に担体を連通 させる方法が好ましい。 ゆつくり窄めることにより担体同士が目詰まりすること を防止することができる。 .
反応後、 D NAまたは RNAなどとハイプリダイズした担体やハイプリダイズ していない担体を中空管に通過させるが、 ハイプリダイズした担体は蛍光あるい は発光を発生させるかあるいは蛍光ある ヽは発光強度がノ ヅクグランドに対して 強い状態になっているので通過時、 各担体の信号と同時もしくは前後して、 蛍光 あるいは発光の有無または強弱を検出し、 その信号をコンピュー夕に順次取り込 み、 各担体の信号を相当する塩基配列に関連づけ、 検出対象とする D NAまたは RN A配列の有無を表示する。 その結果、 蛍光あるいは発光を持った （または蛍 光あるいは発光強度が強い） 担体に示されている信号に相当する塩基配列が検体 中に存在することを検出することができる。検出部が小さいために担体全部が通 過するのに長時間を要する場合には、 信号と蛍光または発光の検出部を複数使用 し、 流路に並列に設置し、 それぞれの検出部が検出した情報をデ一夕処理手段に 集積し、 解析することができる。
この溶液を上記担体が 1つずつ通過するような微小な中空管を持った管を通過 させ、 通過する際に担体のもつ信号 Aと試料中に検出すべき塩基配列が存在する 場合に担体上に形成される信号 Bをほぼ同時に検出することができるが、 信号 A と信号 Bが同じ担体から発することさえ判別できれば別々に検出してもよい。 デ ジ夕ル信号の検出の場合には、 近年デジタル信号を的確に読みとる装置が多く開 発されているが、 微小なものが読みとれる能力があれば 、かなるものでも使用で きる。例えば微小なデジタル信号を読みとる方法としては、 光学的に ¾大して、 例えばノーコードの夕ヅチスキヤナ一の様な原理のもので読みとる方法や、 C C Dカメラ等で映像として一旦とらえ、 拡大もしくはそのまま読みとり装置にて読 みとる方法、 または微小なレーザーを担体に照射して反射光や透過光で読みとる 方法等があげられる。 C Dなどで使われて ヽる磁気光学的な記録の場合には C D などで使われていると同様レーザ一で光学的に読む方法が好ましい。
本願発明において、 あらかじめ既知量の試料 D NA等検出すべき物質を用いて 検量線を作成することにより、 試料中の D N A等検出すべき物質の濃度を定量す ることもできる。
本願発明により例えば次のような応用が可能になる。
感染症患者の血清を検体とし、 担体に各種感染病原の適当な腿を結合させ、 標識として抗ヒトイムノグロプリン抗体に蛍光標識化合物または発光標識化合物 を結合させたものを使用すると、 感染症患者がどの様な種類の感染症に感染して いるのかが 1回の操作で判明する。
アレルギー患者の血清を検体とし、 担体に各種アレルゲンの適当な を結合 させ、 標識として抗ヒトイムノグロプリン抗体に蛍光標識化合物または発光標識 ィ匕合物を結合させたものを使用すると、 患者がどの様な種類のアレルゲンに感作 されているのかが 1回の操作で判明する。
ある細胞のライゼ一トを試料とし、 担体に各種蛋白質または低分子化合物を結 合させ、 標識として担体に結合させた各種蛋白質または低分子化合物に対する抗 体に蛍光標識化合物または発光標識化合物が結合したものを使用すると、 担体に 結合させた各種蛋白質または低分子化合物に親和性のある物質が試料中に存在す ると標識された抗体が反応できず、 蛍光標識化合物または発光標識化合物が結合 していない担体に相当する結合物に親和性のある物質が試料中に存在することに なり、 細胞中の当該物質の探索が 1回の操作で判明する。 この場合において担体 に D N Aを結合させた場合にはその D N Aに親和性のある蛋白例えば D N Aの発 現プロモー夕に結合する蛋白質の存在検出も可能である。 さらにこの場合におい て、 担体上に付された蛋白質同士を結合させる能力のある物質が試料中に存在す る場合は、 2つの担体が結合子の存在する面を互いに向かいあって会合する。 こ の会合も判定できるように検出の際、 バーコ一ド等の向きや検出の時間間隔を調 整することにより当該物質の検出を行うことができる。
また、 近年の遺伝子クロ一ニング、 遺伝子配列解析の技術の進歩で、 多くの新 規遺伝子が新たに取得されているが、 そのような遺伝子の多くは、 それがどのよ うな機能を有しているのかは不明のままである。 本願発明は、 そのような機能不 明な遺伝子配列のコ一ドする蛋白質の機能解明にも応用が可能である。例えば、 当該遺伝子断片を 5 ' 上流に配して、 その 3， 下流に Green fluorescent protein (以下 G F Pという。 ） をコードする遺伝子配列を連結させ、 当該遺伝子がコー ドする蛋白質を G F Pとの融合蛋白として発現させる。 このような、 蛍光； f票識化 された機能未知の遺伝子がコ一ドする蛋白質を担体に固定化させた後、 種々の既 知物質を固定化させたバ一コードを付した担体とインキュベートすることで、 機 能未知の遺伝子がコ一ドする蛋白質と結合する物質を、 バーコ一ドと蛍光シグナ ルをモニターすることで、 当該物質と結合する物質をスクリーニングすることが 可能である。即ち、 本法を用いることにより、 機能未知の遺伝子配列がコードす る蛋白質のきのうを容易に解析することが可能となる。 また、 変異のある G F P を利用すると、 それらは各々が異なる蛍光を有することから、 解析したい目的遺 伝子の 3， 下流にそれぞれの異なる蛍光を有する G F Pを結合させることで、 複 数の機能未知の遺伝子の解析を同時に効率よく行うことも可能である。
なお上記の例で用いる標識化合物としては必ずしも G F Pである必用はなく、 遺伝子工学的に遺伝子からの蛋白発現が可能で、 それ自身が何らかのシグナルを 有しているものであれば全て利用できる。例えば、 ェクオリンやルシフヱラーゼ のような酵素も、 検出系に用いることができる。
ある蛋白質とそれと結合する蛋白質もしくは低分子物質またはプロモ一夕等の 蛋白質に作用する物質は生体中の条件に近い溶液中で相互作用し、 結合する。 例 えば該蛋白質を担体に付しておき、 それに相互作用する物質を添加し、 インキュ ベ一卜することによつて担体上に該蛋白質とそれに相互作用する物質の複合体を 生成させる。担体上に結合した蛋白質同士を結合させる能力のある物質の場合は、 2つの担体が結合する面を互 ヽに向けあつて会合する。生成した複合体がどのよ うなものかを明らかにするためには、 複合体に結合してその種類を明らかにする 標識化合物をさらに反応させ、 標識の有無を検出する。 この様にしてある蛋白質 と当該蛋白質と相互作用する物質が存在するか否かを判定することができる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本願発明の装置の概略図を示す。
第 2図は、 本願発明の装置の概略図を示す。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1
(1)信号 Aを有する担体の作成
三菱レイョン社製、 直径 1. 5 mm長さ 15 c mのポリメチルメ夕ァクリレー トのファイバ一を lmo 1ZLの NaOH水溶液中で 80°Cで 2時間インキュべ —トして表面を加水分解してカルボキシル基の N a塩とし、 洗浄後、 それを一旦 0. 02 M塩酸溶液でカルボキシル基に戻した。 このファイバ一を回転させなが ら、 TDK レーザーマーカ一 CLM— 03型印刷機でコード 128のバーコ ード 01を直接印刷した。 バ一コード印刷部分を切断して取り出し、 長さ 15m mの担体を作成した。 同様にバ一コード 02を印刷して切り出し、 同様な担体を 作成した。
(2)担体結合一本鎖 DN A (担体結合結合子） の調製
バーコード 01を有する担体 50本を HEPES緩衝液 10mlに分散し、 5'末端にアミノ基を有する 15塩基からなる配列番号 1の塩基配列を有するォ リゴ DNAを 1 imol添加し、 さらに W S C [Water soluble carbodiimide,ィ匕 合物名 l-Ethyl-3-(-dimethylaminopropyl) carbodiimide, hydrochlorideヽ 同仁化 学社製] 50〃mo 1添加して配列番号 1の塩基配列を有するオリゴ DNAをァ ミノ基を介して該担体に固定した。配列番号 1の塩基配列を有するォリゴ D N A が結合した担体は 1%BS A溶液中でブロッキングを行い、 蒸留水で洗浄し、 配 列番号 1の塩基配列を有するオリゴ D N Aを結合したバーコ一ド 01を持つ担体 を調製した。配列番号 1の塩基配列中の 5， 末端の AAAはスぺーサ一として挿 入している。
同様にバーコ一ド 02を有する担体 50本に、 5， 末端にアミノ基を有する 1 5塩基からなる配列番号 2の塩基配列を有するォリゴ D N Aを結合させ同様に処 理し、 配列番号 2の塩基配列を有するオリゴ DN Aを結合したバーコード 02を 持つ担体を調製した。 '
( 3 ) 蛍光結合一本鎖 ϋ Ν Α (蛍光結合結合子） の調製
配列番号 3の塩基配列を有するオリゴ DNAの 3 ' 末端に F I TC (フルォレ セインイソチオシアナ一ト） を反応させて蛍光標識したオリゴ DNA2nmo 1 /mlの溶液を調製した。
(4)検体 DN Aの調製
配列番号 1の塩基配列および配列番号 3の塩基配列に相補的な配列を有する配 列番号 4の塩基配列を有するオリゴ DNAを調製し、 TE緩衝液（lOmmo 1/ L トリス、 1 mmo 1/L EDTA) に 1 nmo 1/m 1の濃度で溶解して検 体溶液を調製した。
また、 配列番号 1の塩基配列および配列番号 3の塩基配列に相補的でない配列 を有する配列番号 5の塩基配列を有するォリゴ D N Aを調製し、 T E緩衝液に 1 nmo 1/m 1の濃度で溶解して検体を調製した。
(5)ハイプリダイゼーシヨン
上記 （2)で調製した 01と 02のバーコ一ドをそれぞれ有する担体をそれぞ 5個ずつ含む 0.05mo 1/Lの HEPES緩衝液（pH7、 lmo 1/L N aClを含む） 10mlに、 上記 (3)で調製した蛍光結合一本鎖 DNA (蛍光 結合結合子） 100 zLおよび上記 (4)で調製した配列番号 4の塩基配列を有 する検体 D N A、 配列番号 5の塩基配列を有する検体 D N Aまたは T E緩衝液 1 00〃Lを添加し、 それぞれ 50°Cにて緩慢な攪拌下、 30分間加温した。
つ ヽで東洋濾紙社製セル口一スアセテートの 0. 8〃mのメンブランフィルタ ― (C080A047A) にて濾過し、 0. 05 mo 1/Lの H E P E S緩衝液 (pH 7、 lmol/Lの NaClを含む） で洗浄し、 再度同緩衝液 10mlに担体を 分散させた。
(6) 検出
第 1図に示す検出装置を作成し、 ±13 (5)で調製した各溶液を信号検出手段 中の中空管に通過させながらバーコ一ドと蛍光の検出を行った。 バーコ一ドリー ダ一は日栄ィンテヅク社製ハンドレーザースキャナー S L— 114型を使用した c 蛍光検出機は日立 F— 4000型蛍光分光光度計を使用し、 励起光波長 495 nm、 蛍光波長 520 nmで蛍光強度を測定した。 中空管は石英ガラス管で内径 は 2 mm、 流速は 0. 6c m/秒とした。バーコードの信号と蛍光の信号検出の 時間差が 36秒であったため、 その時間差により特定のバーコードを有する担体 上の蛍光信号を対応させた。 '
蛍光強度は、 ノイズを考慮しながらモニターしている蛍光強度の最大値を蛍光 強度とし、 塩基配列の等しい 5個のバーコ一ド 02の担体が有する蛍光強度の平 均を 1として示した。
その結果を第 1表に示す。
第 1 表
Figure imgf000027_0001
その結果、 バーコード 01の担体に対応する蛍光値が顕著に高く認められた。 バーコ一ド 01の結合子 D N Aの塩基配列に相補的でない配列番号 5の塩基配列 を有する DNAi食体および担体のみ （DNAなし） では、 いずれのバーコード信 号を有する担体に対応する蛍光値が低 ヽことから、 本願発明方法により特異的に 特定配列を検出することができることが示された。 実施例 2
実施例 1の （2) で製造した 01と 02のバーコ一ドを有する担体それぞれ 5 個ずつ含む 0. 05mo 1ZLの HEPES緩衝液（pH7、 lmo l/Lの N aClを含む） 10 mlに、 実施例 1の （4) で調製した配列番号 4の塩基配列 を有する検体 D N A、 配列番号 5の塩基配列を有する検体 D N Aまたは T E緩衝 液 100〃Lを添加し、 それぞれ 50°Cにて緩慢な攪拌下、 30分間加温した。 ついで SYBR Greenl溶液を T E緩衝液で 5000倍希釈した溶液を 1 0ml添加し、 室温にて緩慢な攪拌下、 30分間加温した後、 実施例 1と同様に 第 1図の装置を用いて測定した。 なお、 蛍光検出においては、 励起光波長 254 nm、 蛍光波長 520 nmで測定した。
蛍光強度は、 実施例 1と同様に、 塩基配列の等しい 5個のバーコード 02の担 体が有する蛍光強度の平均を 1として示した。
結果を第 2表に示す。 .
ώ 3§
Figure imgf000028_0001
その結果、 バーコード 01の担体に対応する蛍光値が顕著に高く認められた。 バーコ一ド 01の結合子 D Ν Αの塩基配列に相補できでない配列番号 5の塩基配 列を有する検体および担体のみ （食体なし） では、 いずれのバ一コード信号を有 する担体に対応する蛍光値が低いことから、 本方法により特異的に特定配列を検 出することができることが示された。 また、 本願発明方法により、 ハイブリダィ ゼ一シヨン操作の後、 担体と未結合標識の分離操作を要さずに簡便な操作で測定 できることが示された。
実施例： 3
配列番号 3の塩基配列を有するオリゴ DNAの 5' 末端より 6番目のグァニン にアミノ基を導入したオリゴ DNAに、 ァクリジニゥムー I (同人化学社製） を 結合させ、 2 nmo 1/mlの溶液を調製した （以下ァクリジニゥム標識結合子 と略す） 。
実施例 1の （ 2 ) で製造した 01と 02のバーコ一ドを有する担体それぞれ 5 個ずつ含む 0. lmo 1/Lの L i t hium s u c c i na t e緩衝液 （p H5)、 20% Lithium laury丄 sulf at e, 0. 4mo l L LiCl, 2 Ommo 1/L EGTA、 2 Ommo 1/L EDTAの 500〃 Lに、 実施例 1の （ 4 ) で調製した配列番号 4の塩基配列を有する検体 DNA、 配列番号 5の塩基配列を有する検体 DNAまたは TE溶液 10〃Lを添 加し、 さらに上記ァクリジニゥム標識結合子溶液を 0. lpmo l/Lとなるよう に添加しそれぞれ 60 °Cにて緩慢な攪拌下、 30分間加温しハイブリダイゼ一シ ヨン反応を行った。 ついで、 0. 6mo 1ZLの Te t raborat e緩衝液 (pH8. 5)、 5% Tr i t onX— 100、 ΤΕΊΈΑ潜夜を 1500〃L を添加し、 60°Cにて 20分間加温して、 未反応のァクリジニゥム標識結合子の 加水分解を行い、 試料入り反応容器を水中に約 3分間つけて急冷した。
検出は第 1図の信号検出手段を第 2図に変えた装置を用いて行った。 本反応後 の試料を、 チュ一ブに通液させ、 バーコ一ドリ一ダ一でシグナルを検出した後、 さらに、 0. 03%H202を含む 2mo 1 L N a OH溶液を第 2図に示す試 薬供給手段より導入して該試料にチューブ中で混和させ、 直ちにルミカウンター 2500発光検出器（マイクロテヅク ·ニチオン社製） の検出部を用いて発光力 ゥントを測定したところ、 01のバ一コードを付した担体で、 配列番号 4の塩基 配列を有する DN Aを反応させた検体のみ、 明瞭な化学発光カウントを検出でき た。
実施例 4
( 1 )信号 Aを有する担体の作成
実施例 1 (1) と同様に、 信号 Aを有する担体を作製した。
(2)担体結合蛋白 （担体結合抗体） の調製
バ一コード 01を有する担体 5◦本を HEPES緩衝液 10mlに分散し、 ヒ ドロキシサクシイミド （関東化学製） を 100〃mo l添加し、 さらに WSC (Water soluble carbodiimide，ィ匕合物名 l-Ethyl-3-(-dimethylainiaopropyl) carbodiimide, hydrochloride, 同仁化学社製） 100 zmo 1添加してカルボキ シル基をサクシイミド化し、 一旦同緩衝液にて担体を洗浄後、 すぐに抗ヒトイム ノグロプリンァ鎖抗体 l^mo 1/m 1を含む緩衝液 10mlを添加して抗体を 固定化した。さらに 1%BSA溶液中でプロヅキングを行い、蒸留水で洗浄し、抗 ヒトイムノグロブリンァ鎖抗体が結合したバーコード 01を持つ担体を調製した。 同様にバーコード 02を有する担体 50本に、 抗ヒトイムノグロブリン〃鎖抗 体を結合させ同様に処理し、 抗ヒトイムノグロブリン〃鎖抗体を結合したバーコ ード 02を持つ担体を調製した。
( 3 ) 蛍光結合抗原の調製
ヒト I gGに FITC (フルォレセインイソチオシアナ一ト）を反応させて蛍 光標識した 2nmo 1/m 1の溶液 Aを調製した。また、同様にヒト I g A及び IgMに FITC (フルォレセインイソチオシアナート）を反応させて蛍光標識 した 2nmo 1/mlの溶液 (それぞれ溶液 B、 溶液 Cという。）を調製した。
(4) 蛋白の反応
上記 (2) で製造した 01と 02のバーコ一ドを有する担体それぞれ 5個ずつ 含む 0. 05mo 1/Lの HEPES緩衝液 （pH7) 10mlに、 上記 （3) で調製した蛍光結合お源溶液 A、 100 Lおよび溶液 B、 100〃Lを添カロし、 それぞれ 37 °Cにて緩慢な攪拌下、 30分間加温した。 '
ついでセルロースアセテートの 0. 8 zmのメンプランフィル夕一 （東洋濾紙 社製ヽ C080A047A) にて濾過し、 0. 05 m o 1 /Lの H E P E S緩衝液 （ p H7) にて 2回洗浄し、 再度同緩衝液 10mlに担体を分散させた。 これを検出 ί食体溶液 Xとした。
また、 他方、 上記 (2) で製造した 01と 02のバーコードを有する担体それ それ 5個ずつ含む 0. 05mo 1/Lの HEPES緩衝液（pH7) 10mlに、 上記 （3) で調製した蛍光結合 i¾ 溶液 (、 100 /Lおよび溶液 B、 100〃 Lを添加し、 それぞれ 37 °Cにて緩慢な攪拌下、 30分間加温した。
ついでセルロースアセテートの 0. 8〃mのメンプランフィル夕一 （東洋濾紙 社製ヽ- C080A047A) にて濾過し、 0. 05mo l/Lの HEPES緩衝液 （ p H7) にて 2回洗浄し、 再度同緩衝液 10mlに担体を分散させた。 これを検出 ネ食体 Yとした。 ( 5 )検出
第 1図、 第 2図に示す様な検出装置を作成し、 上記（4 ) で調製した X、 Y各 溶液を検出装置中の中空管に通過させながらバーコ一ドと蛍光の検出を行った。 バーコードリーダ—は日栄インテック社製ノヽンドレ—ザ一スキャナー S L— 1 1
4型を使用し、 蛍光検出機は日立 F— 4 0 0 0型蛍光分光光度計を使用し、 励起 光波長 4 9 5 nm、 蛍光波長 5 2 0 nmで測定した。 中空管は石英ガラス管で内 径は 2 mm. 流速は 0 . 6 c m/秒であつた。バーコ一ドの信号と蛍光の信号検 出のずれが 3 6秒であったため、 その時間差により特定のバーコードを有する担 体上の蛍光信号を対応させた。
その結果を第 3表に示す。
第 3 表
Figure imgf000031_0001
蛍光強度は、 ノィズを考慮しながらモニターしている蛍光強度の最大値を蛍光 強度とし、 5個のバーコ一ド 0 2の担体が有する蛍光強度の平均を 1として示し た。
その結果、 検体 Xの場合、 バーコード 0 1の担体に対応する蛍光値が顕著に高 く認められた。即ちバーコード 0 1の抗ヒト I g Gに反応するヒト I g Gを有す る検体 Xではバーコ一ド 0 1の担体に対応する蛍光強く検出され、 また、 検体 Y の場合、 バーコード 0 2担体に対応する蛍光値が顕著に高く認められた。即ちバ —コ一ド 0 2の抗ヒト I gMに反応するヒト I gMを有する検体 Yではバーコ一 ド 0 2の担体に対応する蛍光強く検出された。一方検体なしでは、 蛍光値が高ま らないことから、 本願発明方法により特異的に特定の蛋白質 (抗体)に反応する蛋 白質 φ¾)を検出することができた。
実施例 5
( 1 ) バーコ一ド標識を有するアビジン結合担体及びマウスィムノグロプリン結 合担体の調製 .
実施例 1と同様の方法を用いてポリメチルメ夕ァクリレートのファイバーを材 料として、 表面にカルボキシル基を導入し、 バーコード 01、 及びバーコード 0 2を持つ長さ 15 mmの担体を作成した。 実施例 1と同様に、 バーコ一ド 01を 有する担体 50本を HEPES緩衝液 10mlに分散し、 ヒドロキシサクシィミ ドを 100 mo 1添加し、 さらに WS Cを 100 /mo 1添加してカルボキシ ル基をサクシイミド化し、 一旦同緩衝液にて担体を洗浄後、 すぐにアビジン 1 z mo 1/m 1を含む緩衝液 10 m 1を添加してアビジンを担体に固定化した。 さ らに 1 %BSA溶液中でプロヅキングを行い、蒸留水で洗净し、 アビジンが結合し たバーコ一ド 01を持つ担体を調製した。
同様にバーコード 02を有する担体 50本に、 マウスィムノグロブリン Gを結 合させ同様に処理し、 マウスィムノグロブリン Gを結合したバーコ一ド 02を持 つ担体を調製した。
( 2 ) 検体ポリぺプチド溶液の調製
ァミノ末端に F I T Cを有するァビジン結合性べプチド配列を含む 15ァミノ 酸からなる配列番号 6の塩基配列を有する F I T C標識ポリぺプチドを合成し、 0. 1%BSA含有 PBSに 2nmo 1 /mlの濃度で溶解して食体溶液を調製 した。
また、 同様にァミノ末端に F I T Cを有するアビジン結合性べプチド配列を含 まない 15アミノ酸からなる配列番号 の塩基配列を有する FIT C標識ポリぺ プチドを合成し、 0. 1%BSA/PBSに 2nmo 1/mlの濃度で溶解して検 体を調製した。
( 3 ) 検体ポリぺプチド溶液と担体との反応
上記 (1)で製造した 01と 02のバーコ一ドを有する担体それぞれ 5個ずつ 含む 0. 05mo 1ZLの HEPES緩衝液 （pH7) 10mlに、 上記 （2) で調製した配列番号 6のアミノ酸配列を有する検体、 配列番号 7のアミノ酸配列 を有する検体、 またはポリペプチドを含まない 0. 1%BSA/PBSを 100 z L添加し、 それぞれ 37 °Cにて緩慢な攪拌下、 30分間加温した。
ついでセルロースアセテートの 0. 8〃mのメンブランフィルター （東洋濾紙社 製、 C080A047A) にて濾過し、 0. 05mol/Lの HEPES緩衝液 （ p H 7) にて 2回洗浄し、 再度同緩衝液 10mlに担体を分散させた。 3
( 4 ) 検出
第 1図、 第 2図に示す検出装置を作成し、 上記 ( 3 ) で調製した各溶液を検出 装置中の中空管に通過させながらバーコードと蛍光の検出を行った。 バーコ一ド リーダ一は日栄インテック社製ハンドレーザースキャナ一 S L— 1 1 4型を使用 し、 蛍光検出機は日立 F— 4 0 0 0型蛍光分光光度計を使用し、 励起光波長 4 9 5 nm、蛍光波長 5 2 0 nmで測定した。中空管は石英ガラス管で内径は 2 mm、 流速は 0 . 6 c mZ秒、であった。バーコードの信号と蛍光の信号検出のずれが 3 6秒であったため、 その時間差により特定のバーコ一ドを有する担体上の蛍光信 号を対応させた。
その結果を第 4表に示す。
第 4 表
Figure imgf000033_0001
蛍光強度は、 ノイズを考慮しながらモニタ一している蛍光強度の最大値を蛍光 強度とし、 検体が無いときの 5個のバーコード 0 2の担体が有する蛍光強度の平 均を 1として示した。
その結果、 配列番号 1の検体の場合、 バーコード 0 1の担体に対応する蛍光値 が顕著に高く認められた。即ちバーコード 0 1のアビジンに反応するペプチド配 列を有する配列番号 1の検体ではバーコ一ド 0 1の担体に対応する蛍光強く検出 され、 一方、 配列番号 2の検体、 及び検体無しの場合、 いずれのバーコ一ド信号 を有する担体の対応する蛍光値も高まらないことから、 本願発明方法により特異 的に特定の蛋白質 (アビジン)に反応するポリぺプチド配列を検出することができ た。 産業上の利用可能性
本願発明により、 安価で汎用性の高い特定の塩基配列を検出する方法、 特定の 塩基配列を検出する試薬および特定塩基配列を検出する «を提供される。 配列表フリーチキスト
配列番号 1一人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 2一人工配列の説明：合成 D NA 配列番号 3一人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 4—人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 5—人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 6一人工配列の説明：合成ぺプチド 配列番号 7一人工配列の説明：合成ぺプチド

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 溶液に懸濁しかつ信号 Aおよび信号 Bを検出可能な信号検出手段中に形成 された信号検出用中空管に貫流させたとき該中空管の横断面に対して重複して移 動することのない形状を有する担体であって、 検出すべき物質に結合能を有する 物質 （以下、 結合子と略記する） をスぺ一サーを介しまたは介さず結合させた識 別可能な信号 Aをもつ担体と、 検出すべき物質を含有する試料とを溶液中で混合 し、 検出すべき物質と該結合子を結合させ、 該結合により信号 Bを担体上に形成 せしめた後、 該中空管に連通する溶液供給手段により該担体懸濁液を該中空管に 貫流させ、 該信号検出手段により信号 Aおよび信号 Bを検出し、 信号 Aと信号 B を関連づけることを特徴とする試料中の検出すべき物質の検出方法。
2 . 検出すべき物質が、 特定の塩基配列を有する物質であり、 結合子が検出す ベき物質の塩基配列もしくはその部分配列と相補的塩基配列を有する'物質である 請求項 1記載の検出方法。
3 . 検出すべき物質と結合子との結合が、 相補的塩基配列によるハイプリダイ ズにより行われる請求項 2記載の検出方法。
4. 識別可能な信号 Aが、 結合子の塩基配列と関連づけられたものである請求 項 3記載の方法。
5 . 担体が、 結合子の塩基配列と関連づけられた 互に識別可能な信号 Aを有 し、相互に異なる信号 Aを有する複数の担体の混合物である請求項 3記載の方法。
6 . 結合子が、 塩基数 5〜5 0 0の D NA、 RNAまたは P NAである請求項 2〜 5のいずれかに記載の方法。
7 . 担体上の信号 Bの形成が、 結合子の塩基配列と検出すべき物質の塩基配列 とのハイプリダイゼーションを認識可能な標識を有する化合物を結合させること により行われる請求項 3 - 6のいずれかに記載の方法。
8 . ノ、ィプリダイゼ一シヨンを認識可能な標識を有する化合物が、 検出すべき 物質が有する、 結合子の塩基配列に対する相補配列以外の残余の塩基配列に相補 的な塩基配列を有する化合物と標識化合物とを結合させた化合物である請求項 7 記載の方法。
9 . 検出すべき物質が有する、 結合子の塩基配列に対する相補配列以外の残余 の塩基配列に相補的な塩基配列を有する化合物が、 塩基数 5〜5 0 0の D NA、 R N Aまたは P N Aである請求項 8記載の方法。
1 0 . ノ、ィプリダイゼ一シヨンを認識可能な標識を有する化合物が、 該ハイブ リダイゼ一ションを認識する抗体と標識化合物とを結合させた化合物である請求 項 7記載の方法。 ·
1 1 . ノ、イブリダィゼ一シヨンを認識可能な標識を有する化合物が、 該ハイブ リダィゼ一シヨンを認識するインターカレ一夕一と標識化合物とを結合させた化 合物である請求項 7記載の方法。
1 2 . 担体と結合していない標識を有する化合物を担体から分離する工程を含 む請求項 1 1記載の方法。
1 3. 標識化合物が、 蛍光物質、 発光物質、 酵素または酵素により蛍光もしく は発光を発する化合物である請求項 7〜 1 2のいずれかに記載の方法。
1 4. 担体が蛍光を発する物質を結合させたものであり、 標識化合物がェネル ギ一トランスファ一により蛍光を発する化合物である、 請求項 1 3記載の方法。
1 5 . ノ、イブリダィゼ一シヨンを認識可能な標識を有する化合物が、 インター カレ一シヨンにより信号 Bを生成する化合物である請求項 7記載の方法。
1 6 . 結合子が検出すべき物質と結合能を有する蛋白質である請求項 1記載の 方法。
1 7 . 識別可能な信号 Aがデジタル信号である請求項 1〜： L 6のいずれかに記 載の方法。
1 8 . デジタル信号 Aが、 磁気的ま は光学的である請求項 1 7記載の方法。
1 9 . デジタル信号が、 バーコ一ドである請求項 1 7記載の方法。
2 0 . 中空管の形状が円柱形でありかつ、 担体が該中空管の内径よりも小さい 外形を有する円柱形であって、 該円柱形の長さが該中空管の内径よりも大きいも のである請求項 1〜 1 9のいずれかに記載の方法。
2 1 . 担体が、 円柱形または球形で'ある請求項 1〜2 0のいずれかに記載の方 法。
2 2 . 担体が磁性粒子を内在するものである請求項 2 1記載の方法。
2 3 . 担体が円柱形であり、 外径が直径 1〃 π！〜 2 mmであり、 長さが 1 0〃 m〜 2 c mである請求項 1〜 2 2のいずれかに記載の方法。
2 4 . 担体の比重が、 0 . 8〜 2 . 0である請求項 1〜 2 3のいずれかに記載 の方法。
2 5 . 担体の表面が、 f鋤旨でコ一ティングされたものである請求項 1〜2 4の いずれかに記載の方法。
2 6 . 検出すべき物質に結合能を有する結合子をスぺーサ一を介しまたは介さ ず結合させた識別可能な信号 Aを有する担体。
2 7 . 結合子が検出すべき塩基配列もしくはその部分配列と相補的塩基配列を 有するものである請求項 2 6記載の担体。
2 8 . 結合子が検出すべき物質に結合能を有する蛋白質である請求項 2 6の担 体。
2 9 . 磁性粒子を内在する担体である請求項 2 6 - 2 8のいずれかに記載の担 体。
3 0 . 信号 Aがデジタル信号である請求項 2 6〜2 9のいずれかに記載の担体。 3' 1 . デジタル信号が、 バーコ一ドである請求項 3 0記載の担体
3 2 . 担体が、 円柱形または球形である請求項 2 6〜3 1のいずれかに記載の 担体。
3 3 . 担体が円柱形であり 外径が直径 1〃n！〜 2 mmであり、 長さが 1 0 n m〜 2 c mである請求項 2 6〜 3 2のいずれかに記載の担体。
3 4 . 担体の比重が 0 . 8〜 2 . 0のである請求項 2 6〜 3 3のいずれかに記 載の担体。
3 5 . 担体の表面が樹脂でコ一ティングされている請求項 2 6〜 3 4のいずれ かに記載の担体。
3 6 . 信号検出手段、 データ入力手段、 データ処理手段およびデータ出力手段 を有し、 該信号検出手段は、 検出すべき塩基配列もしくはその音卩分配列と相補的 塩基配列を有する結合子をスぺーサーを介しまたは介さず結合させた担体上にあ る少なくとも二種類の信号 Aおよび Bを検知可能な信号検出器 Aおよび Bを備え、 該信号検出器 Aおよび Bは、 該担体を貫流させる中空管を有し、 該担体は該中空 管の横断面に対して重複して移動しない構造を有し、 該デ一夕処理手段は、 デ一 夕入力手段から入力される担体上の信号 Aと関連づけられた検出すベき特定物質 を特定するデ一夕と信号検出手段により検出された信号 Aおよび Bとから、 担体 上の信号 Aと該特定物質を関連づけ、 該関連づけたデータをデータ出力手段に出 力する機能を備えることを特徴どする、 特定物質の検出装置。
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