WO2001048234A1 - Procede de production de glycine - Google Patents

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WO2001048234A1
WO2001048234A1 PCT/JP2000/009353 JP0009353W WO0148234A1 WO 2001048234 A1 WO2001048234 A1 WO 2001048234A1 JP 0009353 W JP0009353 W JP 0009353W WO 0148234 A1 WO0148234 A1 WO 0148234A1
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WO
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group
ammonia
glycine
glycinonitrile
reaction system
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Application number
PCT/JP2000/009353
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English (en)
French (fr)
Inventor
Toshiya Aoki
Kiyoshi Kawakami
Kazumasa Otsubo
Original Assignee
Asahi Kasei Kabushiki Kaisha
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Publication date
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Priority to AU22292/01A priority patent/AU2229201A/en
Publication of WO2001048234A1 publication Critical patent/WO2001048234A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing glycine. More specifically, a glycinonitrile aqueous solution is subjected to a hydrolysis reaction in a hydrolysis reaction system under the action of a microbial enzyme to convert the glycinonitrile to glycine while producing ammonia as a by-product.
  • the hydrolysis reaction system contains at least one organic impurity compound containing a specific structure having a molecular weight of 95 or more that inhibits the microbial enzyme, and during the hydrolysis reaction, Performing the reaction under the condition that the content of the organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme is maintained at 10% by weight or less based on the weight of the hydrolysis reaction system.
  • glycine which is useful as a raw material for medical and agricultural chemicals, a food additive, and a detergent, can be industrially produced with high purity, efficiently, easily, and with low environmental load. Becomes Conventional technology
  • glycine has been prepared from formaldehyde, hydrogen cyanide and ammonia by the Strecker method and once glycino.
  • alkali such as caustic soda
  • ammonia By synthesizing nitrile, hydrolyzing it with alkali such as caustic soda to convert it into glycine soda and ammonia, neutralizing it with an acid such as sulfuric acid, and recovering it by crystallization.
  • imine compounds such as Japanese Patent Publication No. 5 1- 2448 815 states that glycinonitrile releases ammonia upon heating to form imine compounds such as iminodiacetonitrile, which is further modified. It is described as producing a black compound.
  • the conventional method has the disadvantage that the degradation of glycine yield due to such decomposition and denaturation is unavoidable, and the decolorization requires complicated processing using activated carbon and a special ion exchange resin. (It corresponds to Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-190851, Japanese Patent Application Laid-Open No. 412-6949. )).
  • glycinonitrile is simply degraded using a microorganism having a water-solubility of a nitrile group.
  • a method for obtaining glycine and ammonium by hydrolysis is known.
  • the specification of Japanese Patent Publication No. 58-151,200 (corresponding to French Patent No. 2,255,855) shows that the Brevipacterium 312 strain was prepared using a caustic
  • the method of suspending in the reaction solution prepared in Step 8 and using it for the hydrolysis reaction is described in Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 3-62391 (corresponding to EP187680-B).
  • Line A method of suspending bacterial N-774 strain in a reaction solution adjusted to pH 7.7 with a phosphate buffer and using it for a hydrolysis reaction is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-28008.
  • No. 89 (corresponding to EP 450508-B) states that there are oral genus Dococcus, Arsulopactor, Caseopactor, Syu Domonas, Enteropactor, which have the ability to hydrolyze a ditolyl group.
  • a microorganism of the genus Acinetobacter, Alcaligenes, Corynebacterium, or Streptomyces is suspended in a reaction solution adjusted to pH 7.7 with a phosphate buffer, and glycinonitrile to glycine.
  • a method for obtaining syn is disclosed.
  • these methods use more than the same amount of dried microorganisms as glycine or use more than 5% by weight of dried microorganisms based on glycine over 30 hours.
  • a neutralizing agent to maintain the pH in a neutral range.
  • sulfuric acid or phosphoric acid is added to neutralize the glycine ammonium salt, so that a large amount of ammonium sulfate ammonium phosphate remains in the reaction solution.
  • the production method of glycine using these microorganisms also has a disadvantage that a large amount of acid is used and a large amount of waste is discharged. Furthermore, in these methods, compared to the above-mentioned alkaline hydrolysis method, the recovery of daricin requires a step such as addition of methanol in addition to the concentration operation, which complicates the operation.
  • Japanese Patent Publication No. 58-88 No. 1 5 1 2 0 Specification
  • Rench Patent No. 2 25 5 Corresponding to No. 85
  • the organic acid obtained from the microorganism obtained in 20 g of glycerin medium was 0.3 mol, and the activity of the microorganism was extremely low. It has the drawbacks that it requires complicated operations, consumes a large amount of power, and requires the use and disposal of a large amount of microorganisms.
  • the conventional method of producing glycine from glycinonitrile using microorganisms has a disadvantage that the activity per unit of dry microorganism is low and the activity per unit time is low, and a large amount of medium and microorganisms must be discarded. was there.
  • electrodialysis was not used, the neutralization agent used to adjust the pH of the reaction solution or to recover glycine was inevitably discarded, and ammonia recovery was difficult. Even if electrodialysis is used, ammonia can be recovered There are drawbacks that waste power and require many complicated operations, and industrial implementation has not been satisfactory. Summary of the Invention
  • the present inventors have conducted intensive studies on reaction methods and reaction conditions for solving the above problems, and microorganisms suitable for such reaction methods.
  • the aqueous glycinonitrile solution was subjected to a hydrolysis reaction in a hydrolysis reaction system under the action of a microbial enzyme having hydrolytic activity of a ditolyl group.
  • the hydrolysis reaction system removes at least one organic impurity compound containing a specific structure having a molecular weight of 95 or more that inhibits the microbial enzyme.
  • the organic impurity compound is contained in the hydrolysis reaction system during the hydrolysis reaction such that the content of the organic impurity compound in the hydrolysis reaction system is 10% by weight based on the weight of the hydrolysis reaction system.
  • the main object of the present invention is to provide an efficient and high-purity
  • An object of the present invention is to provide a method for producing glycine, which produces lysine and ammonia quantitatively and collects them separately, and has a low environmental load.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a glycine production system used in Example 12.
  • a glycinonitrile aqueous solution in a method for producing glycine there is provided a glycinonitrile aqueous solution in a method for producing glycine
  • the aqueous solution of glycinonitrile is subjected to a hydrolysis reaction in a hydrolysis reaction system under the action of a microbial enzyme having a hydrolytic activity of a ditolyl group to convert the glycinonitrile into glycine while producing ammonia as a by-product. Convert to thin,
  • the hydrolysis reaction system contains at least one organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme, and the at least one organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme has a molecular weight of 95 or more, and It contains at least one member selected from the group consisting of a lyl group, a carboxyl group, an amide group, an amino group, a hydroxyl group and a trimethyleneamine structure, and the trimethyleneamine structure has the following formula (1) ):
  • n an integer of 1 or more.
  • the content of the organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme in the hydrolysis reaction system is 10% by weight or less based on the weight of the hydrolysis reaction system.
  • Glycine is isolated from the hydrolysis reaction system
  • a method is provided that comprises: Next, in order to facilitate understanding of the present invention, basic features and preferred embodiments of the present invention will be listed.
  • the aqueous solution of glycinonitrile is added to the hydrolysis reaction system under the action of a microbial enzyme having a hydrolysis activity of a tril group.
  • the glycinonitrile is converted to glycine by-producing ammonia by a hydrolysis reaction,
  • the hydrolysis reaction system contains at least one organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme, wherein the at least one organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme has a molecular weight of 95 or more, and , A hydroxyl group, an amide group, an amino group, a hydroxy group, and a trimethyleneamine structure.
  • the trimethyleneamine structure has the following formula (1) ):
  • n an integer of 1 or more.
  • the content of the organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme in the hydrolysis reaction system is 10% by weight or less based on the weight of the hydrolysis reaction system.
  • Glycine is separated from the hydrolysis reaction system.
  • a method comprising:
  • the at least one organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme is a group consisting of synthesis of glycinonitrile from hydrogen cyanide, formaldehyde and ammonia, and hydrolysis of glycinonitrile to glycine and ammonia. 2.
  • each ⁇ 1 independently represents a ditolyl group, a propyloxyl group or an amide group, and ⁇ represents 2 or 3.
  • the at least one organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme comprises at least one compound selected from the group consisting of the following compounds (a) and (b): Or the method described in 2.
  • ⁇ 1 represents a nitrile group, a carboxyl group, or an amide group
  • each ⁇ 2 independently represents an amino group or a hydroxyl group
  • ⁇ represents an integer of 0 or more
  • ⁇ 1 represents an integer.
  • Each is independently represented by the following formula (4) or (5).
  • each Y 2 independently represents an amino group or a hydroxyl group.
  • each Y independently represents an amino group or a hydroxyl group
  • each Z 2 is independently represented by the following formula ( 8) or ( 9) .
  • Y 2 represents an amino group or a hydro ti xyl group
  • the above item 1 or 2, wherein the at least one organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme comprises at least one compound selected from the group consisting of the following compounds (c) and (d): 2. The method according to 2.
  • each Y 1 independently represents a ditolyl group, a propyloxyl group or an amide group.
  • n an integer of 4 or more.
  • the at least one organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme includes a compound having at least one skeleton in the molecule selected from the group consisting of the following skeletons (e) and (f). 3.
  • each Y 1 independently represents a ditolyl group, a propyloxyl group or an amide group, and n represents an integer of 2 or more.
  • Y 1 is independently in two preparative drill group, a carboxyl group or an amino-de-group
  • each Upsilon 2 independently represent an amino group or an arsenide de port hexyl group
  • eta represents an integer of 1 or more A skeleton represented by.
  • the at least one organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme includes a compound having at least one skeleton in a molecule selected from the group consisting of the following skeletons (g) and (h): 3.
  • each Y 1 independently represents a ditolyl group, a propyloxyl group or an amide group
  • each Y 2 independently represents an amino group or a hydroxyl group
  • n represents an integer of 2 or more.
  • Y 1 is independently in two preparative drill group, a carboxyl group or an amino-de-group, each Upsilon 2 independently represent an amino group or an arsenide de port hexyl group, a field integer of 1 or more ⁇ A skeleton represented by.
  • the at ⁇ also one organic impurity compound inhibiting microorganism enzyme, contact the 1 3 C-NMR spectrum measured in heavy water 53-: The method according to any one of the above items 1 to 8, characterized in that a peak is shown between LOO ppm.
  • the at least one organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme was found to have a UV-visible absorption spectrum measured for the hydrolysis reaction system of 340-380 nm and 440-4.
  • the concentration of the at least one organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme is 1% by weight or less based on the weight of the hydrolysis reaction system. The method according to any of the above.
  • the microbial enzyme having the activity of hydrolyzing a nitril group is selected from the group consisting of Acinetobacter, Rhodococcus, Corynepacterium, Alkaligenes, Mycobacterium, Rhodosiudomonas, and Candida. 17.
  • the strain of the genus Acinetobacter was deposited with the Deposit No. FE RM BP—2451, deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry of Japan. or AK2227 strain, deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan, under the accession number FERMBP — 7413.
  • Rhodococcus was deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry under the deposit number FERMBP — 5 2 1 9 Rhodococcus Maris BP — 4 7 9 — 9 strains 17.
  • the method according to item 17 above which is characterized in that:
  • strain belonging to the genus Alkaligenes was deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry under the deposit number FERMBP — 4750, strain Alkaligenes eucalysus IF ⁇ 131111. 17.
  • Rhodoche domonas strain of the genus Rhodoche domonas' Shueroides deposited under the American Type Culture Collection and having a deposit number of ATCC 1116-167. The method described in.
  • the strain of the genus Candida is Candida tropicalis having a deposit number of ATCC 2031, deposited with the American Type Culture Collection. The method described in 17 above.
  • Glycine and ammonia are separated from at least one selected from the group consisting of distillation, reactive distillation, entrainment with an inert gas, ion exchange, extraction, reprecipitation using a poor solvent, and crystallization by concentration or cooling.
  • 25. The method according to the above item 25, wherein the cells are separately collected by operation.
  • 27. Recover ammonia by distillation, reactive distillation or entrainment with an inert gas, and recover glycine by crystallization by concentrating or cooling the remaining liquid after recovery of ammonia.
  • the hydrolysis reaction system is subjected to a hydrolysis reaction under the action of a microbial enzyme produced by a microorganism added to the hydrolysis reaction system in a closed reaction system, and the glycinonitrile is converted to ammonia Converted to glycine while growing,
  • microorganism and the microbial enzyme separated by at least one operation selected from the group consisting of centrifugal filtration and membrane filtration, and the microbial enzyme produced as a by-product in steps (1) to (5)
  • Some of the organic impurity compounds that interfere with the process are removed from membrane filtration and separation using adsorbents. Separated by at least one operation selected from the group consisting of
  • aqueous glycinonitrile solution subject the aqueous glycinonitrile solution to a hydrolysis reaction, and convert the glycinonitrile to glycine while producing ammonia as a by-product;
  • a method for producing daricin comprising isolating the glycine from a reaction system, wherein the hydrolysis of the glycinonitrile is carried out in the presence of ammonia.
  • aqueous glycinonitrile solution and subject the aqueous glycinonitrile solution to a hydrolysis reaction to remove the glycinonitrile.
  • a method for producing dalysine which comprises converting monic acid to glycine while being by-produced, and isolating the glycine from a hydrolysis reaction system, wherein the hydrolysis reaction is carried out in the absence of a base and an acid.
  • a method characterized in that glycine is isolated from the reaction system and, on the other hand, ammonia by-product is recovered separately from the recovery of glycine.
  • Glycine and ammonia are distilled, reactively distilled, entrained by inert gas, ion-exchanged, extracted, reprecipitated with a poor solvent, and reduced by crystallization by concentration or cooling. 31. The method as described in 31 above, wherein the both are separately collected by one operation.
  • Ammonia is recovered by distillation, reactive distillation or entrainment with an inert gas, and glycine is recovered by concentrating the remaining liquid X after ammonia recovery by subjecting it to crystallization by cooling.
  • the present invention will be described in detail.
  • glycinonitrile is preferably synthesized from hydrogen cyanide, formaldehyde and ammonia.
  • a method of synthesizing glycinonitrile a known method can be used. That is, glycolonitrile (hydroxyacetonitrile) is synthesized from cyanide, hydrogen hydride and formaldehyde. Then, a method of synthesizing glycinonitrile by adding ammonia or a method of synthesizing dalicinonitrile directly from hydrogen cyanide, formaldehyde and ammonia can be used.
  • the hydrolysis reaction system of the present invention includes glycolonitrile, glycinonitrile, glycine, ammonia, water, a catalyst, organic impurity compounds that inhibit microbial enzymes, and the like.
  • the organic impurity compound that inhibits a microbial enzyme contained in the hydrolysis reaction system of the present invention is a substance that reversibly inhibits the activity of the microbial enzyme or reversibly inhibits the enzyme to inactivate the enzyme and reuse the microbial enzyme. It is a compound that makes it impossible.
  • Such an organic impurity compound has a molecular weight of 95 or more, and is a group consisting of a nitrile group, a carbonyl group, an amide group, an amino group, a hydroxyl group and a trimethylenamine structure. Compounds containing at least one selected are included.
  • Organic impurity compounds include raw materials used in the glycine production process, catalysts, etc.
  • organic impurity compound contained in the hydrolysis reaction system of the present invention include at least one of the following compounds (A) to (F) ′.
  • each Y 1 independently represents a ditolyl group, a propyloxyl group or an amide group, and n represents 2 or 3.
  • the hydrolysis products of the nitrile group of these condensable compounds include iminodiacetate, cyanomethylaminoacetate, iminodiacetamide, cyanomethylaminoacetamide, and carpamoylmethylamin.
  • Minoacetic acid tri-triacetic acid, N- (cyanomethyl) iminodiacetic acid, ⁇ , ⁇ -bis (cyanomethyl) aminoacetic acid, ⁇ — (potumbamoylmethyl) iminodiacetic acid, ⁇ , ⁇ — Bis (carbamoylmethyl) aminoacetic acid: tritrilotriacetamide, corrected paper (Rule 91) N- (cyanomethyl) iminodiacetamide, N, N-bis (cyanomethyl) aminoacetamide and the like.
  • ⁇ 1 represents a ditolyl group, a propyloxyl group or an amide group
  • each ⁇ 2 independently represents an amino group or a hydroxyl group
  • ⁇ represents an integer of 0 to 100.
  • ⁇ 1 are each independently represented by the following formula (4) or (5).
  • each Y independently represents an amino group or a hydroxyl group.
  • each Zeta 2 is it express by the following equation independently (8) or (9).
  • the compound represented by the formula (3) is an addition multimerization compound and a product obtained by hydrolyzing a ditolyl group of the addition multimerization compound.
  • the compound represented by the formula (6) is a cycloaddition compound having a pyrimidine skeleton in which the addition compound is cyclized, and a hydrolysis product thereof.
  • the compound represented by the formula (7) is a cycloaddition compound having a pyridine skeleton in which the addition compound is cyclized, and a hydrolysis product thereof.
  • Such adducts, etc. are exemplified by the cyanoaddition reaction of phenylacetonitrile in Japan, Chemical Chemistry Lecture, 1st Edition, Vol. 18-2, p. 347, published by The Chemical Society of Japan. It is known that methyl groups are formed by the mechanism of addition dimerization, addition trimerization, and cyclization or polymerization.
  • the addition dimerization compound represented by the formula (3) includes, for example, 1,3-diamino-2-iminobutyronitrile formed by an addition reaction of glycolonitrile and dalicinonitrile, 1 , 3 — dihydroxy 2 — imino ptyronitrile, 1 — amino 1-imimino 1-3 — hydroxyptyronitrile, or 3 — amino 2-imimino 1 1 — hem Droxyptilonitrile and the like.
  • the hydrolysis products of the ditolyl group of these compounds include 1,3-diamino-2-iminobutylic acid, 1,3-dihydroxy-2-imidinobutylic acid, 1 —Amino 2 —Imino 3 —Hydroxyptylactide 3 —Amino 2 —Imino 1 —Hydroxyptychlic Acid 1,3-Diamino-2—Iminobutylamide, 1,3-Dihydroxy-2—Iminobutylamide, 1—Amino2—Iminino-3—Hydroxybutylamide, 3-Amino 2-Imino 1-Hydroxybutylamide and the like.
  • compounds having the structure of the formula (4) in which a ditolyl group is added to a methylene group as an internal structure include 1, 3, and 5 — Triamino 1, 2,4—Diminohexantrile, 1, 3.—Diamino — 2,4 —Dimino — 5 — Hydroxidihexanetril, 1, 5 — diamino 2, 4 diamino 1 3 — hydroxyhexanenitrile, 3, 5 — diamino 1 2,4 — diimino 1 — hydroxyhexanitrile, 1 —Amino 2,4 diimino 3,5 —Dihydroxyhexaneditrile, 3 —Amino —2,4 —Dimino1,5 — Dihydroxyhexaneditrile , 5 — amino 2, 4 — dimino 1, 3 — dihydroxyhexaneditrile, 2, 4 — dimino — 1, 3, 5 — Hexane two door Li Le, etc.
  • 1,3,5—triamine 2,4—diminohexanoic acid, 1,3 are the hydrolysis products of the ditolyl group of these compounds.
  • —Jimino 2,4 Jimino 1 5 —Hydroxyhexanoid quasi-did, 1, 5 —Diamino 2,4 —Dimino 3 —Hydroxyhexanoic quat ., 3, 5-diamino 1, 2, 4 dihydro 1-hydroxyhexanoic acid, 11-amino 2, 4, diamino 3, 5, 5-dihydro Sihexanois quasid, 3—Amino 2, 4—Diimino 1, 5—Dihydroxyhexanois quasi, 5—Amino 2, 4—Dimino—1 , 3—Dihydroxyhexanoic acid quasid, 2,4—Dimino 1,3,5—Trihydroxyhexanoic acid quasid, 1,3,5 —Triamino2 , 4 di
  • compounds having the structure of the formula (5) in which a ditolyl group is added to an imino group as an internal structure include 2,4 diamino — (2—Amino 1—Iminoethylimino) Ptilonitrile, 2—Amino—4 Hydroxy 3— (2—Amino 1—Iminoethylimino) Ptilonitrile , 4 — amino 2 — hydroxy 3 — (2 — amino 1 — iminoethylimino) ptyronitrile, 2, 4 — dihydroxy 3 — (2 — amino 1 1 iminoethylimino) ptyronitrile, 2,4—diamino 3— (2—hydro Xy- 1 -amino tyrimino) ptyronitrile, 2-amino 4-hydroxy 1 3-(2-hydroxy 1-imi eno tylimino) ptyronitrile, 4-ami
  • the hydrolysis products of the ditolyl group of these compounds include 24-diamino 13-(2-amino 1-imino ethyl imino) petit acid, and 2-amino. ⁇ 4 ⁇ Hydroxy-1 3 ⁇ (2 ⁇ Amino 1-Imino-Ethyl-Imino) Plastic Acid 4 ⁇ Amino 1-2-Hydroxy-1 3 ⁇ (2 ⁇ Amino 1-Imino-ethylimino) Petri-acid, 2, 4 —Dihydroxy 1- 3 — (2—A, Mino- 1 —Iminoethyl-imino) Petit-acid, 2, 4—Jamino 3— (2—Hydroxy 1—Iminoethylimino) Acid Acid, 2—Amino 4—Hydroxy—3— (2—Hydroxy—I (No ethyl imino) petit acid, 4 — amino 2 — hydroxy 1 3 — (2 ”hidden 1-Iminoe
  • the compound represented by the formula (3) also includes an addition-multiplying compound in which a glycinonitrile / glycoronitrile nitrile group is further added to a methyl group / amino group of the above compound.
  • an addition-multiplying compound in which a glycinonitrile / glycoronitrile nitrile group is further added to a methyl group / amino group of the above compound.
  • a random structure in which the structural unit represented by the formula (4) and the structural unit represented by the formula (5) are alternately added in a molecule, and a block structure in which the same structural unit is arranged are included.
  • Examples of the cycloaddition compound represented by the formula (6), in which the terminal having a 2-tril group is cyclized to form a pyrimidine skeleton, include 4,5-diamino-2,6-bis (aminomethyl) pyrimidine.
  • This includes a random structure in which the structural unit shown in (4) and the structural unit shown in formula (5) are alternately added in the substituent, and a block structure in which the same structure is arranged. Further, it includes a hydrolysis product of a nitrile group of the above cycloaddition compound.
  • Examples of the cycloaddition compound represented by the formula (7), in which the terminal having a tritolyl group is cyclized to form a pyridine skeleton, include 2,3,4,5—tetraamino-6-aminomethylpyri.
  • cycloaddition compounds in which a ditolyl group is further added to the methylene group at the 6-position of these compounds and is substituted by a substituent having the structure shown in formula (8) or (9).
  • a random structure in which the structural unit represented by the formula (4) and the structural unit represented by the formula (5) are alternately added in the substituent, and a block structure in which the same structure is arranged are also included. Further, it also includes a hydrolysis product of a ditolyl group of the above cycloaddition compound.
  • each Y 1 independently represents a ditolyl group, a sulfoxyl group or an amide group.
  • n an integer of 4 to 200.
  • the compounds represented by the formulas (10) and () are products obtained by hydrolyzing a hydrogen cyanide tetramerized compound and a nitrile group of the hydrogen cyanide tetramerized compound.
  • the compound represented by the formula (12) is a hydrogen cyanide polymer.
  • Examples of the hydrogen cyanide tetramer represented by the formula (10) or (11) include diaminomaleonitrile and its tautomer, aminoiminosuccinonitrile.
  • the products obtained by hydrolyzing the ditolyl group of the hydrogen cyanide tetramerized compound include diaminomaleic acid, 2,3-diamino-13-cyanoacrylic acid, and 2,3-diamino-3-cyanoacyl acid.
  • each Y 1 is independently a nitrile group, a carboxyl group or Represents an amide group, and n represents an integer of 220.
  • Y 1 is independently in two preparative drill group, a carboxyl group or an amino-de-group, each Upsilon 2 independently represent an amino group or an arsenide de port hexyl group, eta is 1-7 integer 0 Represents a skeleton represented by).
  • the structure having the skeleton represented by the formula (13) includes a hydrogen cyanide polymerized structure and a structure obtained by hydrolyzing a ditolyl group thereof.
  • Examples thereof include an amino cyanomethylene structure and an aminocarbamoyl structure.
  • Examples include a structure having a methylene structure and / or an aminocarboxymethylene structure and having a number of repetitions of 2 or more.
  • 1 3 C was measured in heavy water - in the NMR spectra, methylene structure 7 0-9 Compounds showing a peak between 0 ppm are included.
  • the compound having a skeleton represented by the formula (14) or (15) includes a polycyclic compound and a hydrolyzate of a ditolyl group thereof, and includes, for example, 3, 4, 4, 5- Triamino 4 — (Cyano, carboxy or calvamoyl) — 3,4,5,6 —Tetrahydrid 5-, 6-position of the 6-membered ring of the pyridine skeleton is the 2-, 3-position of the adjacent 6-membered ring.
  • polycyclic structures, structures, and 3,7,9,10—tetraamino—3,4,6,7,9,10—hexahydridopyridino [2,3—e] pyridines Polycyclic structures in which positions 6, 7, 8, and 9 of the skeleton are the 5, 10, 4, and 3 positions of the adjacent pyridine skeleton.
  • Such polycyclic compounds include compounds whose methylene structure shows a peak between 60 and 80 ppm in 1 C-NMR spectrum measured in heavy water. Also, compounds exhibiting an absorption maximum at 380 nm and 460 nm in the ultraviolet-visible absorption spectrum are included.
  • each Y 1 independently represents a ditolyl group, a sulfoxyl group or an amide group, each ⁇ 2 independently represents an amino group or a hydroxyl group, and ⁇ is an integer of 210 Represents.
  • Y 1 is independently in two preparative drill group, a carboxyl group or an amino-de-group, each Upsilon 2 independently represent an amino group or an arsenide de port hexyl group, eta represents an integer of 1 7 0
  • the skeleton represented by ' It is known that an oxidized polymer having a skeleton represented by the formula (16) and a product obtained by hydrolyzing a nitrile group thereof are formed by a reaction in which methylene groups are oxidatively coupled.
  • glycolonitrile and glycinonitrile are oxidized and cleaved, 2,3-diaminosuccinotril, 2-amino-3, hydroxysuccinonitrile, and these are hydrolysates.
  • the oxidized polymerized structure having the skeleton of (16) and the structure obtained by hydrolyzing the ditolyl group thereof include an aminocyanomethylene structure, an aminocarbamoylmethylene structure, an aminocarboxymethylene structure, and a hydroxycyanone.
  • the compound having the skeleton represented by the formula (17) or (18) is produced by cycloaddition of the cyano group of the above-mentioned oxidized polymer structure.
  • Examples of the polycyclic compound having the structure represented by the formula (17) or (18) and the product obtained by hydrolyzing the ditolyl group thereof include 3, 4, 4, 5, and 14- (Cyano, carboxy or carbamoyl) 1-3,4,5,6-tetrahydropyrididine skeleton of the 6-membered ring of the 6-membered ring of the 6-membered ring of the adjacent 6-membered ring Polycyclic structures at the 2- and 3-positions, and 3, 7, 9, 10 — (amino and / or hydroxy) — 3, 4, 6, 7, 9, 9, 10 — hexahydripiri Dino [2,3—e] includes compounds with a polycyclic structure in which the 6,7,8,9 position of the pyridine skeleton is the 5,10,4,3 position of the adjacent pyridine
  • Compounds having such a polycyclic structure include compounds having a methylene structure showing a peak between 60 and 80 ppm in lo C—NMR spectrum measured in heavy water. In addition, compounds that exhibit an absorption maximum between 340 and 380 nm and between 440 and 480 nm in the ultraviolet-visible absorption spectrum are also included.
  • n represents an integer from:! To 150.
  • the organic impurity compound included in the hydrolysis reaction system of the present invention includes a cyclization reaction product of a condensation reaction product of a hydroxyl group and an amino group, and an addition reaction product of a nitrile group and an active methylene group.
  • compounds formed by combining these reactions are also included. That is,
  • the organic impurity compounds contained in the hydrolysis reaction system of the present invention are all polyfunctional compounds having a molecular weight of 95 or more, and they significantly reduce the activity of the microbial enzyme.
  • the content of the compound having a molecular weight of 95 or more, preferably a molecular weight of 130 or more is 1.0% by weight or less, preferably 5% by weight or less, and more preferably 1% by weight or less.
  • the activity of microbial enzymes and the like is improved by producing glycine under the conditions maintained.
  • oxygen dissolved in the hydrolysis reaction system is added to the weight of the hydrolysis reaction system.
  • the concentration of oxygen dissolved in an aqueous solution under atmospheric pressure is usually 8 to 10 ppm, but if the concentration of dissolved oxygen is reduced to 5 wt ppm or less, the effect of reducing the generation of by-products can be seen.
  • the dissolved oxygen concentration is preferably adjusted to 0.5 wt ppm or less, more preferably to 0.5 wt ppm or less.
  • a closed reaction system that blocks air from leaking into the reaction system a reaction system pressurized with an inert gas, and an inert gas are used. It is possible to use a circulated reaction system or a reaction system with a pressure lower than atmospheric pressure. it can.
  • the inert gas rare gases such as helium gas and argon gas, natural gases such as methane gas, ethane gas and propane gas, low boiling ethers such as dimethyl ether, or nitrogen gas can be used alone or in combination. . It is preferable to use nitrogen gas for reasons such as safety.
  • the pressure range in this case is not particularly limited. However, in consideration of the pressure resistance of the microbial enzyme to be used, it is preferable that the pressure exceeds atmospheric pressure and is equal to or less than 1.0 MPa, and more preferable that the pressure exceeds atmospheric pressure and is equal to or less than 0.5 MPa. .
  • the reaction can be performed at a pressure lower than atmospheric pressure exceeding 0.7 kPa, which is the vapor pressure of water at 0 ° C, and 4.atmospheric pressure or higher. Less than is preferred.
  • Reducing paper that uses a reducing biochemical compound, formic acid compound, or sulfite compound as the reducing compound used in the reducing compound addition method (Rule 91) be able to.
  • the reducing biochemical compound used in the method for adding a reducing compound is not particularly limited. Examples thereof include ascorbic acid esters such as L-ascorbic acid, L-ascorbic acid stearate, and L-ascorbic acid.
  • Salts such as tritium, dals thione, cistine salts such as L-cystine, L-cystine hydrochloride monohydrate, L-cystineethyl ester hydrochloride and L-cystine methyl ester hydrochloride
  • N-substituted cysteines such as cysteine esters or N-acetyl-L-cystine can be used.
  • L-ascorbic acid is used.
  • the amount of the reducing biochemical compound added depends on the concentration of dissolved oxygen, but from the viewpoint of stabilization of glycinonitrile, is preferably 0.001 to 5 mo 1%, more preferably 0.1% to glycinonitrile.
  • the formic acid compound used in the method for adding a reducing compound is not particularly limited.
  • formic acid salts such as dicarboxylic acid and ammonium formate, and formate esters such as methyl formate and ethyl formate are used.
  • formic acid or ammonium formate is used.
  • the amount of the formic acid compound added varies depending on the dissolved oxygen concentration. However, from the viewpoint of stabilizing glycinonitrile, the amount of the formic acid compound is preferably 0.02 to 8 mo 1%, more preferably 0.02%, based on glycinonitrile. Use 2 to 4 mol%.
  • the sulfite compound used in the method for adding a reducing compound is not particularly limited. Examples thereof include sulfurous acid gas, sulfurous acid, sodium sodium sulfite, sodium hydrogen sulfite, sodium bisulfite, calcium bisulfite, and sodium sulfite. An ammonia or the like can be used. Preferably, diammonium sulfite is used. However, since the sulfite compound is an electrolyte and also has the effect of promoting the formation of by-products, the amount of the sulfite compound to be added to glycinonitrile is 0.01 based on the conditions described below. To 2% by weight, preferably 0 ⁇ '01 to ⁇ % by weight.
  • a method for reducing the content of the organic impurity compound contained in the hydrolysis reaction system of the present invention to 10% by weight or less a method using ammonia as a glycinonitrile stabilizer may be mentioned.
  • Glycinonitrile releases ammonia when heated to produce imine compounds such as iminodiacetonitrile, and is further modified to produce black compounds, so the hydrolysis reaction system in which ammonia is dissolved Can be used to stabilize glycinonitrile.
  • the amount of ammonia added varies depending on the reaction temperature and time, but is preferably 0.01 to 5 mol, more preferably 0.01 to 2 mol, per 1 m 01 of glycinonitrile.
  • the excess ammonia used in the synthesis of dalicinonitrile may be used without separation.
  • the electrolyte contained in the hydrolysis reaction system is added to the weight of glycinonitrile.
  • a method of controlling the content to 2% by weight or less can be given.
  • Electrolytes are known to promote the formation of by-products from nitrile compounds. You.
  • the electrolyte used in the present invention includes, in addition to a mixture of an alkali metal salt, an alkaline earth metal salt, and a phosphate buffer, an alkali metal such as caustic soda capable of forming a salt with glycine and alkali earth.
  • electrolytes include compounds of a class of metals, and mineral acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid, and nitric acid.
  • the addition of these electrolytes promotes the formation of by-products from nitrile compounds.
  • electrolytes have the effect of increasing the dissolved amount of oxygen when added to aqueous solutions. (Chemical Handbook issued by the Chemical Society of Japan, 4th revised edition, II, p. 159, table 8.54). Therefore, the electrolyte used as a culture medium or buffer in the microbial enzyme manufacturing process was washed to a predetermined amount to reduce the amount of alkali catalyst contained in the aqueous glycinonitrile solution and adjust the pH of the reaction solution.
  • the total amount of the electrolyte contained in the hydrolysis reaction system is 2% by weight or less, preferably 1% by weight or less, more preferably 0.5% by weight or less based on the weight of glycinonitrile.
  • microorganism that produces a microbial enzyme having hydrolytic activity of a nitrile group used in the present invention examples include, for example, genus Acinetobacter, genus Rhodococcus, Genus Corynebacterium, genus Al cal igenes, genus Mycobacterium: Rhodopseudomonas, candy evening
  • Suitable microorganisms are those belonging to the genus (Candida), but are not limited thereto. Specifically, the following strains may be mentioned,
  • AK226 sp. AK226 (Deposit No. FERMBP-2451) deposited on May 28, 1960 (the original deposit date) No. 6 3 — 2 5 9 6
  • a commonly used medium can be used.
  • the carbon source include organic acids such as darcos, glycerin, saccharose, fructose, and acetic acid, dextrin, maltose, and the like.
  • the nitrogen source include ammonia and its salts, urea, and sulfuric acid. Salts, nitrates and organic nitrogen sources (yeast extract, malt extract, peptone, soybean oil, meat extract, etc.) are used.
  • inorganic nutrients such as phosphate, sodium, potassium, iron, magnesium, cobalt, manganese and zinc, and vitamins are appropriately added to the medium.
  • the cultivation is carried out aerobically at a pH of 4 to 10, preferably pH 6 to 8, at a temperature of 5 to 50 ° C, preferably 20 to 35 ° C. Lactam compounds ( ⁇ -lactam, ⁇ -latitam, ⁇ -force prolactam, etc.), nitrile compounds, amidation
  • An enzyme inducer such as a compound may be added.
  • Microorganisms used in the present invention Microorganisms that produce enzymes can be used industrially as they are, but mutants improved by a method of inducing mutation with a suitable mutagen or a genetic engineering technique, such as enzymes A mutant strain that produces constitutively can be produced and used.
  • a microorganism collected from a culture solution may be used as it is, or a microbial treated product (crushed microorganism, an enzyme separated from a crushed microorganism, immobilized microorganism, A treated product in which an enzyme separated and extracted from a microorganism is immobilized may be used. Collection of the microorganism from the culture solution can be performed by a known method.
  • the treated microorganisms or microorganisms separated by the above-described method can be once suspended and stored in distilled water or a buffer solution.
  • distilled water particularly the distilled water separated and distilled under the condition that the air is shut off in the crystallization step or the like.
  • a stabilizer can be added to the storage solution for storage stability. In this case, too, it is preferable to use daricin as a stabilizer in order to reduce post-reaction waste.
  • a method of adding the aqueous solution of glycinonitrile or the aqueous solution of glycinonitrile containing ammonia obtained by the above-described method to the aqueous suspension of the treated microorganism or microorganism obtained by the above-described method is used to quickly perform the method.
  • the hydrolysis reaction of glycinonitrile proceeds, and glycine can be produced. That is, usually, the microorganism or the processed microorganism is charged into a reactor, for example, in a dry microorganism equivalent of 0.01 to 5% by weight, and glycinonitrile as a substrate in a weight of 1 to 40% by weight.
  • the reaction may be carried out at 0 ° C., preferably at 10 to 50, for a reaction time of, for example, 1 to 24 hours, preferably 3 to 8 hours.
  • Glycinonitrile may be charged at a low concentration and added over time, or the reaction temperature may be changed over time.
  • the pH of the reaction solution after the reaction increases as compared to before the reaction.
  • a buffer solution can be added before the reaction or an acid or alkali can be added during the reaction, but the amount of waste after the reaction is reduced. Above, it is preferable not to add such a buffer, acid or alkali to the hydrolysis reaction system.
  • the hydrolysis reaction can be carried out in an open reactor, it is closed using a closed reactor from the viewpoint of preventing environmental pollution due to scattering of by-product ammonia, recovering ammonia, and shutting off air.
  • Ammonia is separated from glycine by distillation, reactive distillation, entrainment with inert gas, ion exchange, extraction, reprecipitation using a poor solvent, and / or crystallization by concentration or cooling.
  • Can be recovered from Ammonia is recovered from the hydrolysis reaction system by distillation, reactive distillation, or entrainment separation into an inert gas from the point that operation is simple and no extra components such as organic solvents, acids, and alkalis are used. It is preferable to recover glycine by subjecting the remaining liquid to crystallization by concentration or cooling.
  • a single-tube tower, a tray tower, or a packed tower equipped with a cooler for cooling and recovering ammonia and water is used as the reaction apparatus. It is preferable to continuously or intermittently perform the reduced-pressure reactive distillation under a pressure condition of 20 kPa or more to 0.6 kPa or more in this case. More preferably, the reaction distillation under reduced pressure is performed under a pressure condition of 12.6 kPa to 1.3 kPa.
  • the reactor is equipped with an inert gas blowing nozzle and a cooling trap for recovering ammonia and water from the inert gas, and is used under conditions of slight pressure to reduced pressure.
  • Ammonia can be continuously or intermittently entrained in the inert gas and separated from the reaction solution. Further, in order to promote the separation of ammonia, reduced pressure reactive distillation can be performed under inert gas flow conditions.
  • the reaction method can be a patch type method or a flow type reaction method, and these may be used in combination. As described above, the reaction method of the hydrolysis reaction system differs depending on the method of adding the microorganism glycinotolyl and the method of separating and recovering ammonia.
  • a patch-type system or a multi-stage flow-type reaction system using a multi-stage stirring tank can be used.
  • a tube-type system is mainly used. The reaction can be carried out by a tube type flow reaction system using a reaction device of a mold type or a system combining these, but is not limited thereto.
  • Glycinonitrile is hydrolyzed with a molar yield of approximately 100%. All by-produced ammonia can be produced and accumulated in the closed reactor once as a high-concentration aqueous solution of glycine in the form of ammonium salt of glycine. In addition, all or most of the generated ammonia can be separated from the reaction solution by a reactive distillation method or an inert gas flow method at the same time as the reaction, and then cooled and recovered. When the cells have a nitrile hydratase enzyme as a microbial enzyme, glycine is hydrolyzed and glycine amide is co-produced in the hydrolysis system.
  • a microorganism or a microbial enzyme having glycine amide hydrolytic activity it can be completely converted to glycine and ammonia.
  • Recovery of glycine from a high-concentration aqueous solution of glycine containing glycine ammonium salt can be performed, for example, by separating microorganisms or microbial enzymes from the reaction solution by centrifugal filtration and / or membrane filtration. After that, it can be recovered by crystallization, ion exchange, or reprecipitation using a poor solvent.
  • Ammonia can be recovered by distillation or extraction after being separated by evaporation together with some water.
  • Preferred production methods of the present invention include, for example, (1) in a closed reaction system, hydrogen cyanide is reacted with formaldehyde in an aqueous medium in the presence of an alkali catalyst to obtain an aqueous solution of dali coronitrile; (2) Ammonia is added to the aqueous solution of glycolonitrile and reacted to obtain an aqueous solution of glycinonitrile while producing water. Most of the ammonia and a portion of the water are separated by distillation to obtain glycinonitrile. A hydrolysis reaction system containing aqueous solution and unseparated ammonia was obtained.
  • the hydrolysis reaction system is subjected to a hydrolysis reaction under the action of a microbial enzyme produced by a microorganism added to the hydrolysis reaction system in a closed reaction system, and the glycinonitrile is converted to ammonia (5) separating the microorganism and the microbial enzyme by at least one operation selected from the group consisting of centrifugal filtration and membrane filtration; Part of the organic impurity compound that inhibits the microbial enzyme by-produced in (5) to (5) is separated by at least one operation selected from the group consisting of membrane filtration and separation using an adsorbent; 6) The separated microorganism and the microorganism enzyme are recycled to step (4), and
  • the ammonia by-produced in () and the excess water remaining in the hydrolysis reaction system after step (4) are separated by distillation, and the separated ammonia 5.8 and water are recycled to step (2), and (9) after or simultaneously with step (7), the glycine is separated by crystallization, and (9) the glycine is separated.
  • Glycine can be produced by drying the glycine crystals.
  • the aqueous glycinonitrile solution is subjected to a hydrolysis reaction to convert the glycinonitrile into glycine while producing ammonia as a by-product, and then the glycine is isolated from the hydrolysis reaction system.
  • the glycinonitrile is hydrolyzed in the presence of ammonia.
  • the concentration of ammonia is preferably 0.001 to 5 mo 1 per 1 mol of glycinonitrile.
  • glycine is isolated from the hydrolysis reaction system in the absence of a base and an acid, and ammonia produced as a by-product is collected separately from glycine. Can be.
  • glycine and ammonia are distilled, reactively distilled, entrained by inert gas, ion exchange, extraction, poor solvent It is preferable to collect them separately by at least one operation selected from the group consisting of reprecipitation using, and crystallization by concentration or cooling.
  • ammonia should be recovered by distillation, reactive distillation or entrainment with an inert gas, and glycine should be recovered by concentrating the remaining liquid after ammonia recovery or subjecting it to crystallization by cooling. Is preferred.
  • Evaporation and recovery of ammonia and water were performed using a thin-film distillation apparatus (Shibata Chemical Co., Ltd., Japan) under reduced pressure and a residence time of less than 1 minute.
  • proteins were removed by filtration under pressure using an ultrafiltration filter for a syringe (Termo Co., Japan).
  • proteins were removed using a circulating ultrafiltration membrane device (Ultrafiltration membrane SIP-1003 manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd., Japan).
  • Glycine Glycine, glycinonitrile, glycolonitrile, iminodiacetonitrile, iminodiacetic acid, hexamethylenetetramine, ammonia, sulfate ion, sodium ion by ion pair chromatography And so on.
  • a liquid chromatographic device LC-16 manufactured by Shima ⁇ Co., Ltd., Japan
  • RI, and UV detectors RI, and UV detectors
  • ⁇ DS column Tosoh, Japan
  • GPC gel permeation chromatography
  • UV-visible spectrophotometer (U-32010 manufactured by Hitachi, Ltd., Japan) the UV-visible absorption spectrum of the hydrolysis reaction system at 200 nm to 800 nm was measured.
  • the coloring compound contained in the hydrolysis reaction system was analyzed by obtaining the wavelength and the peak height showing the absorption maximum from the obtained spectrum.
  • An 8-liter autoclave (made by Asahi Kasei Corporation, Japan) equipped with a stirrer and a jacket was used as the reactor.
  • the inside of the reactor was set to a nitrogen atmosphere, and 1200 g of 37% formaldehyde and an equivalent amount of hydrogen cyanide were added thereto and reacted to produce an aqueous solution of glycolonitrile.
  • 500 g of a 25% aqueous ammonia solution was added to the obtained aqueous solution of glycolonitrile and reacted for 2 hours to produce glycinonitrile.
  • glycinonitrile aqueous solution was analyzed by liquid chromatography, it contained 0.8% by weight of iminodiacetonitrile in addition to glycinoetrile.
  • Glycinonitrile water was also analyzed by gel permeation chromatography. Analysis of the solution revealed that the aqueous solution contained 1.2% by weight of an organic impurity compound having a molecular weight of 95 or more.
  • the cultured microorganism was collected from the culture solution by centrifugation and washed three times with distilled water. Distilled water was added to the washed microorganism to obtain a microorganism suspension of 18.0% by weight in terms of dry microorganism weight.
  • Distilled water was added to the washed microorganism to obtain a microorganism suspension of 18.0% by weight in terms of dry microorganism weight.
  • 53.3 g of the 30% by weight aqueous glycinonitrile solution synthesized in (1) above and 46.7 g of distilled water were placed in a nitrogen atmosphere. was charged.
  • 1.0 g of the microbial suspension was added to the autoclave, and the reaction was started at 40 ° C. At this time, the pH of the mixture in the auto crepe was about 7.
  • the pH increased after the start of the reaction, and became pH 10 two hours later.
  • the reaction was performed for 10 hours to obtain a reaction solution.
  • the quantification of glycinonitrile as the raw material and the glycine produced by the liquid chromatography method and the quantification of ammonia by the Nessler method was done.
  • the raw material glycinonitrile was completely disappeared from the reaction solution, and the yield of glycine was 99%.
  • Ammonia was generated quantitatively.
  • the amount of glycine produced per dry microorganism was 11 ⁇ g / g, and the activity of producing glycine was 12 g / g ⁇ Hr.
  • the remaining reaction solution (98 g) was subjected to refrigerated centrifugation to separate microorganisms, and the supernatant was recovered. Ultrafiltration of the collected supernatant under pressure The remaining microorganisms and proteins were removed through a filter. When an ultraviolet-visible absorption spectrum was measured using 2 ml of the obtained filtrate, the absorbance at a wavelength of 468 nm was 0.79. The remainder of the supernatant was passed through a thin-film distillation apparatus, and the ammonia and excess water were separated by evaporation. The coagulated liquid and the ice and liquid collected in the dry ice ethanol trap were combined to obtain 48 g of ammonia water. In the bottom, 43 g of glycine concentrate was recovered. The concentrate was crystallized while cooling to room temperature. The crystals obtained by one crystallization operation were dried to obtain 16.5 g of glycine crystals. The purity of the resulting glycine was 99.99%. Comparative Example 1
  • the aqueous glycinoethyl solution heated for 30 minutes or more had an ammonia odor.
  • the concentration of the aqueous solution with the heating time the concentration of glycinonitrile is between 30% by weight and 35% by weight, which indicates that the glycinonitrile is denatured. It has been found.
  • the amount of the organic pure compound having a molecular weight of 95 or more increased with time.
  • Organic impurities compound includes a I Mi Bruno Jiase Toni Application Benefits Le, Besides 1 3 C - Gobutsu and of a peak between 5 0 to 9 O ppm in the NMR spectrum Torire, ultraviolet-visible absorption In the spectrum, compounds showing absorption maxima at 380 nm and 468 nm were included.
  • Microbial hydrolysis activities were compared using 12 types of samples obtained by combining 11 types of the heated liquid sampled above and an unheated aqueous solution of dalicinonitrile.
  • a 5.0 ml sample was charged into a test tube, and 5.0 ml of distilled water was added thereto.
  • a suspension of microorganisms of 12.5% by weight by dry microorganism weight conversion was prepared using Acinetobacter p. Sp. AK226 strain cultured in the same manner as in Example 1. 0.5 ml of the prepared microorganism suspension was added to each test tube, and the tube was sealed with a parafilm.
  • a sealed test tube was set in a thermostatic shaker in a nitrogen box, and hydrolysis was carried out at 30 ° C for 8 hours. 2 g of the reaction solution was analyzed by liquid chromatography. As shown in Table 1, the glycine yield depends on the concentration of the organic impurity compound, and the concentration of the organic impurity compound was corrected to 10% by weight on paper (Rule 91). Above this point, there was a significant decrease (see results for samples 11 and 12). Most of the components other than glycine contained in the reaction solution are unreacted glycinonitrile, which suggests that the organic impurity compounds greatly inhibited the enzyme activity of the microorganism.
  • the cultured microorganism was collected from the culture solution by centrifugation and washed three times with distilled water. Distilled water was added to the washed microorganism to obtain a microorganism suspension of 5.0% by weight in terms of dry microorganism weight.
  • a pressure-resistant Schlenk tube replaced with nitrogen gas, 1.0 ml of a microorganism suspension and 16 ml of distilled water were added under a nitrogen stream, and 3 mi of glycinonitrile aqueous solution was further added.
  • the pressure-resistant Schlenk tube was sealed, and the reaction was started at 20. At this time, the pH of the mixture in the autoclave was about 7, and after 2 hours, it was ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .1.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a 30% by weight aqueous glycinonitrile solution was synthesized.
  • the cultured microorganism was collected from the culture solution by centrifugation and washed three times with distilled water. Distilled water was added to the washed microorganism to obtain a microorganism suspension of 12.5% by weight in terms of dry microorganism weight.
  • a 20 O ml glass clave replaced with nitrogen gas, the above
  • Example 4 In the same manner as in Example 1, 48 g of aqueous ammonia and 43 g of glycine concentrated solution were recovered through centrifugation, ultrafiltration and thin-film distillation. The glycine concentrate was subjected to glycine crystallization and drying operations to obtain 17 g of glycine crystals. The purity of the obtained glycine was 99.99%.
  • Example 4 In the same manner as in Example 1, 48 g of aqueous ammonia and 43 g of glycine concentrated solution were recovered through centrifugation, ultrafiltration and thin-film distillation. The glycine concentrate was subjected to glycine crystallization and drying operations to obtain 17 g of glycine crystals. The purity of the obtained glycine was 99.99%. Example 4
  • Example 3 The microorganisms recovered by centrifugation in Example 3 were washed three times with distilled water, and distilled water was added to prepare 5 g of a microorganism suspension.
  • Glycine was produced in the same manner as in Example 3 using the obtained suspension of the microorganism. Specifically, 200 ml of glass autoclave replaced with nitrogen gas was added to the 30% produced in (1) above. Under a nitrogen atmosphere, 50.0 g of a weight% aqueous glycinonitrile solution and 45.0 g of distilled water were charged. Next, 5 g of the microorganism suspension was added to the autoclave, and the reaction was started at 50 ° C. The reaction was performed for 8 hours to obtain a reaction solution.
  • Example 2 Using 2 g of the obtained 100 g reaction solution, analysis was carried out in the same manner as in Example 1. As a result, glycinonitrile was completely lost, the yield of glycine was 99%, and ammonia was produced quantitatively.
  • the amount of glycine produced per dried microorganism was 157 g / g, and the activity of producing glycine was 27 g / g ⁇ ⁇ .
  • the total amount of glycine produced per dried microorganism in Example 3 and Example 4 was 335 g / g, and the glycine production activity was 20 g / g ⁇ Hr.
  • Example 5 From the remaining reaction solution, 48 g of ammonia water and 42 g of a glycine concentrated solution were recovered in the same manner as in Example 1. The daricin concentrated solution was subjected to glycine crystallization and drying operations to obtain 16 g of glycine crystals. The resulting glycine had a purity of 99.99%.
  • Example 5 Example 5
  • Example 4 After the microorganisms recovered by centrifugation in Example 4 were washed three times with distilled water, distilled water was added to prepare 5 g of a microorganism suspension. Glycine was produced in the same manner as in Example 3 using the obtained suspension of the microorganism. More specifically, 20 O ml glass autoclaved with nitrogen gas was added to the 30 PT / JP00 / 09353
  • the amount of glycine produced per dried microorganism was 13.6 gZg, and the activity of glycine production was 17 gZg'Hr.
  • the total amount of glycine produced per dry microorganism in Examples 3, 4 and 5 was 418, and the glycine production activity was 268'11r.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a 30% by weight aqueous glycinonitrile solution was synthesized.
  • Example 7 The amount of glycine produced per dried microorganism was 100 g / g, and the activity of glycine production was 10.0 g / g ⁇ Hr. The remaining reaction solution was subjected to the same treatment as in Example 1, and 4.6 g of daricin was crystallized and recovered.
  • Example 7 The remaining reaction solution was subjected to the same treatment as in Example 1, and 4.6 g of daricin was crystallized and recovered.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a 30% by weight glycinonitrile aqueous solution was synthesized.
  • Corynebacterium tritrichophilus (ATCCC211419) was cultured under the same conditions as in Example 6. .
  • the cultured microorganism was collected from the culture solution by centrifugation and washed three times with distilled water. Distilled water was added to the washed microorganism to obtain a microorganism suspension of 8.0% by weight in terms of dry microorganism weight.
  • a hydrolysis reaction of glycinonitrile was carried out for a total of 10 hours in the same manner as in Example 2.
  • a prayer was conducted in the same manner as in Example 1 using 2 g of the obtained 32 g reaction solution. As a result, glycinonitrile was completely eliminated, and the yield of daricin was 99%. Ammonia was also generated quantitatively.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a 30% by weight glycinonitrile aqueous solution was synthesized.
  • the cultured microorganism was collected from the culture solution by centrifugation and washed three times with distilled water. Distilled water was added to the washed microorganism to obtain a microorganism suspension of 12.5% by weight in terms of dry microorganism weight.
  • Nitrogen gas injection nozzles reaching the bottom of three 100-Oml constant-temperature jacketed tank-type flasks with a stirrer, a nitrogen gas nozzle reaching the bottom, a mist separator connected to a dry ice trap, a thermometer, and a sampler Prepare a reactor with a ring tube.
  • a separate flask was charged with 9 ml of the microorganism suspension, and 30 ml of a 30% by weight aqueous glycinonitrile solution and 16 ml of distilled water were charged.
  • one hour after the reaction was started at 30 ° C while feeding 3 liters of nitrogen gas per hour using a gas flow meter, 3 O ml of 30% by weight Synonitrile aqueous solution Added to reactor. This operation was repeated three more times, and the reaction was performed for a total of 5 hours.
  • 15 g of the reaction by-product was recovered by combining the ice and the liquid.
  • the recovered reaction by-product was dissolved in 50 ml of water, and the amount of ammonia was measured by the Nessler method. As a result, 14 g of ammonia was recovered. Further, 305 g of the reaction solution was recovered, and analysis was performed in the same manner as in Example 1 using 2 g of the reaction solution. As a result, glycinonitrile disappeared, and the glycine yield was 99%. A trace amount of ammonia remained. The amount of glycine produced per dried microorganism was 53 g Z g, and the activity of glycine production was llg g'H r.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a 30% by weight glycinonitrile aqueous solution was synthesized.
  • the cultured microorganism was collected from the culture solution by centrifugation and washed three times with distilled water. Distilled water was added to the washed microorganism to obtain a microorganism suspension of 12.5% by weight in terms of dry microorganism weight.
  • Single-tube type distillation connected to a vacuum pump through three nozzles of nitrogen gas that reaches the bottom of a three-piece, 100 m1 constant-temperature jacket tank with a stirrer and a dry ice trap.
  • a reactor was provided with a tower, a pressure sensor, a thermometer, and a sampling tube connected to a liquid pump.
  • Separable flasks were charged with 11 ml of the microorganism suspension, 30 ml of a 30% by weight glycinonitrile aqueous solution, and 159 ml of distilled water.
  • the reaction was started at 30 ° C while feeding 3 liters of nitrogen gas per hour using a gas flow meter. One hour later.
  • 30 ml of a 30% by weight aqueous solution of glycinonitrile was added to the reactor. This operation was repeated three more times, and the reaction was performed for a total of 5 hours.
  • 25 g of reaction by-products including ice and liquid were collected.
  • the recovered reaction by-product was dissolved in 50 ml of water, and the amount of ammonia was determined by the Nessler method. As a result, 15 g of ammonia was recovered. Further, 295 g of the reaction solution was recovered, and analysis was performed in the same manner as in Example 1 using 2 g of the reaction solution. As a result, glycinonitrile disappeared, and the glycine yield was 99%. Also, trace amount of ammonia remains. Existed. The amount of glycine produced per dry microorganism was 42 gg, the activity of glycine production was 9 g / gHr, and the remaining reaction solution (293 g) was treated in the same manner as in Example 1. Then, 48 g of glycine was crystallized and recovered.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a 30% by weight glycinonitrile aqueous solution was synthesized.
  • microorganisms were cultured under the same conditions as in Example 6.
  • Acinetobacter sp. AK227 strain (FERM BP—7413) Mycobacterium sp. AC 777 strain (FERM BP— 2352) Rhodoseudomonas suheroides (ATCC 1 1 167)
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a 30% by weight aqueous glycinonitrile solution was synthesized.
  • microorganisms were cultured under the same conditions as in Example 6.
  • Acinetobacter sp. AK226 strain (FERM BP-2451) Rhodococcus maris BP- 479-9 strain (FERM BP-5219) Corynebacterium sp. C5 strain (FERM BP-7414)
  • Corynepacterium nitriophilus (ATCC 2141 9)
  • microorganism was collected from the culture by centrifugation and washed three times with distilled water. Distilled water was added to the washed microorganism to obtain a 12.5% by weight microorganism suspension in terms of dry microorganism weight. 200 ml of glass autoclaved with nitrogen gas was placed on the 30% by weight aqueous glycinonitrile solution prepared in (1) above.
  • the amount of produced ammonia was quantified by the Nessler method, and the amount of dalicinonitrile as the raw material and the amount of glycine produced were quantified by the liquid chromatography method.
  • Example 3 shows the results.
  • a 1-liter stainless steel autocrepe 6, 7, 8 and a flash distillation unit 9 with a stirrer, level sensor, pressure gauge, safety valve and temperature indicator were connected in series, and under the following conditions, A glycinonitrile aqueous solution was synthesized. Prior to the reaction, the autoclaves 6, 7, 8 and the piping connecting them were purged with nitrogen. Three diaphragm pumps were prepared, and liquefied hydrogen hydride 2 was added for 100 g hours with a 37% by weight aqueous solution of formaldehyde 1 (containing less than 10% by weight of methyl alcohol), which had been purged with nitrogen using the pumps.
  • reaction temperature was set at 40 ° C, and the reaction for producing glycolonitrile was started. An exotherm was observed immediately after the start of the reaction, but the reaction changed at the set temperature.
  • the residence time was adjusted to 1 hour using a level control outlet, and the reaction solution containing the glycolonitrile from autoclave 7 was fed to the autoclave 8 by a pump, and at the same time, 0.2 MPa.
  • Ammonia gas 4 was continuously fed through a mass flow controller at 82 normal liters / hour. Reaction temperature to 55 ° C After setting, production of glycironitrile was started.
  • the residence time of the reaction solution in autoclave 7 was adjusted to 1 hour by a level controller, and the reaction solution was fed to autoclave 8 by a pump.
  • the temperature of auto creep 8 was set at 55 ° C.
  • the reaction solution containing glycyronitrile was continuously extracted by a pump.
  • the initial reaction solution up to 6 hours from the start of the reaction was recovered as a waste solution, and the reaction solution after 6 hours was fed to a flash distillation apparatus 9 set to normal pressure.
  • the temperature of the column top of the flash distillation device 9 was set at 120 ° C., and the reaction solution fed to the distillation device 9 was cooled at the column top. At this time, water was removed by cooling with ice and wet ammonia gas was collected by a dry ice ethanol trap to obtain liquid ammonia 10.
  • the recovered liquid ammonia 10 was used as a raw material to be supplied to the auto crepe 7.
  • From Karamubo Tom 'glyceraldehyde synonyms bets drill aqueous solution containing a small amount of ammonia were collected and cold storage in the intermediate tank 1 1 5 D C. At this time, 100 ppm of sulfuric acid of 100% by weight was added as a stabilizer. A 33% by weight aqueous solution of glycilonitrile was obtained. It contained 0.9% by weight of imino diacetonitrile and 1.3% by weight of an organic impurity compound having a molecular weight of 95 or more.
  • a 10 L stainless steel autoclave equipped with a stirrer, thermometer and pH sensor was used as the hydrolysis reactor 12.
  • 540 g of the glycinonitrile aqueous solution stored in the intermediate tank 11 was charged into the hydrolysis reactor 12 and
  • the filtrate (that is, the reaction solution containing glycine) was obtained by centrifugal filtration.
  • the circulating ultrafiltration membrane device 15 (Ultrafiltration membrane SIP — 101 3 manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd., Japan) To serve It was fed and concentrated while circulating. The concentrate was stored in the intermediate tank 16 once. When the circulating fluid was reduced to 500 ml, the operation of adding 500 ml of distilled water to 1000 ml and further concentrating to 500 ml was repeated twice. The last remaining 500 ml of circulating fluid was discarded.
  • step (3) was repeated in a cycle of 12 hours. 83% by weight of an ammonium salt of glycine and 0.9% by weight of an organic impurity compound having a molecular weight of 95 or more were contained.
  • the concentrated solution was passed through a column 17 charged with 100 g of activated carbon to obtain a concentrated solution treated with activated carbon.
  • the obtained concentrated solution treated with activated carbon was fed to a continuous crystallizer 18 at a rate of 4 to 25 g.
  • the crystallizer 18 is equipped with a stirrer, a level sensor, a thermometer and a vacuum distillation column. At 70 ° C, about 200 g of excess water and liquid ammonia contained in the concentrated solution are respectively obtained Evaporated under reduced pressure at time and about 20 g / hour.
  • Distilled water 19 and liquid ammonia 10 in the recovered state were recycled and used in the above reaction (1).
  • the slurry (glycine concentration: 40% by weight) accumulated in the crystallization tank was intermittently interposed between the upper and lower levels of the crystallization tank. It was withdrawn from the bottom by suction and subjected to hot filtration. 4% by weight of the obtained filtrate was blown down (blow 20), and the remaining filtrate 21 was circulated to the crystallization tank. Crystallization reached a steady state three hours after the start of operation.
  • the crystallized glycine was taken out from the crystallizer 18 and dried to obtain glycine crystals 22. When the purity of the obtained glycine crystal 22 was analyzed, the purity was 99.9%. In this system, glycine was obtained at an average rate of 82 g / hour (5.4 g / g per microorganism), and the overall process yield was 90%.
  • glycine useful as a raw material for synthesis of pharmaceuticals and agrochemicals, a food additive, and a raw material for detergents can be converted into glycine having high purity and high glycine production activity per microorganism and per unit time.
  • Ammonia can be produced quantitatively without decomposition or consumption, can be easily and separately recovered, and can be industrially produced with little environmental load.

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Description

明 細 書 グリ シンの製造方法 技術分野
本発明は、 グリ シンの製造方法に関する。 更に詳しく は、 グリ シノニ ト リル水溶液を、 加水分解反応系において、 微生 物酵素の作用下に加水分解反応に付して該グリ シノニ ト リル をアンモニアを副生しながらグリ シンに変換する際に、 該加 水分解反応系は該微生物酵素を阻害する分子量が 9 5以上の 特定の構造を含む少なく とも 1 つの有機不純物化合物を含有 し、 該加水分解反応の間、 該加水分解反応系における該微生 物酵素を阻害する該有機不純物化合物の含有量が、 該加水分 解反応系の,重量に対して 1 0重量％以下に維持される条件下 で該反応を行う ことを包含する ことを特徴とするグリ シンの 製造方法に関する。 本発明の製造方法を用いる と、 医農薬合 成原料、 食品添加物、 洗浄剤原料と して有用なグリ シンを、 高純度で効率よく簡便に環境負荷も少なく工業的に製造する ことが可能となる。 従来技術
従来、 グリ シンは、 ホルムアルデヒ ド、 シアン化水素及び アンモニアを原料として、 シュ ト レッカー法で一旦グリ シノ 二 ト リルを合成し、 これを苛性ソーダ等のアルカ リで加水分 解してグリ シンソ一ダとアンモニアに変換し、 更に硫酸等の 酸で中和後、 晶析法で回収する こ とによ り製造されている
(日本国特開昭 4 3 — 2 9 9 2 9号明細書、 日本国特開昭 5 1 — 1 9 7 1 9号明細書、 日本国特開昭 4 9一 1 4 4 2 0号 明細書、 曰'本国特開昭 4 9一 3 5 3 2 9 号明細書） 。 このよ うに、 従来の塩基を用いた加水分解法はアルカ リや酸をグリ シンと等量使用するため、 塩類を多量に副.生し、 廃棄による 環境負荷が大きいという欠点があった。 更に、 この塩類はグ リ シンと溶解度が酷似しているため 1 段の晶析では回収でき ず、 晶析と母液循環操作を複数回繰り返すなどの煩雑な操作 が必要であった （日本国特開昭 5 1 — 3 4 1 1 3号明細書
(D E 2 5 4 1 6 7 7 — B.号及び N L 7 5 1 1 0 2 3 — B号 に対応） ） 。 加えて、 中間体のグリ シノニト リ ル水溶液は p H 2 . 5以上では不安定であ り、 温度が高いほど分解や着色 等の変性をし易いことが知られている （日本国特開昭 4 9 — 1 4 4 2 0号明細書、 日本国特開昭 5 4 — 4 6 7 2 0 号明細 書、 日本国特開昭 5 4 — 4 6 7 2 1 号明細書） 。 日本国、 日 本化学会発行の工業化学雑誌第 7 0巻 5 4頁 （ 1 9 6 7 年） によれば、 シアン化水素はアルカ リ条件下では重合変性し、 重合が進むと黒色固体が生成する。 又、 日本国、 日本化学会 発行の実験化学講座第一版 3 4 7頁には、 グリ シノニ ト リル 等のシァノ メチル基はアルカ リ条件下で付加重合変性し、 ピ リ ジン化合物やピリ ミジン化合物を生成し易いこ とが記載さ れている。 日本国特開昭 6 2 — 2 1 2 3 5 7号明細書 （米国 特許第 4 6 6 1 6 1 4号に対^) には、 ホルムアルデヒ ド、 シアン化水素及びアンモニアから もィミ ノジァセ トニ ト リル 等のイ ミ ン化合物を生成する ことが記載されている。 日本国 特公昭 5 1 — 2 4 4 8 1 5号明細書には、 グリ シノニ ト リル は加熱するとアンモニアを放出しイ ミ ノジァセ トニ ト リル等 のィ ミ ン化合物を生成し、 更に変性されて黒色化合物を生成 する ことが記載されている。 このよう に、 従来法ではこう し た分解や変性に伴うグリ シンの収率低下が避けられず、 脱色 するために活性炭や特殊なイオン交換樹脂を用いた煩雑な処 理を必要とするという欠点もあった （日本国特開平 3 — 1 9 0 8 5 1 号明細書、 日本国特開平 4一 2 2 6 9 4 9号明細書 ..( E P 4 5 9 8 0 3 — B号に対応） ） 。
そこで、 多量のアルカ リや酸を使用せず、 グリ シノニ ト リ ルを穏和な条件で加水分解する方法として、 二 ト リル基の加 水分解能を有する微生物を用いてグリ シノニ ト リルを単純に 加水分解し、 グリ シンとアンモニゥムを得る方法が知られて いる。 日本国特公昭 5 8 — 1 5 1 2 0号明細書 （フ ラ ンス国 特許第 2 2 5 5 8 5号に対応） には、 ブレビパクテリ ゥム 3 1 2株を苛性カ リ等で p H 8 に調整した反応液に懸濁し て加水分解反応に用いる方法が、 日本国特開平 3 — 6 2 3 9 1号明細書 （ E P 1 8 7 6 8 0 — B号に対応） には、 コ リ ネ バクテリ ゥム N— 7 7 4株をリ ン酸緩衝液で p H 7 . 7 に 調整した反応液に懸濁して加水分解反応に用いる方法が、 ま た日本国特開平 3 — 2 8 0 8 8 9号明細書 （ E P 4 5 0 8 8 5 — B号に対応） には、 二 ト リル基の加水分解能を有する口 ドコ ッカス属、 ァルスロパクター属、 カセォパクター属、 シ ユー ドモナス属、 ェンテロパクター属、 ァシネ トパクター属， アルカ リ ゲネス属、 コ リ ネバクティ リ ァ属、 又はス 卜 レブト マイセス属の微生物をリ ン酸緩衝液で P H 7 . 7 に調整した 反応液に懸濁してグリ シノニ ト リルからグリ シンを得る方法 が開示されている。 しかし、 これらの方法は、 実施例による と、 グリ シンと等量以上の乾燥微生物を用いる こと、 あるい は 3 0 時間をかけてグリ シンに対して 5重量％以上の多量の 乾燥微生物を用いる ことが必要であ り、 更に微生物の活性維 持のために p Hを中性域に保っため逐次的に中和剤を添加す るこ とが必要である。 通常、 グリ シンのアンモニゥム塩を中 和するには例えば硫酸やリ ン酸を添加するため、 反応液には 硫酸アンモニゥムゃリ ン酸アンモニゥムが多量に残る ことに なる。 従って、 これらの微生物を用いるグリ シンの製造方法 も多量の酸を用い、 多量に廃棄物を排出する欠点をもってい る。 更にこれら方法では、 上記のアルカ リ加水分解法に比べ ダリ シンの回収には濃縮操作に加えてメタノールを添加する などの工程が必要となり操作が複雑になる問題や （日本国特 公昭 5 8 — 1 5 1 2 0号明細書 （フランス国特許第 2 2 5 5 8 5号に対応） ） 、 微生物の使用量が多く廃棄物が一層多い という欠点もあった。 一方、 微生物と電気透析を用い、 アル カ リ をリサイクルしながらグリ シンとアンモニアを別々 に回 収する方法が知られている （日本国特開平 1 0 — 1 7 9 1 8 3 号明細書 （米国特許第 5 9 3 2 4 5 4号、 E P 8 5 2 2 6 1 一 A号に対応） ） 。 この方法は、 微生物を用いてグリ シン を含む有機酸のアンモニゥム塩を生成する工程、 アルカ リ塩 に交換しアンモニアを遊離する工程、 アンモニアを回収する 工程、 電気透析でアルカ リ と有機酸を分別する工程、 有機酸 を有機溶媒を用いて抽出する工程、 及び有機酸を有機溶媒か ら分離する工程を経てグリ シンを製造する。 また、 実施例に よる と、 2 0 gのグリセリ ン培地で得られた微生物から得ら れた有機酸は 0 . 3モルであ り、 微生物の活性が極めて低い 従って、 この方法も多段工程と煩雑な操作が必要である上、 多量の電力を消費し、 多量の微生物の使用及び廃棄が必要で あるという欠点をもっていた。
このよう に、 従来の微生物を用いてグリ シノニ トリルから グリ シンを製造する方法は、 乾燥微生物当たり 、 且つ単位時 間当た り の活性が低く 、 培地や微生物を多量に廃棄しなけれ ばならない欠点があった。 また、 電気透析を用いない場合、 反応液の P Hを調整するため、 もしく はグリ シンを回収する ために用いる中和剤の廃棄が避けられずアンモニアの回収は 困難であった。 電気透析を用いても、 ア ンモニアの回収には 電力を浪費し、 且つ多段の煩雑な操作を必要とする欠点があ り、 工業的実施は満足の.いく ものではなかった。 発明の概要
以上のような状況に鑑み、 本発明者等は、 上記の問題を解 決するための反応方法や反応条件、 及びこう した反応方法に 適した微生物について鋭意研究を行った。 その結果、 驚く ベ きことに、 グリ シノニ ト リル水溶液を、 加水分解反応系にお いて、 二ト リル基の加水分解活性を有する微生物酵素の作用 下に加水分解反応に付して該グリ シノニ ト リルをアンモニア を副生しながらグリ シ.ンに変換する際に、 該加水分解反応系 は該微生物酵素を阻害する分子量が 9 5 以上の特定の構造を 含む少なく とも 1 つの有機不純物化合物を含有し、 該有機不 純物化合物は、 該加水分解反応の間、 該加水分解反応系にお ける該有機不純物化合物の含有量が、 該加水分解反応系の重 量に対して 1 0重量％以下に維持される条件下で該反応を行 う ことによ り、 微生物、 培地、 酸、 アルカ リ などの多量の使 用及び廃棄の必要を伴わず、 グリ シンの着色を抑制し、 微生 物当たり且つ単位時間当たり のグリ シン産生活性が高く 、 グ リ シンとアンモニアを、 分解又は消費を伴わずに定量的に製 造し、 且つ容易に別々に回収できるこ とを見出した。 本発明 は、 これらの知見に基づき完成され.たものである。
したがって、 本発明の主たる目的は、 効率よ く高純度のグ リ シンとアンモニアを定量的に生成し、 且つ別々 に回収し、 環境への負荷も少ないグリ シンの製造方法を提供する ことに. ある。
本発明の上記及び他の諸目的、 諸特徴並びに諸利益は、 添 付の図面を参照しながら行う以下の詳細な説明及び請求の範 囲の記載から明らかになる。 図面の簡単な説明
添付の図面において ：
図 1 は実施例 1 2 において使用されるグリ シンの製造シス テムの概略図である。
(符号の説明）
1 ： ホルムアルデヒ ド水溶液
2 ： 液化シァン化水素
3 ： 水酸化ナ ト リ ウム
4 ： アンモニアガス
5 ： 微生物懸濁液
6 , 7 ， 8 ： オー トク レーブ
9 ： フラッ シュ蒸留装置
1 0 ： 液状アンモニア
1 1 、 1 6 ： 中間タ ンク
1 2 ： 加水分解反応器
1 3 ： 連続遠心分離装置 1 4 ： 廃棄する微生物
1 5 ： 循環式限外濾過膜装置
1 7 ： 活性炭カラム
1 8 ： 連続晶析装置
1 9 ： 蒸発回収した水
2 0 ： ブロー
2 1 ： 濾液
2 2 ： グリ シンの結晶 発明の詳細な説明
本発明の 1 つの態様によれば、 グリ シンの製造方法にして グリ シノニ ト リル水溶液を提供し、
該グリ シノニ ト リル水溶液を、 加水分解反応系において、 二 ト リル基の加水分解活性を有する微生物酵素の作用下に加 水分解反応に付して該グリ シノニト リルをアンモニアを副生 しながらグリ シンに変換し、
該加水分解反応系は該微生物酵素を阻害する少なく とも 1 つの有機不純物化合物を含有し、 該微生物酵素を阻害する該 少なく とも 1 つの有機不純物化合物は、 分子量が 9 5 以上で あ り、 二 ト リル基、 カルボキシル基、 アミ ド基、 アミ ノ基、 ヒ ドロキシル基及びト リ メチレンァミ ン構造からなる群よ り 選ばれる少なく とも 1 つを含有し、 該ト リ メチレンアミ ン構 造は下記式 （ 1 ) ：
Figure imgf000011_0001
(式中、 nは 1 以上の整数を表わす。 ） 、
で表わされる骨格を有し、
該加水分解反応を、 該加水分解反応の間、 該加水分解反応 系における該微生物酵素を阻害する該有機不純物化合物の含 有量が、 該加水分解反応系の重量に対して 1 0重量％以下に 維^される条件下で行い、
そして、
該加水分解反応系からグリ シンを単離する、
ことを包含する こ とを特徴とする方法が提供される。 次に、 本発明の理解を容易にするために、 本発明の基本的 諸特徴及び好ましい態様を列挙する。
. グリ シンの製造方法にして、
グリ シノニ ト リル水溶液を提供し、
該グリ シノニ ト リル水溶液を、 加水分解反応系において、 ト リル基の加水分解活性を有する微生物酵素の作用下に加 水分解反応に付して該グリ シノニト リルをアンモニアを副生 しながらグリ シンに変換し、
該加水分解反応系は該微生物酵素を阻害する少なく とも 1 つの有機不純物化合物を含有し、 該微生物酵素を阻害する該 少なく とも 1 つの有機不純物化合物は、 分子量が 9 5 以上で あり、 二 ト リル基、 力ルポキシル基、 アミ ド基、 アミ ノ基、 ヒ ドロキシル基及びト リ メチレンァミ ン構造からなる群よ り 選ばれる少なく とも 1 つを含有し、 該ト リ メチレンアミ ン構 造は下記式 （ 1 ) ：
Figure imgf000012_0001
n
(式中、 nは 1 以上の整数を表わす。 ） 、
で表わされる骨格を有し、
該加水分解反応を、 該加水分解反応の間、 該加水分解反応 系における該微生物酵素を阻害する該有機不純物化合物の含 有量が、 該加水分解反応系の重量に対して 1 0重量％以下に 維持される条件下で行い、
そして、
該加水分解反応系からグリ シンを単,離する ことを包含することを特徴とする方法。
2 . 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1 つの有機不純物 化合物が、 シアン化水素、 ホルムアルデヒ ド及びアンモニア からのグリ シノニ ト リルの合成、 及びグリ シノニ トリルのグ リ シンとアンモニアへの加水分解からなる群よ り選ばれる少 なく とも 1 つの反応において副生物として生成されたもので ある こ とを特徴とする前項 1 に記載の方法。
3 . 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1 つの有機不純物 化合物が、 下記式 （ 2 ) で表わされる化合物を含むこ とを特 徵とする前項 1 又は 2 に記載の方法。
Figure imgf000013_0001
(式中、 各 Υ 1は独立に二 ト リル基、 力ルポキシル基又は アミ ド基を表わし、 ηは 2又は 3 を表わす。 ）
4 . 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1 つの有機不純物 化合物が、 下記の化合物 （ a ) 及び （ b ) からなる群よ り選 ばれる少なく とも 1つの化合物を含むこ とを特徴とする前項 1 又は 2 に記載の方法。 2
( a ) 下記式 （ 3 )
Figure imgf000014_0001
(式中、 Υ 1 は二 ト リル基、 カルボキシル基又はアミ ド基 を表わし、 各 Υ 2は独立にアミ ノ基又はヒ ドロキシル基を表 わし、 ηは 0以上の整数を表わし、 Ζ 1はそれぞれ独立に下 記式 （ 4 ) 又は （ 5 ) で表わされる。 ）
(4)、 又は
Figure imgf000014_0002
(5)
Figure imgf000014_0003
(式中、 各 Y 2は独立にアミ ノ基又はヒ ドロキシル基を表 わす。 ）
で表わされる化合物、 及び、
( b ) 下記式 （ 6 ) 又は （ 7 ) ： (6)、 又は
Figure imgf000015_0001
(7)
Figure imgf000015_0002
(式中、 各 Y は独立にアミ ノ基又はヒ ドロキシル基を表 わし、 各 Z 2は独立に下記式 （ 8 ) 又は （ 9 ) で表わされ る。 ）
γ
—— Z1— C— CH2 (8)、 又は
NH
,一 H (9)
(式中、 Y 2はァミノ基又はヒ ド tiキシル基を表わし、 z
1 はそれぞれ式 （ 3 ) において定義した通りであ り、 nは 0 以上の整数を表わす。 ） で表わされる化合物。 5. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純物 化合物が、 下記の化合物 （ c ) 及び （ d ) からなる群よ り選 ばれる少なく とも 1 つの化合物を含むことを特徴とする前項 1又は 2に記載の方法。
( c ) 下記式 （ 1 0 ) 又は （ 1 1 ) ：
NH2 H2
二 (10)、 又は
Y1 Y1
Figure imgf000016_0001
(式中、 各 Y 1は独立に二 ト リル基、 力ルポキシル基又は アミ ド基を表わす。 ）
で表わされる化合物、 及び、
( d ) 下記式 （ 1 2 ) ：
(H C N) (12)
(式中、 nは 4以上の整数を表わす。 ）
で表わされる化合物。 訂正された用紙 （規則 91) 6 . 該微生物酵素を.阻害する該少なく とも 1 つの有機不純物 化合物が、 下記の骨格 （ e ) 及び （ f ) からなる群よ り選ば れる少なく とも 1 つの骨格を分子内に有する化合物を含むこ とを特徴とする前項 1 又は 2 に記載の方法。
( e ) 下記式 （ 1 3 ) ：
Figure imgf000017_0001
(式中、 各 Y 1 は独立に二 ト リル基、 力ルポキシル基又は アミ ド基を表わし、 nは 2以上の整数を表わす。 ）
で表わされる骨格、 及び、
( f ) 下記式 （ 1 4 ) 又は （ 1 5 ) ：
( 1 4)、 又は
Figure imgf000017_0002
6
Figure imgf000018_0001
(式中、 Y 1 はそれぞれ独立に二 ト リル基、 カルボキシル 基又はアミ ド基を表わし、 各 Υ 2は独立にアミ ノ基又はヒ ド 口キシル基を表わし、 ηは 1以上の整数を表わす。 ） で表わされる骨格。
7. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純物 化合物が、 下記の骨格 （ g ) 及び （ h) からなる群よ り選ば れる少なく とも 1つの骨格を分子内に有する化合物を含むこ とを特徴とする前項 1又は 2 に記載の方法。
( g ) 下記式 （ 1 6 ) ：
Figure imgf000018_0002
(式中、 各 Y 1 は独立に二 ト リル基、 力ルポキシル基又は アミ ド基を表わし、 各 Y 2は独立にアミ ノ基又はヒ ドロキシ ル基を表わし、 nは 2以上の整数を表わす。 ） 7 で表わされる骨格、 及び、
( h ) 下記式 （ 1 7 ) 又は （ 1 8 )
(17)、 又は
Figure imgf000019_0001
N、
,2 C γ2、
Y 〈18)
Zし^ ノ -C.
(式中、 Y 1 はそれぞれ独立に二 ト リル基、 カルボキシル 基又はアミ ド基を表わし、 各 Υ 2は独立にアミ ノ基又はヒ ド 口キシル基を表わし、 ηば 1以上の整数を表わす。 ） で表わされる骨格。
8. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純物 化合物が、 へキサメチレンテ トラミ ンを含むことを特徴とす る前項 1又は 2に記載の方法。
9. 該微生物酵素を阻害する該少なく ^も 1つの有機不純物 化合物が、 重水中で測定した 1 3 C— N M Rスぺク トルにお いて、 5 3〜 ： L O O p p mの間にピークを示すことを特徴と する前項 1〜 8 のいずれかに記載の方法。
1 0. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純 物化合物が、 該加水分解反応系について測定した紫外可視吸 収スペク トルにおいて、 3 4 0〜 3 8 0 nm及び 44 0〜 4
8 O n mに吸収極大を示すことを特徴とする前項 1〜 9のい ずれかに記載の方法。
1 1. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純 物化合物の分子量が、 1 3 0以上である ことを特徴とする前 項 1〜 1 0のいずれかに記載の方法。
1 2. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純 物化合物の濃度が、 該加水分解反応系の重量に対して 1重 量％以下である こ とを特徴とする前項 1〜 1 1 のいずれかに 記載の方法。
1 3. 該加水分解反応系が、 該加水分解反応系の重量に対し て 5重量 p p m以下の酸素を溶存させているこ とを特徴とす る前項 1〜 1 2のいずれかに記載の方法。
1 4. 該加水分解反応を、 密閉反応系、 不活性ガスで加圧し た反応系、 不活性ガスを流通させた反応系又は大気圧未満の 圧力の反応系を用いて行い、 該加水分解反応系に溶存する酸 素濃度を抑制する ことを特徴とする前項 1〜 1 3 のいずれか に記載の方法。
1 5. 該加水分解反応 、 アンモニアが溶存する該加水分解 反応系で行う こと特徴とする前項 1〜 1 4のいずれかに記載 の方法。 -
1 6. 該加水分解反応を、 グリ シノニ ト リルの重量に対して 2重量％以下の電解質を含む該加水分解反応系で行う ことを 特徴とする前項 1〜 1 5のいずれかに記載の方法。
1 7. 二 ト リル基の加水分解活性を有する該微生物酵素が、 ァシネ トパクター属、 ロ ドコッカス属、 コ リネパクテリ ゥム 属、 アルカ リゲネス属、 マイコバクテリ ウム属、 ロ ドシユ ー ドモナス属及びキャ ンディ ダ属からなる群よ り選ばれる属の 微生物に由来する ことを特徴とする前項 1〜 1 6のいずれか に記載の方法。
1 8. 該ァシネ トバクタ一属の菌株が、 通商産業省工業技術 院生命工学工業技術研究所に寄託した寄託番号 F E RM B P— 2 4 5 1 のァシネ トパク夕一 s p . AK 2 2 6株、 又 は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した 寄託番号 F E R M B P — 7 4 1 3 のァシネ トノ クタ一 s p . A K 2 2 7株である ことを特徴とする前項 1 7 に記載の方法
1 9 . 該ロ ドコ ッカス属の菌株が、 通商産業省工業技術院生 命工学工業技術研究所に寄託した寄託番号 F E R M B P — 5 2 1 9 のロ ドコ ッ'カス マリス B P — 4 7 9 — 9株である こ とを特徴とする前項 1 7 に記載の方法。
2 0 . 該コ リネパクテリ ゥム属の菌株が、 通商産業省工業技 術院生命工学工業技術研究所に寄託した寄託番号 F E R M B P — 7 4 1 4のコ リ ネゾ ク テ リ ゥム s p . C 5株、 又は、 アメ リ カン タイプ カルチヤ一 コ レクショ ンに寄託した寄 託番号 A T C C 2 1 4 1 9 のコ リ ネバクテリ ゥム 二 ト リ 口 フィ ラスである こ とを特徴とする前項 1 7 に記載の方法。 .
2 1 . 該アルカ リゲネス属の菌株が、 通商産業省工業技術院 生命工学工業技術研究所に寄託した寄託番号 F E R M B P — 4 7 5 0 のアルカ リゲネス フエカ リス I F〇 1 3 1 1 1 株である こ とを特徴とする前項 1 7 に記載の方法。
2 2. 該マイ コパクテリ ゥム属の菌株が、 通商産業省工業技 術院生命工学工業技術研究所に寄託した寄託番号 F E R M B P — 2 3 5 2 のマイ コパクテリ ゥム s p . A C 7 7 7株 である .ことを特徴とする前項 1 7 に記載の方法。
2 3 . 該ロ ドシュ一 ドモナス属の菌株が、 アメ リカン タイ プ カルチャー コ レクショ ンに寄託された寄託番号 A T C C 1 1 1 6 7 のロ ドシユー ドモナス 'スフエロイデスである こ とを特徴とする前項 1 7 に記載の方法。
2 4. 該キャ ンディ ダ属の菌株が、 アメ リ カ ン タイプ カル チヤ一 コ レク ショ ンに寄託された寄託番号 A T C C 2 0 3 1 1 のキャ ンディ ダ ト ロピカ リスである ことを特徵とする 前項 1 7 に記載の方法。
2 5 . 該加水分解反応系からグリ シンの単離を行い、 一方、 グリ シンの回収とは別に副生アンモニアを回収することを特 徵とする前項 1〜 2 4 のいずれかに記載の方法。
2 6 . グリ シン及びアンモニアを、 蒸留、 反応蒸留、 不活性 ガスによる同伴、 イオン交換、 抽出、 貧溶媒を用いた再沈殿 及び濃縮又は冷却による晶析からなる群よ り選ばれる少なく とも 1 つの操作により別々に回収する ことを特徴とする前項 2 5 に記載の方法。 2 7 . アンモニアを蒸留、 反応蒸留又は不活性ガスによる同 伴によ り回収し、 そして、 グリ シンを、 アンモニア回収後の 残液の濃縮又は冷却による晶析に付すことによ り 回収するこ とを特徴とする前項 2 6 に記載の方法。
2 8 . 該方法が、 下記の工程を包含する ことを特徴とする前 項 1 〜 2 7 のいずれかに記載の方法。
( 1 ) 密閉反応系において、 水性媒体中でアルカ リ触媒の存 在下にシアン化水素をホルムアルデヒ ド と反応させてダリ コ ロニ ト リル水溶液を得、
( 2 ) 該グリ コロニ ト リル水溶液にア ンモニアを添加して反 応させ、 水を生成しながらグリ シノエ ト リル水溶液を得、 大 部分のアンモニアと水の一部を蒸留分離し、 グリ シノニ ト リ ル水溶液と未分離のアンモニアを含む加水分解反応系を得、
( 3 ) 分離したアンモニアを工程 （ 2 ) にリサイクルし、 ·
( 4 ) 該加水分解反応系を、 密閉反応系内の該加水分解反応 系に添加した微生物によって産生される微生物酵素の作用下 に加水分解反応に付し、 該グリ シノニ ト リルをアンモニアを 副生しながらグリ シンに変換し、
( 5 ) 該微生物及び該微生物酵素を、 遠心濾過及び膜濾過か らなる群よ り選ばれる少なく とも 1 つの操作によ り分離し、 工程 （ 1 ) 〜 （ 5 ) で副生した該微生物酵素を阻害する有機 不純物化合物の一部を、 膜濾過及び吸着剤を用いた分離から なる群よ り選ばれる少なく とも 1 つの操作によ り分離し、
( 6 ) 分離した該微生物及び該微生物酵素は工程 （ 4 ) にリ サイ クルし、
( 7 ) 工程 （ 4 ) で副生したアンモニアと工程 （ 4 ) .の後で 該加水分解反応系に残る過剰量の水を蒸留分離し、 分離した アンモニアと水は工程 （ 2 ) にリサイ クルし、
( 8 ) 工程 （ 7 ) の後又は工程 （ 7 ) と同時に、 該グリ シン を晶析によ り分離し、
( 9 ) 分離された該グリ シンの結晶を乾燥する。
2 9. グリ シノニ ト リル水溶液を提供し、 該グリ シノニ ト リ ル水溶液を加水分解反応に付して該グリ シノニ ト リルをアン モニァを副生しながらグリ シンに変換し、 そして、 加水分解 反応系から該グリ シンを単離する こ とを包含するダリ シンの 製造方法において、 該グリ シノニ ト リルの加水分解をアンモ エアの存在下で行う ことを特徴とする方法。
3 0. アンモニアの濃度が、 グリ シノニ ト リル 1 m 0 1 に対 して 0. 0 0 l〜 5 m o 1 であることを特徴とする前項 2 9 に記載の方法。
3 1 . グリ シノニ ト リル水溶液を提供し、 該グリ シノ ニ ト リ ル水溶液を加水分解反応に付して該グリ シノニ ト リルをアン モニァを副生しながらグリ シンに変換し、 そして、 加水分解 反応系から該グリ シンを単離する ことを包含するダリ シンの 製造方法において、 塩基及び酸の不存在下で、 該加水分解反 応系からグリ シンの単離を行い、 一方、 グリ シンの回収とは 別に副生アンモニアを回収する ことを特徴とする方法。
3 2 . グリ シン及びアンモニアを、 蒸留、 反'応蒸留、 不活性 ガスによる同伴、 イオン交換、 抽出、 貧溶媒を用いた再沈殿. 及び濃縮又は冷却による晶析からなる群よ り選ばれる少なく とも 1 つの操作によ り別々 に回収する ことを特徴とする前項 3 1 に記載の方法。
3 3 . アンモニアを蒸留、 反応蒸留又は不活性ガスによる同 伴によ り回収し、 そして、 グリ シンを、 アンモニア回収後の 残液の濃縮 Xは冷却による晶析に付すことによ り回収する こ とを特徴とする前項 3 2 に記載の方法。 以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明において、 グリ シノニ ト リルはシアン化水素、 ホル ムアルデヒ ド及びアンモニアから合成する ことが好ましい。 .グリ シノニ ト リルを合成する方法としては、 公知の方法を用 いる こ とが出来る。 即ち、 シァン,化水素とホルムアルデヒ ド からグリ コ ロニ ト リル （ヒ ドロキシァセ トニ ト リル） を合成 し、 次にアンモニアを加えてグリ シノニ ト リルを合成する方 法、 又はシアン化水素とホルムアルデヒ ド とアンモニアから 直接ダリ シノニ ト リルを合成する方法等を用いる ことが出来 る。
本発明の加水分解反応系には、 グリ コ ロニ ト リル、 グリ シ ノニ ト リル、 グリ シン、 アンモニア、 水、 触媒、 微生物酵素 を阻害する有機不純物化合物などが含まれる。
本発明の加水分解反応系に含まれる微生物酵素を阻害する 有機不純物化合物とは、 微生物酵素の活性を可逆的に阻害す る、 または、 不可逆的に阻害し酵素を失活させ微生物酵素を 再利用出来なくする化合物である。 こう した有機不純物化合 物としては、 分子量が 9 5以上であ り 、 二 ト リル基、 力ルポ キシル基、 アミ ド基、 アミ ノ基、 ヒ ドロキシル基及びト リ メ チレンアミ ン構造からなる群よ り選ばれる少なく とも 1つを 含有する化合物が含まれる。 有機不純物化合物には、 グリ シ ンの製造工程に用いる原材料、 触媒など ^)添加物や原材料中 に含まれている不純物も含まれる。 また、 シアン化水素、 ホ ルムアルデヒ ド及びアンモニアからのグリ シノニ ト リルの合 成工程及び/又はグリ シノニ ト リル（アミ ノ アセ トニ ト リル） のグリ シンとアンモニアへの加.水分解反応工程において副生 物と して生成する化合物も含まれる。 更に、 二 ト リル基の加 水分解活性を有する微生物酵素の製造工程で生成した副生物 あるいはダリ シンの分離精製工程から循環される副生物等が 訂正された用紙 （規則 91) 含まれる。
本発明の加水分解反応系に含まれる有機不純物化合物の具 体的な例としては、 次の （ A ) 〜 （ F )' の化合物の少なく と も一種を挙げるこ とができる。
( A ) 下記式 （ 2 ) ：
NHs-^ CCH^1 ) , · · · · ( 2 )
(式中、 各 Y 1 は、 独立に二ト リル基、 力ルポキシル基又 はアミ ド基を表わし、 nは 2又は 3 を表わす。 ）
で示される化合物が含まれる。
式 （ 2 ) で示される化合物は、 ィ ミ ン（一 N H —）又はニ ト リ 口 （一 N = )構造を有する縮合化合物及びその加水分解生成 物であ り、 例えばグリ コ ロニ ト リルとグリ シノニ ト リルの縮 合反応で生成する こ とが知られているイ ミ ノジァゼトニ ト リ ルゃニ ト リ ロ ト リ アセ トニ ト リルが挙げられる。 また、 これ ら縮合性化合物の二 ト リ ル基の加水分解生成物としては、 ィ ミ ノ ジ酢酸、 シァノ メチルァミ ノ酢酸、 イ ミ ノ ジァセ トアミ ド、 シァノ メチルアミ ノ アセ トアミ ド、 カルパモイルメチル ァミ ノ酢酸、 二 ト リ 口 ト リ酢酸、 N — （シァノ メチル） イ ミ ノ ジ酢酸、 Ν , Ν — ビス （シァノ メチル） ァミ ノ酢酸、 Ν— (力ルバモイルメチル） イ ミ ノ ジ酢酸、 Ν， Ν — ビス （カル バモイルメチル） ァミ ノ酢酸： 二 ト リ ロ ト リ アセ トアミ ド、 訂正された用紙 （規則 91) N - (シァノ メチル） イ ミ ノ ジァセ トアミ ド、 N，N—ビス (シァノメチル） アミ ノアセ トアミ ド等が挙げられる。
( B ) 下記の化合物 （ a ) 及び （ b ) ：
( a ) 下記式 （ 3' ) ：
(3)
Figure imgf000029_0001
(式中、 Υ 1 は二 ト リル基、 力ルポキシル基又はアミ ド基 を表わし、 各 Υ 2は独立にア^ ノ基又はヒ ドロキシル基を表 わし、 ηは 0〜 1 0 0 の整数を表わし、 Ζ 1はそれぞれ独立 に.下記式 （ 4 ) 又は （ 5 ) で表わされる。 ）
（4)、 又は
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000029_0003
(式中、 各 Y は独立にアミ ノ基又はヒ ドロキシル基を表 わす。 ）
で示される化合物、 及び ( b ) 下記式 （ 6 ) 又は （ 7 )
(6)、 又は
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0002
(式中、 各 Y 2は独立にアミ ノ基又はヒ ドロキシル基を表 わし、 各 Ζ 2は独立に下記式 （ 8 ) 又は （ 9 ) で表わされ る。 ）
(8)、 又は
Figure imgf000030_0003
H (9)
(式中、 Y 2はァミ ノ基又はヒ ドロキシル基を表わし、 Ζ 1 はそれぞれ式 （ 3 ) において定義した通りであ り、 ηは 0 〜 1 0 0 の整数を表わす。 ） で示される化合物。
式 （ 3 ) で示される化合物は、 付加多量化化合物と該付加 多量化化合物の二 ト リル基が加水分解した生成物である。 式 ( 6 ) で示される化合物は、 該付加化合物が環化したピリ ミ ジン骨格を有する付加環化化合物、 及びその加水分解生成物 である。 式 （ 7 ) で示される化合物は、 該付加化合物が環化 したピリジン骨格を有する付加環化化合物、 及びその加水分 解生成物である。 こう した付加化合物等は、 日本国、 日本化 学会発行の実験化学講座第一版第 1 8 — 2巻 3 4 7頁のフエ 二ルァセ トニ ト リルの付加反応において例示されているよう に、 シァノ メチル基同士が付加 2量化、 付加 3量化、 更に環 化や重合するメカニズムで生成する ことが知られている。
式 （ 3 ) で示される付加 2量化化合物としては、 例えば、 グリ コ ロニ ト リルとダリ シノニ ト リルの付加反応で生成する 1 , 3 —ジァミ ノ ー 2 —イ ミ ノ ーブチロニ ト リ ル、 1， 3 —ジ ヒ ドロキシー 2 —イ ミ.ノ ープチロニ ト リル、 1 —ァミ ノ 一 2 ーィ ミ ノ 一 3 — ヒ ドロキシプチロニ ト リル、 または 3 —アミ ノ ー 2 —ィ ミ ノ 一 1 — ヒ ドロキシプチロニ ト リル等が挙げら れる.。 また、 これらの化合物の二 ト リル基の加水分解生成物 としては、 1 , 3 —ジァミ ノ ー 2 —イ ミ ノ ーブチリ ックァシ ド、 1 , 3 —ジヒ ドロキシー 2 —イ ミ ノ ーブチリ ックァシ ド、 1 —アミノ ー 2 —イ ミ ノ ー 3 —ヒ ドロキシプチリ ックァシ ド 3 —アミ ノ ー 2 —イ ミ ノ ー 1 ーヒ ドロキシプチリ ックァシ ド 1， 3 —ジァミ ノ 一 2 —イ ミ ノ ーブチルアミ ド、 1， 3 —ジヒ ド ロキシー 2 —イ ミ ノ ープチルアミ ド、 1 —アミ ノ ー 2 —ィ ミ ノ 一 3 — ヒ ドロキシプチルアミ ド、 3 —アミ ノ ー 2 —イ ミ ノ ー 1 ー ヒ ド ロキシブチルアミ ド等が挙げられる。
式 （ 3 ) で示される付加 3量化化合物のう ち、 内部構造と して二 ト リ ル基がメチレン基に付加した式 （ 4 ) の構造を有 する化合物と しては、 1， 3， 5 — ト リ ア ミ ノ 一 2 , 4—ジィ ミ ノへキサン二 ト リル、 1， 3.—ジァミ ノ — 2 , 4 —ジィ ミ ノ — 5 — ヒ ド ロキジへキサン二 ト リル、 1， 5 — ジァミ ノ ー 2 , 4 ージィ ミ ノ 一 3 — ヒ ド ロキシへキサン二 ト リ ル、 3 , 5 — ジァミ ノ 一 2 , 4 — ジイ ミ ノ ー 1 — ヒ ド ロキシへキサンニ ト リル、 1 —アミ ノ ー 2， 4 ージイ ミ ノ ー 3， 5 —ジヒ ド ロキシ へキサン二 ト リル、 3 —ァミ ノ — 2 , 4 — ジィ ミ ノ ー 1， 5 — ジヒ ド ロキシへキサン二 ト リ ル、 5 —ァミ ノ 一 2 , 4 —ジィ ミ ノ 一 1 ， 3 —ジヒ ド ロキシへキサン二 ト リ ル、 2 , 4 —ジィ ミ ノ — 1 ， 3， 5 — ト リ ヒ ド ロキシへキサン二 ト リ ル等が挙げ られる。 これらの化合物の二 ト リ ル基の加水分解生成物と し ては、 1 ， 3 , 5 — ト リ ア ミ ノ ー 2， 4 — ジィ ミ ノ へキサノ ィ ッ ク ァシ ド、 1， 3 —ジァミ ノ ー 2， 4 —ジィ ミ ノ 一 5 — ヒ ド ロキシへキサノイ ツ クァシ ド、 1， 5 — ジア ミ ノ ー 2， 4 —ジ イ ミ ノ ー 3 — ヒ ド ロキシへキサノイ ツ クァシ ド.、 3， 5 —ジ ァミ ノ 一 2， 4ージィ ミ ノ 一 1 ー ヒ ド ロキシへキサノイ ツ ク ァシ ド、 1 一アミ ノ ー 2， 4 ージィ ミ ノ 一 3， 5 — ジヒ ド ロキ シへキサノイ ツ クァシ ド、 3 —ァミ ノ 一 2 , 4 —ジイ ミ ノ ー 1 , 5 —ジヒ ド ロキシへキサノイ ツ ク ァシ ド、 5 —アミ ノ ー 2 , 4 —ジィ ミ ノ — 1， 3 —ジヒ ドロキシへキサノイ ツ クァシ ド、 2 , 4 —ジィ ミ ノ ー 1 , 3 , 5 — ト リ ヒ ドロキシへキサノ イ ツ ク ァシ ド、 1， 3， 5 — ト リ アミ ノ ー 2， 4 ージィ ミ ノへ キサンアミ ド、 1， 3 —ジァミ ノ ー 2， 4 ージイ ミ ノ ー 5 —ヒ ドロキシへキサンアミ ド、 1 , 5 —ジアミ ノ ー 2 , 4 —ジイ ミ ノ 一 3 — ヒ ド ロキシへキサンアミ ド、 3 , 5 — ジァミ ノ 一 2， 4 —ジィ ミ ノ 一 1 — ヒ ドロキシへキサンアミ ド、 1 —ァミ ノ — 2 , 4 —ジィ ミ ノ ー 3 , 5 —ジヒ ド ロキシへキサンアミ ド、 3 —アミ ノ ー 2 , 4 —ジィ ミ ノ 一 1 , 5 —ジヒ ド ロキシへキサ ンアミ ド、 5 —ァミ ノ 一 2 , 4 —ジィ ミ ノ 一 1 , 3 —ジヒ ドロ キシへキサンアミ ド、 2 , 4 —ジィ ミ ノ 一 1， 3 , 5 — ト リ ヒ ドロキシへキサンアミ ド等が挙げられる。
式 （ 3 ) 示される付加 3量化化合物のうち、 内部構造とし て二 ト リル基がイ ミ ノ基に付加した式 （ 5 ) の構造を有する 化合物と しては、 2， 4 ージァミ ノ 一 3 — ( 2 —アミ ノ ー 1 —イ ミ ノエチルイ ミ ノ） プチロニ ト リル、 2 — ァミ ノ — 4 一 ヒ ド ロキシー 3 — （ 2 —アミ ノ ー 1 一イ ミ ノ エチルイ ミ ノ） プチロニ ト リ ル、 4 —ア ミ ノ ー 2 —ヒ ド ロキシー 3 — （ 2 — ァミ ノ 一 1 —イ ミ ノエチルイ ミ ノ） プチロニ ト リル、 2 , 4 —ジヒ ド ロキシー 3 — ( 2 —ァミ ノ 一 1 一イ ミ ノエチルイ ミ ノ） プチロニ ト リ ル、 2 , 4 —ジァミ ノ ー 3 — （ 2 —ヒ ド ロ キシ— 1 ーィ ミ ノ チルイ ミ ノ） プチロニ ト リ ル、 2 —アミ ノ ー 4 — ヒ ドロキシ一 3 — ( 2 — ヒ ド ロキシ一 1 —イ ミ ノエ チルイ ミ ノ） プチロニ ト リル、 4 ーァミ ノ — 2 — ヒ ド ロキシ — 3 — ( 2 —ヒ ドロキシ一 1 —イ ミ ノエチルイ ミ ノ） プチ口 二 ト リ ル、 2， 4 —ジヒ ド ロキシ一 3 — ( 2 — ヒ ド ロキシ一 1 一イ ミ ノエチルイ ミ ノ） プチロニ ト リル等が挙げられる。 これら の化合物の二 ト リ ル基の加水分解生成物と しては、 2 4 —ジァミ ノ 一 3 — （ 2 —アミ ノ ー 1 —イ ミ ノ エチルイ ミ ノ） プチリ ックァシ ド、 2 —アミ ノ ー 4 — ヒ ド ロキシ一 3 — ( 2 — アミ ノ ー 1 一イ ミ ノ エチルイ ミ ノ） プチリ ッ ク ァシ ド 4 —ァミ ノ 一 2 — ヒ ド ロキシ一 3 — ( 2 —アミ ノ ー 1 一イ ミ ノ エチルイ ミ ノ） プチリ ッ クァシ ド、 2 , 4 — ジヒ ド ロキシ 一 3 — ( 2 —ァ,ミ ノ — 1 —イ ミ ノエチルイ ミ ノ） プチ リ ッ ク ァシ ド、 2， 4 —ジァミ ノ ー 3 — （ 2 — ヒ ドロキシー 1 ーィ ミ ノェチルイ ミ ノ） プチリ ッ ク ァシ ド、 2 —アミ ノ ー 4 ー ヒ ド ロキシ— 3 — （ 2 — ヒ ドロキシ— 1 一イ ミ ノ エチルイ ミ ノ） プチリ ッ クァシ ド、 4 —アミ ノ ー 2 — ヒ ド ロキシ一 3 — ( 2 " ヒ ド ロキシ一 1 一イ ミ ノエチルイ ミ ノ） プチリ ッ クァ シ ド、 2， 4 —ジヒ ドロキシー 3 — （ 2 — ヒ ド ロキシー 1 — イ ミ ノ エチルイ ミ ノ） プチリ ッ クァシ ド、 2 , 4 —ジァミ ノ — 3 — （ 2 —アミ ノ ー 1 一イ ミ ノ エチルイ ミ ノ） ブチルアミ ド、 2 —アミ ノ ー 4 ー ヒ ドロキシー 3 — （ 2 —ァミ ノ 一 1 — イ ミ ノ エチルイ ミ ノ） ブチルアミ ド、 4 —アミ ノ ー 2 — ヒ ド ロキシ一 3 — （ 2 —アミ ノ ー 1 —イ ミ ノエチルイ ミ ノ）. プチ ルアミ ド、 2， 4 —ジヒ ドロキシ一 3 — ( 2 —ァミ ノ 一 1 — イ ミ.ノエチルイ ミ ノ） ブチルアミ ド、 2， 4 —ジァミ ノ — 3 ― ( 2 —ヒ ドロキシ一 1 一イ ミ ノエチルイ ミ ノ） ブチルアミ ド、 2 _アミ ノ ー 4 ー ヒ ドロキシ一 3 — ( 2 —ヒ ドロキシ一 1 一イ ミ ノエチルイ ミ ノ） ブチルアミ ド、 4 —アミ ノ ー 2 — ヒ ドロキシ一 3 — ( 2 — ヒ ドロキシ一 1 一イ ミ ノエチルイ ミ ノ） ブチルアミ ド、 2， 4 —ジヒ ドロキシ— 3 — ( 2 — ヒ ド 口キシ— 1 —イ ミ ノエチルイ ミ ノ） ブチルアミ ド等が挙げら れる。
式 （ 3 ) で表わされる化合物には、 上記の化合物のメチル 基ゃィ ミ ノ基にグリ シノニ ト リルゃグリ コロニ ト リルのニ ト リル基が更に付加した付加多量化化合物も含まれる。 この場 合、 式 （ 4 ) に示す構造単位と式 （ 5 ) に示す構造単位とが 分子内で交互に付加したランダム構造も、 同一構造単位が並 ぶブロ ック構造も含まれる。
二 ト リル基を有する末端が環化してピリ ミジン骨格を形成 する式 （ 6 ) に示す付加環化化合物としては、 4， 5 —ジァ ミ ノ ー 2 , 6 —ビス （アミ ノメチル） ピリ ミジン、 4 一アミ ノ ー 5 —ヒ ドロキシ一 2， 6 —ビス （アミ ノ メチル） ピリ ミ ジン、 5 —ァミ ノ 一 4 — ヒ ドロキシ一 2 , 6 — ビス （ァミ ノ メチル） ピリ ミジン、 4， 5 —ジアミ ノ ー 2 —アミ ノ メチル — 6 — ヒ ドロキシメチルピリ ミジン、 4 —アミ ノ ー 5 — ヒ ド 口キシ一 2 —アミ ノ メチルー 6 — ヒ ドロキシピリ ミジン、 5 ーァミ ノ 一 4 ーヒ ドロキシ一 2 _アミ ノ メチル一 6 — ヒ ドロ キシピリ ミ ジン、 4， 5 —ジァミ ノ 一 6 —アミ ノ メチルー 2 ' ーヒ ドロキシメチルピリ ミジン、 4 一アミ ノ ー 5 —ヒ ドロキ シー 6 —アミ ノメチルー 2 — ヒ ドロキシビリ ミ ジン、 5 —ァ ミ ノ一 4 — ヒ ドロキシー 6 —アミ ノ メチル一 2 —ヒ ドロキシ ピリ ミジン、 4， 5 —ジァミ ノ ー 2， 6 — ビス （ヒ ドロキシメ チル） ピリ ミジン、 4 —アミ ノ ー 5 — ヒ ドロキシ一 2 , 6 — ビス （ヒ ドロキシメチル） ピリ ミジン、 5 —ァミ ノ 一 4 — ヒ ドロキシ一 2， 6 —ビス （ヒ ドロキシメチル） ピリ ミジン等 が挙げられる。 また、 これらの化合物の 1位メチレン基に二 ト リ ル基が更に付加し、 式 （ 8 ) 又は （ 9 ) に示す構造の置 換基で置換した付加環化化合物も含まれる。 この場合、 式
( 4 ) に示す構造単位と式 （ 5 ) に示す構造単位とが置換基 内で交互に付加したランダム構造も、 同一構造が並ぶブロッ ク構造も含まれる。 更に、.上記した付加環化化合物の二 ト リ ル基の加水分解生成物も含まれる。
二 ト.リル基を有する末端が環化してピリ ジン骨格を形成す る式 （ 7 ) に示す付加環化化合物としては、 2 , 3， 4， 5 — テ ト ラアミ ノ ー 6 —ァミ ノメチルピリ ジン、 2， 3 , 4 — ト リ アミ ノ ー 5 — ヒ ドロキシー 6 —アミ ノ メチルピリ ジン、 2， 4， 5 — ト リ アミ ノ ー 3 —ヒ ドロキシ一 6 —アミ ノ メチルピ リ ジン、 2， 4 , 5 — ト リ アミ ノ 一 3， 5 —ジヒ ドロキシー 6 一アミ ノ メチルビリ ジン、 2 , 3 , 4， 5 —テ トラアミ ノ ー 6 —ヒ ドロキシメチルピリ ジン、 2 , 3 , 4 — ト リ アミ ノ 一 5 — ヒ ドロキシ一 6 — ヒ ドロキシメチルピリ ジン、 2， 4， 5 — ト リ アミ ノ 一 3 —ヒ ドロキシー 6 —ヒ ドロキシメチルピリ ジン 2 ， 4 , 5 — ト，リ アミ ノ 一 3 , 5 —ジヒ ドロキシー 6 —ヒ ドロ キシメチルピリ ジン化合物が挙げられる。 また、 これらの化 合物の 6位メチレン基に二 ト リル基が更に付加し.、 式 （ 8 ) 又は （ 9 ) に示す.構造の置換基で置換した付加環化化合物も 含まれる。 この場合、 式 （ 4 ) に示す構造単位と式 （ 5 ) に 示す構造単位とが置換基内で交互に付加したランダム構造も 同一構造が並ぶブロ ック構造も含まれる。 更に、 上記した付 加環化化合物の二 ト リル基の加水分解生成物も含まれる。
( C ) 下記の化合物 （ c ) 及び （ d )
( c ) 下記式 （ 1 0 ) 又は （ 1 1 ) ：
(10)、 又は
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0002
(式中、 各 Y 1は独立 ϊ 二 ト リル基、 力ルポキシル基又は アミ ド基を表わす。 ）
で示される化合物、 及び
( d ) 下記式 （ 1 2 )
(H C N) n ( 1 2 )
(式中、 nは 4〜 2 0 0 の整数を表わす。 ）
で示される化合物。
式 （ 1 0 ) 及び （ ) で示される化合物は、 シアン化水 素 4量化化合物と該シアン化水素 4量化化合物のニ ト リル基 が加水分解した生成物である。 式 （ 1 2 ) で示される化合物 は、 シアン化水素重合物である。 ■
式 （ 1 0 ) 又は （ 1 1 ) で示されるシアン化水素 4量化化 合物と しては、 例えばジァミ ノマレオニ ト リルとその互変異 性体であるアミ ノイ ミ ノサクシノニ ト リルが挙.げられる。 該 シアン化水素 4量化化合物の二 ト リル基が加水分解した生成 物と しては、 ジァミ ノマレイ ン酸、 2 , 3 —ジァミ ノ 一 3 — シァノ アク リル酸、 2 , 3 —ジアミ ノ ー 3 —シァノアク リル アミ ド、 2， 3 —ジアミ ノ ー 3 —力ルバモイルアク リル酸、 2 , 3 —ジアミ ノ ー 3 —力ルバモイルアク リルアミ ド、 アミ ノイ ミ ノサク シノニックァシ ド、 2 —アミ ノ ー 3 —ィ ミ ノ 一 3 —力ルバモイルプロ ピオンアミ ド、 2 _アミ ノ ー 3 —イ ミ ノ ー 3 —シァノ プロ ピオン酸、 2 —ァミ ノ 一 3 —ィミ ノ 一 3 訂正された用紙 （規則 91) — シァノ プロ ピオンアミ ド、 2 —ァミ ノ 一 3 —イ ミ ノ ー 3 — 力ルバモイ ルプロ ピオン酸、 3 —アミ ノ ー 2 —イ ミ ノ ー 3 — シァノ プロ ピオン酸、 3 —アミ ノ ー 2 —イ ミ ノ ー 3 —シァノ プロ ピオンアミ ド、 3 —アミ ノ ー 2 —イ ミ ノ ー 3 —カルパモ ィルプロ ピオン酸が挙げられる。
式 （ 1 2 ) で示される シアン化水素重合物と しては、 n = 4のとき、 式 （ 1 0 ) や （ 1 1 ) で示される化合物に加えて
3 アミ ノ ー 2 , 4—ジィ ミ ノ ブチリ ッ ク ァシ ド、 n = 5の とき、 3 —アミ ノ ー 3 —シァノ 一 2， 4—ジィ ミ ノ プチリ ツ ク ァシ ドゃ 3 —ァミ ノ 一 2 , 4 , 5— ト リ イ ミ ノヘプタ ノイ ツ ク ァシ ド、 n = 6の とき、 3， 4ージァミ ノ 一 3 , 4—ジシァ ノ 一 2 —イ ミ ノ ブチリ ッ クァシ ドや 3 —ァミ ノ 一 3 —シァ ノ 一 2， 4， 5 — ト リ イ ミ ノ ヘプ夕 ノイ ツ クァシ ドなどが挙げら れる。 n = 7以上のシアン化水素重合物も含まれる。
(D) 下記の骨格 （ e ) 及び し i ) を分子内にそれぞれ有す る化合物 ：
( e ) 下記式 （ 1 3 ) ：
Figure imgf000039_0001
(式中、 各 Y 1 は独立に二 ト リ ル基、 カルボキシル基又は アミ ド基を表わし、 nは 2 2 0 の整数を表わす。 ） で示される骨格、 及び
( f ) 下記式、 （ 1 4 ) 又は （ 1 5 )
(14)、 又は
Figure imgf000040_0001
(15)
Figure imgf000040_0002
(式中、 Y 1 はそれぞれ独立に二 ト リル基、 カルボキシル 基又はアミ ド基を表わし、 各 Υ 2は独立にアミ ノ基又はヒ ド 口キシル基を表わし、 ηは 1 〜 7 0 の整数を表わす。 ） で示される骨格。
式 （ 1 3 ) で示される骨格を有する構造物には、 シアン化 水素重合構造物やその二 ト リル基が加水分解した構造物が含 まれ、 例えば、 アミ ノ シァノ メチレン構造物、 アミ ノカルバ モイルメチレン構造物及び/又はアミ ノカルポキシメチレン 構造物を有し、 繰り返し数が 2以上の構造物が挙げられる。 こう したシアン化水素重合構造物には、 重水中で測定した 1 3 C — N M Rスぺク トルにおいて、 メチレン構造が 7 0〜 9 0 p p mの間にピークを示す化合物が含まれる。
式 （ 1 4 ) 又は （ 1 5 ) で示される骨格を有する化合物に は、 多環式化合物やその二 ト リル基の加水分解生成物が含ま れ、 例えば、 3 , 4 , 4 , 5 —テ トラアミ ノ 一 4 — (シァノ、 カルポキシ又は力ルバモイル） — 3 , 4 , 5 , 6 —テ トラヒ ド 口 ピリ ジン骨格の 6員環の 5， 6位が隣の 6員環の 2， 3位で ある多環式、構造体や、 3 , 7 , 9 , 1 0 —テ トラアミ ノ — 3， 4 , 6 , 7 , 9， 1 0 —へキサヒ ドロ ピリ ジノ [ 2 , 3 — e ] ピリ ジ ン骨格の 6 , 7， 8， 9位が隣のピリ ジン骨格の 5， 1 0， 4， 3 位である多環式構造体が挙げられる。 こう した多環式化合物 には、 重水中で測定した 1 C— N M Rスぺク トルにおいて、 メチレン構造が 6 0〜 8 0 p p mの間にピ一ク を示す化合物 が含まれる。 また、 紫外可視吸収スペク トルにおいて 3 8 0 n m及ぴ 4 6 0 n mに吸収極大を示す化合物も含まれる。
上記したシアン化水素重合物等の生成メカニズムは、 日本 国、 日本化学会発行の工業化学雑誌第 7 0巻 5 4頁 （ 1 9 6 7年） に開示されている。
( E ) 下記の骨格 （ g ) 及び （ h ) を分子内にそれぞれ有す る化合物 ：
( g ) 下記式 （ 1 6 ) ：
Figure imgf000042_0001
(式中、 各 Y 1 は独立に二 ト リル基、 力ルポキシル基又は アミ ド基を表わし、 各 Υ 2は独立にアミ ノ基又はヒ ドロキシ ル基を表わし、 ηは 2 1 2 0の整数を表わす。 ）
で示される骨格、 及び
( h ) 下記式 （ 1 7 ) 又は （ 1 8 ) ：
(17)、 又は
Figure imgf000042_0002
γ 2
c 2、C (18)
c.
n
(式中、 Y 1 はそれぞれ独立に二 ト リル基、 カルボキシル 基又はアミ ド基を表わし、 各 Υ 2は独立にアミ ノ基又はヒ ド 口キシル基を表わし、 ηは 1 7 0の整数を表わす。'） で示される骨格。 式 （ 1 6 ) で示される骨格を有する酸化重合物及びその二 ト リル基が加水分解した生成物は、 メチレン基同士が酸化力 ップリ ングする反応で生成することが知られている。 例えば グリ コ ロニ ト リルとグリ シノニ ト リ ルが酸化カ ツ プリ ングし た、 2， 3 —ジァミ ノサクシノ ト リル、 2 —ァミ ノ 一 3 — ヒ ドロキシサクシノニ ト リル、 またこれらが加水分解した、 2， 3 —ジアミ ノサクシノニックァシド、 2 , 3 —ジアミ ノ ー 3 —力ルバモイルプロピオンアミ ド、 2 , 3 —ジァミ ノ ー 3 一シァノプロピオン酸、 2 , 3 —ジァミ ノ 一 3 —カルパモイ ルプロ ピオン酸、 2 , 3 —ジアミ ノー 3 - シァノ プロピオン アミ ド、 2 —アミ ノ ー 3 —ヒ ドロキシ一 3 —シァノプロ ピオ ン酸、 2 —アミ ノ ー 3 —ヒ ドロキシ一 3 —力ルバモイルプロ ピオン酸、 2 —ァミ ノ 一 3 —ヒ ドロキシー 3 —シァノ プロ ピ オンアミ ド、 3 —ァミ ノ 一 2 —ヒ ドロキシ一 3 —シァノ プロ ピオン酸、 3 —アミ ノ ー 2 —ヒ ドロキシ— 3 —カルパモイル プロ ピオン酸、 3 —ァミ ノ 一 2 — ヒ ドロキシー 3 —シァノプ ロ ピオンアミ ドが挙げられる。 こう した酸化カ ップリ ング生 成物に更にメチレン化合物がカップリ ングし、 分子内に式
( 1 6 ) の骨格を有する酸化重合構造物及びその二 ト リル基 が加水分解した構造物としては、 アミ ノ シァノ メチレン構造 物、 アミ ノカルバモイルメチレン構造物、 ァミ ノカルポキシ メチレン構造物、 ヒ ドロキシシァノ メチレン構造物、 ヒ ドロ キシカルパモイルメチレン構造物及び/又はヒ ドロキシアミ ノカルポキシメチレン構造物を有し、 繰り返し数が 2以上の 構造'物が挙げられる。 こう した酸化重合構造物には、 重水中 で測定した 1 3 C — N M Rスぺク トルにおいて、 メチレン構 造が 7 0〜 9 0 p p mの間にピークを示す化合物が含まれる。
式 （ 1 7 ) 又は （ 1 8 ) で示される骨格を有する化合物は 上記の酸化重合構造物のシァノ基が付加環化する ことによ り 生成される。 式 （ 1 7 ) 又は （ 1 8 ) で示される構造を有す る多環式化合物及びその二 ト リル基が加水分解した生成物と しては、 3 , 4 , 4， 5 — （ァミ ノ及びノ又はヒ ドロキシ） 一 4 - (シァノ、 カルポキシ又は力ルバモイル） 一 3， 4， 5 , 6 ーテ トラ ヒ ドロ ピリ ジン骨格の 6 員環の 5， 6位が隣の 6 員環の 2， 3位である多環式構造体や、 3 , 7 , 9 , 1 0 — (ァ ミ ノ及び/又はヒ ドロキシ） — 3 , 4， 6， 7 , 9 , 1 0 —へキ サヒ ドロピリ ジノ [ 2， 3 — e ] ピリ ジン骨格の 6 , 7 , 8 , 9 位が隣のピリ ジン骨格の 5 , 1 0 , 4 , 3位である多環式構造 の化合物が含まれる。 こ う した多環式構造の化合物には、 重 水中で測定した l o C — N M Rスペク トルにおいて、 メチレ ン構造が 6 0〜 8 0 p p mの間にピークを示す化合物が含ま れる。 また、 紫外可視吸収スペク トルにおいて、 3 4 0〜 3 8 0 n mの間及び 4 4 0〜 4 8 0 n mの間に吸収極大を示す 化合物も含まれる。
( F ) へキサメチレンテ トラミ ン、 及び
下記式 （ 1 ) ：
Figure imgf000045_0001
(式中、 nは：！ 〜 1 5 0 の整数を表わす。 ）
で示される ト リ メチレンァミ ン構造を有する化合物 ：
これらの化合物はホルムアルデヒ ドとアンモニアが縮合し て生成する ことが知られている。 式 （ 1 ) の構造を有する化 合物としては、 n = l のとき、. N—アミ ノメチルーへキサヒ ドロ一 1 ， 3 , 5 — 卜 リ アジン、 n = 2 のとき、 Ν , Ν'—ビス' アミ ノ メチルーへキサヒ ドロ ， 3 , 5 — ト リ アジン、 ペン タメチレンテ ト ラミ ン、 へキサメチレンペンタミ ン、 η = 3 のとき、 Ν , Ν，， Ν'，一 ト リ スアミ ノ メチルーへキサヒ ドロ— 1 ， 3 , 5 — ト リ アジン、 η = 4のとき、 へキサメチレンテ ト ラミ ン、 ヘプタメチレンペンタミ ンが挙げられる。 本発明の加水分解反応系に'含まれる有機不純物化合物には 上記したよう に、 ヒ ドロキシル基とアミ ノ基の縮合反応生成 物、 二 ト リル基と活性メチレン基の付加反応生成物と環化反 応生成物、 又はメチレン基の酸化反応生成物と環化反応生成 物や、 これらの生成物の二 ト リル基の加水分解皮応生成物が 含まれる。 更に、 これらの反応が組み合わされて生成した化 合物も含まれる。 即ち、
( I ) 式（3 )、 （6 )、 （7 )、 （1 0 )、 （1 1 )で示される化合 物又は式（1 3 )〜（1 8 )で示される骨格のァミ ノ基と、 式 (3 )、 （6 )、 （7 )で示される化合物又は式（1 4)〜（1 8 )で 示される骨格のヒ ドロキシル基との縮合生成物、
( Π ) 式（2 )、 （3 )、 （1 0 )〜（1 2 )で示される化合物又は 式（ 1 3 )、 （1 4 )、 （1 6 )、 （1 7 )で示される骨格の二 ト リ ル基同士の付加生成物
(ΠΙ) 式（2 )、 （3 )、 ( 1 0 )~ ( 1 2 )で.示される化合物又は 式（1 3 )、 （1 4)、 （1 6 )、 （1 7 )で示される骨格の二 ト リ ル基と、 式（3 )、 （6 )、 （7 )、 （1 1 )で示される化合物のィ ミ ノ基との付加生成物、
(IV) 式（2 )、 （3 )、 （1 0 )〜（1 2 )で示される化合物又は 式（1 3 )、 （1 4 )、 （1 6 )、 （1 7 )で示される骨格の二 ト リ ル基と、 式（1 )〜（3 )、 （6 )、 （7 )で示される化合物のメチ レン基との付加生成物、
(V) 式（1 )〜（3 )、 （6)、 （7 )で示される化合物のメチレ ン基同士の酸化カップリ ング生成物、
が挙げられる。 これらの化合物には、 重水中で測定した 1 3 C— NMRスぺク トルにおいて、 5 3〜 1 0 0 p p mの間に ピ一ク を示す化合物が含まれる。 また、 環化反応を経て生成 する化合物は着色する ことから、 紫外可視吸収スペク トルに おいて、 3 4 0〜 3 8 0 11 111と 4 4 0〜 4 6 0 11 11 に吸収極 大を示す化合物が含まれる。
本発明の加水分解反応系に含まれる有機不純物化合物は、 何れも分子量が 9 5以上の多官能性化合物であり 、 これらが 微生物酵素の活性を著しく低下させる。 本発明において、 分 子量が 9 5以上、 好ましく は分子量が 1 3 0以上の化合物の 含有量が 1 .0重量％以下、 好ましく は 5重量％以下、 更に好 ま しく は 1重量％以下に維持される条件下でグリ シンを製造 する ことによ り微生物酵素等の活性を向上させる。
本発明の加水分解反応系に含まれる有機不純物化合物の含 有量を 1 0重量％以下にする方法としては、 該加水分解反応 系に溶存する酸素を、 該加水分解反応系の重量に対して 5重 量 p p m以下に制限する方法が挙げられる。 大気圧下で水溶 液に溶存する酸素濃度は通常 8〜 1 0 p p mであるが、 溶存 する酸素濃度を 5重量 p p m以下にすると副生物の生成を減 らす効果が見られる。 微生物酵素等の加水分解活性の阻害を 抑制するためには、 溶存する酸素濃度を 0. 5重量 p p m以 下にする ことが好ましく 、 0. 0 5重量 p p m以下にする こ とが更に好ましい。
本発明において、 加水分解反応系に溶存する酸素濃度を制 限する方法として、 反応系への空気の漏れ込みを遮断する密 閉反応系、 不活性ガスで加圧した反応系、 不活性ガスを流通 させた反応系又は大気圧未満の圧力の反応系を用いる こ とが できる。 不活性ガスとしては、 ヘリ ウムガス及びアルゴンガ ス等の希ガス類、 メタンガス、 ェタンガス及びプロパンガス 等の天然ガス類、 ジメチルエーテ等の低沸点エーテル類、 又 は窒素ガスを単独又は混合して用いる ことができる。 安全性 等の理由から窒素ガスを用いる ことが好ましい。 密閉反応系 を用いる場合、 不活性ガスで加圧することにより効果的に空 気が遮断できる。 この場合の圧力範囲としては特に限定され ないが、 使用する微生物酵素の耐圧を考慮すると大気圧を越 えて 1 . O M P a以下が好ましく、 大気圧を越えて 0 . 5 M P a以下がよ り好ましい。 大気圧未満の圧力の反応系を用い る場合、 水の 0 °Cにおける蒸気圧である 0 . 7 k P aを越え て大気圧未満で行う ことができ、 4. O k P a以上大気圧未 満が好ましい。
本発明において、 加水分解反応系に溶存する酸素濃度を制 限するためには、 空気を遮断するだけでなく、 原材料等に 元々溶存している酸素を取り除く必要がある。 溶存酸素を取 り除く方法と しては、 公知の様々な方法が利用できる、 例え ば、 蒸留操作で溶存酸素を取り除く蒸留脱気法、 不活性ガス を流通させ溶存酸素を不活性ガスと置換する ことで取り除く 不活性ガスの流通処理法、 又は還元性化合物を添加し酸素を 還元消費して取り除く還元性化合物添加法を用いるこ とがで きる。 還元性化合物添加法に用いる還元性化合物としては還 元性生化学化合物、 蟻酸化合物、 又は亜硫酸化合物を用いる 訂正された用紙 （規則 91) ことができる。 還元性化合物添加法に用いる還元性生化学化 合物としては特に制限はないが、 例えば、 L 一ァスコルビン 酸、 L —ァスコルビン酸ステアリ ン酸エステル等のァスコル ビン酸エステル類、 L —ァスコルビン酸ナ ト リ ウム等の塩類 , ダル夕チオン、 L —システィ ン、 L 一システィ ン塩酸塩一水 和物等のシスティ ン塩類、 L —システィ ンェチルエステル塩 酸塩や L —システィ ンメチルエステル塩酸塩等のシスティ ン エステル類、 または N—ァセチル— L —システィ ン等の N置 換システィ ン類を用いることができる。 好ましく は、 L —ァ スコルビン酸が用いられる。 還元性生化学化合物の添加量は 溶存酸素濃度によ り異なるが、 グリ シノニ ト リルの安定化の 点から、 グリ シノニ ト リルに対して 0 . 0 0 1 〜 5 m o 1 % 好ましく は 0 . 0 1 〜 2 m o l %用いる。 還元性化合物添加 法に用いる蟻酸化合物としては特に制限はないが、 例えば、 蠛酸、 蟻酸アンモニゥム等の蟻酸塩類や、 蟻酸メチル、 蟻酸 ェチル等の蟻酸エステル類が用いられる。 好ましく は、 蟻酸 又は蟻酸アンモニゥムが用いられる。 蟻酸化合物の添加量は 溶.存酸素濃度によ り異なるが、 グリ シノニ ト リルの安定化の 点から、 グリ シノニ ト リルに対して 0 . 0 0 2 〜 8 m o 1 % 好ましく は 0 . 0 2 〜 4 m o l %用いる。 還元性化合物添加 法に用いる亜硫酸化合物としては特に制限はないが、 例えば 亜硫酸ガス、 亜硫酸、 亜硫酸ニナ ト リ ウム、 亜硫酸水素ナ ト リ ウム、 亜硫酸二カ リ ウム、 亜硫酸水素カ リ ウム、 亜硫酸二 アンモニゥム等を用いる ことができる。 好ましく は、 亜硫酸 二アンモニゥムが用いられる。 伹し、 亜硫酸化合物は電解質 であ り副生物の生成を促進する効果もある ことから、.亜硫酸 化合物の添加量は以下に述べる条件に則しグリ シノニ ト リ ル に対して 0. 0 0 1 〜 2重量％、 好ま しく は 0 ·' 0 1〜 丄 重 量％用いる。
更に、 本発明の加水分解反応系に含まれる有機不純物化合 物の含有量を 1 0重量％以下にする方法としては、 アンモニ ァをグリ シノニ ト リルの安定剤として用いる方法が挙げられ る。 グリ シノニ ト リルは加熱するとアンモニアを放出してィ ミ ノ ジァセ トニ ト リル等のイ ミ ン化合物を生成し、 更に変性 されて黒色化合物を生成する ことから、 アンモニアが溶存す る加水分解反応系を用いてグリ シノニ ト リルを安定化させる ことができる。 アンモニアの添加量は反応温度や時間によつ て異なるが、 グリ シノニ ト リル 1 m 0 1 に対して 0. 0 0 1 〜 5 m o l が好ましく 、 0. 0 1〜 2 m o l がよ り好ましい 通常ダリ シノニ ト リルの合成に用いる過剰のアンモニアを分 離せずにそのまま用いてもよい。
更に、 本発明の加水分解反応系に含まれる有機不純物化合 物の含有量を 1 0重量％以下にする方法としては、 加水分解 反応系に含まれる電解質を、 グリ シノニ ト リルの重量に対し て 2重量％以下に制御する方法が挙げられる。 電解質はニ ト リル化合物からの副生物の生成を促進する ことが知られてい る。 本発明で用いる電解質とはアルカ リ金属塩、 アルカ リ土 類金属塩、 およびリ ン酸'緩衝液等の混合物に加え、 グリ シン - と塩を形成できる苛性ソーダ等のアルカ リ金属やアルカ リ土 類金属の化合物、 硫酸、 塩酸、 硝酸等の鉱酸類を含む。 これ らの電解質を添加すると二 トリル化合物からの副生物生成が 促進されるが、 その理由の一つとして、 電解質は水溶液に添 加する と酸素の溶存量を増加させる効果のある ことが知られ ている （日本国、 日本化学会発行の化学便覧 改訂 4版 I I 一 1 5 9 頁 表 8 . 5 4 ) 。 従って'、 微生物酵素の製造工程 で培地又は緩衝液として用いた電解質は所定量まで洗浄し、 グリ シノニ ト リル水溶液に含まれるアルカ リ触媒量を低減さ せ、 反応液の p Hを調整するためのリ ン酸緩衝剤の添加を極 力抑制する ことが好ましい。 加水分解反応系に含まれる電解 質の総量は、 グリ シノニ ト リルの重量に対して 2重量％以下 にし、 好ましく は 1 重量％以下、 更に好ましく は 0. 5重 量％以下にする。
上記した、 加水分解系に溶存する酸素を制限する方法、 ァ ■ ンモニァを溶存させる方法及び電解質濃度を制御する方法は 組合わせて用いる こともできる。 これらの方法をすベて組合 わせて行う こ とがよ り好ましい。
本発明に用いる二 ト リル基の加水分解活性を有する微生物 酵素を産生する微生物と しては、 例えば、 ァシネ トパクター (Accinetobacter) 属、 ロ ドコ ッカス ( Rhodococcus) 属、 コ リ ネバクテリ ゥム （Corynebacter ium) 属、 アルカ リ ゲネ ( Al cal igenes) 属、 マイ コバクテリ ゥム （Mycobac ter ium)属， ：ロ ドシユー ドモナス (Rhodopseudomonas 属、 キャ ンディ 夕
(Candida)属に属する微生物が適しているが、 これらに限定 されるものではない。 具体的には、 以下の菌株が挙げられる ,
( 1 ) 日本国、 通商産業省工業技術 生命工学工業技術研究 所 （日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0
5 - 0 0 4 6 ) ) に昭和 6 0年 5 月 2 8 日 （原寄託日） に寄 託した寄託番号 F E R M B P - 2 4 5 1 のァシネ トバクタ 一 s p . A K 2 2 6株 （日本国特公昭 6 3 — 2 5 9 6号明 細書） 、 '
( 2 ) 日本国、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究 所 （日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 — 0 0 4 6 ) ) に昭和 6 0年 5 月 2 8 日 （原寄託日） .に寄 託した寄託番号 F E R M B P — 7 4 1 3 のァシネ トパク夕 一 s p . A K 2 2 7株 （日本国特公昭 6 3 — 2 5 9 6号明 細書） 、
( 3 ) 日本国、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究 所 （日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 - 0 0 4 6 ) ) に平成 5年 1 1 月 2 日 （原寄託日） に寄託 した寄託番号 F E R M B P— 5 2 1 9 のロ ドコ ッカス マリ
• ス B P — 4 7 9 — 9株 （日本国特開平 7 — 3 0 3 4 9 1 号 明細書、 日本国特開平 7 — 3 0 3 4 9 6号明細書） 、 ( 4〉 日本国、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究 所 （日本国茨城県つく ば巿東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 - 0 0 4 6 ) ) に昭和 6 1年, 8月 2 8 日 （原寄託日） に寄 託した寄託番号 F E RM B P— 7 4 1 4のコ リネパクテリ ゥム s p . C 5株 （日本国特公平 6 — 6 5 3 1 3号明細 書） 、
( 5 ) 米国、 アメ リカン タイプ カルチャー コ レクショ ン (米国ヴァージニァ州マナッサスブルヴアール大学 （郵便番 号 1 0 8 0 1 ) ) に寄託した寄託番号 AT C C 2 1 4 1 9 のコ リ ネパクテリ ゥム ニ ト リ ロフイ ラス株 （日本国特開平 2 — 8 4 1 9 8号明細書） 、
( 6 ) 日本国、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究 所 （日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 - 0 0 4 6 ) ) に平成 6年 7月 2 2 日 （原寄託日） に寄託 した寄託番号 F E RM B P— 4 7 5 0のアルカ リゲネス フ ェカ リ ス I F O 1 3 1 1 1株 （日本国特開平 6 — 7 0 8 5 6号明細書） 、.
( 7 ) 日本国、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究 所 （日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 - 0 0 4 6 ) ) に平成元年 3月 2 7 日 （原寄託日） に寄託 した寄託番号 F E RM B P— 2 3 5 2のマイ コパクテリ ゥ ム s p . A C 7 7 7株 （日本国特開平 2— 8 4 9 1 8号明 細書、 米国特許第 5 2 8 3 1 9 3号） ( 8 ) 米国、 アメ リカン タイプ カルチャー コ レクショ ン (米国ヴァージニァ州マナッサスブルヴアール大学 （郵便番 号 1 0 8 0 1 ) ) に寄託された寄託番号 A T C C 1 1 1 6 7 の'ロ ドシユー ドモナス スフエロイデス株 （日本国特開平 6 — 3 0 3 9 9 1 号明細書） 、 及び
( 9 ) 米国、 アメ リ カン タイプ カルチャー コ レクショ ン (米国ヴァージニァ州マナッサスブルヴアール大学 （郵便番 号 1 0 8 0 1 ) ) に寄託された寄託番号 A T C C 2 0 3 1 1 のキャンディ ダ ト ロピカ リス株 '（日本国特開平 6 — 3 0 3 9 9 1 号明細書） 。
本発明に用いる微生物酵素を産生する微生物の培養には、 通常用いられる培地を用いるこ とができる。 炭素源としては 例えば、 ダルコ一ス、 グリセリ ン、 サッカロース、 フラク ト ース、 酢酸等の有機酸、 デキス ト リ ン、 マル トース等が、 窒 素源としては、 アンモニアとその塩類、 尿素、 硫酸塩、 硝酸 塩、 有機窒素源 （酵母エキス、 麦芽エキス、 ペプトン、 大豆 油、 肉エキス等） が用いられる。 また、 培地にはリ ン酸塩、 ナ ト リ ウム、 カ リ ウム、 鉄、 マグネシウム、 コバルト、 マン ガン、 亜鉛等の無機栄養源、 及びビタミ ン類が適宜添加され る。 培養は P H 4〜 1 0、 好ましく は p H 6 〜 8 で、 温度 5 〜 5 0 °C、 好ましく は 2 0〜 3 5 °Cで好気的に行われる。 ま た、 上記の培地に、 ラクタム化合物 （ァ -ラクタム、 δ -ラり タム、 ε -力プロラクタム等） 、 二ト リル化合物、 アミ ド化 合物等の酵素誘導剤を加えてもよい。 本発明に用いる微生物 酵素を産生する微生物はそのまま工業使用する ことができる が、 適当な変異剤で突然変異を誘発する方法もしく は遺伝子 工学的手法によ り改良された変異株、 例えば、 酵素を構成的 に産生する変異株を作製して用いる こ ともできる。 本発明に 用いる微生物酵素と しては、 培養液から採取した微生物をそ のまま用いていもよいし、 微生物処理物 （微生物の破砕物、 微生物破砕物よ り分離した酵素、 固定化した微生物又は微生 物から分離抽出された酵素を固定化した処理物） を用いても よい。 培養液からの微生物の採取は公知の方法で行う ことが 出来る。
本発明においては、 上述の方法で分離した微生物又は微生 物処理物は一旦、 蒸留水や緩衝液に懸濁して保存する ことが 出来る。 この場合、 反応後の廃棄物を減らす上で蒸留水、 特 に晶析工程等で空気を遮断した条件で蒸留分離した蒸留水を 再使用する ことが好ましい。 また、 保存安定化のために安定 剤を保存液に添加する ことも出来る。 この場合も、 反応後の 廃棄物を減らす上で安定剤としてダリ シンを用いる こ とが好 ましい。
本発明においては、 上述の方法で得られた微生物又は微生 物処理物の懸濁水溶液に、 上記の方法で得られたグリ シノニ ト リル水溶液又はアンモニァを含むグリ シノニ ト リル水溶液 を添加する方法、 得られた微生物又は微生物処理物の懸濁永 溶液を該グリ シノニ ト リル水溶液に添加する方法、 または得 られた微生物又は微生物処理物を公知の方法で固定化してこ れに該グリ シノニ ト リル水溶液を流通する方法を用いる こと によ り、 速やかにグリ シノニ ト リルの加水分解反応が進行し グリ シンを製造する こ とができる。 即ち、 通常、 前記微生物 又は微生物処理物を、 例えば乾燥微生物換算で 0 . 0 1 〜 5 重量％、 基質のグリ シノニ ト リルを 1 〜 4 0重量％反応装置 に仕込み、 温度として例えば 0 〜 6 0 °C、 好まし く は 1 0 〜 5 0 ：にて、 反応時間を例えば 1 〜 2 4時間、 好ましく は 3 〜 8時間反応させればよい。 グリ シノニ ト リルを低濃度で仕 込み、 経時的に追加 加したり、 反応温度を経時的に変化さ せてもよい。 グリ シノニ ト リルが加水分解されてグリ シンと アンモニアに変換されると反応後の反応溶液の p Hは反応前 に比べて増加する。 このように反応の進行に伴い p Hが増加 するのを抑えるために反応前に緩衝液を添加した り、 反応中 に酸又はアルカ リ を添加することもできるが、 反応後の廃棄 物を減らす上ではこう した緩衝液、 酸やアルカ リ を加水分解 反応系に添加しないことが好ましい。 加水分解反応は開放型 の反応器で実施する こともできるが、 副生するアンモニアの 飛散による環境汚染の防止、 アンモニアの回収、 及び空気の 遮断の観点から、 密閉型の反応器を用いて閉鎖的反応条件で 加水分解反応を行い、 副生するアンモニアを反応器中に一旦 蓄積する こ とが好ましい。 アンモニアは、 蒸留、 反応蒸留、 不活性ガスによる同伴、 イオン交換、 抽出、 貧溶媒を用いた再沈殿、 及び 又は濃縮 あるいは冷却による晶析を行う ことでグリ シンとは別々に加 水分解反応系から回収する ことができる。 操作が簡便で有機 溶媒、 酸、 アルカ リ等の余分な成分を用いない点から、 加水 分解反応系から蒸留、 反応蒸留又は不活性ガスへの同伴分離 により アンモニアを回収し、 そして、 アンモニア回収後の残 液を濃縮あるいは冷却による晶析に付すことによ り グリ シン を回収する方法が好ましい。 反応蒸留を行う場合、 反応装置 として、 アンモニアと水を冷却回収するための冷却器の付い た単管搭、 棚段搭、 または充填塔を用い、 反応溶液の沸騰圧 以上、 例えば 6 0ででは 2 0 . O k P a以上から Ο Τ では 0 6 k P a以上の圧力条件下で、 連続的にまたは間欠的に減圧 反応蒸留を行う ことが好ましい。 更に好ましく は、 1 2 . 6 k P a ~ 1 . 3 k P a の圧力条件下で減圧反応蒸留する。 不 活性ガスによる同伴回収をする場合、 反応装置に不活性ガス の吹き込みノズルと、 アンモニアや水を不活性ガスから回収 するための冷却 ト ラ ップとを備え、 微加圧〜減圧条件下で連 続的にまたは間欠的にアンモニアを不活性ガスに同伴させ反 応溶液から分離する ことができる。 更に、 アンモニアの分離 を促進するために、 減圧反応蒸留を不活性ガス流通条件下で 行う こともできる。 反応方式はパッチ型方式や流通型反応方 式を用いる ことができ、 これらを組み合わせて用いてもよい このよう に加水分解反応系の反応方式は、 微生物ゃグリ シ ノ ト リルの添加方法やアンモニアの分離回収方法によ り異 なるが、 微生物又は微生物処理物の懸濁水溶液を用いる場合 やアンモニアを反応蒸留又は不活性ガスで同伴分離する場合 は、 主にパッチ型方式又は多段の撹拌槽を用いた多段流通型 反応方式を用いることができ、 固定化した微生物を用いる場 合は、 主に管型の反応装置を用いた管型流通反応方式又はこ れらを組み合わせた方式で行う ことができるが、 これらに限 定されるものではない。
グリ シノニ ト リルは、 ほぼ 1 0 0 %のモル収率で加水分解 される。 副生する全てのアンモニアは密閉型反応器中に一旦 グリ シンの高濃度水溶液としてグリ シンのアンモニゥム塩の 状態で生成蓄積させる ことができる。 また、 生成するアン.モ ニァの全部または大部分を反応と同時に反応蒸留法や不活性 ガスの流通法で反応溶液から分離して冷却回収する こ と もで きる。 菌体が微生物酵素として二 ト リルヒ ドラターゼ酵素を 有する場合、 グリ シンが加水分解され加水分解反^系に、 グ リ シンアミ ドが並産される。 この場合はグリ シンアミ ドの加 水分解活性を有する微生物又は微生物酵素を追添加する こ と により 、 完全にグリ シンとアンモニアに変換する こともでき る。 グリ シンのアンモニゥム塩を含むグリ シンの高濃度水溶 液からのグリ シンの回収は、 例えば、 反応溶液から微生物又 は微生物酵素を遠心濾過及び/又は膜濾過等によって分離し た後、 晶析、 イオン交換又は貧溶媒を用いた再沈殿により回 収する ことができる。 またアンモニアは一部の水と一緒に蒸 発分離後、 蒸留や抽出によって回収する ことができる。 本発 明の好ま しい製造法としては、 例えば、 （ 1 ) 密閉反応系に おいて、 水性媒体中でアルカ リ触媒の存在下にシアン化水素 をホルムアルデヒ ド と反応させてダリ コロニ ト リル水溶液を 得、 （ 2 ) 該グリ コ ロニ ト リル水溶液にアンモニアを添加し て反応させ、 水を生成しながらグリ シノニ ト リル水溶液を得. 大部分のアンモニアと水の一部を蒸留分離し、 グリ シノニ ト リル水溶液と未分離のアンモニアを含む加水分解反応系を得.
( 3 ) 分離したアンモニアを工程 （ 2 ) にリサイ クルし、
( 4 ) 該加水分解反応系を、 密閉反応系内の該加水分解反応 系に添加した微生物によって産生される微生物酵素の作用下 に加水分解反応に付し、 該グリ シノニ ト リルをアンモニアを 副生しながらグリ シンに変換し、 （ 5 ) 該微生物及び該微生 物酵素を、 遠心濾過及び膜濾過からなる群よ り選ばれる少な く とも 1つの操作によ り分離し、 工程 （ 1 ) 〜 （ 5 ) で副生 した該微生物酵素を阻害する有機不純物化合物の一部を、 膜 濾過及び吸着剤を用いた分離からなる群よ り選ばれる少なく とも 1つの操作によ り分離し、 ( 6 ) 分離した該微生物及び 該微生物酵素は工程 （ 4 ) にリサイ クルし、 （ 7 ) 工程
( ) で副生したアンモニアと工程 （ 4 ) の後で該加水分解 反応系に残る過剰量の水を蒸留分離し、 分離したアンモニア 5. 8 と水は工程 （ 2 ) にリサイクルし、 （ ） 工程 （ 7 ) の後又 は工程 （ 7 ) と同時に、 該グリ シンを晶析によ り分離し、 ( 9 ) 分離された該グリ シンの結晶を乾燥する こ とにより、 グリ シンを製造する ことがでぎる。 本発明において、 グリ シノニ ト リル水溶液を加水分解反応 に付して該グリ シノニ ト リルをアンモニアを副生しながらグ リ シンに変換し、 そして、 加水分解反応系から該グリ シンを 単離するグリ シンの製造方法において、 該グリ シノニ ト リル の加水分解をアンモニアの存在下で行う。 その際、 アンモニ ァの濃度が、 グリ シノニ ト リル 1 m ο 1 に対して 0 . 0 0 1 〜 5 m o 1 である ことが好ましい。 本発明の方法を用いる こ とによ り、 グリ シノエ ト リルを安定化し、 グリ シンを定量的 に効率よく 製造することができる。 更に、 本発明において、 グリ シノニ ト リル水溶液を加水分 解反応に付して該グリ シノニ ト リルをアンモニアを副生しな がらグリ シンに変換し、 そして、 加水分解反応系から該グリ シンを単離するグリ シンの製造方法において、 塩基及び酸の 不存在下で、 該加水分解反応系からグリ シンの単離を行い、 一方、 グリ シンの回収とは別に副生アンモニアを回収する こ とができる。 その際、 グリ シン及びアンモニアを、 蒸留、 反 応蒸留、 不活性ガスによる同伴、 イオン交換、 抽出、 貧溶媒 を用いた再沈殿、 及び濃縮又は冷却による晶析からなる群よ り選ばれる少なく とも 1 つの操作によ り別々 に回収する こと が好ましい。 更に、 アンモニアを蒸留、 反応蒸留又は不活性 ガスによる同伴によ り回収し、 そして、 グリ シンを、 アンモ ニァ回収後の残液の濃縮又は冷却による晶析に付すことによ り 回収する こ とが好ましい。 本発明の方法を用いるこ とによ り 、 アンモニアをリサイ クルする ことが可能となり、 また、 環境への付加も少なくする ことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に挙げる実施例及び比較例によ り本発明をより具体的 に説明するが、 本発明はこれらによって何ら限定されるもの ではない。
尚、 実施例及び比較例においては、 反応系への酸素の混入 を防ぐために、 基本的な反応操作は全て窒素雰囲気下で行つ た。 反応系に初めて投入する水溶液類は窒素ガスで一旦加圧 後、 再び常圧に戻す等の窒素置換操作を数回繰り返して空気 を窒素で置換 （即ち、 酸素濃度を 0 . O l p p m以下に） し てから使用した。 但し、 工業プロセス （実施例 1 2 ) におい ては、 グリ シノニ ト リルの濃縮工程やグリ シンの晶析のため の濃縮操作で得られる蒸留水をリサイクルするので、 水溶液 などを窒素下で保存する以外に特別の操作は必要ではない。 次の実施例及び比較例において、 種々の操作を以下のよう にして行った。
( 1 ) アンモニア及び水の蒸発回収
アンモニアの蒸発回収や水の蒸発回収は薄膜蒸留装置 （日 本国、 柴田化学社製） を用い、 減圧下、 滞留時間 1分以内の 条件で実施した。
( 2 ) 反応液の濃縮 3 0 m l 以下の反応液を濃縮する場合には、 循環式ァスピ レーター減圧下ロータ リーエバポレーター装置 （日本国、 東 京理化製） を用いて行った。
( 3 ) 微生物の分離
グリ シノニ ト リルの加水分解反応の後に微生物を分離する 際には、 冷却遠心分離装置 （日本国、 日立社製） を用い、 1 0 , 0 0 0 r ρ mで 1 5分間遠心分離を行った。
( ) タンパク質類の除去
実施例 1 〜 1 1 においては注射機用限外濾過フィ ルタ一 (日本国、 テルモ株式会社） を用い、 加圧下でろ過する こと によ り タンパク質類の除去を行った。 実施例 1 2 においては 循環式限外濾過膜装置 （日本国、 旭化成工業 （株） 製の限外 濾過膜 S I P— 1 0 1 3 ) を用いてタンパク質類の除去を 行った。
( 5 ) 液体ク ロマ トグラフィ ー
イオンペアクロマ トグラフィ ー法にてグリ シン、 グリ シノ 二 ト リル、 グリ コ ロニ ト リル、 イ ミ ノ ジァセ トニ ト リル、 ィ ミ ノジ酢酸、 へキサメチレンテ ト ラミ ン、 アンモニア、 硫酸 イオン、 ナ ト リ ウムイオン等を分析じた。 分析装置としては 液体ク ロマ トグラフィ ー装置 （日本国、 島^社製 L C 一 6 訂正された用紙 （規則 91) A、 R I 及び U V検出器） と〇 D Sカラム （日本国、 東ソー 製） を用い、 イオンペア剤としてペンタンスルホン酸ナ ト リ ルムを用いてイオンペアクロマ トグラフィ ー法を実施した。
( 6 ) ゲルパーミ ュエーシヨ ンク ロマ トグラフィー
分子量 5 5 のグリ コロニ ト リル及び分子量 4 0 0 0以下の 有機不純物化合物の分析をゲルパ一ミ ユエーシヨ ンク ロマ ト グラフィ ー （ G P C ) で行った。 ゲルパ一ミユエ一ショ ンク 口マ トグラフィ ー装置としては、 日本国、 島津社製の L C— 9 A及び米国、 ニコ レ社製の G P C— I R、 R I 及び U V検 出器を用い、 カラムとして G S — 2 2 0 N Qカラム （日本国、 昭和電工社製の Showd'ex旭パック） を用いた。
( 7 ) 着色化合物の分析
紫外可視分光光度計 （日本国、 日立社製の U— 3 2 1 0 ) を用いて、 加水分解反応系の 2 0 0 n m〜 8 0 0 n mにおけ る紫外可視吸収スペク トルを測定した。 得られたスぺク トル か ら吸収極大を示す波長及びピークの高さを求めるこ とで、 加水分解反応系に含まれる着色化合物を分析した。
( 8 ) N M R
重水中で 1 H— N M Rスぺク トルと 1 3 C— N M Rスぺク トルをそれぞれ測定し、 有機不純物化合物を分折した。 訂正された用紙 （規則 91) — N M Rは日本国、 日本電子製の J N M— α 4 0 0 を用 いて行い、 1 3 C— N M Rはドイツ国、 ブルーカー社製の A C— 2 0 0 を用いて行った。 いずれの場合も、 測定用の試料 としては、 加水分解反応系を減圧乾燥した後に重水に溶解し、 内部標準として 4， 4 —ジメチルー 4 ーシランペンタ ンスル ホン酸ナ ト リ ウム （ δ θ . 0 1 5 p p m ) を用いたものを使 用した。 実施例 1
( 1 ) グリ シノニ ト リルの合成
攪拌機とジャケッ トを備えた容量 8 リ ッ トルのオー トク レ —ブ （日本国、 旭化成株式会社製） を反応器として用いた。 反応器の内部を窒素雰囲気にし、 そこに 1 2 0 0 gの 3 7 % ホルムアルデヒ ド及び当量のシアン化水素を加えて反応させ グリ コ ロニ ト リル水溶液を製造した。 得られたグリ コ ロニ ト リル水溶液に 5 0 0 0 gの 2 5 %アンモニア水溶液を添加し 2時間反応させてグリ シノニ ト リルを製造した。 次に反応液 中に存在する未反応のアンモニアと過剰の水を薄膜蒸留装置 で減圧除去し、 3 0重量％グリ シノニ ト リル水溶液を得た。 得られたグリ シノニ ト リル水溶液を液体ク ロマ トグラフィ ー 法で分析したと ころ、 グリ シノエ ト リルの他に 0 . 8重量％ のィ ミ ノ ジァセ トニト リルが含まれていた。 また、 ゲルパー ミ ユエーショ ンク ロマ トグラフィ一法でグリ シノニ ト リル水 溶液を分析したと ころ、 分子量 9 5以上の有機不純物化合物 が、 水溶液中に 1 . 2重量％含まれていた。 更に製造したグリ シノニ ト リルを 1 3 C— N M Rで分析し たところ、 グリ シノニ ト リルとイ ミ ノ ジァセ トニ ト リルに対 応するピーク以外にも 6 0〜 7 O p p mに付近にピークが確 認された。 また、 製造したグリ シノニ ト リル水溶液の吸光度 を測定したところ、 3 4 4 n mと 4 6 8 n mに吸収極大が見 られ、 1 O mm石英セル当たりの吸光度は 3 4 4 n mが 0 . 2 9 7 、 4 6 8 n mが 0 . 0 8であった。
( 2 ) 微生物の培養 ァシネ トパクター s p . A K 2 2 6株 （ F E R M B P — 2 4 5 1 ) を、 下記の組成からなる培地を用い、 3 0 °Cで 1 日培養した。 培地
(下記の成分を蒸留水に溶解したもの、 p H 7 . 5 ) フマル酸 1 . 0重量％
肉エキス 1 . 0
ペプト ン 1 . 0
食塩 0 . 1
ε —力プロラクタム 0 . 3
リ ン酸第一カ リ ウム 0 . 2
硫酸マグネシウム · 7水塩 0 . 0 2
塩化アンモニゥム 0 . 1
硫酸第二鉄 · 7水塩 0 . 0 0 3
訂正された用紙 （規則 91) 塩化マンガン · 4水塩 0 . 0 0 2 塩化コノ ルト · 6水塩 0 . 0 0 2
( 3 ) 夕リ シノ ニ ト リルの加水分解
培養した微生物を培養液から遠心分離によ り集菌し、 蒸留 水で 3 回洗浄した。 洗浄した微生物に蒸留水を加え、 乾燥微 生物重量換算で 1 8 . 0重量％の微生物の懸濁液を得た。 窒 素ガスで置換した 2 0 0 m l の硝子オー トク レーブに、 上記 ( 1 ) で合成した 3 0重量％グリ シノニ ト リル水溶液 5 3 . 3 g と蒸留水 4 6 . 7 g を窒素雰囲気下で仕込んだ。 次に微 生物の懸濁液 1 . 0 g をオー トク レープに加え、 4 0 °Cにて 反応を開始した。 この時オー トク レープ内の混合物の p Hは 約 7 だった。 反応開始後 p Hは上昇し、 2時間後には p H 1 0 になった。 反応を 1 0 時間行い、 反応液を得た。 得られた 1 0 0 gの反応液のうち 2 g を用いて、 液体ク ロマ トグラフ ィ 一法による原料のグリ シノニ ト リ ルと生成したグリ シンの 定量、 及びネスラー法によ り アンモニアの定量を行った。 液 体ク ロマ トグラフィ ーによる分析の結果、 反応液にから原料 であるグリ シノニ ト リルは完全に消失し、 グリ シンの収率は 9 9 %だった。 また、 アンモニアは定量的に生成していた。 乾燥微生物当たり のグリ シンの生成量は 1 1 Ί g / gであ り グリ シンの生成活性は 1 2 g / g · H r であった。
残り の反応液 9 8 g を冷却遠心分離に付して微生物を分離 し、 上澄みを回収した。 回収した上澄みを加圧下で限外濾過 フィ ルタ一に通し、 残存する微生物やタンパク質を取り除い た。 得られた濾液の 2 m l を用いて紫外可視吸収スペク トル を測定したところ、 4 6 8 n mの波長における吸光度は 0 . 7 9 であった。 上澄みの残り を全て薄膜蒸留装置に掛け、 ァ ンモニァと過剰の水を蒸発分離した。 凝集液と ドライ アイス エタノール トラップに回収した氷と液体を合わせ 4 8 gのァ ンモニァ水が得られた。 ボ トムには 4 3 gのグリ シン濃縮液 を回収した。 この濃縮液を室温まで冷却しながら晶析した。 一回の晶析操作で得た結晶を乾燥し、 1 6 . 5 gのグリ シン の結晶が得られた。 得られたグリ シンの純度は 9 9 . 9 9 % であった。 比較例 1
グリ シノニ ト リル水溶液に含まれる副生化合物である有機 不純物化合物の影響を検討した。 実施例 1 で合成した 3 0重 量％グリ シノニ ト リル水溶液を用い、 窒素流通下、 9 0 °Cで グリ シノニ ト リル水溶液を加熱した。 加熱に伴い窒素に同伴 する蒸気はドライアイスエタノール トラップで補足した。 加 熱後 1 5分、 3 0分、 1 時間、 その後は 3 0分毎に 5 時間ま で加熱した液を 1 0 m l ずつサンプリ ングし、 冷却保存した また、 サンプリ ングした液の一部を用い、 液体クロマ トグ ラフィ 一、 ゲルパーミ ュエーシヨ ンク ロマ トグラフィ ー、 紫 外可視分光光度計及び 1 3 C— N M Rによる分析を行った。 3 0分以上加熱したグリ シノエ ト リル水溶液にはアンモニア 臭があった。 加熱時間と共に水溶液は濃縮されているにもか かわらず、 グリ シノニ ト リルの濃度は 3 0重量％から 3 5重 量％の間 こあ り、 このことからグリ シノニ ト リルは変性して いる こ とが判明した。 また経時的に分子量 9 5以上の有機 純物化合物の量が増加していた。 有機不純物化合物はィ ミ ノ ジァセ トニ ト リ ルを含んでおり、 その他にも 1 3 C — N M R スぺク トリレにおいて 5 0〜 9 O p p mの間にピークを示す化 合物や、 紫外可視吸収スペク トルにおいて 3 8 0 n mと 4 6 8 n mに吸収極大を示す化合物が含まれていた。
上記でサンプリ ングした 1 1種の加熱液と加熱していない ダリ シノニ ト リル水溶液を合わせた 1 2種のサンプルを用い、 微生物による加水分解活性を比較した。 窒素ボックスの中で 5 . 0 m 1 のサンプルを試験管に仕込み、 そこに蒸留水 5 . 0 m 1 を添加した。 次に、 実施例 1 と同様に培養したァシネ トバクタ一 s p . A K 2 2 6株を用い、 乾燥微生物重量換 算で 1 2 . 5 重量％の微生物の懸濁液を調製した.。 調製した 微生物の懸濁液 0 . 5 m 1 を各試験管に添加し、 パラフィル ムで密閉した。 窒素ボックス内の恒温振とう器に密閉した試 験管をセッ ト し、 3 0 °Cで 8 時間加水分解反応を実施した。 反応液のうち 2 g を用いて液体クロマ トグラフィ ー法で分析 した。 表 1 に示すよ う に、 グリ シンの収率は有機不純物化合 物の濃度に依存し、 有機不純物化合物の濃度が 1 0重量％を 訂正された用紙 （規則 91) 越える と著しく低下した （サンプル 1 1 と 1 2 の結果を参 照） 。 反応液に含まれるグリ シン以外の成分は殆どが未反応 グリ シノニ ト リルであ り、 そのことから、 有機不純物化合物 は微生物の酵素活性を大きく 阻害したと考えられる。 一方、 有機不純物化合物の濃度が 5重量％以下では 9 0 %以上のグ リ シン収率を示し、 1 重量％以下では加熱をしないグリ シノ 二 ト リルを用いた場合と同等のグリ シン収率が得られた。 表 1
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実施例 2
( 1 ) グリ シノニ ト リルの合成
実施例 1 と同様に 3 0重量％のグリ シノニ ト リル水溶液を 合成した。 ( 2 ) 微生物の培養
実施例 1 と同様にァシネ トパクター s p . A K 2 2 6株 を培養した。
( 3 ) グリ シノニ ト リルの加水分解
培養した微生物を培養液から遠心分離によ り集菌し、 蒸留 水で 3 回洗浄した。 洗浄した微生物に蒸留水を加え、 乾燥微 生物重量換算で 5 . 0重量％の微生物の懸濁液を得た。 窒素 ガスで置換した耐圧シュ レンク管に、 窒素気流下において 1 . 0 m 1 の微生物の懸濁液と 1 6 m 1 の蒸留水を加え、 更にグ リ シノニ ト リル水溶液 3 m i を添加した。 耐圧シュレンク管 を密閉し、 2 0 で反応を開始した。 この時オー トク レープ 内の混合物の p Hは約 7 であり、 2時間後には ρ Η Ι Ο . 1 になった。 反応液の一部を取り出して液体ク ロマ トグラフィ —法にて分析したと ころ、 グリ シノニ ト リルは消失し、 ダリ シンが定量的に生成していた。 そこで 2時間毎に反応温度を 5 °C昇温し、 それと同時に基質である 3 0重量％グリ シノニ ト リル水溶液を 3 m 1 づっ反応器に追加するという操作を計 4回繰り返し、 合計 1 0時間反応を行って 3 2 m l の反応液 を得た。 そのうち 2 m 1 を用い、 実施例 1 と同様に分析した その結果、 グリ シノニ ト リルは完全に消失し、 グリ シンの収 率は 1 0 0 %だった。 また、 アンモニアも定量的に生成して いた。 乾燥微生物当たり のグリ シンの生成量は 1 2 0 gノ g であ り、 グリ シンの生成活性は 1 2 g / g · H r であった。
残り の反応液 3 0 m 1 を冷却遠心分離に付し、 限外濾過膜 で処理した。 得られた濾液をロータ リーエバポレーターで濃 縮し、 冷却して結晶化した後、 濾別し、 乾燥して 4 . 6 gの グリ シンの結晶を得た。 得られたグリ シンの純度は 9 9 . 9 9 %であった。 実施例 3
( 1 ) グリ シノニ ト リルの合成
.実施例 1 と同様に 3 0重量％のグリ シノニ ト リル水溶液を 合成した。
( 2 ) 微生物の培養
実施例 1 と同様にァシネ ドバクタ一 s p . A K 2 2 6株 を培養した。
( 3 ) グリ シノニ ト リルの加水分解
培養した微生物を培養液から遠心分離によ り集菌し、 蒸留 水で 3 回洗浄した。 洗浄した微生物に蒸留水を加え、 乾燥微 生物重量換算で 1 2 . 5重量％の微生物の懸濁液を得た。 窒 素ガスで置換した 2 0 O m l の硝子ォ一 トク レーブに、 上記
( 1 ) で製造した 3 0重量％グリ シノニ ト リル水溶液 5 3 . 訂正された用紙 （規則 91) 3 g と蒸留水 4 1 . 7 g を窒素雰囲気下で仕込んだ。 次に微 生物の懸濁液 5 g をオー トク レープに加え、 5 0 °Cにて反応 を開始した。 この時オー トク レープ内の混合物の p Hは約 7 だった。 反応開始後 ρ Hは上昇し、 1 時間後には p Hは 1 0 になった。 反応を 8時間行い、 反応液を得た。 得られた 1 0 O gの反応液のうち 2 g を用い、 実施例 1 と同様に分析した, その結果、 グリ シノニ ト リルは完全に消失しており、 グリ シ ンの収率は 9 9 %だった。 また、 アンモニアは定量的に生成 していた。 乾燥微生物当たり のグリ シンの生成量は 1 6 8 g であり、 グリ シンの生成活性は 2 1 g / g · H r であつ た。
また実施例 1 と同様の操作で遠心分離、 限外濾過、 薄膜蒸 留を経てアンモニア水 4 8 g とグリ シン濃縮液 4 3 g を回収 した。 グリ シン濃縮液についてはグリ シンの結晶化と乾燥操 作を経て、 1 7 gのグリ シン結晶を得た。 得られたグリ シン の純度は 9 9 . 9 9 %であった。 実施例 4
実施例 3 において遠心分離操作で回収した微生物を蒸留水 で 3 回洗浄した後、 蒸留水を加えて微生物の懸濁液 5 gを調 製した。 得られた微生物の懸濁液を用い、 実施例 3 と同様に グリ シンを製造した。 具体的には、 窒素ガスで置換した 2 0 0 m l の硝子オー トク レープに、 上記 （ 1 ) で製造した 3 0 重量％グリ シノ ニ ト リル水溶液 5 0 . 0 g と蒸留水 4 5 . 0 gを窒素下で仕込んだ。 次に微生物の懸濁液 5 gをオー トク レーブに加え、 5 0 °Cにて反応を開始した。 反応を 8 時間行 い、 反応液を得た。 得られた 1 0 0 gの反応液のうち 2 g を 用い、 実施例 1 と同様に分析した。 その結果、 グリ シノニ ト リルは完全に消失してお り、 グリ シンの収率は 9 9 %だった, また、 アンモニアは定量的に生成していた。 乾燥微生物当た り のグリ シンの生成量は 1 5 7 g /gであ り、 グリ シンの生 成活性は 2 7 g / g · Η Γ であった。 実施例 3 と実施例 4の 通算の乾燥微生物当たりのグリ シンの生成量は 3 3 5 g / g であ り、 グリ シンの生成活性は 2 0 g / g · H r であった。
また残り の反応液については、 実施例 1 と同様の操作でァ ンモニァ水 4 8 g とグリ シン濃縮液 4 2 g を回収した。 ダリ シン濃縮液についてはグリ シンの結晶化と乾燥操作を経て、 1 6 gのグリ シン結晶を得た。 得られたグリ シンの純度は 9 9 . 9 9 %であった。 実施例 5
実施例 4 において遠心分離操作で回収した微生物を蒸留水 で 3 回洗浄した後、 蒸留水を加えて微生物の懸濁液 5 gを調 製した。 得られた微生物の懸濁液を用い、 実施例 3 と同様に グリ シンを製造した。 具体的には、 窒素ガスで置換した 2 0 O m l の硝子オー トク レープに、 上記 （ 1 ) で製造した 3 0 P T/JP00/09353
73 重量％グリ シノニ ト リル水溶液 4 3. 3 gと蒸留水 5 1 . 7 gを窒素下で仕込んだ。 次に微生物の懸濁液 5 gをオー トク レーブに加え、 5 0 °Cにて反応を開始した。 反応を 8時間行 い、 反応液を得た。 得られた 1 0 0 gの反応液のうち 2 gを 用い、 実施例 1 と同様に分析した。 その結果、 グリ シノニ ト リルは完全に消失しており、 グリ シンの収率は 9 9 %だった t また、 アンモニアは定量的に生成していた。 乾燥微生物当た りのグリ シンの生成量は 1 3 6 g Z gであり、 グリ シンの生 成活性は 1 7 g Z g ' H rであった。 実施例 3、 実施例 4及 び実施例 5 の通算の乾燥微生物当たり のグリ シンの生成量は 4 6 1 8であ り、 グリ シンの生成活性は 2 6 8 ' 11 rであった。 実施例 6
( 1 ) グリ シノニ ト リルの合成
実施例 1 と同様に 3 0重量％のグリ シノニト リル水溶液を 合成した。
( 2 ) 微生物の培養
ロ ドコ ッカス マリ ス B P— 4 7 9 — 9株 （ F E R M B
P - 5 2 1 9 ) を、 下記の組成からなる培地を用い、 3 0 °C で 1 日培養した。 培地
(下記の成分を蒸留水に 溶解したもの、 p H 7 . 5 ) グリ セリ ン 1 0重量％
肉エキス 1 0
ペプト ン 1 0
食塩 0 1
ε —力プロラクタム 0 3
リ ン酸第一カ リ ウム 0 2
硫酸マグネシウム · 7水塩 0 0 2
塩化アンモニゥム 0 1
硫酸第二鉄 · 7水塩 0 0 0 3
塩化マンガン · 4水塩 0 0 0 2
塩化コノ ル ト · 6水塩 0 0 0 2
( 3 ) グリ シノエ ト リルの加水分解 培養した微生物を培養液から遠心分離により集菌し、 蒸留 水で 3 回洗浄した。 洗浄した微生物に蒸留水を加え、 乾燥微 生物重量換算で 6 . 0重量％の微生物の懸濁液を得た。 得ら れた微生物の懸濁液 1 . 0 m l を用い、 実施例 2 と同様にグ リ シノニ ト リルの加水分解反応を合計 1 0時間行った。 得ら れた 3 2 gの反応液のうち 2 gを用い、 実施例 1 と同様に分 祈した。 その結果、 グリ シノエ ト リルは完全に消失し、 グリ シンの収率は 1 0 0 %だった。 また、 アンモニアも定量的に 生成していた。 乾燥微生物当たり のグリ シンの生成量は 1 0 0 g Z gであ り、 グリ シンの生成活性は 1 0 . 0 g / g · H r であった。 残り の反応液を実施例 1 と同様の処理に付し、 4. 6 g の ダリ シンを晶析回収した。 実施例 7
( 1 ) グリ シノニ ト リルの合成
実施例 1 と同様に 3 0重量％のグリ シノニ ト リル水溶液を 合成した。
( 2 ) 微生物の培養
コ リネパクテリ ゥム 二 ト リ ロフィ ラス （A T C C 2 1 4 1 9 ) を、 実施例 6 と同様の条件で培養した。 .
( 3 ) グリ シノニ ト リ ルの加水分解
培養した微生物を培養液から遠心分離によ り集菌し、 蒸留 水で 3 回洗浄した。 洗浄した微生物に蒸留水を加え、 乾燥微 生物重量換算で 8 . 0重量％の微生物の懸濁液を得た。 得ら れた微生物の懸濁液 1 . 0 m 1 を用い、 実施例 2 と同様にグ リ シノニ ト リルの加水分解反応を合計 1 0時間行った。 得ら れた 3 2 gの反応液のうち 2 g を用い、 実施例 1 と同様に分 祈した。 その結果、 グリ シノニ ト リルは完全に消失し、 ダリ シンの収率は 9 9 %だった。 また、 アンモニアも定量的に生 成していた。 乾燥微生物当たり のグリ シンの生成量は 7 5 g gであ り、 グリ シンの生成活性は 8 g / g · H rであった 残り の反応液を実施例 1 と同様の処理に付し、 4 . 6 gの ダリ シンを晶析回収した。 訂正された用紙 （規則 91) 実施例 8
( 1 ) グリ シノニ ト リルの合成
実施例 1 と同様に 3 0重量％のグリ シノニ ト リル水溶液を 合成した。
( 2 ) 微生物の培養
コ リ ネバクテリ ゥム s p . C 5株を、 実施例 6 と同様の 条件で培養した。
( 3 ) グリ シノニ ト リルの加水分解
培養した微生物を培養液から遠心分離によ り集菌し、 蒸留 水で 3 回洗浄した。 洗浄した微生物に蒸留水を加え、 乾燥微 生物重量換算で 1 2 . 5重量％の微生物の懸濁液を得た。 撹 拌器の付いた 1 0 0 O m l の恒温ジャケッ ト槽型 3つロセパ ラブルフラスコに、 底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル ドライ アイ ス トラップに接続したミス トセパレ一夕一、 温度 計、 およびサンプリ ング管を備えた反応器を用意しだ。 セパ ラブルフラスコに微生物の懸濁液 9 m l を仕込み、 3 0重 量％グリ シノニ ト リル水溶液 3 0 m 1 と蒸留水 1 6 1 m l を 仕込んだ。 次にガス流量計を用いて 1 時間当た り 3 リ ッ トル の窒素ガスをフィ ー ドしながら、 3 0 °Cにて反応を開始した 1 時間後、 3 O m l の 3 0重量％グリ シノニ ト リル水溶液を 反応器に追加した。 この操作を更に 3回繰り返し、 合計 5時 間反応を行った。 ドライアイス トラップには氷と液体を合わ せて 1 5 gの反応副生物が回収された。 回収した反応副生物 を 5 0 m 1 の水に溶解し、 ネスラー法によ り アンモニアを定 量したと ころ、 アンモニアが 1 4 g回収されていた。 更に 3 0 5 gの反応液が回収され、 この反応液 2 gを用いて実施例 1 と同様に分析した。 その結果、 グリ シノニ ト リルは消失し、 グリ シンの収率は 9 9 %であった。 また、 ト レース量のアン モニァが残存していた。 乾燥微生物当たり のグリ シンの生成 量は 5 3 g Z gであ り、 グリ シンの生成活性は l l gノ g ' H rであった。
残り の反応液 3 0 3 gを実施例 1 と同様の処理に付し、 4 7 gのダリ シンを晶析回収した。 実施例 9
( 1 ) グリ シノニ ト リルの合成
実施例 1 と同様に 3 0重量％のグリ シノニ ト リル水溶液を 合成した。
( 2 ) 微生物の培養
アルカ リゲネス フエカ リス I F O 1 3 1 1 1株 （ F E R M B P— 4 7 5 0 ) を、 実施例 6 と同様の条件で培養し た。 ( 3 ) グリ シノニ ト リルの加水分解
培養した微生物を培養液から遠心分離によ り集菌し、 蒸留 水で 3 回洗浄した。 洗浄した微生物に蒸留水を加え、 乾燥微 生物重量換算で 1 2 . 5重量％の微生物の懸濁液を得た。 撹 拌器の付いた 1 0 0 0 m 1 の恒温ジャケッ ト槽型 3つロセパ ラブルフラスコに、 底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル、 ドライ アイス ト ラップを経て減圧ポンプに接続した単管型の 蒸留塔、 圧力センサー、 温度計、 および液送ポンプに接続し たサンプリ ング管を備えた反応器を用意した。 セパラブルフ ラスコに微生物の懸濁液 1 1 m 1 仕込み、 3 0重量％グリ シ ノニ ト リル水溶液 3 0 m l と蒸留水 1 5 9 m l を仕込んだ。 次にガス流量計を用いて 1 時間当た り 3 リ ツ トルの窒素ガス をフィ ー ドしながら、 3 0 °Cにて反応を開始した。 1 時間後. 3 0 m 1 の 3 0重量％グリ シノニ ト リル水溶液を反応器に追 加した。 この操作を更に 3 回繰り返し、 合計 5 時間反応を行 つた。 ド ライアイス トラップには氷と液体を合わせて 2 5 g の反応副生物が回収された。 回収した反応副生物を 5 0 m 1 の水に溶解し、 ネスラー法によ り アンモニアを定量したと こ ろアンモニアが 1 5 g回収されていた。 更に 2 9 5 g の反応 液が回収され、 この反応液 2 g を用いて実施例 1 と同様に分 析した。 その結果、 グリ シノニ ト リルは消失し、 グリ シンの 収率は 9 9 %であった。 また、 ト レース量のアンモニアが残 存していた。 乾燥微生物当たり のグリ シンの生成量は 4 2 g gであり、 グリ シンの生成活性は 9 g / g · H r であった, 残り の反応液 2 9 3 g を実施例 1 と同様の処理に付し、 4 8 gのグリ シンを晶析回収した。 実施例 1 0
( 1 ) グリ シノニ ト リルの合成
実施例 1 と同様に 3 0重量％のグリ シノニ ト リル水溶液を 合成した。
( 2 ) 微生物の培養
以下の微生物を実施例 6 と同様の条件で培養した。 微生物
ァシネトパクター s p. AK227株 （FERM BP— 7413) マイコバクテリゥム s p. AC 777株 （FERM BP— 2352) ロドシユードモナススフエロイデス （ATCC 1 1 167)
キャンディダ トロピカリス （ATC C 203 1 1)
シュ一ドモナス s p. 88— SB— CN 5株
ァクレモニゥム s p. D 9 K株
クレブシエラ s p. D 5 B株
( 3 ) グリ シノニ ト リルの加水分解 訂正された用紙 （規則 91) 各微生物について、 培養液から遠心分離によ り集菌し、 蒸 留水で 3 回洗浄した。 洗浄した微生物に蒸留水を加え、 乾燥 微生物重量換算で 1 2 . 5重量％の微生物の懸濁液を得た。 窒素ガスで置換した 2 0 O m l の硝子オー トク レープに、 上 記 （ 1 ) で製造した 3 0重量％グリ シノニ ト リル水溶液 5 3 3 g と蒸留水 4 2 . 7 g を窒素下で仕込んだ。 次に懸濁液 4 0 g をオー トク レープに加え、 4 0 °Cにて反応を開始した。 反応を 8時間行い、 反応液を得た。 得られた 1 0 0 gの反応 液のうち 2 g を用いて、 液体クロマ トグラフィ 一法による原 料 グリ シノエ ト リルと生成したグリ シンの定量、 及びネス ラー法による生成ア ンモニアの定量を行った。 表 2 に示す通 り、 いずれの微生物を用いた場合もグリ シノニ ト リルは完全 に消失し、 グリ シンは高い収率で生成していた。 また、 アン モニァは定量的に生成していた。 表 2
Figure imgf000082_0001
実施例 ( 1 ) グリ シノニト リルの合成
実施例 1 と同様に 3 0重量％のグリ シノニ 卜 リル水溶液を 合成した。
グリ シノニ ト リル水溶液の 4 6 8 n mにおける吸光度を測 定したところ、 グリ シノエ ト リル 1 m o 1 に換算して、 1 0 mm石英セル当たり吸光度は 0 . 0 8であった。
( 2 ) 微生物の培養
以下の微生物を実施例 6 と同様の条件で培養した。
微生物
ァシネトパクター s p. AK226株 （FERM BP— 2451) ロドコッカス マリス BP— 479— 9株 （FERM BP— 5219) コリネバクテリゥム s p. C 5株 （FERM BP— 7414)
コリネパクテリウムニトリロフィラス （ATCC 2141 9)
アル力リゲネス フエカリス I FO 1 31 1 1株 （ATCC 8750)
( 3 ) グリ シノニ ト リルの加水分解
各微生物について、 培養液から遠心分離によ り集菌し、 蒸 留水で 3 回洗浄した。 洗浄した微生物に蒸留水を加え、 乾燥 微生物重量換算で 1 2 . 5重量％の微生物の懸濁液を得た。 窒素ガスで置換した 2 0 0 m l の硝子オー トク レープに、 上 記 （ 1 ) で製造した 3 0重量％グリ シノニ ト リル水溶液 5 3
3 g と蒸留水 4 2 . 7 g を窒素下で仕込み.、 更に表 3 に示す 還元性化合物を添加した。 微生物の懸濁液は、 表 3 に示した 微生物懸濁液量 （重量） を用い、 更に微生物懸濁液と蒸留水 の合計量が 5 g となるよう に蒸留水を添加した。 3 0 °Cにて 反応を開始し、 1 0 時間反応を行った。 比較のために、 各微 生物について還元性化合物を添加しない実験も行った。 更に 密閉反応器の効果を比較するために、 空気開放系での検討も 合わせ行った。 得られた 1 0 0 gの反応液のうち 2 g を用い , 生成したアンモニアはネスラー法によ り定量し、 原料のダリ シノニ ト リルと生成したグリ シンは液体クロマ トグラフィ ー 法で定量した。
更に実施例 1 と同様に冷却遠心分離と限外濾過分離を行い 得られた溶液の 4 6 8 n mの吸光度を測定した。 また残り の 液は薄膜蒸留、 1 回の晶析操作、 及び乾燥を経てグリ シンの 結晶を回収し、 グリ シンの純度を測定した。 結果を表 3 に示 す。
還元性化合物を添加する ことでグリ シンの着色変性を大き く抑制する ことができた。 同時にグリ シンの収率も向上し、 グリ シンの結晶の純度は 9 9 . 9 9 %であった。 一方、 空気 中で反応すると褐色の反応液が得られ、 収率も低下した。 こ の場合、 限外濾過は困難となった。 得られたグリ シン結晶は 着色し純度は 9 9 %に低下した。 表 3
00 CO
Figure imgf000085_0001
* : 468 nmにおける吸光度 （グリシン lmo 1換算で 1 Omm石英セル当たり）
実施例 1 2
図 1 に示すシステムに基づき、 本発明のグリ シンの連続的 製造方法を具体的に説明する。
( 1 ) グリ シノニ 卜 リルの合成
撹拌器、 レベルセンサー、 圧力計、 安全弁、 及び温度指示 計が付属した 1 リ ツ トルのステンレス製オー トク レープ 6、 7、 8及ぴフラッ シュ蒸留装置 9 を直列に繋ぎ、 以下の条件 で、 グリ シノニ ト リル水溶液を合成した。 反応に先立ち、 ォ 一トク レーブ 6、 7、 8及びそれらを繋ぐ配管を窒素置換し た。 3台のダイアフラムポンプを用意し、 ポンプを用いて窒 素置換した 3 7重量％のホルムアルデヒ ド水溶液 1 (メチル アルコール 1 0重量％未満含有） を 1 0 0 g 時間、 液化シ アン化水素 2 を 3 3 . 3 g Z時間、 及ぴ 4 %水酸化ナ ト リ ウ ム 3 を 1 O O p p m含む蒸留水 2 4 0 gノ時間をオー トク レ —ブ 6 に連続的にフィ ー ドした。 反応温度を 4 0 °Cに設定し グリ コ ロニ ト リルを製造するための反応を開始した。 反応開 始直後には発熱が見られたが設定温度で反応は推移した。 レ ベルコ ン ト口一ラーで滞留時間を 1 時間に調整し、 オー トク レーブ 7 のグリ コ ロニ ト リルを含む反応液をオー トク レープ 8 にポンプでフィ ー ドし、 同時に 0 . 2 M P a のアンモニア ガス 4 をマスフローコ ン トローラーを通して 8 2 ノルマルリ ッ トル/時間で連続的にフィ ー ドした。 反応温度を 5 5 °Cに 設定し、 グリ シロニ 卜リルの製造を開始した。 反応開始時点 ではアンモニアの吸収のために大きな発熱が見られたが、 設 定温度及び設定圧力で反応は推移した。 レベルコン ト ローラ 一でォ一 トク レーブ 7 の反応液の滞留時間を 1 時間に調整し、 反応液をポンプでォー トク レ一ブ 8 にフィ一 ドした。 ォー ト ク レープ 8 の温度は 5 5 °Cに設定した。 1 時間の滞留時間後 にポンプで連続的にグリ シロニ ト リルを含む反応液を抜き出 した。 反応開始から 6時間迄の初期反応液を廃液として回収 し、 6 時間以降の反応液は常圧に設定したフラッシュ蒸留装 置 9 にフィ ー ドした。 フラッシュ蒸留装置 9 のカラム ト ップ の温度を一 2 0 °Cに設定し、 蒸留装置 9 にフィー ドした反応 液をカ ラム トップで冷却した。 この'際、 水分を氷冷.除去し、 湿ったアンモニアガスはドライアイスエタノール トラップで 回収し、 液状アンモニア 1 0 を得た。 回収した液状アンモニ ァ 1 0 はオー トク レープ 7 に供給する原料として利用した。 カラムボ トムから'少量のアンモニアを含むグリ シノニ ト リル 水溶液を回収し、 中間タンク 1 1 において 5 DCで冷却保存し た。 この時 1 0重量％の硫酸を安定剤として 1 0 0 p p m添 加した。 3 3重量％のグリ シロニ ト リル水溶液を得た。 イ ミ ノ.ジァセ トニ ト リルが 0 . 9重量％含まれており、 分子量が 9 5 以上の有機不純物化合物が 1 . 3重量％含まれていた。
( 2 ) 微生物の培養 実施例 1 と同様にァシネ トパクター s p . A K 2 2 6株 ( F E R M B P - 2 4 5 1 ) を培養した。 培養液から遠心 分離により集菌し、 蒸留水で 3 回洗浄した後、 蒸留水で 1 2 . 5重量％の微生物の懸濁液 5 とした。
( 3 ) 加水分解反応と微生物の分離
撹拌器、 温度計、 p Hセンサーを備えた 1 0 Lのステンレ ス製オー ト ク レープを加水分解反応器 1 2 として用いた。 窒 素気流下において、 中間タンク 1 1 に保存したグリ シノニ ト リル水溶液 5 4 0 0 g を加水分解反応器 1 2 に仕込み、 上記
( 2 ) で調製した微生物懸濁液 5 を 6 0 g添加し、 5 0 の 設定温度でグリ シノニ ト リルの加水分解反応を開始した。 8 時間後に反応液を連続遠心分離 ¾置 1 3 (米国、 ウェス トフ ァ リャ "社製の T A 1 — 0 2型） に導入し、 反応液から微生 物を分離した。 分離した微生物スラ リーの 5分の 1 を廃棄し
(廃棄微生物 1 4 ) 、 残り を蒸留水で 3 回洗浄した。 得られ —た微生物に蒸留水を加えて 4 8 gの懸濁液とし、 これに上記
( 2 ) と同様に調製した微生物の懸濁液 1 2 g を合わせた合 計 6 0 gの微生物の懸濁液を加水分解反応器 1 2 に仕込み、 グリ シノニ ト リルの加水分解反応を行った。 同様の操作を 2 回目以降も続けた。 遠心濾過によって得られた.濾液 （即ちグ リ シンを含む反応液） を循環式限外濾過膜装置 1 5 (日本国、 旭化成工業 （株） 製の限外濾過膜 S I P — 1 0 1 3 ) に供 給し、 循環しながら濃縮した。 濃縮液は中間タンク 1 6 に入 れて一旦保存した。 循環液が 5 0 0 m 1 まで減少したら、 そ こに蒸留水 5 0 0 m l を加えて 1 0 0 0 m l とし、 更に 5 0 0 m 1 まで濃縮するという操作を 2 回繰り返した。 最後に残 つた循環液 5 0 0 m 1 は廃棄した。
上記の工程 （ 3 ) は、 1 2時間サイ クルで繰り返した。 8 3重量％のグリ シンのアンモニゥム塩及び分子量 9 5以 上の有機不純物化合物が 0 . 9重量％含まれていた。
( 4 ) グリ シン結晶の回収
上記 （ 1 ) の反応開始後 1 8時間目には、 中間タンク 1 6 に濃縮液が約 6 k g得られたので、 グリ シンの連続晶析を開 始した。 1 0 0 g の活性炭を仕込んだカラム 1 7 に濃縮液を 通して活性炭処理された濃縮液を得た。 得られた活性炭処理 された濃縮液を 4 2 5 gノ時間の速度で連続晶析装置 1 8 に フィ ー ドした。 晶析装置 1 8 は撹拌器、 レベルセンサー、 温 度計及び減圧蒸留カラムを備えてお り 、 7 0 °Cにて、 濃縮液 に含まれる過剰の水と液体アンモニアをそれぞれ約 2 0 0 g 時間と約 2 0 g /時間で減圧蒸発させた。 蒸発回収した状 蒸留水 1 9 と液体アンモニア 1 0 は上記 （ 1 ) の反応に循環 使用した。 晶析槽に蓄積したスラ リー （グリ シン濃度 ： 4 0 重量％ ) を晶析槽のレベル上限と下限との間で間欠に晶析槽 ボ トムから吸引によって抜き出して、 熱時濾過に付した。 得 られた濾液の 4重量％をブローダウンし （ブロー 2 0 ) 、 残 り の濾液 2 1 は晶析槽に循環した。 晶析は運転開始から 3 時 間後には定常状態に達した。 晶析したグリ シンを晶析装置 1 8 か ら取り 出し、 乾燥してグリ シンの結晶 2 2 を得た。 得ら れたグリ シンの結晶 2 2 の純度を分析したところ、 純度は 9 9 . 9 9 %であった。 このシステムにおいては、 グリ シンは 平均して 8 2 g /時間の割合で得られ （微生物あたり 5. 4 g / g ) 、 全工程一貫収率は 9 0 %であった。
産業上の利用可能性
本発明のグリ シンの製造方法を用いる と、 医農薬合成原料 食品添加物、 洗浄剤原料として有用なグリ シンを、 高.純度で 微生物当たり且つ単位時間当たりのグリ シン生産活性が高く グリ シンとアンモニアを、 分解又は消費を伴わずに定量的に 製造し、 且つ容易に別々 に回収でき、 更に、 環境負荷も少な く 工業的に製造する ことが可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . グリ シンの製造方法にして、
グリ シノニ ト リル水溶液を提供し、
該グリ シノニ ト リル水溶液を、 加水分解反応系において、 二 ト リル基の加水分解活性を有する微生物酵素の作用下に加 水分解反応に付して該グリ シノニ ト リルをアンモニアを副生 しながらグリ シンに変換し、
該加水分解反応系は該微生物酵素を阻害する少なく とも 1 つの有機不純物化合物を含有し、 該微生物酵素を阻害する該 少なく とも 1 つの有機不純物化合物は、 分子量が 9 5以上で あり、 二 ト リル基、 カルボキシル基、 アミ ド基、 アミ ノ基、 ヒ ドロキシル基及びト リ メチレンアミ ン構造からなる群よ り 選ばれる少なく とも 1 つを含有し、 該ト リ メチレンアミ ン構 造は下記式 （ 1 ) ：
Figure imgf000092_0001
(式中、 nは 1 以上の整数を表わす。 )
で表わされる骨格を有し、 該加水分解反応を、 該加水分解反応の間、 該加水分解反応 系における該微生物酵素を阻害する該有機不純物化合物の含 有量が、 該加水分解反応系の重量に対して 1 0重量％以下に 維持される条件下で行い、
そして、
該加水分解反応系からグリ シンを単離する、
ことを包含する ことを特徴とする方法。
2 . 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1 つの有機不純物 化合物が、 シアン化水素、 ホルムアルデヒ ド及びアンモニア からのグリ シノニ ト リルの合成、 及びグリ シノニ ト リルのグ リ シンとアンモニアへの加水分解からなる群よ り選ばれる少 なく とも 1 つの反応において副生物として生成されたもので あるこ とを特徴とする請求項 1 に記載の方法。
3 . 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1 つの有機不純物 化合物が、 下記式 （ 2 ) で表わされる化合物を含むこ とを特 徴とする請求項 1 又は 2 に記載の方法。
NH3-n (CH: Y] ( 2 )
(式中、 各 Υ 1 は独立に二 ト リル基、 力ルポキシル基又は アミ ド基を表わし、 ηは 2又は 3 を表わす。 ）
4 . 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1 つの有機不純物 化合物が、 下記の化合物 （ a ) 及び （ b ) からなる群よ り選 ばれる少なく とも 1 つの化合物を含むことを特徴とする請求 項 1 又は 2 に記載の方法。
( a ) 下記式 （ 3 ) ：
Figure imgf000094_0001
(式中 Y 1 は二 ト リル基、 力ルポキシル基又はアミ ド基 を表わし 各 Y 2は独立にアミ ノ基又はヒ ドロキシル基を表 わし、 nは 0以上の整数を表わし、 Z 1 はそれぞれ独立に下 記式 （ 4 ) 又は （ 5 ) で表わされる。 ）
(4)、 又は
Figure imgf000094_0002
Figure imgf000094_0003
(式中、 各 Υ ώは独立にアミ ノ基又はヒ ドロキシル基を表 わす。 ）
で表わされる化合物、 及び、
( b ) 下記式 （ 6 ) 又は （ 7 )
(6)、 又は
Figure imgf000095_0001
Figure imgf000095_0002
(式中、 各 Y 2は独立にアミ ノ基又はヒ ドロキシル基を表 わし、 各 Ζ 2は独立に下記式 （ 8 ) 又は （ 9 ) で表わされ る。 ）
η一 C— CH2 (8)、 又は
NH
-H (9) (式中、 Y 2はァミ ノ基又はヒ ドロキシル基を表わし、 Ζ 1 はそれぞれ式 （'3 ) において'定義した通りであ り、 ηは 0 以上の整数を表わす。 ）
で表わされる化合物。
5 . 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1 つの有機不純物 化合物が、 下記の化合物 （ c ) 及び （ d ) からなる群よ り選 ばれる少なく とも 1 つの化合物を含むこ とを特徴とする請求 項 1 又は 2.に記載の方法。
( c ) 下記式 （ 1 0 ) 又は （ 1 1 ) ：
( ι ο)、 又は
Figure imgf000096_0001
Figure imgf000096_0002
(式中、 各 Υ 1 は独立に二 ト リル基、 力ルポキシル基又は アミ ド基を表わす。 ）
で表わされる化合物、 及び、
( d ) 下記式 （ 1 2 ) ：
訂正された用紙 （規則 91) (H C N) n (12)
(式中、 nは 4以上の整数を表わす。 ）
で表わされる化合物。
6 . 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1 つの有機不純物 化合物が、 下記の骨格 （ e ) Y NC及II び （ f ) からなる群よ り選ば
1一 H2
れる少なく とも 1 つの骨格を分子内に有する化合物を含むこ とを特徴とする請求項 1 又は 2 に記載の方法。
( e ) 下記式 （ 1 3 ) ：
(13)
n
(式中、 各 Y 1 は独立に二 卜 リル基、 カルボキシル基又は アミ ド基を表わし、 nは 2以上の整数を表わす。 ）
で表わされる骨格、 及び、
( f ) 下記式 （ 1 4 ) 又は （ 1 5 ) ：
(14)、 又は
Figure imgf000097_0001
Figure imgf000098_0001
(式中、 Y 1 はそれぞれ独立に二 ト リル基、 力ルポキシル 基又はアミ ド基を表わし、 各 Υ 2は独立にアミ ノ基又はヒ ド 口キシル基を表わし、 ηは 1以上の整数を表わす。 ） で表わされる骨格。 .
7. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純物 化合.物が、 下記の骨格 （ g ) 及び （ h) からなる群よ り選ば れる少なく とも 1つの骨格を分子内に有する化合物を含むこ とを特徴とする請求項 1又は 2 に記載の方法。
( g ) 下記式 （ 1 6 ) ：
Figure imgf000098_0002
(式中、 各 Y 1 は独立に二 ト リル基、 カルボキシル基又は アミ ド基を表わし、 各 Y 2は独立にアミ ノ基又はヒ ド ロキシ ル基を表わし、 nは 2以上の整数を表わす。 ） で表わされる骨格、 及び、
( h ) 下記式 （ 1 7 ) 又は （ 1 8 )
(17)、 又は
Figure imgf000099_0001
Figure imgf000099_0002
(式中、 Y 1 はそれぞれ独立に二 ト リル基、 カルボキシル 基又はアミ ド基を表わし、 各 Y 2は独立にアミ ノ基又はヒ ド 口キシル基を表わし、 nは 1以上の整数を表わす。 ） で表わされる骨格。
8. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純物 化合物が、 へキサメチレンテ トラミ ンを含むことを特徴とす る請求項 1 又は 2 に記載の方法。
9. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純物 化合物が、 重水中で測定した 1 3 C— N M Rスペク トルにお いて、 5 3〜 1 0 0 p p mの間にピークを示すことを特徴と する請求項 1〜 8のいずれかに記載の方法。
1 0. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純 物化合物が、 該加水分解反応系について測定した紫外可視吸 収スぺク トルにおいて、 3 4 0〜 3 8 O n m及び 44 0〜 4 8 O n mに吸収極大を示すこ とを特徴とする請求項 1〜 9の いずれかに記載の,方法。
1 1. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純 物化合物の分子量が、 1 3 0以上である ことを特徴とする請 求項 1〜 1 0のいずれかに記載の方法。
1 2. 該微生物酵素を阻害する該少なく とも 1つの有機不純 物化合物の濃度が、 該加水分解反応系の重量に対して 1重 量％以下である ことを特徴とする請求項 1〜 1 1のいずれか に記載の方法。
1 3. 該加水分解反応系が、 該加水分解反応系の重量に対し て 5重量 p p m以下の酸素を溶存させているこ とを特徴とす る請求項 1〜 1 2のいずれかに記載の方法。
1 4. 該加水分解反応を、 密閉反応系、 不活性ガスで加圧し た反応系、 不活性ガスを流通させた反応系又は大気圧未満の 圧力の反応系を用いて行い、 該加水分解反応系に溶存する酸 素濃度を抑制する ことを特徴とする請求項 1 〜 1 3 のいずれ かに記載の方法。
1 5 . 該加水分解反応を、 アンモニアが溶存する該加水分解 反応系で行う こと特徴とする請求項 1 〜 1 4 のいずれかに記 載の方法。
1 6 . 該加水分解反応を、 グリ シノエ ト リルの重量に対して 2重量％以下の電解質を含む該加水分解反応系で行う ことを 特徴とする請求項 1 〜 1 5 のいずれかに記載の方法。
1 7 . 二 ト リル基の加水分解活性を有する該微生物酵素が、 ァシネ トパクター属、 ロ ドコ ッカス属、 コ リ ネバクテリ ゥム 属.、 アルカ リゲネス属、 マイ コバクテリ ウム属、 ロ ドシユ ー ドモナス属及びキャンディ ダ属からなる群よ り選ばれる属の 微生物に由来する ことを特徴とする請求項 1 〜 1 6 のいずれ かに記載の方法。
1 8 . 該ァシネ トパクター属の菌株が、 通商産業省工業技術 院生命工学工業技術研究所に寄託した寄託番号 F E R M B P — 2 4 5 1 のァシネ トパクター s p . A K 2 2 6株、 又 は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した 寄託番号 F E R M B P — 7 4 1 3 のァシネ トパクター s p . A K 2 2 7株である ことを特徴とする請求項 1 7 に記載の方 法。
1 9 . 該ロ ドコ ッカス属の菌株が、 通商産業省工業技術院生 命工学工業技術研究所に寄託した寄託番号 F E R M B P— 5 2 1 9 のロ ドコ ッカス マリ ス B P — 4 7 9 — 9株である ことを特徴とする請求項 1 7 に記載の方法。
2 0 . 該コ リネパクテリ ゥム属の菌株が、 通商産業省工業技 術院生命工学工業技術研究所に寄託した寄託番号 F E R M B P — 7 4 1 4のコ リネパクテリ ゥム s p . C 5株、 又は、 アメ リ カン タイプ カルチャー コ レク ショ ンに寄託した寄 託番号 A T C C 2 1 4 1 9 のコ リネパクテリ ゥム 二 ト リ 口 フィ ラスである こ とを特徴とする請求項 1 7 に記載の方法。
2 1 . 該アルカ リゲネス属の菌株が、 通商産業省工業技術院 生命工学工業技術研究所に寄託した寄託番号 F E R M B P — 4 7 5 0 のアルカ リゲネス フエカ リ ス I F O 1 3 1 1 1 株である ことを特徴とする請求項 1 7 に記載の方法。
2 2 . 該マイ コバクテリ ゥム属の菌株が、 通商産業省工業技 術院生命工学工業技術研究所に寄託した寄託番号 F E R M B P — 2 3 5 2 のマイ コノ クテリ ゥム s p . A C 7 7 7株 である ことを特徴とする請求項 1 7 に記載の方法。
2 3 . 該ロ ドシユー ドモナス属の菌株が、 アメ リ カン タイ プ カルチャー コ レクショ ンに寄託された寄託番号 A T C C 1 1 1 6 7 のロ ドシュ一 ドモナス スフエロイデスである こ とを特徴とする請求項 1 7 に記載の方法。
2 4. 該キャ ンディ ダ属の菌株が、 アメ リ カ ン タイプ カル チヤ一 コ レクショ ンに寄託された寄託番号 A T C C 2 0 3
1 1 のキャ ンディ ダ トロ ピカ リスである ことを特徴とする 請求項 1 7 に記載の方法。
2 5 . 該加水分解反応系からグリ シンの単離を行い、 一方、 グリ シンの回収とは別に副生アンモニアを回収する ことを特 徵とする請求項 1 〜 2 4 のいずれかに記載の方法。
2 6 . グリ シン及びアンモニアを、 蒸留、 反応蒸留、 不活性 ガスによる同伴、 イオン交換、 抽出、 貧溶媒を用いた再沈殿 及び濃縮又は冷却による晶析からなる群よ り選ばれる少なく とも 1 つの操作によ り別々に回収する ことを特徴とする請求 項 2 5 に記載の方法。
2 7 . アンモニアを蒸留、 反応蒸留又は不活性ガスによる同 伴によ り回収し、 そして、 グリ シンを、 アンモニア回収後の 残液の濃縮又は冷却による晶析に付すことによ り 回収する こ とを特徴とする請求項 2 6 に記載の方法。
2 8 . 該方法が、 下記の工程を包含する ことを特徴とする請 求項 1 〜 2 7 のいずれかに記載の方法。
( 1 ) 密閉反応系において、 水性媒体中でアルカ リ触媒の存 在下にシアン化水素をホルムアルデヒ ドと反応させてグリ コ ロニ ト リ ル水溶液を得、
( 2 ) 該グリ コ ロニ ト リル水溶液にアンモニアを添加して反 応させ、 水を生成しながらグリ シノニ ト リル水溶液を得、 大 部分のアンモニアと水の一部を蒸留分離し、 グリ シノニ ト リ ル水溶液と未分離のアンモニアを含む加水分解反応系を得、
( 3 ) 分離したアンモニアを工程 （ 2 ) にリサイ クルし、
( 4 ) 該加水分解反応系を、 密閉反応系内の該加水分解反応 系に添加した微生物によって産生される微生物酵素の作用下 に加水分解反応に付し、 該グリ シノニ ト リルをアンモニアを 副生しながらダリ シンに変換し、
( 5 ) 該微生物及ぴ該微生物酵素を、 遠心瀘過及び膜濾過か らなる群よ り選ばれる少なく とも 1 つの操作によ り分離し、 工程 （ 1 ) 〜 （ 5 ) で副生した該微生物酵素を阻害する有機 不純物化合物の一部を、 膜濾過及び吸着剤を用いた分離から なる群よ り選ばれる少なく とも 1つの操作によ り分離し、
( 6 ) 分離した該微生物及び該微生物酵素は工程 （ 4 ) にリ サイ クルし、
( 7 ) 工程 （ 4 ) で副生したアンモニアと工程 （ 4 ) の後で 該加水分解反応系に残る過剰量の水を蒸留分離し、 分離した アンモニアと水は工程 （ 2 ) にリサイクルし、
( 8 ) 工程 （ 7 ) の後又は工程 （ 7 ) と同時に、 該グリ シン を晶析によ り分離し、
( 9 ) 分離された該グリ シンの結晶を乾燥する。
2 9. グリ シノニ ト リル水溶液を提供し、 該グリ シノニ ト リ ル水溶液を加水分解反応に付して該グリ シノニ ト リルをアン モニァを副生しながらグリ シンに変換し、 そして、 加水分解 反応系から該グリ シンを単離する ことを包含するダリ シンの 製造方法において、 該グリ シノニ ト リルの加水分解をアンモ ニァの存在下で行う ことを特徴とする方法。
3 0. アンモニアの濃度が、 グリ シノニ ト リル 1 m 0 1 に対 して 0. 0 0 1〜 5 m 0 1 である ことを特徴とする請求項 2 9 に記載の方法。
3 1 . グリ シノニ ト リル水溶液を提供し、 該グリ シノニ 卜 リ ル水溶液を加水分解反応に付して該グリ シノニ ト リルをアン モニァを副生しながらグリ シンに変換し、 そして、 加水分解 反応系か ら該グリ シンを単離する こ とを包含するダリ シンの 製造方法において、 塩基及び酸の不存在下で、 該加水分解反 応系からグリ シンの単離を行い、 一方、 グリ シンの回収とは 別に副生アンモニアを回収する ことを特徴とする方法。
3 2 . グリ シン及びアンモニアを、 蒸留、 反応蒸留、 不活性 ガスによる同伴、 イオン交換、 抽出、 貧溶媒を用いた再沈殿 及び濃縮又は冷却による晶析からなる群よ り選ばれる少なく とも 1 つの操作によ り別々 に回収する ことを特徴とする請求 項 3 1 に記載の方法。
3 3 . アンモニアを蒸留、 反応蒸留又は不活性ガスによる同 伴によ り 回収し、 そして、 グリ シンを、 アンモニア回収後の 残 Mの濃縮又は冷却による晶析に付すことによ り回収する こ とを特徴とする請求項 3 2 に記載の方法。
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