JP2017112850A - ポリグルタミン酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ポリグルタミン酸は1万程度から1千万超の分子量を有し、その保水性、保湿性、凝集性等の特性は、医薬品や化粧品、健康食品、環境保全・修復等の幅広い分野で応用されている。ポリグルタミン酸の特性はその分子量に関わらず全般的に認められるが、取扱性等の観点では低分子量側が好ましい。
発酵進行に伴う酸素供給不足を解消するために、例えば、高撹拌培養や培養槽に酸素を含む気体の微細気泡を形成させる酸素供給装置等を設置する方法が報告されているが(例えば、特許文献1)、工業的観点から特殊な装置の使用は回避するのが望ましい。
本明細書において、ポリグルタミン酸は、α−ポリグルタミン酸又はγ−ポリグルタミン酸の何れでもよい。また、D−グルタミン酸から構成されるD体、L−グルタミン酸から構成されるL体、D−グルタミン酸とL−グルタミン酸から構成されるD,L体の何れでもよい。
炭素源としては、例えば、糖類(グルコース、アラビノース、キシロース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシット、グリセリン、可溶性澱粉、廃糖蜜、転化糖等)、有機酸(酢酸、クエン酸等)、アルコール類(エタノール等)等が挙げられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、無機・有機アンモニウム塩、尿素、コーングルテンミール、大豆粉、酵母エキス、肉エキス、魚肉エキス、ポリペプトン、ペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール等が挙げられる。
無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が挙げられる。
有機微量栄養素としては、例えば、ビタミン等が挙げられる。
培養様式によって、培養期間中に前記培地成分を連続的又は断続的に添加してもよい。
培地中、窒素源の濃度は、好ましくは0.01〜5%(w/v)である。また、グルタミン酸又はその塩の濃度は、好ましくは1〜10%(w/v)である。
また、培地中、無機塩類の濃度は、好ましくは0.01〜5%(w/v)である。
pHは、例えば、炭酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、グルコン酸、酒石酸等の有機酸又はその塩、リン酸、塩酸、硫酸等の無機酸又はその塩、水酸化ナトリウム等の水酸化物、アンモニア又はアンモニア水等を用いて調整することができる。
培養温度は、使用する微生物の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、20〜45℃が好ましく、28〜40℃がより好ましい。
培養液に対する上記微生物の接種量は、特に制限されないが、培養体積の0.1〜2%程度である。
通気酸素濃度は、30〜90%であるが、菌体増殖の促進及びポリグルタミン酸の生産性向上の点、ポリグルタミン酸の低分子化の点から、下限としては40%以上がより好ましい。また、上限としては85%以下が好ましく、80%以下がより好ましい。なお、通気酸素濃度は培養挙動に合わせて変化させてもよい。
酸素供給量は、培養系において空気中の酸素が液相の微生物へ移動する速度(酸素移動速度;OTR)の積算値で示される。
酸素移動速度(OTR)は、排ガス分析法によって求めることができる。詳細は後掲の実施例に記載した。
本発明において、通気速度(通気量)は、ポリグルタミン酸の生産性の点から、0.2〜1vvmが好ましく、撹拌回転数は、撹拌翼径が0.5m以下では200〜1,300r/minが好ましく、更に600〜1,000r/minが好ましい。また、撹拌翼径が0.5m以上では10〜200r/minが好ましい。
圧力は、常圧から微加圧の条件が好ましく、加圧条件としては0〜0.1MPaの範囲が好ましい。
本発明の方法によれば、培養液1Lあたり、好ましくはポリグルタミン酸を5g以上、より好ましくは10g以上製造することができる。
分子量の低下率は、次の式に従って求めることができる。
ポリグルタミン酸の分子量の低下率=(P0−P1)/P0×100
(式中、P0=培養液に酸素濃度21%の空気を通気させた時のポリグルタミン酸の分子量、P1=培養液に酸素濃度30〜90%の空気を通気させ、培養0〜24時間の酸素供給量を800〜2,000mmol/L/24hrとした時のポリグルタミン酸の分子量)
本発明の方法により得られるポリグルタミン酸の分子量は、1,000〜5,700kDa、好ましくは3,000〜5,650kDa、より好ましくは5,000〜5,600kDaである。
ポリグルタミン酸の分子量は、分子質量としてゲルろ過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。詳細は後掲の実施例に記載した。
培養液を適宜希釈し、次のHPLCにより分析を行った。
<HPLC条件>
カラム:pWXL6000−pWXL4000
ガードカラム:pWXL用
溶離液:0.1M Na2SO4
運転条件:流量1mL/min、50℃、40分
検出波長:210nm
前掲のHPLC条件にてRI検出を行い、RTから算出した。RTの検量線作成には分子量の異なる10種類のプルラン(分子量Mw=1,500〜1,600,000)を使用した。
次の排ガス分析法により酸素移動速度(OTR、単位:mol/m3/hr)を求め、培養0〜24時間の積算値を酸素供給量(単位:mmol/L/24hr)とした。
<排ガス分析法>
通気発酵槽と排気ガス分析装置を接続し、発酵時のO2およびCO2排ガスを分析した。本結果から、酸素収支を取ることで発酵時のOTRを算出した。
排ガス分析法におけるOTR算出式
kLa(酸素移動容量係数)[/hr]
C*(飽和溶存酸素濃度)[mol/m3]
C(培養槽内溶存酸素濃度)[mol/m3]
V(通気培養槽の実容量)[m3]
R(気体定数)8.2×10−5[m3・atm/mol/K]
Pi(流入空気圧力)[atm]
Po(排ガス圧力)[atm]
Fi(流入空気流量)[m3/hr]
Fo(排ガス流量)[m3/hr]
Yi(流入空気の酸素分率)[−]
Yo(排ガス酸素分率)[−]
Ti(流入空気の絶対温度)[K]
To(排ガス絶対温度)[K]
前述のOTRを、飽和溶存酸素濃度と培養槽内溶存酸素濃度の差(C*−C)で除すことで、kLaを算出した。
kLa算出式
Bacillus subtilis NBRC3013株を使用した。
500mL容のひだ付三角フラスコに培養液40mLを投入し、121℃で20分間滅菌した。培養液には市販のLB培地を用いた。LB培地の組成を表1に示す。
これに、NBRC3013株を1白金耳接種し、撹拌回転数200r/min、培養温度30℃で24時間培養した。
2L培養槽に表2に示す培養液を1200mL投入し、滅菌した。
滅菌した2L培養槽に、前培養液24mLを投入し、初発pH6.6、温度37℃、撹拌回転数(撹拌翼径5.7cm)700r/min、通気酸素濃度40%、通気速度(通気量)0.5vvmの条件にて撹拌培養を72時間行った。
この時の酸素供給量は860mmol/L/24hrであった。
培養後、菌体を除去し、培養液1Lあたりのポリグルタミン酸の生産量とポリグルタミン酸の分子量を求めた。
初発pH6.3、通気酸素濃度80%、撹拌回転数600r/min、他条件は実施例1と同様にし培養を行った。酸素供給量は1,261mmol/L/24hrであった。
初発pH6.5、撹拌回転数800r/min、他条件は実施例1と同様にし培養を行った。酸素供給量は1,268mmol/L/24hrであった。
初発pH6.4、通気酸素濃度60%、撹拌回転数800r/min、他条件は実施例1と同様にし培養を行った。酸素供給量は1,434mmol/L/24hrであった。
初発pH6.4、通気酸素濃度70%、他条件は実施例1と同様にし培養を行った。酸素供給量は1,690mmol/L/24hrであった。
初発pH6.6、通気酸素濃度21%、撹拌回転数500r/min、他条件は実施例1と同様にし培養を行った。酸素供給量は180mol/L/24hrであった。
初発pH6.4、撹拌回転数800r/min、他条件は比較例1と同様にし培養を行った。酸素供給量は508mol/L/24hrであった。
初発pH6.5、通気酸素濃度70%、撹拌回転数800r/min、他条件は実施例1と同様にし培養を行った。酸素供給量は2,037mmol/L/24hrであった。
各実施例及び比較例の条件と評価結果を表3に示す。
これに対し、実施例に示す様に、高酸素濃度下、酸素供給量を特定の範囲に制御するとポリグルタミン酸の生産性が向上することが確認された。生産されたポリグルタミン酸は低分子であった。ポリグルタミン酸の分子量の低下率は、比較例2に比べていずれも3%以上であった。
Claims (5)
- 培養液に酸素濃度が30〜90%の空気を通気させ、培養0〜24時間の酸素供給量を800〜2,000mmol/L/24hrとしてポリグルタミン酸を生産する能力を有する微生物を培養する工程を含む、ポリグルタミン酸の製造方法。
- 酸素移動容量係数が50〜200/hrとなるように通気する、請求項1記載のポリグルタミン酸の製造方法。
- 撹拌回転数が200〜1,300r/minである請求項1又は2記載のポリグルタミン酸の製造方法。
- ポリグルタミン酸の分子量を酸素濃度21%の空気を通気させた時と比べて3%以上低分子化させる請求項1〜3のいずれか1項記載のポリグルタミン酸の製造方法。
- ポリグルタミン酸を生産する能力を有する微生物が、納豆菌(Bacillus subtilis natto)である請求項1〜4のいずれか1項記載のポリグルタミン酸の製造方法。
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