JP6735090B2

JP6735090B2 - ポリグルタミン酸の製造方法

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Publication number: JP6735090B2
Application number: JP2015248538A
Authority: JP
Inventors: 悠櫻井
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2020-08-05
Anticipated expiration: 2035-12-21
Also published as: JP2017112850A

Description

本発明は、微生物を用いたポリグルタミン酸の製造方法に関する。

ポリグルタミン酸は、グルタミン酸を重合単位とするポリペプチドであり、天然にはポリ−γ−グルタミン酸が納豆の糸引き成分として存在する。通常、生物が作り出すアミノ酸はＬ体のみであるが、納豆菌が紡ぐポリグルタミン酸はＬ体とＤ体のグルタミン酸が混在している。
ポリグルタミン酸は１万程度から１千万超の分子量を有し、その保水性、保湿性、凝集性等の特性は、医薬品や化粧品、健康食品、環境保全・修復等の幅広い分野で応用されている。ポリグルタミン酸の特性はその分子量に関わらず全般的に認められるが、取扱性等の観点では低分子量側が好ましい。

工業的にポリグルタミン酸は納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｎａｔｔｏ）を液体培養する発酵法によって生産され、菌体増殖に伴い菌体外に分泌するポリグルタミン酸を回収・精製して製品とする。しかし、ポリグルタミン酸の発酵生産では、その高粘性に起因して培養中の酸素供給不足が起こり易く、急激な生産量の低下が問題とされる。
発酵進行に伴う酸素供給不足を解消するために、例えば、高撹拌培養や培養槽に酸素を含む気体の微細気泡を形成させる酸素供給装置等を設置する方法が報告されているが（例えば、特許文献１）、工業的観点から特殊な装置の使用は回避するのが望ましい。

特開２００６−３４２３５号公報

したがって、本発明は、特殊な装置を必要とせず、生産性よくポリグルタミン酸を製造することのできる方法を提供することに関する。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、培養液に高濃度の酸素を含む空気を通気し、培養０〜２４時間に供給する酸素の量を特定範囲に制御することで、生産されるポリグルタミン酸が低分子化し、ポリグルタミン酸の生産性が向上することを見出した。

すなわち、本発明は、培養液に酸素濃度が３０〜９０％（体積比率、以下同じ）の空気を通気させ、培養０〜２４時間の酸素供給量を８００〜２，０００ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒとしてポリグルタミン酸を生産する能力を有する微生物を培養する工程を含む、ポリグルタミン酸の製造方法を提供するものである。

本発明によれば、設備負荷を低減しながら、ポリグルタミン酸を生産性良く得ることができる。本発明のポリグルタミン酸は低分子であるため、取扱い性等の点で有利である。

本発明のポリグルタミン酸の製造方法は、培養液に酸素濃度が３０〜９０％の空気を通気させ、培養０〜２４時間の酸素供給量を８００〜２，０００ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒとしてポリグルタミン酸を生産する能力を有する微生物を培養する工程を含む。
本明細書において、ポリグルタミン酸は、α−ポリグルタミン酸又はγ−ポリグルタミン酸の何れでもよい。また、Ｄ−グルタミン酸から構成されるＤ体、Ｌ−グルタミン酸から構成されるＬ体、Ｄ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸から構成されるＤ，Ｌ体の何れでもよい。

本発明で用いられるポリグルタミン酸を生産する能力を有する微生物は、基質からポリグルタミン酸を生産し、菌体外に産出する能力を有する微生物であればよく、自然界から分離された野性株であっても、該野生株から誘導された変異株であってもよい。斯かる微生物としては、例えば、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｎａｔｔｏ）を含む一部のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌とその近縁種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｖａｒ．ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）や、Ｎａｔｒｉａｌｂａａｅｇｙｐｔｉａｃａ、Ｈｙｄｒａ等を挙げることができる。また、遺伝子組換え技術を用いたポリグルタミン酸の生産例としては、プラスミドにて遺伝子導入された組換え枯草菌（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩＳＷ１２１４株）（Ａｓｈｉｕｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔａｌ．：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０，ｐｐ．１７９４−１７９７（２００６））等が知られている。なかでも、比較的容易にポリグルタミン酸を生産・蓄積できる点から、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が好ましく、より好ましくは納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｎａｔｔｏ）である。

ポリグルタミン酸を生産する能力を有する微生物は、従来公知の培地を用いて培養することができる。例えば、ＬＢ培地等の市販の液体培地を用いることができる。また、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要な有機微量栄養源等を培地の成分として適宜用いることができる。
炭素源としては、例えば、糖類（グルコース、アラビノース、キシロース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシット、グリセリン、可溶性澱粉、廃糖蜜、転化糖等）、有機酸（酢酸、クエン酸等）、アルコール類（エタノール等）等が挙げられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、無機・有機アンモニウム塩、尿素、コーングルテンミール、大豆粉、酵母エキス、肉エキス、魚肉エキス、ポリペプトン、ペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール等が挙げられる。
無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が挙げられる。
有機微量栄養素としては、例えば、ビタミン等が挙げられる。
培養様式によって、培養期間中に前記培地成分を連続的又は断続的に添加してもよい。

ポリグルタミン酸生産用の培地中、炭素源の初発（培地調製時又は培養開始時）の濃度（以下、同じ）は、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）である。
培地中、窒素源の濃度は、好ましくは０．０１〜５％（ｗ／ｖ）である。また、グルタミン酸又はその塩の濃度は、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）である。
また、培地中、無機塩類の濃度は、好ましくは０．０１〜５％（ｗ／ｖ）である。

培養液の初発（培地調製時又は培養開始時）ｐＨ（３７℃）は５〜９が好ましく、６〜８がより好ましい。
ｐＨは、例えば、炭酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、グルコン酸、酒石酸等の有機酸又はその塩、リン酸、塩酸、硫酸等の無機酸又はその塩、水酸化ナトリウム等の水酸化物、アンモニア又はアンモニア水等を用いて調整することができる。

培養方法は、好気的条件下であればよく、通気攪拌培養、振盪培養等の一般的な方法を適用することができる。
培養温度は、使用する微生物の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、２０〜４５℃が好ましく、２８〜４０℃がより好ましい。

ポリグルタミン酸を生産する能力を有する微生物を用いてポリグルタミン酸を生産する場合、一般的には、先ず前培養を行って菌体を活性化させ、次いで、これを本培養の培養液に接種して培養を行い、ポリグルタミン酸を生産することが好ましい。前培養及び本培養の期間は、適宜設定できるがそれぞれ１２〜９６時間が好ましく、２４〜７２時間がより好ましい。
培養液に対する上記微生物の接種量は、特に制限されないが、培養体積の０．１〜２％程度である。

本発明では、ポリグルタミン酸を生産する際、空気と酸素富化空気の混合比率を変えることで酸素濃度を制御する。具体的には、酸素濃度が３０〜９０％の空気を通気させ、培養０〜２４時間に８００〜２，０００ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒとなるように酸素供給を行う。
通気酸素濃度は、３０〜９０％であるが、菌体増殖の促進及びポリグルタミン酸の生産性向上の点、ポリグルタミン酸の低分子化の点から、下限としては４０％以上がより好ましい。また、上限としては８５％以下が好ましく、８０％以下がより好ましい。なお、通気酸素濃度は培養挙動に合わせて変化させてもよい。

また、培養０〜２４時間の酸素供給量は８００〜２，０００ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒであるが、ポリグルタミン酸の生産性の点から、１，０００〜１，７００ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒが好ましい。
酸素供給量は、培養系において空気中の酸素が液相の微生物へ移動する速度（酸素移動速度；ＯＴＲ）の積算値で示される。
酸素移動速度（ＯＴＲ）は、排ガス分析法によって求めることができる。詳細は後掲の実施例に記載した。

本発明において、酸素移動容量係数（ｋ_Ｌａ）は、菌体増殖の促進及びポリグルタミン酸の生産性向上の点、ポリグルタミン酸の低分子化の点から、好ましくは５０〜２００／ｈｒ、より好ましくは７０〜１８０／ｈｒ、更に好ましくは８５〜１５０／ｈｒである。

酸素供給量は、通気酸素濃度の他、通気速度（通気量）、撹拌回転数、圧力等によって調整することができる。
本発明において、通気速度（通気量）は、ポリグルタミン酸の生産性の点から、０．２〜１ｖｖｍが好ましく、撹拌回転数は、撹拌翼径が０．５ｍ以下では２００〜１，３００ｒ／ｍｉｎが好ましく、更に６００〜１，０００ｒ／ｍｉｎが好ましい。また、撹拌翼径が０．５ｍ以上では１０〜２００ｒ／ｍｉｎが好ましい。
圧力は、常圧から微加圧の条件が好ましく、加圧条件としては０〜０．１ＭＰａの範囲が好ましい。

このような酸素の供給により、菌体増殖が促進され、また、生産されるポリグルタミン酸は低分子化し、酸素供給が改善されて菌体によるポリグルタミン酸の生産性が向上する。
本発明の方法によれば、培養液１Ｌあたり、好ましくはポリグルタミン酸を５ｇ以上、より好ましくは１０ｇ以上製造することができる。

本発明の方法により得られるポリグルタミン酸の分子量は、通常酸素濃度、すなわち酸素濃度２１％の空気を通気させた時と比べて３％以上、更に４％以上、更に７％以上低下したものが好ましい。尚、培養液に酸素濃度２１％の空気を通気させた時の培養０〜２４時間の酸素供給量は８００ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒ未満であり、通常、後述する比較例２のように、５００ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒ程度である。
分子量の低下率は、次の式に従って求めることができる。
ポリグルタミン酸の分子量の低下率＝（Ｐ_０−Ｐ_１）／Ｐ_０×１００
（式中、Ｐ_０＝培養液に酸素濃度２１％の空気を通気させた時のポリグルタミン酸の分子量、Ｐ_１＝培養液に酸素濃度３０〜９０％の空気を通気させ、培養０〜２４時間の酸素供給量を８００〜２，０００ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒとした時のポリグルタミン酸の分子量）
本発明の方法により得られるポリグルタミン酸の分子量は、１，０００〜５，７００ｋＤａ、好ましくは３，０００〜５，６５０ｋＤａ、より好ましくは５，０００〜５，６００ｋＤａである。
ポリグルタミン酸の分子量は、分子質量としてゲルろ過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。詳細は後掲の実施例に記載した。

培養終了後の培養液からポリグルタミン酸を回収する方法は、特に限定されず、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から必要に応じて菌体を除去した後、酸沈殿法、溶媒沈殿法、膜精製法等を単独又は適宜組み合わせることによって、培養液中のポリグルタミン酸を回収又は精製することができる。

以下の実施例において、酸素濃度の「％」は空気中の体積比率を示し、それ以外の「％」は「％（ｗ／ｖ）」を意味する。

〔ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）の分析〕
培養液を適宜希釈し、次のＨＰＬＣにより分析を行った。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ｐＷＸＬ６０００−ｐＷＸＬ４０００
ガードカラム：ｐＷＸＬ用
溶離液：０．１ＭＮａ_２ＳＯ_４
運転条件：流量１ｍＬ／ｍｉｎ、５０℃、４０分
検出波長：２１０ｎｍ

〔ポリグルタミン酸の分子量の測定〕
前掲のＨＰＬＣ条件にてＲＩ検出を行い、ＲＴから算出した。ＲＴの検量線作成には分子量の異なる１０種類のプルラン（分子量Ｍｗ＝１，５００〜１，６００，０００）を使用した。

〔酸素供給量の算出〕
次の排ガス分析法により酸素移動速度（ＯＴＲ、単位：ｍｏｌ／ｍ^３／ｈｒ）を求め、培養０〜２４時間の積算値を酸素供給量（単位：ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒ）とした。
＜排ガス分析法＞
通気発酵槽と排気ガス分析装置を接続し、発酵時のＯ_２およびＣＯ_２排ガスを分析した。本結果から、酸素収支を取ることで発酵時のＯＴＲを算出した。
排ガス分析法におけるＯＴＲ算出式

ＯＴＲ（酸素移動速度）［ｍｏｌ／ｍ^３／ｈｒ］
ｋ_Ｌａ（酸素移動容量係数）［／ｈｒ］
Ｃ^＊（飽和溶存酸素濃度）［ｍｏｌ／ｍ^３］
Ｃ（培養槽内溶存酸素濃度）［ｍｏｌ／ｍ^３］
Ｖ（通気培養槽の実容量）［ｍ^３］
Ｒ（気体定数）８．２×１０^−５［ｍ^３・ａｔｍ／ｍｏｌ／Ｋ］
Ｐ_ｉ（流入空気圧力）［ａｔｍ］
Ｐ_ｏ（排ガス圧力）［ａｔｍ］
Ｆ_ｉ（流入空気流量）［ｍ^３／ｈｒ］
Ｆ_ｏ（排ガス流量）［ｍ^３／ｈｒ］
Ｙ_ｉ（流入空気の酸素分率）［−］
Ｙ_ｏ（排ガス酸素分率）［−］
Ｔ_ｉ（流入空気の絶対温度）［Ｋ］
Ｔ_ｏ（排ガス絶対温度）［Ｋ］

〔酸素移動容量係数の算出〕
前述のＯＴＲを、飽和溶存酸素濃度と培養槽内溶存酸素濃度の差（Ｃ^＊−Ｃ）で除すことで、ｋ_Ｌａを算出した。
ｋ_Ｌａ算出式

〔供試菌株〕
ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＢＲＣ３０１３株を使用した。

〔前培養〕
５００ｍＬ容のひだ付三角フラスコに培養液４０ｍＬを投入し、１２１℃で２０分間滅菌した。培養液には市販のＬＢ培地を用いた。ＬＢ培地の組成を表１に示す。
これに、ＮＢＲＣ３０１３株を１白金耳接種し、撹拌回転数２００ｒ／ｍｉｎ、培養温度３０℃で２４時間培養した。

〔本培養〕
２Ｌ培養槽に表２に示す培養液を１２００ｍＬ投入し、滅菌した。

実施例１
滅菌した２Ｌ培養槽に、前培養液２４ｍＬを投入し、初発ｐＨ６．６、温度３７℃、撹拌回転数（撹拌翼径５．７ｃｍ）７００ｒ／ｍｉｎ、通気酸素濃度４０％、通気速度（通気量）０．５ｖｖｍの条件にて撹拌培養を７２時間行った。
この時の酸素供給量は８６０ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒであった。
培養後、菌体を除去し、培養液１Ｌあたりのポリグルタミン酸の生産量とポリグルタミン酸の分子量を求めた。

実施例２
初発ｐＨ６．３、通気酸素濃度８０％、撹拌回転数６００ｒ／ｍｉｎ、他条件は実施例１と同様にし培養を行った。酸素供給量は１，２６１ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒであった。

実施例３
初発ｐＨ６．５、撹拌回転数８００ｒ／ｍｉｎ、他条件は実施例１と同様にし培養を行った。酸素供給量は１，２６８ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒであった。

実施例４
初発ｐＨ６．４、通気酸素濃度６０％、撹拌回転数８００ｒ／ｍｉｎ、他条件は実施例１と同様にし培養を行った。酸素供給量は１，４３４ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒであった。

実施例５
初発ｐＨ６．４、通気酸素濃度７０％、他条件は実施例１と同様にし培養を行った。酸素供給量は１，６９０ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒであった。

比較例１
初発ｐＨ６．６、通気酸素濃度２１％、撹拌回転数５００ｒ／ｍｉｎ、他条件は実施例１と同様にし培養を行った。酸素供給量は１８０ｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒであった。

比較例２
初発ｐＨ６．４、撹拌回転数８００ｒ／ｍｉｎ、他条件は比較例１と同様にし培養を行った。酸素供給量は５０８ｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒであった。

比較例３
初発ｐＨ６．５、通気酸素濃度７０％、撹拌回転数８００ｒ／ｍｉｎ、他条件は実施例１と同様にし培養を行った。酸素供給量は２，０３７ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒであった。
各実施例及び比較例の条件と評価結果を表３に示す。

表３に示すように、比較例１〜３の条件ではポリグルタミン酸を効率良く得ることができなかった。
これに対し、実施例に示す様に、高酸素濃度下、酸素供給量を特定の範囲に制御するとポリグルタミン酸の生産性が向上することが確認された。生産されたポリグルタミン酸は低分子であった。ポリグルタミン酸の分子量の低下率は、比較例２に比べていずれも３％以上であった。

Claims

培養液に酸素濃度が４０〜９０％の空気を通気させ、培養０〜２４時間の酸素供給量を８００〜１，７００ｍｍｏｌ／Ｌ／２４ｈｒとして納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｎａｔｔｏ）を培養する工程を含む、ポリグルタミン酸の製造方法。
酸素移動容量係数が５０〜２００／ｈｒとなるように通気する、請求項１記載のポリグルタミン酸の製造方法。
撹拌回転数が２００〜１，３００ｒ／ｍｉｎである請求項１又は２記載のポリグルタミン酸の製造方法。
ポリグルタミン酸の分子量を酸素濃度２１％の空気を通気させた時と比べて３％以上低分子化させる請求項１〜３のいずれか１項記載のポリグルタミン酸の製造方法。