WO2001040514A1 - Procede d'estimation des proprietes de floculation de la levure basse de brasserie - Google Patents

Procede d'estimation des proprietes de floculation de la levure basse de brasserie Download PDF

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Makiko Jibiki
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Asahi Breweries, Ltd
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    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the presence or absence of cohesiveness of bottom brewer's yeast or the detection of a non-cohesive mutation.
  • lager-type beers are brewed in countries around the world, including Japan and Germany.
  • Most yeasts used in this type of beer brewing are called bottom brewer yeasts because they tend to agglomerate late in the fermentation and settle at the bottom of the fermentation tank.
  • the cohesiveness of this yeast is an important property in the beer brewing process that affects yeast recovery and subsequent filtration as well as the flavor and quality of the beer.
  • recovered yeast is repeatedly used because of its superiority in production. Therefore, it is important to determine the cohesiveness of bottom brewer's yeast in screening and selection of new yeast.
  • yeasts after culturing and fermentation are collected, and the yeasts are coagulated with Ca ions, which are coagulation-promoting substances, in an environment where yeasts are easily flocculated and sedimented (that is, pH around 4.5 and low temperature). This is a method of artificially expressing cohesion and measuring the state of coagulation and sedimentation.
  • yeast mutations do not occur in all cells at once, but it is also important to isolate several single colonies, investigate their agglutination, and understand the population of the mutant strain. .
  • the isolation and analysis of the LO gene has also been reported, indicating that it has a highly homologous DNA base sequence on a different chromosome from the FLQ1 gene (Science 2 £ 5, 2077 (1994), Curr. Genet., 25, 196 (1994), and also reported the isolation and analysis of> g gene (Agric. Biol. Chem., 42, 2889 (1983), Mol. Gen. Genet., 251, 707 (1986)).
  • An object of the present invention was to establish a method for easily and reproducibly evaluating the cohesiveness of bottom brewer's yeast in a short period of time without performing fermentation.
  • PCR was performed using a primer designed based on the ORF sequence of the aggregating gene ⁇ £ Li2 ⁇ (Science, 2 £ 5, 2077 (1994)) on the chromosome ⁇ of the laboratory yeast Saccharomyces cerevisiae. Investigating the presence or absence of amplification of the target fragment and its size Furthermore, the genome of the cohesive lower brewer yeast was transformed into type III, PCR was performed using the primers described above, and the amplified product was used as a probe to perform Southern hybridization, thereby obtaining the lower beer. The present inventors have found that it is possible to determine the presence or absence of ⁇ fe of yeast and to detect non-aggregating mutations in yeast, and completed the present invention.
  • the first of the present invention is a method for judging the presence or absence of agglutination of bottom brewer's yeast by using the ORF sequence of the aggregating gene FLQ5 of laboratory yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the second aspect of the present invention is a method for judging non-aggregation and decrease in agglutination due to mutation of a bottom brewer's yeast which originally has agglutination by utilizing the same sequence.
  • the third aspect of the present invention is a method for predicting non-aggregation and decrease in aggregation due to mutation of bottom brewer's yeast originally having aggregation, by using the same sequence.
  • the fourth aspect of the present invention is a method for judging the presence or absence of cohesiveness of the bottom brewer's yeast by performing a PCR reaction using primers designed from the same sequence and detecting the presence or absence of an amplification product.
  • the fifth aspect of the present invention is a method for performing a PCR reaction using primers designed from the same sequence and detecting the presence or absence of an amplification product, thereby determining non-aggregation and decrease in agglutination due to mutation in bottom brewer's yeast. is there.
  • a PCR reaction is performed using primers designed from the same sequence, and the size of the yeast strain showing aggregability is compared with the size of the DNA of the amplification product. It is the one who predicts the presence or absence of non-aggregation or decrease in aggregation.
  • a seventh aspect of the present invention is to isolate 21 single mouths from the yeast group and then perform a PCR reaction using a primer designed from the same sequence to ascertain the population of the mutant strain in the yeast group. This is a method of determining non-aggregation and coagulation due to mutation in the bottom brewer's yeast.
  • the eighth aspect of the present invention is to isolate several single colonies from the yeast group, and then perform a PCR reaction using primers designed from the same sequence, and determine the population of the mutant strain in the yeast group. This is a method for predicting non-aggregation or decrease in aggregation due to mutation in the bottom beer yeast.
  • a ninth aspect of the present invention is to determine the presence or absence of aggregation of the bottom beer yeast using the product amplified by PCR using primers designed from the same sequence with the total DNA of the bottom beer yeast having cohesion. This is a method of determining.
  • the total DNA of a cohesive bottom brewer's yeast is designated as ⁇ type, and a product amplified by PCR using a primer designed from the same sequence is used for the mutation of the bottom beer yeast. This is a method of determining non-aggregation.
  • Figure 1 is a photograph showing the cohesiveness of various bottom beer yeasts and the results of electrophoresis of PCR amplification products.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of electrophoresis of the PCR amplification products of the cohesive strain and the non-cohesive strain derived from the cohesive bottom brewer's yeast.
  • FIG. 3 is an electrophoretogram showing the relationship between the size of the PCR amplification product of the strain derived from the lower brewer's yeast having cohesion and the strength of cohesion.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of Southern analysis of the cohesive strain and the non-cohesive strain derived from the cohesive bottom brewer's yeast.
  • the present invention provides various levels of bottom brewer's yeast and aggregation by utilizing the ORF region (3228 bp) base sequence of the aggregating gene FLQ5 on the chromosome VIII of the laboratory yeast Saccharomyces cerevisiae chromosome VIII or its complementary sequence.
  • a method for determining the agglutinability of yeast at the level of a mutant strain derived from a sexual lower surface yeast In other words, it is a method of evaluating agglutination by investigating the presence of genes required for the expression of agglutinability in yeast.
  • any known method can be used to prepare the yeast genome to be determined (for example, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl30 (1990)). Furthermore, when preparing from a large number of samples, the automatic DNA extraction device, which has made remarkable progress in recent years, is easy, efficient and effective.
  • Confirmation of the presence status of the gene can be performed by any conventionally known method.
  • the main method is shown below.
  • the primer length is preferably about 20 bp.
  • the C-terminal side is a DNA molecule of 0 to about 2000 bp or a primer consisting of a DNA molecule containing a base sequence complementary to its base sequence
  • the N-terminal side is about 2400 to The point is to design a DNA molecule of 3228 bp or a primer consisting of a DNA molecule containing a base sequence complementary to its base sequence. Examples of primers are shown in Table 1. When a C-terminal sequence is selected as the sense sequence, any N-terminal sequence may be selected as the antisense side.
  • Sequence a corresponds to SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • sequence b corresponds to SEQ ID NO: 2
  • sequence c corresponds to SEQ ID NO: 3
  • sequence d corresponds to SEQ ID NO: 4.
  • the above DNA molecule can be chemically synthesized according to a known method. It is also possible to outsource to a specialized contractor.
  • the origin of the polymerase or the like used in the PCR reaction does not matter, but those which have excellent heat resistance and can stably amplify long chains are preferable.
  • the reaction conditions may be general PCR conditions, preferably a heat denaturation temperature of 90 to 95 ° C, an annealing temperature of 40 to 65 ° C, an extension temperature of 70 to 75 ° C, and a cycle number of 20 or more.
  • the amplification product thus obtained can be separated by electrophoresis using an agarose gel or the like according to a conventional method, and can be detected by staining with an ethidium die.
  • the obtained amplification product is simply purified by a known method, and then labeled with a radioactive element or a fluorescent dye. Using this as a probe, hybridization is performed in which the yeast genome to be determined is electrophoresed and then hybridized with a sample blotted on a membrane. Signs applied Detect the status of hybridization according to the law.
  • TE Tris-HCl (pH 7.5), ImM EDTA
  • the mixture was centrifuged for 5 minutes. After separating the water tank, 1 ml of 100% ethanol was added, and the mixture was allowed to stand at -20 ° C for more than 10 minutes, and then centrifuged again to collect the precipitate. The resulting precipitate was dissolved in 0.4 ml of TE described above, and 3 ⁇ 1 of a 10 mg / ml RNAse A solution was added, followed by heating at 37 ° C for 5 minutes.
  • the same strain was cultured in a YPD medium, fermented in a wort medium, and evaluated for agglutinability by the Bums method described above.
  • coexistence with Ca ions which is a coagulation promoting substance, in an environment where yeast is easily coagulated and sedimented (ie, pH around 4.5 and low temperature), artificially expresses cohesiveness and the coagulation and sedimentation state
  • This is a method to determine the cohesiveness based on the amount of sedimentation.
  • the three types of cohesive lower brewer yeast, the cohesive strain derived therefrom, and the non-cohesive strain generated by spontaneous mutation were cultured until the stationary phase by the method shown in Example 1, and DNA was extracted. Similarly, PCR was carried out using the primers shown in Table 1 above in pairs, and the amplification products were subjected to electrophoresis.
  • Fig. 2 Some of the results are shown in Fig. 2 when the PCR reaction was performed using primers a and c as a pair. The presence of the approximately 5,000 bp amplified DNA and the presence of non-aggregated cells Thus, it was confirmed that it was possible to evaluate the agglutinating mutant by this method. In addition, it was possible to evaluate the presence or absence of agglutination using any pair of primers other than the both ends of the 3 ⁇ 4O, 5 sequence (ie, primers a and c).
  • YPD plate medium l% Yeast Extract, 2% Peptone, 2% Dextrose, 2% Agarose
  • yeast DNA was extracted using an automatic DNA extractor (Toyobo Mag-Extractor II).
  • a PCR reaction was similarly performed using the primers shown in Table 1 above in pairs according to the method described above, and the amplified product was subjected to electrophoresis.
  • Fig. 3 shows a part of the electrophoresis results, and the results of using primers a and c as a pair.
  • the presence of strains differing not only in the presence or absence of DNA of about 5,000 bp but also in the band size to be amplified was recognized.
  • Strains having different amplification conditions by PCR were subjected to a fermentation test using wort at a small scale of 50 ml, and then the cohesion was evaluated by the Burns method described above.
  • the three yeast groups differ in the percentage of agglutinating strains, and the yeast group with good aggregability has a high percentage of agglutinating strains and has a very low agglutination It was confirmed that the percentage of agglutinating strains was extremely low in the strains obtained. It is expected that the number of suspended yeasts during fermentation will be higher in the yeast group with a low agglutinating strain abundance, and it will be difficult to recover the yeasts after fermentation. It was possible to grasp the existence ratio.
  • Example 4 Method for judging agglutination of bottom brewer's yeast by Southern hybridization After culturing flocculant strains derived from flocculant yeast and ⁇ coagulant strains generated by spontaneous mutation in YPD medium until stationary phase, extraction of total DNA was performed using Methods in Cell Biology (Academic Press Vol.12, p39-44, 1975). The extracted DNA was digested with EcoRI or BamHI restriction enzyme (Takara Shuzo), electrophoresed on a 1% agarose gel, and then blotted on Nylon Membrane Hybond N + (Amersham 'Pharmacia), followed by Southern analysis. Was served.
  • the product amplified by performing PCR reaction using a pair of primers shown in Table 1 above with flocculent yeast DNA as type I was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a fragment of about 5,000 bp was cut out under ultraviolet irradiation. Thereafter, using a probe extracted with the QIA quick Gel Extraction Kit (QIAGEN), the test was performed according to the protocol using an ECL detection system (manufactured by Amersham Pharmacia).
  • Fig. 4 shows the results when the amplified fragment obtained by performing the PCR reaction with the primers a and c as a pair is used as a probe, and the band of thread J 9.3Kb observed in the agglutinating strain is non-aggregating. It was not recognized in the strain, and it was possible to determine the agglutination using this method.
  • the present invention it is possible to easily and quickly determine the presence or absence of agglutination and detect non-aggregating mutations more easily and quickly than before without fermenting the bottom brewer's yeast to be determined. It is useful not only for research and development but also for process control and quality control in industrial production.

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Description

明細書
下面ビール酵母の凝集性判定方法
技術分野
本発明は下面ビール酵母の凝集性の有無の判定法あるいは非凝集性化変異の検 出に関する。
冃 5¾技俯
今日、 日本やドイツをはじめ世界各国でラガータイプのビールが醸造されてレヽ る。 このタイプのビール醸造に使用する酵母の多くは発酵後期に凝集し、 発酵夕 ンクの底部に沈降する性質を持つことから、 下面ビール酵母と呼ばれている。 こ の酵母の凝集性は、 ビール醸造工程において酵母回収やその後の濾過並びにビー ルの香味や品質に影響を及ぼす重要な性質である。 また、 下面ビール酵母は性質 が安定している場合、生産における優位性から回収酵母を繰り返し ί 用している。 そのため、 下面ビール酵母の凝集性を判定することは、 新たな酵母のスクリー二 ング ·選択などにおいて重要である。
酵母の一般的な凝集性測定法としては Burns法 （J.Inst Brew., 43, 31, 1937)、 Helm法 (Wallerstein Laboratory Communications 1£, 315, 1953)および数多く の改良法がある。 これらの方法はいずれも培養 ·発酵後の酵母を集菌し、 酵母を 凝集 ·沈降しやすい環境下 （すなわち pH4.5 前後、 低温） で、 凝集促進物質で ある Ca イオンと共存させることにより、 人工的に凝集性を発現させてその凝 集 ·沈降状況を測定する方法である。
また、 実際のビール醸造工程において酵母凝集性の低下もしくは消失が認めら れた場合、 その酵母を回収して繰り返し使用できるか判断しなければならない。 その非凝集性化の原因が酵母自身に生じた不可逆的な変化、 すなわち変異に起因 するのか、 あるいは酵母には問題がなく環境要因による可逆的な変 ί匕であるのか を判断するためには、 一定条件下で培養 ·発酵を行った後に、 凝集性測定法によ つて評価をしなくてはならず、測定結果を得るまでに 2週間程度掛かつてしまう。 さらに、 酵母の変異は一度にすベての細胞でおこるわけではなく、 シングルコ ロニーをいくつか単離し、 それそれについて凝集性を調査し、 変異株のポピユレ ーシヨンを把握することも重要である。 しかしながら、 従来の培養 ·発酵を行つ た後に凝集性を測定する方法では一度に多数の菌株を扱うことは困難である。 近年、 実験室酵母サッカロマイセス 'セレビシェ ( Saccharomyces cerevisiae) では全染色体について塩基配列が明らかになり、 いくつかの凝集性に関与する遺 伝子の存在が確認されている （Science s, 546 (1996), Nautre I, 7(1997))0 これらの遺伝子のうち、 第 I染色体上に存在する ^em 遺伝子については最も 研究が進められており、 遺伝子の単離とその解析が行われている（特表平 Ί- 509372, Yeast, 2, 1(1993), Yeast, m, 211(1994))。 また、 LO 遺伝子の単離と その解析についても報告されており、 FLQ1遺伝子とは異なる染色体上にあるせ、 相同性の高い DNA塩基配列を持つことが示されている（Scienc e 2£5, 2077 (1994), Curr. Genet., 25, 196 (1994》。 また、 > g遺伝子の単離とその解析に ついても報告されている（Agric. Biol. Chem., 42, 2889 (1983), Mol. Gen. Genet., 251. 707 (1986))。
また、 下面ビール酵母はサヅカロマイセス ·セレビシェおよびサヅカロマイセ ス 'バヤナス (S.bayanus)の両酵母に由来する染色体を持っていることが明ら かになつているが、 これら両親株に由来する遺伝子に着目して下面酵母の凝集性 を判定することには成功していない（Yeast, 14, 923(1998)， System. Appl.
Microbiol, in Press(1999))。
サッカロマイセス 'セレビシェの凝集性遺伝子 FLQ1. FL08の ORF配列に着 目した方法では、 ビール酵母の凝集性有無の判定には成功していない。 さらに、 最近になってビール酵母の凝集性遺伝子の一部が明らかになり、 その遺伝子の一 部の塩基配列の存在有無により、 ビール酵母夕ィプの凝集性の有無が判定できる と報告されているが、 酵母の変異による凝集性の低下 ·消失についての報告はな い (特開平 8-205900)。
発明の開示
本発明では発酵を行わず短期間で、 容易に、 再現性良く下面ビール酵母の凝集 性を評価する方法を確立することを目的とした。
実験室酵母サッカロマイセス ·セレピシェの第 νπι 染色体上に存在する凝集 性遺伝子 ^£Li2^の ORF配列 (Science, 2£5, 2077 (1994))を基に設計したプライ マ一を用いて、 PCR を実施し、 目的断片の増幅の有無およびそのサイズを調査 する，レにより、 さらに、 凝集性下面ビール酵母のゲノムを錶型とし、 上記記載 のプライマ一を用いて PCR を実施し、 増幅した産物をプローブとして、 サザン ハイブリダィゼ一シヨンを行うことによって、 下面ビール酵母の;疑集 ^fe有無の判 定および非凝集性化変異の検出が可能になることを見い出し、本発明を完成した。 すなわち、 本発明の第 1は実験室酵母サッカロマイセス ' セレピシェ ( accharomyces cerevisiae) の凝集性遺伝子 FLQ5の ORF配列を利用するこ とにより下面ビール酵母の凝集性有無を判定する方法である。
本発明の第 2は同配列を利用することにより本来凝集性を持つ下面ビール酵母 の変異による非凝集性化および凝集性低下を判定する方法である。
本発明の第 3は同配列を利用することにより本来凝集性を持つ下面ビール酵母 の変異による非凝集性化、 凝集性低下を予知する方法である。
本発明の第 4は同配列から設計したプライマーを用いて、 P C R反応を行い、 増幅産物の有無を検出することにより、 下面ビール酵母の凝集性有無を判定する 方法である。
本発明の第 5は同配列から設計したプライマーを用いて、 P C R反応を行い、 増幅産物の有無を検出することにより、 下面ビール酵母の変異による非凝集性化 および凝集性低下を判定する方法である。
本発明の第 6は同配列から設計したプライマーを用いて、 P C R反応を行い、 凝集性を示す酵母株の同増幅産物の D N Aのサイズとを比較することより、 下面 ビール酵母の凝集性変異による非凝集性化または凝集性低下の有無を予知する方 である。
本発明の第 7は酵母群からシングルコ口二一数点を単離してから . 同配列から 設計したプライマ一を用いて、 P C R反応を行い、 酵母群中の変異株のポピユレ ーシヨンを把握することにより、 下面ビール酵母の変異による非凝集性化および 凝果 ΐ王 卜を判定する方法である。
本発明の第 8は酵母群からシングルコロニー数点を単離してから、 同配列から 設計したプライマ一を用いて、 P C R反応を行い、 酵母群中の変異株のポピユレ ーシヨンを把握することにより、 下面ビール酵母の変異による非凝集性化または 凝集性低下を予知する方法である。 本発明の第 9は凝集性のある下面ビール酵母の全 DNAを錶型とし、 同配列か ら設計したプライマーを用いて PCR により増幅した産物を使用して、 下面ビー ル酵母の凝集性有無を判定する方法である。
本発明の第 1 0は凝集性のある下面ビール酵母の全 DNAを鎵型とし、 同配列 から設計したプライマ一を用いて PCR により増幅した産物を使用して、 下面ビ ール酵母の変異による非凝集性化を判定する方法である。
図面の簡単な説明
図 1は各種下面ビール酵母の凝集性および PCR増幅産物の電気泳動結果を示 す写真である。
図 2は凝集性のある下面ビール酵母由来の凝集性株および非凝集性株の PCR 増幅産物の電気泳動結果を示す写真である。
図 3は凝集性のある下面ビール酵母由来株の PCR増幅産物サイズと凝集性の 強さとの関係を示す電気泳動図である。
図 4は凝集性のある下面ビール酵母由来の凝集性株および非凝集性株のサザン 解析結果を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、 実験室酵母サッカロマイセス . セレピシェ ( accharomyces cerevisiae) 第 VIII染色体上の凝集性遺伝子 FLQ5の ORF領域 （3228bp ) 塩 基配列またはその相補配列を利用することにより、 種々の下面ビール酵母レベル ならびに凝集性下面酵母由来の変異株レベルにおいて酵母の凝集性を判定する方 法を提供する。 すなわち酵母の凝集性発現に必要な遺伝子の存在状況を調査する ことにより、 凝集性を評価する方法である。
以下に本発明を詳しく説明する。 判定対象となる酵母のゲノムの調製は公知の いかなる方法も使用可能である（例えば Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p l30(1990))。 さらに、 多数の試料から調製する場合 は、 近年著しい進歩を遂げている自動 DNA抽出装置が容易で効率がよく有効で ある。
遺伝子の存在状況の確認は従来から知られているいずれの方法も取り得る。 以 下に主たる方法を示す。 ①判定対象となる酵母から抽出したゲノムを錡型として連続した 10bp以上の 塩基からなるプライマ一対を用いて PCR法によって核酸の増幅を行う。 安定し た高い検出感度を得るためにはプライマー長は約 20bp前後が好ましい。 また、 プライマーの組み合わせにあたり C末端側は 0〜約 2000bpの間の DNA分子あ るいはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む DNA分子からなるプライ マーと、 N末端側は約 2400〜3228bpの間の DNA分子あるいはその塩基配列に 対して相補的な塩基配列を含む DNA分子からなるブラィマーと設計することが ポイントとなる。 プライマーの例を表 1 に示すが、 センス配列として C末端側 の配列を選択した場合、 アンチセンス側として任意の N末端側の配列を選択す ればよい。 すなわち、 プライマー例に示す、 a配列に対して、 c配列あるいは d 配列のいずれを選択しても判定は可能であり、 同様に b配列に対して、 c、 dい ずれの配列を選択して良い。 配列 aは配列表の配列番号 1に、 配列 bは配列番号 2に、 配列 cは配列番号 3に、 配列 dは配列番号 4に対応する。 上記の DNA分 子は公知の方法に従い、 化学合成することが出来る。 また、 専門業者に委託する ことも可能である。
PCR反応に用いるポリメラ一ゼ等の起源は問わないが、 耐熱性に優れ、 安定 して長鎖の増幅をおこなうことができるものが好ましい。 また、 プライマー対と 判定対象ゲノム以外があらかじめ混合されているキットの利用、例えば、 TaKaRa Perfect Shot (宝酒造製） などを利用することが容易に安定した結果を得るため に有効である。 反応条件は一般的な PCR条件でよく、 熱変性温度 90〜95°C、 ァニーリング温度 40〜65°C、 伸長温度 70〜75°C、 サイクル回数 20回以上が好 ましい。
得られた増幅産物は常法に従ってァガ口ースゲルなどを用いて電気泳動等によ つて分離し、ェチジゥムブ口マイ ド等によって染色することによって検出できる。 ②凝集性を有する酵母から調製したゲノムを鎵型として上記プライマ一を用い て PCR法によって核酸の増幅を行う。 得られた増幅産物を公知の方法にて簡易 精製した後に、 放射性元素あるいは蛍光色素等で標識する。 これをプローブとし て、 判定対象の酵母ゲノムを電気泳動した後にメンブラン上にブロッテイングし た試料とハイブリダィズさせるハイブリダイゼーシヨンを行う。 適用した標識方 法にあわせてハイブリダィズの状況を検出する。
実施例
以下に実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれに限定され るものではない。
実施例 1 ： 下面ビール酵母の凝集^ έの判定
① 酵母 DNAの抽出
下面ビール酵母 30株をそれそれ 10mlの YPD培地 （l%Yeast Extract, 2% Peptone, 2%Dextrose) において定常期まで培養した後、 遠心分離により集菌し た。その後、蒸留水で洗浄、集菌をおこなつた。 0.2mlの 2% Triton X- ιΟΟ, 1% SDS， lOOmM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH8.0), ImM Na2EDTAに懸濁した。 さらにフ ェノール · クロ口ホルム · イソアミルアルコール (25:24: 1) 0.2ml および酸洗浄 を行ったガラスビーズ 0.3g を加えて、 3分間十分に攪拌した。 TE(10mM Tris-HCl(pH7.5), ImM EDTA) 0.2ml を添加した後、 5分間遠心分離した。 水 槽を分離した後、 1mlの 100%エタノールを加えて、 10 分間以上、 — 20°Cに静 置した後、 再度遠心分離して沈殿を回収した。 得られた沈殿を前述の TE0.4ml に溶解させ、 10mg/ml RNAse A溶液を 3〃1加え、 37°C、 5分間加温した。 続 いて の 4M酢酸アンモニゥムおよび lmlの 100%エタノールを加えて、 10 分間以上、 — 20°Cに静置した後、 再度遠心分離して沈殿を回収した。 得られた 沈殿を 50 の蒸留水に溶解させ、 このうちの一部を試験に供した。
② 凝集性遺伝子 M 配列の一部を用いた PCR法による凝集性の判定 サッカロマイセス ·セレピシェ ( accharomy es cerevisiae) の第 VIII 染色 体上に存在する凝集性遺伝子 FL05の O F配列を基にブラィマー対を設計した。 プライマ一対の例を表 1 に示す。 PCR反応条件は、 94。C 2分間のホットス夕 —トの後、 94。C 1分間、 57.5°C 2分間、 72°C 2分間を 30サイクル繰り返し、 最後に 72°C 20分間保温した。 この一部を取り出し、 1%ァガロースゲルを用い た電気泳動に供した。 一方、 同じ菌株について YPD培地にて培養後、 麦汁培地 で発酵し、 先に記載した Bums法にて凝集性を評価した。本方法は酵母を凝集 · 沈降しやすい環境下 （すなわち pH4.5前後、 低温） で、 凝集促進物質である Ca イオンと共存させることにより、 人工的に凝集性を発現させてその凝集 ·沈降状 況を测定する方法であり、 沈降量を持って凝集性を判定する。 これらの結果の一 部、 プライマー aと cを対で用いて PCR反応により増幅した結果を図 1に示す が、 約 5,000bpの増幅 DNAの存否と Burns法にて評価した結果が一致してい ることを確認した。 本発明により、 下面ビール酵母の凝集性株 （ブルッフ酵母） と非凝集性株 （シュタウプ酵母） を判別することが可能であった。 すなわち、 本 発明により短時間に下面ビール酵母の凝集性を評価することが可能となり、 スク リ一二ングの際の一手法となりうることが確認された。
表 1
Figure imgf000008_0001
実施例 2 ： 下面ビール酵母の凝集性変異株の評価
3種類の凝集性下面ビール酵母それそれに由来する凝集性株および自然変異に より生じた非凝集性株を実施例 1に示した方法にてそれそれ定常期まで培養した 後に、 DNA を抽出した。 同様に前掲表 1 に示すプライマ一を対で用いて PCR 反応を行わせ、 増幅産物を電気泳動に供した。
その結果の一部、 プライマー aと cを対で用いて PCR反応を行わせた時の結 果を図 2 に示すが、 約 5，000bpの増幅 DNAの存否により凝集性細胞と非凝集 性細胞を判別することができ、 本方法によって凝集性変異株を評価することが可 能であると確認された。 また、 ¾O,5配列両末端 (すなわちプライマー aおよび c) 以外の任意のブライマ一対によっても凝集性の有無を評価することが可能で あった。
実施例 3 ： 酵母群中に占める変異株のポピュレーション調査
① シングルコロニーの単離および酵母 DNAの抽出
同一酵母に由来し、 ビール発酵中の凝集性の異なる酵母群 3群をそれそれ YPD 平板培地（ l%Yeast Extract, 2% Peptone, 2% Dextrose, 2% Agarose) に塗布し、 25°C、 3日間培養して、 シングルコロニーを数十株ずつ単離した。 実施例 1記 載の方法でシングルコロニーそれそれの株を定常期まで培養した後、 集菌、 洗浄 し、 自動 DNA抽出装置 （東洋紡 Mag-Extractor Π) によって酵母の DNAを抽 出した。
② PCR法による凝集性の判定
上記記載の方法により同様に前掲表 1に示すプライマ一を対で用いて PCR反 応を行わせ、 増幅産物を電気泳動に供した。
その泳動結果の一部、 プライマ一 aおよび cを対で用いた結果を図 3 に示す 、 約 5,000bpの DNAの増幅の有無のみならず、 増幅するバンドサイズに差異 のある株の存在が認められた。 PCR による増幅状況の異なる株を 50ml の小ス ケールにて麦汁を用いた発酵試験に供した後に、 先に記載した Burns 法により 凝集性を評価した。 その結果、 約 5,000bpの DNAの増幅断片の有無と凝集性の 有無の間に一致が認められ、 さらに、 DNA増幅断片のサイズが短くなつた株で 凝集性の低下が認められた。 本方法により凝集性を失った株の検出のみならず、 これまで報告のない凝集性の低下あるいは消失の恐れのある株の検出が可能であ つた。
③ 変異株のポピュレーション調査
上記試験の結果、 表 2に示すように 3つの酵母群では凝集性株の存在割合が異 なっており、 凝集性の良い酵母群では凝集性株の存在割合が高く、 凝集性が非常 に低下した株では凝集性株の存在割合が極めて低下していることが確認された。 凝集性株の存在割合が低い酵母群では発酵中の浮遊酵母数がより多く、 発酵後の 酵母回収に困難をきたすことが予想され、 本方法を用いて実用上に影響する凝集 性変異株の存在割合を把握することが可能であった。
表 2
Figure imgf000009_0001
実施例 4 ： サザンハイブリダイゼーシヨンにより下面ビール酵母の凝集性を 判定する方法 凝集性酵母に由来する凝集性株および自然変異により生じた^凝集性株を YPD培地で定常期まで培養した後、 全 DNAの抽出を Methods in Cell Biology (Academic Press Vol.12, p39-44, 1975)記載の方法にて行った。 抽出した DNA を EcoRIあるいは BamHIの制限酵素 （宝酒造製） により消ィ匕し、 1%ァガロー スゲルを用いて電気泳動した後にナイロンメンブランハイボンド N+ (アマシャ ム 'フアルマシア製） にブロッテイングし、 サザン解析に供した。
凝集性酵母 DNAを鋅型として前掲表 1 に示すプライマ一対をもちいて PCR 反応を行って増幅した産物を、 1%ァガロースゲルにて電気泳動し、 約 5，000bp の断片を紫外線照射下で切り出した後、 QIA quick Gel Extraction Kit (QIAGEN 社)によって抽出したものをプローブとし、 ECL検出システム （アマシャム ·フ アルマシア製） を用いてプロトコール通りに実施した。
プライマー aおよび cを対として PCR反応を行わせて得られた増幅断片をブ ローブとした場合の結果を図 4に示すが、 凝集性株に認められる糸 J 9.3Kbのバ ンドが非凝集性株では認められず、 本方法を用いて凝集性の判定を行うことが可 能であった。
産業上の利用の可能个生
本発明により、 判定対象の下面ビール酵母を発酵を行うことなく、 従来よりも 容易かつ迅速に高精度の凝集性有無の判定および非凝集性化変異の検出が可能に なり、 一度に多量のサンプルを扱えることから、 研究開発のみならず、 工業生産 における工程管理および品質管理にも有益である。

Claims

請求の範囲
1. 実験室酵母サヅカロマイセス 'セレピシェ {Sa charomv ^ cerevisiae) の 凝集性遺伝子 FLQ5の ORF配列を利用することを特徴とする下面ビール酵母の 凝集性有無の判定方法。
2. 実験室酵母サッカロマイセス 'セレピシェ {Saccharomvc.es cerevisiae) の 凝集性遺伝子 FLQ の ORF配列を利用することを特徴とする下面ビール酵母の 凝集性変異による非凝集性化または凝集性低下の有無の判定方法。
3. 実験室酵母サッカロマイセス 'セレピシェ ( Sa charomvn s cerevisiae) の 凝集性遺伝子 FL05の ORF配列を利用することを特徴とする下面ビール酵母の 凝集性変異による非凝集性化または凝集性低下を予知する方法。
4. サンプル酵母株を培養後、 DNAを抽出し、 凝集性遺伝子 ELQ5_の ORF配 列から設計した連続した 10 bp以上の塩基からなるプライマ一を用いて、 該 D N Aと P C R反応を行い、 増幅産物の有無を検出することを特徴とする請求項 1 記載の下面ビール酵母の凝集性有無の判定方法。
5. サンプル酵母株を培養後、 DNAを抽出し、 凝集性遺伝子 ELQ5_の ORF配 列から設計した連続した 10 bp以上の塩基からなるプライマ一を用いて、 該 D N Aと PC R反応を行い、 増幅産物の有無を検出することを特徴とする請求項 2 記載の下面ビール酵母の凝集性変異による非凝集性化または凝集性低下の有無の 判定方法。
6. サンプル酵母株を培養後、 DNAを抽出し、 凝集性遺伝子 ELQ5_の ORF配 列から設計した連続した 10 bp以上の塩基からなるプライマーを用いて、 該 D NAとPCR反応を行ぃ、 凝集性を示す酵母株の同増幅産物の DN Aのサイズと を比較することを特徴とする請求項 3記載の下面ビール酵母の凝集性変異による 非;疑集性化または凝集性低下の有無の予知方法。
7. 酵母群からシングルコロニーを数点単離し、 各コロニーごとに培養後、 DN Aを抽出し、 凝集性遺伝子 ELQ5_の ORF配列から設計した連続した 1 Obp以 上の塩基からなるプライマーを用いて、 該 DNAと PCR反応を行い、 増幅産物 の有無を検出し、 酵母群中の凝集性変異株のポピュレーシヨンを把握することを 特徴とする請求項 2記載の下面ビール酵母の凝集性変異による非凝集性化または 凝集性低下の有無の判定方法。
8 . 酵母群からシングルコロニーを数点単離し、 各コロニーごとに培養後、 D N Aを抽出し、 凝集性遺伝子 FLQ の ORF配列から設計した連続した 1 0 b p以 上の塩基からなるプライマーを用いて、 該 D N Aと P C R反応を行 、 増幅産物 の有無を検出し、 酵母群中の凝集性変異株のポピュレーションを把握することを 特徴とする請求項 3記載の下面ビール酵母の非凝集性化または凝集性低下を予知 する方法。
9 . 凝集性を示す下面ビール酵母から調製したゲノムを鎵型とし、 凝集性遺伝子 FLO の ORF配列から設計した連続した 1 0 b p以上の塩基からなるプライマ —を用いて PCR により増幅した産物をプローブとして、 サンプル酵母を培 #|麦 抽出した D N Aとハイブリダィゼーシヨンを行うことを特徴とする請求項 1記載 の下面ビール酵母の凝集性有無の判定方法。
1 0 . 凝集性を示す下面ビール酵母から調製したゲノムを錡型とし、 凝集性遺伝 子 FLO の ORF配列から設計した連続した 1 0 b p以上の塩基からなるブラィ マ一を用いて PCR により増幅した産物をプローブとして、 サンプル酵母を培養 後抽出した D N Aとハイブリダィゼ一シヨンを行うことを特徴とする請求項 2記 載の下面ビール酵母の凝集性変異による非凝集性化または凝集性低下の有無の判 定方法。
1 1 . 凝集性遺伝子 FLO の ORF配列から設計した連続した 1 0 b p以上の塩 基からなるプライマーの塩基配列が配列番号 1から 4のいずれかである請求項 4 から 9のいずれか 1項記載の方法。
1 2 . プライマ一セッ卜が配列番号 1または 2の第一のプライマーと配列番号 3 または 4の第二のブライマ一からなる請求項 1 1記載の方法。
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