WO2001022083A2 - Verfahren zur identifizierung von mhc-restringierten antigenen - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for the identification of MHC-restricted T-cell antigens.
  • Tumor formation is the result of genetic changes in the cell that lead to the expression of aberrant gene products.
  • T cells are able to recognize such changes in the protein pattern of degenerate cells. Activation of antigen-specific T cells is a prerequisite for the induction of an antitumor immune response.
  • the molecular identification of T-cell tumor antigens therefore creates the conditions for the development of antigen-specific vaccines and other forms of T-cell-mediated immunotherapy (Rosenberg, 1996, 1999).
  • antigens In recent years, in particular in the case of malignant melanoma, several antigens have been identified that are recognized by the patient's autologous T cells. A possible therapeutic benefit of these antigens is currently being investigated in clinical studies. For a broad clinical application, however, it is necessary to identify as many tumor antigens as possible, because: 1. The previously known antigens are usually only expressed in a small percentage of all malignant melanomas and can therefore only be used in a small patient population. 2. Because antigens are peptides of HLA molecules are presented and HLA molecules in the human population are highly polymorphic, one must identify as many antigens as possible in order to have antigens available for vaccination for each HLA constellation. 3.
  • Vaccinations with only one antigen often lead to the tumor being switched off by this tumor and thus to the development of resistance.
  • Such resistance development should be prevented by simultaneous vaccination with as many antigens as possible.
  • the identification of other tumor antigens in melanoma as well as in other tumors is therefore an essential prerequisite for successful immunotherapy.
  • the identification of tumor antigens consists of two steps. First, the isolation of the patient's tumor-specific T cells by repeated in vitro stimulation with autologous tumor cells, and second, the molecular identification of the antigens recognized by the T cells. A simple and generally applicable method is desirable for this.
  • Some methods for identifying MHC-restricted T cell antigens are already known from the prior art.
  • the known approaches include in particular the following methods (Rosenberg, 1999): transient transfection of allogeneic or xenogeneic cell lines; Elution and HPLC fractionation of MHC-bound peptides; Retroviral transduction of autologous fibroblasts.
  • MHC class I-restricted tumor antigens can also be identified biochemically (Cox et al., 1994). For this purpose, tumor cells are lysed and the restricting MHC molecules are immunoprecipitated using monoclonal antibodies. The peptides bound to them are eluted from these MHC molecules and separated by reverse phase HPLC. Target cells are then loaded with the individual peptide fractions. These target cells are characterized by the fact that they only express the respective restriction element in peptide-unbound form. The exogenous addition of peptides therefore quickly leads to binding by the "empty" MHC molecules.
  • fibroblasts can only be cultured in vitro for a limited number of passages. Since fibroblasts also do not express MHC class II, this method is also limited to the identification of MHC class I-restricted antigens. In comparison to the transient expression cloning, as described under 1, the retroviral transduction of the target cells is associated with a considerably greater amount of work. However, the main disadvantage of this method is the comparatively low expression of the genes introduced retrovirally. This low level of expression requires about 10 times less sensitivity compared to transient transfection and thus 10 times more screening effort.
  • Figure 1 LCL infection with influenza
  • the cell line LCL 1.26 was incubated with recombinant influenza viruses (FPV-1 104 as vector), which carry the gene for the green fluorescence protein under the control of a promoter, which is characterized by an increased activity against the Wild-type promoter distinguished (promoter-up variant). After 24 hours, the cells glowing green under UV light were counted.
  • FPV-1 104 recombinant influenza viruses
  • Figure 2 Presentation of the model antigen in the context of MHC class II molecules after infection with recombinant influenza virus.
  • LCL 1.11 were infected with wild-type (wt) or recombinant FPV influenza viruses that express the model antigen under the control of the promoter-up variant.
  • MA model antigen
  • GM-CSF is released by the model antigen-specific T cell clone, but not after wild-type virus (wt) infection or after infection with GFP gene-bearing influenza viruses.
  • Figure 4 Presentation of the model antigen in the context of MHC class II molecules after infection with recombinant retroviruses.
  • the present invention thus provides a method for identifying MHC-restricted antigens, specifically both MHC class I and / or class II-restricted antigens. The following steps are included in the method according to the invention:
  • step (c) infecting immortalized autologous cells expressing MHC class I and / or MHC class U molecules on their surface with the recombinant virus particles obtained in step (b);
  • the invention is based on the fact that the mRNAs are isolated from a cell, for example an animal or human tumor cell, and a cDNA library is created therefrom. Analogously, it can also be cells that are infected with a microorganism are, for example a bacterium, a virus, a fungus or a protozoan. Of course, mixed infected cells are also possible. As an alternative to producing a cDNA bank from the infected cell, it is also possible to start from a gene bank that would be produced directly from the microorganism to be examined.
  • the cDNA or the DNA of the gene bank is introduced into the genome of retroviruses or as additional vRNA in modified influenza viruses, whereby recombinant retroviruses or influenza viruses arise.
  • the retroviruses used are preferably amphotropic or pseudotyped retroviruses.
  • the production of recombinant retroviruses and examples of amphotropic retroviruses are described in Kinsella et al. (1996), examples of pseudotyped retroviruses in Miletic et al. (1999).
  • Another example of retroviruses is the group of lentiviruses, with HTV and SIV in particular being mentioned here.
  • FPV Bratislava promoter-up variants are preferably used as modified influenza viruses.
  • the production of such influenza viruses with promoter up variants is described in Neumann and Hobom (1995), Flick and Hobom (1999) and WO-A-96/10641.
  • influenza promoter up variants mentioned have an increased transcription rate (both with the vRNA promoter and in the cRNA promoter of the complementary sequence) and an increased replication and / or expression rate relative to the wild type and differ from the wild type in that that they have at least one segment (one of the naturally present or an additional one) in which a total of up to 5 nucleotides are exchanged in the 5 'and 3' conserved region of the wild type.
  • the nucleotides in positions 3 and 8 are preferably replaced by other nucleotides, the nucleotides now inserted forming a base pair (item 3: G, then item 8: C; Pos. 3: G, then Pos. 8: G; etc.).
  • the nucleotide in position 5 of the 3 'conserved region can also be replaced.
  • the 3 'conserved regions of the wild-type influenza viruses have the following sequences
  • exchanges can also be made in the 13 nucleotide long 5 'conserved region of the wild type, e.g. B. in positions 3 and 8, again provided that the nucleotides now inserted form a base pair.
  • the 5 'conserved regions of the wild-type influenza viruses have the following sequences:
  • Influenza A 5'-AGUAGAAACAAGG-3 'Influenza B: 5'-AGUAG (A / U) AACA (A / G) NN-3' Influenza C 5'-AGCAGUAGCAAG (G / A) -3 '
  • Influenza virus mutants in which the exchanges G3A and C8U are carried out in the 3 'conserved region are preferably used in the present invention.
  • Most preferred influenza mutants are influenza A mutants and especially those that still have the U5C exchange (the above mutations are numbered from the 3 'end; such counting from the 3' end is also indicated by a line on the number, for example G 3A).
  • Further preferred influenza mutants include the mutations G3C, U5C and C8G (counted from the 3 'end) in the 3'-terminal nucleotide sequence, which gives the following 3'-terminal nucleotide sequence: (5') - CCUGGUUCUCCU-3 ⁇
  • influenza viruses defined above, those are particularly preferred which have the following 3'-terminal nucleotide sequence: (5 ') - CCUGUUUCUACU-3'
  • the modified segment preferably still has the modifications U3A and A8U in its 5'-terminal sequence, in the case of influenza C viruses it can still have the modifications C3U and G8A in its 5'- have terminal sequence.
  • influenza promoter up variants of the present invention have the following general structures:
  • Influenza A promoter-up variant "1 104": 5'-AGUAGA ⁇ CAAGGNN U5.6 ... (880-2300 ntd) ... N'N ⁇ 'CCUGUUUOJACU-3 ,
  • Influenza A promoter-up variant "1920" ⁇ : 5'-AGAAGAAUCAAGGNNNU 5. 6 ... (880-2300 ntd) ... N'N , N'CCUGUUUCuACU-3 '
  • Influenza A (Promoter-up version "1948"): 5 ⁇ -AGUAGAAACAAGGNNNU fifth 6. ⁇ (880-2300 ntd) ... N • N'N , CCUGGUUCuCcU-3 ,
  • N and N ' indefinite but base-paired positions, complementary between 5' and 3 'end, different for different of the eight segments, but always constant across all isolates;
  • the recombinant viruses are grown on suitable host cells and, if necessary, isolated by methods known per se.
  • Immortalized autologous cells preferably B cells or dendritic cells that express MHC class I and / or MHC class II molecules, are then infected with these recombinant retroviruses or influenza viruses. This is followed by steps d) to g), as described above.
  • autologous means the origin of the cells, i.e. the cells are from the same individual as the T cells used to screen for antigen expression.
  • T cell clones are used which recognize an antigen in certain cells. Since the identity of the antigen recognized by the T cells is unknown, the aim is to find out which antigen is recognized by the T cells. The availability of the T cell clones thus says nothing about the nature of the antigen. For example, one assumes T cell clones that recognize a prostate carcinoma line, but not EBV-immortalized cells and fibroblasts from the same individual. The aim now is to use a cDNA bank to identify the still unknown antigen from the prostate cancer cells, the autologous EBV-immortalized cells as recipient cells for the cDNA bank and the specific T cell clones.
  • the invention was preceded by the establishment of tumor-specific T cell clones. Since T cells only recognize antigen in connection with MHC molecules, in some clones However, an identification of the restricting MHC molecule was not possible, already established methods for the identification of T cell antigens could not be used for these clones. Since cells from different tissues of an individual express identical MHC molecules, possibilities were sought to find autologous B cells of the To make patients usable as recipient cells for the expression of cDNA banks from the tumor. B cells from any individual can be infected with Epstein-Barr virus, a human representative of the lymphocryptovirus group or related primate viruses from this group, immortalized and made available in practically unlimited quantities as so-called lymphoblastoid cell lines (LCL).
  • LCL lymphoblastoid cell lines
  • the use of the patient's autologous LCL as target cells requires efficient gene transfer to these cells, which has so far not been achieved by chemical or physical transfection methods. Comparatively little is known about the infection rate of LCL with viruses.
  • modified influenza A viruses firstly results in a uniquely efficient infection of LCL, secondly it occurs through the use of the transcriptionally activated viral regulatory elements in the FPV virus variants to an unmatched high level of gene expression of the genetic information that has been introduced, which results in high sensitivity and thus simplicity of detection.
  • influenza A virus-derived vectors for gene transfer in LCL described here required a determination of the infection efficiency. As shown in Figure 1, up to 80% of the lymphoblastoid cell lines LCL1.26 are infected with these viruses. In addition to a high infection rate, a number of other prerequisites had to be met for the intended application so that the influenza virus system could be used for the stated purpose.
  • a high expression rate of the foreign sequence introduced into the cells is essential for a high sensitivity of the detection method.
  • influenza viral transcription / translation machinery as demonstrated in Western analyzes for a model antigen, an approximately 5 times higher expression rate than after transient transfection and an approximately 10 times higher expression level than after retroviral transduction could be achieved.
  • influenza virus does not interfere with the presentation of the antigen.
  • influenza virus infection does not result in non-specific T cell activation or in the cytokine release by the infected LCL.
  • T cell activation requires at least 20 hours of co-cultivation of target cells and T cells.
  • a possible infection of T cells by the influenza viruses used from the supernatant or released from LCL) and a lysis of the cells after 8 hours would make the detection of a specific T cell activation impossible.
  • the influenza viruses used do not infect the T cells or at least not productively, ie viral genes are not expressed.
  • the LCL 1.26 cell line was incubated with recombinant influenza viruses that carry the gene for the green fluorescence protein. After 24 hours, the cells glowing green under UV light were counted.
  • Retroviruses were also considered as a possible alternative to gene transfer by recombinant influenza viruses and were therefore included in our investigations. As shown in Figure 3, very good efficiency of gene transfer could also be achieved with recombinant retroviruses. With the help of model antigens, an antigen-specific T cell stimulation could also be demonstrated with recombinant retroviruses (Figure 4). However, retroviruses do not reach the high level of expression of influenza viruses. The invention is generally illustrated below.
  • the starting point of the method of the invention is the isolation of mRNA or of DNA from cells whose antigens are to be examined.
  • cells of human origin are used in particular, although cells of animal origin, for example from rodents such as mice or rats, can also be used. It is preferably cells from a patient suffering from a tumor, e.g. B. a tumor of the hematopoietic system such as a B Zeil tumor, e.g. B. a leukemia.
  • the method can also be used for the identification of autoantigens or foreign antigens, e.g. from microbially infected tissue (bacteria, viruses, fungi, protozoa and any mixed infection). If this is a known microorganism, its genetic information (in the form of RNA or genomic DNA) can also be used directly.
  • the mRNA or the DNA is isolated by known molecular biological methods. For example, see Sambrook et al., (1989). The mRNA is then rewritten into its cDNA by techniques which are also known to produce a 14
  • the genetic information contained in the mixture of the cDNA or DNA fragments is now introduced into the genome of influenza viruses.
  • the procedure is generally shown as follows:
  • the genetic information for the proteins encoded by influenza A viruses is located on 8 negative strand RNAs, the coding regions being flanked in each case by the virus-specific promoter and termination sequences, which encompass both the transcription and the replication and the packaging of the Control vRNAs in the virus particles.
  • RNA and RNA carries the viral promoter or packaging signals presupposes that this gene is firstly present as a negative strand RNA and secondly carries the viral promoter or packaging signals.
  • This can be achieved, for example, by using a plasmid vector which, in addition to a resistance gene, for example for ampicillin, and a bacterial origin of replication, additionally has a polylinker sequence which is flanked directly on both sides by the non-translated (cDNA) promoter sequences of influenza A virus is, but in a modified form, which leads to increased activity of the promoter.
  • the viral 5 ' and 3' promoter sequences are in turn surrounded by the sequences of the human RNA polymerase I promoter and terminator, which were isolated from the human rDNA.
  • the cDNAs from the tissue to be examined are cloned into the polylinker sequence of this plasmid in the inverse orientation with respect to the RNA polymerase I promoter and amplified in E. coli. After transient transfection of these plasmids into suitable target cells, the transcriptional activity of RNA polymerase I results in pseudoviral negative-strand RNAs from the cloned-in cDNAs, which carry the viral transcription and packaging signals at their ends.
  • autologous B cells are infected with the recombinant virus particles, which contain one or more copies of cDNAs as negative strand vRNAs.
  • the B cells have to be immortalized before the infection, but EBV genes are preferably used other immorization systems are also known, for example oncogenes. The procedure is as follows
  • Lymphocytes are purified from the donor's peripheral blood using a Ficoll gradient and incubated with cell culture containing EBV.
  • the B95-8 cell line was incubated and immortalized
  • the infection of the immortalized autologous B cells leads to an expression of the pseudoviral gene segments originating from the original cell, which, like the genetic information of the virus's negative strand RNAs, are expressed as proteins, and cleavage products of these proteins are expressed by the cell's own antigen presentation machinery Compound with MHC molecules on the cell surface of the B cells where they can be recognized by antigen-specific T cells
  • APC antigen presenting cells
  • a stable transfection of the APCs with the cDNAs is forbidden for the method according to the invention for two reasons firstly, the stable transfection with the help of resistance genes always requires selection for growth-promoting and against growth-inhibiting genes. This leads to a shift in the representation of the cDNA bank due to the selection-related long culture period of the cells. Secondly, the expression of toxic, eg apoptosis, fördemden genes for the death of the transfected cells and thus for the loss of these genes In order to avoid these selection mechanisms, which would prevent identification of potential antigens, the shortest possible experimental conditions must be sought after transient transfect tion of cells with plasmids, the maximum level of expression is reached after 48-72 hours.
  • influenza system is superior to the normal transient transfection with plasmids. Due to the virus' own transcription machinery, maximum expression of the introduced foreign gene occurs as early as 6-12 hours after infection. This shortens the test times after introducing the foreign gene from around 72 hours to just 24 hours
  • the B cells infected with recombinant influenza viruses are therefore co-cultivated with autologous T cell clones which have a specificity for the antigen to be identified. If the influenza viruses were used to insert a cDNA as a vRNA into the B- If cells are inserted and expressed, which codes for the antigen recognized by the T cells, the antigen-specific T cells are stimulated.
  • the stimulation of the T cells via their T cell receptor is associated with a release of cytokines which are associated with Known methods, for example, ELISA-V, can be detected Of course, other methods can also be used with which the antigen-specific T cell stimulation can be detected.
  • this also includes the detection of T cell-mediated cytotoxicity and others measurable parameters of T cell activation If virus particles were contained in the influenza virus population which code for the antigen in question and have caused T cells to be released from the cytokine, the virus population is divided into smaller pools and with them the infection of the B cells and the procedure for antigen recognition are repeated after the viruses have been separated , which code for the antigen, the isolation and identification of the antigen recognized by the T cells can be carried out in a subsequent step
  • retroviruses can also be used for the infection of autologous LCL and for the expression of the antigens to be identified. With retroviruses, a similarly good transduction efficiency as with modified influenza viruses can be achieved, but retroviruses do not achieve the high expression level of the modified influenza viruses.
  • the production of recombinant retroviruses is described in detail in the prior art and reference is made here only to the publication by Kinsella et al (1996) as an example.
  • the open reading frame of the neomycin phosphotransferase U gene was cloned into the polylinker sequence of the influenza vector plasmid described above in inverse orientation with respect to the polymerase I promoter, and E. coli was transformed therewith.
  • Antigen-specific T cells are available in the laboratory for the detection of the neomycin phosphotransferase ⁇ gene product.
  • 5 ⁇ g plasmid DNA were mixed with 185 ⁇ l medium and 15 ⁇ l Lipofectamine TM (Gibco BRL) and incubated for 30 min at room temperature.
  • influenza A vuus 1
  • lxl 0 7 MDCK cells were incubated with 1 ml virus supernatant With lO ⁇ l of the culture supernatant harvested again after 15 hours, 1 ⁇ 10 5 LCL were infected and then co-cultivated with the same number of antigen-specific T cells. After 20 hours, the GM-CSF concentration in the culture supernatant was determined using an ELISA
  • the neomycin phosphotransferase II gene was again used as the model antigen for MHC class II restricted T line detection after retroviral transduction, and the green fluorescence protem (GFP) was used for the determination of the infection efficiency.
  • the open reading frames of both genes were retrovirally between the 5 and 3 Long Terminal Repeats (LTR) from Moloney murme leukemia virus (M-MuLV) was cloned into the plasmid PDMCO (Gngnani et al, 1998), and amplified as described above with E. coli.
  • lxlO 5 cells were taken up in 2 ml of virus supernatant and polybrene was added at a concentration of 2 ⁇ g / ml. The cells were then centrifuged at 1800 ⁇ m in a Va ⁇ fuge 3 2RS (Heraeus) for 30 min at room temperature. After adding new virus supernatant and again The cells were used for centrifugation Incubated for 12 hours at 37 ° C. The virus supernatant was then replaced by culture medium. 48 hours after infection, lxl 0 3 infected LCL were co-cultivated with the same number of antigen-specific T cells. After 20 hours, the GM-CSF concentration in the culture supernatant was determined using an ELIS As.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung von MHC-restringierten Antigenen. Die nachfolgenden Schritte werden dabei vom erfindungsgemässen Verfahren mitumfasst: (a) Herstellen einer Genbank oder cDNA-Bank aus einer zu untersuchendenZelle oder einem zu untersuchenden Mikroorganismus; (b) Einbringender cDNA oder DNA der Genbank in das Genom von Retroviren oder als zusätzliche vRNA von modifizierten Influenzaviren, die eine erhöhte Transkriptions-, Replikations- und/oder Expressionsrate relativ zu dem Wildtyp aufweisen um rekombinante Viruspartikel zu erhalten; (c) Infizieren von immortalisierten autologen Zellen, die MHC Klasse 1- und/oder MHC Klasse II-Moleküle auf ihrer Oberfläche exprimieren, mit den in Schritt (b) erhaltenen rekombinanten Viruspartikeln; (d) Exprimieren von durch die cDNA oder die DNA der Genbank codierten Proteinen in den autologen Zellen und Präsentieren der von der autologen Zelle erzeugten Spaltprodukte dieser Proteine auf der Zelloberfläche in Verbindung mit MHC Molekülen; (e) Co-Kultivieren von T-Zellen mit den autologen Zellen; (f) Stimulieren der T-Zellen durch solche autologen Zellen, die ein durch die T-Zellen erkanntes Antigen auf ihrer Zelloberfläche präsentieren; (g) Vereinzelung der Klone, die das Antigen exprimieren, und Identifizierung des Antigens.

Description

VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON MHC-RESTRINGIERTEN ANTIGENEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von MHC-restringierten T-Z ell-Antigenen.
Zwei Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung bilden die konzeptionelle Basis der gegenwärtigen Tumorimmunologie: 1. Die Tumorentstehung ist Folge genetischer Veränderungen der Zelle, die zur Expression aberranter Genprodukte führen. 2. T-Zellen sind in der Lage, solche Veränderungen im Proteinmuster entarteter Zellen zu erkennen. Voraussetzung für die Induktion einer antitumoralen Immunantwort ist die Aktivierung Antigen-spezifischer T-Zellen. Die molekulare Identifizierung von T-Zell-Tumorantigenen schafft demnach die Voraussetzung für die Entwicklung Antigen-spezifischer Vakzinen sowie anderer Formen T-Zell-vermittelter Immuntherapien (Rosenberg, 1996, 1999).
In den letzten Jahren wurden insbesondere beim malignen Melanom mehrere Antigene identifiziert, die von autologen T-Zellen der Patienten erkannt werden. Ein möglicher therapeutischer Nutzen dieser Antigene wird momentan im Rahmen klinischer Studien untersucht. Für eine breite klinische Anwendung ist es allerdings notwendig, möglichst viele Tumorantigene zu identifizieren, denn: 1. Die bisher bekannten Antigene werden in der Regel nur in einem kleinen Prozentsatz aller malignen Melanome exprimiert und sind somit nur bei einem kleinen Patientenkollektiv anwendbar. 2. Da Antigene als Peptide von HLA-Molekülen präsentiert werden und HLA-Moleküle in der menschlichen Population hochpolymoφh sind, muß man möglichst viele Antigene identifizieren, um für jede HLA-Konstellation Antigene zur Vakzinierung zur Verfügung zu haben. 3. Vakzinierungen mit nur einem Antigen führen häufig zur Abschaltung dieses Antigens durch den Tumor und damit zur Resistenzentwicklung. Solcher Resistenzentwicklung soll durch eine gleichzeitige Vakzinierung mit möglichst vielen Antigenen vorgebeugt werden. Die Identifizierung weiterer Tumorantigene beim Melanom als auch bei anderen Tumoren ist somit zwingende Voraussetzung für erfolgreiche Immuntherapien.
Experimentell setzt sich die Identifizierung von Tumorantigenen aus zwei Teilschritten zusammen. Erstens, der Isolierung Tumor-spezifischer T-Zellen des Patienten durch wiederholte in vitro Stimulation mit autologen Tumorzellen, und zweitens, der molekularen Identifikation der von den T-Zellen erkannten Antigene. Hierfür ist ein einfaches und allgemein anwendbares Verfahren wünschenswert.
Aus dem Stand der Technik sind bereits einige Methoden zur Identifizierung von MHC- restringierten T-Zell Antigenen bekannt. Die bekannten Lösungsansätze umfassen insbesondere die folgenden Verfahren (Rosenberg, 1999): Transiente Transfektion von allogenen oder xenogenen Zelllinien; Elution und HPLC Fraktionierung MHC gebundener Peptide; Retrovirale Transduktion von autologen Fibroblasten.
Diese Methoden und die damit verbundenen Nachteile werden nachfolgend näher dargestellt.
1. Transiente Transfektion von allogenen/xenogenen Zellinien Diese Methode beruht auf der Expression von cDNA Banken aus Tumoren in etablierten Zellinien (Boon, 1993). Als Zielzellen werden hierfür 293 oder COS-7 Zellen verwendet, die sich sehr effizient transfizieren lassen. Bezogen auf den HLA Genotyp des jeweiligen Patienten handelt es sich dabei allerdings um allogene (293) bzw. xenogene (COS-7) Zellinien. Da T-Zellen MHC-restringent sind, d.h. Antigen nur in Verbindung mit einem entsprechenden MHC-Molekül erkennen, ist die Kenntnis der Restriktionselemente notwendige Voraussetzung für eine Identifizierung von Antigenen. Eine T-Zell Erkennung der eingebrachten Antigene wird nur über die Co-Transfektion des jeweiligen Restriktionselements ermöglicht. Die Identifizierung des jeweiligen Restriktionselements ist aber oftmals schwierig oder gar unmöglich. Da die verwendeten Zielzellen darüber hinaus MHC Klasse II negativ sind, ist diese Methode auf die Identifizierung von MHC Klasse I- restringierten Antigenen mit bekanntem Restriktionselement beschränkt.
2. Biochemische Identifikation des Antigens
Neben der Expressionsklonierung ist eine Identifikation von MHC Klasse I-restringierten Tumorantigenen auch auf biochemischem Wege möglich (Cox et al., 1994). Dazu werden Tumorzellen lysiert und die restringierenden MHC Moleküle mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern immunpräzipitiert. Aus diesen MHC Molekülen werden die daran gebundenen Peptide eluiert und über reverse phase HPLC aufgetrennt. Anschließend werden Zielzellen mit den einzelnen Peptid-Fraktionen beladen. Diese Zielzellen zeichnen sich dadurch aus, daß sie nur das jeweilige Restriktionselement in Peptid-ungebundener Form exprimieren. Die exogene Zugabe von Peptiden führt deshalb rasch zu einer Bindung durch die "leeren" MHC Moleküle. Durch Co-Kultivierung dieser Peptid-beladenen Zielzellen mit tumorspezifischen T-Zellen werden positive Fraktionen identifiziert und über die Peptid-Sequenz das Antigen ermittelt. Wie bereits unter 1 , so ist auch hier die Kenntnis des HLA-Restriktionselements unabdingbare Voraussetzung für die Identifizierung von T-Zell-Antigenen, und zwar erstens für die Immunpräzipitation der restringierenden MHC Moleküle und zweitens für die Beladung entsprechender Zielzellen mit den eluierten Peptiden. Ein zusätzlicher Nachteil liegt in der enorm großen Tumormenge, die für die Peptid-Gewinnung benötigt wird, so daß diese Methode nur bei Tumoren angewendet werden kann, die sich gut in vitro kultivieren und expandieren lassen. Eine Identifizierung von T-Zell-Antigenen ist auch bei dieser Methode auf MHC Klasse I-restringierte Antigene beschränkt, da eine analoge HPLC Fraktionierung von MHC Klasse Il-Peptiden durch deren Längen-Heterogenität unmöglich ist.
3. Retrovirale Transduktion autologer Fibroblasten
Das oben beschriebene Problem der notwendigen Identifikation des Restriktionselements wird hinfällig, wenn autologe Zielzellen für die Expression der cDNA Bank aus dem Tumor verwendet werden. Für die Durchführung eines Antigen-Screenings werden große Zellmengen benötigt, so daß als Zielzellen nur solche Zellen des Patienten in Frage kommen, die sich in vitro entsprechend expandieren lassen. Fibroblasten lassen sich aus kleinen Hautbiopsien gewinnen und zudem sehr gut retroviral transduzieren. Die Identifikation von MHC Klasse I-restringierten Antigenen durch die retrovirale Transduktion autologer Fibroblasten mit cDNAs aus Tumoren wurde deshalb als Methode vorgestellt, welche die Definition des Restriktionselements überflüssig machen soll (Wang et al., 1998). Diese Methode ist allerdings mit einigen Nachteilen behaftet. Primäre Fibroblasten können nur eine begrenzte Anzahl an Passagen in vitro kultiviert werden. Da Fibroblasten außerdem kein MHC Klasse II exprimieren, ist auch diese Methode auf die Identifizierung von MHC Klasse I-restringierten Antigenen beschränkt. Im Vergleich zur transienten Expressionsklonierung, wie unter 1 beschrieben, ist die retrovirale Transduktion der Zielzellen mit einem wesentlich größeren Arbeitsaufwand verbunden. Der Hauptnachteil dieser Methode ist allerdings in der vergleichsweise niedrigen Expression der retroviral eingebrachten Gene zu sehen. Dieses niedrige Expressionsniveau bedingt eine im Vergleich zur transienten Transfektion etwa 10- fach geringere Sensitivität und somit einen 10-fach höheren Screening-Aufwand.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das die oben beschriebenen Nachteile des Standes der Technik vermeidet, insbesondere eine Kenntnis des restringierenden MHC Moleküls nicht erfordert, eine unbegrenzte Proliferation der Zielzellen erlaubt und gleichzeitig eine Identifizierung sowohl von MHC Klasse I- als auch MHC Klasse II-restringierten Antigenen ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungs gemäß durch das Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen, der nachfolgenden Beschreibung sowie den Ausführungsbeispielen und Abbildungen. Die Abbildungen zeigen:
Figur 1 : LCL Infektion mit Influenza Zur Bestimmung der Influenza Infektionsrate von LCL wurde die Zellinie LCL 1.26 mit rekombinanten Influenza- Viren (FPV-1 104 als Vektor) inkubiert, welche das Gen für das Green Fluorescence Protein unter der Kontrolle eines Promotors tragen, der sich durch eine verstärkte Aktivität gegenüber dem Wildtyp-Promotor auszeichnet (Promotor-Up- Variante). Nach 24 Stunden wurden die unter UV-Licht grün leuchtenden Zellen gezählt.
Figur 2: Präsentation des Modellantigens im Kontext von MHC Klasse II Molekülen nach Infektion mit rekombinantem Influenza- Virus. LCL 1.11 wurden mit Wildtyp (wt) bzw. rekombinanten FPV-influenza Viren, die das Modellantigen unter der Kontrolle der Promotor-Up-Variante exprimieren, infiziert. Nach viraler Transduktion des Modellantigens (MA) in LCL 1.1 1 kommt es zu einer GM-CSF Freisetzung durch den Modellantigen— spezifischen T-Zell-Klon, nicht aber nach Wildtyp Virus (wt) Infektion oder nach Infektion mit GFP-Gen-tragenden Influenza Viren.
Figur 3: LCL Infektion mit Retroviren
1 x 105 Zellen der EBV immortalisierten lymphoblastoiden Zellinie LCL 1.26 wurden mit rekombinanten Retroviren infiziert, welche das green fluorescence protein exprimieren. 72 Stunden nach Infektion wurden die grün leuchtenden Zellen gezählt.
Figur 4: Präsentation des Modellantigens im Kontext von MHC Klasse II Molekülen nach Infektion mit rekombinanten Retroviren.
1 x 105 Zellen der lymphoblastoiden Zellinie LCL 1.11 wurden retroviral mit dem Neomycin Posphotransferase II Gen (Pinco-NeoR) bzw. mit dem
Green Fluorescence Protein Gen (Pinco-GFP, Grignani et al, 1998) transduziert. 72 Stunden später wurden die infizierten bzw. nicht-infizierte LCL1.11 Zellen mit 1 x 105 T-Zellen inkubiert. Die verwendeten, MHC Klasse II restringierten T-Zellen sind spezifisch für ein auf HLA-DP3 präsentiertes Epitop des Neomycin Phosphotransferase II Proteins. Nach 24 stündiger Co-Kultivierung der Zellen wurde die GM-CSF Konzentration im Zellüberstand mittels eines ELISAs ermittelt. Die vorliegende Erfindung schafft somit ein Verfahren zur Identifizierung von MHC- restringierten Antigenen, und zwar sowohl von MHC Klasse I und/oder Klasse II restringierten Antigenen. Die nachfolgenden Schritte werden dabei vom erfindungsgemäßen Verfahren mitumfaßt:
(a) Herstellen einer Genbank oder cDNA-Bank aus einer zu untersuchenden Zelle oder einem zu untersuchenden Mikroorganismus;
(b) Einbringen der cDNA oder DNA der Genbank in das Genom von Retroviren oder als zusätzliche vRNA von modifizierten Influenzaviren, die eine erhöhte Transkriptions-, Replikations- und/oder Expressionsrate relativ zu dem Wildtyp aufweisen, um rekombinante Viruspartikel zu erhalten;
(c) Infizieren von immortalisierten autologen Zellen, die MHC Klasse I- und/oder MHC Klasse U-Moleküle auf ihrer Oberfläche exprimieren, mit den in Schritt (b) erhaltenen rekombinanten Viruspartikeln;
(d) Exprimieren von durch die cDNA oder die DNA der Genbank kodierten Proteinen in den autologen Zellen und Präsentieren der von der autologen Zelle erzeugten Spaltprodukte dieser Proteine auf der Zelloberfläche in Verbindung mit MHC Molekülen;
(e) Co-Kultivieren von T-Zellen mit den autologen Zellen;
(f) Stimulieren der T-Zellen durch solche autologen Zellen, die ein durch die T-Zellen erkanntes Antigen auf ihrer Zelloberfläche präsentieren;
(g) Vereinzelung der Klone, die das Antigen exprimieren, und Identifizierung des Antigens.
Die Erfindung geht davon aus, daß aus einer Zelle, beispielsweise einer tierischen oder menschlichen Tumor-Zelle, deren mRNAs isoliert und daraus eine cDNA-Bank angelegt wird. Analog kann es sich auch um Zellen handeln, die mit einem Mikroorganismus infiziert sind, beispielsweise einem Bakterium, einem Virus, einem Pilz oder einer Protozoe. Selbstverständlich sind auch mischinfizierte Zellen möglich. Alternativ zu der Herstellung einer cDNA-Bank aus der infizierten Zelle kann hier auch von einer Genbank ausgegangen werden, die direkt aus dem zu untersuchenden Mikroorganismus hergestellt würde. In einem nächsten Schritt wird die cDNA oder die DNA der Genbank in das Genom von Retroviren oder als zusätzliche vRNA in modifizierte Influenza- Viren eingebracht, wodurch rekombinante Retroviren bzw. Influenza- Viren entstehen. Als Retroviren werden bevorzugt amphotrope oder pseudotypisierte Retroviren eingesetzt. Die Herstellung rekombinanter Retroviren sowie Beispiele für amphotrope Retroviren sind in Kinsella et al. (1996), Beispiele für pseudotypisierte Retroviren in Miletic et al. (1999) beschrieben. Als weiteres Beispiel für Retroviren sei die Gruppe der Lentiviren genannt, wobei hier insbesondere HTV und SIV erwähnt werden sollen.
Als modifizierte Influenza- Viren werden bevorzugt Promotor-Up-Varianten von FPV Bratislava eingesetzt. Die Herstellung solcher Influenza- Viren mit Promotor-Up-Varianten ist in Neumann und Hobom (1995), Flick und Hobom (1999) sowie WO-A-96/10641 beschrieben.
Die genannten Influenza-Promotor-Up- Varianten weisen eine erhöhte Transkriptionsrate (sowohl mit dem vRNA Promoter als auch in dem cRNA Promoter der komplementären Sequenz) sowie eine erhöhte Replikations- und/oder Expressionsrate relativ zum Wildtyp auf und unterscheiden sich von dem Wildtyp dadurch, daß sie wenigstens ein Segment (eines der natürlich vorhandenen oder ein zusätzliches) aufweisen, in dem in den 5' und 3' konservierten Region des Wildtyps insgesamt bis zu 5 Nukleotide ausgetauscht sind. Vorzugsweise sind in der 12 Nukleotide langen 3' konservierten Region des Wildtyps die Nukleotide in Position 3 und 8 (von 3' Terminus gezählt) durch andere Nukleotide ersetzt, wobei die nun eingefügten Nukleotide ein Basenpaar bilden (Pos. 3:G, dann Pos. 8:C; Pos. 3:G, dann Pos. 8:G; usw). Darüber hinaus kann ebenfalls noch das Nukleotid in der Position 5 der 3' konservierten Region (vom 3 Terminus aus gezählt) ausgetauscht sein. Die 3' konservierten Regionen der Wildtyp-Influenzaviren weisen die folgenden Sequenzen auf
Influenza A (5')-CCUGCUUUUGCU-3'
Influenza B (5')-N (C U)GCUUCUGCU-3 '
Influenza C (5')-CCUGCUUCUGCU-3 '
Optional können auch noch Austausche in der 13 Nukleotide langen 5' konservierten Region des Wildtyps vorgenommen werden, z. B. in Position 3 und 8, wiederum vorrausgesetzt, dass die nun eingefügten Nukleotide ein Basenpaar bilden. Die 5' konservierten Regionen der Wildtyp-Iinfluenzaviren weisen die folgenden Sequenzen auf:
Influenza A: 5'-AGUAGAAACAAGG-3' Influenza B: 5'-AGUAG(A/U)AACA(A/G)NN-3' Influenza C 5'-AGCAGUAGCAAG(G/A) -3'
Bevorzugt werden in der vorliegenden Erfindung solche Influenzavirus-Mutanten verwendet, in denen in der 3' konservierten Region die Austausche G3A und C8U vorgenommen werden. Am meisten bevorzugte Influenzamutanten sind Influenza-A- Mutanten und insbesondere solche, die noch den Austausch U5C aufweisen (die vorstehenden Mutationen sind vom 3' Ende ausgehend beziffert; solches Zählen vom 3' Ende wird auch durch eine Linie auf der Zahl gekennzeichnet, so z.B. G 3A). Weitere bevorzugte Influenzamutanten umfassen die Mutationen G3C, U5C and C8G (vom 3' Ende gezählt) in der 3'-termιna!en Nukleotidsequenz, was die folgende 3'-termιnale Nukleotidsequenz ergibt: (5')-CCUGGUUCUCCU-3\
Aus den vorstehend definierten Influenzaviren sind diejenigen besonders bevorzugt, die die folgende 3'-termιnale Nukleotidsequenz aufweisen: (5')-CCUGUUUCUACU-3' Im Falle von modifizierten Influenza-A-Viren weist das modifizierte Segment vorzugsweise noch die Modifikationen U3A and A8U in seiner 5'-terminalen Sequenz auf, im Falle von Influenza-C-Viren kann es noch die Modifikationen C3U and G8A in seiner 5'-terminalen Sequenz aufweisen.
Die am meisten bevorzugten Influenza-Promotor-Up-Varianten der vorliegenden Erfindung weisen die folgenden allgemeinen Strukturen auf:
Influenza A (Promoter-Up-Variante "1 104"): 5'-AGUAGA ^CAAGGNN U5.6...(880-2300 ntd)...N'N^'CCUGUUUOJACU-3,
Influenza A (Promoter-Up-Variante "1920"^ : 5'-AGAAGAAUCAAGGNNNU5.6... (880-2300 ntd)...N'N,N'CCUGUUUCuACU-3'
Influenza A (Promoter-Up-Variante "1948",) : 5■-AGUAGAAACAAGGNNNU5.6.■■(880-2300 ntd)...N•N'N,CCUGGUUCuCcU-3,
Influenza B:
5,-AGUAG(A/U)AACA(AyG)NNNNNU5.6.. 880-2300 ntd)...N,N^'N^ C/U)GUUUCU CU-3•
Influenza C:
5,-AGUAGUAACAAG(G/A)GU5.6... (880-2300 ntd)...CCCCUGUUUCUACU-3'
In diesen Strukturen gilt:
1) Unterstrichen (und größer) die notwendigen Mutationen gegenüber der Wildtypsequenz zur Erzeugung der Pomoter-Up-Variante;
2) größeres nicht unterstrichenes A in dem 5' Teil der Sequenz: überzähliges A (Position 10), winkelbildend;
3) (A/G) an einer Position: unterschiedliche Isolate bzw. Einzelsegmente mit verschiedener Sequenz jeweils an Positionen, die analytisch austauschbar sind; 4) N und N': unbestimmte, aber basengepaarte Positionen, komplementär zwischen 5' und 3' Ende, für verschiedene der acht Segmente unterschiedlich, jedoch jeweils konstant über alle Isolate;
5) (880-2300 ntd): die Segmentlänge der Virussegmente, bei Segmenten mit Fremdgen-Inhalt bis zu 4000 ntd.
Die rekombinanten Viren werden auf geeigneten Wirtszellen vermehrt und gegebenenfalls durch an sich bekannte Methoden isoliert. Mit diesen rekombinanten Retroviren bzw. Influenza- Viren werden dann irnmortalisierte autologe Zellen, bevorzugt B-Zellen oder dendritische Zellen, die MHC Klasse I- und/oder MHC Klasse II-Moleküle exprimieren, infiziert. Hieran schließen sich die Schritte d) bis g), wie oben beschrieben, an.
Erfindungsgemäß wird unter "autolog" die Herkunft der Zellen verstanden, d.h. die Zellen stammen aus demselben Individuum wie die T-Zellen, mit denen das Screening auf Antigenexpression durchgeführt wird.
Voraussetzung für die vorliegende Erfindung ist natürlich, daß T-Zellklone eingesetzt werden, die ein Antigen in bestimmten Zellen erkennen. Da die Identität des von den T- Zellen erkannten Antigens unbekannt ist, soll herausgefunden werden, welches Antigen von den T-Zellen erkannt wird. Die Verfügbarkeit der T-Zellklone sagt somit nichts über die Natur des Antigens aus. Beispielsweise geht man von T-Zellklonen aus, die eine Prostata- Karzinomlinie erkennen, nicht aber EBV-immortalisierte Zellen sowie Fibroblasten desselben Individuums. Ziel ist es nunmehr, mit Hilfe einer cDNA-Bank aus den Prostatakarzinomzellen, den autologen EBV-immortalisierten Zellen als Empfängerzellen für die cDNA-Bank und den spezifischen T-Zellklonen das noch unbekannte Antigen zu identifizieren.
Nachfolgend wird die Erfindung im einzelnen ausgeführt.
Der Erfindung vorausgegangen war die Etablierung von tumorspezifischen T-Zell-Klonen. Da T-Zellen Antigen nur in Verbindung mit MHC Molekülen erkennen, bei einigen Klonen eine Identifizierung des restringierenden MHC Moleküls aber nicht möglich war, konnten bereits etablierte Methoden zur Identifizierung von T-Zell-Antigenen für diese Klone nicht angewendet werden Da Zellen unterschiedlicher Gewebe eines Individuums identische MHC Moleküle exprimieren, wurde nach Möglichkeiten gesucht, autologe B-Zellen des Patienten als Empfängerzellen für die Expression von cDNA Banken aus dem Tumor nutzbar zu machen. B-Zellen von jedem beliebigen Individuum können mit Epstein-Barr Virus, einem humanen Vertreter der Lymphocryptovirus-Gruppe oder verwandten Primaten-Viren dieser Gruppe infiziert, immortalisiert und in praktisch unbegrenzter Menge als sog. lymphoblastoide Zellinien (LCL) verfügbar gemacht werden. Die Verwendung von autologen LCL als Zielzellen erübrigt die teilweise schwierige bis unmögliche Identifizierung der MHC Restriktionselemente Da LCL konstitutiv MHC Klasse I und Klasse U exprimieren, ist sowohl eine Identifikation von MHC Klasse I-restringierten Antigenen, die von zytotoxischen T-Zellen erkannt werden, als auch von MHC Klasse II-restringierten Antigenen, die von T- Helferzellen erkannt werden, möglich.
Die Verwendung von autologen LCL des Patienten als Zielzellen setzt allerdings einen effizienten Gentransfer in diese Zellen voraus, der bisher weder durch chemische noch physikalische Transfektionsmethoden erzielt werden konnte. Über die Infektionsrate von LCL mit Viren ist vergleichsweise wenig bekannt Wie im folgenden beschrieben, wird durch die Verwendung von modifizierten Influenza A Viren erstens eine einzigartig effiziente Infektion von LCL erreicht, zweitens kommt es durch die Verwendung der transkriptionsaktivierten viruseigenen regulatorischen Elemente in den FPV- Virusvarianten zu einer unübertroffen hohen Genexpression der eingebrachten Erbinformation, was eine hohe Sensitivität und somit Einfachheit des Nachweises bedingt.
Die hier beschriebene Nutzung von Influenza A Virus-abgeleiteten Vektoren für den Gentransfer in LCL setzte eine Bestimmung der Infektionseffizienz voraus. Wie in Abbildung 1 gezeigt, werden bis zu 80% der lymphoblastoiden Zellinien LCL1.26 mit diesen Viren infiziert. Neben einer hohen Infektionsrate mußte für die beabsichtigte Anwendung eine Reihe weiterer Voraussetzungen erfüllt sein, damit eine Nutzung des Influenza Virussystems zum genannten Zweck möglich wird.
1. Expressionsniveau des eingebrachten Fremdgens?
Für eine hohe Sensitivität des Nachweisverfahrens ist eine hohe Expressionsrate der in die Zellen eingebrachten Fremdsequenz essentiell. Durch die Nutzung der influenza-viralen Transkriptions/Translations-Maschinerie konnte, wie in Western Analysen für ein Modellantigen nachgewiesen, eine etwa 5-fach höhere Expressionsrate als nach transienter Transfektion und ein etwa 10-fach höheres Expressionsniveau als nach retroviral er Transduktion erzielt werden.
2. Virale Interferenz mit Antigen-Präsentation und -Erkennung?
Für mehrere Viren ist bekannt, daß sie mit der Antigenpräsentation interferieren und so einer Immunerkennung entgehen. Um für das verwendete Influenza A Virus analoge Mechanismen auszuschließen, wurde ein für ein Modellantigen kodierendes Gen in die FPV- Viren eingebracht und LCLs damit infiziert. Die MHC Präsentation des Modellantigens wurde durch einen Modellantigen-spezifischen T-Zell-Klon ermittelt. Wie in Abbildung 2 gezeigt, interferiert Influenza Virus nicht mit der Präsentation des Antigens. Darüber hinaus kommt es durch die Influenza Virus-Infektion weder zu einer unspezifischen T-Zell-Aktivierung noch zu einer Zytokinfreisetzung durch die infizierten LCL.
3. Infektion der T Zellen?
Der Nachweis einer T-Zell-Aktivierung setzt eine mindestens 20-stündige Co-Kultivierung von Zielzellen und T-Zellen voraus. Eine mögliche Infektion von T-Zellen durch die verwendeten Influenza Viren (aus dem Überstand oder freigesetzt aus LCL) und eine nach 8 Stunden einsetzende Lyse der Zellen würde den Nachweis einer spezifischen T-Zell- Aktivierung unmöglich machen. Wie ebenfalls mit Hilfe des Green Fluorescence Protein (GFP) nachgewiesen werden konnte, infizieren die verwendeten Influenzaviren die T-Zellen nicht oder zumindest nicht produktiv, d.h. virale Gene werden nicht exprimiert.
Zur Bestimmung der Influenza-Infektionsrate von LCL wurde die Zellinie LCL 1.26 mit rekombinanten Influenza- Viren inkubiert, welche das Gen für das Green Fluorescence Protein tragen. Nach 24 Stunden wurden die unter UV Licht grün leuchtenden Zellen gezählt.
Als mögliche Alternative zum Gentransfer durch rekombinante Influenza Viren kamen auch rekombinante Retroviren in Betracht und wurden deshalb in unsere Untersuchungen mit einbezogen. Eine sehr gute Effizienz des Gentransfers ließ sich, wie in Abbildung 3 gezeigt, auch mit rekombinanten Retroviren erreichen. Mit Hilfe von Modellantigenen konnte auch mit rekombinanten Retroviren eine Antigen-spezifische T-Zell-Stimulation nachgewiesen werden (Abbildung 4). Allerdings erreichen Retroviren nicht das hohe Expressionsniveau von Influenza Viren. Nachfolgend wird die Erfindung allgemein dargestellt.
Ausgangspunkt des Verfahrens der Erfindung ist die Isolierung von mRNA oder von DNA aus Zellen, deren Antigene einer Untersuchung unterzogen werden sollen. Hierzu werden insbesondere Zellen humanen Ursprungs eingesetzt, wiewohl jedoch auch Zellen tierischen Ursprungs, beispielsweise aus Nagern wie Mäusen oder Ratten, verwendbar sind. Bevorzugt handelt es sich um Zellen aus einem Patienten, der an einem Tumor leidet, z. B. einem Tumor des blutbildenden Systems wie einem B Zeil Tumor, z. B. einer Leukämie. Das Verfahren läßt sich jedoch auch für die Identifizierung von Autoantigenen oder von Fremdantigenen anwenden, z.B aus mikrobiell infiziertem Gewebe (Bakterien, Viren, Pilze, Protozoen sowie jede beliebige Mischinfektion). Handelt es sich dabei um einen bekannten Mikroorganismus, so kann dessen Erbinformation (in Form von RNA oder genomischer DNA) auch direkt verwendet werden.
Die Isolierung der mRNA oder der DNA erfolgt durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden. Verwiesen sei hier beispielsweise auf Sambrook et al., (1989). Die mRNA wird anschließend durch ebenfalls bekannte Techniken in ihre cDNA umgeschrieben, um eine 14
cDNA-Bank der Zelle zu gewinnen. Es wird hier auf die obige, beispielhaft genannte Veröffentlichung verwiesen.
Die im Gemisch der cDNA- oder DNA-Fragmente enthaltene genetische Information wird nunmehr in das Genom von Influenza- Viren eingebracht. Die Vorgehensweise ist allgemein dargestellt wie folgt:
Die genetische Information für die von Influenza A Viren kodierten Proteine befindet sich auf 8 Negativ-Strang RNAs, wobei die kodierenden Bereiche jeweils von den Virus-spezifischen Promotor- und Terminati onssequenzen flankiert werden, die sowohl die Transkription und die Replikation als auch die Veφackung der vRNAs in die Viruspartikel steuern.
Die Herstellung rekombinanter Influenza- Viren, d.h. die Veφackung eines Fremdgens in Influenza A Viruspartikel, und die Expression dieses Gens nach Infektion einer Zielzelle setzt voraus, daß dieses Gen erstens als Negativ-Strang RNA vorliegt und zweitens die viralen Promotor- bzw. Veφackungssignale trägt. Dies kann beispielsweise erreicht werden durch die Verwendung eines Plasmid- Vektors, der neben einem Resistenzgen, beispielsweise für Ampicillin, und einem bakteriellen Replikationsursprung zusätzlich eine Polylinker-Sequenz besitzt, die unmittelbar beiderseits von den nicht-translatierten (cDNA) Promotorsequenzen von Influenza A Virus flankiert wird, jedoch in modifizierter Form, die zur Aktivitätssteigerung des Promotors führt. Die viralen 5 'und 3' Promotorsequenzen sind ihrerseits von den Sequenzen des humanen RNA Polymerase I Promotors und Terminators umgeben, die aus der humanen rDNA isoliert wurden.
Zur Erstellung einer cDNA Bank werden die cDNAs aus dem zu untersuchenden Gewebe in die Polylinker-Sequenz dieses Plasmids in inverser Orientierung bezüglich des RNA Polymerase I Promotors kloniert und in E.coli amplifϊziert. Nach transienter Transfektion dieser Plasmide in geeignete Zielzellen entstehen durch die transkriptioneile Aktivität von RNA Polymerase I aus den einklonierten cDNAs pseudovirale negativ-Strang RNAs, die an ihren Enden die viralen Transkriptions- und Veφackungssignale tragen. Da die Veφackung der viralen RNAs in Viruspartikel nicht von der kodierenden Region, sondern ausschließlich von den legulatoπschen Signalsequenzen am 5'- und 3 '-Ende abhangt, werden diese pseudoviralen RNAs nach Ubeπnfektion der transfizierten Zellen mit Influenza A Helfer- Virus (FPV Bratislava) m die neugebildeten Viruspartikel aufgenommen, die m den Kultui überstand abgegeben werden Die in den Zellkulturuberstand freigesetzten Viren werden geerntet und wahlweise weiter konzentπert Selbstverständlich sind auch andere dem Fachmann bekannte odei von ihm im Rahmen der Versuche zu konstruieiende Vektoren, die auf Influenza-Vnen, aber auch auf den nachfolgend beschπ ebenen Retroviren beruhen, im Rahmen der Erfindung emsetzbai
In einem nächsten Schπtt werden autologe B-Zellen mit den rekombinanten Viruspartikeln, die eine oder mehrere Kopien von cDNAs als Negativ-Strang vRNAs enthalten, infiziert Die B-Zellen müssen vor der Infektion lmmortahsiert werden, wobei bevorzugt EBV-Gene eingesetzt werden Es sind aber auch andere Immortahsierungssysteme bekannt, so z B Onkogene Hierbei wird wie folgt vorgegangen
Aus dem peπpheren Blut des Spenders weiden Lymphozyten (PBL) über einen Ficoll- Gradienten aufgereinigt und mit EBV-haltigem Zellkultui überstand z B der B95-8 Zellinie inkubiert Diese Affenzellmie gibt infektiöses EBV in den Zellkulturuberstand ab, wodurch die B-Zellen des Spenders infiziert und lmmortahsiert werden
Zui Offenbarung wird beispielsweise auf die nachfolgenden Veröffentlichungen hingewiesen v Knebel Doebeπtz et al , 1983, Rickinson et al , 1984
Durch die Infektion der immortalisierten autologen B-Zellen kommt es zu einer Expression der aus der Ursprungszelle stammenden pseudoviralen Gensegmente, die ähnlich wie die genetische Information der viruseigenen Negatι\ -Strang RNAs als Proteine expπmiert weiden Spaltprodukte dieser Proteine werden durch die zelleigene Antigen- Prasentationsmaschmeπe in Verbindung mit MHC Molekülen auf der Zelloberflache der B- Zellen piasentiert, wo sie von Antigen-spezifischen T-Zellen erkannt werden können Bei der vorliegenden Erfindung werden somit zum Zwecke der Antigen-Identifikation Gemische von unbekannten cDNAs in die immortalisierten autologen Zellen, die zur Antigenpräsentation befähigt sind (APC= antigen presenting cells) transient eingebracht Eine stabile Transfektion der APCs mit den cDNAs verbietet sich für das erfindungsgemäße Verfahren aus zwei Gründen Erstens bedingt die stabile Transfektion mit Hilfe von Resistenzgenen immer eine Selektion auf wachstumsfördernde und gegen wachstumshemmende Gene Dies führt durch die selektionsbedingte lange Kulturdauer der Zellen zu einer Verschiebung in der Repräsentanz der cDNA Bank Zweitens führt die Expression von toxischen, z B Apoptose-fördemden Genen zum Absterben der transfizierten Zellen und somit zum Verlust dieser Gene Um diese Selektionsmechanismen, die eine Identifizierung potentieller Antigene verhindern würden, zu vermeiden, müssen kürzestmögliche Versuchsbedingungen angestrebt werden Nach transienter Transfektion von Zellen mit Plasmiden wird das maximale Expressionsniveau nach 48-72 Stunden erreicht. In dieser Hinsicht ist z B das Influenza System der normalerweise üblichen transienten Transfektion mit Plasmiden überlegen. Bedingt durch die viruseigene Transkriptionsmaschinerie kommt es bereits 6 - 12 Stunden nach Infektion zu einer maximalen Expression des eingebrachten Fremdgens. Dadurch verkürzen sich die Versuchszeiten nach Einbringen des Fremdgens von etwa 72 Stunden auf nur 24 Stunden
In einem nächsten Schritt werden deshalb die mit rekombinanten Influenza-Viren infizierten B-Zellen mit autologen T-Zell-Klonen co-kultiviert, die eine Spezifität für das zu identifizierende Antigen besitzen Wurde durch die Influenza- Viren eine cDNA als vRNA in die B-Zellen eingeschleust und exprimiert, welche für das von den T-Zellen erkannte Antigen kodiert, kommt es zu einer Stimulation der Antigen-spezifischen T-Zellen Mit der Stimulation der T-Zellen über ihren T-Zellrezeptor ist eine Freisetzung von Zytokinen verbunden, die mit bekannten Methoden, z B durch ELISA-V erfahren, nachweisbar ist Selbstverständlich sind auch andere Verfahren einsetzbar, mit denen die Antigen-spezifische T Zeil-Stimulation detektierbar ist Hierzu gehören ausser dem Nachweis einer Zytokinexpression auch der Nachweis einer T-Zell vemittelten Zytotoxizität und andere meßbare Parameter der T-Zellaktivierung Waren innerhalb der Influenza- Viruspopulation Viruspartikel enthalten, die für das betreffende Antigen kodieren und T-Zellen zur Zytokinfreisetzung gebracht haben, wird die Viruspopulation in kleinere Pools aufgeteilt und mit diesen die Infektion der B-Zellen und die Prozedur der Antigenerkennung wiederholt Nach Vereinzelung der Viren, die für das Antigen kodieren, kann in einem folgenden Schritt die Isolierung und Identifizierung des von den T-Zellen erkannten Antigens erfolgen
Als Alternative für die modifizierten Influenza- Viren können auch Retroviren für die Infektion von autologen LCL und zur Expression der zu identifizierenden Antigene eingesetzt werden. Mit Retroviren ist eine ähnlich gute Transduktionseffizienz wie mit modifizierten Influenza Viren zu erreichen, Retroviren erreichen jedoch nicht das hohe Expressionsniveau der modifizierten Influenza Viren. Die Herstellung rekombinanter Retroviren ist im Stand der Technik ausführlich beschrieben und nur beispielhaft wird hier auf die Veröffentlichung von Kinsella et al (1996) verwiesen.
Im folgenden ist die Beschreibung von zwei Versuchen dargestellt, so wie sie im Labor, einmal mit modifizierten Influenza Viren „1 104" und einmal mit Retroviren, durchgeführt wurden.
Herstellung rekombinanter Influenza Viren, Infektion autologer LCL und Erkennung eines Modellantigens
Der offene Leserahmen des Neomycin-Phosphotransferase U Gens wurde in die Polylinker- Sequenz des oben beschriebenen Influenza- Vektor-Plasmids in inverser Orientierung bezüglich des Polymerase I Promotors einkloniert, und E. coli damit transformiert. Für die Erkennung des Neomycin-Phosphotransferase π Genprodukts stehen im Labor Antigen- spezifische T-Zellen zur Verfügung. Nach präparativer Plasmidaufarbeitung mit Hilfe kommerziell vertriebener Verfahren (Qiagen Maxi Prep Kit) wurden 5μg Plasmid DNA mit 185μl Medium und 15μl Lipofectamine TM (Gibco BRL) gemischt und für 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe weiterer 3 ml Medium wurde das Gemisch auf 2,5x106293T Zellen gegeben. Nach 6 Stunden wurde der Überstand abgenommen und durch Zellmedium ei setzt 18 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen gewaschen und mit Influenza A Vuus ubeπnfiziert (MOI = 1), und weitere 15 Stunden spater rekombmantes Virus im Zelluberstand geemtet Zui Erhöhung des Virustiteis wurden lxl 07 MDCK Zellen mit 1 ml Virusuberstand inkubiert Mit lOμl des wiederum nach 15 Stunden geernteten Kulturuberstandes wurden lxl 05 LCL infiziert und anschließend mit der gleichen Zahl Antigen-spezifischer T-Zellen co-kultiviert Nach 20 Stunden wurde die GM-CSF Konzentration im Kulturuberstand mit Hilfe eines ELISAs ermittelt
Herstellung von rekombinanten Retroviren, Infektion von autologen LCL und Erkennung eines Modellantigens durch Anügen-spezifische T-Zellen
Als Modellantigen für die MHC Klasse II restringierte T Zeil Erkennung nach retroviraler Transduktion wurde wiederum das Neomycin-Phosphotransferase II Gen, und für die Bestimmung der Infektionseffizienz, das green fluorescence protem (GFP) verwendet Die offenen Leserahmen beider Gene wurden zwischen die 5 und 3 retroviral en Long Terminal Repeats (LTR) von Moloney murme leukemia virus (M-MuLV) m dem Plasmid PDMCO (Gngnani et al , 1998) einkloniert, und wie oben beschrieben m E coli amplifiziert Um lekombinante Retiovnen herzustellen, wurden 5μg Plasmid DNA mit 370μl Medium (ohne FCS) und 30μl LipofectammeTM (Gibco BRL) gemischt und 30 Min bei Raumtemperatur mkubiert Nach Zugabe weiterer 3ml Medium wurde das Gemisch auf 2x106 Zellen der amphotropen Veφackungszelhnie Phoenix gegeben und für 6 Stunden bei 37°C mkubiert 24 Stunden nach Transfektion wurden 2μg Puromycin / ml Kulturmedium zugegeben, wodurch nur Zellen überleben, die den PINCO Vektoi aufgenommen haben Nach 48 stundiger Puromycin Selektion wurden die Zellen gewaschen und in Medium ohne Puromycin aufgenommen Der virushaltige Kulturuberstand wurde nach 48-72 Stunden geemtet, der Virustiter lag bei 2xl06 Viren pro ml Kulturmedium
Zur Infektion von LCL wurden lxlO5 Zellen in 2ml Virusuberstand aufgenommen und Polybrene in einer Konzentration von 2μg/ml zugesetzt Anschließend wurden die Zellen bei 1800 φm in einer Vaπfuge 3 2RS (Heraeus) für 30 Min bei Raumtemperatur zentπfugiert Nach Zugabe von neuem Virusuberstand und erneuter Zentπfugation wurden die Zellen für 12h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Virusüberstand durch Kulturmedium ersetzt. 48 Stunden nach Infektion wurden lxl 03 infizierte LCL mit der gleichen Anzahl an Antigen- spezifischen T-Zellen co-kultiviert. Nach 20 Stunden wurde die GM-CSF Konzentration im Kulturüberstand mit Hilfe eines ELIS As ermittelt.
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Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1 Verfahren zur Identifizierung von MHC -restringierten Antigenen mit den nachfolgenden Schritten
(a) Herstellen einer Genbank oder cDNA-Bank aus einer zu untersuchenden Zelle oder einem zu untersuchenden Mikroorganismus,
(b) Einbringen der cDNA oder DNA der Genbank in das Genom von Retroviren oder als zusätzliche vRNA von modifizierten Influenzaviren, die eine erhöhte Transkriptions-, Replikations- und/oder Expressionsrate relativ zu dem Wildtyp aufweisen, um rekombinante Viruspartikel zu erhalten,
(c) Infizieren von immortalisierten autologen Zellen, die MHC Klasse I- und/oder MHC Klasse D-Moleküle auf ihrer Oberfläche exprimieren, mit den in Schritt (b) erhaltenen rekombinanten Viruspartikeln,
(d) Exprimieren von durch die cDNA oder die DNA der Genbank kodierten Proteinen in den autologen Zellen und Präsentieren der von der autologen Zelle erzeugten Spaltprodukte dieser Proteine auf der Zelloberfläche in Verbindung mit MHC Molekülen,
(e) Co-Kultivieren von T-Zellen mit den autologen Zellen, (f) Stimulieren der T-Zellen durch solche autologen Zellen, die ein durch die T-Zellen erkanntes Antigen auf ihrer Zelloberfläche präsentieren,
(g) Vereinzelung der Klone, die das Antigen exprimieren, und Identifizierung des Antigens
2 Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als Zelle eine tierische oder humane Eukaryontenzelle ausgewählt wird
3 Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Eukaryontenzelle eine Tumorzelle oder eine durch einen Mikroorganismus infizierte Zelle eingesetzt wird
4 Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine durch ein Virus oder ein Bakterium oder einen Pilz oder eine Protozoe oder aus einer Kombination eines oder mehrerer dieser Mikroorganismen infizierte Zelle eingesetzt wird
5 Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß von der cDNA oder der DNA der Genbank abgeleitete Negativstrang RNAs in ein oder mehrere Segmente der modifizierten Influenzaviren und/oder als zusätzliches Segment in die modifizierte Influenzaviren eingebracht werden
6 Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als modifizierte Influenzaviren modifizierte Influenza-A-Viren und als Retroviren amphotrope oder pseudotypisierte Retroviren sowie Lentiviren eingesetzt werden
7 Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Herstellung der Negativstrang-RNA durch Transkription der pseudoviralen Gensegmente mit der RNA-Polymeiase I erfolgt
8 Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach Schπtt (b) durch Selektion eine Anreicherung der rekombinanten Viruspartikel erfolgt und/oder die rekombinanten Viruspartikel isoliert werden
9 Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltprodukte der Proteine in Verbindung mit MHC Klasse I oder MHC Klasse II auf der B-Zelle präsentiert werden
10 Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulation der antigenspezifischen T-Zellen durch Freisetzung von Zytokinen, durch Prohferation der T-Zellen oder durch Nachweis der zytotoxischen Aktivität der T-Zellen gemessen wird
1 1 Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Freisetzung der Zytokme durch em ELISA Verfahren nachgewiesen wird
12 Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach Einbringen der cDNA oder der DNA der Genbank eine Ubeπnfektion mit Wildtyp Influenza- Virus erfolgt
13 Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Immortalisierung der autologen Zellen mit Hilfe von EBV-Genen oder Onkogenen erfolgt
14 Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Co-Kultivierung der B Zellen mit T Helferzellen bei MHC Klasse II restringierten Antigenen und mit zytotoxischen T Zellen bei MHC Klasse I restringierten Antigenen erfolgt
15 Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Genbank oder cDNA-Bank aus einem Virus, einem Bakterium, einem Pilz oder einem Protozoen hergestellt wird
16 Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als autologe Zellen B Zellen oder dendritische Zellen eingesetzt werden
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