WO2001018545A2

WO2001018545A2 - Verfahren zur identifizierung von bindungspartnern mit positions-spezifischen arrays

Info

Publication number: WO2001018545A2
Application number: PCT/DE2000/003071
Authority: WO
Inventors: Eberhard Krause; Thomas Bittorf; Jens Schneider-Mergener
Original assignee: Jerini Ag
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2001-03-15
Also published as: WO2001018545A3; DE19943743A1; JP2003511652A; EP1212622A2; AU7644200A; PL353995A1; CZ2002660A3; HUP0203074A2; DE10082703D2; DE19943743C2; CA2386607A1

Abstract

Beschrieben ist ein Verfahren zur massenspektrometrischen Identifizierung von Bindungspartnern mit positionsspezifischen Arrays, wobei man auf einem Trägermaterial mittels positionsspezifisch aufgebrachter kleiner Volumina von Reaktionspartnern ein positionsspezifischer Ligat-Array herstellt, wobei man schrittweise mindestens zwei aufeinander folgende Reaktionen ausführt, das auf dem Trägermaterial fixierte positionsspezifische Ligat-Array mit einem Gemisch von Liganden inkubiert, anschliessend nicht an das Ligat-Array gebundene Liganden entfernt und der/die an das Ligat-Array gebundene/n Ligand/en weiter mittels Massenspektrometrie charakterisiert.

Description

Verfahren zur Identifizierung von Bindungspartnern mit positions-spezifischen Arrays

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur mas- senspektrometrischen Identifizierung von Bindungspartnern mit positions-spezifischen Arrays.

Mit der fortschreitenden Entschlüsselung des menschlichen Genoms wird es mehr und mehr offensichtlich, daß die

Funktion von Genen sowie das Verhalten von Genprodukten sehr schwierig oder in den meisten Fällen unmöglich vorherzusagen ist. Aus diesem Grund wird es immer wichtiger, Verfahren zu entwickeln, um die Funktion von Genen zu er- mittein. Die Funktion setzt sich dabei im wesentlichen aus dem dynamischen Auftreten und Verschwinden der Proteine und ihre Interaktion mit Liganden zusammen, die in der Mehrzahl ebenfalls Proteine darstellen. Die Regulation der Funktion von Proteinen ist ein extrem komplizier- ter Prozeß, der auf verschiedenen Ebenen beeinflußt wird, so z.B. durch posttranslationale Modifikationen, ihre Halbwertszeiten, Kompartimentierung, aber auch dynamischen Veränderungen der Tertiärstruktur. Die Untersuchung der Funktion und der Interaktionen aller Proteine inner- halb einer Zelle wird „Proteomics" genannt (Dove, 1999; Hochstrasser, 1998), die Gesamtheit aller Proteine einer Zelle wird als „Proteom" bezeichnet. Dieses Forschungsgebiet wird einen enormen Einfluß auf die Identifizierung von Wirkstoffzielen, Wirkstoffzuschnitt und Wirkstoffent- deckung haben.

Die zur Darstellung des Proteoms einer Zelle derzeit fast ausschließlich verwendete Methode ist die zweidimensiona- le Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) . Die Protei- ne werden in der ersten Dimension durch eine isoelektrische Fokussierung getrennt. Eine dazu orthogonal ausge- ω Cü K. K) F-" P>

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Die im Augenblick vorhandene Methode der Wahl zur Identifizierung von zellulären interagierenden Partnern ist das „two-hybrid" Screeningsystem in Hefe (z.B. Colas und Brent, TIBTECH 1998, 16 S. 355-363). Dieser in vitro Ansatz führt jedoch oftmals zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen.

Die US 5,821,047 beschreibt einen weiteren aktuellen An- satz zur Identifizierung von zellulären interagierenden Partnern, das sogenannte „phage display" . Das Verfahren umfaßt die Fusion eines zu untersuchenden Proteins an die carboxyterminale Domäne des Gen III coat Proteins des fi- lamentösen Phagen M13. Mit diesem auf der Oberfläche des Phagen M13 präsentierten Fusionsprotein wird dann nach neuen Liganden des zu untersuchenden Proteins gescreent.

Eine weitere interessante und sich verbreitende Technik ist die Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Biomolekular- Interaktionsanalyse Massenspektrometrie (BIA/MS) (Nelson und Krone, 1999) . Es bleibt abzuwarten, wie sich dieser Ansatz im Hinblick auf Signifikanz der Daten als auch auf nötige Automatisierung als praktikabel erweisen wird.

Dazu werden auf Cellulosemembranen mit der sogenannten

„Spot-Synthesetechnik" synthetisierte Peptide verwendet, um molekulare Erkennungsereignisse zu untersuchen.

Alle oben beschriebenen Verfahren zur Analyse des Pro- teoms und der Untersuchung im Bereich der Proteomics weisen erhebliche Nachteile auf. Sie sind experimentell aufwendig und zeitintensiv und erfassen bei der Analyse nicht alle Proteine einer Zelle auf einmal. Die 2D-PAGE ist zudem für viele Proteine nicht sensitiv genug und für die Proteomics-Analyse ungeeignet, da sie keine Interaktionen von Proteinen einer Zelle erfassen kann.

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Besonders bevorzugt ist es, wenn als Zelllysat ein ³⁵S- Methionin-markiertes oder ³⁵S-Cystein-markiertes Lysat verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß das Zelllysat zusammen mit mindestens einem definierten Cofaktor verwendet wird. Als Cofaktoren können zum Beispiel Proteine oder Metallionen verwendet werden.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray verwendeten Peptide zwischen 3 und 30 Aminosäuren lang sind. Bevorzugt sind Peptide zwischen 6 und 15 Aminosäuren Länge, besonders bevorzugt sind Peptide von 13 Aminosäuren Länge. Besonders bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Ausführungsform, bei der die für das Peptidarray verwendeten Peptide über einen Linker an das Trägermaterial fixiert sind. Dieser Linker kann Protease-sensitiv oder chemisch spaltbar sein.

Ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Peptidarray ein SPOT-Peptidarray ist.

Nicht an das Peptidarray gebundenes Protein kann erfindungsgemäß mittels Waschen mit einem Puffer oder durch Fällung entfernt werden.

Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß das/die an das Peptidarray gebundene/n Protein/e vor der Proteasebehandlung vom Trägermaterial gelöst und anschließend einer Gelelektropho- rese unterzogen wird/werden. c co M N3 t-> cπ o Cπ O cπ o cπ

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ß-Blocker, cardiovascular aktive Verbindungen, Antarrhythmika, Antihistaminika, Tranquilantien, H₂- Blocker, Acidose-Therapeutika, Aminoglycosid-Antibiotika, Amoebicide, Anästhetika, Analgetica, Androgene, Antacida, Anthel intica, Antiallergika, Antiandrogene, Antibiotika, Anticholinergika, Anticoagulantien, Anticonvulsiva, Anti- dote, Antiemetica, Antifibrinolytika, Antihypertensiva, Antihypertonica, Antihypotonica, Antimalariamittel, An- timycotica, Antiparkinson-Mittel, Antiphlogistika, Antip- soriatica, Antipyretica, Antirhematica, Antiscabiasa, An- tiseborrhoica, Antiseptica, Antitumormittel, Antitussiva, Atemanaleptika, Bronchiolytika, Calciumantagonisten, Car- diotonica, Cerebrotonica, Chemotherapeutica, Cholesterin- senker, Cytostatika, Dehydropeptidase- Inhibitoren, Des- infizentia, Diagnostika, Diuretica, Expektorantien, Fi- brinolytika, Fungicide, Gestagene, Glucocorticoide, Gona- dorelin (LH-RH) -Agonisten, Hypnotica, Immunstimulantien, Immunsuppressiva, Keratolytika, ß-Lactamase-Inhibitoren, Laxativa, Lebertherapeutika, LichtSchutzmittel, Lipidsen- ker, Lipolyselnhibitoren, Lipotropica, Lokalanästhetika, Malariamittel, Miotica, Muskelrelaxantien, Mydriatica, Neuroleptika, Neurotropica, Ophthalmologika, Parasympa- thicomimetika, Prostatatherapeutika, Protelytika, Phy- chotropika, Rhinologika, Röntgenkontrstmittel, Sedativa, Spasmolytika, Spermatocide, Sympathicomimetika, Throm- bocyten-Aggregationshe mer, Trypsin-Inhibitoren, Tuberku- lostatika, Ulcustherapeutika, Vasoconstrictoren, Vasodi- latatoren, Venemittel, Virustatica, Vitamine) oder Naturstoffe (beispielsweise Ξteroide, Terpene, Alkaloide, Fla- vonoide, Fettsäuren, Lipide, Pheromone, Riechstoffe, Antikörper, Hormone, Gifte, Abwehr-, Signal- und Wuchsstoffe, Enzyme) und andere als die oben genannten organoche- mischen Verbindungen.

Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben werden. ω IS- N. P¹ o Cπ O cπ O cπ

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Figur 4 zeigt ein MALDI Mass Fingerprint des Spots E2 (Thyrosin-Protein-Kinase JAK3) .

Figur 5 zeigt die MS-Fit-Rechnung des Spots E2 aus Figur 4 dar

Figur 6 zeigt die ³⁵S-Aktivität nach Inkubation einer Bibliothek aus 1600 Dipeptoiden mit ³⁵S-Methionin markiertem Zell-Lysat.

Identifizierung von Bindungspartnern des Erythropoetin-

Rezeptors mit positions-spezifischen Peptidarrays und

Massenspektrometrie

Um potentielle intrazellulär interagierende Partner des Erythropoetin Rezeptors (EPOR) zu identifizieren, wurden Zelllysate von Erythropoetin (EPO) stimulierten und nicht-stimulierten Zellen mit Cellulosemembran-gebundenen EPOR-spezifischen Peptidscans inkubiert, der Proteingehalt verschiedener ausgewählter Spots einer Gelelektro- phorese unterzogen und distinkte Banden mittels Massenspektrometrie analysiert.

In früheren Experimenten konnte gezeigt werden, daß Inkubation eines Sets von an eine Cellulosemembran gebundenen überlappenden Peptiden, die vom cytoplasmatischen Teil des 55 kDa Tumor-Nekrosisfaktor Rezeptor (TNF-R55) stammten, mit einem ³⁵S-Methionin markierten Jurkat Zelllysat zu einer Bindung von zellulären Proteinen an distinkte Spots des TNF-R Scans führte. Die durch diesen Ansatz hervorgehobenen TNF-R Regionen entsprachen exakt den vorher als für die verschiedenen biologischen Funktionen dieses Rezeptors verantwortlich beschriebenen intrazellulären TNF-R Regionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß ein durch das Hefe „two-hybrid" System neu entdecktes Protein FAN spezifisch mit distinkten Spots des TNF-R

Scans interagierte, der einer Region entsprach, die für die Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase bekannt ist. Die Verwendung der zwei Techniken führte deshalb zu einer relativ schnellen Identifizierung eines neuen an der TNF Signalkaskade beteiligten Proteins. Dennoch war dieser Prozeß relativ arbeitsaufwendig, da eine große Zahl von durch das „two-hybrid" System erhaltenen cDNA Klonen (>50) auf eine Bindung an eine bestimmte Region des Rezeptors hin zu charakterisieren waren.

Um einen direkteren Weg zur Identifizierung von interagierenden Partnern in der zellulären Signalkaskade unter Umgehung des Hefe „two-hybrid" Systems zu untersuchen, wurde versucht, Proteine direkt von den Spots zu erhalten und diese sie durch tryptischen Verdau, Massenspektrome- trie und Datenbankanalyse zu analysieren. Um diesen neuen experimentellen Ansatz zu testen, wurde in diesem Fall ein Cellulosemembran-gebundener von EPO-R stammender Pep- tidscan synthetisiert, der dann mit EPO-ansprechenden J2E Erythroleukämischen Zelllysaten inkubiert wurde, die mit ³⁵S-Methionin/Cystein markiert waren (siehe Figur 1) . Es konnte eine Bindung an distinkte Rezeptor-spezifische Spots beobachtet werden. Überraschenderweise gab es einen klaren Unterschied in der Bindung bei der Verwendung eines Lysats einer mit EPO stimulierten J2E Zelle.

Die intrazellulären Domänen der Cytokinrezeptoren sind bekannterweise aus strukturellen Modulen für die Bindung von spezifischen zellulären Signalproteinen zusammengesetzt. Es wird vermutet, daß die Fähigkeit, mit bestimm- ten Targets zu interagieren, Kompetenz und Spezifität bei der Regulation der Genexpression bewirkt. Um eine neue Strategie zur Analyse der Interaktionen zwischen zellulären Proteinen und Peptiden, welche die intrazelluläre Domäne des EPO Rezeptors repräsentieren, zu untersuchen, wurden durch die Spot-Synthese hergestellte Cellulose- gebundene Peptide angewendet. Zelluläre Proteine der o U) f . M P¹ cπ o cπ O cπ O cπ

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JAK2 mit stark carboxyterminal trunkierten Rezeptorformen Immunopräzipitiert . Zusätzlich beseitigen Mutationen in der Region nahe der Membran die JAK2-Bindung und - Funktion gleichermaßen. Eine zweite Interaktionsstelle wurde in einem mehr distalen Teil des Rezeptors identifiziert. Interessanterweise bindet SHPl, eine Tyrosinphos- phatase, die bekannterweise funktioneil an der EPO- induzierten Signalkaskade beteiligt ist, mit hoher Affinität an dieselben Peptide, die Aminosäuren 386-398 und ebenso an die proximale Membran-Aminosäuresequenz wie für JAK2. Es wurde früher gezeigt, daß die Phosphatase, welche die SH2-Domäne enthält, an das Phosphotyrosin 429 im carboxyterminalen Teil des aktivierten Rezeptors bindet. Die hier vorgelegten Ergebnisse wurden mit unphosphory- lierten Peptiden erhalten, obwohl eine Phosphorylierung durch eine Kinase, die in dem für die in vitro Translation verwendeten Reticulocytenlysat vorliegen könnte nicht vollständig auszuschließen ist. Das Bindungsmuster zeigt, daß vielleicht zusätzliche Interaktionen unabhängig von einer Phosphorylierung existieren. JAK2 und SHPl wurden als funktional zusammenhängend beschrieben und interagie- ren ebenso in in-vitro Experimenten. Wie oben genannt, enthält das für die in vitro Translation verwendete Lysat zusätzliche nichtradioaktive Proteine, die in der Bin- dungsreaktion stören können. Dies könnte eine Erklärung dafür sein, daß JAK2 an die bevorzugte SHPl Stelle bindet und umgekehrt. Wenn Bindung von „kaltem" JAK2 und SHPl an die Peptide annehmen, kann radioaktives Jak2 und SHPl wechselwirken und dadurch indirekt an die Peptide gebun- den werden. Die genaue Stelle der Interaktion für PLCγ und den EPOR ist bisher noch nicht beschrieben. Ob PLCγ- Bindung eine Bindung an spezifische Tyrosine innerhalb des EPOR benötigt, bleibt festzustellen. Unsere Daten deuten auf eine Bindungsdomäne in der Nähe des C-Terminus hin, die möglicherweise zu der vorgeschlagenen SH2- Phosphotyrosin Interaktion führt. Um den oben beschriebenen Ansatz weiter zu vertiefen, wurde untersucht, ob es möglich ist, Proteine zu identifizieren, die an Peptide gebunden sind, welche von der Rezeptorsequenz stammen. Dazu wurden Peptide verwendet, die eine starke Interaktion mit zellulären Proteinen zeigten, mit Zelllysaten inkubiert und die Proteine nach ausgiebigem Waschen wie beschrieben eluiert. Nach Trennung auf Acrylamid wurden diese Proteine gefärbt, in-Gel enzymatisch verdaut, die Fragmente isoliert und einer Massenspektrometrie unterzogen. Die Reinheit und Menge der in den Gelbanden vorhandenen Proteine war für absolut ausreichend, um die aus den Peptidspots erhaltene Proteinspezies über Peptid Mass Fingerprints zu identifizie- ren. Einige dieser Proteine sind für Funktionen in Zusammenhang mit EPOR nicht beschrieben. Zum Beispiel wurde die Janus Kinase JAK3, von der bekannt ist, daß sie an IL-2, 4, 7, 9, 15 Signalkaskaden beteiligt ist, als ein Bindepartner von Peptiden aus der EPOR-Sequenz identifiziert (Figur 4 und Figur 5) . Weitere Untersuchungen über die funktioneile Relevanz der identifizierten Proteine folgen.

In-Gel-Verdau Ein von Shevchenko et al. (1) verwendetes und leicht mo- difiertes In-Gel-Verdau Verfahren wurde angewendet. Die Proteinspots wurden ausgeschnitten, mit 50% Acetonitril in 25 mM Ammoniumbicarbonat, durch Dehydrierung in Acetonitril geschrumpft und in einer Vakuumzentrifuge getrock- net.

Die Gelstücke wurden 10 μl 5 mM Ammoniumbicarbonat mit 300 ng Trypsin aufgequollen. Nach 60 min, wurde 5 μl 5 mM Ammoniumbicarbonat hinzugefügt, um die Gelstücke während des tryptischen Verdaus feucht zu halten (37 °C, über

Nacht). Um die Peptide zu extrahieren, wurden 15 μl 0,5% Trifluoressigsäure (TFA) in Acetonitril hinzugefügt und die Proben für 5 min beschallt. Die Peptide wurden direkt aus der abgetrennten Flüssigkeit mittels MALDI Massenspe- trometrie analysiert.

MALDI Massenspetrometrie und Datenbanksuche Die massenspektrometrischen Messungen wurden auf einer Voyager-DE STR BioSpectrometrie Workstation MALDI-TOF Massenspektrometer (Perseptive Biosystems, Inc.) durchge- führt. 2 μl der Analyselösung wurde mit 2 μl alpha-Cyano- 4-hydroxyzimtsäure (4-HCCA) Matrixlösung, bestehend aus 10 mg Matrix in 1 ml 0,3% TFA in Acetonitril-Wasser (1:1, v/v) gelöst, gemischt. Von der erhaltenen Mischung wurde 1 μl auf die Probenplatte aufgebracht. Die Proben wurden bei Raumtemperatur (24 °C) luftgetrocknet. Alle Messungen wurden im Reflektionsmodus bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV, 70% Gitterspannung und einer Verzögerung von 200 ns durchgeführt. Jedes erhaltene Spektrum war das Mittel aus 256 Laserbeschüssen. Die Massenspektren wurden unter der Verwendung bekannter Trypsinfragmente als interne Standards kalibriert. Die bestimmten Peptidmassen wurden mit theoretischen Massen von Proteinen aus der NCBInr.11.09.98 Datenbank unter der Verwendung des Suchprogramms MS-FIT verglichen (http://falcon.ludwig.ucl.ac.uk/msfit.htm) .

Bestimmung von Bindungspartnern einer Peptoid-Bibliothek Eine Bibliothek aus 1600 Dipeptoiden (Membrangröße: 9 cm x 9 cm) der allgemeinen Formel I

worin Ri und R₂ für beliebige Reste stehen, wurde mit einem ³⁵S-Methionin markiertem Zell-Lysat inkubiert. Die Positionen A, B und C, stellen dabei die folgen Verbindungen dar:

Dipeptoid A

Dipeptoid B

Dipeptoid C

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur massenspektrometrischen Identifizierung von Bindungspartnern mit positionsspezifischen Arrays, wobei man auf ein Trägermaterial mittels positionsspezifisch aufgebrachter kleiner Volumina von Reaktionspartnern ein positionspezifischer Ligat-Array herstellt, wobei man schrittweise mindestens zwei aufeinander folgende Reaktionen ausführt, das auf dem Trägermaterial fixierte positionsspezifische Ligat-Array mit einem Gemisch von Liganden inkubiert, anschließend nicht an das Ligat-Array gebundene Liganden entfernt und der/die an das Ligat-Array gebundene/n Ligand/en weiter mittels Massenspektrometrie charakterisiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Ligat-Array ein Peptidarray, Array aus Nucleinsäuren oder anderen organochemischen Verbindungen oder über Fragmentkondensation von Peptiden erhaltenes Proteinarray ist.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch von Liganden ein Zelllysat, Gemisch von Nucleinsäuren oder Gemisch von anderen organochemischen Verbindungen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man auf einem Trägermaterial mittels positionsspezifisch aufgebrachter kleiner Volumina von Reaktionspartnern ein positionspezifischer Peptidarray her- stellt, das auf das Trägermaterial fixierte positions- spezifische Peptidarray mit einem Zelllysat inkubiert, anschließend nicht an das Peptidarray gebundenes Protein entfernt und das/die an das Peptidarray gebundene/n Protein/e nach Proteasebehandlung mittels Massenspektrometrie charakterisiert.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial fest oder flexibel ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial aus Harzbeads, Po- lymerpins oder Chipmaterial besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial aus einer Polymermembran besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial aus einer Nylon-, Cellulose-, modifizierten Cellulose- oder modifizierten Polypropylenmembran besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein Vollzelllysat verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein durch Zentrifugation, Filtration oder andere geeignete Verfahren vorfraktioniertes Vollzelllysat verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekenn- zeichnet, daß man als Zelllysat ein Lysat aus pro- karyontischen oder eukaryontischen Zellen verwendet.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein Lysat aus transformierten Zellen verwendet.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein ³⁵S- Methionin- oder ³⁵S-Cystein-markiertes Lysat verwendet.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zelllysat zusammen mit mindestens einem definierten Cofaktor verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Cofaktoren Proteine oder Metallionen verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray verwendeten Peptide zwischen 3 und 30 Aminosäuren lang sind.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray verwendeten Peptide zwi- sehen 6 und 15 Aminosäuren lang sind.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray verwendeten Peptide 13 Aminosäuren lang sind.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Ligat-Array verwendeten Ligate über einen Linker an das Trägermaterial fixiert sind.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker Protease-sensitiv ist.

21. Verfahren nach Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet, daß der Linker chemisch spaltbar ist.

22. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Peptidarray ein SPOT-Peptidarray ist .

23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Charakterisierung der Liganden mittels MALDI oder ESI Massenspektrometrie erfolgt.

24. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht an das Peptidarray gebundene Prote- in mittels Waschen mit einem Puffer entfernt.

25. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht an das Peptidarray gebundene Protein durch Fällung entfernt.

26. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das/die an das Peptidarray gebundene/n Protein/e vor der Proteasebehandlung vom Trägermaterial löst und anschließend einer Gelelektrophorese unter- zieht.

27. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Charakterisierung der Protease-behandelten Proteine mittels MALDI oder ESI Massenspektrometrie erfolgt.

28. Roboter zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorgenannten Ansprüche.