WO2000063388A1 - Nouvelle aspartokinase desensibilisee - Google Patents

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WO2000063388A1
WO2000063388A1 PCT/JP2000/002456 JP0002456W WO0063388A1 WO 2000063388 A1 WO2000063388 A1 WO 2000063388A1 JP 0002456 W JP0002456 W JP 0002456W WO 0063388 A1 WO0063388 A1 WO 0063388A1
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dna
lysine
coryneform bacterium
amino acid
seq
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PCT/JP2000/002456
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French (fr)
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Haruhiko Yokoi
Junko Ohnishi
Keiko Ochiai
Yoshiyuki Yonetani
Akio Ozaki
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • the present invention relates to a novel aspartokinase derived from a coryneform bacterium, which encodes the enzyme
  • the present invention relates to a method for producing L-lysine. Scenic fe
  • the following method is known as a method for producing L-lysine by fermentation using a microorganism belonging to the genus Corynepacterium.
  • L-lysine-producing mutant for example, S- (2-aminoethyl) -cystine (hereinafter abbreviated as AEC) resistant mutant (amino acid fermentation, 1986, p. 273, Gakkai Shuppan Center) ), L-homoserine-requiring mutant (amino acid fermentation, 1986, p. 273, Gakkai Shuppan Sen-ichi), respiratory inhibitor-resistant mutant (Tokuhei 5-55114), pyrimidine analog-resistant mutant (Japanese Unexamined Patent Publication No. -88094) and purine analog-resistant mutants (JP-B-63-062199) are known.
  • AEC S- (2-aminoethyl) -cystine
  • AK aspartokinase
  • desensitized AK Mutant AK from which this feedback inhibition has been released (hereinafter abbreviated as desensitized AK) is It is known that microorganisms belonging to the genus Corynepacterium that carry a gene (hereinafter abbreviated as desensitized AK gene) secrete L-lysine outside the cells (amino acid fermentation, 1986 , P. 273, Academic Publishing Center).
  • the wild-type gene can be mutated by combining it with a technique that converts the nucleotide sequence to the desired one in a test tube (for example, using the Strak Gene QuikChange site-directed mugenesis kit). Can be converted to a type.
  • a technique that converts the nucleotide sequence to the desired one in a test tube for example, using the Strak Gene QuikChange site-directed mugenesis kit.
  • An object of the present invention is to convert AK, a key enzyme of L-lysine biosynthesis in coryneform bacteria, to a desensitized form which is released from concerted feedback inhibition by L-lysine and L-threonine and feedback inhibition by lysine alone. It should be modified to make it advantageous for L_lysine production.
  • the present inventors have conducted intensive studies on an efficient method for producing L-lysine by coryneform bacteria, and found that L-lysine and L-threonine have released concerted feedback inhibition, and that L-lysine alone can be used as a filter.
  • the present inventors have found that a strain having a desensitized AK from which debac inhibition has been released has excellent L-lysine-producing ability, and completed the present invention.
  • the present invention relates to the following (1) to (12).
  • coryneform bacterium is a genus Corynebacterium or Brevibacterium
  • a recombinant DNA capable of being replicated in a coryneform bacterium obtained by incorporating any one of the above DNAs (1) to (3) into a vector.
  • a microorganism or a transformant selected from the coryneform bacterium of the above (5) and the transformant of the above (6) and (7) is cultured in a medium, and L-lysine is produced and accumulated in the culture.
  • a method for producing L-lysine comprising collecting L-lysine from the culture.
  • a DNA encoding aspartokinase which is derived from a coryneform bacterium and has a base sequence in which the amino acid residue at position 31 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 is Thr.
  • a DNA encoding the aspartokinase of the above (1) can be prepared.
  • the microorganism that supplies the DNA containing the gene encoding AK may be any microorganism that belongs to coryneform bacteria and has AK activity. No.
  • Examples of the coryneform bacterium in the present invention include the genus Agrococcus, the genus Agromyces, the genus Arthrobacter, the genus Aureobacterium, and the genus Levibacterium.
  • Preferable examples include bacteria belonging to the genus Corynebacterium and the genus Brevipacterium. As specific examples, for example, the following strains are used.
  • Corynebacterium guru mimic ATCC13032 Corynebacterium guru mimic ATCC13869 Corynebacterium guru micam ATCC13870 Corynebacterium carnae ATCC15991 Corynebacterium acetoglu micam ATCC15806.
  • the wild-type strain supplies the wild-type AK gene, which is subject to feedback inhibition by L-lysine or L-lysine and L-threonine.
  • a mutation operation from a wild-type strain for example, N-methyl- ⁇ '-nitro --- ⁇ Method using torsogazine (NTG); Microbial Experiment Manual, 1986, p. 131, Kodansha Scientific Inc.
  • mutants include L-lysine-producing bacteria induced by mutation treatment from the wild-type strain of C.
  • glutamicum ATCC13032 or the wild-type ⁇ gene
  • NTG method or the in vitro mutation method eg, hydroxyl A method using an amine; including a desensitized AK gene, which is induced by mutation in the gene by Molecular and General Genetics, 145, 101 (1978), and is desensitized using AEC resistance and L-lysine productivity as an index. Stocks, etc. can be given.
  • the AK gene was obtained from a strain containing the AK gene, for example, by the method of Saito et al. [Biochimica et Biophysica Acta, 72, 619 (1963)]. That is, chromosomal DNA is prepared and cut with an appropriate restriction enzyme. After cleavage, the obtained fragment is ligated to a vector (for example, plasmid) capable of autonomous replication in the microorganism, and this is introduced into a host microorganism lacking AK activity. It can be obtained by isolating a transformant capable of expressing AK activity from the microorganism and isolating the gene from the transformant.
  • a vector for example, plasmid
  • any microorganism that can express the AK gene of a coryneform bacterium can be used.
  • Preferable is an AK-deficient strain of Escherichia coli.
  • Any vector capable of autonomous replication can be used as long as it can autonomously replicate in a microorganism into which the vector has been introduced.
  • pUC18 Takara Shuzo
  • One vector such as pBluescriptSK (-) (manufactured by Toyobo), is a vector that can replicate autonomously in Escherichia coli, and a vector, such as pCE54 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-105999), is a vector that can replicate autonomously in both Escherichia coli and coryneform bacteria. be able to.
  • pBluescriptSK manufactured by Toyobo
  • pCE54 Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-105999
  • Ligation of the vector and the DNA fragment containing the AK gene can be performed by a usual method using T4 DNA ligase or the like.
  • introduction into a host can be performed by the method of Hanahan et al. [Journal of Molecular Biology, 166, 557 (1983)].
  • the AK gene can be isolated and obtained by the following method.
  • Oligomeric DNA was synthesized based on the already known base sequence information of the AK gene derived from Corynebacterium gullica micam [eg, GenBank Accession No. E06825], and the DM was used as a primer, A DNA fragment containing the gene is amplified and isolated by PCR. The DNA fragment is ligated to a vector having a selectable marker gene and introduced into an appropriate host microorganism such as Escherichia coli or coryneform bacterium. The AK gene can be obtained by isolating the vector introduced from the microorganism. It is not necessary to use an AK-deficient strain for the host microorganism.
  • any vector can be used as long as it can replicate autonomously in coryneform bacterium. May be.
  • pCGl JP-A-57-134500
  • pCG2 JP-A-58-35197
  • PCG4 JP-A-57-183799
  • pCGll JP-A-57-134500
  • pCG116 pCE54
  • pCBlOl All of which are JP-A-58-105999
  • pCE51, pCE52, pCE53 [Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)]
  • pCS299P showing the production process in the present invention.
  • those having a relatively small size such as pCG116 and pCS299P, having many closing sites, and having a selectable marker gene such as a drug resistance gene are used.
  • Methods for introducing the above recombinant DNA into coryneform bacteria include the protoplast method (for example, JP-A-57-186492 and JP-A-57-18649), electroporation [for example, Journal of Bacteriology, 175, 4096]. (1993)].
  • the coryneform bacterium having the DNA encoding the novel AK of the present invention on the chromosome may be any coryneform bacterium containing the AK gene on the chromosome.
  • microorganisms having the DNA fragment artificially inserted into the chromosome can be mentioned by, for example, “Society 1” for “Micro mouth biology”.
  • L-lysine By culturing the transformed strain belonging to the coryneform bacterium having the DNA containing the novel AK gene obtained as described above, L-lysine can be produced and accumulated in the culture solution.
  • an ordinary nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like can be used as a culture medium.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, maltose, and starch hydrolysate, alcohols such as ethanol, and organic acids such as acetic acid, lactic acid, and succinic acid can be used.
  • Nitrogen sources include various inorganic and organic ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, and ammonium acetate, urea, Other nitrogen-containing compounds and nitrogen-containing organic substances such as meat extract, yeast extract, corn 'steep' liquor, and soybean hydrolyzate can be used.
  • the inorganic salts there can be used dihydrogen phosphate phosphate, dihydrogen phosphate phosphate, ammonium sulfate, sodium chloride, magnesium sulfate, calcium carbonate, and the like.
  • trace nutrients such as biotin and thiamine can be added as needed.
  • These micronutrients can also be replaced by media additives such as meat extract, yeast extract, corn 'steep' liquor, casamino acids and the like.
  • Cultivation is performed under aerobic conditions such as shaking culture and deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 20 to 40 ° C.
  • the pH in the medium is preferably maintained near neutrality.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia and the like.
  • the culture period is usually 1 to 6 days.
  • L-Lysine can be recovered from the resulting culture by a known method such as activated carbon treatment or ion exchange resin treatment.
  • Fig. 1 is a diagram showing the construction process of PCS299P. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Shuttle plasmid PCS299P capable of autonomous replication in both Escherichia coli and coryneform bacteria was prepared by the following method.
  • PCG116 Bio / Technology, 11, 921 (1993) was cut with (manufactured by Takara Shuzo) to obtain an il digested fragment.
  • the strain was added to 10 g of LB agar medium containing 20 g / ml kanamycin [Pactotryptone (Difco), 5 g of yeast extract (Difco), 10 g of sodium chloride, and 16 g of Pactagar (Difco) in water. On a medium containing 1 L and adjusted to pH 7.0] to select a transformant. The transformant was cultured overnight in an LB medium containing 20 zg / ml kanamycin, and a plasmid was prepared from the obtained culture solution by the alkaline SDS method (Molecular- 1 'Cloning 2nd edition). pCS116-299Bgll DNA was obtained.
  • the restriction enzyme cleavage site of PCS116-299Bgll was confirmed by a conventional method.
  • Corynepterium and ammoniagenes ATCC6872 were transformed by electroporation using pCS116-299Bgll DNA [FEMS Microbiology Letters, 65, 299, (1989)].
  • a plasmid was extracted from the transformant in a conventional manner, and the plasmid was cleaved with a restriction enzyme to confirm that the plasmid was pCS116-299Bgll.
  • pCS116-299Bgll DNA was digested with ⁇ 1 (Takara Shuzo) and ⁇ 11 and purified by ethanol precipitation.
  • a partially deleted plasmid was obtained from the obtained DNA using a deletion kit for kilosequencing (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method.
  • the strain was cultured on an LB agar medium containing 20 g / ml kanamycin, and a transformant was selected.
  • the transformant was cultured overnight in an LB medium containing 20 ⁇ g / ml: Plasmid was prepared by the method. Restriction enzyme maps of each of the obtained plasmids were prepared according to a conventional method, and plasmids having different partial deletion lengths were selected.
  • the selected plasmid was used to transform Corynebacterium 'Ammoniagenes ATCC6872 by electroporation.
  • the resulting transformant is spread on a CM agar medium containing 20 zg / ml kanamycin and cultured at 30 ° C for 2 days.
  • Corynepacteria ammonia ammoniagenes is used as an index based on the appearance of kanamycin resistant colonies.
  • a plasmid capable of autonomous replication was selected.
  • the plasmid having the longest deletion region among the plasmids having autonomous replication ability was selected, and this plasmid was designated as pCS299del6.
  • pCS299del6 DNA was prepared from the transformant according to a conventional method, it was cleaved with restriction enzymes ⁇ pI and PvuH (both from Takara Shuzo). After fractionating the cleaved DNA fragment by agarose gel electrophoresis, an approximately 2.7 kb MA fragment having DNA derived from pCG116 was separated and extracted and purified using DNAprep (manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.).
  • pBluescript SK (+) (Toyobo Co., Ltd.) DNA was cut with ⁇ RV (Takara Shuzo) according to a conventional method. The obtained cut DNA fragment was concentrated by an ethanol precipitation method, and then treated with alkaline phosphatase. The treated DNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis, and extracted and purified using DNA prep.
  • the ligated DNA was used to transform Escherichia coli NM522 according to a conventional method.
  • the strain was treated with 100 ⁇ g / ml of ampicillin, 50 ⁇ g / ml of X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-? -D-galactoside), and 1 ol / l of IPTG (isopropylthio- Transformants were selected by culturing on LB agar medium containing ⁇ -D-galactoside).
  • the transformant was cultured overnight in an LB medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin, and a plasmid was prepared from the resulting culture by the Arikari SDS method. Restriction enzyme maps of the obtained plasmids were prepared according to a conventional method.
  • the plasmid that generates fragments of 3.4 kb and 2 kb by ⁇ RI digestion was designated PCSSK21.
  • the DNAs shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 were synthesized, and these DNAs were used as primers for pHSG299 DNA.
  • the PCR reaction was performed using Taq DNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the attached reaction conditions. After the reaction product was precipitated with ethanol according to a conventional method, it was cleaved with restriction enzymes ⁇ 1 and ⁇ I (Takara Shuzo). The cleaved DNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis, and the obtained DNA fragment of about 1.3 kb was extracted and purified using DNA prep.
  • the DNAs shown in SEQ ID NOS: 3 and 4 were synthesized, and PCR was performed using these DNAs as primers, pHSG299 DNA as type III, and Taq DNA polymerase according to the attached reaction conditions.
  • the reaction product was precipitated with ethanol according to a conventional method, and then cleaved with restriction enzymes l and il.
  • the cleaved DNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis, and the obtained DNA fragment of about 1.3 kb was extracted and purified using DNA prep.
  • the plasmid PCSSK21 obtained above was cut using ⁇ II (manufactured by Takara Shuzo) and each other.
  • the cleaved DNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis, and the obtained DNA fragment of about 2.7 kb was extracted and purified using DNA prep. After mixing and purifying the above three types of MA fragments extracted and purified, they were ligated using a ligation kit ver.
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method.
  • the strain was cultured on an LB agar medium containing 20 ⁇ g / ml of kanamycin, 50 ⁇ g / ml of X-Gal, and 1 ol / l of IPTG, and a transformant was selected.
  • the transformant was cultured overnight in an LB medium containing 20 g / ml kanamycin, and a plasmid was prepared from the resulting culture by the alkaline SDS method.
  • a restriction map of each of the obtained plasmids was prepared according to a conventional method, and the plasmid having the structure shown in FIG. 1 was designated as PCS299P.
  • Example 2 Production of mutant strain producing L-lysine and nucleotide sequence determination of AK gene derived from the strain Mutant treatment of Corynebacterium glutamicum wild-type strain (ATCC13032) with NTG (Microbial Experiment Manual, 1986, p.
  • the appearing colony was isolated, and a production test of L-lysine was performed by the method described in Example 5 described later, and a clone having improved productivity was selected. From one of the strains (AEC11 strain) and the wild-type strain ATCC13032, the AK gene was amplified by PCR as follows, and the nucleotide sequence was determined.
  • Chromosomal DNA was prepared from each strain by the method of Saito et al. [Biochimica et Biophysica Acta, 72, 619 (1963)].
  • a DNA primer for amplification was designed based on the nucleotide sequence of the AK gene [GenBank, Accession No. E06825], which is known in Corynebacterium 'Guruya micum ATCC13869 strain. The DNA primers are shown in SEQ ID NOS: 5 and 6.
  • PCR was carried out using a DNA polymerase derived from Phyrococcus sp. KOD strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and the attached buffer. PCR was performed for 30 cycles, with the reaction at 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds as one cycle.
  • the amplified DNA of about 1.5 Kb was purified using a PCR product sequencing kit (manufactured by Amersham-Pharmacia), and the purified DNA was subjected to cycle sequencing.
  • the DNA primer used for the sequencing reaction was designed based on the above AK gene base sequence. The DNA primers are shown in SEQ ID NOs: 7 to 16.
  • ABI Prism Die 'Yuichi Mine Ichiichi' Cycle Sequencing 'Lady's Reaction' Kit (PerkinElmer), 96 ° C-10 seconds, 50 ° C-5 seconds, A 25-cycle sequence reaction was performed using a reaction at 60 ° C. for 4 minutes as one cycle, and the nucleotide sequence was determined by ABI Prism 377 DNA Sequencing 'System (manufactured by Pachinkin Pharma Co., Ltd.).
  • SEQ ID NOS: 17 and 18 show the nucleotide sequence of the mutant AK gene derived from the AEC11 strain and the amino acid sequence of the corresponding open reading frame.
  • thymine at position 932 is Then it was cytosine.
  • the L-threonine residue at position 311 (codon ACC) of wild-type AK was replaced with an isoleucine residue (codon ATC) in the AK gene derived from the AEC11 strain.
  • Examples of the desensitizing mutation of the AK gene of Corynebacterium glutamicum include mutation of Ala279 to an amino acid other than Ala (JP-A-6-62866, JP-A-6-261766), Gly345Asp [Journal of Bacteriology, 175, 4096 ( 1993)], Ser301Tyr [Molecular Microbiology, 5, 1197 (1991)], Ser301Phe, Thr308Ile (all disclosed in JP-A-6-261766), etc., but this mutation did not correspond to any of them.
  • the AK gene was cloned from Corynebacterium glutamicum wild-type strain (ATCC13032) and L-lysine-producing AEC11 strain by PCR.
  • a 1.5 Kb gene fragment containing the AK gene derived from the ATCC13032 strain or the AEC11 strain obtained in the same manner as in Example 2 was treated with I and BamHI (Takara Shuzo), and then subjected to agarose electrophoresis. It was cut out from the gel and purified using Gene 'Clean' kit (BI0101).
  • Shuttle vector PCS299P capable of autonomous growth in both Escherichia coli and coryneform bacterium shown in Example 1 was cut with ⁇ 1 and ⁇ ⁇ ⁇ , and the Reigeshon kit ver. L (Takara Shuzo) was used to ligate to the above AK gene fragment.
  • Escherichia coli DH5 strain manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • was transformed according to the attached manual and colonies growing on an LB agar medium containing 100 / g / ml of ampicillin were isolated. These colonies were cultured, and plasmid DNA was prepared in the same manner as in Example 1.
  • the nucleotide sequence was determined by the method described in Example 2, and a clone containing no mutation in the PCR process was selected.
  • One of the plasmids containing the AK gene derived from the ATCC13032 strain obtained by the selection was named pAKl, and the plasmid containing the AK gene derived from the AECll strain was named pAK2.
  • pAKl One of the plasmids containing the AK gene derived from the ATCC13032 strain obtained by the selection
  • pAK2 the plasmid containing the AK gene derived from the AECll strain was named pAK2.
  • Plasmids ⁇ 1, pAK2 and PCS299P were introduced into Corynebacterium gullimicum wild-type strain ATCC13032 by electroporation [FEMS Microbiology Letters, 65, 299 (1989)].
  • the resulting strain carrying the plasmid pAK1 was designated as Tf-14, the strain carrying pAK2 as Tf-5, and the strain carrying pCS299PII as Tf-21.
  • the AK activity of these transformants was measured by the method of Foretty et al. [Journal of Bacteriology, 175, 4096 (1993)].
  • Table 1 shows the AK specific activity of the crude extract of the transformant.
  • Tf-5 not only lost the concerted inhibition by L-lysine and L-threonine, but also significantly released the feedback inhibition by L-lysine.
  • Tf-5 was deposited at the Research Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry (1-3 1-3 Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan) under the deposit number: FERM BP-6689 on April 2, 2001 Have been.
  • Example 5 Corynepac Effect of mutant AK on L-lysine production in Terium glutamicum The L-lysine-producing ability of Tf-5, Tf-14 and Tf-21 produced in Example 4 was evaluated by culture.
  • Each strain was seeded with a seed medium (50 g sucrose, 30 g soy hydrolyzate, 3 g urea, 20 g peptone, 20 g strength amino acid, 20 g meat extract, 0.5 g magnesium sulfate heptahydrate, 2 g potassium dihydrogen phosphate) , Ammonium sulfate 8g, thiamine 'hydrochloride lmg, piotin 0.1mg, pantothenate 10mg, ferrous sulfate heptahydrate 10ing, zinc sulfate heptahydrate lmg, nicotinic acid 20mg and calcium carbonate 10g in water 1 L. pH 7.2) 5 ml was inoculated and cultured at 30 ° C for 16 hours with shaking.
  • a seed medium 50 g sucrose, 30 g soy hydrolyzate, 3 g urea, 20 g peptone, 20 g strength amino acid, 20 g meat extract
  • 1 ml of the seed culture obtained in this culture was used for main culture medium (moisture molasses 200 g, ammonium sulfate 45 g, urea lg, monopotassium dihydrogen phosphate 0.5 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g, biotin 0.3 mg and calcium carbonate).
  • 30 g was contained in 1 L of water, pH 7.0), and inoculated into 10 ml, followed by shaking culture at 30 ° C for 72 hours.
  • Quantification of L-lysine accumulated in the medium was performed by high-performance liquid chromatography.
  • AK which is a key enzyme of L-lysine biosynthesis in coryneform bacteria, is modified to a desensitized type which is released from concerted feedback inhibition by L-lysine and L-threonine and feedback inhibition by lysine alone. This can be advantageous for the production of L-lysine.
  • SEQ ID NO: 2 Description of artificial sequence-Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 4 Description of artificial sequence-Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 7 Description of artificial sequence—Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 8 Description of artificial sequence-Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 10 Description of artificial sequence-One synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 11 Description of artificial sequence-Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 12 Description of artificial sequence-synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 13 Description of artificial sequence-synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 14 Description of artificial sequence-synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 15 Description of artificial sequence-synthetic DNA
  • SEQ ID 16 Description of artificial sequence-Synthetic DNA

Description

明 細
新規な脱感作型ァスパルトキナーゼ 技術分野
本願発明はコリネ型細菌由来の新規なァスパルトキナーゼ、該酵素をコードする
DNA、 該 DNAを含有する組換え体 DNA、 該組換え体 DNAを保有するコリネ型細菌、 ある いは該 DNAを染色体上に保有するコリネ型細菌、 および該微生物を培養することを 特徴とする L-リジンの製造法に関する。 景技 fe
コリネパクテリゥム属に属する微生物を用いた発酵法による L—リジンの製造 法としては以下の方法が知られている。
( 1 ) L一リジン生産変異株を用いる方法としては、 例えば、 S- (2-アミノエチ ル） -システィン （以下、 AECと略す） 耐性変異株 （アミノ酸発酵、 1986年、 273頁、 学会出版センター） 、 L一ホモセリン要求変異株 （アミノ酸発酵、 1986年、 273頁、 学会出版セン夕一） 、 呼吸系阻害剤耐性変異株 （特公平 5-55114) 、 ピリミジンァ ナログ耐性変異株 （特開昭 59-88094) 、 プリンアナログ耐性変異株 （特公昭 63- 062199) 等が知られている。
( 2 )遺伝子組換え技術を用いた組換え菌による方法としては、 コリネバクテリ ゥム属に属する微生物において、 自立複製し、選択可能な表現型を与えるマ一カー 遺伝子を有するベクタープラスミ ド、およびそれを効率良く該細菌に導入する方法 が開示されており、それらを用いて L一リジンを含む各種 Lーァミノ酸の合成に関 与する遺伝子の細胞内コピー数を増し、該アミノ酸を効率良く製造する方法が開示 されている （特公平 5- 11959、 特公平 7-55155) 。
L—リジンの生合成制御としては、 L—ァスパラギン酸からァスパラチルリン 酸の生合成を触媒するァスパルトキナ一ゼ （以下、 A Kと略す） に対する L—リジ ンと L—スレオニンによる協奏的フィードバック阻害が最も良く知られている。こ のフィードバック阻害が解除された変異型 A K (以下、 脱感作型 A Kと略す） をコ —ドする遺伝子（以下、 脱感作型 A K遺伝子と略す） を有するコリネパクテリゥム 属に属する微生物では L一リジンを菌体外に分泌することが知られている（ァミノ 酸発酵、 1986年、 273頁、 学会出版センター） 。 変異の塩基配列情報があれば、 試 験管内で塩基配列を望みのものに変換する技法 （例えば、 ストラタジーン社 QuikChangeサイ トダイレクテツド · ミュー夕ジエネシス ·キットを用いる方法） と 組み合せ、 野生型遺伝子を変異型に変換しうる。最近、 上記脱感作型 A K遺伝子の 塩基配列レベルの解析が報告されている [Journal of Bacteriology, 175, 4096 (1993) ； Molecular Microbiology 5, 1197 (1991 )； 特開平 6-62866] 。 発明の開示
本願発明の課題は、コリネ型細菌における L—リジン生合成の鍵酵素である A K を L—リジンおよび L—スレオニンによる協奏フィ一ドバック阻害およびリジン 単独によるフィードバック阻害から解除された脱感作型に改変し、 L _リジンの生 産に有利なものにすることである。
本願発明者らは、コリネ型細菌による効率的な L—リジンの生産法に関して鋭意 研究した結果、 L—リジンおよび L—スレオニンによる協奏フィードバック阻害の 解除された性質にさらに L—リジン単独でもフィ一ドバック阻害が解除された脱 感作型の A Kを有する菌株が優れた Lーリジン生産能を有することを見出し、本願 発明を完成させた。
即ち、 本願発明は以下 （ 1 ) から （ 1 2 ) に関する。
( 1 ) コリネ型細菌由来であり、配列番号 1 8記載のアミノ酸配列において 3 1 1番目のアミノ酸残基が Thr以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、 かつ L—リジンおよび L—スレオニンによる協奏的なフィードバック阻害が解除 されたァスパルトキナ一ゼをコードする DNA。
( 2 ) DNAが、 配列番号 1 7記載の塩基配列を有する DNAである、 上記 （ 1 ) の MA。
( 3 )コリネ型細菌が、 コリネバクテリゥム属およびブレビバクテリゥム属か らなる群より選ばれる属に属するコリネ型細菌である、 上記 （ 1) の DNA。
(4) 上記 （ 1) 〜 （3) いずれか 1つの DNAをベクターに組み込んで得ら れる、 コリネ型細菌で複製可能な組換え体 DNA。
(5) 上記 （ 1) 〜 （3) いずれか 1つの DNAを染色体上に有する、 コリネ 型細菌。
(6) 上記 （4) の組換え体 DNAを保有する、 コリネ型細菌に属する形質転 換株。
( 7 ) 形質転換株が、コリネバクテリウム'グル夕ミカム Tf-5(FERMBP-6689) である、 上記 （6) の形質転換株。
(8) 上記 （ 5 ) のコリネ型細菌、 上記 （ 6 ) および （ 7 ) の形質転換株か ら選ばれる微生物または形質転換株を培地に培養し、培養物中に L—リジンを生成 蓄積させ、該培養物から L一リジンを採取することを特徴とする、 L—リジンの製 造法。
(9) 上記 （ 1) 〜 （3) いずれか 1つの DNAにコードされるァスパルトキ ナーゼ。
( 10) コリネ型細菌由来であり、配列番号 18記載のアミノ酸配列の 3 1 1番目のアミノ酸残基が Thrである塩基配列を有する、 ァスパルトキナ一ゼをコ一 ドする DNA。
( 1 1) 配列番号 1 Ί記載の 932番目の塩基がシトシンに置換された塩基 配列を有する上記 （ 10) の DNA。
該 DNAを用いることにより、 上記 （ 1) のァスバルトキナーゼをコードする DNA を作製することができる。
( 12) 上記 （ 10) または （ 1 1) の DNAによりコードされるァスノ "レト キナーゼ。
以下、 本願発明について詳細に説明する。
AKをコードする遺伝子 （以下、 AK遺伝子と略す） を含む DNAの供給菌として は、 コリネ型細菌に属し、 AK活性を有する微生物であればいかなる微生物でも良 い。
本願発明におけるコリネ型細菌としてはァグロコッカス (Agrococcus)属、ァグ口 マイセス（Agromyces)属、 アースロバクタ一（ Arthrobacter )属、 オーレォバクテリ ゥム (Aureobacterium)属、 フ、、レビノ クテリウム (Brevibacterium)属、 セノレ口モナス (Cellulomonas)属、 クラビバクタ一（Clavibacter)属、 コリネバクテリゥム (Corynebacterium)属、 ミクロノ クテリゥム (Microbacterium)属、 ラサイノ ク夕一 (Rathayibacter)属ヽ テラバク夕一 (Terrabacter)属、 ヅリセラ（Turicella)属に属 する細菌があげられる。好適には、 コリネバクテリウム属、 ブレビパクテリゥム属 に属する細菌をあげることができる。具体例として、例えば下記の菌株が用いられ る。
コリネバクテリゥム ·グル夕ミカム ATCC13032 コリネバクテリゥム ·グル夕ミ 力ム ATCC13869 コリネバクテリウム ·グル夕ミカム ATCC13870 コリネバクテリウ ム ·カルナェ ATCC15991 コリネバクテリゥム ·ァセトグル夕ミカム ATCC15806。 野生型株からは L一リジン、あるいは L—リジンと L—スレオニンによるフィ一 ドバック阻害のかかる、 野生型の A K遺伝子が供給される。該野生型の A K遺伝子 よりフィードバック阻害の解除された脱感作型 A K遺伝子を取得する方法として は、例えば、野生型株から変異操作 [例えば N-メチル -Ν' -二ト口- Ν-二トロソグァ二 ジン （NTG) を用いる方法；微生物実験マニュアル、 1986年、 131頁、 講談社サイェ ンティフィヅク社]を施した後、 AEC耐性を指標に選択され、 L—リジン生産性とな つた変異株から取得する方法をあげることができる。好適な変異株としては、 コリ ネバクテリゥム ·グルタミカム野生型株 ATCC13032より変異処理により誘導された L—リジン生産菌、 あるいは野生型 Α Κ遺伝子を取得した後、 上記 NTG法あるいは 試験管内変異法 [例えばヒドロキシルァミンを用いる方法； Molecular and General Genetics, 145, 101 ( 1978)] によって該遺伝子に変異を誘起し、 AEC耐性かつ L— リジン生産性を指標に脱感作した脱感作型 A K遺伝子を含む株等をあげることが できる。
A K遺伝子は、 A K遺伝子を含む株より、 例えば斎藤らの方法 [Biochimica et Biophysica Acta, 72, 619 ( 1963)] により単離することで取得することができる。 即ち、 染色体 DNAを調製し、 これを適当な制限酵素で切断する。 切断後、 得られた 切断断片を微生物内で自立複製可能なベクタ一 （例えばプラスミ ド） に連結し、 こ れを A K活性が欠損した宿主微生物に導入する。該微生物より A K活性を発現する ようになつた形質転換株を単離し、該形質転換株より該遺伝子を単離することによ り取得することができる。
該宿主微生物としては、コリネ型細菌の A K遺伝子が発現可能な微生物であれば、 いずれも用いることができる。 好適には大腸菌の A K欠損株があげられる。
自立複製可能なベクターとしては、該ベクターを導入した微生物中で自立複製で きるものならばいかなるものでも良い。 例えば、 pUC18 (宝酒造社製） 、
pBluescriptSK (-) (東洋紡社製） 等の大腸菌中で自立複製可能なベクタ一、 pCE54 (特開昭 58-105999) 等の大腸菌とコリネ型細菌の両方で自立複製可能なシャトル ベクタ一等をあげることができる。
ベクタ一と A K遺伝子を含む DNA断片との連結は、 T4DNAリガーゼ等を用いる通常 の方法で行なうことができる。
宿主への導入は例えば大腸菌の場合、 ハナハンらの方法 [Journal of Molecular Biology, 166, 557 ( 1983)] 等により行なうことができる。
さらに、 以下の方法により A K遺伝子を単離取得できる。
既に公知のコリネバクテリゥム ·グル夕ミカム由来 A K遺伝子の塩基配列情報 [例えば、 ジェンバンク （GenBank) ァクセッション 'ナンバー E06825] を基にォ リゴマー DNAを合成し、 該 DMをプライマーとして用い、 PCR法により該遺伝子を含 む DNA断片を増幅単離する。該 DNA断片を選択マーカー遺伝子を有するベクタ一に連 結して大腸菌、 コリネ型細菌等の適当な宿主微生物に導入する。該微生物より導入 したベクターを単離することにより、 A K遺伝子を取得することができる。宿主微 生物に A K欠損株を用いる必要はない。
本願発明でいう 「コリネ型細菌で複製可能な組換え体 DNA」 作製のために用いら れるベクターとしては、コリネ型細菌中で自立複製しうるものであればいかなるも のでも良い。 具体的には、 pCGl (特開昭 57- 134500) 、 pCG2 (特開昭 58- 35197) 、 PCG4 (特閧昭 57-183799) 、 pCGll (特閧昭 57-134500) 、 pCG116、 pCE54、 pCBlOl (いずれも特開昭 58-105999) 、 pCE51、 pCE52、 pCE53 [Molecular and General Genetics, 196, 175 ( 1984)] 、 および本願発明において作製過程を示した pCS299P 等があげられる。 好適には pCG116、 pCS299Pなどのようにサイズが比較的小さく、 クロ一ニング部位を多数有し、薬剤耐性遺伝子などの選択可能なマーカー遺伝子を 持つものが用いられる。
上記組換え体 DNAをコリネ型細菌へ導入するための方法として、 プロトプラスト 法（例えば、特開昭 57-186492および特開昭 57-18649)、電気穿孔法 [例えば、 Journal of Bacteriology, 175, 4096 ( 1993)] 等をあげることができる。
本願発明の新規 A Kをコードする DNAを染色体上に有するコリネ型細菌とは、 該 A K遺伝子を染色体上に含むコリネ型細菌であればいかなるものでも良い。例えば、 変異操作によって取得された株、 相同組換え法 [Bio/Technology， 9, 84 ( 1991 )] 、 ファージゃトランスポゾンを用いる方法 [Escherichia coli and Salmonella typhimurium、 1996年、 2325頁、 2339頁、 アメリカン 'ソサエティ一 'フォー 'マ イク口バイオロジー刊] 等により該 DNA断片を染色体内に人為的に挿入した微生物 等をあげることができる。
以上のようにして取得した、 新規 A K遺伝子を含む DNAを有するコリネ型細菌に 属する形質転換株を培養することにより、培養液中に L—リジンを生成蓄積させる ことができる。
培養培地としては、 炭素源、 窒素源、 無機塩類などを含む通常の栄養培地を用い ることができる。
炭素源としては、 例えばグルコース、 果糖、 シユークロース、 マルト一ス、 でん ぶん加水分解物等の糖類、 エタノールなどのアルコール類、 酢酸、 乳酸、 コハク酸 等の有機酸類を用 、ることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 炭酸アン モニゥム、酢酸アンモニゥムなどの各種無機および有機アンモニゥム塩類、尿素、 その他窒素含有化合物、 ならびに肉エキス、 酵母エキス、 コーン 'スティープ' リ カー、 大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としてはリン酸第一水素力リゥム、 リン酸第二水素力リゥム、硫酸アンモ 二ゥム、 塩化ナトリウム、 硫酸マグネシウム、 炭酸カルシウム等を用いることがで きる。
その他、 必要に応じて、 ピオチン、 チアミン等の微量栄養源を加えることができ る。 これら微量栄養源は、 肉エキス、 酵母エキス、 コーン 'スティープ' リカー、 カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
培養は、 振とう培養、 深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一 般に 20〜40°Cが好適である。培地中の pHは、 中性付近に維持することが好ましい。 pHの調整は、 無機あるいは有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アン モニァなどを用いて行う。 培養期間は通常 1〜6日間である。
培養終了後、 菌体を除去する。得られた培養液より活性炭処理、 イオン交換樹脂 処理などの公知の方法により L—リジンを回収することができる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるもの ではない。 図面の簡単な説明
第 1図 第 1図は PCS299Pの造成過程を示した図である。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1 プラスミ ド PCS299Pの造成
大腸菌とコリネ型細菌双方で自立複製可能なシャトルプラスミ ド PCS299Pを以下 の方法で作製した。
PCG116 [Bio/Technology, 11 , 921 ( 1993 )] を (宝酒造社製） で切断し、 il切断断片を取得した。
PHSG299 (宝酒造社製） を BajnHI (宝酒造社製） で切断後、 得られた BajnHI切断断 片を常法にしたがってェ夕ノール沈殿法により濃縮し、該断片をアル力リフォスフ ァ夕ーゼで処理した。得られた上記 2種類の断片を混合し、 ライゲ一シヨンキット ver. 1 (宝酒造社製） を用い、 リガーゼ反応を行った。 反応産物を用い、 常法 [Molecular Cloning, 第 2版、 1989年、 コールド 'スプリング 'ハーバ一 ·ラボ ラトリ— .プレス（以下、 モレキユラ— ·クローニング第 2版と略す）] に従って大 腸菌 NM522株を形質転換した。 該菌株を、 20 g/mlのカナマイシンを含む LB寒天培 地 [パクトトリプトン （ディフコ社製） 10g、 酵母エキス （ディフコ社製） 5g、 塩 化ナトリウム 10g、 パクトァガー （ディフコ社製） 16gを水 1Lに含み、 pH7.0に調整 された培地]上で培養し、 形質転換株を選択した。該形質転換株を 20 zg/mlのカナ マイシンを含む LB培地を用い終夜培養し、 得られた培養液からアルカリ SDS法 （モ レキユラ一'クロ一ニング第 2版）によりプラスミ ドを調製し、 pCS116-299Bgll DNA を取得した。
該 PCS116- 299Bgllの制限酵素切断部位を常法に従って確認した。
pCS116-299Bgll DNAを用いて電気穿孔法 [FEMS Microbiology Letters, 65, 299, ( 1989)]によりコリネパクテリゥム，アンモニアゲネス ATCC6872を形質転換した。 該菌株を 20〃g/mlのカナマイシンを含む CM寒天培地 [ポリペプトン S (日本製薬 社製） ] 10g、 酵母エキス S (日本製薬社製） 5g：、 エルリッヒ肉エキス （極東製薬ェ 業社製） 10g、 塩化ナトリウム 3g、 ピオチン 30〃gを水 1Lに含み、 pH7.2に調整され た培地]上で培養し、 形質転換株を選択した。 該形質転換株より常法に従ってブラ スミ ドを抽出し、該プラスミ ドを制限酵素で切断することにより、該プラスミ ドが pCS116-299Bgllであることを確認した。
pCS116-299Bgll DNAを、 ^1 (宝酒造社製） および ^ 11で切断した後、 ェ夕ノ —ル沈殿法により精製した。 得られた DNAからキロシーケンシング用デリーシヨン キット （宝酒造社製） を用いて部分欠失プラスミ ドを取得した。該プラスミ ドを用 い、 常法に従って大腸菌 NM522株を形質転換した。 該菌株を 20 g/mlのカナマイシ ンを含む LB寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を 20〃g/ml ：含む LB培地を用い終夜培養し、 得られた培養液からアル力 U SDS 法にてプラスミ ドを調製した。常法に従って、得られた各プラスミ ドの制限酵素地 図を作成し、 部分欠失長の異なるプラスミ ドを選択した。
選択したプラスミ ドを用いて、 電気穿孔法によりコリネパクテリゥム 'アンモニ ァゲネス ATCC6872を形質転換した。 得られた形質転換株を 20 zg/mlのカナマイシ ンを含む CM寒天培地上に塗布後、 30°Cで 2日培養し、 カナマイシン耐性コロニーの 出現の有無を指標としてコリネパクテリゥム ·アンモニアゲネス中で自立複製能を 有するプラスミ ドを選択した。
自立複製能を有するプラスミ ドの中で最も長い欠失領域を有するプラスミ ドを 選択し、 このプラスミ ドを pCS299del6とした。
pCS299del6 DNAを常法に従って形質転換株より調製した後、 制限酵素 ^£さ Iおよび PvuH (いずれも宝酒造社製） を用いて切断した。該切断 DNA断片をァガロースゲル 電気泳動により分画後、 pCG116由来の DNAを有する約 2.7kbの MA断片を分離し、 DNA prep (旭硝子社製） を用いて抽出精製した。
pBluescript SK ( + ) (東洋紡績社製） DNAを、 常法に従って^ RV (宝酒造社製） で切断した。 得られた切断 DNA断片をエタノール沈殿法により濃縮後、 アルカリフ ォスファタ一ゼ処理した。該処理 DNA断片をァガロースゲル電気泳動により分画後、 DNA prepを用いて抽出精製した。
上記 2.7kb断片と pBluescript SK( + )断片をライゲーシヨンキット ver. 1を用い て連結した後、該連結 DNAを用いて、常法に従って大腸菌 NM522株を形質転換した。 該菌株を 100〃g/mlのアンピシリン、 50 〃g/mlの X-Gal (5- bromo-4-chloro - 3- indoyl- ?-D-galactoside) 、 1賺 ol/lの IPTG ( isopropylthio- β -D-galactoside ) を含む LB寒天培地上で培養し、 形質転換株を選択した。 該形質転換株を 100〃g/ml のアンピシリンを含む LB培地を用い終夜培養し、 得られた培養液からアル力リ SDS 法によりプラスミ ドを調製した。常法に従って、得られた各プラスミ ドの制限酵素 地図を作成した。 ^RI切断によって 3.4kbと 2kbの断片を生じるプラスミ ドを PCSSK21とした。
配列番号 1、 2に示した DNAを合成し、これらの DNAをプライマーとして、 pHSG299DNA を鍀型として、 Taq DNAポリメラ一ゼ （宝酒造社製） を用い、 添付の反応条件に従 つて、 PCR反応を行った。 反応産物を常法に従ってエタノール沈殿した後、 制限酵 素 ^1および^ I (宝酒造社製） を用いて切断した。 該切断 DNA断片をァガロース ゲル電気泳動により分画し、 得られた約 1.3kbの DNA断片を DNA prepを用いて抽出精 製した。
配列番号 3、 4に示した DNAを合成し、これらの DNAをプライマ一として、 pHSG299DNA を錡型として、 Taq DNAポリメラ一ゼを用い、 添付の反応条件に従って、 PCRを行つ た。 反応産物を常法に従ってエタノール沈殿した後、 制限酵素 lおよび ilを 用いて切断した。 該切断 DNA断片をァガロースゲル電気泳動により分画し、 得られ た約 1.3kbの DNA断片を DNA prepを用いて抽出精製した。
上記で取得したプラスミ ド PCSSK21を^ II (宝酒造社製）および互 を用いて切 断した。該切断 DNA断片をァガロースゲル電気泳動により分画し、得られた約 2. 7kb の DNA断片を DNA prepを用いて抽出精製した。 抽出精製された上記の 3種類の MA 断片を混合した後、 ライゲーシヨンキット ver. 1を用いて連結した。
該連結 DNA断片を用いて常法に従って大腸菌 NM522株を形質転換した。該菌株を 20 〃g/mlのカナマイシン、 50〃g/mlの X- Gal、 1腿 ol/lの IPTGを含む LB寒天培地上で培 養し形質転換株を選択した。
該形質転換株を、 20 g/mlのカナマイシンを含む LB培地を用い終夜培養し、得られ た培養液からアルカリ SDS法によりプラスミ ドを調製した。 常法に従って、 得られ た各プラスミ ドの制限酵素地図を作成し、第 1図に記載された構造を有するプラス ミ ドを PCS299Pとした。 実施例 2 L—リジン生産変異株の作出と該株由来 A K遺伝子の塩基配列決定 コリネバクテリウム ·グルタミカム野生型株（ATCC13032) に NTGによる変異処理 (微生物実験マニュアル、 1986年、 131頁、 講談社サイエンティフィ ック社） を施 した後、 lmg/ml AECおよび lmg/ml L—スレオニンを含む最少寒天培地 [グルコース 5g、 リン酸一水素二カリウム 0. 75g、 リン酸二水素一カリウム 0.75g、 硫酸アンモニ ゥム lg、 硫酸マグネシウム 7水和物 0.5g、 塩化ナトリウム 0. 1g、 硫酸第一鉄 7水 和物 10mg、 硫酸マンガン 7水和物 8mg、 塩酸カルシウム lmg、 チアミン塩酸塩 lmg、 ピオチン 0.03mg、 寒天 （ディフコ社製） 16gを水 1Lに含み、 pH7, 2に調整された培 地] に塗布し、 30°Cで 2日培養した。 出現したコロニーを単離し、 後述実施例 5に示 す方法で L—リジンの生産試験を行い、 生産性が向上したクローンを選定した。 そのうちの一株 （AEC11株） および野生型株 ATCC13032より、 以下のごとく PCR法 により A K遺伝子を増幅し、 塩基配列を決定した。
それぞれの株より、 斎藤らの方法 [Biochimica et Biophysica Acta, 72, 、 619 ( 1963 )]により染色体 DNAを調製した。コリネバクテリゥム 'グル夕ミカム ATCC13869 株において既知となっている A K遺伝子の塩基配列 [GenBank, ァクセッション - ナンバー E06825]を元にして増幅用の DNAプライマ一を設計した。該 DNAプライマ一 を配列番号 5および 6に示した。上記で調製した染色体 DNA、 DNAプライマー、 パー キンエルマ一社製サーマルサイクラ一 （ジ一ンアンプ PCRシステム 9600 )、
Phyrococcus sp. KOD株由来 DNAポリメラーゼ （東洋紡社製） 、 および添付のバッフ ァ一を用い、 PCRを行った。 PCRは、 94°C- 30秒、 60°C-30秒、 74°C-60秒の反応を 1 サイクルとして 30サイクル行った。 増幅された約 1.5Kbの DNAを PCRプロダクト ·プ レシ—ケンシング .キット （アマシャム · フアルマシア社製） を用いて精製後、 該精製 DNAを鎵型としてサイクルシ一ケンシングを行った。 シーケンス反応に用い る DNAプライマーは、 上記 A K遺伝子塩基配列を元にしてデザインした。該 DNAブラ イマ一を配列番号 7 ~16に示した。 ABIプリズム ·ダイ '夕一ミネ一夕一 'サイク ル ·シ一ケンシング 'レディ一 . リアクション 'キッ ト （パーキンエルマ一社製） を用い、 96°C-10秒、 50°C- 5秒、 60°C-4分の反応を 1サイクルとして 25サイクルシ 一ケンス反応を行い、 ABIプリズム 377 DNAシーケンシング 'システム （パ一キンェ ルマ一社製） により塩基配列を決定した。
AEC11株由来の変異型 A K遺伝子の塩基配列および対応するオープン · リ一ディ ング ·フレームのアミノ酸配列を配列番号 17および 18に示す。配列番号 17に示した 変異型 A K遺伝子の塩基配列において、 932番目のチミンが野生型 A K遺伝子では ではシトシンであった。 該塩基置換により、 野生型 A Kの 311番目の L—スレオニ ン残基 （コ ドン ACC) が、 AEC11株由来 A K遺伝子ではイソロイシン残基 （コ ドン ATC) に置換されていた。 コリネバクテリゥム 'グルタミカムの A K遺伝子の脱感 作変異としては、 Ala279の Ala以外のアミノ酸への変異 （特開平 6-62866、 特開平 6-261766)、 Gly345Asp [Journal of Bacteriology, 175, 4096 ( 1993)]、 Ser301Tyr [Molecular Microbiology, 5, 1197 ( 1991 )] 、 Ser301Phe、 Thr308Ile (いずれも 特開平 6- 261766)などの報告があるが、 本変異はそのいずれにも該当していなかつ た。 実施例 3 変異型 A K遺伝子のクローニングとコリネ型細菌への導入
上記変異の Lーリジン生産性への影響を以下の方法で評価した。
コリネパクテリゥム ·グルタミカム野性型株 （ATCC13032) および L—リジン生 産菌 AEC11株より PCR法により A K遺伝子をクローニングした。実施例 2と同様の方 法で得られた ATCC13032株由来または AEC11株由来 A K遺伝子を含む約 1.5Kbの遺伝 子断片を I、 BamHI (宝酒造社製） で処理した後、 ァガロース電気泳動に供し、 ゲルより切り出し、 ジーン 'クリーン 'キット （BI0 101社製） により精製した。 実施例 1で示した、 ェシヱリヒア ·コリとコリネ型細菌内双方で自律増殖可能なシ ャトルべクタ一 PCS299Pを ^1、 ^ϋΗΙで切断し、 ライゲ一シヨンキット ver. l (宝 酒造社製） を用いて、 上記 A K遺伝子断片と連結した。該連結産物を用い、 ェシェ リヒア .コリ DH5ひ株 （東洋紡社製） を添付マニュアルに従って形質転換した後、 アンピシリン 100 /g/mlを含む LB寒天培地で生育するコロニーを単離した。 これら のコロニーを培養し、 実施例 1と同じ方法でプラスミ ド DNAを調製した。 実施例 2 で示した方法により塩基配列決定を行ない、 PCR過程での変異を含まないクローン を選定した。 該選定により得られた ATCC13032株由来 A K遺伝子を含むプラスミ ド の一つを pAKl、 AECll株由来 A K遺伝子を含むプラスミ ドを pAK2と名付けた。 実施例 4 コリネパクテリゥム ·グルタミカムの野生型 A Kと変異型 A Kの酵素解 析
コリネバクテリゥム ·グル夕ミカム野生型株 ATCC13032にプラスミ ド ρΑΚ1、 pAK2 および PCS299Pを、 電気穿孔法 [FEMS Microbiology Letters, 65, 299 (1989)] に より、 それぞれ導入した。 得られたプラスミ ド pAKlを保有する株を Tf- 14、 pAK2を 保有する株を Tf-5、 pCS299P 〇を保有する株を Tf- 21と命名した。 これら形質転換株の A K活性をフォレツティーらの方法により [Journal of Bacteriology, 、 175， 4096 (1993)] 測定した。
第 1表に形質転換株の粗抽出液の A K比活性を示した。
ΑΚ遺伝子を含むプラスミ ドの導入株 （Tf-14および Tf- 5) では、 ベクタ一導入 株 （Tf-21) に比べ、 AK比活性が約 6倍に増大することが示された。 Tf- 5は L— リジンと L—スレオニンによる協奏的阻害が解除されているだけでなく、 L—リジ ンによるフィードバック阻害も大幅に解除されていた。
Tf-5は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番 3号） に平成 1 1年 4月 2日付けで受託番号： FERM BP- 6689 として寄託 されている。
^ 1 ^fe
AK比活性 Aspar ty 1 -hy droxamate/ mg- - pro te i n/ m i n) 菌株 L- Ly s L- Thr L- -し y s +し - Thr 無添カロ lmM lOraM lraM lOmM 各 IraM 各 lOmM
Tf-21 2.8
Tf-14 17.3 16.5 9.7 23. 1 4.8 1.2
(100) (96) (56) (133) (140) (28) (7)
Tf-5 16.7 16.7 15 30.9 35.8 18.2 18.4
(100) (100) (89) (185) (215) (109.) (110) 括弧内は無添加時の比活性を 100 と したときの相対活性値 （％) を示 実施例 5 コリネパクテリゥム ·グルタミカムにおける変異型 AKの L—リジン 生産能への効果 実施例 4で作出された Tf-5、 Tf- 14および Tf- 21の Lーリジン生産能を培養評価し た。
各菌株を、 種培地 （ショ糖 50g、 大豆加水分解物 30g、 尿素 3g、 ペプトン 20g、 力 ザミノ酸 20g、 肉エキス 20g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0.5g、 リン酸二水素一カリ ゥム 2g、 硫酸アンモニゥム 8g、 チアミン '塩酸塩 lmg、 ピオチン 0.1mg、 パント テン酸カルシウム 10mg、 硫酸第一鉄 7水和物 10ing、 硫酸亜鉛 7水和物 lmg、 ニコチ ン酸 20mg及び炭酸カルシウム 10gを水 1 Lに含む。 pH7.2) 5mlに植菌し、 30°Cで 16 時間振とう培養を行った。
該培養で得られた種培養液 lmlを本培養培地（廃糖蜜 200g、硫酸アンモニゥム 45g、 尿素 lg、 リン酸二水素一カリウム 0.5g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0.5g, ピオチン 0.3mg及び炭酸カルシウム 30gを水 1Lに含む。 pH7.0) 10mlに植菌し、 30°C で 72時間振とう培養した。培養終了時のプラスミ ド保持率を、 プラスミ ドの薬剤耐 性マーカ一であるカナマイシンの耐性を指標にして測定したところ、いずれもほぼ 100%の高い安定性を示した。
培地中に蓄積した L—リジンの定量は、高速液体ク口マトグラフィ一により行な つた。
結果を第 2表に示した。
本願発明の変異型 A K遺伝子の導入により、 L—リジン生産能が著しく向上する ことが示された。
第 2表
菌株 L ー リ ジン生産性 （g/L)
Tf-21 0. 1
Tf-14 0. 1
Tf-5 8. 1
産業上の利用可能性
本願発明により、コリネ型細菌における Lーリジン生合成の鍵酵素である A Kを L—リジンおよび L—スレオニンによる協奏フィ一ドバック阻害およびリジン単 独によるフィードバック阻害から解除された脱感作型に改変し、 L—リジンの生産 に有利なものにすることができる。 配列表フリーテキスト 配列番号 1 人工配列の説明一合成 DNA
配列番号 2 人工配列の説明一合成 DNA
配列番号 3 人工配列の説明一合成 DNA
配列番号 4 人工配列の説明一合成 DNA
配列番号 5 人工配列の説明一合成 DNA
配列番号 6 人工配列の説明一合成 DNA
配列番号 7 人工配列の説明—合成 DNA
配列番号 8 人工配列の説明一合成 DNA
配列番号 9 人工配列の説明一合成 DNA
配列番号 1 0 ：人工配列の説明-一合成 DNA
配列番号 1 1 ：人工配列の説明一合成 DNA 配列番号 1 2 ：人工配列の説明一合成 DNA 配列番号 1 3 ：人工配列の説明—合成 DNA 配列番号 1 4 ：人工配列の説明一合成 DNA 配列番号 1 5 ：人工配列の説明一合成 DNA 配列番号 1 6 ：人工配列の説明一合成 DNA

Claims

請求の範囲
1. コリネ型細菌由来であり、配列番号 1 8記載のアミノ酸配列において 3 1 1番 目のアミノ酸残基が Thr以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、 かっ —リジンおよび Lースレオニンによる協奏的なフィードバック阻害が解除された ァスバルトキナーゼをコ一ドする DNA。
2. DNAが、 配列番号 1 7記載の塩基配列を有する DNAである、 請求項 1記載の DNA。
3. コリネ型細菌が、コリネバクテリゥム属およびブレビバクテリゥム属からなる 群より選ばれる属に属するコリネ型細菌である、 請求項 1記載の DNA。
4. 請求項 1〜3いずれか 1項に記載の DNAをベクターに組み込んで得られる、 コ リネ型細菌で複製可能な組換え体 DNA。
5. 請求項 1〜 3記載の DNAを染色体上に有するコリネ型細菌。
6. 請求項 4記載の組換え体 DNAを保有する、 コリネ型細菌に属する形質転換株。
7. 形質転換株が、 コリネバクテリゥム ·グル夕ミカム Tf-5(FERM BP-6689)である、 請求項 6記載の形質転換株。
8. 請求項 5記載のコリネ型細菌、請求項 6および 7記載の形質転換株から選ばれ る微生物または形質転換株を培地に培養し、培養物中に L—リジンを生成蓄積させ、 該培養物から L一リジンを採取することを特徴とする、 L—リジンの製造法。
9. 請求項 1〜3いずれか 1項に記載の DNAにコ一ドされるァスパルトキナ一ゼ。
10. コリネ型細菌由来であり、 配列番号 1 8記載のアミノ酸配列の 3 1 1番目の アミノ酸残基が Thrである塩基配列を有するァスパルトキナーゼをコ一ドする DNA。
11. ァスパルトキナ一ゼをコードする DNAが、配列番号 1 7記載の 9 3 2番目の塩 基がシトシンに置換された塩基配列を有する、請求項 1 0記載のァスパルトキナー ゼをコ一ドする DNA。
12. 請求項 9〜1 1いずれか 1項に記載の DNAによりコードされるァスパルトキナ
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Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003040373A2 (en) * 2001-08-06 2003-05-15 Degussa Ag Production of l-lysine by genetically modified corynebacterium glutamicum strains
US6927046B1 (en) 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
US7083942B2 (en) 2002-03-09 2006-08-01 Degussa Ag Alleles of the aceA gene from coryneform bacteria
US7160711B2 (en) 2001-08-06 2007-01-09 Degussa Ag Coryneform bacteria which produce chemical compounds I
WO2007063866A1 (ja) 2005-11-29 2007-06-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 新規蛋白質および該蛋白質をコードするｄｎａ
WO2007074857A1 (ja) 2005-12-27 2007-07-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Ｌ－グルタミンの製造法
US7566557B2 (en) 2003-12-18 2009-07-28 Paik Kwang Industrial Co., Ltd. Gene variants coding for proteins from the metabolic pathway of fine chemicals
JP2009531042A (ja) * 2006-03-30 2009-09-03 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア カダベリンの生産方法
DE102008001874A1 (de) 2008-05-20 2009-11-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
JP2009284905A (ja) * 2009-06-26 2009-12-10 Toray Ind Inc カダベリン発酵コリネ型細菌を用いたポリアミドの製造方法
WO2010005099A1 (ja) 2008-07-09 2010-01-14 味の素株式会社 アミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法
US20100255544A1 (en) * 2001-08-06 2010-10-07 Evonik Degussa Gmbh Coryneform bacteria which produce chemical compounds ii
JP2011510642A (ja) * 2008-02-04 2011-04-07 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア ジピコリネートの産生方法
WO2011073278A1 (en) 2009-12-17 2011-06-23 Basf Se Processes and recombinant microorganisms for the production of cadaverine
US8202706B2 (en) 2006-07-13 2012-06-19 Evonik Degussa Gmbh Method of production of L-amino acids
WO2012114256A1 (en) 2011-02-22 2012-08-30 Basf Se Processes and recombinant microorganisms for the production of cadaverine
WO2013000827A1 (de) 2011-06-28 2013-01-03 Evonik Degussa Gmbh Varianten des promotors des für die glyzerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase kodierenden gap-gens
EP2612915A1 (en) 2006-09-01 2013-07-10 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Method for production of L-Glutamine
WO2013179711A1 (ja) 2012-05-29 2013-12-05 味の素株式会社 ３－アセチルアミノ－４－ヒドロキシ安息香酸の製造方法
EP2940144A1 (de) 2014-04-30 2015-11-04 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Produktion von L-Lysin unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums
EP2940143A1 (de) 2014-04-30 2015-11-04 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums
EP2940039A1 (de) 2014-04-30 2015-11-04 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren in Corynebakterien unter Verwendung eines Glycin spaltenden Systems
DE102014208199A1 (de) 2014-04-30 2015-11-05 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU222503B1 (hu) 1995-06-07 2003-07-28 Ajinomoto Co., Inc. Eljárás L-lizin termelésére
JP4035855B2 (ja) 1996-06-05 2008-01-23 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
MXPA03007089A (es) 2001-02-08 2004-10-15 Archer Daniels Midland Co Construccion de polinucleotidos para produccion incrementada de lisina.
DE10239073A1 (de) * 2002-08-26 2004-03-11 Basf Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Feinchemikalien
DE102004011248A1 (de) * 2004-03-09 2005-09-22 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
US20090029425A1 (en) * 2006-03-09 2009-01-29 Basf Se Process for the production of beta-lysine
EP2386650B1 (en) * 2006-04-07 2013-07-03 Evonik Degussa GmbH Method for producing L-amino acids using the gap promoter
EP1881076A1 (en) * 2006-07-17 2008-01-23 Evonik Degussa GmbH Method for producing L-amino acids
KR101512432B1 (ko) 2010-06-15 2015-04-16 백광산업 주식회사 미생물을 이용한 아스파테이트 계열 아미노산의 생산방법
EP3456833A1 (en) 2017-09-18 2019-03-20 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
EP3467099A1 (en) * 2017-10-05 2019-04-10 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
EP3498853A1 (en) 2017-12-14 2019-06-19 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-lysine
EP3594355A1 (en) 2018-07-12 2020-01-15 Evonik Operations GmbH Method for the fermentative production of l-lysine
EP3599282B1 (en) 2018-07-24 2021-03-17 Evonik Operations GmbH Method for the fermentative production of l-lysine
RU2019128538A (ru) 2018-09-26 2021-03-11 Эвоник Оперейшенс ГмбХ Способ ферментативного получения l-лизина
EP3660158A1 (en) 2018-11-29 2020-06-03 Evonik Operations GmbH Method for the fermentative production of l-lysine
EP3670525A1 (en) 2018-12-18 2020-06-24 Evonik Operations GmbH Method for the fermentative production of l-lysine using c. glutamicum strains with a mutated kup transporter
US10829746B2 (en) * 2019-01-23 2020-11-10 Evonik Operations Gmbh Method for the fermentative production of L-lysine
WO2021048353A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 Evonik Operations Gmbh Coryneform bacteria with a heterologous threonine transporter and their use in the production of l-threonine
WO2023041425A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Evonik Operations Gmbh Method for the fermentative production of l-lysine using c. glutamicum strains expressing modified gluconate repressor proteins gntr1 and gntr2
WO2023222510A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222505A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222515A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06261766A (ja) * 1993-03-16 1994-09-20 Mitsubishi Petrochem Co Ltd フィードバックインヒビションの解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5610036B1 (ja) 1969-07-23 1981-03-05
JPS5828292A (ja) 1981-08-10 1983-02-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ−リジンの製造法
JPS5886094A (ja) 1981-11-13 1983-05-23 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ−リジンノ製造法
US5236831A (en) 1981-12-29 1993-08-17 Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes
JPS5988094A (ja) 1982-11-10 1984-05-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ−リジンの製造法
JPH0673318B2 (ja) 1986-09-02 1994-09-14 理化学研究所 マイクロ波導入装置
JPH0755155B2 (ja) 1986-09-10 1995-06-14 協和醗酵工業株式会社 アミノ酸の製造法
US5096502A (en) 1990-12-03 1992-03-17 The Babcock & Wilcox Company Advanced water lance control system based on peak furnace wall emissivity
JPH0511959A (ja) 1991-07-04 1993-01-22 Matsushita Electric Ind Co Ltd マルチウインドウ制御装置
JP3473042B2 (ja) 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
JP2580960B2 (ja) 1993-08-09 1997-02-12 タイガー魔法瓶株式会社 電子レンジの湯沸し制御システム

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06261766A (ja) * 1993-03-16 1994-09-20 Mitsubishi Petrochem Co Ltd フィードバックインヒビションの解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KALINOWSKI J. ET AL.: "Genetic and biochemical analysis of the aspartkinase from Corynebacterium glutamicum", MOL. MICROBIOL., vol. 5, no. 5, 1991, pages 1197 - 1204, XP002929074 *

Cited By (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7741460B2 (en) 1999-12-30 2010-06-22 Archer-Daniels-Midland Company Polynucleotides encoding a truncated ORF2 from Corynebacterium
US6927046B1 (en) 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
US8067210B2 (en) 1999-12-30 2011-11-29 Hanke Paul D Method of producing lysine by culturing a host cell expressing a polynucleotide encoding a feedback resistant aspartokinase from corynebacterium
WO2003040373A3 (en) * 2001-08-06 2003-12-18 Degussa Production of l-lysine by genetically modified corynebacterium glutamicum strains
US7160711B2 (en) 2001-08-06 2007-01-09 Degussa Ag Coryneform bacteria which produce chemical compounds I
WO2003040373A2 (en) * 2001-08-06 2003-05-15 Degussa Ag Production of l-lysine by genetically modified corynebacterium glutamicum strains
US20100255544A1 (en) * 2001-08-06 2010-10-07 Evonik Degussa Gmbh Coryneform bacteria which produce chemical compounds ii
US7083942B2 (en) 2002-03-09 2006-08-01 Degussa Ag Alleles of the aceA gene from coryneform bacteria
US7566557B2 (en) 2003-12-18 2009-07-28 Paik Kwang Industrial Co., Ltd. Gene variants coding for proteins from the metabolic pathway of fine chemicals
WO2007063866A1 (ja) 2005-11-29 2007-06-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 新規蛋白質および該蛋白質をコードするｄｎａ
US8058037B2 (en) 2005-11-29 2011-11-15 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Protein and DNA encoding the protein
WO2007074857A1 (ja) 2005-12-27 2007-07-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Ｌ－グルタミンの製造法
JP2009531042A (ja) * 2006-03-30 2009-09-03 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア カダベリンの生産方法
JP2013146269A (ja) * 2006-03-30 2013-08-01 Basf Se カダベリンの生産方法
US8202706B2 (en) 2006-07-13 2012-06-19 Evonik Degussa Gmbh Method of production of L-amino acids
EP2612915A1 (en) 2006-09-01 2013-07-10 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Method for production of L-Glutamine
JP2011510642A (ja) * 2008-02-04 2011-04-07 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア ジピコリネートの産生方法
AU2009211870B2 (en) * 2008-02-04 2013-09-05 Basf Se Method for the production of dipicolinate
DE102008001874A1 (de) 2008-05-20 2009-11-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
WO2010005099A1 (ja) 2008-07-09 2010-01-14 味の素株式会社 アミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法
JP2009284905A (ja) * 2009-06-26 2009-12-10 Toray Ind Inc カダベリン発酵コリネ型細菌を用いたポリアミドの製造方法
WO2011073278A1 (en) 2009-12-17 2011-06-23 Basf Se Processes and recombinant microorganisms for the production of cadaverine
DE112010004851T5 (de) 2009-12-17 2012-09-20 Basf Se Verfahren und rekombinante Mikroorganismen für die Herstellung von Cadaverin
US9745608B2 (en) 2011-02-22 2017-08-29 Basf Se Processes and recombinant microorganisms for the production of cadaverine
WO2012114256A1 (en) 2011-02-22 2012-08-30 Basf Se Processes and recombinant microorganisms for the production of cadaverine
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WO2013000827A1 (de) 2011-06-28 2013-01-03 Evonik Degussa Gmbh Varianten des promotors des für die glyzerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase kodierenden gap-gens
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