WO2000045830A1

WO2000045830A1 - Substances permettant d'eviter la survenue de l'arteriosclerose, substances immunostimulantes, vertebres nourris a l'aide ces substances et oeufs de ces vertebres

Info

Publication number: WO2000045830A1
Application number: PCT/JP2000/000627
Authority: WO
Inventors: Minoru Takebe
Original assignee: Nichimo Co., Ltd.
Priority date: 1999-02-04
Filing date: 2000-02-04
Publication date: 2000-08-10
Also published as: CN1145493C; KR20010034730A; CA2321107A1; EP1070504A4; CN1293574A; EP1070504A1; AU2255800A

Description

明細書動脈硬化防止素材、免疫賦活素材およびこれらを食した脊椎動物並びにその卵発明の技術分野本発明は、豆類を原料とする動脈硬化防止素材、免疫賦活素材およびこれらを食した脊椎動物並びにその卵に係り、特に人間や動物や鳥や魚等の脊椎動物（以下、「脊椎動物」という）の循環器系における動脈硬化およびそれを原因とする疾患が発生することを防止させる動脈硬化防止機能を保有する動脈硬化防止素材、脊椎動物の免疫機能を向上させる免疫賦活機能を保有する免疫賦活素材およびこれらの動脈硬化防止素材、免疫賦活素材を食材の一部に添加させた食料を食用して育成された人間を除く脊椎動物並びにその卵に関する。

本発明において、豆類とは、大豆等の豆科の穀類やこれらの粕、加工製品等を意味する。発明の背景技術一般に、豆類を原料とした生成物に対する需要は多く、多種多様の生成物が提供されている。

従来から、とりわけ麹菌を用いて造られる醸造物として、豆類を原料とするものには、醤油、味噌等があった。これらの従来の醸造物における麹菌の働きは、主として澱粉を糖化するための利用であり、蛋白質を分解するための利用であった。そして、これらの醸造物においては麹菌のみでは製品化は困難であり、乳酸菌や酵母等の働きを利用することによりそれぞれの製品とされていることも知られている。これは麹菌の有する特性を利用したことである。

しかしながら、それらのほとんどが嗜好性食品であり、従来には栄養面や健康維持を目的として、多量に食することのできる食品はなかったといつて過言ではない。

そこで、本発明者等は、原料となる大豆等の豆類に対して麹菌を-用いて製麹処理を施すとともにその生成物に対して加水分解処理を施して、フィチン酸が完全に分解除去された生成物や、イソフラボンァグリコンを多量に含有する生成物であって、多量に食することのできる食品、飼料、餌料等を提案している（特開平 7— 2 3 7 2 5号公報、国際公開 W 0 9 5 / 1 6 3 6 2号公報等参照）。

本発明者は、前記のような植物である豆類を原料とする生成物が今日においては食生活の変化、特にコレステロール等の脂質の摂取量の増加に伴う動脈硬化等の疾患を非常に有効に予防できることを見いだして本発明に至った。

現代人は大昔から長い間続けてきた貧困生活から開放され、また、医学の進歩で寿命が延び、更に、先進国では飽食とも言える時代に入った。このため食事ゃストレスで生活習慣病とも言える慢性病に罹るリスクが高まつて来ている。本発明者は動脈硬化症の発病と免疫低下には非常に相関性がある点に着目し、ストレスを受けても免疫低下が起こらず、しかもエストロゲンと同じような成分で動脈硬化を予防できる食品の開発が望まれるところであった。大豆など豆類に含まれるイソフラボンには弱いエスト口ゲン作用があることはすでに知られているが、イソフラボンァグリコンを多量に含有する食品、飼料、餌料等についての動脈硬化に対する予防や治療の効果を検討した報告はなかった。一方、大豆などの豆類を使って、麹菌の発酵を行った生成物に免疫賦活機能があるという報告もなかった。本発明者は製造方法を同じにする生成物に動脈硬化防止機能と免疫賦活機能を有することを見出し、本発明に至った。

具体的に説明すると、女性では閉経前後の 45〜5 5歳から総コレステロール（以下、 TCという）が増加し、高比重リポ蛋白コレステロール (以下、 HDL— Cという）は徐々に低下し、低比重リポ蛋白コレステロール（以下、 LDL— C) が増加するなど脂質代謝の異常が起こり、虚血性心疾患による死亡のリスクが同年代の男性よりも高まる。この原因は閉経後に女性ホルモン（エストロゲン）の分泌が低下するためである。このためエストロゲン補充療法等により、動脈硬化症の予防が行われている。しかし、合成のエストロゲン製剤を使った場合、ホルモン作用が強すぎて子宮癌等の副作用が出る危険があった。

エストロゲンの作用メカニズムを説明すると、エス卜ロゲンが免疫を司るサイト力インのインタ一ロイキン一 1 ( I L— 1) 、インタ一ロイキン — 6 ( I L— 6) 、 TNF (tumor necrosis factor)の合成、分泌を抑制したり、 T G F— /3 (transforming growth factor)の合成を促進していることが分かってきた (Eriksen,E.F. et al.： Science, 241： 84-85, 1988) 。エストロゲン分泌低下による TNFや I L一 1の過剰産生が脂質代謝異常に繋がるとも思われる。また、ストレスによる免疫機能の変化もこのようなサィトカインが関係しており、動脈硬化症予防と免疫賦活機能の両面から有効な食品の開発が待たれる所であった。

動脈硬化について更に説明すると、食事の肉食化に伴い、殊に動物性脂肪の摂取の増加により血清コレステロール値が急増しており、このことが原因での動脈硬化が問題となっている。従って、この動脈硬化防止対策としては、まずト一タルの血清コレステロール値を下げることであり、さらには血清コレステロールとしては H D L— C、 L D L— C、超低比重リポ蛋白コレステロール（以下、 V H D L— Cという）からなるが、なかでも、特に血中 L D L— C値を下げることである。なぜならば、酸化 L D L— C は動脈硬化を進行させる原因となり、動脈硬化性心臓病などの ^患-に罹りやすくなることである。国際的な疫学調査報告でコレステロール摂取量と動脈硬化性心臓病による死亡率はよく相関しており、欧米人は東洋人に比ベて、コレステロール摂取量による虚血性心疾患による死亡率がかなり高いといわれていることからもこのことは裏付けられている。しかしながら、最近では我国においても特に若年層での血清コレステロール値の調査では、米国人の同年代に比較して上回っているとの報告もあることから、今後我国においてこの問題は深刻化することが予測されている。

従って、一旦動脈硬化が発現してしまうとこれの有効な治療方法もなく、最終的には血栓という致命的な症状になってしまう。この血栓のリスクは若い時よりも中高年層になるほど多くなると報告されている。血管内皮細胞は単に血液成分と組織との物理的な隔壁として存在するのではなく、抗血栓作用、物質の選択的透過性、凝固促進作用、脂質代謝以外にも多くの生物活性物質を産生分泌して、積極的に生体の機能維持に関与している。この血管内皮の機能である血管弛緩物質であるァセチルコリンゃプロス夕サイクリンなどがあり、プロスタザイクリンは中年者や高年者では若年者の 1 / 3〜 1 Z4程度に減少するという報告がある（Y a n a g i s a w a M. , e t a l . : ( 1 988) 3 3 2, 4 1 1— 4 1 5) 。また、血管収縮物質であるエンドセリン（ET) の産生量が高齢者群では若年者群に比較して 2倍以上となることが報告されている（T 0 k u n a g a O. ， e t a 1. ： L a b I n v e s t ( 1 9 92) 6 7, 2 1 0 - 2 1 7) 。さらには LDL—Cは血管内皮細胞の LDL— Cレセプ夕一を介して細胞内へ取り込まれる。酸化した変形 LD L— Cの取り込みが高く、このことが動脈硬化の発生進展に重要な役割を果たしている。この取り込みは若年者より高齢者の血管内皮細胞で多いという報告が-ある (H a s h i mo t o M. , e t a l . ： E x p G e r o n t o l o g y ( 1 9 9 1 ) 26, 39 7— 40 6) 。このことは人間の一生の間に血管内皮細胞の形態や機能の変化が起こり、高齢者になることで動脈硬化などの病変部ではさらに強く悪変が起こることが問題であり、この血管内皮細胞レベルでの変化を予防することも動脈硬化が原因である疾患対応としては非常に重要なものとなる。

従って、若年者および高齢者を問わず動脈硬化症の予防素材（例えば、予防食品）として優れた効力を有する動脈硬化防止素材の開発が要望される。

一方、先進国において栄養状態が良くなつたにもかかわらず、感染症に対する免疫力は向上していないし、新たに食物アレルギーや花粉症が深刻な問題となっている。また、畜産動物などの経済動物は生産性を追及するために幼動物時から放養密度の高い環境で育成するので、ストレスとなり、免疫力が低下し、感染症での死亡率が下がらないのが現状で、多くは抗生物質の投与がなされている。また、脊椎動物の健康維持にとっては免疫賦活機能についても大切となり、その目的とした生菌剤が開発されているが、例えば、浅野等（浅野等

「畜産の研究」第 48巻、第 1 1号、 6 3〜 6 5頁（ 1 994) ) は偏性嫌気性菌である Clostridium butyricum の芽胞生菌ゃ菌体末の製素材を鶏に投与し、免疫応答能に及ぼす影響を調べ、免疫増強作用が何らか影響していると報告している。しかしながら、この細菌については田中等（田中等「無菌生物」（Lgermfree life gnotobil.) Vo l . 2 1 , No. 2 , 8 0 - 82 ( 1 9 9 1 ) ) は無菌ゥズラに投与した場合、ラクトース添加飼料で盲腸に、気腫、炎症を伴う異常が認められたと報告している-。さらにはこの Clostridium butyricum は腸内常在細菌であるが、新生児壊死腸炎の報告もあるので、このことについては問題点となる。

従って、脊椎動物に対してこのような悪影響をしない乳酸菌で免疫賦活作用を得ることがより安全で、有効であるということがいえる。

そこで、特開平 7 - 2380 24号公報および特開平 8— 99887号公報においては、人の腸内常在菌の 1種である乳酸菌（ェンテロコッカス属）を用いて免疫性を増強させることが提案されている。

しかしながら、これらの公報に記載されている免疫賦活素材は乳酸菌のみの培養物であり、単に乳酸菌の有する特性を利用したものに過ぎない。また、免疫系に関しては全身免疫系と局所免疫系があり、局所免疫系の腸管粘膜免疫系については経口感染に対する免疫系として注目されている。この免疫系は I gA抗体を高めることが必要になるが、 I gA抗体を高める有効な抗原を見つけることが重要である。即ち、毒性のない有効な抗原で経粘膜免疫寛容を起こすことで、 I gA抗体を高め、全身免疫系の I g E抗体を下げることができるという報告がある。このことは腸管粘膜免疫系を高めることで食物アレルギーや花粉症の発生源である I g E抗体を下げて食物アレルギー等の予防に繋がることが期待できる。発明の概要本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、原料である豆類に麹菌を培養増殖させた後に乳酸菌との共存共生する働きを利用して得られる生成物あって、脊椎動物の健康を維持するために有効な動脈硬化防止機能を保有する動脈硬化防止素材や、免疫賦活機能を保有する免疫賦活 ·素材や、これらの動脈硬化素材および免疫賦活素材を食料に添加させて育成させた入間を除く脊椎動物や、その卵を提供することを目的とする。

また、本発明は食品、飼料、餌料等に必要量添加することにより動脈硬化防止機能を発揮する動脈硬化防止素材や、免疫賦活機能を発揮する免疫賦活素材を提供することを目的とする。

本発明者は、前記目的を達成するために鋭意研究し、豆類に麹菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質およびまたは糖質を加水分解することにより、若しくは前記のようにして生成するとともに'、前記製麹処理による生成物中に含まれている乳酸菌およびまたは前記製麹処理による生成物に添加された乳酸菌を前記加水分解の際に増殖促進させることにより製造した生成物が、脊椎動物の健康を促進する優れた機能であるコレステロール値低下機能について伴う動脈硬化防止機能や、免疫陚活機能を保有することを見出して本発明を完成させたものである。

本発明を完成させた理由をさらに説明すると、前記のようにして製造された生成物には、第 1に脊椎動物の血清コレステロールのトータル量を低減させる作用を有しており、第 2に動脈硬化に悪影響を及ぼす LDL— C の酸化防止作用を有しており、第 3に酸化 L D L— Cがマクロファージ内に取り込まれることにより発生した泡沫細胞中のコレステロールエステルを分解する作用を有していることにより動脈硬化防止機能が発揮されることが期待される。さらに、前記のようにして製造された生成物には、血管の弛緩作用を有していることにより動脈硬化防止機能が発揮されることが期待される。さらに、前記のようにして製造された生成物には、免疫賦活作用を有していることにより免疫賦活機能が発揮されることが期铮される。さらに、これらの作用について説明する。

米国ではィソフラボンを含む大豆蛋白質が血清コレステロール値の上昇を抑制する働きがあることを食品医薬品局（FDA) が認め、大豆蛋白質を摂取することにへルスクレームを付けて表示させ、米国人の心臓疾患の予防を促す方向で検討されているといわれている。一方、スガノ等（S u g a n o, M. , Go t o, S . ， Y a m a d a , Y . , Yo s h i d a, K. , H a s h i mo t o, Y. , Ma t s u o, T. a n d K i m o t o, M. ( 1 9 90 ) J . N u t r . 1 20 : 97 7 - 985. ) は胆汁酸の腸管吸収が大豆蛋白質の未消化物あるいは非吸収性べプチドの介在によって阻害を受けるため、分離大豆蛋白質を微生物由来のプロテア一ゼで処理した後に残る高分子画分（h i g h— mo l e c u l a r— we i g h t f r a c t i o n，以下 HMF) は、分離大豆蛋白質そのものより優れた胆汁酸結合能とトータル血清コレステロール値降下を示したと報告している。また、アンソニー等（An t h o n y, M. , C l a r k s o n, T. Β . , Η u g b e s , C . L . , J r . , Mo r g a n, T. . a n d B u r k e, G. L. , ( 1 996) J . N u t r . 1 26

： 43— 5 0) はモンキーの高コレステロ一ル血症に対する大豆イソフラボンの予防効果について報告している。このように、本発明の前記生成物は血清コレステロールのトータル量を低減させる作用を有していることがわかる。一方、乳酸菌の培養物がコレステロールや中性脂肪を低下させる活性があるという報告がある（特公平 4— 7 3 9 84号公報、特公平 5— 2 6 76 8号公報、特公平 1一 4228 0号公報、特公平 3— 6 5 362 号公報）。これらは乳酸菌の菌体成分にコレステロールや中性脂肪を低下させる活性を見いだしている。 - さらに抗酸化剤の動脈硬化防止機能について説明すると、本発明の動脈硬化防止機能を有する生成物を摂取することによって、生成物中の抗酸化作用成分が吸収された血液中に移行し、血液中の脂質成分、特に LDL— Cの酸化に抑制的に働くので、前記したマクロファージへの酸化 L D L— Cの取り込みが抑えられるので結果的に動脈硬化の予防が期待できる。この抗酸化作用については、活性酸素消去能や脂質酸化酵素の阻害で評価することができる。

一般に、植物性食品中にはポリフエノール性の抗酸化物質が含まれている。例えば、茶、赤ワイン、玉葱、りんご等にはフラボノイド類が含まれており、このフラボノィド成分が血中 LDL— Cの酸化を抑制したという報告がある（ I s h i k awa, T. , S u z u k awa, M. ， 1 TO, T. , Υ ο s h i d a , H. , A y a o r i , M. , N i s h i w a k i , M. , Y o n emu r a, A. , H a r a , Y. a n d N a k amu r a, H. ： Am J . C I i n. N u t r . , 66, 2 6 1 ( 1 9 97 ) 参照）。： L u i z d a S i l v a等 ( L u i z d a S i 1 v a , E . , e t a 1. A r c h i v s o f B i o c h em i s t r y a n d B i o p h y s i c s ( 1 9 98 ) 349, 2, 3 1 3— 3 20 ) は玉葱に含まれるフラボノィド類であるケルセチンが LDL— Cの酸化に関与している酵素である 1 5—リポキシゲナーゼの活性を阻害することを報告し、フラボノイド成分が LDL— C酸化抑制に有効であることを示唆している。

しかしながら、豆類とりわけ大豆に含まれるイソフラボノィド類についての血中 LDL— C酸化抑制作用についての報告はないが、本発明者は本発明者等がすでに提案している大豆の発酵生成物には血中 L D L— Cの酸化を抑制できるということを着目した。

即ち、カイ等（C a i， Q. ， We i , H. , ： N u t r C a n c e r ( 1 9 9 6 ) 2 5, 1〜7) は、 S E N C A Rマウスにゲニスティンを飼料に添加したものを投与した時に、小腸でカタラーゼが誘導し、皮膚で SOD (Superoxide dismutase) が誘導し、皮膚、小腸、肝臓、腎臓及び肺でダルタチオン一 S—トランスフェラーゼの酵素活性が増加したことを報告している。このことはイソフラボンァグリコンに効果のあることをいつている。従って、本発明の生成物はイソフラボンをァグリコン化しているので、彼らが言う効果は十分に期待できる。

本発明者により本発明の生成物内に S ODが生成されていることが確認されている。即ち、原料としての 2種類の大豆胚芽（蒸煮）および脱脂大豆（蒸煮）に対して、麹菌としてァスペルギルス ' オリゼーを用いて本発明方法によって生成した発酵大豆胚芽および発酵脱脂大豆のそれぞれの S OD様活性を測定したところ、 2種類の原料である大豆胚芽（蒸煮）および脱脂大豆（蒸煮）のそれぞれ SOD様活性は検出できないのに対し、本発明品の発酵大豆胚芽は 5 7 0単位/ gであり、発酵脱脂大豆は 3 7 0単位/ gと優れた S OD様活性を示している（但し、検出限界は 3 0単位ノ gである）。

ここで血中の LD L— Cの酸化はス一パーォキシドが L D L一 Cに作用することによって起こるものである。 S〇Dは活性酸素を分解する作用があるので、 S〇D様活性の高い本発明品の発酵大豆を摂取することにより、 LDL -Cの酸化を防止することが期待できる。 L D L— Cの酸化は動脈硬化につながるので、本発明においては、十分に LDL— Cの酸化を防止することにより動脈硬化の確実な予防効果を期待することができる-。

さらに、マクロファージに酸化 LDL— Cが取り込まれた場合には、当該イソフラボンァグリコンが動脈硬化性疾患を抑制する働きを発揮すると考えられる。即ち、マクロファージ内の中性コレステロール .エステラ一ゼ（N— CE a s e) が活性化すると、蓄積した泡沫細胞中のコレステロ —ルエステルを分解、除去するので、 N— C E a s eの活性は動脈硬化の防止となる。例えば、トミ夕等（T om i t a, T. e t a 1 ( 1 9 9 6) B i o c h i m. B i o p h y s . a c t a 1 3 0 0， 2 1 0 - 2 1 8) は、女性ホルモンであるエストラジオール（ 1 7 /3— e s t r a d i o 1 (E 2) ) が N— CE a s eの活性を誘導することを細胞レベルで確認している。従って、イソフラボンァグリコンは女性ホルモン様の働きがあることから、 E 2と同様にレセプ夕一と結合して動脈硬化性疾患を防止する働きが期待できる。

マクロファ一ジについて述べると、マクロファージが放出するサイトカインそのものが血管弛緩作用への影響も考えられる。即ち、作用因子としてのサイト力インであるインターロイキン（以下、 I Lという）には、例えば I L一 6のように血栓を促進する作用もあり、このような I Lを活性することはむしろ問題となる力 I L一 1や I L— 2には血管弛緩作用のあるプロス夕サイクリン（PG I 2) の産生を上昇させることが認められている。このことはァラキドン酸代謝における律速酵素は、シクロォキシゲナ一ゼ（以下、 COXという）であるが、 I L— 1が COXの発現を誘導し、 I L— 2もまた COXを誘導することが示されている（丸尾等「医学のあゆみ」（ 1 9 94) Vo し 1 70, N o. 6， 426— 429参照）。従って、本発明の生成物で産生するサイト力インはヘルパー T細胞 1型（Th l ) の細胞性免疫の作用が期待できるため、 I L— 2が産生されるので、プロス夕サイクリンの産生を誘導し、血管を弛緩させるため、動脈硬化症による血栓の予防効果が期待できる。

さらに、本発明者等は本発明品の生成物が未処理の脱脂大豆に比較して、マウスの肝臓中のチトクローム P— 450の酵素活性を誘導することを確認しており、戸田等（戸田昇、岡村富夫：「日本薬理雑誌（総統）」（1 9 9 0 ) 9 5, 29 5 - 376) はァラキドン酸の代謝系として知られているチトクローム P - 450が内皮由来弛緩因子（Endothelium derived relaxing factor:EDRF) の産生に関与する可能性を報告している。従つて、本発明の生成物は当該 EDR Fによる血管を弛緩させる作用や血小板凝集抑制作用や、これらによる粥状動脈硬化に対しての抗血栓作用が期待できる。

以上のように、本発明の動脈硬化防止機能を有する生成物は、多岐に渡つて動脈硬化が原因となる疾患を予防することが期待できるのが特徴である。

前記の通り大豆蛋白質は確かに腸管からの胆汁酸の吸収を阻害する働きはあり、血中コレステロール値を降下させる効果は期待できるが、この働きを発揮させるには大豆蛋白質の量的な摂取が必要であった。また、フラボノィド類には確かに L D L— Cの酸化抑制作用はある力エストロゲン作用がないため、酸化抑制作用だけの効果の期待であり、動脈硬化防止効果は余り強くはなかった。本発明品である動脈硬化防止素材は麹菌で発酵して成るイソフラボンァグリコン等の発酵生成物が主体である。とりわけ、イソフラボンァグリコンのダイゼィンを主体とする本発明品には弱いエストロゲン作用があり、エストロゲン受容体と結合し、肝臓の L D L— C受容体の活性を亢進する作用効果があることが確認できた。このことは大豆蛋白質ゃフラボノイド類にはない動脈硬化防止作用である。しかもイソフラボンァグリコンゃ発酵生成物には抗酸化作用が強いことが確認されているので、その効果も充分に期待できる。動脈硬化の原因となる高脂血症の予防、 L D L— Cの酸化の予防、糖代謝改善、血管壁に対する作用として血管拡張作用、中膜平滑筋細胞の増殖抑制などエストロゲン作用がすべて期待できる。

また、本発明の生成物においては、原料である豆類が製麴処理されるとともに加水分解処理され、これと同時に乳酸菌が多量に増殖されている。この多量に増殖された乳酸菌により免疫賦活機能が発揮されるとともに、生成物内に生成されたイソフラボンァグリコンが容易に血管内に吸収され、マクロファージに作用して免疫性を向上させることにより、非常に優れた免疫賦活機能が発揮されることが期待できる。

更に、本発明の構成と作用効果とを合わせて説明する。

このようにしてなされた本発明の動脈硬化防止素材は、豆類に齄菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質およびまたは糖質を加水分解することにより製せられて、動脈硬化防止機能を保有する生成物とされることを特徴とする。この動脈硬化防止素材においては、動脈硬化防止機能を保有するために、人や家畜や鳥や魚類等の脊椎動物の消化器官から体内に吸収されると、動脈硬化防止. 機能を発揮することにより、当該脊椎動物の動脈硬化疾患の発生を確実に防止させて、健康の維持、促進、病気の予防等を良好に行なわせることができる。

また、本発明の他の動脈硬化防止素材は、豆類に麹菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質およびまたは糖質を加水分解する際に、前記製麹処理による生成物中に含まれている乳酸菌およびまたは前記製麹処理による生成物に添加された乳酸菌が増殖促進させられることにより製せられて、動脈硬化防止機能を保有する生成物とされることを特徴とする。この動脈硬化防止素材においては、動脈硬化防止機能を保有するために、人や家畜や鳥や魚類等の脊椎動物の消化器官から体内に吸収されると、動脈硬化防止機能を発揮することにより、当該脊椎動物の動脈硬化疾患の発生を確実に防止させて、健康の維持、促進、病気の予防等を良好に行なわせることができる。さらに、増殖された乳酸菌が脊椎動物の消化器官から体内に吸収されると、乳酸菌の機能によりコレステロール全体量の低減がはかられ、これにより動脈硬化防止機能がより一層高められることとなる。

また、前記乳酸菌はェンテロコッカス属、特に、ェンテロコッカス ' フェシゥムおよびェンテロコッカス · フエカリスの少なくとも 1種とするとよい。このような乳酸菌を用いることにより、より優れた動脈硬化防止機能を発揮させることができる。また、前記動脈硬化防止素材は前記動脈硬化防止機能を保有する生成物が濃縮状態とされていることを特徴とする。このように動脈硬化防止機能を保有する生成物が濃縮されているために、動脈硬化防止機能が更に一層高められ、動脈硬化の症状を招く因子の低減をより確実に行うことができる。

さらに説明すると、前記動脈硬化防止機能は、前記したようなイソフラボンァグリコンを多量に含有している本発明の生成物の保有する抗酸化作用、 L D L— C低減作用、内皮由来弛緩因子（E D R F ) による血管弛緩作用や血小板凝集抑制作用、マクロファ一ジが酸化 L D L— Cを取り込むことにより血管内面に蓄積した泡沫細胞中のコレステロ一ルエステルを分解、除去する作用、 I L一 1や I L— 2による血管弛緩作用、乳酸菌によるコレステロール低減作用の 1つ若しくは複数の作用により発揮されるものである。

また、本発明の免疫賦活素材は、豆類に麹菌を接種して製麹 ύ、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質およびまたは糖質を加水分解するとともに、前記製麹処理による生成物中に含まれている乳酸菌およびまたは前記製麹処理による生成物に添加された乳酸菌が、前記加水分解の際に増殖促進させられることにより製せられて、免疫賦活機能を保有する生成物とされることを特徴とする。この免疫陚活素材においては、免疫賦活機能を保有するために、脊椎動物の消化器官から体内に吸収されると、免疫賦活機能を発揮することにより、当該脊椎動物の免疫性を向上させて、健康の維持、促進、病気の予防等を良好に行なわせることができる。特に、多量に含有されているイソフラボンァグリコンと乳酸菌とが共に保有している免疫賦活機能により優れた免疫賦活機能が発揮されることとなる。

更に、この免疫賦活素材は、動脈硬化防止機能をも合わせて保有する生成物であるため雌本発明の保有する前記の免疫賦活機能および動脈硬化防止機能が相乗的に発揮され瑠こととなる。

また、前記乳酸菌はェンテロコッカス属、特に、ェンテロコッカス ' フェシゥムおよびェンテロコッカス · フエカリスの少なくとも 1種とするとよい。このような乳酸菌を用いることにより、より優れた免疫賦活機能を発揮させることができる。

また、本発明の人間を除く脊椎動物は、前記の動脈硬化防止素材若しくは前記の免疫賦活素材を食して育成されたことを特徴とする。本発明の人間を除く脊椎動物は、具体的には、前記動脈硬化防止素材や免疫賦活素材を添加した食料を摂取することにより育成される。これらの動脈硬化防止素材や免疫賦活素材は脊椎動物の消化器官から体内に吸収されると、動脈硬化防止機能を発揮することにより、当該脊椎動物の動脈硬化疾患の発生を確実に防止させて、健康の維持、促進、病気の予防等を良好に行なわせることができるし、免疫賦活機能を発揮することにより、当該脊椎動物の免疫性を向上させて、健康の維持、促進、病気の予防等を良好に行なわせることができる。さらに、このようにして育成された脊椎動物を食用として利用する場合には、極めて健康な状態で育成された脊椎動物の食肉等として利用することができる。

また、本発明の人間を除く脊椎動物の卵は、前記の動脈硬化防止素材若しくは前記の免疫賦活素材を食した脊椎動物の卵からなることを特徴とする。本発明の動脈硬化防止素材若しくは免疫賦活素材が添加された食料を摂取した鳥類および魚類が産卵した卵の成分は、これらを添加していない通常の食料を摂取した鳥類等の卵の成分に比較してコレステロールが低く、イソフラボンァグリコンが多量のものとなる。これは本発明の動脈硬化防止素材若しくは免疫陚活素材により鳥類および魚類が健康となり、その結果得られる卵もより健康的な成分となるからである。図面の簡単な説明図 1は、本発明により豆類の 1種である大豆粕から動脈硬化防止素材若しくは免疫賦活素材を製造する製造方法の 1実施例を示す工程図である。図 2は動脈硬化防止素材による動脈硬化防止機能を検証する場合のラッ卜の体重の変化を示す線図である。

図 3は動脈硬化防止素材による動脈硬化防止機能を検証する場合のラットの摂餌量の変化を示す線図である。

図 4は動脈硬化防止素材による動脈硬化防止機能を検証する場合のラッ卜の血液中の T L、 L D L— C、 H D L— C、中性脂肪（以下、 T Gという）の値の変化を示す線図である。

図 5は動脈硬化防止素材による動脈硬化防止機能を検証する場合のラッ卜の滑筋細胞増殖能と濃縮素材等の添加量との関係を示す線図である。図 6は動脈硬化防止素材による動脈硬化防止機能を検証する場合のラットの滑筋細胞増殖能と濃縮素材等の添加量との他の関係を示す線図である。好ましい実施例及び発明を実施するための最良の形態の説明以下、本発明の実施例を図 1から図 6について説明する。図 1はその実線部分において本発明により豆類の 1種である大豆粕から動脈硬化防止素材や免疫賦活素材を製造する製造方法の 1実施例を示し、同図鎖線部分において更に本発明の製造方法の他の実施例を示している。まず、この図 1の実線に示す工程に沿って本発明の動脈硬化防止素材や免疫賦活素材を製造する場合を説明する。

まず、大豆粕を蒸煮する。この蒸煮を施すことにより、蒸煮を行なわない場合に比較して麹菌の増殖が容易となる。また、この大豆粕の蒸煮は製造目的等に応じて蒸煮とその後の製麹処理とを別個に行なうバッチ式や、蒸煮とその後の製麴処理とを連続して行なうことのできる製麹装置-によつて連続式で行うと良い。

そして、この蒸煮が終了した大豆粕を一旦冷却して、大豆粕中の水分量を麹菌が増殖可能な量（例えば、約 3 6重量％) とさせる。

このようにして水分量を整えられた大豆粕に対して、本発明に従って軌脈硬化防止素材や免疫賦活素材が以下のようにして製造される。

即ち、蒸煮が終了した大豆粕単体を冷却して麹菌が死滅しない温度以下の 4 O :以下になった時に、麹菌からなる種麹を所定重量比だけ接種し、両者が均一となるまで混合する。

その後、接種した種麹の増殖作用により混合物の温度を上げるために混合物を製麹装置内で品温を一旦低下させて約 3 2 程度にコントロールしながら放置すると大豆粕が麹菌によって発酵させられて、即ち製麴処理が進行して約 3 8で程度まで昇温するとともに、増殖する麹菌の菌糸の成長に伴って生成物が締まって固まって来る。その後、製麹が進行して製麹装置内において固まって来る生成物を回転攪拌してほぐすとともに、通気を行って内部に均一に空気を供給し、品温を約 3 3〜3 5で程度まで下げるようにコントロールし、更に通気を継続しながら製麹処理を進行させる。これにより麹菌が死滅することを確実に防止して、麹菌の増殖を十分に行わせることができる。その後、製麹装置内の生成物の固まり具合に応じて必要回数の回転撹拌を施すとともに、通気を継続する。

この製麹に用いる麹菌としては、古くからの日本独特の発酵食品やテンべに用いられている麹菌であり、食品として安全なァスペルギルス ·ゥサミ、ァスペルギルス '力ヮチ、ァスペルギルス 'ァヮモリ、ァスペルギルス ·サイトイ、ァスペルギルス ·ォリゼ一、ァスペルギルス ·二ガー等のァスペルギルス属およびリゾープス属の麹菌を用いるとよい。 - この発酵時間については、使用する麹菌の種類に応じて、少なくとも 2 4時間以上であり、麹菌が十分に増殖して大豆粕中の蛋白質および/または糖質を所定量分解させるに十分な発酵時間とするとよい。

本実施例においては、製麹処理による生成物に対して蛋白質およびまたは糖質の加水分解を更に行なうものである。ここで糖質とは少糖類等の糖類や澱粉等を含むものである。製麹後の加水分解も基質をフレーク状態に保持したまま行なわれる。

すなわち、本実施例においては、製麹終了後の生成物に、例えば 5 0重量％の水分量となるように加水してから 3 0〜 5 5でに加温し、保温しながら所定時間保持して製麹処理による生成物内の蛋白質およびまたは糖質の加水分解が施される。このようにして蛋白質およびまたは糖質の加水分解が行われることにより、動脈硬化防止機能および Zまたは免疫賦活機能を有しているイソフラボンァグリコンが多量に生成される。

また、本実施例においては前記加水分解を、乳酸菌の菌数が 1 0 ⁸ c f u/g 以上になるまでの必要な時間を保持する条件を満たすようにしても生成物が製造されている。本実施例においては、この乳酸菌は製麹処理による生成物中に天然に含まれている乳酸菌である。このようにして本実施例においてはプロバイオテックスが利用されることとなり、乳酸菌と麹菌とは原料である豆類からの生成物よりなる同一の基質上に共存共栄して一緒に活発に増殖される。

本実施例において、麹菌として味噌用麹菌のァスペルギルス ·ォリゼ一を用いて本発明の製造方法に従って製造された発酵大豆粕から乳酸菌を分離し、表一 1に示す試験項目の試験を行なって乳酸菌の同定を行なった。

表- 1 分離菌 aの性状

試験項目試験結果形態球菌 ' *·/ グラム染色性 + ^/

胞子一

運動性一 ^ / 酸素に対する態度通性嫌気性 1 カタラーゼ一 / 生成乳酸 L ( + )

グルコースからのガスの生成一 */

lot:での生育 +

45" での生育 +

50 での生育' + ·

6.5 ¾NaCI存在下での生育 +

PH9.6での生育 +

40 ¾胆汁存在下での生育 +

黄色色素の生成

溶血性 (羊血液）

アルギニンジヒドロラ一ゼ +

馬尿酸の加水分解 +

エスクリンの加水分解 +

0.1 3；メチレンブルーミルクでの生育 +

酸の生成

D-キシ口ース

L-ラムノース

シユークロース +

ラクトース +

メリビオース +

ラフイノース

メレチ卜ース

グリセロール - ^2,^1 ァドニトール

ソルビトール + *2 マンニトール +

L-ァラビノース +

菌体内 DNAの GC含量（mol¾) *4 40

*1 前報（試験報告書第 598010212-001号）の結果を示した, 非典型性状

*3 ただし， Enterococcus faecium J CM 580 （基準株）も分離菌 aと同様な反応を示した。

*4 H?LC法によった。表一 1の性状から分離した乳酸菌は、ェンテロコッカス属（En terococc us) のェンテロコッカス ' フエシゥム（En t erococcus f aec i um) であると同定された。この乳酸菌は腸球菌といわれる消化管内常在菌であることを確認した。

本実施例における前記発酵時間および加水分解時間ならびに加水分解温度を、豆類の種類、状態、特性、分量、麹菌の種類、状態、特性、分量、乳酸菌の種類、状態、特性、分量、生成物である動脈硬化防止素材若しくは免疫賦活素材の種類、特性等に応じて調整するとよい。

このようにして製造された本実施例の動脈硬化防止素材若しくは免疫賦活素材は、製麹処理とその後の加水分解処理により大豆粕中の蛋白質およびノまたは糖質が十分に分解されてイソフラボンァグリコンを多量に含む生成物とされている。このィソフラボンァグリコンは動脈硬化防止機能若しくは免疫賦活機能を有していて、脊椎動物の腸壁から容易に血液内に吸収され、早期に動脈硬化防止機能若しくは免疫賦活機能を発揮するようになる。

さらに説明すると、一方の動脈硬化防止機能は、前記したようなイソフラボンァグリコンを多量に含有している本発明の生成物の保有する抗酸化作用、 L D L— C低減作用、マクロファージが酸化 L D L—Cを取り込むことにより血管内面に蓄積した泡沫細胞中のコレステロールを分解、除去する作用、内皮由来弛緩因子（E D R F ) による血管弛緩作用や血小板凝集抑制作用、ィン夕ーロイキン I L— 1や I L— 2による血管弛緩作用、乳酸菌によるコレステロール低減作用の 1つ若しくは複数の作用により発揮されるものである。

また、他方の免疫賦活機能は、本発明の生成物の基質内に非常に多数増殖されている乳酸菌、特にェンテロコッカス属中でもェンテロコッカス · フエシゥムが優れた免疫賦活機能を保有しているために、その菌が製産する免疫賦活剤が人や家畜や魚類等の脊椎動物の消化器官から体内に吸収されると、免疫賦活機能を発揮することにより、当該生物の免疫性を向上させて、健康の維持、促進、病気の予防等を良好に行なわせることができる。また、本発明によるコレステロール低下機能は次のようにしてなされるものと考えられる。

前記のように多量に増殖された乳酸菌自体の働きと、麹菌の増殖によつて生成された酵素であるプロテアーゼによる未分解物の働きとの枏乗的な作用によるコレステロール値の低下作用が発揮されることが期待できる。更に、前記動脈硬化防止機能、免疫賦活機能およびコレステロール低下機能は相乗的に作用するようになり、脊椎動物の健康の維持、促進、病気の予防等を良好に行なわせることができる。

また、本発明の動脈硬化防止素材や免疫賦活素材は脊椎動物の育成において、例えば、家畜、家禽、魚類等の食料に必要量添加して給与される。このようにして、脊椎動物が前記動脈硬化防止素材や免疫陚活素材を添加した食料を摂取することにより育成されると、これらの動脈硬化防止素材や免疫賦活素材は脊椎動物の消化器官から体内に吸収され、動脈硬化防止機能を発揮することにより、当該脊椎動物の動脈硬化疾患の発生を確実に防止させて、健康の維持、促進、病気の予防等を良好に行なわせることができるし、免疫賦活機能を発揮することにより、当該脊椎動物の免疫性を向上させて、健康の維持、促進、病気の予防等を良好に行なわせることができる。さらに、このようにして育成された脊椎動物を食用として利用する場合には、極めて健康な状態で育成された脊椎動物の食肉等として利用することができる。

更に、本実施例の動脈硬化防止素材や免疫賦活素材を摂取した鳥類および魚類が産卵した卵の成分は、これらを添加していない通常の食料を摂取した鳥類等の卵の成分に比較してコレステロールが低く、イソフラボンァグリコンが多量のものとなる。これは本実施例の動脈硬化防止素材や免疫賦活素材により鳥類および魚類が健康となり、その結果得られる卵もより健康的な成分となるからである。このことより、本実施例の動脈硬化防止素材や免疫賦活素材を飼料並びに餌料に添加して給与すると、種々の脊椎動物の有効な養殖方法を行なうことができる。

次に、図 1の鎖線に示す部分により本発明の動脈硬化防止素材や免疫賦活素材の他の製造方法を説明する。

本実施例においては、製麹処理によって生成された生成物に対して、加水分解工程において麹菌と乳酸菌とを共存共生させて増殖促進させるようにしたものである。

従って、製麹処理が終了するまでは前記実施例と同一の工程で行なわれる。そして、加水分解の際に乳酸菌を製麹処理による生成物に添加するか、およびまたは原料となる豆類に含有されていた自然由来の乳酸菌をもって、乳酸菌を生成物中に入れる。

この乳酸菌としては、ェンテロコッカス属特にェンテロコッカス · フエシゥムとするとよい。

このようにして乳酸菌を製麹処理による生成物中に入れて加水分解工程を開始させると、加水分解工程中に製麹処理において増殖した麹菌と乳酸菌とが同一基質である前記生成物に共存共生し、乳酸菌は生成物から栄養の付与を受けて増殖を促進させられて、生成物に麹菌と乳酸菌とがー緒に培養された状態となる。特に、製麹処理により生成物中にはビタミン B類が生成され、乳酸菌にとっても吸収しやすい栄養価の高い成分が生成されるために、これらを栄養源として乳酸菌の増殖が促進される。更に、本実施例の生成物内には、麹菌の酵素で種々の成分が加水分解されたものは、大豆粕を消化酵素で分解したものに相当し、消化物と未消化物とが分離している状態である。麹菌の酵素で加水分解された分解物（消化物）は人や家畜が摂取すると直ちに吸収されるが、未分解物は吸収されずに腸内で常在している有用な乳酸菌の栄養源となり、人や家畜にとって有用な短鎖脂肪酸の生成を増加させることになる。

しかも、前記生成物は乳酸菌が活発に増殖できる培地であるから、増殖したその乳酸菌が家畜の腸内で前記生成物に含有される酵素未分解物を栄養源として常在できるものである。そして、最終的には麹菌と有用微生物とが同一基質である生成物に培養されているプロバイオテックスを利用した乳酸菌の増殖促進機能を保有する豆類を原料としたの動脈硬化防止素材や免疫賦活素材が生成される。

このようにして製造された本実施例の動脈硬化防止素材や免疫賦活素材も前記実施例と同様に優れた機能を発揮する。

次に、本発明の動脈硬化防止素材や免疫賦活素材について具体例をもつて説明する。

前記のようにして麹菌としてァスペルギルス ·オリゼーを用いて本発明によって生成した動脈硬化防止素材や免疫賦活素材となる発酵大豆粕はィソフラボン化合物が良好に分解されたものとなる。即ち、未処理大豆粕においては、グリコシドであるダイジンおよびゲニスチンがァグリコンであるダイゼィンおよびゲニスティンに比較して極めて多いのに、本発明によつて生成された発酵大豆粕においては、グリコシドであるダイジンおよびゲニスチンが分解されて極めて少なくなり、分解によって生成されたァグリコンであるダイゼィンおよびゲニスティンが極めて多くなる。

即ち、無処理の大豆粕に対して品温が 3 5 になるように通風しながら、調節し、 4 8時間の製麹を施し、水分含量が約 5 0 %となるように加水し、 4 5 で 2 4時間以上に亘つて麹菌の酵素で大豆の成分や麹菌の成分を加水分解を施してなる大豆粕中のィソフラボン化合物の含有量は表一 2の通りとなり、イソフラボン化合物のァグリコン体であるダイゼィンゃゲニスティンが多量に得られることが分かる。

また、大豆胚芽について説明すると、予め大豆胚芽を蒸煮後に水分含量が約 3 7 %となるように加水した後、蒸煮し、殺菌し、冷却した後、大豆胚芽と麹菌との配合割合は、大豆胚芽を 4 0 0 k gに対して麹菌胞子を 8 X 1 0 '個に調整した種麹（精白米にて調整）を 2 0 0 gを混合した。さらに製麹のス夕一ト時には 3 2でに冷却した後、品温が 4 0でになるまで通風しないで 4 O tになった時点で通風しながら、温度上昇を抑えた。ス夕一トから約 1 7時間後の最初の攪拌（盛工程）を行った。大豆胚芽の塊を解し、攪拌後品温が 3 5で前後になるように通風しながら、温度をコントロールをした。次いで約 8時間後に 2回目の攪拌（仲工程）を行い、塊を解した。再び品温を通風で 3 5 前後にコントロールし、さらに約 1 6時間後に 3回目の攪拌（仕舞工程）を前回同様に行った。その後は品温が約

3 8でになるように通風しながら、温度コントロールし、スタートから 4 8時間後に製麹を終了させた。製麹終了後、水分含量が 5 0 %になるように攪拌しながら、水分調整を行い、品温が約 5 0でになるように加温後、

4 8時間以上麹菌の酵素で大豆胚芽中のイソフラボン化合物の大部分がァダリコン体になるまで加水分解した。表一 3の通り本発明による処理により大豆胚芽のィソフラボン化合物はァグリコン体のダイゼィンが主体に多量得られた。

表一 2

(単位： mgZlひ 0 g) 表一 3 単位： mg/100 g

このように本発明によれば、大豆粕中のィソフラボン化合物のうち薬理作用の高いァグリコン類を極めて高い生成比率をもって製造することがでさる。次に、上記のような特性を有する本発明の免疫賦活素材による免疫賦活機能をひよこ並びにマウスの育成試験の内容をもって説明する。免疫賦活機能に関する試験 1

試験目的

鶏の雛の育成時のへい死数により免疫賦活機能を調べる。

試験方法

比較区と試験区とにそれぞれ孵化直後の幼鶏を 6 2 0 0羽づっ分け、比較区には通常の飼料中に枯草菌素材（0 . 1重量％) を添加した飼料を供与し、試験区には通常の飼料中に本発明の豆類由来生成物であって乳酸菌（En t e r oc occus f aec i um) を有用微生物として増殖させた生成物（0 . 1重量％) を添加した飼料を供与し、. 1週齢、 2週齢、 3週齢、週齢の時の雛のへい死数を比較した。

試験結果

1週齢の時の雛のへい死数は、比較区では 4 0羽、試験区では 2 5 羽

2週齢の時の雛のへい死数は、比較区では 6 0羽、試験区では 5 0 羽

3週齢の時の雛のへい死数は、比較区では 1 2 5羽、試験区では 6 0 羽

4週齢の時の雛のへい死数は、比較区では 1 7 0羽、試験区では 7 5 羽

であった。

比較区では 3週以上経過した時にへい死数が非常に多くなつたために抗生物質であるアンピシリンを急遽投与したが、へい死数の増加を抑えることができなかった。

この結果より、 4週齢の結果を比較すると、本発明の免疫賦活素材を飼料に添加することにより雛のへい死数を、現在通常行われている枯草菌素材と現在の最高の対策とされている抗生物質を添加した場合の 45 %以下に押さえることができた。これは本発明の免疫賦活素材の保有する免疫賦活機能が良好に作用して、体力が最も弱い時期の幼鶏の免疫性を向上させることにより、へい死を防止させたものである。免疫陚活機能に関する試験 2

試験目的

マウスをストレスを付加した状態で育成し、脾臓の性状（ 1し一 5、 I L— 2、 I NF—ァ、 NK活性）の変化によって全身の免疫賦活機能を調べ、パイエル板の性状（ I L— 5、 I L— 2、 I NF—ァ、 I gA抗体）の変化によって腸管、食道、肛門等の粘膜組織のある部分の免疫賦活機能を調べる。前記の一方の脾臓の性状を示す各因子（ I L— 5、 I L- 2、 I NF—ァ、 NK活性）はそれぞれストレスによって低下させられる性質を有している。他方のパイエル板の性状を示す各因子（ I L一 5、 I L一 2、 I NF—ァ、 I gA抗体）も同様にそれぞれストレスによって低下させられる性質を有している。

試験方法

1) 比較区と試験区 1および 2とにそれぞれ 4週齢の雌のマウスを 6 匹づっ分け、比較区には通常の飼料を供与し、試験区 1には通常の飼料中に本発明の豆類由来生成物であって乳酸菌（Enterococcus faecium) を有用微生物として増殖させた生成物（0. 1重量％) を添加した飼料を供与し、試験区 2には通常の飼料中に本発明の豆類由来生成物であって乳酸菌 (Enterococcus faecium) を有用微生物として増殖させた生成物（ 1. 0 重量％) を添加した飼料を供与し、通常の環境下における育成設定温度である 2 6 ± 1でに対して 38土 1での育成温度として高温ストレスを負荷した状態で 28日間育成し、 29日目に全例を解剖して脾臓の性状の変化およびパイエル板の性状の変化を以下の測定手順によって測定した。

2) 脾臓処理方法とパイエル板処理方法

一方の脾臓（S PL) については、各例から脾臓を締出後、スライドグラスを用いて押しつぶして細胞を回収し、培養液によって細胞を洗浄した後にステンレスメッシュで濾過し、細胞浮遊液として用いた。

他方のパイエル板（PP) については、パイエル板を小腸より摘出した後にスライドグラスで押しつぶしメッシュで濾過した後に遠心分離し、上清を I gA測定に使用し、沈殿物をパーコールを用いた比重遠心分離を行い、界面に残った細胞を回収し、洗浄して調製した。これらの細胞は、 5 X 1 0⁸ c e 1 1 s /m 1の濃度に調製したものを 96穴プレートに 20 0 a 1づっ加え 37でで培養した。

3) 各測定項目測定方法

• NK活性の測定（脾臓について）

前記のようにしてで調製した細胞浮遊液を 1 60 0 r pm、 5t:で 2分間の遠心分離を施し、その後、さらに 1 0 % F C S添加 R PM I 1 6 40培地中に浮遊させて、 NK活性を⁵¹ C r遊離法にて測定した。

· I gA抗体の測定（パイエル板について）

測定にはマイクロプレートリーダ一（MTP— 32) を使用した。 I gA抗体価は、蛍光酵素抗体法（蛍光 EL I SA法）にて測定を行った。この蛍光 EL I SA法は、まず 96穴ブラックプレートを用い、 0. 1 M のリン酸バッファ一に 2mg "m lの濃度で希釈した抗マウス I gA抗体を各ゥエルに 50 1づっ加え、ー晚 4ででコートした。このコーティング終了後、 P B Sに Twe e n 20を 0. 0 5 %溶かした洗浄用バッファ一 (P B S/Twe e n) で 3回洗浄し、 P B Sに B S Aを 1 %溶かしたブロッキング用バッファ二を各ゥエルに 1 00 1加え、室温で 1時間ブロッキングを行った。ここに、前記の遠心分離時の上清を 0. 45 mシリンジフィル夕で濾過したものを加え、ピオチン化した抗マウス I g A抗体と J3— D— g a l a c t o s i d a s結合ストレプトアビジンでそれぞれ 1時間処理を行った。洗浄後、 0. ImM 4 -MU- /3 -D- g a 1 a c t o s i d eを 1 00 z I加え、 3 7 で 2時間ィンキュベー-トした。反応は 0. 1 M g 1 y c i n e— N a〇Hを 1 00 1加えて停止させ、マイクロプレートリーダーで測定し、 f l u o r e s c e n c e u n i t s (FU) として示した。

•サイトカインの測定

I L - 2について

R e s p o n d e rとしてマウスの脾臓およびパイエル板のナイロンウールカラム通過細胞を使用し、非働化した同系の正常マウス血清 (NMS) 0. 5 %および 5 X 1 0— ⁵Mの 2—メルカプトエタノール（2 ME ：和光純薬製商品名）を含む RPM I— 1 640培地（S i gma) で、 5 X 1 0⁸ c e 1 1 s /m 1に調製した。これを 1 00 1づっ 96 穴の V型マイクロプレート（F l ow L a b o r a t o r i e s , I n c . ) に分注して、 37 、 5 %C〇₂の条件下で 5日間培養して、この培養上清を I L一 2サンプルとして使用した。サンプルを CTLL— 2細胞（2. 5 X 1 0³ c e 1 1 s ) に加え、その³ H— T d Rの取り込み値から 01 1 1 1 3 らの ]" 01) 1 セ a n a l y s i sに準拠して I L— 2 un i tを算出した。

I L一 5、 I NF - rについて

前記脾臓処理方法およびパイエル板処理方法にて調製した細胞を 10%FCS添加 RPMI— 1640培地で細胞を調製し、 24穴プレートに 2 X 10⁸個 Zm 1 /we 1 1になるように分注後、 ConA50 g /m 1を最終濃度 5 gZm 1になるよう 100 1加え、 37で、 5 % CO ₂ィンキュベー夕一内で 24時間培養した。培養後、各 we 1 1の細胞浮遊液を 0. 45 シリンジフィル夕で濾過し、濾過液を I L— 5、 I NF—ァ産生能測定用サンプルとした。抗マウス I L— 5および I-NF— ァ抗体をコートした 96穴プレートに細胞培養上清を 50 m 1づっ加え、 2次抗体にピオチン化した抗マウス各サイトカインの抗体を加えた。 1時間室温で培養後、ストレプトアビジンべ一夕ガラクトシダ一ゼを加えてさらに 1時間培養後、 4一メチルフンベリフエ二ルベー夕ガラクトシドを添加し反応させ、反応停止後 MTP— 32にて測定した。

試験結果

試験区 1および 2と比較区における脾臓の性状（ I L— 5、 I L一 2、 I NF—ァ、 NK活性）の変化およびパイエル板の性状（I L— 5、 I L 一 2、 I NF—ァ、 I g A抗体）の変化は表一 4および表一 5に示す通りである。各表において、測定値は平均値土標準備差で表し、有意差検定は 5 %とし、表中に *を付してある。表一 4 脾臓各測定項目

*有意差あり ( 5 %) 表一 5 パイエル板各測定項目

*有意差あり（5 %) 表一 4および表 - 5から、本発明の免疫賦活素材の保有する免疫賦活機能が良好に作用して、全身の免疫賦活機能および粘膜組織のある部分の免疫陚活機能が大きく向上させられたことがわかる。

即ち、マウスに対して通常の育成条件の温度より 1 o :も高い高温負荷を 2 8日間に亘つてかけられているために、マウスにはストレスがたまり、比較区においては脾臓の性状およびパイエル板の性状を示す各因子がそれぞれ低下しているのに対し、本発明の免疫賦活素材を飼料に添加された試験区 1および 2においては、脾臓の性状およびパイエル板の性状を示す各因子がそれぞれ比較区よりも有意差をもった高い値を示している。表— 4 において、特に、脾臓の性状を顕著に示す N K活性値を見れば、比較区の 1 8. 5 ± 4. 3に対して試験区 1においては 23. 6 ± 3. 9と大きく向上させられていので、全身の免疫賦活機能が本発明素材によって大きく向上させられたことがわかる。また、表一 5において、特に、パイエル板の性状を顕著に示す I g A抗体を見れば、比較区の 42 5. 5 ± 1 6. 3 に対して試験区 1においては 52 5. 5 ± 1 9. 6および試験区 2においては 6 2 3. 5 ± 1 5. 3と大きく向上させられているので、本発明素材に腸管粘膜免疫系の I g A抗体を高める抗原が存在することが確認できた。免疫系には全身免疫系と局所免疫系があり、局所免疫系の腸管粘膜免疫系は経口感染の免疫系であるため最近非常に注目されている。この局所免疫系は抗原による経口的な経粘膜免疫寛容が成立すると全身免疫系の I gE 抗体の分泌を抑制するとの報告がある。 I gE抗体は食物アレルギーや花粉症などの発症に関係する抗体といわれ、腸管粘膜免疫を賦活させることで近年問題化している食物アレルギーや花粉症を予防することも可能になるかもしれないため、腸管粘膜免疫系を賦活させる毒性のない安全な抗原が望まれる所であつたが、本発明素材は少なくとも腸管粘膜免疫系に対して安全な抗原を含有していることが確認できた。さらには I gA抗体の賦活には TGF— βの産生が関係しているとの報告（Sonoda,E. ,Matsumoto, R.et al. :J.Exp. Med. , 170 : 1415-1420, 1989) もあり、腸管免疫の陚活が動脈硬化の予防にも関与する可能性も示唆できる。また、本発明素材で腸管粘膜免疫系ばかりでなく、全身免疫系の陚活も NK活性が高まったことは癌の予防などの効果の期待が示唆できる。

なお、従来においては、表— 5に示すような I g A抗体を向上させ機能を有する食品はなかった。更に、上記のような特性を有する本発明の動脈硬化防止素材による動脈硬化防止機能をラットの育成試験の内容をもって説明する。動脈硬化防止機能に関する試験 1

試験目的

卵巣を摘出したラットにカゼイン添加飼料（表— 6参照）を与えて育成して動脈硬化を起こしやすい体質とさせたラットに対して、本発明の動脈硬化防止素材を更に濃縮した動脈硬化防止素材（以下、濃縮素材という）を 5週間連日経口投与しながら育成して、その間のラットの体重変化および摂餌量変化や、経口投与終了時における血液中の T C、 L D L— C、 H D L— C、 T Gの値によって動脈硬化防止機能を調べる。

ここで卵巣を摘出したラットを検体とするのは、閉経後の雌の脊椎動物においてはエストロゲンの分泌が急速に低下するために動脈硬化が急速に進行するので、体重、摂餌量、 T C、 L D L— C、 H D L - C T Gの値がそれぞれ顕著に増加するために、これらの変化を測定することにより動脈硬化防止機能を判定することができるからである。

本発明の豆類由来生成物は麹菌の酵素で大豆胚芽中のイソフラボン化合物をァグリコン体にした生成物であってダイゼィンの割合が約 7 0 %を占める。ダイゼィンはゲニスティンに比べてエストロゲン作用が強いため卵巣摘出ラットでの脂質代謝異常改善効果が期待できる。試験に使ったイソフラボンァグリコンの抽出濃縮物は大豆胚芽生成物をへキサンで脱脂後、溶媒（例えば、エタノール）で抽出濃縮を施し、約 3 0重量％ (ダイゼィンが 2 3 . 4重量％、グリシティンが 8 . 0重量％、ゲニスティンが 1 . 5重量％) としたものである。そのイソフラボンァグリコン組成は表— 7 の通りである,

表一 6

表一 7 本発明素材の濃縮物の組成

試験方法

1 ) 卵巣摘出の有無による差をも判定するために、卵巣摘出ラット ( 9週齢）と卵巣を摘出しない偽手術を施した偽手術ラット（9週齢）を用意し、 1週間以上の馴化飼育を行い、健康で各区で体重も揃った検体となる雌のラットを育成した。

2) ラットへの投与物として、日本薬局方カルメロースナトリウムを日本薬局方注射用水に溶解させて 0 . 5重量％の濃度に調製した媒体と、この媒体に対して 2種類の規定量の前記濃縮素材並びにィソフラボングリコシドを混合した既定濃度の懸渴液を用意した。

3) 比較区 1に偽手術ラットを 8匹、比較区 2および 3並びに試験区 1および 2とにそれぞれ卵巣摘出ラットを 8匹づっ分け、各区の各ラットに対して最近時の体重に対する割合を 1 0 m 1 Z k gとして表一 8に示す投与物を 1日 1回強制経口投与した。比較区 3並びに試験区 1および 2には、投与するァグリコンになっているィソフラボンの量が同表の投与量となるように調整した。

表一 8

4) 体重の測定

全ラットの体重を、投与開始日と、その後週 1回測定した。

5) 摂餌量

全ラットについて、週 1回、 2日間の摂餌量を測定し、 1日平均摂餌量を算出した。

6) 血液の化学的特性の検査全ラットについて、 5週の投与終了後の翌日、エーテル麻酔下で腹大動脈から採血した血液中の TC、 LDL— C、 HDL— C、 TGの値を測定した。

7) データの統計学的処理

各区の定量データについて B a r t 1 e t t法による等分散性の検定を行い、等分散の場合には 1元配置法による分散分析を行い、有意ならば対照群との群間比較は Du n n e t t法により行う。一方、等分散でない場合には K r u s k a— Wa 1 1 i sの検定を行い、有意ならば対照群との群間比較は順位を利用した D u n n e t t法により行う。なお、検定は両側検定とし、有意水準は 5および 1 %とする。

試験結果

1) 体重の測定結果は図 2に示す通りである。

2) 摂餌量の測定結果は図 3に示す通りである。

3) 血液中の TC、 LDL— (：、 HDL— C、 TGの値の測定結果は表— 9および図 4に示す通りである。

表一 9

'Pく 0.01 (有意差あり）図 2に示す体重の変化より、本発明の動脈硬化防止素材の保有する動脈硬化防止機能が良好に作用して、ラットの体重の増加が抑えられて、動脈硬化の進行が抑制されたことがわかる。

即ち、比較区 2および 3並びに試験区 1および 2の卵巣摘出ラットは、比較区 1の偽手術ラットに比較して、投与物の投与前の育成期間に卵巣が摘出されているために体重が 2 5 gも増加している。投与物を投与すると、比較区 2および 3においては投与物による動脈硬化防止機能が十分でないためにラッ卜の体重はそのまま増加傾向を維持して増加するのに対し、試験区 1および 2においては投与物であるァグリコンを濃縮された本発明の濃縮素材の動脈硬化防止機能が十分に発揮されてラッ卜の体重は最初の 1 週間で減少し、その後は比較区 1の偽手術ラットと同様の体重の変化傾向を有するようになり、体重の増加を有効に抑えられていることがわかる。図 3に示す摂餌量の変化により、本発明の動脈硬化防止素材の保有する動脈硬化防止機能が良好に作用して、ラットの摂餌量の増加が低く抑えられて、動脈硬化の進行が抑制されたことがわかる。

即ち、比較区 1から 3においてはラットの摂餌量が多いが、試験区 1および 2の本発明のァグリコンを濃縮された濃縮素材を投与したラットの摂餌量は低く抑えられており、動脈硬化の進行が抑制されたことがわかる。表一 9および図 4に示す摂餌量血液中の T C、 L D L - C , H D L— C、 T Gの値の変化より、本発明の動脈硬化防止素材の保有する動脈硬化防止機能が良好に作用して、ラットの各値が低く抑えられて、動脈硬化の進行が抑制されたことがわかる。

即ち、比較区 1の偽手術ラッ卜に比較して比較区 2の卵巣摘出ラットはエストロゲンの分泌が急速に低下することにより T C、 L D L— C、 H D L一 C、 TGの値がそれぞれ増加している。また、比較区 3のイソフラボングリコシドを投与されたラットにおいては、 TC、 LDL— C、 HDL 一 Cの各値が比較区 1の約 1 Z2程度までしか低減されておらず、中性脂肪の値に至っては比較区 1よりも増大しており、効果的な動脈硬化防止機能が発揮されていない。

これらに対して、試験区 1および 2の本発明のァグリコンを濃縮された濃縮素材を投与したラットにおいては、 TC、 LDL-C, HDL— C、 TGの値の全てが大きく低減されている。動脈硬化を発症させる最大の要因である LDL— Cについてみれば、ァグリコンの含有量が低い試験区 1 においても比較区 1の 1 2以下に低減されており、ァグリコンの含有量が多い試験区 2においては比較区 1の 1 Z 5以下に低減されており、十分な効果的な動脈硬化防止機能が発揮されていることがわかる。また、 TC および HD L— Cの各値は、ァグリコンの含有量が低い試験区 1においても比較区 1の 1 3以下に低減されており、ァグリコンの含有量が多い試験区 2においては比較区 1の 1 7および 1/ 1 1以下に低減されている。更に、 TGの値は、ァグリコンの含有量が多い試験区 2においては比較区 1の約 2 3以下に低減されており、ァグリコンの含有量が低い試験区 1 においても比較区 1より低減されている。従って、これらの結果より本発明の動脈硬化防止素材の保有する動脈硬化防止機能が良好に作用して、ラッ卜の各値が低く抑えられて、動脈硬化の進行が抑制されたことがわかる。卵巣摘出ラットは更年期女性のモデル動物である。すなわち、閉経後の女性はホルモンの分泌の減少により、脂質代謝異常が起こり、高脂血症になりやすいため動脈硬化症になるリスクが高まるが、この試験の結果では本発明素材（イソフラボンァグリコン濃縮物）は更年期女性の脂質代謝異常の改善効果がかなり期待できる結果であった。従来は大豆蛋白質に食事中のコレステロールの摂取を抑制する働きが認められていたが、この場合大豆蛋白質を食事と共に摂取しなければならなかった。しかし、本発明品の場合、サプリメントとしての摂取でよく、食事中の蛋白質の何割かを大豆蛋白質に置き換える必要もないので、食事に対してストレスを持たずに血中コレステロール値が抑えられる。動脈硬化防止機能に関する試験 2

試験目的

本発明の前記の濃縮素材が動脈硬化の原因の 1つである血管中膜平滑筋細胞の増殖を抑制する作用があることを調べる。

試験方法

1) 脳卒中が容易に発症しやすい脳卒中易発症ラット（SHRS P) の大動脈中膜由来平滑筋細胞（SMC) を e x p 1 a n t法によって調整し、 5代継代培養した。

2) 24 we 1 1 p l a t e に 1 0 000 /w e 1 1の S M C を播種後、 37^、 5 % C 0₂で 1 0 %の F B Sを含む DMEM培地で s u b c ο η ί 1 u e n t状態の細胞を洗浄し、 0. 4% a l b um i nを含む DMEM培地（フエノールレット不含）に交換後 48時間培養した。

3) 1 0 %の FB S (チヤコール処理済）を含む DMEM培地（フエノールレット不含）にゲニスティン（以下、 G e nという）、ダイゼイン

(以下、 D a i という）、グリシティン（以下、 G 1 yという）および本発明の濃縮素材をそれぞれ 0. 1〜 30 ^mo 1ノ 1の濃度に添加し、 5 日間培養し、細胞数を c u l t e r c o u n t e rによって測定した (以下、測定 Aという）。

4) 上記方法に従って P D G F 2 0 n g /m 1 を添加して細胞数を測定した（以下、測定 Bという）。

試験結果

1) 測定 Aの結果は図 5に示す通りである。

2) 測定 Bの結果は図 6に示す通りである。

図 5および図 6に示すように、ィソフラボンの濃度の増加に従って平滑筋細胞増殖能（コンントロールと比較）が低減している。特に、本発明の濃縮素材によれば、 G e n単体および D a i単体のものとほぼ同等の細胞低減作用が発揮されていることがわかる。従って、本発明の濃縮素材は動脈硬化の原因の 1つである血管中膜平滑筋細胞の増殖を抑制する作用があり、優れた動脈硬化防止機能を発揮することができるものである。

即ち、動脈硬化では酸化 L C L— Cのマクロファ一ジへの取り込みで血管に脂肪線条が形成されるが、動脈硬化の後期には血管中膜の平滑筋細胞の遊走と増殖が起こり、血管は閉塞しやすくなる。この試験で本発明の生成物であるイソフラボンァグリコン濃縮物に比較的低濃度で平滑筋細胞の増殖を抑制する作用が確認できたことは、すでに動脈硬化が進行している人にとってもそれ以上の進行を抑える働きが期待できることを示唆しており、本発明品は動脈硬化防止には非常に有効な素材となり得る。また、前記のようにして製造された大豆粕を飼料等として利用する場合には、図 1に示すように、前記各実施例のようにして製造された大豆粕をそれぞれ乾燥させ、その後粉砕することにより、粉砕大豆粕として利用するとよい。また、乳酸菌の菌体を利用する免疫賦活素材の場合には、菌体が死んでも機能を発揮するために、生成物を加熱殺菌して用いるようにしてもよい。

また、本発明においては従来の製麹装置をそのまま利用して実施することができ、生産ベースの装置を特に製造する必要もなく、汎用性の高いものである。

なお、本発明は前記各実施例に限定されるものではなく、必要に応じて変更すことができる。

Claims

請求の範囲

1 豆類に麹菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質およびまたは糖質を加水分解することにより製せられて、動脈硬化防止機能を保有する生成物とされることを特徴とする動脈硬化防止素材。

2 前記製麹処理による生成物中に含まれている乳酸菌およびまたは前記製麹処理による生成物に添加された乳酸菌が、前記加水分解の際に増殖促進させられることを特徴とする請求項 1に記載の動脈硬化防止素材。

3 前記乳酸菌はェンテロコッカス属であるあることを特徴とする請求項 2に記載の動脈硬化防止素材。 4 前記ェンテロコッカス属は、ェンテロコッカス ' フエシゥムおよびェンテロコッカス · フエカリスの少なくとも 1種であることを特徵とする請求項 3に記載の動脈硬化防止素材。

5 前記動脈硬化防止機能を保有する生成物が濃縮状態とされていることを特徴とする請求項 1から請求項 4のいずれか 1項に記載の動脈硬化防止素材。

6 豆類に麹菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質およびまたは糖質を加水分解するとともに、前記製麹処理による生成物中に含まれている乳酸菌およびまたは前記製麹処理による生成物に添加された乳酸菌が、前記加水分解の際に増殖促進させられることにより製せられて、免疫賦活機能を保有する生成物とされることを特徴とする免疫賦活素材。

7 免疫賦活素材は、動脈硬化防止機能をも保有する生成物であることを特徴とする請求項 6に記載の免疫賦活素材。

8 前記乳酸菌はェンテロコッカス属であるあることを特徴とする請求項 6または請求項 7に記載の免疫賦活素材。

9 前記ェンテロコッカス属は、ェンテロコッカス ' フエシゥムおよびェンテロコッカス · フエカリスの少なくとも 1種であるあることを特徴とする請求項 8に記載の免疫賦活素材。

1 0 前記請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の動脈硬化防止素材若しくは前記請求項 6から請求項 9のいずれか 1項に記載の免疫賦活素材を食した人間を除く脊椎動物。

1 1 前記請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の動脈硬化防止素材若しくは前記請求項 6から請求項 9のいずれか 1項に記載の免疫賦活素材を食した人間を除く脊椎動物の卵。