WO2000023476A1 - Peptides specifiques pour la neovascularisation - Google Patents

Description

明 細 書

新生血管特異的べプチ ド

技 術 分 野

本発明は、 新生血管に選択的に帰巣するペプチ ド分子、 よ り 詳し く は例えば癌組織の新生血管内皮細胞に対する リ ガン ド と して機能し、 分子医薬と して有用であ り、 標 的組織に選択的に薬物送達を可能とする ド ラ ッ グ デリ バ リ 一 システム （ D D S ) 製剤に応用可能であ り、 癌治療 効果の向上に寄与できる、 新生血管特異的ペプチ ド に関 する。

背 景 技 術

癌化学療法を困難にしている一因 と しては、 投与され た薬物が標的とする癌組織のみな らず正常組織まで殺傷 し、 副作用を引き起こすこ とが挙げられる。 かかる副作 用の軽減や、 抗癌剤の薬効の向上を実現する もの と して、 癌治療の分野においては、 ド ラ ッ グ デリ バリ ー システ ム （D D S ： Drug De l ivery Sy s t em)が注目 を集めている。

癌を標的と した上記 D D S は、 パッ シブターゲティ ン グによる ものと、 アクティ ブ夕ーゲティ ングによる もの の 2 種類に大別される。 新生血管は既存の血管に比べて 血管透過性が亢進しているため、 長期血中滞留型の製剤 は、 徐々 に癌組織に集積する。 その性質を利用 したター ゲティ ングが、 パッ シブターゲテイ ングであ り、 欧米で は既に リ ボソームを用いたパッ シブタ一ゲティ ング製剤 が、 力ポジ肉腫の治療に使用 されている。 一方、 ァクテ イ ブ夕一ゲティ ング製剤は、 癌細胞やその周辺組織に高 発現する蛋白な どの細胞表面マーカ一に結合する抗体や その他の リ ガン ド にて薬剤を修飾し、 正常組織に有害な 影響を与えず、 癌組織に積極的且つ選択的に薬剤を送達 できるよ う に設計した製剤である。

また、 現在の癌治療分野においては、 血管新生が注目 されている。 この血管新生とは、 癌が成長する過程にお いて、 癌の成長に伴って癌組織内部の血管も同時に発達 する こ とをい う。 即ち、 癌細胞の活発な増殖、 癌組織の 成長、 転移が起こるためには、 栄養分、 酸素の供給、 代 謝老廃物の排泄を行う器官である血管が新たに構築され る こ とが重要であ り、 この点で、 癌組織の成長は、 血管 新生に大き く 依存している といえる。

この血管新生を抑制すれば、 癌組織の成長、 転移を抑 制できる と考え られ、 この こ とか ら、 新生血管を標的と した癌の治療法、 特に新生血管を標的とするアクティ ブ 夕ーゲティ ング製剤 （ D D S製剤） の開発が当業界で所 望されている。

明 の 1 ^ 上記癌組織の新生血管内皮細胞に対して リ ガン ド とな る物質を同定、 単離、 提供できれば、 これは D D S製剤 への応用および癌治療効果の更なる向上が期待できる。 本発明は、 かかる新たな リ ガン ド を提供する こ とを 目的 と している。 また本発明は、 血管新生を抑制する物質を 提供する こ とをも 目的と している。

本発明者 らは、 上記目的よ り鋭意研究を重ねる過程に おいて以下の知見を得た。 即ちまず本発明者ら は、 チヤ ンノ、、一 リ ング法（Folkman, J. , e t al. , J. Exp. Med. , ill, 275-288 ( 1971 ))によ り、 マウス背部に腫瘍新生血 管を誘導形成させた後、 フ ァージのコー ト タ ンパク質 P 111遺伝子にラ ンダムな D N Aを挿入して、 フ ァージ外 殻表面にラ ンダムな 1 5 ア ミ ノ酸配列のペプチ ド を発現 し得るよ う に構築したラ ンダムペプチ ドディ スプレイ フ ァージを上記マウスに投与し、 その後、 該マウス を液体 窒素で凍結し、 新生血管のできた皮膚を切 り取 り、 蛋白 分解酵素阻害剤含有培養液中にてホモジナイ ズし、 洗浄 ' 遠心分離後、 新生血管か ら フ ァージを回収し、 これを 大腸菌に感染させて大量培養し、 分離、 精製して、 新生 血管内皮に集積した リ ガン ド となるペプチ ド発現フ ァー ジを得た。 か く して得られた複数個のフ ァージについて、 それらの発現するペプチ ドの配列決定を行っ た。 ついで、 新生血管に親和性の高いペプチ ド発現フ ァー ジを選択するために、 上記で得 られた各フ ァージを、 癌 細胞を移植した担癌マウスの尾静脈内に投与し、 上記と 同様にマウスを液体窒素で凍結し、 癌組織を切除摘出 し、 得 られた材料か ら フ ァージを分離精製し、 大腸菌に感染 させ、 培養した。 そして、 フ ァージのコ ロニー形成単位 を選別前のフ ァージをコ ン ト ロールと して測定し、 新生 血管に対する親和性を、 癌組織 1 0 0 m g あた り におけ る、 尾静脈内に投与したフ ァージ数に対する集積フ ァー ジ数の比と して算出 し、 か く して、 新生血管に対する親 和性の高い リ ガン ド と しての候補ペプチ ドを得た。

更に、 本発明者らは、 上記ペプチ ド、 上記ペプチ ドの デン ド リ マー （dendrimer)、 上記べプチ ドの部分べプチ ド な どを合成し、 これらが実際に抗腫瘍効果を奏する こ と を確認する と共に、 上記ペプチ ド、 特に Trp_Arg-Pro配列 および Pro- Arg-Pro配列を含むペプチ ドで修飾した リ ポソ —ムの腫瘍内分布がコ ン ト ロールに比べて有意に高い こ とを確認した。

本発明は、 これらの知見に基づいて完成されたもので ある。

本発明によれば、 新生血管に選択的に帰巣し、 以下の (a)および（b)のいずれかである新生血管特異的べプチ ド が提供される。

( a)配列番号 1 か ら 1 1 で示されるアミ ノ酸配列のいずれ かを有するぺプチ ド またはそのデン ド リ マ一、

(b )上記（a)に示されるア ミ ノ酸配列において 1 若し く は 複数個のア ミ ノ酸が置換、 欠失若し く は付加されたア ミ ノ酸配列か らな り、 かつ新生血管に親和性を有するぺプ チ ド またはそのデン ド リ マ一。

特に、 本発明によれば、 配列番号 1 か ら 1 1 で示され る ア ミ ノ酸配列のいずれかを有するぺプチ ド またはその デン ド リ マ一である上記新生血管特異的ペプチ ド ； よ り 好ま し く は、 配列番号 1、 5 および 6 で示されるァ ミ ノ 酸配列のいずれかを有するペプチ ド またはそのデン ド リ マーである上記新生血管特異的ペプチ ド ； 配列番号 1 〜 1 1 で示されるアミ ノ酸配列のペプチ ドの同一または異 なる複数個を含むデン ド リ マ一である上記新生血管特異 的ペプチ ド ； 配列番号 1 2 〜 1 7 で示されるア ミ ノ酸配 列のいずれかを有するぺプチ ド またはそのデン ド リ マ一 である上記新生血管特異的ペプチ ド ； および配列番号 1 9、 2 1、 2 3 〜 2 5 および 2 8 〜 3 2 で示されるァ ミ ノ酸配列のいずれかを有するペプチ ド またはそのデン ド リ マーである上記新生血管特異的ペプチ ドが提供され る。 また、 本発明によれば、 癌組織、 例えば肉腫またはメ ラ ノ ーマに形成される新生血管に選択的に帰巣するぺプ チ ドである上記新生血管特異的ペプチ ドが提供される。

更に、 本発明によれば、 上記新生血管特異的ペプチ ド の少な ぐと も 1 種、 好ま し く は、 配列番号 1、 5、 6、 1 3 〜 ； 1 7、 1 9、 2 1、 2 3 〜 2 5 および 2 8 〜 3 2 で示されるア ミ ノ酸配列のいずれかを有するぺプチ ド ま たはそのデン ド リ マ一の少なく と も 1 種を有効成分と し、 これを製剤担体と共に含有する制癌組成物および癌転移 抑制組成物が提供される。

更に、 本発明によれば、 上記新生血管特異的ペプチ ド の少な く と も 1 種、 好ま し く は、 配列番号 1 5 〜 1 7 で 示されるア ミ ノ酸配列のいずれかを有するぺプチ ド また はそのデン ド リ マーの少な く と も 1 種と、 抗癌剤または 癌転移抑制剤 とを有効成分と し、 これを製剤担体と共に 含有する リ ボソーム製剤が提供される。

更に、 本発明によれば、 上記新生血管特異的ペプチ ド の少な く と も 1 種の有効量を患者に投与する抗癌および 癌転移抑制方法、 特に配列番号 1、 5、 6、 1 3 〜 1 7、 1 9、 2 1、 2 3 〜 2 5 および 2 8〜 3 2で示されるァ ミ ノ酸配列のいずれかを有するぺプチ ド またはそのデン ド リ マ一の少なく と も 1 種の有効量を患者に投与する制 癌および癌転移抑制方法が提供される。

更に、 本発明によれば、 上記 リ ボソーム製剤、 好ま し く は、 配列番号 1 5 〜 1 7 で示されるア ミ ノ酸配列のい ずれかを有するペプチ ドまたはそのデン ド リ マ一の少な く と も 1 種と、 抗癌剤または癌転移抑制剤とを有効成分 と し、 これを製剤担体と共に含有する リ ボソーム製剤を 患者に投与する制癌および癌転移抑制方法が提供される。

以下、 本明細書におけるア ミ ノ酸、 ペプチ ド、 塩基配 列、 核酸等の略号による表示は、 I U P A C、 I U B の 規定、 「塩基配列又はアミ ノ酸配列を含む明細書等の作 成のためのガイ ド ライ ン」 （特許庁編） および当該分野 における慣用記号に従う ものとする。

本発明新生血管特異的ペプチ ドの具体例 と しては、 後 述する実施例に示される方法によ り得 られる配列番号 1 カゝ ら 1 1 に示されるアミ ノ酸配列を有する ものを例示で きる。

以下、 本発明新生血管特異的ペプチ ドの同定および新 生血管への親和性につき詳述する。

本発明新生血管特異的ペプチ ドの同定には、 分子ライ ブラ リ ーのスク リ ーニング手法を採用でき、 上記ライ ブ ラ リ ーと しては、 例えばフ ァージデイ スプレイ ライ ブラ リ ーを好ま し く 例示できる。 かかる ライ ブラ リ 一は、 巿 販のものを用いる こ とができる。 該ライ ブラ リ 一中のラ ンダムペプチ ドディ スプレイ フ ァージは、 標的とする分 子または細胞に特異的に結合するべプチ ド を同定するた めに、 特定の標的分子または目的の細胞を用いてイ ンビ 卜 口でス ク リ ーニングされ得る多数のペプチ ド を発現す るのに利用 される。 該ライ ブラ リ ーを用いるスク リ 一二 ングは、 種々 の細胞表面レセプターと特異的に結合する リ ガン ドゃ種々 の抗体を同定するために使用される。 こ れら フ ァージディ スプレイ ライ ブラ リ 一の作成方法およ びイ ンビ ト ロスク リ ーニング法については、 スコ ッ トお よびス ミ スの方法が参照される （Scot t, J. M. and Smi th, G. P. , Science, 119. 386-390 ( 1990)； Smi th, G. P. and Scot t, J. K. , Method s in Enzymology, 2 _, 228-257

本発明の新生血管に帰巣し得る分子と しての新生血管 特異的ペプチ ドの同定のために、 よ り好ま し く 使用 され る方法と しては、 例えば特表平 1 0 — 5 0 2 6 7 4号公 報 （対応米国特許第 5 6 2 2 6 9 9 号）に記載された、 ル オス ラーティ ら の器官または組織に帰巣する分子を同定 する方法が例示できる。 該方法は潜在的な器官帰巣分子 のライ ブラ リ 一をス ク リ ーニングするイ ンビボバニング を用 いる こ と によ り 1、 2 または 3 の選択された器官ま たは組織に特異的に帰巣する分子を同定する方法であ り、 次の如 く して実施できる。

即ち、 まず、 公知のフ ァージライ ブラ リ 一にラ ンダム D N Aを導入 した後、 得られる フ ァージライ ブラ リ 一の 希釈混合物を、 例えばマウスの尾静脈に投与し、 1 〜 4 分後に、 マウスを液体窒素中で急速凍結する。 フ ァージ を回収するために、 死体を解凍し、 所望の器官または組 織を採取し、 蛋白分解酵素阻害剤を含む培養液中にてホ モジナイ ズし、 得 られた試料を 1 %ゥシ血清アルブミ ン を含有する氷冷培養液で数回洗浄後、 大腸菌に感染させ る。 フ ァージで感染された大腸菌をテ ト ラサイ ク リ ンを 含有する培地中で数時間培養後、 テ ト ラサイ ク リ ンを含 有する寒天プレー ト にプレコー ト し、 回収されたフ ァー ジを含むコ ロニーを更に適当な培地中で培養して、 フ ァ ージを分離 ' 精製する。 そして 2 回目以降のバイ オパニ ングを行う。 この 2 回目以降のイ ンビポパニングは、 上 記で得 られたフ ァージを用 いて上記と同様に して行い得 る。 か く して、 所望の選択されたフ ァージによって発現 されたペプチ ド をコー ドする D N Aを得る こ とができる。 得 られる D N Aを配列決定する こ とによ り、 所望の器官 または組織に帰巣する分子を同定する こ とができる。

上記 D N Aの配列決定は、 当業界で公知の方法によ り 容易に行い得、 例えばジデォキシ法 〔Proc. Nat 1. Acad. Sc i. , USA. , 74, 5463-5467 ( 1977)〕 やマキサム -ギル ノ 一 卜法 [Method in Enzymology, 61, 99 ( 1980) ] 等 によ り行う こ とができる。 かかる塩基配列の決定は、 巿 販のシークェンスキッ ト等を用いても容易に行い得る。

また、 器官または組織に帰巣する分子の親和性を検出 する方法と しては、 例えば次の方法を採用する こ とがで きる。 即ち、 前記器官または組織に特異的に帰巣する分 子を同定する方法において、 得られた器官または組織特 異的ペプチ ド発現フ ァージおよび選別前のフ ァージを実 験動物の尾静脈内に投与し、 前記と同様の方法でフ ァー ジのコ ロニ一形成単位を測定し、 例えば標的器官または 組織 1 0 O m g 当た り における尾静脈内投与したフ ァー ジ数に対する集積フ ァージ数の比を評価する こ とによ り、 所望の器官または組織に帰巣する分子の.親和性を検出す る こ とができる。

その他、 例えば競合法によって、 標的器官または組織 帰巣ペプチ ドの一つを選択し、 該ペプチ ド を合成し、 高 速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー （H P L C ) によ り 精製した 後、 前記合成ペプチ ド と同一のペプチ ドを発現する フ ァ —ジを含む幾つかの標的器官または組織帰巣べプチ ド フ ァ 一ジの標的器官または組織への帰巣における影響を、 合成ペプチ ド との同時投与によって調べる こ とによ り、 ペプチ ドの帰巣特異性を確認する こ とができる （特表平

1 0 — 5 0 2 6 7 4号 ： 米国特許第 6 5 2 2 6 9 9 号参 メ日召ゝヽ )。

上記新生血管特異的ペプチ ドの同定および新生血管へ の親和性の検出法の詳細は、 後記実施例に示すとお り で ある。 後記実施例に示されるマウスにおいてイ ンビポパ ニングを用 いて同定された本発明新生血管特異的べプチ ドは、 ヒ ト または他の哺乳動物種における癌の新生血管 組織と結合 し得る。 また、 マウスにおいて増殖された新 生血管形成に存在する標的分子と結合する本発明べプチ ドは、 ヒ ト または他の哺乳動物体における癌の新生血管 形成における対応する標的分子と結合し得る。 更に、 本 発明ペプチ ドは、 イ ンビ ト ロで患者か ら得られたサンプ ルと特異的に結合し得る。 これらの こ とよ り、 本発明べ プチ ドがヒ ト患者の対応する分子と結合する能力を有す る こ とが確認できる。

癌組織内血管の形成は、 増殖を支持する新しい血管の 連続形成が起こる こ とによ り特徴づけ られ、 こ の点で一 般的な組織学的血管の形成とは区別されている （Folkman, Nat. Med. , 丄， 27-31 (1995)； Rak, Ant icancer Drugs, 6, 3- 18 ( 1995))。 従って、 イ ンビポバニングによって同 定された新生血管に特異的に帰巣する本発明ペプチ ドは、 癌に対する新生血管形成の抑制因子と して使用 し得る。

一方、 新生血管に特異的に帰巣する本発明ペプチ ドは、 正常で健全な器官または組織に対しては、 有害作用を及 ぼす可能性が低い。

また、 本発明ペプチ ドは、 癌細胞ではなく 新生血管に 帰巣する こ とか ら、 制癌剤のよ う な薬剤耐性を獲得する 可能性が低い と考え られる。

更に新生血管に特異的に帰巣する本発明べプチ ドは、 炎症性組織、 再生または傷害組織に存在するよ う な他の タイ プの新生血管系を標的と しても使用 し得る。 また、 子宮組織においても新生血管形成が生じているので、 本 発明ペプチ ドは、 かかる子宮組織との結合性をも有する と考え られ、 子宮筋腫等の疾患に影響力を及ぼすこ とが 予想できる。

上記の如 く して同定、 確認された本発明ペプチ ドは、 配列番号 1 か ら 1 1 で特定される ものであ り、 これら は いずれも新生血管に帰巣する性質を有する こ とによ り特 徴づけ られる。

本発明ペプチ ド には、 上記配列番号 1 か ら 1 1 で示さ れるア ミ ノ酸配列を有するペプチ ドの他に、 該ア ミ ノ酸 配列において、 1 若し く は複数個のアミ ノ酸が置換、 欠 失若し く は付加によ り 改変されたア ミ ノ酸配列か らな り 且つ新生血管に親和性を有するペプチ ド、 即ち新生血管 に帰巣する性質を有するペプチ ドが包含される。

こ こで、 ア ミ ノ酸の 「置換、 欠失若し く は付加」 の程 度およびそれらの位置などは、 改変された蛋白質が、 配 列番号 1 か ら 1 1 で示されるア ミ ノ酸配列か らなる新生 血管特異的ペプチ ド と同様の性質を有する同効物であれ ば特に制限されない。 上記アミ ノ酸配列の改変 （変異） な どは、 天然において、 例えば突然変異や翻訳後の修飾 な どによ り 生じる こ と もあるが、 天然由来の遺伝子に基 づいて人為的に改変する こ と もできる。 本発明は、 この よ う な改変 · 変異の原因および手段などを問わず、 上記 特性を有する全ての改変ペプチ ドを包含する。

また本発明ペプチ ド には、 上記配列番号 1 か ら 1 1 で 示されるアミ ノ酸配列を有するペプチ ドの相同物も包含 される。 該相同物には、 配列番号 1 か ら 1 1 に示される ア ミ ノ酸配列のペプチ ド と同一活性を有する、 哺乳動物 の蛋白質、 例えばヒ ト、 ゥマ、 ヒッジ、 ゥシ、 ィ ヌ、 サ ル、 ネコ、 クマや、 ラ ッ ト、 ゥサギなどのげつ歯類動物 の蛋白質も包含される。

上記改変されたア ミ ノ酸配列を有する本発明べプチ ド の例 と しては、 例えば配列番号 1 、 5 および 6 で示され る配列中 に一部重複 して存在する配列、 例えば、

Pro - Arg - Proおよび Trp - Arg - Proを残存させ、 その他のァ ミ ノ酸配列部分のア ミ ノ酸残基を他のア ミ ノ酸残基に置 換した り、 欠失させた り、 他のア ミ ノ酸残基を付加 した ものや、 配列番号 2 に示すアミ ノ酸配列において、 2番 目および 8番目 のア ミ ノ酸残基を他のア ミ ノ酸残基に置 換したものや、 配列番号 1 1 において 4〜 1 1 番目 のァ ミ ノ酸配列部分のみを残存させ、 他を欠失させたものを 例示できる。

上記ア ミ ノ酸配列の一部を改変させた本発明ペプチ ド の具体例 と しては、 例えば配列番号 1 9 に示される 1 2 ア ミ ノ酸残基か らなる もの ； 配列番号 1 2 〜 1 4および 2 1 に示される 8 ア ミ ノ酸残基か らなる もの ； 配列番号 1 5 〜 1 7 および 2 3 〜 2 5 に示す 5 アミ ノ酸残基か ら なる もの ； 配列番号 2 8〜 3 1 に示される 4ア ミ ノ酸残 基か らなる もの ； および配列番号 3 2 に示される 3 ア ミ ノ酸残基 （Trp - Arg - Pro) か らなる ものなどを例示できる, よ り 詳し く は、 例えば配列番号 1 2 に示すものは、 配 列番号 1 1 において 4〜 1 1 番目のアミ ノ酸配列部分の みを残存させたものである。 配列番号 1 3 に示すものは、 配列番号 5 に示す 1 5 ア ミ ノ酸配列の内、 N末端よ り 8 ア ミ ノ酸配列を残存させ、 残 り の 7つのア ミ ノ酸残基を 欠失させたものである。 配列番号 1 4 に示すものは、 配 列番号 6 に示すア ミ ノ酸配列の N末端よ り 7 つのアミ ノ 酸残基を欠失させた 8 アミ ノ酸配列か らなる ものである。 配列番号 1 5 に示すものは、 配列番号 5 に示すア ミ ノ酸 配列の 2 〜 6 ア ミ ノ酸配列か らなる ものである。 配列番 号 1 6 に示すものは、 配列番号 6 の 9 〜 1 3 アミ ノ酸配 列か らなる ものである。 また、 配列番号 1 7 に示すもの は、 配列番号 1 に示すア ミ ノ酸配列の 1 〜 4 ア ミ ノ酸配 列の N末端に A 1 aを付加 したものである。

また、 本発明ペプチ ド中、 少なく と も 2 つのシスティ ン残基を有するペプチ ド、 例えば配列番号 1 1 で示され るア ミ ノ酸配列のペプチ ドは、 自発的に環状化する と考 え られ、 このよ う な環状ペプチ ドは、 線状形態で存在す る場合においても活性を有する場合があるので、 該ぺプ チ ド内のひとつまたは両方のシスティ ン残基は、 本発明 のべプチ ドの帰巣特性に著しい影響を与える こ となく、 欠失させる こ とができる。 かかる現象は、 例えばコイ ビ —ネン ら の報告 ( Koivunen, et al. , J. Biol. Chem. , 268, 20205-20210 ( 1993) )に支持される。 上記欠失されたァ ミ ノ酸配列を有するペプチ ドの具体例は、 配列番号 1 2 に示すとお り である。 このよ う な一部欠失されたァ ミ ノ 酸配列を有するペプチ ド も、 これが上記新生血管帰巣特 O 0 476

16 性を有する限 り本発明に包含される。

以下、 本明細書において、 「新生血管特異的ペプチ ド」 乃至 「本発明ペプチ ド」 なる語には、 上述した配列番号 1 〜 1 1 のア ミ ノ酸配列を基準と して、 その一部ア ミ ノ 酸配列が欠失した部分ペプチ ドな どの改変されたァ ミ ノ 酸配列を有するペプチ ド も含める ものとする。

本発明に係る新生血管特異的ペプチ ド には、 また、 上 記配列番号 1 か ら 1 1 で示されるア ミ ノ酸配列を有する ぺプチ ドゃ該ア ミ ノ酸配列を改変され且つ新生血管に帰 巣する性質を有するペプチ ド と共に、 これらペプチ ドの デン ド リ マ一が包含される。

こ こで、 デン ド リ マーなる語は、 一定の組成と分子量 を有する球形乃至他の三次元構造の巨大分子と して知 ら れてお り、 また多抗原性ペプチ ド （mul t iple antigen peptide: MAP)と しても知 られている。 その合成は、 例え ば複数個の機能基を有する化学構造核か ら出発して、 各 機能基に化学構造核が有する と同一の機能基を複数個そ の末端に有する枝 （繰 り返し単位） を結合させ、 更に末 端の機能基に順次同一の繰 り返し単位を導入する こ と に よ り実施できる。 その詳細は特表昭 6 0 — 5 0 0 2 9 5 号公報、 特開昭 6 3 — 9 9 2 3 3号公報、 特開平 3 — 2 6 3 4 3 1 号公報、 米国特許第 4 5 0 7 4 6 6号明細 書、 同第 4 5 6 8 7 3 7 号明細書、 ポ リ マ一ジャーナル (Polymer Journal)第 1 7 巻第 1 1 7 頁 （ 1 9 8 5 ) 、 ァ ンケノ ンテへ レミ ー (Toma 1 i a, e t a 1. , Angewand t e Chem. Int. Engl. )第 2 9 巻第 1 3 8 — 1 7 5 頁 （ 1 9 9 0 ) 、 マク ロモ レキュールズ（Macromolecures)第 2 5 巻第

3 2 4 7 頁 （ 1 9 9 2 ) 等に記載されている。

上記のよ う にデン ド リ マ一は、 その樹枝状形状か ら星 形の立体配置を有する球状の外観を呈する開始部分とな る核構造、 開始核に放射状に結合した繰 り返し単位で構 成される内部層 （世代）および各分枝の最も外側の末端に 結合 した活性化官能基よ り なる外表面を有している。 デ ン ド リ マーの大きさ、 形態および反応性は、 開始核部分、 デン ド リ マーを製造する際に決定される世代の数および 各世代に用い られる繰 り返し単位を選択する こ と によつ て調節する こ とが可能である。

異なる大きさ のデン ド リ マーは、 利用される世代の数 を増やすこ と によって容易に得る こ とが可能であ り、 そ の製造は、 例えば米国特許第 4 6 9 4 0 6 4号明細書の 記載を参考にする こ とができる。 こ こで、 窒素原子を開 始部分となる核構造部分と し、 核構造部分に結合する -( 11₂(；11₂(：(^1{(：11₂(11₂-構造か らなる繰 り返し単位、 そして 各分枝の最も外側の末端のア ミ ノ基に結合した活性化官 能基と して、 例えば配列番号 1 〜 1 7 か らなる本発明血 管新生特異的べプチ ドを構成成分とするデン ド リ マ一、 ある いは後記実施例に示される、 リ ジン、 アルギニン、 グルタ ミ ン酸、 ァスパラギン酸等のア ミ ノ酸を核構造部 分と し、 核構造部分に直説結合する繰 り 返し単位を同様 に前記ア ミ ノ酸と し、 活性化官能基と して配列番号 1 〜 1 7 か ら選ばれるア ミ ノ酸配列の本発明血管新生特異的 ペプチ ド または配列番号 1 9、 2 1、 2 3 〜 2 5 および 2 8 〜 3 2 か ら選ばれるア ミ ノ酸配列の本発明血管新生 特異的ペプチ ドを有するデン ド リ マーを例示する こ とが できる。

前記窒素原子を開始部分とるデン ド リ マ一は、 例えば 米国ポ リ サイ エンス社（Polysciences, Inc. , 400 Val ly Road, Warrington, PA, 18976, U. S. A. )か ら市販されてい る ものを用い、 後記の固相合成法を用いて本発明血管新 生特異的べプチ ドを各分枝の最も外側の末端に結合した デン ド リ マ一を製造する こ とができる。 同様に リ ジンを 開始部分となる核構造部分と し、 核構造部分に直説結合 するア ミ ノ酸を同 じ く リ ジンか らなる繰 り 返し単位、 そ して後記の固相合成法を用いて本発明血管新生特異的べ プチ ド を各分枝の最も外側の末端に結合したデン ド リ マ —を製造する こ とができる。 このデン ド リ マーには渡辺 2376

19 化学工業社製の Fmoc₈— Lys₄— Lys₂— Lys— ^ Ala— Alko樹 脂を用いる こ とができる。 また、 上記において、 各分枝 の最も外側の末端に結合する本発明血管新生特異的ぺプ チ ドの一部に変えて、 も し く は核構造部分に結合させる 形で、 抗癌活性を有する構成成分を結合させたデン ド リ マーを製造する こ と もできる。

上記各デン ド リ マーは、 例えば以下の如 く して合成す る こ とができる。 即ち、 固相ペプチ ド合成用の樹脂に、 スぺ—サーを介してまたは介さずに ₂ つのア ミ ノ基を同 一のまたは同一でない保護基で保護した α， ω -ジァ ミ ノ 酸を繰 り 返し単位と して、 その繰 り返し単位の縮合と保 護基の除去を繰 り返すこ とによ り デン ド リ マーを得る こ とができる。

こ こで、 固相ペプチ ド合成用の樹脂と しては、 ポ リ ス チレン樹脂、 ポ リ アク リ ルア ミ ド樹脂、 ポ リ スチレンポ リ エチレングリ コール樹脂などの末端にク ロ ロ メチル基、 4 一 （ヒ ド ロキシメチル） フエ ノ キシ基、 4 一 ( ( - 2' , 4' ー ジメ 卜キシフエニル） ― 9 一 フルォレニルメ 卜 キシカルポニルア ミ ノ メチル） フエ ノ キシ基などを有す る通常のペプチ ド合成に用い られる樹脂を使用する こ と ができる。

スぺーサ一と しては 1 個または複数個のア ミ ノ酸を挙 げる こ とができる。 α， ω -ジア ミ ノ酸と しては リ ジン、 オル二チン、 1， 4 ー ジァ ミ ノ絡酸、 1， 3 — ジァ ミ ノ プロ ピオン酸などが挙げられる。 保護基と しては B o c基、 F m o c基、 Z基などが挙げられる。 したがって機能基と して はァ ミ ノ基、 カルボキシル基、 水酸基などが挙げられる。 枝数と しては、 繰 り 返し単位の縮合と保護基の除去を n 回繰 り 返すこ と によ り 2 n となる。 具体的には 2〜 1 6 の数が挙げられる。

かかるデン ド リ マーの精製は通常の技術、 例えばセフ ァ ク リ ール S — 3 0 0 (フ アルマシア社製） などのマ ト リ ッ クスでのサイ ズ排除可能な樹脂を用 いたク ロマ ト グ ラ フ ィ 一操作などによ り実施できる。

か く して得 られるデン ド リマ一ペプチ ドは、 その枝部 分に存在する本発明血管新生特異的ぺプ _チ ドが、 その本 来の血管新生に選択的に帰巣し、 血管新生抑制作用を奏 し、 か く して所望の制癌効果および癌転移抑制効果を奏 し得るのである。 しかも該デン ド リ マーペプチ ドは、 そ の内部に制癌作用 を有する公知の薬剤を包み込んで投与 すれば、 標的とする血管新生部分にだけ該薬剤を作用 さ せる こ とができ、 よ り 副作用の少ない薬剤とする こ とが できる利点がある。

上記デン ド リマ一ペプチ ド において、 その枝部分に存 在させる本発明血管新生特異的ペプチ ドは、 各枝共、 同 一のペプチ ドである必要はな く、 異なるア ミ ノ酸配列の ペプチ ド を複数個組み合わせたものであってもよい。 そ の例 と しては、 例えば配列番号 1、 配列番号 5、 配列番 号 6 のア ミ ノ酸配列のペプチ ド を、 或いは配列番号 1 〜 1 1 に示される 1 5 アミ ノ酸配列のペプチ ド、 配列番号 1 2 〜 1 4 および 2 1 に示される 8 アミ ノ酸配列のぺプ チ ド、 配列番号 1 5 〜 1 7 および 2 3 〜 2 5 に示される 5 ア ミ ノ酸配列のペプチ ド、 配列番号 2 8 〜 3 1 に示さ れる 4 ア ミ ノ酸配列、 および配列番号 3 2 に示される 3 ア ミ ノ酸配列のそれぞれを、 別の枝部分に結合させたも のを例示できる。 このよ う なデン ド リ マ一は、 投与対象 における血中および組織中での安定性、 結合された分子 の比活性等を向上させる こ とができる。

本発明新生血管特異的ペプチ ドは、 そのアミ ノ酸配列 に従って、 一般的な化学合成法によ り製造する こ とがで きる。 該方法には、 通常の液相法および固相法によるべ プチ ド合成法が包含される。 かかるペプチ ド合成法は、 よ り 詳し く は、 ア ミ ノ酸配列情報に基づいて、 各ァ ミ ノ 酸を 1 個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていく ステッ プ ワイ ズェロ ンゲーシヨ ン法と、 ア ミ ノ酸数個か らなる フ ラ グメ ン ト を予め合成し、 次いで各フ ラ グメ ン ト をカ ツ プリ ング反応させる フ ラグメ ン ト · コ ンデンセ一シヨ ン 法と を包含する。 本発明新生血管特異的ペプチ ドの合成 は、 そのいずれによる こ と もできる。

上記ペプチ ド合成に採用 される縮合法も、 公知の各種 方法に従う こ とができる。 その具体例と しては、 例えば アジ ド法、 混合酸無水物法、 D C C法、 活性エステル法、 酸化還元法、 D P P A (ジフ エニルホスホ リ ルアジ ド）法、 D C C +添加物 （ 1ー ヒ ド ロキシベンゾ ト リ ァゾール、 N — ヒ ド ロキシサク シンアミ ド、 N— ヒ ド ロキシ一 5 — ノ ル ポルネンー 2 , 3 — ジカルポキシイ ミ ド等）、 ウ ッ ド ヮ一 ド法等を例示できる。 これら各方法に利用できる溶媒も この種ペプチ ド縮合反応に使用される こ とがよ く 知 られ ている一般的なものか ら適宜選択する こ とができる。 そ の例 と しては、 例えば N — メチルピロ リ ド ン （ N M P ) 、 ジメチルホルムア ミ ド （D M F )、 ジメチルスルホキシ ド ( D M S 〇）、 へキサホスホロア ミ ド、 ジォキサン、 テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン （T H F )、 酢酸ェチル等およびこれらの 混合溶媒等を挙げる こ とができる。

尚、 上記ペプチ ド合成反応に際して、 反応に関与しな いア ミ ノ酸及至ペプチ ド におけるカルボキシル基は、 一 般にはエステル化によ り、 例えばメチルエステル、 ェチ ルエステル、 第三級ブチルエステル等の低級アルキルェ ステル、 例えばべンジルエステル、 p — メ トキシベンジ ルエステル、 p —二 ト ロべンジルエステルァラルキルェ ステル等と して保護する こ とができる。 また、 側鎖に官 能基を有する ア ミ ノ酸、 例えば T y rの水酸基は、 ァセチル 基、 ベンジル基、 ベンジルォキシカルポニル基、 第三級 ブチル基等で保護されてもよいが、 必ずし もかかる保護 を行う必要はない。 更に例えば A r gのグァニジノ基は、 二 ト ロ基、 ト シル基、 2 — メ トキシベンゼンスルホニル基、 メチレン一 2 —スルホニル基、 ベンジルォキシカルポ二 ル基、 イ ソボルニルォキシカルボ二ル基、 ァダマンチル ォキシ力ルポニル基等の適当な保護基によ り保護する こ とができる。 上記保護基を有するアミ ノ酸、 ペプチ ドお よび最終的に得 られる本発明新生血管特異的ペプチ ド に おける これら保護基の脱保護反応もまた、 慣用される方 法、 例えば接触還元法や、 液体アンモニア ナ ト リ ウム、 フ ッ化水素、 臭化水素、 塩化水素、 ト リ フルォロ酢酸、 酢酸、 蟻酸、 メ タ ンスルホン酸等を用いる方法等に従つ て、 実施する こ とができる。

か く して得 られる本発明の新生血管特異的ポ リ べプチ ドは、 通常の方法に従って、 例えばイ オン交換樹脂、 分 配ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 ゲルク ロマ ト グラ フィ ー、 ァフ ィ ニティ 一ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー （H P L C )、 向流分配法等のペプチ ド化学の分野 で汎用 されている方法に従って、 適宜その精製を行う こ とができる。

上記によ り 得 られる本発明新生血管特異的べプチ ド (そのデン ド リ マーを含む、 以下同 じ） は、 新生血管に 特異的に帰巣する作用を有してお り、 それら 自身で新生 血管形成抑制剤と して有用である。 また、 本発明新生血 管特異的ペプチ ドは、 癌組織の新生血管に特異的に帰巣 する作用を有するため、 癌組織に対する リ ガン ド と して、 例えば癌化学療法剤のよ う な抗癌剤などの薬物と結合さ せて用いる こ とができる。

こ こで、 対象とする各種癌疾患と しては、 例えば、 黒 色腫、 大腸癌、 卵巣癌、 肝癌、 乳癌、 脳腫瘍、 腎癌、 滕 臓癌、 子宮頸癌、 食道癌、 肺癌、 胃癌などを例示できる。

また、 本発明新生血管特異的ペプチ ド と結合させて用 いる こ とのできる薬物と しての抗癌剤または抗癌活性成 分と しては、 5 — フルォロウラシル （ 5 — F U ) を代表 と して、 以下の各種の癌化学療法剤を例示する こ とがで きる。 即ち、 アルキル化剤、 例えばシク ロホス フ ア ミ ド、 メルフ ァ ラ ン、 ラニムスチン、 ィ ホスフ ア ミ ド、 塩酸ナ ィ ト ロ ジエ ンマスター ド ー N —才キシ ドな ど ； 代謝拮抗 剤、 例えば 6 _ メルカプ ト プリ ン、 リ ポシ ド、 エノ シ夕 ビン、 カルモフール、 シ夕 ラ ビン、 シ夕 ラ ビンォクホス フ エホー ト、 テガフール、 5 — F U、 ドキシフルゥ リ ジ ン、 ドキシフルリ ジン、 ヒ ド ロキシカルバミ ド、 フルォ ロ ウ ラ シル、 メ ト ト レキサー ト、 メルカ プ ト プリ ンなど ； 抗腫瘍性抗生物質製剤、 例えばァクチノ マイ シン D、 塩 酸アク ラルビシン、 塩酸イ ダルビシン、 塩酸ェピルビシ ン、 塩酸 ドキソルビシン、 塩酸ダウ ノルビシン、 塩酸ピ ラルビシン、 塩酸ブレオマイ シン、 ジノ ス夕チンスチマ ラマー、 硫酸ブレオマイ シン、 マイ トマイ シン（：、 ネオ カルチノ ス夕チン、 硫酸べプロマイ シンなど ； 抗腫瘍性 植物成分製剤、 例えばエ トポシ ド、 、 塩酸イ リ ノ テカ ン、 ドセタキセル水和物、 硫酸ビンク リ スチン、 硫酸ビンデ シン、 硫酸ピンブラスチン、 パク リ 夕キセル、 その他、 ァセグラ ト ン、 ウベニメ クス、 シスブラチン、 シゾフ ィ ラ ン、 ソ ブゾキサン、 ク レスチン、 クェン酸 ト レミ フエ ン、 酢酸メ ド ロキシプロゲステロ ン、 クェン酸夕モキシ フェ ン、 カルポプラチン、 塩酸フ ア ド ロ ゾ一ル水和物、 塩酸プロカルバジン、 塩酸ミ トキサン ト ロ ン、 L —ァス パラギナーゼ、 ト レチノ イ ン、 ネダブラチン、 ピシバニ —ル、 フルタ ミ ド、 ペン トス夕チン、 ボルフイ マ一ナ ト リ ウム、 レンチンナンなど。

また、 抗腫瘍活性を有するサイ ト力イ ンと しては、 I F N _ o;、 I F N— 3、 I F N— ァ、 I L — 1、 I L - 2、 I L — 1 2、 T N F、 T G F — /3、 ア ンジォス夕チ ン、 ト ロ ンポスポンジン、 エン ドス夕チンなどが例示さ れる。 抗体または抗体断片と しては、 抗 V E G F抗体、 抗 F G F抗体、 抗 H G F抗体 I 抗 L — 8抗体などの癌の 増殖 · 促進に関連する因子に対する抗体またはそれらの 抗体断片を例示できる。

このよ う に、 本発明の新生血管特異的ペプチ ドは、 こ れに制癌剤ゃ抗癌活性を有するサイ トカイ ンなどの活性 薬物を結合させるかまたは修飾させて リ ボソーム製剤に するなどの、 D D S 製剤を作成する こ とができ、 かかる 製剤は癌に対するァクティ ブ夕一ゲティ ングを行う こ と ができる。

本発明新生.血管特異的べプチ ド を抗癌活性を有するサ イ ト力イ ン等の蛋白質と結合させる場合、 かかる結合物 は、 遺伝子組換え技術に従い、 本発明ペプチ ド と上記サ ィ トカイ ン等との融合蛋白質と して発現させる こ とがで きる。 かかる融合蛋白質の製造および発現は、 この分野 で周知慣用の技術に従う こ とができる。 即ち、 融合蛋白 質は、 通常の遺伝子組換え技術（例えば、 Science, 224, 1431 (1984)； Biochem. Biophys. Res. Comm. , 130, 692 ( 1985)； Proc. Natl. Acad. Sc i. USA. , 80, 5990 ( 1983)な ど参照）に従っ て調製できる。 また融合蛋白質の製造およ び発現に際 しては、 大野 らの方法 「タ ンパク実験プロ ト コール 1 機能解析編、 細胞工学別冊、 実験プロ ト コール シ リ ーズ、 1997年、 秀潤社」 を参考にする こ とができる。

得 られた組換え融合蛋白質は、 所望によ り、 その物理 的性質、 化学的性質等を利用 した各種の分離操作 〔 「生 化学データーブッ ク II」 、 1175- 1259 頁、 第 1 版第 1 刷、 1980年 6月 Π日株式会社東京化学同人発行 ；

Biochemistry, 25 (25) , 8274-8277 ( 1986) ; Eur. J.

Biochem. , i , 313-321 ( 1987) 等参照〕 によ り 分離、 精製できる。 該方法と しては、 具体的には例えば通常の 再構成処理、 蛋白沈澱剤による処理 （塩析法） 、 遠心分 離、 浸透圧ショ ッ ク法、 超音波破砕、 限外濾過、 分子篩 ク ロマ ト グラ フ ィ ー （ゲル濾過） 、 吸着ク ロマ ト グラ フ ィ 一、 イ オン交換ク ロマ ト グラフ ィ ー、 ァフィ 二テイ ク 口マ ト グラ フィ ー、 高速液体ク ロマ ト グラ フィ ー

( H P L C ) 等の各種液体ク ロマ ト グラ フィ ー、 透析法、 これ ら の組合せ等を例示できる。 特に好ま しい上記方法 と しては、 所望の蛋白質を結合させたカ ラムを利用 した ァ フ ィ 二ティ ク ロマ ト グラ フ ィ ーを例示できる。

また、 本発明新生血管特異的ペプチ ドを、 物理的、 化 学的または生物学的な物質と結合させて リ ガン ド と して 0/2376

28 利用する場合、 該物理的、 化学的または生物学的な物質 は、 前記癌化学療法剤 （抗癌剤等） を含有し得る室のあ るマイ ク ロデバイ スのよ う な薬物送達系物質である こ と もできる。 かかる薬物送達系物質の例 と しては、 例えば リ ボソーム、 透過性若し く は半透過性の膜を含有するマ イ ク 口カ プセル、 他の室を有するマイ ク ロデバイ スなど の生物学的物質を挙げる こ とができる。 これらは、 一般 に非毒性で、 好ま し く は生分解性であるのがよい。

上記抗癌剤等の薬物を含有し得る種々 の薬物送達系物 質を本発明ペプチ ド と結合させる方法は、 この分野にお いて周知であ り、 具体的には、 例えば八ロ ウ らやヘルマ ンソ ン (Harlow and Lane, Ant ibodies : A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) : He rmans on, Bioconjugate Techniques, Academic Press ( 1996) )の方法を挙げる こ とができる。

以下、 上記薬物送達系物質と本発明ペプチ ド との結合 による製剤の具体例と しての リ ボソーム製剤につき詳述 する。

リ ボソーム製剤は、 酸性 リ ン脂質を膜構成成分とする か或いは中性リ ン脂質と酸性リ ン脂質とを膜構成成分と する リ ボソームに、 本発明ペプチ ドを保持させる こ と に よ り 得 られる。 こ こで、 膜構成成分と しての酸性リ ン脂質と しては、 通常の酸性 リ ン脂質よ り狭義に定義され、 よ り 具体的に はジラウロイルホスファチジルグリセロール （ D L P G ) 、 ジミ リ ス トイルホスファチジルグリセロール （ D M P G ) 、 ジパルミ トイルホスフ ァチジルグリセロール （ D P P G ) 、 ジステアロイルホスフ ァチジルグリセロール （D S P G) 、 ジォレオイルホスフ ァチジルグリ セロール （ D〇 P G ) 、 卵黄ホスフ ァチジルグリ セロール （卵黄 P G ) 、 水添卵 黄ホス フ ァチジルグリ セロール等の天然または合成ホス フ ァチジルグリ セ口一ル類 （ P G ) およびジラウ ロイル ホスフ ァチジルイ ノ シ トール （D L P I ) 、 ジミ リ ス ト ィ ルホス フ ァチジルイ ノ シ トール （ D M P I ) 、 ジパル ミ トィ ルホスフ ァチジルイ ノ シ トール （ D P P I ) 、 ジ ステア ロイ ルホス フ ァチジルイ ノ シ トール （ D S P I ) 、 ジォレオイ ルホスフ ァチジルイ ノ シ トール （D〇 P I ) 、 大豆ホスフ ァチジルイ ノ シ トール （大豆 P I ) 、 水添大 豆ホス フ ァチジルイ ノ シ トール等の天然または合成ホス フ ァチジルイ ノ シ トール類 （ P I ) を示す。 これら は一 種単独でまたは二種以上混合して使用できる。

また、 中性 リ ン脂質と しては、 大豆ホス フ ァチジルコ リ ン、 卵黄ホスフ ァチジルコ リ ン、 水添大豆ホスフ ァチ ジルコ リ ン、 水添卵黄ホス フ ァチジルコ リ ン、 ジミ リ ス トイ ルホス フ ァチジルコ リ ン （ D M P C ) 、 ジパルミ ト ィ ルホス フ ァチジルコ リ ン （D P P C ) 、 ジラウ ロイ ル ホス フ ァチジルコ リ ン （ D L P C ) 、 ジステアロイ ルホ ス フ ァチジルコ リ ン （ D S P C ) 、 ミ リ ス トイ ルパルミ トイ ルホス フ ァチジルコ リ ン （ M P P C ) 、 パルミ トイ ルステア リ イルホス フ ァチジルコ リ ン （ P S P C ) 、 ジ ォ レオイ ルホスフ ァチジルコ リ ン （D O P C ) 等の天然 または合成ホス フ ァチジルコ リ ン類 （ P C ) 、 大豆ホス フ ァチジルエタ ノ ールァ ミ ン、 卵黄ホス フ ァチジルエタ ノ ールァ ミ ン、 水添大豆ホスフ ァチジルエタ ノ ールア ミ ン、 水添卵黄ホス フ ァチジルエタ ノ ールァ ミ ン、 ジミ リ ス トィ ルホスフ ァチジルエタ ノ ールァ ミ ン （D M P E ) 、 ジパルミ トイ ルホスフ ァチジルエタ ノ ールァ ミ ン

(D P P E ) 、 ジラウ ロイ ルホスフ ァチジルエタ ノ ール ァ ミ ン （ D L P E ) 、 ジステアロイルホスフ ァチジルェ 夕 ノ ールァ ミ ン （D S P E ) 、 ミ リ ス トイ ルパルミ トイ ルホス フ ァチジルエタ ノ ールァミ ン （ M P P E ) 、 パル ミ トイ ルステア ロイ ルホス フ ァチジルエタ ノ ールァ ミ ン ( P S P E ) 、 ジォレオイルホスフ ァチジルエタ ノ ール ァ ミ ン （ D O P E ) 等の天然または合成ホスフ ァチジル エタ ノ ールア ミ ン類 （ P E ) 等を例示できる。 これら は 一種単独でまたは二種以上混合して使用する こ とができ る。

上記 リ ボソーム膜は、 上記酸性 リ ン脂質を単独で構成 成分と して用いるかまたは上記中性 り ン脂質と酸性リ ン 脂質とを併用 して常法に従い形成される。 こ こで酸性 リ ン脂質の併用割合は、 リ ボソーム膜構成成分中に約

0. 1 〜 1 0 0 モル％程度、 好ま し く は約 1 〜 9 0 モル %、 よ り好ま し く は約 1 0 〜 5 0モル％程度とするのが よい。

上記 リ ボソームの調製に当たっては、 更に例えばコ レ ステロ一ルなどを添加する こ とができる。 このコ レステ ロールの添加によればリ ン脂質の流動性を調製して、 リ ポソ一ムの調製をよ り簡便なものとする こ とができる。 該コ レステロールは通常リ ン脂質に対して等量まで、 好 ま し く は 0. 5 〜 1倍等量の量で添加配合されるのが好 ま しい。

リ ボソーム分散液中の有効成分と酸性 リ ン脂質との配 合割合は、 有効成分に対して酸性リ ン脂質が約 0. 5 〜 1 0 0 当量程度、 好ま し く は約 1 〜 6 0 当量程度、 よ り 好ま し く は約 1. 5 〜 2 0 当量程度とされるのがよい。

また、 本発明のペプチ ド修飾に用い られるペプチ ドの 全脂質中のモル％は、 数モル％か ら数十モル％程度、 好 ま し く は 5 〜 1 0 モル％程度までのモル％、 通常は 5 モ ル％程度でもあってもよい。 後記実施例 4 に示されるよ う に本発明べプチ ドそれ自体に抗癌活性がある場合は、 5 〜 4 0 モル％程度であってもよい。 尚、 水溶性の抗癌 剤または抗癌活性を有する物質の場合は、 リ ボソーム内 水層に封入するので、 1 0 %か ら 9 0 %の効率で封入さ れる こ と となる、 対照的に脂溶性の抗癌剤または抗癌活 性を有する物質の場合は、 リ ボソーム膜内に所望の有効 成分を封入する場合は、 1 0 0 %近く の高い封入効率で 行う こ とが可能である。

次に、 上記リ ボソームの製造法を説明する。 該 リ ポソ —ムを製造する に当っては、 種々 の公知の方法を用いる こ とができる。 例えばリ ボソーム膜構成成分をク ロ ロホ ルム等の有機溶媒に溶解後、 溶媒を減圧留去して リ ピッ ド フ ィ ルムを形成させ、 これに薬物を溶解した水相を添 加 し脂質の相転移温度以上に加温し、 ポルテッ クス、 ホ モジナイ ズ等の処理によ り リ ボソーム分散液を調製する。 また、 粉末状 リ ボソーム膜構成成分を相転移温度以上に 加温し、 薬物水溶液と混合撹拌する こ とによ り、 リ ポソ —ム分散液を調製する こ と もできる。 尚、 添加する薬物 水溶液は薬物が溶けている限り任意のものを使用でき、 添加する薬物水溶液の量も任意に増減できる。

こ のよ う に して得られた リ ボソームの分散液は必要に 応 じて限外濾過膜法、 例えばポ リ カーボネー ト製メ ンブ ラ ンフ ィ ル夕一を用 いて粒径分布をコ ン ト ロールする こ と も可能である。 透析膜を用いて濃縮する こ と も可能で ある。

また、 この リ ボソーム分散液には、 製剤設計上必要な 添加剤と して、 防腐剤、 等張化剤、 緩衝剤、 安定化剤、 可溶化剤、 吸収促進剤等の各種の公知物質を適宜配合す る こ とができ、 また必要に応じてこれらの添加物を含む 液または水で希釈する こ と もできる。 上記添加剤の具体 例 と しては、 防腐剤と しては塩化ベンザルコニゥム、 塩 化べンゼ トニゥム、 ク ロ 口へキシジン、 パラベン類 （メ チルパラベン、 ェチルパラベン等） 、 チメ ロサール等の 真菌および細菌に有効な防腐剤を、 等張化剤と しては D 一マンニ トール、 D — ソルビ トール、 D —キシリ トール、 グリ セ リ ン、 ブ ドウ糖、 マネ ト一ス、 蔗糖、 プロ ピレン グリ コール等の多価アルコール類や塩化ナ ト リ ゥム等の 電解質類を、 また安定化剤と しては ト コ フエ ロール、 ブ チルヒ ド ロキシァニソール、 プチルヒ ド ロキシ トルエン、 エチレンジァ ミ ン四酢酸塩 （ E D T A ) 、 システィ ン等 をそれぞれ例示できる。

上記リ ボソーム分散液の具体例は、 例えば後記実施例 5 、 7 および 8 に示されている。 更に、 本発明新生血管特異的ペプチ ドは、 その有する 癌の新生血管特異的に帰巣する作用を利用 して、 これら に放射性化合物、 蛍光物質、 酵素、 ピオチン、 造影剤な どを結合させて、 癌に対するアクティ ブ夕一ゲティ ング を実施する こ とによ り、 癌の診断剤等と して利用する こ とができる。

また、 本発明新生血管特異的ペプチ ドは、 これら に脂 肪酸 （ベヘン酸、 ステア リ ン酸、 パルミチン酸、 ミ リ スチ ン酸、 ォレイ ン酸等）、 アルキル基、 コ レステリ ル基等を 結合させて、 これら を含む リ ボソーム、 脂質乳剤 と し、 これら と共に制癌剤ゃ抗癌活性を有するサイ トカイ ンな どを含む医薬組成物と して癌に対するァクティ ブ夕一ゲ ティ ングを行う こ と もできる。 上記リ ボソーム製剤の製 造についての詳細は、 例えばウ ッ ド レ ら （Long

Circulating Liposomes: old drugs, New therapeut ics. , M. C. Wood 1 e, G. Storm, Eds : Spr i nger-Ver 1 ag Berl in ( 1998))の文献に記載されている。 また、 上記脂質乳剤と 共に制癌剤ゃ抗癌活性を有するサイ トカイ ンなどを含む 医薬組成物の製造についての詳細は、 ナンパらの文献 (Liposomal appl ications to cancer therapy, Y. Namba, N. Oku, J. Bioac t. Compat. Polymers, 8, 158- 177 ( 1993) ) に記載されている。 更に、 本発明新生血管特異的ペプチ ドは、 これら に各 種脂肪酸、 アルキル基、 コ レステ リ ル基等を結合させて、 これら を含む リ ボソーム、 脂質乳剤と し、 これら に癌造 影のために放射性化合物、 造影剤などを更に結合させて、 癌に対する アクティ ブ夕一ゲティ ングを行う こ と によつ て、 癌の診断剤と しても利用する こ とができる。 これら は即ち癌の存在を同定する癌診断剤とな り得る。 かかる 診断剤の利用によれば、 特に他の方法では検出されない かも しれない、 初期性腫瘍並びに転移性病巣を同定でき る利点がある。 従って、 本発明は癌の診断方法、 特に初 期性癌並びに転移性病巣を同定する診断方法を も提供す る ものである。

か く して癌の存在が同定される こ とによ り、 本発明の 別の実施態様において、 新生血管特異的ペプチ ドは、 癌 に対 して薬剤を帰巣させるために抗癌剤、 例えば癌化学 療法剤と結合され得るか、 または例えば癌化学療法剤ま たは他の抗癌性因子を含有するマイ ク ロデバイ ス と結合 され得、 か く して癌または癌細胞の選択的殺傷を可能な もの とする一方、 正常組織または正常細胞には影響を少 な く する と い う所望のアクティ ブターゲティ ングを実施 可能とする。 この点で、 本発明は癌および癌転移の治療 および転移抑制方法を も提供する ものである。 W 0/23476

36 本発明の新生血管抑制剤乃至癌治療組成物は、 有効成 分と しての新生血管特異的ペプチ ドまたはこれと他の抗 癌剤などとの複合体と共に、 薬学的に許容される担体を 含有する製剤組成物と して患者に投与される。

こ こで、 用い られる薬学的に許容される担体は、 当該 分野において周知されてお り、 調製される製剤組成物の 形態に応じて適宜選択できる。 例えば、 組成物が水溶液 形態に調製される場合、 上記担体と しては水または生理 学的緩衝液を利用できる。 また、 組成物が適当な溶液形 態に調製される場合、 上記担体と しては、 例えば、 グリ コール、 グリ セロール、 オリ 一ブ油のよ う な注入可能な 有機エステルなどを使用できる。

更に有効成分と して上記複合体を利用する場合、 上記 担体と しては、 例えば複合体の吸収を安定化または増加 させるよ う に作用する化合物を使用する こ と もできる。 かかる化合物と しては、 例えば、 グルコース、 スク ロ一 スまたはデキス ト ラ ンのよ うな炭水化物、 ァスコルビン 酸またはグル夕チオンのよ う な抗酸化剤、 キレー ト剤、 低分子タ ンパク質或いはアルブミ ンのよ う な安定化剤乃 至賦形剤を例示する こ とができる。

本発明の新生血管抑制剤または癌治療組成物 （製剤） 中 に含まれる有効成分の量は、 広範囲か ら選択する こ と ができ特に制限される ものではない。 通常、 本発明新生 血管特異的ペプチ ド を単独で有効成分とする場合には、 これは製剤中に約 0. 0 0 0 0 1 〜 7 0重量 、 好ま し く は約 0. 0 0 0 1 〜 5重量％含有される量の範囲か ら 選択されるのが望ま しい。 また、 上記製剤の投与量も、 特に限定されず、 所望の治療効果、 投与方法 （投与経路） 、 治療期間、 患者の年齢、 性別その他の条件などに応じて 広範囲か ら適宜選択する こ とができる。 一般に、 該投与 量は、 患者 1 日 当た り体重 1 k g当た り、 約 0. 0 1 z g〜 ： L O m g程度、 好ま し く は約 0. 1 g〜 ： L m g 程度の範囲か ら選ばれるのがよい。 該製剤は 1 日 当た り 1 回投与に限らず、 数回に分けて投与する こ とができる。 また、 本発明新生血管特異的ペプチ ド を制癌剤および 癌転移抑制剤と共に用いて調製される本発明の新生血管 抑制剤または癌治療組成物の投与量は、 本発明新生血管 特異的ペプチ ド と結合させて用 い られる、 例えば所望の 制癌効果を有するための癌化学療法剤 （薬物） の量に依 存して適宜決定する こ とができる。 例えばこの種の臨床 利用 に際して、 制癌剤有効成分と して一般に使用 される 5 —フルォロウ ラ シル （ 5 — F U) を用いる場合、 該 5 — F Uは通常 1 日 当た り約 0. l m g Z k g〜 5 0 m g k g程度投与される。 これと結合させて利用 される本 発明新生血管特異的ペプチ ドの量は、 自ずと明 らかであ り、 かかる量が本発明ペプチ ドの有効量と され得る こ と は当業者であれば容易に理解できる。 しかも、 本発明の 医薬組成物は、 癌の新生血管に特異的に帰巣する作用を 有する特徴がある こ とを考慮すれば、 癌化学療法剤の投 与量は、 従来使用の臨床用量よ り もかな り少なく ても、 有効に奏効するであろ う こ とが予測される。

上記したよ う に、 本発明新生血管特異的ポ リ ペプチ ド は、. これら に癌造影のために、 放射性化合物、 造影剤な どを結合させて診断剤と して、 癌に対するアクティ ブ夕 —ゲティ ングを実施する こ とができる。 また本発明新生 血管特異的ポ リ ペプチ ドは、 人体か ら単離された細胞、 組織、 器官、 それらの一部分における新生血管形成の存 在を検出するために、 使用する こ とができる。 かかる使 用 によれば、 上記新生血管が癌によ り形成されたもので あるため、 結果と して、 人体か ら単離された試料中の癌 の存在を検出する こ とができる。 上記ヒ ト試料は、 例え ば生検によって得 られる組織切片乃至標本、 組織培養中 に存在するかまたは適応された細胞である こ とができる。 また、 上記ヒ ト試料は、 ホモジナイゼ一シヨ ンによって 処理されたものであってもよ く、 これが好ま しい。

図面の簡単な説明 図 1 は、 実施例 3 ( 3 ) に従う各フ ァージと 8残基合 成べプチ ドの競合阻害実験結果を示す棒グラ フである。

図 2 は、 実施例 3 ( 3 ) に従う各フ ァージと 5 残基合 成べプチ ドの競合阻害実験結果を示す棒グラ フである。

図 3 は、 実施例 4 ( 2 ) に示すデン ド リマーペプチ ド の血管新生抑制効果を示すグラ フである。

図 4 は、 実施例 5 ( 2 ) に示す担癌マウスの リ ポソ一 ム溶液の体内分布を示すグラ フである。

図 5 は、 実施例 6 の （1)に示すデン ド リマーペプチ ドの 腫瘍増殖抑制効果を示すグラ フである。

図 6 は、 実施例 6 の （2)に示す本発明ペプチ ドの腫瘍増 殖抑制効果を示すグラフである。

図 7 は、 実施例 6 の （3)に示す本発明ペプチ ドの腫瘍増 殖抑制効果を示すグラフである。

図 8 は、 実施例 6 の （4)に示す本発明ペプチ ドの腫瘍増 殖抑制効果を示すグラフである。

図 9 は、 実施例 6 の （5)に示す本発明ペプチ ドの腫瘍増 殖抑制効果を示すグラフである。

図 1 0 および図 1 1 は、 実施例 6 の （6)に示す本発明べ プチ ドの腫瘍増殖抑制効果を示すグラ フである。

図 1 2 は、 実施例 7 の （1)に示す本発明ペプチ ド修飾 リ ポソームの腫瘍増殖抑制効果を示すグラ フである。 図 1 3 は、 実施例 7 の （2)に示す本発明ペプチ ド修飾リ ポソ一ムの腫瘍組織に対する親和性を示すグラ フである。

図 1 4 は、 実施例 7 の （3)に示す本発明ペプチ ド修飾 リ ポソ一ムの血中安定性を示すグラ フである。

図 1 5 は、 実施例 8 に従う本発明新生血管特異的ぺプ チ ド と抗癌剤とを有効成分と して含有する リ ボソームの 抗腫瘍効果を示すグラ フである。

発明を実施するための最良の形態

以下、 本発明を更に詳し く 説明するため、 実施例を挙 げるが本発明はこれに限定される ものではない。

実施例 1 新生血管特異的ペプチ ドの同定

( 1 ) フ ァージディ スプレイ ライ ブラ リ 一の調製

ニシ、 サャ らの報告 （Nishi T.， Saya H. , et al. , FEBS Let t, 399, 237-240 (1996) ) に従って、 フ ァージ のコー ト タ ンパク質 p ill遺伝子に 1 5 残基のラ ンダムな ア ミ ノ酸配列ペプチ ド をコー ドする ラ ンダム D N Αを揷 入 して、 フ ァージ外殻表面にラ ンダムな 1 5 残基のア ミ ノ酸配列ペプチ ド を発現できる、 所望のフ ァージデイ ス プレイ ライ ブラ リ一を構築した。

上記で構築されたフ ァージディ スプレイ ライ ブラ リ 一 の特徴は、 スコ ッ ト ら （Scot t， J. K. and Smi th, G. P. , Science, 249, 386-390 ( 1990) )によ り報告されている。 ( 2 ) 新生血管の形成

新生血管特異的ペプチ ド発現フ ァージの標的となる腫 瘍新生血管を、 イ ンビボで誘導するためにチャ ンバー リ ング法 （Folkman, J. , et al. , J. Exp. Med. , 133, 275- 288 ( 1971 ) )を採用 した。

こ こでチャ ンバ一 リ ング法は、 イ ンビポで腫瘍新生血 管の誘導を起こすために確立された手法の一つであ り、 リ ングの中に癌細胞を封入し、 動物皮下に移植する こ と で皮膚に新生血管の誘導を起こ させる ものである。 リ ン グのフ ィ ル夕一は細胞を透過させず、 液性因子のみを透 過させる性質があるため、 この手法によれば、 動物の組 織に癌が転移する こ となく、 また、 免疫細胞による癌細 胞への傷害もなく、 新生血管形成を誘導する こ とができ る。

この手法につき 述すれば、 まずリ ング（外径 1 4 mm， 内径 1 0 mm、 高さ 2 mm、 養鯉用 0. 2 m l のミ リ ポ ァ リ ング？10001401、 ミ リ ポア社製 ）の中に、 B 1 6 B L 6 メ ラ ノ ーマ細胞 （Dr. G. L. Nicolsondnst i tute for Molecular Medicine Irvine, CA)よ り入手、 Cancer Res. , 51, 3612-3619 ( 1997)； FEBS Lett. , 427, 286-290 ( 1998) 等参照） の細胞浮遊液（ 1 x 10 ⁷個 /0. 1 8 m 1 )を、 チ ヤ ンバー リ ング当た り 0. 1 8 m 1 となる量で注入口よ り 注射器で注入し、 ナイ ロ ン棒（ミ リ ポア社製）にて注入 口 を封鎖した。 ついで、 上記リ ングを 5週令の

C 5 7 B L / 6雄性マウスの背部に移植し、 マウスの背 部皮膚に新生血管を形成させた。

( 3 ) 新生血管特異的ペプチ ドディ ス プレイ フ ァージの 選別 （バイ ォバニング）

チャ ンバ一 リ ング移植 5 日後にマウスをネンブタール (0. 2 m l 腹腔内投与）で麻酔し、 上記 （ 1 ) で得 られ たラ ンダムペプチ ドディ スプレイ フ ァ一ジ （ 1 X 1 0 ^{1 1}コ ロニ一形成単位）を 0. 2 m l 尾静脈内に投与した。 投与 4分後、 マウスを液体窒素中に凍結させた。 ド ライ ヤー で凍結させたマウスを融解後、 新生血管の形成された皮 膚を切 り 取 り、 その重量を測定した。

ついで、 得 られた皮膚を ミ ンチし、 タ ンパク分解酵素 阻害剤である 1 m Mフエ二ルメチルスルフ ォニルフルォ ライ ド （シグマ社製）を含むダルベッ コ修飾イ ーグル培養 溶液 （A) (日水製薬 （株） 製、 カタ ロ グ番号 ： Code 05915) 1 m 1 を加え、 氷中でホモジナイ ズした。 ついで エツペン ドルフチューブ中に移し、 1 %ゥシ血清アルブ ミ ン （イ ンタージーン社製）を含む氷冷の前記（A)培養液 (BSA 0. lg + lOOmM PI, 100 1 + DMEM 10ml)で 3 回洗浄 した。 洗浄は遠心器を用い 1 2 0 0 0 回転/分で行った。 遠心後上清を除き、 新生血管か ら回収されたフ ァージを 大腸菌 K 9 1 K A N (カナマイ シン耐性株 ： 熊本大学 · 腫 瘍医学講座、 佐谷秀幸教授よ り分与された ものを使用）に 感染させた。 6 0分間静置の後、 0. 2 x g Zm l テ ト ラサイ ク リ ン （シグマ社製）を含む N Z Y培地（10g NZア ミ ン A ： 和光純薬社製： Code; 541 -00241)、 5gビール酵母ェ キス （商品名 ： ェビォス、 アサヒ ビール社製）および 5g NaClを精製水 1Lに溶解し、 5N NaOHを 1 ml加え、 pH7.5に 調製し、 ォ一 卜 ク レープ滅菌したのち、 室温保存したも のを使用）を 1 0 m l 加え、 3 7 °Cで 1 8 0 〜 2 0 0 回転 /分で 6 0分間イ ンキュベー ト した。

次いで、 線画培養した大腸菌 K 9 1 K A Nの 1 コ ロニ —をかき取 り、 カナマイ シン（和光純薬社製、 最終濃度 100 g/ml)を含む N Z Y培地 5 m 1 に懸濁し、 3 7 °Cで 1 8 0 〜 2 0 0 回転/分でー晚イ ンキュベー ト した。 さ ら に この培養液 1 0 0 1 をカナマイ シンを含む N Z Y培 地 1 0 m l に懸濁し、 3 7 °Cで 1 8 0 〜 2 0 0 回転/分で 4時間イ ンキュベー ト した。 4時間培養後、 培養液を 1 0倍希釈した試料が 6 0 0 n mの吸光度で 0. 1 〜

0. 2 を示すこ とを確認し （細胞数が 5 X 10⁹ eel 1/ml )、 3 0分間静置後、 フ ァージを分離 · 精製し、 2 回 目以降 のバイ オノ ニングに用いた。 7

44 上記操作を 5 回繰 り返して、 新生血管に集積する所望 のペプチ ド発現フ ァージを得た。 上記バイ オパニング操 作の結果を表 1 に示す。

表 1

表 1 は、 1 〜 5 回目のバイ オバニングによって得 られ たフ ァージの回収率を示す。 表に示されるよ う に尾静脈 よ り投与されたフ ァージ数に対する新生血管部位に集積 したフ ァージ数の比を％で示したフ ァージ回収率は、 バ ィ ォバニングの回数が増加する度に上がっている こ とが 分 り、 この こ とか ら新生血管内皮細胞に特異的に結合す るペプチ ド を発現している フ ァージが回収されている こ とが確認された。

( 4 ) 新生血管特異的ペプチ ドの配列決定

上記 （ 3 ) で得 られたフ ァ一ジか ら、 1 5個のフ ァー ジについて、 発現しているペプチ ドの配列決定を以下の とお り行つ た。

即ち、 4 回目のバイオバニングの後のタイ ター測定で 得 られたプレー ト上のコ ロニーをそれぞれ 5 0 コ ロニー ずつ、 無作為に拾い上げ、 新しい N Z Yプレー ト に、 植 菌 し直し、 ー晚 3 7 °Cにて培養し、 これをマスタ一プレ — 卜 と して 4でで保存した。

マスタ一プレー トのコ ロニ一を各々 2 0 m 1 の N Z Y 培地（20 g/m lテ ト ラサイ ク リ ン含有）の入っ た 5 0 m 1 遠心チューブに懸濁し、 3 7 でー晚 2 0 0 回転/分で振 盪培養した。

ついで 3 0 0 0 回転/分、 1 0 分間遠心分離を行っ た後. 上清をオーク · リ ッ ジ遠心チューブに移し、 1 2 0 0 0 回転/分で 1 0 分間遠心分離し、 大腸菌を除菌した。 更に 上清をオーク ' リ ッ ジ遠心チューブに移 し、 3 m 1 のポ リ エチレングリ コール（PEG 6000 :ナカ ライ テスク社製） Z N a C 1 を加え、 よ く撹拌した後、 4 に 4 時間静置し た。 1 2 0 0 0 回転/分で 1 0 分間遠心分離し、 フ ァージ を沈殿させた。 ついで上清を除去し、 沈殿したフ ァージ を 1 m 1 の T B S (ト リ ス緩衝塩溶液）に懸濁させた。

1 . 5 m l のエツペン ドルフ · チューブに移し、

1 5 0 0 0 回転/分で 1 0 分間遠心分離し、 不溶性物質を 除去後、 上清を別のエツペン ドルフ ' チューブに移し、 1 5 0 / 1 のポ リ エチレングリ コール/ N a C l を加え、 よ く撹拌した後、 4 に 1 時間静置した。 次いで

1 5 0 0 0 回転/分で 1 0分間遠心分離し、 フ ァ一ジを再 沈殿させた。 ついで上清を除去し、 沈殿したフ ァージを 2 0 0 1 の T B Sで再度懸濁した。 1 5 0 0 0 回転/分 で 1 0分間遠心分離し、 不溶性物質を沈殿させた後、 該 沈澱物を 0. 5 m 1 のエツペン ドルフ · チューブに移 し、 フ ァージク ロ一ンを 4でで保存した。

上記で得られたフ ァ一ジク ローンよ り の D N Aの抽出 は、 1. 5 m 1 のエツペン ドルフ ' チューブにフ ァ一ジ ク ローン 1 0 0 / 1 に対して T B S l O O z l および T E飽和フ エ ノ ール（二ッポジーン社製） 2 0 0 1 をカロ えて、 1 0分間激し く 撹拌後、 1 5 0 0 0 回転/分で 1 0 分間遠心分離した。 次いで、 上清（水相） 2 0 0 1 に対 して Τ Ε飽和フエ ノ ール 2 0 0 1 およびク ロ 口ホルム 2 0 0 1 を加えて、 前記と同様に 1 0分間激し く撹拌 後、 1 5 0 0 0回転/分で 1 0分間遠心分離した。 更に、 上清 （水相） 1 5 0 1 に対して Τ Ε 2 5 0 し 3 Μ酢 酸ナ ト リ ウム 4 0 し 2 0 m g / m 1 グリ コ ーゲン （ベ — リ ンガー · マイ ンハイ ム社製） およびエタ ノ ール l m l を加えて、 1. 5 m l のエツペン ドルフ ' チュー ブにて一 2 0 で、 一時間放置した後、 1 5 0 0 0 回転 /分で 1 0 分間遠心分離した。 上清を取 り除き、 1 m 1 の

8 0 %エタ ノ ール（一 2 0 ）を緩やかに加えて、

1 5 0 0 0 回転/分で 1 0分間遠心分離し残存する塩を除 いた。 上清を除去後、 チューブ内の水分を蒸発させ、 沈 殿している D N Aを 1 0 z l の滅菌蒸留水に溶解し、 4

°Cにて保存した。 か く して得 られた個々 のフ ァージ

D N Aをペプチ ドの配列決定のために使用 した。

フ ァ一ジ D N Aによ り コー ド されるペプチ ドの配列決 定は、 ジデォキシ法 （ Proc. Natl. Acad. Sc i.， USA. , 74, 5463-5467 (1977) ) によ り、 アマシャム社の THERMO配列 キッ ト （Amersham Li fe Sciene, Code； US79765, Lot番 号； 201503)を用いて機器の使用説明書に従い実施した。 D N Aの伸長反応は、 9 6 °C、 3 0 秒、 4 5 ：、 1 5 秒、 6 0 で、 4 分を 1サイ クルと して、 3 0 サイ クル行い、 D N Aの配列は、 A B I 社製の DNAシーケンサー （ABI PRISMTM377DNAシ一ケンサ一）を用いて行っ た。

かく して決定された新生血管特異的ペプチ ドのァ ミ ノ 酸配列を表 2 に、 1文字ア ミ ノ酸表記で示す。 W 23476

48 表 2

上記表 2 に示されるよ う に 1 5個のう ち、 フ ァージ番 号 1 のペプチ ド配列を発現している フ ァ ージは 5個あつ た。 また、 フ ァージ番号 2 〜 1 1 で示されるペプチ ド配 列を発現している フ ァージはそれぞれ 1個ずつあっ た。

( 5 ) 新生血管特異的ペプチ ド発現フ ァージの親和性試 験— 1

Β 1 6 B L 6 メ ラ ノーマ細胞（ 1 x10 ⁶個）を 5週令の C 5 7 B L Z 6雄性マウスの左腹部に移植し、 担癌マウ ス を作製した。 癌移植 1 0 日後 （固形癌の直径が約 1 c m位になっ たとき） に担癌マウスを上記（ 3 )と同様に ネ ンブタール（0. 2 m 1 腹腔内投与）で麻酔し、 上記 （4 ) で得 られ、 配列決定された N o. 1 〜Ν ο· 1 1 のぺプ チ ド発現フ ァージおよび尾静脈投与前のフ ァージのそれ ぞれ（ 1 X 10¹¹コ ロニー形成単位）を 0. 2 m l ずつ尾静 脈内に投与した。 投与 4分後、 マウスを液体窒素中に凍 結させた。 ド ライ ヤーで凍結させたマウスを融解後、 腫 瘍部位を切除し、 該重量を測定した。

得 られた腫瘍を ミ ンチし、 上記 （ 3 ) と同様に してフ ァ一ジを大腸菌に感染させた後、 培養した。 その後、 癌 組織内に集積したフ ァージのコ ロニ一形成単位を同様に 測定した。

得 られた結果 （回収率％ ) を、 癌組織 1 0 0 m g当た り における、 尾静脈内に投与したフ ァージ数に対する集 積フ ァージ数の百分率比で下記表 3 に示す。 また表 3 に は、 新生血管特異的ペプチ ドディ スプレイ フ ァージの癌 組織への親和性を、 選別前のフ ァージの回収率を 1 と し たときの各ペプチ ド発現フ ァージの結合倍率にて併記す る。 表 3

-ジ番号 IHI rtT7

ノ ア ー 収伞 lOOmg組織）

IN o . 5 . y 0 一 ²

X 1 0 Ό 4. 1

IN o . 6 o

Δ . 4 A - 2

X 1 u b ο

ο . Ο

IN o . 1 1. 1 1

z X 1 u ο

Δ 4. Ο . 2 0≥ . 八 ο ο

N o Ό 0 A

X 丄 0 - 3

丄 ο .

N o . 3 b 1 一 3

X 丄 0 ヮ

y 9

J o . 9 o

ό 7 X 丄 0 Ο 4

1 一 3

IN o . 1 丄 1 y X 丄 U 4 b

N o . 4 丄 . 0 4 X 1 0 Q

一 ³ Ό ζ

N o . 1 0 1. 2 8 X 1 0 -³ 2 8 3

N o . 7 6. 6 9 X 1 0 "⁴ 1 4 8

N o . 8 4. 8 7 X 1 0一 ⁴ 1 0 8 選別前フ ァ一ジ 4. 5 2 X 1 0一 ⁴ 1 0 該表よ り、 フ ァージ番号 N o. 5、 N o. 6、 N o. 1、 N o. 2、 N o. 3 の順で癌組織への親和性が高い こ とがわかる。

( 6 ) 新生血管特異的ペプチ ド発現フ ァージの親和性試 験一 2

マウスの系統を変えたとき、 および腫瘍の株を変えた ときにおいても、 上記 （ 5 ) で選別されたペプチ ド発現 フ ァ ージが新生血管に特異的接着を示すかどう かを以下 の とお り試験した。

即ち、 Meth A肉腫細胞（1 X 10 ⁶個）を 5週令の B A L B Z c雄性マウスの左腹部に移植し、 担癌マウス を作製した。 以下、 上記 （ 5 ) の方法と同 じ方法で試験 を？了つ た。

その結果を表 3 と同様に して、 下記表 4 に示す。

表 4

該表よ り、 フ ァージ番号 N o. 1、 N o. 5、 N o. 6 の順で癌組織への親和性が高い こ とがわかる。

このよ う に異なる種の腫瘍に対しても、 多少の親和性 の増減はある もののフ ァージ番号 N o. 1、 N o. 5お よび N o. 6 は、 新生血管を形成する癌組織に対して高 い親和性を示すこ とが明 らかになつた。

実施例 2 本発明ペプチ ドの固相合成

全自動ペプチ ド合成機 （A C T 3 5 7、 ア ドバンス ト 7

52 ケムテッ ク社製） を使用 し、 同社のプロ グラムに従い、 Fmoc/NMP, Η0Βί¾ 〔 Fmoc： 9-フルォレニルメ トキシカルボ ニル、 NMP： N— メチルピロ リ ド ン、 HOBt： 1 — ヒ ド ロキシ ペンゾ ト リ アゾール〕 による各ペプチ ドの固相合成を以 下のとお り 実施した。

即ち まず C端フ リ ー （〇 H ) のペプチ ド を製造した。 これら は配列番号 1 〜 1 2 に示されるア ミ ノ酸配列に従 つて、 C端ア ミ ノ酸に相当する Fmoc-ア ミ ノ酸— Alko樹月

0. 2 5 mm o l に、 C端よ り 2 番目以降の各ア ミ ノ酸 に相当する Fmoc-ァミ ノ酸を順次、 合成プロ グラムに従い 伸長反応させた。

また C端アミ ドの各ペプチ ドは、 Fmoc- NH-SAL樹脂 0. 2 5 mm o l に C端ア ミ ノ酸に相当する Fmoc-ァミ ノ 酸を合成プロ グラムに従い縮合反応させ、 その後、 C端 よ り 2 番目以降の各アミ ノ酸に相当する Fmoc -アミ ノ酸を 順次縮合反応させて鎖伸長を行った。

各反応終了後、 プログラムに従って、 N端 Fmoc基の脱 保護反応を行っ た。

か く して得 られた各ペプチ ド樹脂をポ リ プロ ピ レン製 のミ ニカ ラム （アシス ト社製） に回収し、 メ タ ノ ール洗 浄後、 真空で乾燥し、 以下の操作に付してペプチ ド を樹 脂か ら切 り 出 し、 側鎖の脱保護反応を行っ た。 即ち、 各 樹脂に リ エージェ ン ト K ( Reagent K, 82.5% TFA, 5%フ エ ノ 一ル， 5% H₂0， 5%チオア二ソール（Thi oani so 1 e)， 2.5%エタ ンジチオール） 2 m l を加え、 ミ ニカ ラム中で 6 0分間反応させた。

次いで、 反応液を冷ジェチルエーテル 8 m 1 中 に滴下 して反応を停止させ、 同時にペプチ ド を沈殿させた。 更 に、 ミ ニカ ラムを T F A 2 m l にて洗浄し、 冷ジェチル エーテル 5 m 1 を追加し、 遠心し、 沈殿をジェチルェ一 テル 1 0 m l で 4回洗浄後、 約 5 m l の 5 0 %ァセ トニ ト リ ルでペプチ ド を可溶化し、 凍結乾燥した。 更に可溶 化と凍結乾燥操作を 2 回繰 り 返して、 所望の粗凍結乾燥 品を得た。

これをォク 夕デシルカ ラム （直径 2 0 X 2 5 0 mm， YMC社製） を用いた逆相高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー

(HPLC) によ り分画し、 所望のペプチ ドを単離した。

尚、 上記において用いた樹脂およびア ミ ノ酸誘導体は、 いずれも渡辺化学工業社製のものである。

か く して単離された各ペプチ ドの同定を、 アミ ノ酸配 列分析およびマススぺク ト ロ メ ト リ 一による分子量測定 によ り行っ た。

実施例 3 合成ペプチ ドを用いた競合阻害実験

( 1 ) ペプチ ドの合成 前記実施例 1 で得 られた試験結果か ら、 新生血管部位 および癌組織への親和性の高い 3種のペプチ ド における 共通配列に着目 し、 X R P構造を含む、 配列番号 1、 5 および 6 のペプチ ド に加えて、 更に、 配列番号 1 3 〜

1 6 に示すア ミ ノ酸配列の各ペプチ ドを、 実施例 2 に示 すペプチ ド固相合成法に従って合成した。 尚、 以下の実 施例においては、 特に明示しない限り、 本発明ペプチ ド と しては、 か く して得 られた C端アミ ド構造のペプチ ド を利用 した。

( 2 ) 各フ ァージと 1 5残基の合成ペプチ ドの競合阻害 実験

実施例 1 ( 5 ) と同様の方法で、 配列番号 1、 5 およ び 6 に示すア ミ ノ酸配列の合成ペプチ ド と N o. 1、

N o. 5 および N o. 6 フ ァージを同時に投与した。 尚、 各ペプチ ドの合成は、 実施例 2 に従っ た。

即ち、 ：8 1 6 8 し 6黒色腫 （ 1 1 0 ⁶個） を 5週齢の C 5 7 B L / 6 マウス （日本 S L C社製） に移植 1 0 日 後、 麻酔下に担癌マウスに上記各合成ペプチ ド 0. 2 5 mo 1と各フ ァージ （ l x 1 0 ⁸コ ロニー形成単位）の混合 液 0. 2 m 1 ずつをそれぞれ尾静脈内に投与し、 癌組織 内に集積したフ ァージのコ ロニー形成単位を同様に測定 した。 また、 コ ン ト ロールと して合成ペプチ ド を含まないフ ァ一ジ溶液 （ 1 X I 0 ⁸コ ロニー形成単位） を投与した群 を設けた。

コ ロニ一形成によ り、 癌組織内の新生血管に集積した フ ァ ージ数を算出 し、 合成ペプチ ドを同時に投与してい ないペプチ ド発現フ ァージの腫瘍集積率を基準値と して、 各合成ペプチ ド による フ ァージの集積阻害を評価した。

その結果を表 5 に示す。

表 5

ファ- ' 番可 合成ペプチ ド ^与量/ lGOmg顯 集積阻害％

No. 1 配列番号 1 5. 95 X 10一 3 5 5

配列番号 5 6. 36 X 10一 ³ 5 2 配列番号 6 5. 92 X 10一 3 5 5

(無投与） 1. 33 X 10— ²

No. 5 配列番号 1 1. 35 X 10一 ² 9

配列番号 5 5. 08X 10一 3 6 6 配列番号 6 3. 61 X 10一 3 7 6

(無投与） 1. 48X 10 -²

No. 6 配列番号 1 1. 14X 10— ²

配列番号 5 6. 60X 10一 ³ 4 3 配列番号 6 6. 43 X 10一 3 4 4

(無投与） 1. 15 X 10- 2 上記表よ り以下の こ とが判る。 即ち、 共通のア ミ ノ酸 配列 （W R P )を有する合成ペプチ ド （配列番号 5および 6 ) は、 N o. 5 および N o. 6 のフ ァージに対して交 差的に阻害活性を示し、 新生血管部位に対する親和性に 上記共通配列 W R Pが重要である こ とを示唆した。

一方、 N o. 1 フ ァージの腫瘍集積は、 いずれの合成 ぺプチ ド によっても同程度阻害された。

( 3 ) 各フ ァージと 8残基または 5残基の合成ペプチ ド の競合阻害実験

上記 （ 2 ) と同様の方法によ り、 合成ペプチ ド （配列 番号 5 および 6 ) に代えて、 上記 （ 2 ) で得られた 4つ の短鎖ペプチ ド （配列番号 1 3 〜 1 6 ) を用いて、 これ ら各合成ペプチ ド と各フ ァージとを投与して、 癌組織内 に集積したフ ァージのコ ロニ一形成単位を同様に測定し、 短鎖合成ペプチ ド によるフ ァージの集積阻害を評価した。 コ ン ト ロールと して合成ペプチ ドを含まないフ ァージ溶 液 （ 1 X I 0 ⁸コ ロニー形成単位） を投与した群を設け†乙 . その結果を図 1 および図 2 に示す。

各図において、 縦軸はフ ァージ集積％を、 横軸はフ ァ ージ N o. を示す。 図 1 中、 白抜き棒は、 合成ペプチ ド 無投与のフ ァージのみ投与群 （コ ン ト ロール群） を、 斜 線を付した棒は配列番号 1 3 に示す短鎖合成ペプチ ド投 与群を、 また黒塗 り棒は配列番号 1 4 に示す短鎖合成べ プチ ド投与群を、 それぞれ示す。

図 1 よ り、 配列番号 5 と配列番号 6 に示すア ミ ノ酸配 列の合成べプチ ドの共通配列である W R P を含む 8 残基 の短鎖合成ペプチ ド （配列番号 1 3 および 1 4 ) は、 そ れぞれに対応する 1 5 残基のペプチ ド発現フ ァージの腫 瘍集積を抑制 した。 その阻害活性は 1 5 残基の合成ぺプ チ ド を用いたものを上回る ものであった。 また、 両者が 交差反応性を示した こ とか ら、 共通配列 W R P の重要性 が示唆され、 更に短鎖化する こ と も可能と考え られる。

また、 図 2 中、 白抜き棒は合成ペプチ ド無投与のフ ァ ージのみ投与群 （コ ン ト ロール群） を、 黒塗 り棒は配列 番号 1 5 に示す短鎖合成ペプチ ド投与群 （フ ァージ N o. 5 使用の場合） を、 また斜線を付した棒は配列番号 1 6 に 示す短鎖合成ペプチ ド投与群 （フ ァージ N o . 6 使用の場合） を、 それぞれ示す。

該図 2 か ら、 更に短鎖化された配列番号 1 5 および 1 6 に示すペプチ ド （ 5 残基） の場合も、 共通配列

W R P を有し、 それぞれに対応する 1 5 残基のペプチ ド 発現フ ァージの腫瘍集積を同様に抑制する こ とが判る。 実施例 4 腫瘍増殖抑制作用 1

( 1 )デン ド リ マ一ペプチ ドの合成 ペプチ ドの腫瘍増殖抑制作用を検討する に際して、 投 与されるぺプチ ドの安定性および活性の増強の見込まれ る多抗原性ペプチ ド （mul t ipl e ant igen pept ide : MAP) , 即ちデン ド リ マ一ペプチ ドを用いて検討した。 デン ド リ マ一ペプチ ドの合成は、 Fnioc— MAP— Alko樹脂を用いる こ と によ り、 実施例 2 に示される固相合成と同一の方法に て実施した。 また、 デン ド リ マ一ペプチ ド合成のための 樹 B旨と しては、 Fmocs - Lys₄- Lys₂ - Lys- /3 Ala— Alko樹 脂（Fmoc-MAP- Alko樹脂、 渡辺化学工業社製）を用いた。

合成ペプチ ド と して、 配列番号 1、 5 および 6 に示す ア ミ ノ酸配列のもの （実施例 2 で得たもの） をそれぞれ 用 いて得 られたデン ド リ マーの構造は、 ア ミ ノ酸残基を 一文字表示によ り示せば、 それぞれ以下の通り である。 〈デン ド リ マーペプチ ド〉

( 1 )配列番号 1 のペプチ ドのデン ド リマーペプチ ド ：

(PRPGAPLAGS PGTS) ₈— Ly s ₄— Lys ₂ - Lys— β Ala

(2)配列番号 5 のペプチ ドのデン ド リ マーペプチ ド ：

(DRWRPALPVVLFPLH) ₈ - Lys₄ - Lys₂ - Lys - )3 Ala

(3)配列番号 6 のペプチ ドのデン ド リマーペプチ ド ：

(ASSSYPLIHWRPWAR) ₈— Lys₄— Lys ₂— Lys— β Ala

( 2 )デン ド リ マーべプチ ドの血管新生抑制効果

Meth A肉腫細胞 （ 5 X 1 0 ⁶細胞 Zm l ) を 5 週齢雄性 B A L B Z c マウス （日本 S L C社製） の左腹側部に 0. 2 m l 皮下投与して固形癌担癌マウスを作成した。 上記肉腫移植 6 〜 1 0 日後、 担癌マウス に移植後癌の直 径が 4 m mに到達した 日 を 1 日 目 と し、 1 〜 1 1 日 目 に コ ン ト ロールと して蒸留水 （D. W. ) を、 また上記 （1) 〜 （3)の各デン ド リ マーペプチ ド を、 それぞれ 2 0 m g / k g /日連日皮下投与した （各群 4匹のマウスを用いた）。

各デン ド リ マーペプチ ドの抗腫瘍効果は、 移植 6 日後 か ら腫瘍増殖、 副作用の一指標と して体重変化および生 存 日数を調べる と共に、 癌の短径および長径を測定し、 以下に示す式に従って癌容積を算出 した。 該計算式によ り算出される癌容積は、 癌を摘出して量った癌重量とき わめて高い相関性を示す（r ² = 0.980)。

癌容積 = 0. 4X a X b ² ( a :長径 b : 短径）

その結果を図 3 に示す。

図 3 において縦軸は癌容積 （cm³) を、 横軸は日数 （日 ） を示し、 図中 （1)は上記（1)のデン ド リ マ一ペプチ ド投与 群を、 （2)は上記（2)のデン ド リ マーべプチ ド投与群を、 (3)は上記（3)のデン ド リ マ一ペプチ ド投与群を、 （4)は蒸 留水投与群をそれぞれ示す。

図 3 よ り、 蒸留水の投与と比較して、 配列番号 1、 5 および 6 に示すア ミ ノ酸配列ペプチ ドのデン ド リ マ一ぺ プチ ドの投与によれば、 著しい腫瘍増殖抑制作用が奏さ れる こ とが明 らかとなった。 この結果よ り、 配列番号 1 、 5 および 6 に示すアミ ノ酸配列のペプチ ドは、 デン ド リ マーペプチ ドの形態で、 優れた腫瘍増殖抑制効果を奏す る こ とが確認された。

実施例 5 ペプチ ド修飾リ ボソームの体内分布

本発明血管新生特異的ペプチ ド、 特に W R P配列およ び P R P配列を含むペプチ ドで修飾した リ ボソームは、 その体内分布が腫瘍の新生血管および/または腫瘍周辺 部位に特異的であれば、 所望の抗癌剤ゃ抗癌活性を有す るサイ トカイ ンなどを含む医薬組成物と して癌に対する アクティ ブ夕一ゲティ ングを行う こ とが可能な D D S製 剤 とする こ とができる。

そ こで、 本例では、 W R P配列および P R P配列を含 む 5 残基か らなるペプチ ドの N末端にステア リ ン酸を結 合させて、 リ ボソーム化して調製した リ ボソームが標的 とする腫瘍に集積するか否かを検討した。

( 1 ) リ ボソーム分散液の調製

リ ボソーム分散液の調製のために本発明新生血管特異 的ペプチ ド （部分ペプチ ド、 配列番号 1 5 ： 配列番号 5 の部分ペプチ ド、 配列番号 1 6 ： 配列番号 6 の部分ぺプ チ ドおよび配列番号 1 7 ： 配列番号 1 の部分ペプチ ドの N端に Alaを付加 したもの） のステア リ ン酸誘導体を実施 例 2 の方法で合成した。

次いで、 脂質 D S P C (ジステアロイルホス フ ァチジル コ リ ン ： 日本精化株式会社製）、 コ レステロール（シグマ 社製）および上記 3種の本発明新生血管特異的ペプチ ド (部分ペプチ ドのステア リ ン酸誘導体） のそれぞれを、 モル比が 1 0 ： 5 ： 4 となる割合で含むク ロ 口ホルム溶 液を調製した。

即ち、 7 5 1 の 1 0 0 mM D S P C、 3 7. 5 n 1 のコ レステロール、 3 0 1 の本発明ペプチ ドおよび

[ォレー ト - 1 - ¹⁴C ] 標識コ レステロールォレー ト ( 5 5 5 K B q ： アマシャム社製） を加えて、 モル比が 1 0 ： 5 ： 4 となる割合で含むク ロ 口ホルム溶液を調製 した。 次いで前記調製液をナス型フ ラスコ に入れ、 ロー 夕 リ ーエバポ レーターで減圧条件下にク ロ 口ホルムを除 去して脂質薄膜を調製した。 さ ら に減圧下にク ロ 口ホル ムを完全に除去し、 乾燥させた。 6 0分間真空乾燥した 後、 0. 3 Mグルコースで水和 した （ D S P C濃度 ； 5. 0 m M ) 。

通常、 こ こで、 0. 3 Mグルコースの代わ り に、 有効 成分と してグリ セ リ ンなどで等張化した 5 _ F U、 ド ク ソルビシンなどの抗癌物質ゃ抗腫瘍活性成分を添加する のであ り、 抗腫瘍活性成分と して特定 D N A断片を含む プラス ミ ド ある いは蛋白質の場合は、 ダルベッ コ の リ ン 酸緩衝生理食塩液 （ P B S ) — M g, C a含有液などを 添加 して調製するか、 あるいはリ ポソ一ム調製後に リ モ — ト ローデイ ング法によ り ア ド リ アマイ シンなどの抗癌 剤を封入するのであるが、 本発明の新生血管特異的ぺプ チ ドはそれ自体、 実施例 3 に示されるよ う に抗腫瘍効果 を有するので、 以下のよ う に、 続く 調製ステッ プでは、 抗癌物質ゃ抗腫瘍活性成分は加えないこ こ と した。

上記調製液について、 凍結と 7 0 °C加温による融解を 3 回繰 り 返した後、 調製液を温浴型の超音波処理装置 （商 品名 ： ULTRASONIK250: ラボスコ株式会社製）にて 1 0分 間超音波処理して撹拌を行った。 次いでェクス トル一ダ 一 （ライ ペッ クス社製） にて、 l O O n mの孔径を持つ ポ リ カーボネー ト膜 （ヌ ク リ ポアポ リ カーボネー ト ： コ —スター社製） を 3 回通過させ、 目的とする本発明新生 血管特異的ペプチ ド （部分ペプチ ド） の N末端にステア リ ン酸が結合 した分子を含む リ ボソーム （分散液）を得た。 このものにおいて部分ペプチ ドはリ ボソームの表面を修 飾する形となっている。

か く して、 D S P C、 コ レステロールおよび本発明新 生血管特異的ペプチ ド （ 3種の部分ペプチ ド、 配列番号 1 5 : R W R P A、 配列番号 1 6 ： HW R P Wおよび配 列番号 1 7 : A P R P G)を 1. 5 m l 中に 7. 5 /モル 3. 7 5 / モルおよび 3 μモルとなるよ う にそれぞれ有 する リ ポソ一ム分散液を得た。

(2) 担癌マウスの リ ボソームの体内分布

Meth A肉腫細胞（l X 1 0 ⁶個ノ 0. 2 m l )を 5週齢の B A L B Z c マウスの腹側皮下に移植し、 固形腫瘍を形 成させた。 1 0 日後、 麻酔下で担癌マウスに上記（1)で調 製した 3種の リ ボソーム分散液 0. Z m l Zマウスずつ を尾静脈内に投与し、 マウスの癌組織、 各臓器への体内 分布を調べた。 尚、 コ ン ト ロールと して、 合成ペプチ ド を含まない リ ボソーム分散液を投与した。 試験した担癌 マウスは、 各群 2〜 3匹であっ た。

被検液投与後、 3時間後に担癌マウスを脱血後、 頸椎 脱臼にて屠殺した後、 解剖し、 血液、 癌組織、 心臓、 肺、 肝臓、 脾臓および腎臓の各臓器を採取した。 各臓器重量 を測定した。 血液はエツペン ドルフチューブに移 し、 3 0 0 0 rpm、 5 分間で遠心分離後、 得 られた血清 5 0 1 をパイ アル瓶に保存した。 また、 各臓器は 1 0 0 m g程度になるよ う に切断し、 同様にバイ アル瓶に入れ、 臓器の重量を測定後保存した （各臓器は 2 ケ所よ り取得し た）。 次いでバイ アル瓶の中の各臓器を ミ ンチし、 1 m l の組織溶解液 （ソルノ ブル： NEN Research Productions 社製）を加えた後、 5 0 イ ンキュベータ一（パーソナル D X : タイ テッ ク株式会社製）で一晩放置した。 翌 日、 消 泡剤と してイ ソ プロパノール（和光純薬工業株式会社製） を 0. 5 m l 添加 した後、 脱色剤と して過酸化水素を 0. 5 m 1 加え、 数時間放置した。

その後、 シンチレ一夕一 （ハイ ォニッ ク フ ロー ： パッカ — ド · バイ オサイ エンス社製） を 1 0 m l 添加し、 よ く バイ アル瓶を振盪し、 さ ら に一晩放匱した。 被検物を液 体シンチレ一シヨ ンカウンタ一（L S C— 3 1 0 0 ： ァ ロ 力社製）で、 腫瘍組織を含む各臓器におけるペプチ ドで修 飾された リ ボソームの生体分布測定した。 なお、 測定は ブラ ンクおよびリ ボソーム 5 0 1 にシンチレ一夕一 （ハ ィ ォニ ッ ク フ ロー ： パ ッ カー ド · バイ オサイ エンス社製） 1 0 m l を加えたものを各 2本用意した。

その結果を図 4 に示す。 該図において、 数値は腫瘍組 織 1 0 0 m g中における投与したペプチ ド修飾リ ポソ一 ムの回収量（％投与量）を示す。

図か ら分かるよ う に、 本発明新生血管特異的ペプチ ド (部分ペプチ ド、 配列番号 1 5 ：配列番号 5 の部分べプチ ド ； R W R P A、 配列番号 1 6 ： 配列番号 6 の部分ぺプ チ ド ； H W R P Wおよび配列番号 1 7 ： 配列番号 1 の部 分ペプチ ド ； A P R P G)で修飾された リ ボソームの腫瘍 内分布は、 いずれもコ ン ト ロールに比べて、 有意に高い こ と を示した （図中、 ★印はコ ン ト ロールに対して有意 ( p < 0. 0 5 ) を示す） 。

また、 これら本発明血管新生特異的ペプチ ド にて修飾 された リ ボソームは、 かかるペプチ ドで修飾していない リ ボソーム （コ ン ト ロール、 ペプチ ド無添加） と比較し て、 血中滞留性が上昇する傾向を示すこ と も明 らかとな つ た。

尚、 上記各ペプチ ドの他の臓器への分布に関しては、 全体的にはコ ン ト ロールと類似した傾向を示し、 fl萃臓、 肺および肝臓においては、 若干低下する傾向が認め られ た。 この傾向は特に配列番号 1 7 のペプチ ドで顕著であ つ た。

実施例 6 腫瘍増殖抑制作用 2

(1) 配列番号 1 のペプチ ドのデン ド リ マーの腫瘍増殖抑 制作用についての用量依存性効果の検討

実施例 4 の （ 1 ) で合成された配列番号 1 のペプチ ド のデン ド リ マ一ペプチ ドの 1 0 m g / k g X 2 /日 およ び 2 0 m gノ k g X 2 日 と、 配列番号 1 の配列を任意 の配列に入れ変えたぺプチ ドのデン ド リ マ一ぺプチ ド (配列番号 1 8 ) の 2 0 m g Z k g X 2 /日およびコ ン 476

66 ト ロールと して蒸留水 （D W) のそれぞれを、 実施例 4 の （ 2 ) の方法に準じて、 腫瘍細胞移植後 1 — 1 0 日 ま で皮下投与し、 腫瘍増殖抑制作用を検討した。 実験に供 したマウスは各群 4〜 6 匹である。 得られた結果を図 3 と同様に して図 5 (縦軸 ： 腫瘍容量 （ c m ³) 、 横軸 ： 腫 瘍細胞移植後日 数 （日） ） に示す。

図中、 白拔丸印は、 デン ド リ マーペプチ ドの 1 0 m g k g X 2ノ日群、 黒丸印は、 デン ド リ マーペプチ ドの 2 0 m g Z k g X 2 Z日群、 白抜き四角印は、 任意に配 列を入れ変えたペプチ ドのデン ド リ マ一ペプチ ドの 2 0 m g Z k g X S /日群および黒四角印は、 蒸留水投与群 をそれぞれ示す。

図 5 よ り、 配列番号 1 の配列を任意の配列に入れ変え たべプチ ドのデン ド リ マーべプチ ド投与群および蒸留水 投与群に比較して、 配列番号 1 のデン ド リ マーペプチ ド 投与群は、 用量依存的に腫瘍増殖抑制作用を示すこ とが 分かる。

(2) 配列番号 1 に関連する短鎖ペプチ ドの腫瘍増殖抑制 効果の検討

この試験では、 下記表 6 に示されるア ミ ノ酸配列の、 配列番号 1 の部分配列またはその部分配列を含む 3種の 短鎖ペプチ ド を実施例 2 の方法に準じたペプチ ドの固相 合成法によ り 合成して使用 した。

表 6

合成した 3 種の各短鎖ペプチ ドおよびコ ン ト ロールと して生理食塩水のそれぞれを実施例 4 の （ 2 ) の方法に 準じて、 腫瘍細胞移植後 1 一 1 0 日 まで皮下投与し、 腫 瘍増殖抑制作用 を検討した。 得 られた結果を、 図 3 と同 様に して図 6 に示す。

図中、 白拔丸印は生理食塩水投与群、 黒丸印は配列番 号 1 9 のペプチ ド投与群、 白抜き四-角印は E列番号 1 7 のペプチ ド投与群および黒四角印は配列番号 2 0 のぺプ チ ド投与群をそれぞれ示す。

図 6'よ り、 配列番号 1 の配列の前半部にある P R P を 含むペプチ ドの投与群 （配列番号 1 9 のペプチ ド投与群 および配列番号 1 7 のペプチ ド投与群） において、 腫瘍 の増殖抑制傾向が確認された。

( 3 ) 配列番号 5 に関連する短鎖ペプチ ドの腫瘍増殖抑制 効果の検討

下記表 7 に示される、 配列番号 5 の全配列を有するぺ プチ ド、 配列番号 5 の 2種の部分配列を有するペプチ ド (配列番号 1 3 のペプチ ドおよび配列番号 2 1 のべプチ ド） および配列番号 5 の配列を任意の配列に入れ換えた ペプチ ド （配列番号 2 2 ) を、 それぞれ実施例 2 の方法 に準じたペプチ ドの固相合成法によ り合成して、 試験に 供 した。

表 7

上記で合成した各べプチ ドのそれぞれ 2 O m g k g Z日 またはコ ン ト ロールと しての蒸留水 （D W) を、 実 施例 4 の （2)の方法に準じて、 腫瘍細胞移植後 4 一 9 日 ま で皮下投与し、 腫瘍増殖抑制作用 を検討した。 実験に供 したマウスは各群 3 〜 5匹である。 結果を図 3 と同様に して図 7 に示す。 図中、 白抜丸印は蒸留水投与群、 黒丸は配列番号 5 の ペプチ ド投与群、 白抜き四角印は配列番号 2 2 のべプチ ド投与群 （比較群、 配列番号 5 の任意配列の 1 5 残基の ペプチ ド投与群） 、 黒四角印は配列番号 1 3 のペプチ ド 投与群および白抜き三角印は配列番号 2 1 のペプチ ド投 与群をそれぞれ示す。

図 7 よ り、 配列番号 5 の全配列のペプチ ド並びに前半 部および後半部の各短鎖ペプチ ドはいずれも腫瘍増殖抑 制作用 を有する こ とが確認された。

(4) 配列番号 5 のペプチ ド に関連する短鎖ペプチ ド （ 5 残 基）の腫瘍増殖抑制効果の検討

上記 （3 )の結果か ら、 腫瘍増殖抑制効果の活性に影響を 与えるペプチ ド配列をさ ら に検討するために、 下記表 8 に示される、 配列番号 5 の 3 種の部分配列を実施例 2 の 方法に準じたペプチ ドの固相合成によ り合成して、 本試 験に供した。

表 8

ア ミ ノ酸配列 備 考

配列番号 2 3 配列番号 5 の 8 — 1 2位ペプチ ド 配列番号 2 4 配列番号 5 の 1 1 一 1 5 位ペプチ ド 配列番号 2 5 配列番号 5 の 5 — 9 位ペプチ ド 上記で合成 した各ペプチ ドのそれぞれ 2 0 m g / k g 日 またはコ ン ト ロールと して生理食塩水を、 実施例 4 の （ 2 ) の方法に準じて、 腫瘍細胞移植後 1 一 1 0 曰 ま で皮下投与 して腫瘍増殖抑制作用を検討した。 実験に供 したマウスは各群 4 〜 5 匹である。 結果を図 3 と同様に して図 8 に示す。

図中、 白抜丸印は配列番号 2 3 のペプチ ド投与群、 黒 丸は配列番号 2 4 のペプチ ド投与群、 白抜き四角印は配 列番号 2 5 のペプチ ド投与群および黒四角印は生理食塩 水投与群をそれぞれ示す。

図 8 よ り、 配列番号 5 の 1 1 — 1 5 位の 5 残基の短鎖 ぺプチ ド においても抗腫瘍活性がある こ とが確認された。 ( 5 ) 配列番号 6 のペプチ ド に関連する短鎖ペプチ ドの腫 瘍増殖抑制効果の検討

上記（3 )と同様に、 配列番号 6 のペプチ ド に関連する短 鎖べプチ ドの腫瘍増殖抑制効果に影響を与えるぺプチ ド 配列を検討するために、 下記表 9 に示される、 配列番号 6 のペプチ ド、 その 3 種の部分配列 （配列番号 2 6、 1 4 および 1 6 ) および配列番号 6 の配列を任意に入れ 換えた配列の比較ペプチ ド （配列番号 2 7 ) を、 実施例 2 の方法に準じたぺプチ ド固相合成法によ り合成して、 本試験に用 いた。 9

上記で合成した各ペプチ ドのそれぞれ 2 O m g k g Z日 またはコ ン ト ロールと して蒸留水を、 施例 4 の （2 ) の方法に準じて、 腫瘍細胞移植後 1 一 1 0 日 まで皮下投 与して腫瘍増殖抑制作用を検討した。 実験に供 したマウ スは各群 5 6 匹である。 結果を図 3 と同様に して図 9 に示す。

図中、 白抜丸印は蒸留水投与群、 黒丸印は配列番号 6 のペプチ ド投与群、 白抜き四角印は配列番号 2 6 のぺプ チ ド投与群、 黒四角印は配列番号 1 4 のペプチ ド投与群、 白抜き三角印は配列番号 1 6 のペプチ ド投与群および黒 三角印は配列番号 2 7 のペプチ ド投与群をそれぞれ示す。

図 9 よ り、 W R P配列を含む配列の短鎖ペプチ ド にお いて抗腫瘍活性がある こ とが確認された。 ( 6 ) W R P配列を含む短鎖ペプチ ドおよび W R P配列を 1 残基置換した配列を含む短鎖ペプチ ドの腫瘍増殖 抑制効果の検討

上記 （5 )の結果か ら、 さ ら に W R P配列の抗腫瘍活性に 対する重要性を検討するために、 下記表 1 0 に示す配列 番号 5 由来、 配列番号 6 由来および配列番号 5 と 6 の両 者の配列由来の 3 〜 4残基の W R P配列を含むぺプチ ド および W R P配列中の各ア ミ ノ酸残基をそれぞれァラニ ン （A ： A l a)で置換した 5 残基ペプチ ドを、 実施例 2 の方 法に準じたペプチ ドの固相合成によ り合成して、 本試験 に供 した。

表 1 0

アミ ノ酸配列 備 考

配列番号 2 8 配列番号 5 の 2— 5位 4残基べプチド 配列番号 2 9 配列番号 6の 9 一 1 2位 4残基ペプチド 配列番号 3 0 配列番号 5の 3— 6位 4残基ペプチド 配列番号 3 1 配列番号 6 の 1 0— 1 3位 4残基ペプチ ド 配列番号 3 2 配列番号 5 と 6 に共通の 3残基べプチド 配列番号 3 3 配列番号 1 6 の Wを Aに置換したペプチ ド 配列番号 3 4 配列番号 1 6 の Rを Aに置換したペプチ ド 配列番号 3 5 配列番号 1 6 の Pを Aに置換したペプチ ド 上記で合成した各ペプチ ドのそれぞれ 2 0 m g / k g Z 日 またはコ ン ト ロールと して蒸留水または生理食塩水 のそれぞれを、 実施例 4 の （2 )の方法に準じて、 腫瘍細胞 移植後 1 一 1 0 日 まで皮下投与 し、 腫瘍増殖抑制作用を 検討した。 実験に供したマウスは各群 5 〜 6 匹である。 結果を図 3 と同様に して、 図 1 0 (配列番号 2 8 〜 3 2 の各ペプチ ドの結果） および図 1 1 (配列番号 3 3 〜 3 5 の各ペプチ ドの結果） に示す。

図 1 0 中、 白抜菱形印は配列番号 3 2 のペプチ ド投与 群、 黒丸は蒸留水投与群、 白抜き四角印は配列番号 2 8 のペプチ ド投与群、 黒四角印は配列番号 2 9 のペプチ ド 投与群、 白抜き三角印は配列番号 3 0 のペプチ ド投与群 および黒三角印は配列番号 3 1 のペプチ ド投与群をそれ ぞれ示す。

図よ り、 W R P配列を含む各配列の短鎖ペプチ ドは、 抗腫瘍活性を有する こ とが確認され、 その抗腫瘍活性の 強さ は、 配列番号 2 8 のペプチ ド =配列番号 2 9 のぺプ チ ド >配列番号 3 0 のペプチ ド -配列番号 3 1 のべプチ ド〉配列番号 3 2 のペプチ ドである こ とが判明 した。

また、 図 1 1 中、 白抜丸印は生理食塩水投与群、 黒丸 は配列番号 3 3 のペプチ ド投与群、 白抜き四角印は配列 番号 3 4 のペプチ ド投与群および黒四角印は配列番号 3 5 のペプチ ド投与群をそれぞれ示す。

図 1 1 よ り、 W R P配列を含まない配列を有する短鎖 ペプチ ド においては、 抗腫瘍活性は認め られない こ とが 判つ た。

以上の結果か ら、 抗腫瘍活性を有するためには W R P 配列が重要であ り、 該 W R P配列を含む少なく と も 4 〜 5 残基以上の配列か らなる短鎖べプチ ドが抗腫瘍活性を 有する こ とが確認された。

実施例 7 ペプチ ド修飾リ ボソームの検討

(1) ペプチ ド修飾リ ボソームによる腫瘍増殖抑制効果の 検討

実施例 5 の （1)に準じて配列番号 1 5、 1 6 および 1 7 の配列を有する各ペプチ ド修飾 リ ボソームを調製し、 そ れら の腫瘍増殖抑制作用を検討した。 但し、 各ペプチ ド 修飾 リ ボソームの調製の際、 〔ォレ一 ト ー 1 一 ¹⁴ ( 〕 標 識コ レステロールォレー 卜 の添加は行わなかっ た。

上記で作成した各べプチ ド修飾リ ボソーム分散液のそ れぞれ 2 O m g / k g Z日 またはコ ン ト ロールと して生 理食塩水およびコ ン ト ロールリ ボソーム （ペプチ ド無添 加） のそれぞれを、 実施例 4 の （2)の方法に準じて、 腫瘍 細胞移植後 4、 6 および 8 日 目 の 3 回、 皮下投与して、 各ペプチ ド修飾リ ボソームの腫瘍増殖抑制作用を検討し た。 実験に供したマウスは各群 5 匹である。 結果を図 3 と同様に して図 1 2 に示す。

図中、 白抜菱形印はコ ン ト 口一ルリ ポソ一ム投与群、 白抜四角印は生理食塩水投与群、 白抜丸印は配列番号 1 7 のペプチ ド修飾 リ ボソーム投与群、 白抜き三角印は 配列番号 1 5 のペプチ ド修飾リ ボソーム投与群および黒 四角印は配列番号 1 6 のペプチ ド修飾 リ ボソーム投与群 をそれぞれ示す。

図 1 2 よ り、 抗腫瘍効果の高さ は、 配列番号 1 5 のべ プチ ド修飾リ ボソーム >配列番号 1 6 のペプチ ド修飾リ ポソ一ム >配列番号 1 7 のペプチ ド修飾リ ボソームの順 である こ とが判っ た。 また図 1 2 よ り、 W R P配列を含 む配列の短鎖べプチ ドが抗腫瘍活性のよ り 強い こ とが確 認された。

( 2 ) ペプチ ド修飾 リ ボソームにおけるペプチ ド組成の腫 瘍組織親和性への影響

実施例 5 のべプチ ド修飾 リ ポソームの体内分布試験の 結果か ら、 配列番号 1 7 の配列を有するペプチ ドで修飾 された リ ボソームが最も腫瘍特異的であった こ とか ら、 このペプチ ドの リ ポソ一.ム中のモル比を変化させて、 腫 瘍に対する特異性の変化を検討した。

即ち、 実施例 5 の （1 )に準じて リ ボソーム分散液を調製 した。 その際、 旨質 D S P C (ジステア ロイルホスフ ァ チジルコ リ ン ： 日本精化株式会社製） 、 コ レステロール (ジグマ社製） および本発明新生血管特異的ペプチ ド (配列番号 1 7 ： 配列番号 1 の部分ペプチ ドの N端に A 1 aを付加 したもの） のステア リ ン酸誘導体のモル比が 1 0 : 5 : 2 ( P R P — 2 0 とレ う） 、 1 0 : 5 : 1 ( P R P — 1 0 とレ う） 、 1 0 : 5 : 0. 5 ( P R P - 5 とレ う ） および 1 0 ： 5 ： 0 (コ ン ト 口一ルリ ポソ一 ム、 対照と い う ） となる割合をそれぞれ採用 した。 リ ポ ソ一ムの濃度は D S P Cが 5 mMとなるよ う に し、 サイ ズは 1 0 0 n mに調製した。

続いて、 実施例 5 の （2)に準じて、 上記で調製された各 リ ボソームの腫瘍組織への親和性を検討した。 試験した 担癌マウスは各群 2 〜 3 匹である。

その結果を、 図 4 と同様に して図 1 3 (縦軸 ： ％投与 量 / ^/ 1 0 0 m g組織、 横軸 ： 各供試リ ボソーム） に示す。

図 1 3 か ら、 本発明 リ ボソーム製剤の有効成分のひと つである新生血管特異的ペプチ ドの量を少なく と も 5 モ ル％ にまで低下させても、 所望の腫瘍への親和性には影 響しない こ とが判明 した。

(3) ペプチ ド修飾 リ ボソームの血清中安定性の検討

上記 （2)で調製したペプチ ド修飾リ ボソームを用いて、 それ ら の血清中での安定性を以下の通 り凝集度を測定す る こ と によ り検討した。

即ち、 各 リ ボソーム分散液 0. 1 5 m l、 未非働化ゥ シ胎児血清 （ JRHバィ ォサイ エンス社製） 0. 7 5 m l お よび 0. 3 Mグルコース溶液 0. 6 m l の混合液を調製 した。 コ ン ト ロールと して、 リ ボソーム分散液 0. 1 5 m l および 0. 3 Mグルコース溶液 1. 3 5 m l の混合 液を調製した。 上記の混合液をそれぞれ 3 7でで 3 0分 間イ ンキュベー ト し、 4 5 0 n mにおける吸光度を測定 した （ベッ クマン社製、 DU- 70スぺク ト ロメーター使用） 。

か く して求めた測定値よ り各 リ ボソーム分散液の凝集 度を下式に従い算出 した。

凝集度 =血清存在下 4 5 0 n mにおける吸光度 （ リ ポソ ーム分散液の濁度） /血清非存在下 （ 0. 3 Mグルコ一 ス溶液中） 4 5 O n mにおける吸光度 （リ ボソーム分散 液の濁度）

得 られた血清中安定性 （凝集度） の結果を、 図 1 4 (縦軸 ： 凝集度、 横軸 ： 各供試 リ ボソーム） に示す。

図 1 4か ら、 本発明の リ ボソーム製剤の血清中の安定 性は、 本発明の リ ボソーム製剤の有効成分のひとつであ る新生血管特異的ペプチ ドの量が少な く と も 1 0 モル％ 以下においては凝集に影響しない こ とが確認された。 実施例 8 新生血管特異的ペプチ ド と抗癌剤とを有効成 分と して含有する リ ボソーム製剤による抗腫瘍効果の検 ϋ

実施例 7 の （2)で得た本発明べプチ ド修飾 リ ポソ一ムの 腫瘍組織に対する親和性への影響試験の結果を基に、 5 モル％の配列列番号 1 7 のペプチ ド を含むペプチ ド修飾 リ ボソームに、 抗癌剤と して知 られている ア ド リ アマイ シンを封入した下記 リ ボソームについてその抗腫瘍効果 を検討した。

(1) ア ド リ アマイ シン （ADR)封入ペプチ ド修飾リ ボソーム の調製

リ ボソーム溶液の調製のために本発明新生血管特異的 ペプチ ド （部分ペプチ ド、 配列番号 1 7 ： 配列番号 1 の 部分ペプチ ドの Ν端に A 1 aを付加したもの） のステア リ ン 酸誘導体を実施例 2 の方法で合成した。

次いで、 脂質 D S P C (ジステア ロイルホス フ ァチジ ルコ リ ン ： 日本精化株式会社製） 、 コ レステロール （シ ダマ社製） および上記の本発明新生血管特異的ペプチ ド (部分ペプチ ドのステア リ ン酸誘導体） を、 モル比が 1 0 : 5 : 0. 5 となる割合で含むク ロ 口ホルム溶液を 調製した。 即ち、 4 0 0 /z l の l O O mM D S P C, 2 0 0 a 1 の 1 0 O mMコ レステロールおよび 1 0 0 1 の 2 0 m Μ本発明ペプチ ドを加えて、 モル比が 1 0 ： 5 : 0. 5 となる割合で含むク ロ 口ホルム溶液を調製し た。 次いで前記調製液をナス型フ ラスコ に入れ、 口一夕 リ ーエバポ レ一夕一で減圧条件下にク ロ 口ホルムを除去 して脂質薄膜を調製した。 さ ら に減圧下にク ロ 口ホルム を完全に除去して乾燥させた。 6 0分間真空乾燥した後、 l m l の 0. 3 Mクェン酸溶液 （ p H 4. 0 ) で水和 し た （ D S P C濃度 ； 4 0 mM) 。

上記調製液について、 凍結と 7 0 °C加温による融解を 3 回繰 り 返した後、 調製液を温浴型の超音波処理装置 (商品名 ： ULTRASONIK250 ： ラボスコ株式会社製） にて 1 0分間超音波処理して攪拌を行っ た。 次いでェクス 卜 ルーダー （ライ ペッ クス社製） にて、 l O O n mの孔径 を持つポ リ カーボネー ト膜 （ヌ ク レオポアポ リ 力一ポネ ー ト ： コースター社製） を 3回通過させ、 目的とする本 発明新生血管特異的ペプチ ド （部分ペプチ ド） の N末端 にステア リ ン酸が結合した分子を含む リ ボソーム （分散 液） を得た。 このものにおいて部分ペプチ ドはリ ポソ一 ムの表面を修飾する形となっている。

リ ボソーム分散液に 0. 5 M炭酸ナ ト リ ウム溶液を加 え、 リ ボソーム外水相の p Hを 7. 5 に調整した。 次い で 2 0 mM H E P E S緩衝液で希釈し、 全量 2. O m l と した。 さ ら に、 1 0 m gノ m 1 ア ド リ アマイ シン （シ ダマ社製） 溶液を 0. 5 8 m 1 加え、 6 0 °Cで 1 時間ィ ンキュベーシ ヨ ンし、 リ ボソーム内水層にア ド リ アマイ シンを封入した。

上記調製液を 5 分間遠心 （日立ェ機社製、 CS120EX ; 100, 000 g) して リ ボソームを沈殿させ、 封入されなかつ たア ド リ アマイ シンを含む上清を除去した。 沈殿を 1 111 1 の 0. 3 Mグルコース溶液で再分散し、 以下に記述 した定量法によ り ア ド リ アマイ シン内封量を算出 した。 次いで、 ア ド リ アマイ シンが 1. 1 m g m 1 ( 1 0 m g / k g ) となるよ う に希釈し、 ア ド リ アマイ シンを 封入した本発明新生血管特異的 リ ボソーム （分散液） を 得た。

か く して、 D S P C、 コ レステロールおよび本発明新 生血管特異的ペプチ ド （配列番号 1 7 ) を 5. 5 m l 中 に 4 0 Μ、 2 0 Μおよび 2 Μとなるよ う にそれぞ れ有する リ ボソーム （分散液） を得た （ D S P C濃度 ； 7. 3 m Μ ) 。

(2)ア ド リ アマイ シンの定量

(a)ァ ド リ ァマイ シン暈の検量線の作成

0 IX I , 1 0 0 / し および 4 0 0 l の 0. S m g Zm l ア ド リ アマイ シン溶液、 9 0 0 ^ 1 、 8 0 0 1 , 7 0 0 z l および 5 0 0 1 の 0. 3 Mグ ルコース溶液および 1 0 0 1 の 1 0 %還元 ト ライ ト ン X - 1 0 0 (reduced Triton X- 100， アル ド リ ツチ社製） をそれぞれ混合後、 4 8 0 n mにおける吸光度を測定し (ベッ クマン社製、 DU-70スぺク ト ロ メータ一） 、 検量線 を得た。

(b)リ ボソーム内水層のァ ド リ アマイ シンの定量

1 0 / l の リ ボソーム分散液、 I O O I の 1 0 %還 元 ト ライ ト ン X— 1 0 0および 8 9 0 1 の 0. 3 Mグ ルコース溶液を混合後、 6 0 °Cにて加温し、 4 8 0 n m における吸光度を測定した。

か く して求めた測定値および検量線よ り ァ ド リ アマイ シンの リ ボソーム内水層への封入率を算出 したと こ ろ、

9 0 %以上の内封率であっ た。

(3) ア ド リ アマイ シン封入本発明ペプチ ド修飾リ ポソ一 ムの抗腫瘍効果

Meth A肉腫細胞（ 1 X 1 0 ⁶細胞/マウス）を 5週齢雄性 B A L B / c マウス （日本 SLC社製）の左腹側部に皮下投与 して固形癌担癌マウスを作成した。 移植した 日 を D a y 1 と し、 6、 9および 1 2 日 目 に溶媒コ ン ト ロールと し て、 0. 3 Mグルコース溶液 （溶媒） 、 ア ド リ アマイ シ ン （A D R )封入コ ン ト ロールリ ボソーム （本発明の新生血 管特異的ペプチ ド を含まない抗癌剤が封入された リ ポソ 一ム） 、 抗癌剤の A D R力 l 5 m g / k g (マウス）とな る よ う に 0. 3 Mグルコースに溶解したフ リ ー A D R溶 液および上記（1 )で調製した A D Rを封入した本発明血管 新生特異的ペプチ ド修飾リ ボソームのそれぞれを尾静脈 内 に投与 した。 試験に供した担癌マウスは各群 5 匹と し た。

投与した各薬物の抗腫瘍効果は、 腫瘍移植 5 日後か ら 腫瘍増殖の一指標と しての腫瘍容積、 副作用の一指標と してのマウス体重変化および生存日数を、 実施例 4の ( 2 ) と同様に して調べる こ と によ り評価した。

結果を図 1 5 に示す。

図中、 縦軸は腫瘍容積を、 横軸に腫瘍移植後の 日 数を 示す。 また図中、 （1)は溶媒投与群、 （2)は A D R封入コ ン ト ロールリ ボソーム投与群、 （3)はフ リ ー A D R溶液投 与群および（4)は A D Rを封入した本発明新生血管特異的 ぺプチ ド修飾リ ポソ一ム投与群をそれぞれ示す。

図 1 5 か ら分かるよ う に、 リ ボソームに封入されなか つ たフ リ ーのア ド リ アマイ シン （A D R ) 溶液を投与 し た群 （群（3)) では、 6、 9および 1 2 日 の 3 回の投与に よ り マウスが全例死亡したのに対して、 リ ボソームに封 入されたア ド リ アマイ シンの投与群 （群（2)) では、 マウ スの死亡は回避された。 また、 ア ド リ アマイ シンを封入 した本発明新生血管特異的べプチ ド修飾 リ ポソ一ムの投 与群 （群（4 ) ) では、 移植された腫瘍の増殖が著し く 抑制 される こ とが判つ た。

この結果よ り、 本発明の新生血管特異的ペプチ ド を有 効成分と して含むペプチ ド修飾リ ボソームに抗癌剤を封 入した リ ボソーム製剤では、 封入された抗癌剤の副作用 が軽減され且つ腫瘍増殖抑制効果が著し く 増強される こ とが確認された。

産業上の利用可能性

本発明によれば、 新規な新生血管特異的ペプチ ドが提 供され、 該新生血管特異的ペプチ ドの利用 によれば、 癌 組織の新生血管内皮細胞の リ ガン ド と しての分子医薬と して、 標的組織に選択的に薬物送達を可能とする D D S 製剤への応用が可能であ り、 癌治療効果の向上に寄与す る癌診断剤、 癌診断方法、 癌治療方法等の提供が可能と なる。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 新生血管に選択的に帰巣し、 以下の )および（b) のいずれかである新生血管特異的ペプチ ド ：

( a) 配列番号 1 か ら 1 1 で示される アミ ノ酸配列のい ずれかを有するぺプチ ド またはそのデン ド リ マー、

(b) 上記 )に示されるア ミ ノ酸配列において 1 若し く は複数個のア ミ ノ酸が置換、 欠失若し く は付加によ り 改変されたア ミ ノ酸配列か らな り、 かつ新生血管に親 和性を有するぺプチ ド またはそのデン ド リ マ一。

2 . 配列番号 1 か ら 1 1 で示されるアミ ノ酸配列のい ずれかを有するペプチ ド またはそのデン ド リ マ一であ る請求項 1 に記載の新生血管特異的ペプチ ド。

3 . 配列番号 1、 5 および 6 で示されるア ミ ノ酸配列 のいずれかを有するぺプチ ド またはそのデン ド リ マ一 である請求項 2 に記載の新生血管特異的ペプチ ド。

4 . 配列番号 1 2 〜 1 7 で示されるア ミ ノ酸配列のい ずれかを有するペプチ ド またはそのデン ド リ マーであ る請求項 1 に記載の新生血管特異的ペプチ ド。

5. 癌組織に形成される新生血管に選択的に帰巣する ぺプチ ドである請求項 1 に記載の新生血管特異的ぺプ チ ド。

6. 癌が肉腫またはメ ラ ノ一マである請求項 5 に記載 の新生血管特異的ペプチ ド。

7. 請求項 5 または 6 に記載の新生血管特異的べプチ ドの少な く と も 1 種を有効成分と して、 製剤担体と共 に含有する制癌組成物および癌転移抑制組成物。

8. 新生血管特異的ペプチ ドが配列番号 1、 5、 6、

1 3 〜 1 7、 1 9、 2 1、 2 3 〜 2 5 および 2 8 〜 3 2 で示されるア ミ ノ酸配列のいずれかを有するぺプ チ ド またはそのデン ド リ マーである請求項 7 に記載の 制癌組成物および癌転移抑制組成物。

9. 請求項 5 または 6 に記載の新生血管特異的べプチ ド の少な く と も 1 種と抗癌剤または癌転移抑制剤 と を 有効成分と して、 製剤担体と共に含有する リ ボソーム 製剤。

1 0. 新生血管特異的ペプチ ドが配列番号 1 5 〜 1 7 で示されるア ミ ノ酸配列のいずれかを有するぺプチ ド またはそのデン ド リ マ一である請求項 1 0 に記載の リ ポソーム製剤。

1 1. 請求項 5 または 6 に記載の新生血管特異的ぺプ チ ドの少なく と も 1 種の有効量を患者に投与する、 制 癌および癌転移抑制方法。

1 2. 新生血管特異的ペプチ ドが配列番号 1、 5、 6、

1 3 〜 ： L 7、 1 9、 2 1、 2 3 〜 2 5 および 2 8 〜

3 2 で示されるア ミ ノ酸配列のいずれかを有するぺプ チ ド またはそのデン ド リ マ一である請求項 1 1 に記載 の制癌および癌転移抑制方法。

1 3. 請求項 9 に記載の リ ボソーム製剤を患者に投与 する、 制癌および癌転移抑制方法。

1 4. 請求項 1 0 に記載の リ ボソーム製剤を患者に投 与する制癌および癌転移抑制方法。