ES2365084T3 - Derivados del péptido vapeehptllteaplnpk biológicamente activos. - Google Patents
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Abstract
Un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24.
Description
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a péptidos cortos y al uso de los mismos. En particular, la presente invención se refiere a péptidos cortos con actividades biológicas
Descripción de la técnica relacionada
En la técnica se conocen péptidos para el tratamiento de enfermedades y como composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.191.113 describe un péptido que tiene una actividad inhibidora para el crecimiento de células de músculo liso y es útil, por lo tanto, para prevenir y tratar afecciones patológicas asociadas al crecimiento de células de músculo liso tales como arteriosclerosis, reestenosis después de angioplastia, estenosis luminal después de injertar un vaso sanguíneo y sarcoma del músculo liso. El documento U.S. 6.184.208 describe otro péptido que se ha descubierto que modula procesos fisiológicos tales como actividad de aumento de peso de la zona de crecimiento epitelial y crecimiento capilar. Además, la publicación PCT Nº WO 03/006492 y la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 2003/219447 sugerían que algunos péptidos y sus composiciones farmacéuticas son biológicamente activos y capaces de modular respuestas inmunitarias.
Es, por lo tanto un objeto de la presente invención proporcionar un péptido o péptidos cortos que tienen actividad biológica.
Sumario de la invención
Un aspecto de la invención se refiere a un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24
Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto más de la invención son métodos de preparación de una composición farmacéutica que comprende proporcionar un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 y mezclar el péptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto más de la invención es un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 para su uso en la reducción de los efectos de una enfermedad humana. En algunas realizaciones, dicho ser humano padece nefritis y/o un trastorno inmunológico.
Un aspecto adicional de la invención es el uso de un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 en la fabricación de un medicamento para tratar una afección seleccionada entre el grupo constituido por nefritis y un trastorno inmunológico.
Otro aspecto de la invención es un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 para su uso en la modulación del sistema inmunitario.
Otro aspecto más de la invención es el uso de un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 en la fabricación de un medicamento para modular el sistema inmunitario. En algunas realizaciones, la modulación del sistema inmunitario es la transformación de linfocitos T in vivo, la transformación de linfocitos T mediante ConA in vivo, la supresión de la formación de anticuerpos y las supresión de células NK.
Un aspecto adicional de la invención es el uso de un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 como suplemento alimenticio.
Breve descripción de los dibujos
Cada una de las cinco figuras demuestra reacciones químicas ejemplares para unir péptidos a moléculas esteroideas.
La figura 1 muestra una serie de reacciones químicas para unir un péptido a una molécula de estrona con un enlace covalente.
La figura 2 muestra un segundo conjunto, alternativo, de reacciones para crear la misma unión que en la figura
1.
La figura 3 contiene una serie de reacciones químicas diseñadas para unir un péptido a una molécula de estradiol con un enlace covalente.
La figura 4 contiene una segunda serie de reacciones químicas para crear la misma unión que en la figura 3.
La figura 5 demuestra un método de unión de un péptido mediante un enlace covalente a una molécula de hidrocortisona.
Descripción detallada de la realización preferida
Se descubrió que el péptido CMS-010 (SEC ID Nº 1), que tiene la secuencia VAPEEHPTLLTEAPLNPK, tiene actividad biológica inmunorreguladora (Solicitud de patente de Estados Unidos Nº 2003/219447) y tiene potencial terapéutico para uso humano. La presente invención se refiere a fragmentos y derivados de CMS-010 que tienen actividad biológica, en particular a un fragmento y derivado constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24. Los usos del fragmento y derivado de CMS-010 incluyen la regulación de células y tejidos. Los fragmentos y derivados de CMS-010 pueden incorporarse en preparaciones farmacéuticas y suplementos alimenticios.
Se entiende que puede ser posible añadir aminoácidos adicionales a los extremos amino o carboxilo de un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24, en el que dicho péptido no comprende la secuencia de CMS-010, y derivados funcionales de la misma como otro método de poner en práctica la presente invención. En dichas realizaciones, un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24, en el que dicho péptido no comprende la secuencia de CMS-10 y derivados funcionales de la misma, conserva una o más de las propiedades terapéuticas o funcionales descritas en este documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, pueden añadirse uno o dos aminoácidos a un péptido descrito sin afectar a su función biológica.
“Péptido sustancialmente puro” se refiere a péptidos que tienen al menos el 10% de p/p en pureza, más preferentemente el 20%, aún más preferentemente el 40% y mucho más preferentemente el 60% y bastante más preferentemente más del 90% puros. En la realización más preferida, la pureza es mayor del 99%. El péptido sustancialmente puro puede usarse para preparar formulaciones farmacéuticas y alimenticias que pueden ser mezclas complejas, como se describen a continuación.
“Modulación” se refiere a un efecto sobre células mediado por la administración o la exposición a péptidos de la invención, en el que la administración o exposición de péptidos a células provoca cambios en las actividades de las células. Los cambios pueden ser potenciar o suprimir la actividad de una célula. La potenciación o la supresión de la actividad de una célula puede ser la potenciación o la supresión de la tasa de división y replicación celular, la potenciación o la supresión de la reacción de la célula respecto a otros elementos, y/o la potenciación o la supresión de la tasa de producción y/o secreción de proteínas o compuestos de la célula.
“Proliferación celular” se refiere a un aumento del número de células presentes y puede deberse a la transformación
- o la inmortalización de una célula. Los trastornos de proliferación celular incluyen, aunque no se limitan a, cánceres, neoplasias benignas, tumores y sarcomas y puede abarcar cualquier número de células. “Trastornos inmunológicos” se refiere a una disfunción o una función perjudicial de una célula inmunitaria u otra parte del sistema inmunitario. Dichos trastornos pueden estar causados por la supresión de actividad de una célula o molécula o la potenciación de la actividad de una célula o molécula.
El uso de un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24 en formulaciones farmacéuticas puede emplearse como posible tratamiento para trastornos o enfermedad inmunológicos. Las formulaciones tienen un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24, mezclado con otros constituyentes activos o inactivos, incluyendo otros péptidos, por ejemplo pueden añadirse de dos a varios (por ejemplo, 3-5) péptidos a la misma formulación con o sin otros ingredientes. Como alternativa, puede usarse un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24 para preparar la formulación junto con péptidos no enumerados en este documento. Estos pueden administrarse de forma intravenosa, intramuscular, intracutánea, subcutánea o intradérmica. El modo de administración también puede ser inyección intra-arterial que conduce directamente al órgano del problema. Otros modos de administración son transdérmica, inhalación como polvo o pulverizado, y otras formas de administrar conocidas por un experto en la materia. La formulación también puede tomarse por vía oral, y puede contener vehículos que pueden usarse para impedir la digestión gástrica del péptido después de la toma oral
- o cualesquiera otros vehículos conocidos en la técnica (un vehículo para administración transdérmica, tal como liposomas, por ejemplo).
Como se usa en este documento, la expresión “péptido híbrido” se usa para referirse a péptidos que contienen péptidos adicionales insertados en el péptido biológicamente activo original que tiene la secuencia especificada anteriormente o sus derivados funcionales, pero que sigue conservando actividad sustancialmente similar. Los péptidos adicionales incluyen péptidos líder que contienen, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que es reconocida por una o más células procariotas o eucariotas como una señal para la secreción de la proteína híbrida al exterior de la célula. La secreción puede ser una secreción directa, o indirectamente a través de vesículas secretoras.
La formulación farmacéutica cualquiera de los vehículos farmacéuticos conocidos. Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen cualquiera de los vehículos farmacéuticamente aceptados convencionales conocidos por los expertos en la materia. Estos incluyen aunque no se limitan a, solución salina fisiológica, agua, emulsiones incluyendo mezclas de aceite y agua o emulsiones de triglicéridos, y otros tipos de agentes, cargas, comprimidos recubiertos y cápsulas. El vehículo apropiado puede seleccionarse en base al modo de administración de la composición farmacéutica.
Un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24, puede administrarse mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea e implante subcutáneo. El péptido también puede administrarse en cualquier forma de administración oral como comprimido, cápsula, suspensión, solución etc., en la forma habitual sin modificación o en forma de liberación lenta, o con o sin protección gastro-entérica. El péptido pude aplicarse además en cualquier forma de administración tópica como pomada, crema, gel, etc., con o sin dispositivo de facilitación transdérmica. El péptido también puede interpretarse en su secuencia genética y clonarse en un sistema de expresión, por sí mismo o en combinación con otras secuencias peptídicas, para generar una molécula peptídica resultante para utilizar la actividad del péptido como se describe en este documento.
La dosis de cada péptido puede ser de 1 ng - 10 g por kg de peso corporal. Una dosis preferida es de 10 ng - 10 mg por kg, y más preferentemente de 1 g - 1mg por kg para un modo de administración por inyección. Sin embargo, la dosis eficaz puede ser de un mínimo de 1 ng por kg de peso corporal, dado que uno o más de los péptidos pueden funcionar a través de receptores que inducirán una cascada de respuesta fisiológica normal. Como alternativa, uno o más de los péptidos pueden ser simplemente un iniciador para una cascada completa de reacción. Para una toma oral, la cantidad puede ser de 1 ng - 10 g por día por kg de peso corporal, más preferentemente de 0,1 g - 1 g por día por kg de peso corporal y aún más preferentemente de 1 g - 10 mg por día.
II. TERAPIA GÉNICA Y MÉTODO DE TRATAMIENTO
La terapia génica basada en la anterior secuencia peptídica se realiza diseñando una secuencia de ácido nucleico que codifica este péptido. El ácido nucleico puede sintetizarse químicamente y ligarse de forma operativa a un promotor, y clonarse en un vector de expresión. El vector de expresión se administra a continuación al cuerpo humano como la forma de terapia génica para su expresión en la célula humana. La expresión “vectores genéticos” como se usa en este documento incluye estos vectores de expresión. Los vectores que pueden usarse para terapia génica incluyen virus adeno-asociados (Mizuno, M. et al. (1998). Jpn J Cancer Res 89, 76-80), vectores LNSX (Miller, A.D. et al. (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) y lentivirus (Goldman, M.J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268).
Otros vehículos para la administración de péptidos incluyen vectores de expresión que codifican el péptido deseado que pueden transferirse a un organismo que pueden replicarse en el organismo huésped al que se desea administrar el péptido sin efectos perjudiciales significativos sobre la salud del organismo huésped. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden transferirse a un organismo que no sea patógeno para el organismo huésped al que se desea administrar el péptido. El vector de expresión puede producir el péptido deseado en un organismo bacteriano o fúngico que no tiene efectos perjudiciales significativos sobre la salud del organismo huésped al que se administrará el péptido. Por ejemplo, el vector de expresión que codifica el péptido deseado puede ser un vector de expresión que produce el péptido deseado en un organismo tal como bacterias del ácido láctico, E. coli o levadura. El vector de expresión puede producir el péptido deseado en un microbio que se encuentra normalmente en el intestino de mamíferos o un microbio tolerado por el tracto digestivo de un mamífero. Algunas de las especies microbianas en las que el péptido deseado puede expresarse incluyen, aunque no se limitan a, especies de Lactobacillus, tales como L. acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsonii,
L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus u otras; especies de Bifidobacterium, tales como B. adolescentis,
B. animalus, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum u otras; Enterococcus faecalis o Ent. facium; Sporolactobacillus inulinus; Bacillus subtilis o Bacillus cereus; Escherichia coli; Propionibacterium freudenreichii; o Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces boulardii.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido de la presente invención, sintetizadas químicamente o producidas mediante otros medios, incluyendo, aunque sin limitarse a, la transcripción inversa de ARNm para producir moléculas de ADNc, se incorporan en vectores de expresión para la transferencia de genes a los organismos deseados mediante métodos de ingeniería genética familiares para los expertos en la materia. Los vectores de expresión pueden ser vectores de ADN o vectores de ARN. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden basarse en elementos genéticos plasmídicos o virales. Los vectores de expresión pueden ser vectores que se replican de forma extra-cromosómica o vectores que se integran en el cromosoma.
Los vectores de expresión comprenden un promotor unido de forma operativa a un ácido nucleico que codifica un péptido de la presente invención El promotor puede ser un promotor regulable, tal como un promotor inducible, o un promotor constitutivo. En algunas realizaciones, el promotor puede seleccionarse para proporcionar un nivel deseado de expresión peptídica. Además, si se desea, los vectores de expresión pueden comprender otras secuencias para promover la producción, presentación y/o secreción de péptidos. Un ácido nucleico que codifica un péptido de la presente invención puede estar unido de forma operativa a una secuencia de ácido nucleico que dirige la secreción del péptido. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención puede estar unido de forma operativa a un ácido nucleico que codifica un péptido señal.
Los vectores de expresión que están diseñados para codificar los péptidos de la presente invención pueden ser vectores de expresión que están adaptados para expresar el péptido de la presente invención en una especie bacteriana que compone la flora intestinal normal de mamíferos, tal como especies de Lactobacillus y Bacillus subtilis. Los ejemplos de dichos vectores de expresión pueden encontrarse en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.100.388, de Casas, y Nº 5.728.571, de Bellini, respectivamente. Se apreciará que puede usarse cualquier vector de expresión que facilite la expresión de un péptido de la presente invención en un organismo que no sea perjudicial para la salud del organismo huésped al que se administrará el péptido.
Los vectores de expresión que están diseñados para codificar los péptidos de la presente invención pueden ser vectores de expresión que están adaptados para expresar el péptido de la presente invención en una especie de levadura que es bien tolerada por el intestino de mamíferos, tal como Saccharomyces cerevisiae; o, preferentemente, Saccharomyces boulardii, que puede colonizar el intestino humano y se usa para tratar algunas formas de diarrea. Pueden usarse vectores de expresión de levadura que expresan de forma constitutiva proteínas y péptidos heterólogos, son altamente estables, por lo tanto se transmiten bien a células de la progenie durante la mitosis y la meiosis y pueden comprender una secuencia codificante para un péptido señal o péptidos que dirigen altos niveles de secreción de proteína recombinante. Un ejemplo de dicho vector de levadura se da en la Patente de Estados Unidos Nº 6.391.585, de Jang et al.
Los vectores de expresión que codifican el péptido de la presente invención pueden introducirse en el organismo en el que se pretende expresar los péptidos a través de técnicas conocidas en la técnica. Estas técnicas incluyen métodos tradicionales de transformar bacterias, levaduras u otros microbios, a través del uso de células bacterianas químicamente competentes, electroporación o transformación con acetato de litio (para levaduras), por ejemplo, así como recientes avances en la transformación de especies bacterianas recalcitrantes a estos procedimientos. En algunas realizaciones, los vectores de expresión se introducen en bacterias del ácido láctico que se sabe que son recalcitrantes a la transformación usando el método descrito por Leer et al. (WO 95/35389).
Las secuencias introducidas pueden incorporarse en ADN cromosómico microbiano o pueden permanecer como elementos de ADN extracromosómico.
Este microbio manipulado genéticamente que contiene el vector de expresión puede inocularse a continuación en el canal alimentario, la vagina, la tráquea, etc., para conseguir inmunoterapia sostenida. Los organismos que expresan el péptido de la presente invención pueden ser ingeridos de forma inactiva o, preferentemente, en forma viva. En el intestino, estos microorganismos producen dicho péptido, lo liberan a la luz mediante secreción o mediante lisis del microorganismo o presentan de otra forma el péptido al huésped, con lo que el péptido produce su efecto pretendido sobre el organismo huésped. Como alternativa, el péptido es presentado al huésped en la membrana mucosa de los conductos nasales, la vagina o el intestino delgado.
Otro método de tratamiento es el uso de liposomas como un medio para administrar el ácido nucleico específico a las células en el cuerpo humano. El ácido nucleico (tal como un vector de expresión que contiene una secuencia nucleica que codifica un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24 es administrado en un entorno que fomenta la captación celular y la incorporación al cromosoma como se describe en Gao, X. y Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722 y el documento US 6.207.456. Como alternativa, el propio péptido puede estar encapsulado en el liposoma y administrarse directamente, usando un método descrito en el documento US
6.245.427.
Las secuencias de ácido nucleico útiles para la terapia génica y método de tratamiento mencionados anteriormente incluyen secuencias que codifican el péptido. Puede usarse cualquiera de las numerosas secuencias de ácido nucleico para codificar el péptido en base al sistema de codón degenerado.
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III. CONJUGACIONES DE PÉPTIDO A Y FORMULACIONES CON EL PÉPTIDO QUE ESTÁ CONSTITUIDO POR LA SEC ID Nº 24
El péptido biológicamente activo de la presente invención puede estar conjugado a otras moléculas biológicamente eficaces o útiles para proporcionar un efecto o uso adicional o para potenciar su eficacia terapéutica. Muchas potenciales moléculas de conjugación, sus efectos biológicos y los métodos para la conjugación de las moléculas a los péptidos se conocen en la técnica. Para otros socios de conjugación candidatos, las reacciones químicas para conjugar los presentes péptidos a ellos pueden ser deducidas por un experto en la materia sin experimentación indebida. A continuación se describen moléculas eficaces. Se describen ejemplos específicos de cómo el péptido de acuerdo con la presente invención puede conjugarse a sus moléculas eficaces y se describen las propiedades biológicas del producto de conjugación resultante.
El fragmento peptídico que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24 puede tener distintos efectos terapéuticos sobre células o tipos de tejido particulares. Un importante objetivo de conjugar moléculas a fármacos peptídicos es dirigir el péptido a una ubicación o componente particular dentro del cuerpo de un individuo que está siendo tratado. De esta manera, el fármaco peptídico y sus efectos pueden concentrarse en la ubicación de la célula
o el tipo de tejido sobre el que tiene el efecto terapéutico pretendido. Esto puede aumentar el efecto que tendría una cantidad molar similar del péptido libre, no conjugado. A la inversa, la dosificación de un fármaco peptídico conjugado que está dirigido a su sitio activo terapéutico puede ser significativamente menor que la dosificación requerida para conseguir el mismo efecto terapéutico a partir de la forma libre, no conjugada del fármaco.
Oto efecto beneficioso de dirigir un fármaco peptídico al sitio en el que se desea más su actividad es la reducción de efectos secundarios no deseados. Un fármaco peptídico que se administra para efectuar un cambio en una célula o tipo de tejido particular también puede actuar en otras ubicaciones dentro de un individuo, algunas veces con resultados perjudiciales. Al dirigir al péptido a la ubicación de actividad deseada, mediante conjugación a una molécula de fijación de objetivo, la concentración de péptido en cualquier otra parte en el individuo y los posteriores efectos secundarios pueden reducirse.
El péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24, puede conjugarse con diversas moléculas para dirigirlo a diferentes ubicaciones por todo el cuerpo de un individuo. Cualquiera de las tecnologías de conjugación descritas a continuación para dirigir a un péptido a una ubicación deseada, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los expertos en la materia, puede emplearse con el péptido de la presente invención. Por ejemplo, se ha demostrado la administración selectiva de un fármaco anti-hepatitis B a células hepáticas (Fiume et al., Ital J Gastroenterol Hepatol, 29(3): 275, 1997). En este estudio, los investigadores conjugaron monofosfato arabinósido de adenina (ara-AMP), un análogo de nucleósido fosforilado activo contra el virus de la hepatitis B, a albúmina humana lactosaminada, una macromolécula que termina en galactosilo. Los hepatocitos expresan una proteína receptora que interactúa con restos galactosilo terminales con alta afinidad. A través de la unión a este receptor, el fármaco conjugado será captado de forma selectiva por los hepatocitos. Después de la absorción, el fármaco conjugado es administrado a lisosomas, donde el enlace entre los dos componentes del fármaco conjugado se escinde, liberando ara-AMP en su forma activa. En el estudio mencionado anteriormente, el fármaco conjugado era tan eficaz como ara-AMP libre en el tratamiento de pacientes con infecciones de hepatitis B crónica, pero no causaba los efectos secundarios clínicos, tales como neurotoxicidad, que causa la administración de ara-AMP libre. Dicho enfoque puede usarse con el péptido de la presente invención.
En un estudio relacionado con el anterior, por el mismo equipo de investigación (Di Stefano et al., Biochem. Pharmacol., 61(4): 459, 2001), un agente quimioterapéutico antineoplásico, 5-fluoro 2-desoxiuridina (FUdR), se conjugó a poli-L-lisina lactosaminada para dirigir el compuesto al hígado y tratar micrometástasis hepática. El fármaco es captado selectivamente por las células hepáticas, que escinden el enlace entre FUdR y la molécula de fijación de objetivo. Una parte de la FUdR libre saldrá a continuación de las células hepáticas y se crea una concentración terapéutica localizada del agente antineoplásico. Esta concentración es suficiente para actividad farmacológica en las células metastásicas que se han infiltrado en el hígado. Dado que el fármaco se concentra de forma selectiva en el hígado, la dosificación del fármaco conjugado puede ser significativamente menor que la dosificación farmacológicamente activa más pequeña del compuesto libre, no conjugado. Esta estrategia puede utilizarse con cualquiera de los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, la conjugación de poli-L-lisina lactosaminada a un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24 podría reducir significativamente la dosificación necesaria para tratar o prevenir un trastorno de proliferación celular que implique tejidos hepáticos.
La dirección de compuestos a tejidos o tipos celulares particulares dentro del cuerpo se ha conseguido para una serie de diferentes tejidos o tipos celulares. Por ejemplo, las células tumorales a menudo expresan niveles anormalmente altos de receptores de hormonas peptídicas en sus superficies, tales como bombesina, hormona de liberación de la hormona luteinizante, y somatostatina. En un estudio, el compuesto antineoplásico paclitaxel (taxol) se ha dirigido de forma selectiva a células tumorales que secretan hormona que expresan receptores de somatostatina a una alta densidad conjugando el fármaco con octreotida, un análogo de somatostatina. El taxol conjugado a octreotida era tan eficaz como el taxol libre pero con toxicidad reducida para las células normales (Huang et al., Chem. Biol., 7(7): 453, 2000). El uso de las técnicas de Huang et al., para conjugar péptidos de la presente invención a análogos de agonistas del receptor de hormonas peptídicas crearía un tratamiento que tiene como diana específicamente células que expresan altos niveles de ese receptor de hormonas peptídicas particular. Este enfoque puede adaptarse a células diana que sobreexpresan cualquier número de receptores de hormonas peptídicas. En otro ejemplo de dirección de un fármaco a un tipo de tejido específico, se usó ácido (poli)L-aspártico como una molécula vehículo para dirigir la administración de fármacos a células de colon específicamente (Leopold et al., J. Pharmacokinet. Biopharm., 23(4): 397, 1995).
Más allá de la dirección específica de un fármaco peptídico a una célula o tipo de tejido particular, la conjugación de un péptido constituido por la secuencia de la SEC ID Nº 24 a moléculas vehículo pude proporcionar otras maneras de potenciar la administración de fármacos peptídicos, aumentando de este modo o mejorando de otro modo sus efectos terapéuticos. Cualquiera de las tecnologías de conjugación descritas a continuación puede usarse con cualquiera de los péptidos de la presente invención, como con otras tecnologías familiares para los expertos en la materia. La eficacia de cualquier fármaco se verá obstaculizada si el compuesto no puede ser administrado a su diana de forma eficaz. Un fármaco debe ser transportado, de forma activa o de otro modo, al sitio de su actividad sin pérdida sustancial de actividad debida al procesamiento o la degradación metabólica. Los fármacos peptídicos están sujetos a la actividad de peptidasas y, como moléculas altamente cargadas, pueden ser refractarios al transporte a través de las membranas celulares lipídicas y membranas celulares endoteliales, tales como la barrera hematoencefálica. La conjugación a otras moléculas proporciona una manera de proteger a los péptidos de la degradación y de potenciar la absorción de fármacos peptídicos al interior de células o compartimentos anatómicos que excluirían normalmente los compuestos.
Al permitir a los péptidos el acceso a ubicaciones dentro del cuerpo de las que normalmente estarían excluidos, las técnicas de conjugación podrían abrir nuevas rutas para la administración del fármaco. En el documento Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3): 434, 1997, cuya química se detalla en el Ejemplo 5 a continuación, los investigadores conjugaron un fármaco peptídico del que se sabe que es un potente analgésico, el heptapéptido deltorfina, a una molécula orgánica que estaba diseñada específicamente para permitir que el péptido cruce la barrera hematoencefálica. Esto permite que el fármaco sea administrado por vía intravenosa en lugar de mediante inyección intracerebroventricular.
La molécula vehículo en Patel et al., se diseñó para dirigirse específicamente a aquellas células endoteliales que comprenden la barrera hematoencefálica además de permitir que el péptido pase a través de la barrera. Las membranas de células endoteliales por todo el cuerpo, incluyendo la barrera hematoencefálica, son heterogéneas con respecto a la especificidad de secuencia y la concentración de endopeptidasas unidas a membrana que se presentan en sus superficies. El diseño de la molécula aprovecha esta característica para permitir la dirección de la molécula vehículo y su carga.
La molécula contiene tres cadenas de ácido graso cuyos extremos libres están modificados con el dipéptido Arg-Pro, que interactuará preferentemente con las endopeptidasas de la barrera hematoencefálica. El transporte de la molécula de fármaco cargada con péptido es permitido a continuación por las cadenas de ácidos grasos lipófilos. Por lo tanto, la molécula de triglicérido modificada en el extremo con el dipéptido permite tanto la dirección como el transporte a través de la barrera hematoencefálica.
Los métodos de conjugación también pueden potenciar la cinética de la actividad de un fármaco peptídico. Cualquiera de las tecnologías de conjugación descritas a continuación para potenciar la cinética de la actividad de un péptido, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los expertos en la materia pueden emplearse con un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24. Patel et al., descubrieron que la forma conjugada del péptido analgésico no solamente era capaz de entrar en el cerebro desde el torrente sanguíneo, sino que también tenía una acción sostenida en comparación con el péptido libre. El fármaco administrado por vía intravenosa necesitó más tiempo para tener un efecto terapéutico, pero el efecto duró más y disminuyó más lentamente que el efecto del péptido libre inyectado por vía intracraneal. Los investigadores descubrieron que la molécula peptídica conjugada es notablemente estable en suero, pero no tenía efecto cuando se inyectaba por vía intracerebroventricular, lo que indica que es probable que la molécula vehículo sea degradada y retirada durante su transporte desde el torrente sanguíneo al cerebro. Los investigadores sospechan que el tiempo requerido para transportar el conjugado y degradar la molécula vehículo es la causa de la cinética alterada. Independientemente de la mecánica del retardo, en un entorno clínico, la estabilidad intravenosa de la molécula peptídica conjugada y el inicio y la actividad prolongadas de los efectos del fármaco significaría que éste podría administrarse con menor frecuencia. Un programa de dosificación menos frecuente y, por lo tanto, más conveniente mejora el valor práctico del fármaco como una opción de tratamiento.
Como sería evidente para un experto en la materia, las técnicas y procedimientos de Patel et al., son fácilmente adaptables a la administración de péptidos cualesquiera que estén dentro de un intervalo de tamaño limitado, incluyendo el péptido de la presente invención. Por ejemplo, un péptido de la presente invención que trata y/o previene trastornos de proliferación celular o inmunológicos, podría estar conjugado a la misma molécula usada por Patel et al., en el tratamiento de un individuo con una infección que afecta al cerebro, la molécula conjugada permitiría que los péptidos de la invención accedieran al cerebro desde el torrente sanguíneo y permitiría que los péptidos ejercieran sus efectos sobre células o tejidos en el cerebro. Las modificaciones para alterar la dirección de la molécula vehículo también serían evidentes para dicho experto. La característica de dirección de la molécula vehículo está en función de la identidad de los dos aminoácidos que comprenden la máscara dipeptídica en el extremo de las cadenas de ácidos grasos. El dipéptido Arg-Pro interactúa preferentemente con el conjunto de endopeptidasas unidas a la membrana, descubiertas en la superficie de la membrana endotelial de la barrera hematoencefálica. Otras células y membranas endoteliales podrían ser potencialmente fijadas como objetivo por otras combinaciones de dipéptidos.
La conjugación también ha sido usada por los investigadores para crear fármacos peptídicos que puedan ser absorbidos eficazmente a través del tracto digestivo o por vía transdérmica. Cualquiera de las tecnologías de conjugación para potenciar la absorción, descritas a continuación, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los expertos en la materia, podrían usarse para potenciar la absorción de un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24. Kramer et al., describen un procedimiento para el acoplamiento de fármacos peptídicos a ácidos biliares. La tasa de absorción para la molécula conjugada después de la administración oral del compuesto es significativamente potenciada en comparación con el péptido en solitario (J. Biol. Chem., 269(14): 10621, 1994). Toth et al. (J. Med. Chem., 42(19): 4010, 1999) describen la conjugación de un fármaco peptídico con propiedades anti-tumorales con lipoaminoácidos (LAA) o liposacáricos (LS), para aumentar la tasa de absorción y potenciar la administración del péptido antineoplásico a su sitio activo. En su estudio, un derivado de somatostatina que muestra fuertes propiedades anti-proliferativas, pero que tiene farmacocinética alterada, se conjuga con LAA o LS. El fármaco conjugado resultante tiene perfiles de absorción mejorados a través de la piel y del epitelio intestinal y una mayor resistencia a la degradación mientras sigue siendo activo contra células tumorales. Estas técnicas serían muy útiles junto con cualquiera de los péptidos de la presente invención. Al aumentar la tasa de absorción de la molécula a través del epitelio intestinal, más cantidad de péptido puede administrarse al torrente sanguíneo y ejerce su efecto sobre el individuo que es tratado.
También puede usarse conjugación para proporcionar liberación sostenida de un fármaco peptídico. Cualquiera de las tecnologías de conjugación para proporcionar liberación sostenida, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los expertos en la materia, puede usarse para proporcionar liberación sostenida de un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24. Como se ha visto anteriormente en el trabajo de Patel et al., la administración sostenida de un fármaco peptídico puede conseguirse con métodos de conjugación. Otro ejemplo es el trabajo de Kim et al. (Biomaterials, 23: 2311, 2002), donde el factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (rhEGF) se conjugó con polietilenglicol (PEG) antes de la microencapsulación en microesferas de ácido (poli)láctico-co-glicólico (PLGA) biodegradables. La microencapsulación en PLGA ha sido usada por varios grupos para administrar diversos factores de crecimiento y proteínas morfogénicas (Meinel et al., J. Controlled Rel.,
70: 193, 2001). A través de la conjugación a PEG, el rhEGF se convirtió en resistente a la formación de agregados hidrosolubles y a la adsorción a la interfaz de agua-fase orgánica durante la formación de micelas con PLGA en comparación con rhEGF libre, no conjugado. La farmacocinética de la formulación con la hormona conjugada mejoró, mostrando una actividad del fármaco de duración más larga, más constante y en general mayor que con la hormona libre, lo que los investigadores especulan que se debe a la estabilidad física potenciada de la hormona conjugada a PEG. Una estrategia similar podía emplearse para crear formulaciones de liberación sostenida de cualquiera de los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, como se ve en el Ejemplo 1 a continuación, fragmentos y derivados particulares de VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010) muestran potentes efectos antiproliferativos e inmuno-moduladores. Al conjugar PEG a este péptido e incorporar el fármaco conjugado al interior de microesferas de PLGA, los efectos anti-proliferativo e inmuno-modulador del péptido de la invención pueden ser más duraderos y más estables, ya que la dosificación del fármaco, dado que está siendo liberado de su conjugado con PEG, es más uniforme y asegura una administración más constante del fármaco peptídico al sitio de infección.
La liberación prolongada de un fármaco peptídico puede potenciar significativamente su actividad. Cualquiera de las tecnologías de conjugación para proporcionar liberación prolongada de un péptido descrito a continuación, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los expertos en la materia, podrían usarse para proporcionar liberación prolongada de un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24. Oldham et al. (Int. J. Oncology, 16: 125, 2000) comparan el agente antineoplásico paclitaxel frente a una nueva forma del fármaco, paclitaxel conjugado a ácido (poli)L-glutámico (PG-TXL). El PG-TXL parecía tener una superior actividad anti-tumoral en comparación con paclitaxel libre, lo que sugería que el fármaco tiene propiedades farmacocinéticas superiores o puede ser incluso un método de acción superior. Sin embargo, los investigadores descubrieron que PG-TXL ejercía sus efectos mediante el mismo mecanismo de acción que el fármaco libre, induciendo la detención del ciclo celular alterando la polimerización de subunidades de los microtúbulos. Las pruebas sugieren que la superior actividad antitumoral del fármaco conjugado surge de una liberación continua y constante del fármaco libre desde el conjugado, manteniendo su concentración terapéutica durante un periodo más largo en comparación con la administración del péptido libre. La adición de una cola de ácido (poli)L-glutámico a un péptido de la invención con propiedades de lucha contra la infección podría potenciar también estas propiedades.
La degradación enzimática de péptidos puede, en algunos casos, reducir la eficacia de los péptidos como fármaco. Cualquiera de las tecnologías de conjugación para reducir la degradación enzimática de un péptido descritas a continuación, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los expertos en la materia, pueden usarse para reducir la degradación enzimática de un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24. Los investigadores han desarrollado muchos enfoques para proteger a péptidos de proteasas secretadas de forma luminal en el intestino, así como peptidasas unidas a la membrana. Estas últimas se encuentran en la superficie de todos los tejidos mucosales, cuyo cruce es a menudo la ruta de entrada para fármacos peptídicos. Bernkop-Schurch et al. (J. Drug Target., 7:55, 1999) describen la reacción de formulaciones de fármacos peptídicos que contienen inhibidores de pepsina. Un análogo de pepstatina se unió covalentemente a polímeros mucoadhesivos; este nuevo inhibidor de pepsina se incluyó en comprimidos que contenían insulina. Después de la incubación en condiciones de laboratorio que simulaban la digestión, toda la insulina de comprimidos de control se metabolizó, mientras que casi el 50% de la insulina de comprimidos que contenían el inhibidor estuvo protegida de la degradación. En otro estudio, el mismo grupo utilizó inhibidores de proteasa a dosificaciones que normalmente causarían efectos secundarios tóxicos para inhibir la agregación de péptidos biológicamente activos (Bernkop-Schnurch et al., Adv. Drug Del. Rev.,
52: 127, 2001). Este enfoque utiliza quitosano, un aminopolisacárido relacionado con la celulosa que se extrae de la quitina, un polisacárido estructural fundamental que se encuentra en crustáceos y otros organismos. Al conjugar los inhibidores de proteasa a quitosano e incluir esta molécula conjugada en la formulación del fármaco peptídico, se observó una inhibición significativa de la proteasas del tracto digestivo, que aumentaba la biodisponibilidad del péptido, sin los efectos secundarios que podrían esperarse con la administración de inhibidores de proteasa libre. En el estudio, se utilizaron diversos inhibidores de proteasa en solitario y en combinación para la conjugación al vehículo de quitosano. Un conjugado de quitosano-EDTA inhibía proteasas endógenas también, uniéndose a cofactores minerales requeridos por algunas proteasas para su actividad. Como sería fácilmente evidente para un experto en la materia, podrían crearse gran número de posibles combinaciones entre moléculas vehículo y restos efectores, para proporcionar propiedades beneficiosas para formulaciones peptídicas, cualquiera de las cuales podría adaptarse fácilmente para su uso con un péptido de la presente invención. Al crear una formulación para administración oral del péptido usando inhibidores de proteasa unidos a quitosano, podría usarse la administración oral de un péptido de la invención en lugar de inyecciones intramusculares. Este enfoque no excluye el uso de la versión conjugada, más absorbible de un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24 en esta formulación, para crear un nivel aún mayor de biodisponibilidad para este péptido y sus derivados.
Además de ser dirigidos a una ubicación por otra molécula, los propios péptidos pueden servir como la molécula que fija el objetivo. Cualquiera de las tecnologías de conjugación para el uso de un péptido para dirigir a una molécula a una ubicación deseada descrita a continuación, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los expertos en la materia, podrían usarse con un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24. Por ejemplo, los investigadores tomaron el fármaco antineoplásico difluorometilornitina (DFMO) y lo conjugaron con un péptido para fines de fijación de un objetivo. La DFMO es un agente altamente citotóxico que es eficaz para destruir una variedad de tipos de células tumorales. Sin embargo, dado que se eliminan rápidamente del cuerpo, su valor terapéutico es limitado. En este estudio, se había conjugado DFMO a un fragmento particular de melanotropina y un análogo del fragmento que contiene dos sustituciones de aminoácidos que se demostró que se une preferentemente a los receptores de melanotropina en una línea celular de melanoma humano (Suli-Vargha et al., J. Pharm. Sci., 86: 997, 1997). Para facilitar la liberación de DFMO de los fragmentos peptídicos por aminopeptidasas, el fármaco se conjugó a los extremos N-terminales de los péptidos. Los investigadores descubrieron que los fármacos conjugados son más eficaces para destruir células de melanoma que el fármaco no conjugado en solitario.
Los efectos del péptido de la presente invención pueden deberse en parte a una capacidad de fijación de objetivos inherente en los propios péptidos. Por ejemplo, como fragmento de melanotropina, un péptido particular de la invención puede unirse a cierto receptor que se encuentra en la superficie de un tipo distinto de célula. Al usar este péptido como conjugante, podría dirigirse a un fármaco a la ubicación de aquellas células dentro del cuerpo de un individuo que está siendo tratado con el fármaco.
Los péptidos como conjugados pueden servir para funciones diferentes de la fijación de objetivos. Cualquiera de las tecnologías de conjugación para potenciar la eficacia terapéutica de un péptido descrito a continuación, así como otras tecnologías de conjugación familiares para los expertos en la materia, pueden utilizarse para potenciar la eficacia terapéutica de un péptido que está constituido por una secuencia de la SEC ID Nº 24. Fitzpatrick et al., han mejorado un agente antineoplásico usando un separador peptídico entre las dos moléculas (Anticancer Drug Design, 10: 1, 1995). El metotrexato ya se había conjugado a albúmina de suero humano (HSA) para aumentar su captación por y su actividad contra las células tumorales. Una vez captado por una célula, parte del metotrexato es liberado del conjugado por enzimas en el lisosoma y puede ejercer a continuación sus efectos citotóxicos. Al insertar un péptido enlazador de cuatro aminoácidos entre el metotrexato y la HSA que es fácilmente digerido por enzimas lisosomales, la cantidad de metotrexato activo generado dentro de las células a partir de la molécula conjugada aumentó. El péptido de la presente invención puede estar ejerciendo su efecto a través de interacción específica con enzimas particulares. Al incorporar un péptido de la invención en una molécula conjugada como segmento enlazador entre un fármaco y su molécula vehículo, o además de otro segmento enlazador, puede alterarse la farmacocinética. Esto puede crear un pro-fármaco que es más resistente o más susceptible a la actividad de proteasas, lo que posteriormente reduce o aumenta la tasa de liberación de la molécula de fármaco del conjugado. Como se ve en los ejemplos de agentes de quimioterapia conjugados anteriores, la alteración de esta tasa de administración de la molécula de fármaco puede potenciar enormemente la eficacia de un fármaco.
Los efectos de un fármaco sobre una célula particular pueden alterarse dependiendo de otros factores tales como el estado de activación de una célula o la presencia de otras señales moleculares cerca o dentro de la célula. En algunos casos, para que un fármaco tenga un efecto, es necesario que otra molécula o señal esté presente. Damjancic et al. (Exp. Clin. Endocrin., 95: 315, 1990) estudiaron los efectos del péptido natriurético auricular humano (hANP) sobre pacientes con síntesis de glucocorticoides endógena deficiente. El péptido se administró a pacientes durante una retirada de terapia con glucocorticoides o durante la posterior reanudación de la terapia usando dexametasona. Los pacientes respondieron a hANP con un aumento de la diuresis y la excreción de sodio solamente cuando la hormona peptídica se administraba durante el tratamiento concomitante con dexametasona. El tratamiento con hANP durante la retirada de la terapia con glucocorticoides no tuvo ningún efecto. El efecto de la administración concurrente de hormona esteroidea también puede ser potenciar la actividad de un péptido. En un informe de Zhu et al. (Acta Pharm. Sinica, 28: 166, 1993), la actividad del péptido analgésico kiotorfina (KTP) se potenció significativamente mediante conjugación a hidrocortisona mediante un segmento enlazador corto, en comparación con la acción del péptido en solitario. No se observó ningún efecto con la administración de hidrocortisona en solitario.
Los resultados de estos estudios ilustran la capacidad de hormonas esteroideas como moléculas conjugadas o como ingredientes en formulaciones que pueden permitir o potenciar la actividad de péptidos biológicamente activos. El péptido de la presente invención también puede modularse o activarse mediante conjugación a o co-aplicación de hormonas esteroideas. Las técnicas de Zhu et al., pueden adaptarse fácilmente para conjugación de moléculas esteroideas al péptido de la presente invención. Las figuras 1 a 5 también proporcionan reacciones de síntesis por etapas ejemplares para unir hormonas esteroideas al péptido de la presente invención.
Los ejemplos presentados anteriormente proporcionan maneras ejemplares para aumentar la utilidad y las actividades de cualquiera de los péptidos de la invención. Los desarrollos adicionales en este campo ayudarán a superar las barreras para crear tratamientos clínicos a base de péptidos eficaces. Como sería evidente para un experto en la materia, las técnicas, reactivos y protocolos desarrollados para su uso en la bioquímica peptídicos, la investigación farmacéutica y los ensayos clínicos son todos fácilmente aplicables a cualquiera de los péptidos de la presente invención.
EJEMPLOS
ANTECEDENTES
Se anticipó que, dentro de la secuencia de VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010), algunos aminoácidos pueden ser más importantes para la bioactividad que los otros. En algunas realizaciones de la invención, al descubrir el resto/restos activos dentro de VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010), aquellos aminoácidos en la secuencia que no contribuyen a la actividad del péptido pueden retirarse de modo que la molécula bioactiva pueda acortarse. Las recombinaciones de diferentes restos activos del péptido también pueden realizarse para obtener nuevas moléculas peptídicas que tienen bioactividades modificadas. El acortamiento de la molécula peptídica bioactiva puede tener importancia tanto biológica como económica. Al tener una secuencia más corta, las propiedades biológicas del péptido se modifican y dichas modificaciones pueden tener potenciales ventajas terapéuticas, tales como semi-vida biológica, afinidad por el receptor, o perfil de efectos secundarios modificados. Los péptidos más cortos también son más baratos de producir y pueden rebajar el coste de producción.
Para determinar los restos activos dentro de VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010), se realizaron una serie de experimentos de truncamiento. Se truncó CMS-010 en cada uno de los enlaces peptídicos desde el extremo amino al extremo carboxilo. Se anticipó que, si un resto activo se truncaba, la bioactividad del par de péptidos resultante podría disminuir, desaparecer o modificarse de alguna manera (activación/inactivación de la bioactividad). Después de localizar el resto o restos activos dentro de CMS-010, puede construirse un nuevo conjunto de péptidos mediante combinaciones de los diferentes restos activos.
Se identificó un conjunto de péptidos truncados o recombinantes en los experimentos de los inventores que tenían bioactividades que tienen un potencial uso terapéutico humano o biológico. Este conjunto de péptidos se da en la Tabla 1 a continuación. Los descubrimientos de los inventores se describen en los ejemplos que siguen a la Tabla 1.
El péptido CMS-010.26 es el péptido de la invención. Los resultados con respecto a otros péptidos se presentan a modo de comparación.
Tabla 1: Péptidos truncados y recombinantes basados en la secuencia de CMS-010
- Péptido
- Secuencia SEC ID Nº
- CMS-010.02
- APEEHPTLLTEAPLNPK 2
- CMS-010.03
- VAPEEHPTLLTEAPLNP 3
- CMS-010.04
- PEEHPTLLTEAPLNPK 4
- CMS-010.05
- VAPEEHPTLLTEAPLN 5
- CMS-010.07
- VAPEEHPTLLTEAPL 6
- CMS-010.08
- VAPEEHPTLLTEAP 7
- CMS-010.09
- EHPTLLTEAPLNPK 8
- CMS-010.11
- HPTLLTEAPLNPK 9
- CMS-010.12
- VAPEEHPTLLTE 10
- CMS-010.13
- PTLLTEAPLNPK 11
- CMS-010.14
- VAPEEHPTLLT 12
- CMS-010.15
- TLLTEAPLNPK 13
- CMS-010.16
- VAPEEHPTLL 14
- CMS-010.17
- LLTEAPLNPK 15
- CMS-010.18
- VAPEEHPTL 16
- CMS-010.19
- LTEAPLNPK 17
- CMS-010.20
- VAPEEHPT 18
- CMS-010.21
- TEAPLNPK 19
- CMS-010.22
- VAPEEHP 20
- CMS-010.23
- EAPLNPK 21
- CMS-010.24
- APLNPK 22
- CMS-010.25
- VAPEEH 23
- CMS-010.26
- PLNPK 24
- CMS-010.27
- VAPEE 25
- CMS-010.28
- LNPK 26
- CMS-010.29
- VAPE 27
- CMS-010.31
- NPK 28
- CMS-010.32
- VA 29
- CMS-010.103
- VALLT 30
- CMS-010.105
- VANPK 31
EJEMPLO 1
El efecto de péptidos sobre la transformación de linfocitos T de ratones inducida por ConA in vitro
1.1 Materiales
1.1.1 Péptidos
5 Todos los aminoácidos implicados eran de forma L: CS Bio Co., Estados Unidos
1.1.2 Control y otros reactivos
Solución salina: OTSUKA Pharmaceutical Co., Ltd, PR China. Medio de cultivo RPMI-1640 y suero fetal bovino (FBS): Gibcol Co., Estados Unidos. MTT y ConA: Sigma Co., Estados Unidos
1.2 Animales 10 Ratones BALB/c (H-2d, SPF, 6-8 semanas de edad, peso 18-22 g): Military Medical Academy of Science, PR China.
1.3 Método [1]
Los bazos de ratones sanos se aislaron de forma aséptica y se dispersaron de forma manual en solución de FBS al 10% en RPMI-1640 usando una aguja de inyección. La suspensión celular dispersada se tamizó adicionalmente a través de un tamiz de acero inoxidable de 15 metros de diámetro de calibre 100. La suspensión de células
15 esplénicas se ajustó a una densidad de 4 x 106/ml y se dividió en alícuotas en placas de cultivo celular de 96 pocillos a 100 l/pocillo. Los péptidos se disolvieron en RPMI-1640 corriente. El diseño de los agrupamientos era como se da a continuación.
Grupo de péptidos: 100 l de solución peptídica de trabajo + 75 l de suspensión de células esplénicas + 25 l de solución de trabajo de ConA.
20 Grupo de control de ConA: 100 l de RPMI-1640 + 75 l de suspensión de células esplénicas + 25 l de solución de trabajo de ConA.
Grupo de control negativo: 125 l de RPMI-1640 + 75 l de suspensión de células esplénicas.
La concentración final de ConA en el pocillo era de 5 g/ml. Las concentraciones finales de péptidos en el pocillo eran de 80 g/ml, 16 g/ml, 3,2 g/ml, 0,64 g/ml y 0,128 g/ml. Cada grupo de péptidos contenía tres pocillos
25 paralelos, y ocho o doce pocillos para los grupos de control. Las células se incubaron durante 68 horas a 37ºC, con CO2 al 5%. Se usó el método de MTT para obtener una lectura de DO570nm de cada pocillo referenciada en 630 nm en un lector de ELISA.
1.4 Resultados Tabla 2. El efecto de péptidos sobre la transformación de linfocitos T de ratones inducida por ConA in vitro
- Grupo
- Concentración N DO
- CMS-010.26
- 80 g/ml 3 0,353 ± 0,016*
- CMS-010.26
- 16 g/ml 3 0,356 ± 0,006*
- CMS-010.26
- 3,2 g/ml 3 0,332 ± 0,015*
- CMS-010.26
- 0,64 g/ml 3 0,348 ± 0,025*
- CMS-010.26
- 0,128 g/ml 3 0,354 ± 0,017*
- CMS-010.105
- 80 g/ml 3 0,407 ± 0,019*
- CMS-010.105
- 0,64 g/ml 3 0,386 ± 0,008*
- Control negativo
- - 12 0,134 ± 0,011*
- Control de ConA
- 5 g/ml 12 0,467 ± 0,043
- *: en comparación con el grupo de control positivo de ConA, P < 0,05
5
10
15
20
25
30
Tabla 3. El efecto de péptidos sobre la transformación de linfocitos T de ratones inducida por ConA in vitro
- Grupo
- Concentración N DO
- CMS-010.32
- 80 g/ml 3 0,276 ± 0,034*
- CMS-010.32
- 16 g/ml 3 0,273 ± 0,023*
- CMS-010.32
- 3,2 g/ml 3 0,309 ± 0,030*
- CMS-010.32
- 0,64 g/ml 3 0,321 ± 0,048
- CMS-010.32
- 0,128 g/ml 3 0,306 ± 0,033*
- Control negativo
- 5 g/ml 8 0,108 ± 0,012*
- Control de ConA
- - 8 0,358 ± 0,028
- *: en comparación con el grupo de control positivo de ConA, P < 0,05
Se descubrió que CMS-010.26, CMS-010.32 y CMS-010.105, a concentraciones adecuadas, son capaces de suprimir la transformación de linfocitos T de ratones inducida por ConA in vitro, con significación estadística en comparación con el control positivo de ConA (P < 0,05).
EJEMPLO 2
El efecto de péptidos sobre la transformación de linfocitos T de ratones y la actividad de células NK in vivo
2.1.1 Péptidos
Todos los aminoácidos implicados eran de forma L: CS Bio Co., Estados Unidos.
Ciclosporina A: Novartis Pharma AG., Suiza. Solución salina: OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd, PR China. Medio de cultivo RPMI-1640 y suero fetal bovino (FBS): GIBCOL, Estados Unidos. MTT y ConA: Sigma Co., Estados Unidos
Ratones BALB/c (H-2d; SPF, 6-8 semanas de edad, peso 18-22 g, 50% hembras y 50% machos): Military Medical Academy of Science, PR China.
Los animales se asignaron aleatoriamente a dos grupos de péptidos (200 g/kg/día y 50 g/kg/día), el grupo de Ciclosporina A (10 mg/kg/día), y el grupo de solución salina (0,5 ml/día). Cada grupo contenía 10 ratones, en los que la mitad eran hembras y la mitad eran machos. Todas las sustancias se disolvieron en 0,5 ml de solución salina y se administraron por vía intraperitoneal una vez al día durante 20 días. Se examinaron la transformación de linfocitos T y la actividad de células NK el día inmediatamente después de la última inyección.
El día después de la última administración de la sustancia de ensayo, los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical. Los bazos se aislaron de forma aséptica y se dispersaron de forma manual en solución de FBS al 10% en RPMI-1640 usando una aguja de inyección. La suspensión de células dispersadas se tamizó adicionalmente a través de un tamiz de acero inoxidable de 150 m de diámetro, de calibre 100 y se ajustó a 4 x 106/ml. Las suspensiones celulares se inocularon en una placa de cultivo de 96 pocillos, 100 l/pocillo con el siguiente diseño.
Pocillos de ensayo: 100 l de suspensión de células + 100 l de ConA Pocillos de control: 100 l de suspensión celular + 100 l de RPMI-1640
Se establecieron cuatro pocillos de ensayo y cuatro de control para cada animal. Las placas se incubaron a 37ºC, CO2 al 5% durante 68 horas. A continuación se añadió MTT y las placas se leyeron a DO 570 nm referenciadas a630 nm con lector de ELISA. Índice de estimulación IE (%) = (DO del pocillo de ensayo / DO del pocillo de control) x
5 100%.
Las células diana YAC-1 se llevaron a fase logarítmica y se ajustaron a una densidad de 1 x 105/ml. Las células esplénicas de ratones preparadas en la sección 2.2.2 anterior se ajustaron a una densidad de 4 x 106/ml y se usaron como células efectoras. Las suspensiones celulares se inocularon en placas de cultivo celular de 96 pocillos de la
10 siguiente manera:
Pocillos de células efectoras: 100 l de suspensión de células esplénicas + 100 l de RPMI-1640
Pocillos de ensayo: 100 l de suspensión de células esplénicas + 100 l de suspensión de células YAC-1
Pocillos de células diana: 100 l de suspensión de células YAC-1 + 100 l de RPMI-1640
Se establecieron tres pocillos de ensayo y tres pocillos de células efectoras para cada animal, y se establecieron 12
15 pocillos de células diana por placa de cultivo celular. Las placas se incubaron a 37ºC, CO2 al 5% durante 4 horas, a continuación se añadió MTT y las placas se leyeron a DO 570 nm referenciadas a 630 nm con lector de ELISA. Actividad de células NK (%) = 1 - [(DO de los pocillos de ensayo - DO de los pocillos de células efectoras) / DO de los pocillos de células diana] x 100%
20 2.3.1 Experimento de transformación de linfocitos T Tabla 4. El efecto de péptidos sobre la transformación de linfocitos T de ratones (1)
Grupo Dosificación N IE
CMS-010.24 50 g/kg/día 10 2,40 ± 0,31** CMS-010.26 200 g/kg/día 7 2,19 ± 0,59** CMS-010.28 200 g/kg/día 9 2,70 ± 0,37** Solución salina 0,5 ml/día 8 3,63 ± 0,69
**: En comparación con el grupo de solución salina, P < 0,01
Tabla 5. El efecto de péptidos sobre la transformación de linfocitos T de ratones (2)
- Grupo
- Dosificación N IE
- CMS-010.25
- 200 g/kg/día 10 2,43 ± 0,69*
- Solución salina
- 0,5 ml/día 10 3,15 ± 0,83
*: En comparación con el grupo de solución salina, P < 0,05
Tabla 6. El efecto de péptidos sobre la transformación de linfocitos T de ratones (3)
Grupo Dosificación N IE
CMS-010.04 50 g/kg/día 8 1,56 ± 0,25**
Solución salina 0,5 ml/día 9 2,24 ± 0,52
**: En comparación con el grupo de solución salina, P < 0,01 Tabla 7. El efecto de péptidos sobre la transformación de linfocitos T de ratones (4)
- Grupo
- Dosificación N IE
- CMS-010.12
- 50 g/kg/d 10 2,12 ± 0,42**
- CMS-010.14
- 50 g/kg/d 9 2,12 ± 0,51**
- Solución salina
- 0,5 ml/día 10 2,96 ± 0,61
**: En comparación con el grupo de solución salina, P < 0,01
Tabla 8. El efecto de péptidos sobre la actividad de células NK de ratones (1)
Grupo Dosificación N Actividad de células NK (%)
CMS-010.24 200 g/kg/día 10 69,0 ± 7,4* CMS-010.24 50 g/kg/día 10 56,0 ± 6,0** CMS-010.26 200 kg/día 9 67,7 ± 5,3** CMS-010.26 50 g/kg/día 10 68,5 ± 7,2* CMS-010.28 200 g/kg/día 9 70,3 ± 6,7* Solución salina 0,5 ml/día 10 76,0 ± 4,3
*: En comparación con el grupo de solución salina, P < 0,05 **: En comparación con el grupo de solución salina, P < 0,01
Tabla 9. El efecto de péptidos sobre la actividad de células NK de ratones (2)
Grupo Dosificación N Actividad de células NK (%)
CMS-010.11 50 g/kg/día 9 63,5 ± 4,7** CMS-010.13 50 g/kg/día 10 70,9 ± 17,5* CMS-010.14 200 g/kg/día 8 43,1 ± 13,7* CMS-010.14 50 g/kg/día 9 75,3 ± 9,0** Solución salina 0,5 ml/día 10 55,3 ± 6,1
*: En comparación con el grupo de solución salina, P < 0,05 **: En comparación con el grupo de solución salina, P < 0,01
2.4 Conclusión
10 A dosificaciones adecuadas, se descubrió que CMS-010.04, CMS-010.12, CMS-010.14, CMS-010.24, CMS-010.25, CMS-010.26 y CMS-010.28 suprimen la transformación de linfocitos T de ratones in vivo, con significación estadística en comparación con el control de solución salina (P < 0,05).
A la dosificación adecuada, se descubrió que CMS-010.24, CMS-010.26 y CMS-010.28 suprimen la actividad de células NK de ratones in vivo, con significación estadística en comparación con el control de solución salina (P <
15
5
10
15
20
25
30
35
40
A la dosificación adecuada, se descubrió que CMS-010.11, CMS-010.13 y CMS-010.14 potencian la actividad de células NK de ratones in vivo, con significación estadística en comparación con el control de solución salina (P < 0,05).
EJEMPLO 3
El efecto de péptido sobre la formación de anticuerpos de ratones in vivo
Todos los aminoácidos implicados eran de forma L: CS Bio Co., Estados Unidos.
Ciclosporina A: Novartis Pharma AG., Suiza. Solución salina: OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., PR China
Ratones BALB/c (H-2d, SPF, 6-8 semanas de edad, peso 18-22 g, 50% hembras y 50% machos): Military Medical Academy of Science, PR China.
Los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos: péptido (200 g/kg/día), Ciclosporina A (10 mg/kg/día) y solución salina (0,5 ml). Cada grupo contenía 12 ratones, 6 hembras y 6 machos. Las sustancias de ensayo se disolvieron en 0,5 ml de solución salina y se aplicaron por vía intraperitoneal una vez al día durante 20 días consecutivos.
Glóbulos rojos de oveja (SRBC) se resuspendieron con solución salina al 2% (v/v) y 0,2 ml de la solución de células resuspendidas se aplicaron por vía intraperitoneal a cada ratón el día 16º después de la administración de la sustancia de ensayo. El día después de la última administración de la sustancia de ensayo, se recogió sangre del canto interno y se dejó a temperatura ambiente durante una hora para la exudación del suero. Después del centrifugado a 200 g durante 10 minutos, el suero se diluyó 200 veces con solución salina normal.
Para la preparación de la solución de trabajo de complemento, se añadieron 10 volúmenes de suero Cavy fresco a un volumen de SRBC compactados mediante centrifugado. Esta mezcla se agitó suavemente durante 30 minutos a 4ºC. A continuación se retiraron los SRBC mediante centrifugado a 200 g durante 10 minutos. Se añadieron diez volúmenes de solución salina normal al sobrenadante para obtener la solución de complemento de trabajo.
Para el ensayo del título de anticuerpos de ratones, se añadieron 0,2 ml de suspensión de SRBC al 1% a 1 ml de suero de ratón enfriado con hielo diluido para cada ratón. Un ml de solución de complemento de trabajo se añadió a continuación y la mezcla se incubó a 37ºC durante 20 minutos. La reacción se interrumpió enfriando cada muestra en hielo durante 10 minutos. A continuación, las muestras se centrifugaron a 200 g durante 10 minutos para obtener el sobrenadante. A 1 ml de este sobrenadante, se añadieron 3 ml de solución de Drabkin y se dejaron a temperatura ambiente durante 10 minutos, y a continuación se midió la DO540nm. La lectura de referencia de lisis-50 a DO540nm se determinó siguiendo el procedimiento exacto al de la muestra, excepto que se sustituyó la mitad de los SRBC por solución salina y sin la retirada por centrifugado de los SRBC no lisados. Índice de suero de la muestra (HC50) = DO540nm de la muestra / DO540nm de lisis 50 x 200
Tabla 10. El efecto del péptido sobre la formación de anticuerpos de ratones
- Grupo
- Dosificación N HC50
- CMS-010.26
- 200 g/kg/día 10 141,3 ± 29,3*
- Ciclosporina A
- 10 mg/kg/d 12 148,9 ± 21,7*
- Solución salina
- 0,5 ml/d 11 167,6 ± 21,5
5
10
15
20
25
30
*: en comparación con el grupo de solución salina, P < 0,05
Se descubrió que CMS 010.26 a la dosificación adecuada suprime la formación de anticuerpos de ratones in vivo, con significación estadística en comparación con el grupo de control de solución salina (P < 0,05).
EJEMPLO 4
El efecto de péptidos sobre la tasa de crecimiento de células de sarcoma S180 transplantadas en ratones KM in vivo
4.1.1 Péptidos
Todos los aminoácidos implicados eran de forma L: CS Bio Co., Estados Unidos.
Solución salina: OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., PR China. Adriamicina: Zhejiang Haizheng Pharmaceutical Co., Ltd., PR China
Ratones KM hembra sanos (SPF, 6-8 semanas de edad, peso 18-22 g): Military Medical Academy of Science, PR China
Se transplantaron células de sarcoma S180 por vía intraperitoneal en ratones KM durante 6-8 días y se recogió de forma aséptica el líquido ascítico. La concentración de células se ajustó a 1 x 107 por ml con FBS al 10% en RPMI1640, y se inyectaron 0,2 ml de suspensión celular a través de la axila en cada ratón KM para desarrollar el modelo de ratones portadores de sarcoma. Los ratones con células de sarcoma S180 transplantadas se asignaron aleatoriamente a cinco grupos: péptido (dos grupos: 50 g/kg/día y 10 g/kg/día), Adriamicina (2 mg/kg/día), Ciclofosfamida (40 mg/kg/día), y solución salina (0,5 ml/día). La inyección intraperitoneal de sustancias de ensayo comenzó el día inmediatamente después del transplante del tumor y continuó una vez al día durante 20 días consecutivos.
El día después de la última administración de la sustancia de ensayo, los sarcomas se extirparon de los ratones y se pesaron. Los diámetros de cada sarcoma en los tres planos (A, B, C) se midieron mediante un calibre vernier. El volumen del sarcoma se calculó mediante la fórmula: V = (1/6)ABC. El índice de inhibición del crecimiento del tumor se calculó mediante la fórmula: índice de crecimiento del tumor = (peso del tumor del grupo de control - peso del tumor del grupo de tratamiento) / peso del tumor del grupo de control x 100%
Tabla 11. El efecto de péptidos sobre el desarrollo de células de sarcoma S180 transplantadas en ratones in vivo (1)
- Grupo
- Dosificación N Peso del sarcoma
- CMS-010.31
- 50 g/kg/día 17 1,20 ± 1,60*
- CMS-010.31
- 10 g/kg/día 14 1,05 ± 1,28*
- CMS-010.103
- 50 g/kg/día 15 1,48 ± 1,44*
- CMS-010.103
- 10 g/kg/día 15 1,72 ± 1,53*
- Adriamicina
- 2 mg/kg/día 17 1,52 ± 1,75*
- Solución salina
- 0,5 ml/día 12 5,07 ± 5,46
*: En comparación con el grupo de solución salina normal, P < 0,05
Tabla 12. El efecto de péptidos sobre el desarrollo de células de sarcoma S180 transplantadas en ratones in vivo (2)
- Grupo
- Dosificación N Peso del sarcoma Volumen del sarcoma
- CMS-010.02
- 500 g/kg/día 10 0,97 ± 0,85* 0,65 ± 0,67*
- CMS-010.02
- 250 g/kg/día 10 0,68 ± 0,72* 0,36 ± 0,40*
- CMS-010.03
- 500 g/kg/día 10 0,33 ± 0,35*@ 0,27 ± 0,33*@
- CMS-010.03
- 250 g/kg/día 10 0,68 ± 0,46* 0,31 ± 0,22*
- CMS-010.04
- 500 g/kg/día 10 0,62 ± 0,44* 0,40 ± 0,28*
- CMS-010.04
- 250 g/kg/día 10 0,27 ± 0,19*@ 0,17 ± 0,12*@
- CMS-010.05
- 500 g/kg/día 10 0,47 ± 0,29*@ 0,34 ± 0,22*
- CMS-010.05
- 250 g/kg/día 10 0,56 ± 0,33* 0,23 ± 0,19*@
- CMS-010.07
- 500 g/kg/día 10 0,52 ± 0,25* 0,37 ± 0,20*
- CMS-010.07
- 250 g/kg/día 10 0,32 ± 0,14*@ 0,24 ± 0,13*@
- CMS-010.08
- 500 g/kg/día 10 1,05 ± 0,64* 1,01 ± 0,63
- CMS-010.08
- 250 g/kg/día 10 0,38 ± 0,27*@ 0,20 ± 0,14*@
- CMS-010.09
- 500 g/kg/día 10 0,85 ± 0,70* 0,84 ± 0,84
- CMS-010.09
- 250 g/kg/día 10 0,45 ± 0,38*@ 0,37 ± 0,44*
- CMS-010.11
- 500 g/kg/día 10 1,14 ± 0,74* 0,95 ± 0,54
- CMS-010.11
- 250 g/kg/día 10 0,64 ± 0,31* 0,63 ± 0,40*
- CMS-010.13
- 500 g/kg/día 10 0,73 ± 0,43* 0,38 ± 0,23*
- CMS-010.13
- 250 g/kg/día 10 0,92 ± 0,56* 0,91 ± 0,59
- CMS-010.14
- 500 g/kg/día 9 0,67 ± 0,70* 0,56 ± 0,53*
- CMS-010.14
- 250 g/kg/día 10 0,44 ± 0,30*@ 0,29 ± 0,21*
- CMS-010.15
- 500 g/kg/día 10 0,68 ± 0,36* 0,63 ± 0,35*
- CMS-010.15
- 250 g/kg/día 9 0,45 ± 0,35*@ 0,41 ± 0,37
- CMS-010.16
- 500 g/kg/día 10 0,99 ± 0,42* 0,92 ± 0,36
- CMS-010.16
- 250 g/kg/día 9 0,63 ± 0,47* 0,61 ± 0,44*
- CMS-010.17
- 500 g/kg/día 10 0,91 ± 0,46* 0,55 ± 0,34*
- CMS-010.17
- 250 g/kg/día 9 0,65 ± 0,41* 0,40 ± 0,24*
- CMS-010.18
- 500 g/kg/día 9 0,59 ± 0,48* 0,58 ± 0,42*
- CMS-010.18
- 250 g/kg/día 9 0,44 ± 0,31*@ 0,27 ± 0,20*@
- CMS-010.19
- 500 g/kg/día 9 0,68 ± 0,68* 0,40 ± 0,42*
- CMS-010.19
- 250 g/kg/día 10 0,41 ± 0,45*@ 0,46 ± 0,58*
- CMS-010.20
- 500 g/kg/día 10 0,59 ± 0,46* 0,54 ± 0,51*
- CMS-010.20
- 250 g/kg/día 9 1,00 ± 0,76* 0,88 ± 0,77
- CMS-010.21
- 500 g/kg/día 10 0,44 ± 0,22*@ 0,44+0,21*
- CMS-010.21
- 250 g/kg/día 10 0,51 ± 0,29* 0,44 ± 0,22*
- CMS-010.22
- 500 g/kg/día 10 0,85 ± 0,73* 0,73 ± 0,87
- CMS-010.22
- 250 g/kg/día 10 0,28 ± 0,12*@ 0,24 ± 0,08*@
- CMS-010.23
- 250 g/kg/día 9 0,27 ± 0,18@ 0,21 ± 0,15*@
- CMS-010.24
- 500 g/kg/día 10 1,20 ± 0,79* 0,62 ± 0,47*
- CMS-010.24
- 250 g/kg/día 10 0,61 ± 0,39* 0,36 ± 0,30*
- CMS-010.25
- 500 g/kg/día 10 0,52 ± 0,38* 0,26 ± 0,21*@
- CMS-010.25
- 250 g/kg/día 9 0,65 ± 0,53* 0,48 ± 0,37*
- CMS-010.27
- 500 g/kg/día 9 1,05 ± 0,86* 0,51 ± 0,33*
- CMS-010.27
- 250 g/kg/día 10 0,78 ± 0,68* 0,58 ± 0,58*
- CMS-010.29
- 500 g/kg/día 10 0,55 ± 0,41* 0,40 ± 0,11*
- CMS-010.29
- 250 g/kg/día 10 1,24 ± 0,72* 1,02 ± 0,66
- CMS-010.31
- 500 g/kg/día 10 0,78 ± 0,89* 0,43 ± 0,50*
- CMS-010.31
- 250 g/kg/día 10 0,27 ± 0,19*@ 0,25 ± 0,20*@
- CMS-010.32
- 500 g/kg/día 10 0,41 ± 0,35*@ 0,40 ± 0,31*
- CMS-010.32
- 250 g/kg/día 10 0,38 ± 0,24*@ 0,25 ± 0,14*@
- Ciclofosfamida
- 40 mg/kg/día 10 1,07 ± 0,80* 0,76 ± 0,66*
- Solución salina
- 0,5 ml/día 10 1,87 ± 0,52 1,20 ± 0,28
- *: En comparación con el grupo de solución salina normal, P < 0,05 @: En comparación con el grupo de Ciclofosfamida, P < 0,05
Se descubrió que CMS-010.103, CMS-010.02, CMS-010.03, CMS-010.04, CMS-010.05, CMS-010.07, CMS-010.08, CMS-010.09, CMS-010.11, CMS-010.13, CMS-010.14, CMS-010.15, CMS-010.16, CMS-010.17, CMS-010.18, CMS
5 010.19, CMS-010.20, CMS-010.21, CMS-010.22, CMS-010.23, CMS-010.24, CMS-010.25, CMS-010.27, CMS010.29, CMS-010.31 y CMS-010.32, a dosificaciones adecuadas, suprimen el desarrollo de células de sarcoma S180 transplantadas en ratones KM in vivo, con significación estadística en comparación con el grupo de control de solución salina normal (P < 0,05).
EJEMPLO 5
10 El efecto de péptidos sobre nefritis de Masugi en conejos
5.1.1 Péptidos
Todos los aminoácidos implicados eran de forma L: CS Bio Co., Estados Unidos.
Inyección de fosfato sódico de dexametasona: Tianjin Jinyao Aminophenal Ltd., PR China. Solución salina: OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., PR China. Vacuna BCG: Beijing Institute of Biological Products, PR China. Lanolina: Tianjin sixth chemical product factory, PR China. Parafina líquida: Tianjin sixth chemical product factory, PR China. Reactivo de diagnóstico para BUN de suero: BECKMAN 443350, Estados Unidos. Reactivo de diagnóstico para Creatinina del suero: BECKMAN 443340, Estados Unidos.
Una oveja macho (8 meses de edad): Department of Laboratory Animal, Tianjin Medical University, PR China. Conejos (MDA, machos, 2-2,5 kg): Beijing Fuhao Breed Farm, PR China.
Un conejo sano se anestesió con 4ml/kg de uretano al 25% mediante inyección intravenosa en la vena auricular, y se le inyectó por vía intravenosa heparina a 1250 U/kg para la heparinización sistémica. El abdomen del conejo se abrió de forma aséptica y las arterias y venas renales se expusieron. Las arterias renales se cateterizaron y las venas renales se cortaron. Los riñones se irrigaron con solución salina hasta que el tejido renal se volvió gris. A continuación se extirparon los riñones. La corteza renal se aisló y se homogeneizó en 0,5 volúmenes de solución salina enfriada con hielo, y a continuación se almacenó a -20ºC.
7,5 ml del homogenado de la corteza renal se mezclaron con 2,5 ml de adyuvante completo de Freund (Lanolina respecto a parafina líquida en una proporción de 1,5, con 5 mg/ml de vacuna BCG). Después del completo emulsionado, el antígeno se inyectó en una oveja en ubicaciones dorsales diferentes, 1 ml por ubicación, una vez cada dos semanas, durante un total de tres rondas de inyecciones. Comenzando con la cuarta inmunización, 5 g de corteza renal se homogeneizaron con un volumen de solución salina y se inyectaron por vía intramuscular en 5 ubicaciones en la oveja, 1 ml por ubicación, una vez cada dos semanas. El título de anticuerpo de la corteza renal de oveja anti-conejo se monitorizó mediante doble inmunodifusión en una base bi-semanal. Cuando el título alcanzó 1:32, el antisuero de oveja se recogió de la arteria carótida. El antisuero de oveja se mezcló con un volumen igual de glóbulos rojos de conejo y se colocó a 4ºC durante 12 horas para la retirada de anticuerpo de glóbulos rojos anticonejo. A continuación, el antisuero se recogió mediante centrifugado y se colocó a 56ºC para inactivar el complemento y las proteasas. El antisuero se almacenó a -20ºC.
5.2.2 Agrupamiento de animales, administración de la sustancia de ensayo y establecimiento del modelo de nefritis de Masugi
Veintidós conejos sanos se asignaron aleatoriamente a 5 grupos: péptido (107,3 g/kg/día y 58,5 g/kg/día, 4 conejos por grupo), dexametasona (0,1 mg/kg/día, 4 conejos), tratamiento con solución salina (1 ml/día, 7 conejos) y sanos normales (3 conejos). Antes del establecimiento de un estado de enfermedad en los conejos, se tomaron mediciones de BUN (Nitrógeno de urea) en suero, creatinina, y proteína de la orina durante 24 horas para cada conejo. Si no había ninguna anormalidad en estas mediciones, se estableció el modelo de nefritis de Masugi en conejos experimentales mediante inyección intravenosa de antisuero de la corteza renal de oveja anti-conejo a través de la vena auricular, 0,5 ml por inyección, una inyección cada 30 minutos, para un total de 4 inyecciones por conejo. Al grupo de conejos sanos normales (control) se le inyectó solución salina de la misma manera. La administración intravenosa de las sustancias de ensayo a través de la vena auricular comenzó el día después de la inyección del antisuero, una vez al día, 1 ml por inyección, durante 30 días consecutivos.
Se recogió orina de cada conejo durante un periodo de 24 horas una vez por semana y el contenido de proteínas se determinó mediante el método del ácido sulfosalicílico.
Para la observación de los efectos de péptidos sobre la eliminación de anticuerpo IgG de la corteza renal de oveja anti-conejo de conejos con nefritis de Masugi, el día después de la última administración de la sustancia de ensayo, los conejos fueron sacrificados por asfixia y se extirpó el riñón derecho, se congelaron y a continuación se tiñeron mediante inmunofluorescencia para detectar la presencia de IgG de oveja. El área positiva para fluorescencia de cada glomérulo se contó. Se examinaron treinta glomérulos por conejo y se calculó el área positiva promedio por glomérulo.
5.2.3.3 Estadísticas
Se determinó la significación estadística mediante el test t del software SPSS.
5.3 Resultados Tabla 13. Efecto del péptido sobre la proteinuria de conejos con nefritis de Masugi
- Grupo
- Dosificación/día N Semana 0 Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4
- CMS-010.26
- 107,3 g/kg 4 9,84 ± 4,29 187 ± 184 114 ± 145 26 ± 24* 28 ± 32*
- CMS-010.26
- 58,5 g/kg 4 9,53 ± 4,64 77 ± 62 150 ± 123 20 ± 12* 36 ± 16*
- Dexametasona
- 0,1 mg/kg 4 9,48 ± 8,46 29 ± 12 13,6 ± 6,3* 13,7 ± 3,1* 25 ± 19
- Tratamiento con solución salina
- 0,5 ml 7 11,72 ± 3,18 122 ± 91 160 ± 138 145 ± 33 157 ± 71
- Sanos normales
- - 3 23,43 ± 18,42 7,7 ± 2,0* - 6,9 ± 4,5* 24 ± 7*
- *: en comparación con el grupo de tratamiento con solución salina, P < 0,05
Tabla 14: Efecto del péptido sobre la eliminación de anticuerpo IgG de corteza renal de oveja anti-conejo de los conejos con nefritis de Masugi
- Grupo
- Dosificación/día N Recuento del área positiva/glomérulos
- CMS-010.26
- 107,3 g/kg 5 5,6 ± 1,2**
- CMS-010.26
- 58,5 g/kg 4 6,3 ± 1,4**
- Dexametasona
- 0,1 mg/kg 4 7,5 ± 1,0
- Tratamiento con solución salina
- 0,5 ml 7 8,7 ± 0,9
- Sanos normales
- - 3 -
- *: en comparación con el grupo de tratamiento con solución salina, P < 0,01
10 Se descubrió que CMS-010.26 era capaz de reducir la gravedad de proteinuria y promover la eliminación de anticuerpo de corteza renal de oveja anti-conejo en conejos con nefritis de Masugi in vivo, con significación estadística en comparación con el grupo de control de tratamiento con solución salina, P < 0,05.
EJEMPLO 6
El efecto de péptidos sobre ratas con nefritis de Heymann in vivo
15 6.1 Materiales
6.1.1 Péptido
Todos los aminoácidos usados eran de forma L: CS Bio Co., Estados Unidos.
Inyección de fosfato sódico de dexametasona: Tianjin Jinyao Aminophenal Ltd., PR China. Solución salina: OTSUKA
20 Pharmaceutical Co. Ltd., PR China. Vacuna BCG: Beijing Institute of Biological Products. Lanolina: Tianjin sixth factory of chemical product, PR China. Parafina líquida: Tianjin sixth factory of chemical product, PR China. Reactivo de diagnóstico para BUN del suero: BECKMAN 443350, Estados Unidos. Reactivo de diagnóstico para creatinina del suero: BECKMAN 443340, Estados Unidos.
6.1.3 Animales
21
5
10
15
20
25
30
35
40
Ratas Wistar (SPF, 6-8 semanas de edad, peso 150-200 g): Beijing Vital River Laboratory Animal Co., Ltd., PR China.
Los abdómenes de ratas Wistar sanas se abrieron de forma aséptica. La vena porta y la vena cava inferior se expusieron. La vena porta se cateterizó y la vena cava inferior se cortó. Los riñones se irrigaron con solución salina hasta que el tejido renal se volvió gris. Los riñones se extirparon y la corteza renal se aisló. La corteza renal se homogeneizó a continuación en hielo y se almacenó a -20ºC.
Se mezcló lanolina con parafina líquida en una proporción de 1:2 v/v, se calentó a 70ºC con agitación, y a continuación se estabilizó en autoclave. Se añadió suficiente vacuna BCG a la mezcla de lanolina/parafina para producir una concentración de vacuna de 3 mg/ml para formar adyuvante completo de Freund. El homogenado de la corteza renal, adyuvante completo de Freund, y solución salina se mezclaron en una proporción de 1:1:2 con mezclado en mortero hasta la completa emulsión.
20 ratas Wistar sanas se asignaron aleatoriamente a dos grupo: péptido (200 g/kg/día) y tratamiento con solución salina (2 ml/día). Dos ml de antígeno se inyectaron por vía intraperitoneal a cada rata, una vez cada dos semanas, durante un total de 5 rondas de inyección. La administración de la sustancia de ensayo mediante inyección intraperitoneal comenzó el día después de la tercerea inmunización, una vez al día hasta el final del experimento.
La cuantificación de la proteína en la orina comenzó en la tercera semana de establecimiento del modelo. Se recogió una muestra de orina de cada rata durante un periodo de 24 horas una vez cada dos y el contenido de proteína en la orina se cuantificó mediante el método del ácido sulfosalicílico.
Los valores de la muestra se compararon mediante test t usando software SPSS
Tabla 15. Efecto de la administración del péptido en 24 horas, concentración de proteína en la orina (mg/dl) de ratas con nefritis de Heymann
- Grupo
- N Semana 3 Semana 5 Semana 7 Semana 9
- CMS-010.26
- 10 6,2 ± 2,3 3,1 ± 1,4 3,9 ± 1,6* 3,8 ± 2,2*
- Tratamiento con solución salina
- 10 4,1 ± 1,3 3,1 ± 0,8 10,9 ± 2,8 12,6 ± 1,2
- *: en comparación con el grupo de solución salina, P < 0,05
A la dosificación adecuada, se descubrió que CMS-010.26 reduce la gravedad de proteinuria en ratas con nefritis de Heymann in vivo, con significación estadística en comparación con el grupo de tratamiento con solución salina (P < 0,05).
Referencias para los ejemplos 1-6
- 1.
- Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 2002, 1: 1426-1428
- 2.
- Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 134-135
- 3.
- Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 2002, 1: 1429
22
- 4.
- Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6): 356-358
- 5.
- Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 128-129
- 6.
- Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (segunda edición). People's Health Publishing House. 1998, 137-138
- 7.
- Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 2002, 1: 1429
- 8.
- Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 137-139
- 9.
- Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 96
- 10.
- Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 2002, 1: 1227-1228
- 11.
- Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 97
- 12.
- Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 2002, 1: 1227
EJEMPLO 7
Administración de péptidos a través de especies bacterianas de Lactobacillus manipuladas genéticamente
Lo siguiente se proporciona como un método ejemplar para administrar péptidos de esta invención a un huésped como se ha descrito anteriormente. Una secuencia de ADN que codifica un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 14 se sintetiza mediante medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión usando técnicas convencionales de manipulación genética familiares para los expertos en la materia. El vector de expresión seleccionado contiene un promotor constitutivo funcional en Lactobacilos, un sitio de clonación múltiple para la introducción de secuencias de ADN en una orientación de 5' a 3' específica así como un gen marcador seleccionable que otorga resistencia a un antibiótico (para ayudar en los procedimientos de clonación) y pude comprender otras secuencias para ayudar en la producción y/o secreción de los péptidos, tales como secuencias de péptidos señal. Un ejemplo de dicho vector es proporcionado por la Patente de Estados Unidos Nº 5.592.908, de Pavla. En resumen, esta patente describe varios promotores conocidos que funcionan en especies de Craksbacillus, así como un método para descubrir nuevos promotores en dichas bacterias, cualquiera de los cuales puede unirse de forma operativa a un ácido nucleico que codifica un péptido de la presente invención para expresar el péptido en Lactobacilos. Un ácido nucleico que codifica un péptido señal, tal como péptidos que comprende de 16 a 35 aminoácidos en su mayoría hidrófobos que con activos en Lactobacillus lactis descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.529.908, mencionada anteriormente, se interpone entre el promotor y el ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención, de modo que el ácido nucleico que codifica el péptido señal está en marco con el ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención.
Además de la secuencia codificante del péptido, La secuencia de ADN sintetizada puede comprender secuencias para ayudar en el ligamiento y la clonación de dicho ADN en el vector de expresión. Por ejemplo, sitios de reconocimiento de la enzima de restricción que corresponden a los descubiertos en el sitio de clonación múltiple del vector pueden incorporarse en el ADN sintetizado en los extremos 5' y 3' de la secuencia, de modo que la secuencia pueda clonarse en la orientación apropiada dentro del vector. Tanto el vector como el ADN sintetizado son digeridos con las enzimas de restricción particulares, y a continuación se purifican. Las reacciones de ligamiento con el vector y el ADN sintetizado vienen seguidas por la transformación en una cepa adecuada de E. Coli. Las bacterias transformadas se siembran en medios que contienen el antibiótico para el que el vector otorga resistencia. Una colonia de bacterias transformadas se selecciona para cultivos de crecimiento y procedimientos de preparación de plásmido; se confirma la presencia del ADN sintetizado en la orientación correcta.
Este vector de expresión se transforma a continuación en una célula huésped bacteriana de una especie de Lactobacillus, tal como L. acidophilus. Las células transformadas se seleccionan en virtud del marcador seleccionable encontrado dentro de la secuencia del vector y la secreción del péptido puede verificarse realizando una transferencia de western, realizando electroforesis en gel de péptidos presentes en el medio de cultivo u otras técnicas convencionales. Se selecciona una colonia transformada de bacterias y se usa para preparar cultivos a gran escala de las bacterias manipuladas genéticamente. Un cultivo de las bacterias manipuladas genéticamente que expresan el péptido deseado se cultiva y al menos una parte del mismo se administra al canal alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo huésped en la que las bacterias son capaces de replicarse. Si se desea, los cultivos bacterianos pueden tratarse de diversas maneras para producir un suplemento para el consumo entérico por el huésped. Estos tratamientos incluyen liofilización u otros métodos de conservación de las bacterias, además de combinar las bacterias con agentes portadores, tales como soluciones, disolventes, medios de dispersión, agentes de retardo, emulsiones y similares. El uso de estos agentes para preparar suplementos se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, las bacterias pueden usarse para preparar productos lácteos cultivados u otros productos alimentarios para el consumo humano, de modo que el organismo que expresa el péptido colonice el intestino del organismo huésped. Una serie de diferentes métodos para incorporar cepas específicas de bacterias del ácido láctico en productos alimentarios tales como yogur, kimchi, queso y mantequilla se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 6.036.952, de Oh. Después del consumo de las bacterias a través de una de una serie de rutas, los organismos manipulados pueden colonizar el intestino y permitir la presentación y/o absorción de los péptidos de esta invención a través de la capa mucosal del intestino.
EJEMPLO 8
Administración de péptidos a través de una forma manipulada genéticamente de Bacillus subtilis
Lo siguiente se proporciona como otro método ejemplar para administrar el péptido de esta invención a un huésped como se ha descrito anteriormente. Una secuencia de ADN que codifica un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 se sintetiza mediante medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión mediante técnicas de ingeniería genética, siendo todas las técnicas conocidas en la técnica. El vector de expresión seleccionado comprende un vector lanzadera, tal como pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ), capaz de propagarse tanto en E. coli como en B. subtilis y que contiene un gen de resistencia a antibióticos para seleccionar colonias de bacterias transformadas. Este vector puede contener un promotor constitutivo activo en B. subtilis, tal como un promotor derivado del gen Sac B de B. subtilis así como una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal activo en B. subtilis que dirige la exportación eficaz de proteínas heterólogas no expresadas desde la célula bacteriana. Un ejemplo de dicho vector se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.268.169, de Fahnestock. En resumen, como se ha detallado anteriormente, el ADN que codifica un péptido de esta invención se sintetizará con sitios de enzimas de restricción y/o otras secuencias para facilitar la clonación del ADN a través de técnicas familiares para los expertos en la materia. Después de la transformación en E. coli., la siembra en placas, la selección y la propagación del plásmido para crear una reserva de plásmidos, el plásmido se transforma a continuación en B. subtilis y se seleccionan transformantes en virtud de la resistencia a un antibiótico en los medios de siembra en placas.
La producto en y la secreción de péptido desde el B. subtilis manipulado genéticamente se verifica usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como radiomarcado de péptidos para detección por autorradiografía después del análisis por SDS-PAGE o transferencia de Western.
Un cultivo de bacterias manipuladas genéticamente se cultiva y al menos una parte del mismo se administra al canal alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo huésped en la que las bacterias son capaces de replicarse.
EJEMPLO 9
Administración de péptidos a través de especies de levadura Saccharomyces manipulada genéticamente.
Lo siguiente se proporciona como otro método ejemplar para administrar el péptido de esta invención a un huésped como se ha descrito anteriormente. Una secuencia de ADN que codifica un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 se sintetiza mediante medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión mediante técnicas de ingeniería genética, siendo todas las técnicas conocidas en la técnica. El vector de expresión seleccionado comprende un vector de expresión de proteína de levadura mantenido de forma estable, que comprende un promotor de levadura constitutivo tal como pADH1, sitios para la replicación del vector tanto en levadura como en E. coli, un gen o genes que otorgan fototrofía a un mutante de levadura auxótrofo para fines de selección, un sitio de clonación múltiple (MCS) y, si se desea, secuencias que codifican un péptido señal. Vectores tales como éste están disponibles en el mercado y se conocen bien en la técnica o pueden construirse fácilmente usando técnicas convencionales. Después de la inserción del ADN sintetizado en el vector de levadura, transformación en E. coli, siembra en placas de E. coli transformado en medios selectivos, selección de una colonia bacteriana transformada y preparación de ADN plasmídico a partir de un cultivo cultivado de bacterias a partir de dicha colonia, el vector se transforma en Saccharomyces cerevisiae mediante técnicas bien conocidas tales como transformación con acetato de litio o electroporación. La cepa de Saccharomyces cerevisiae seleccionada para transformación en una cepa auxótrofa mutante que requerirá un gen en el plásmido para cultivar en placas de medio mínimo. Las colonias de levadura transformadas se aíslan sembrando en placas la levadura en medios de cultivo que carecen del gen proporcionado en el vector. Solamente aquellas levaduras que han recibido el vector y su gen selectivo y que expresan ese producto génico serán capaces de crecer en colonias en los medios mínimos. La verificación de la secreción del péptido puede obtenerse realizando una transferencia de Western, realizando electroforesis en gel de péptidos presentes en el medio de cultivo u otras técnicas convencionales.
Se selecciona una colonia transformada de levadura y se usa para preparar cultivos a gran escala. Un cultivo de la levadura manipulada genéticamente que expresa el péptido deseado se cultiva y al menos una parte del mismo se administra al canal alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo huésped en la que las bacterias son capaces de replicarse. Si se desea, los cultivos de levadura pueden tratarse de diversas maneras para producir un suplemento para el consumo entérico por parte del huésped. Estos tratamientos incluyen liofilización u otros métodos de conservar la levadura, además de combinar las bacterias con agentes portadores, tales como soluciones, disolventes, medios de dispersión, agentes de retardo, emulsiones y similares. El uso de estos agentes para preparar suplementos se conoce bien en la técnica. En otra realización, las levaduras transformadas se usan en la creación de productos alimentarios, tales como productos de leche fermentada como yogur y kéfir, mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Como con cultivos de bacterias del ácido láctico vivas en estos productos alimentarios, las levaduras transformadas colonizan el intestino al menos de forma transitoria y sirven para presentar péptidos al huésped a través de la luz del intestino.
EJEMPLO 10
Dirección de un péptido a una ubicación particular
Lo siguiente se proporciona como un método ejemplar para administrar de forma selectiva el péptido de esta invención a un compartimento, órgano, tipo celular o ubicación particular dentro del cuerpo. En este caso, un trastorno de proliferación celular se trata dirigiendo a un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 a tejidos en el riñón de un individuo. Por ejemplo, el péptido se une mediante enlaces covalentes mediante reacciones químicas conocidas en la técnica a lisozima de bajo peso molecular (LMW), un resto de proteína disponible en el mercado que se concentra específicamente en el tejido renal. Las técnicas para conseguir la conjugación de moléculas a lisozima LMW están documentadas (Folgert et al., Br. J. Pharmcology, 136: 1107, 2002). Las técnicas generales para conjugar proteínas o péptidos entre sí también se enseñan en la bibliografía del campo (Fischer et al., Bioconj. Chem., 12: 825, 2001). La muestra peptídica recién creada se purifica a continuación de reactivos químicos usados en el proceso de unión mediante métodos cromatográficos tales como FPLC de intercambio catiónico y/o centrifugado en gradiente. Una vez purificado, el péptido conjugado se administra a un individuo que necesita terapia para un trastorno de proliferación celular. Para su actividad anti-proliferativa, los péptidos de la invención se dirigen preferentemente al tejido renal en virtud de la unión entre ellos y la lisozima LMW, que se concentra selectivamente en el tejido renal en virtud de la afinidad de la lisozima LMW para las células de los túbulos proximales del riñón. Esta administración preferencial permite un mayor efecto anti-proliferativo en comparación con el de una cantidad molar equivalente de los péptidos de la presente invención por sí mismos. A la inversa, puede reducir la cantidad de fármaco peptídico requerida para conseguir cierto nivel de actividad antiproliferativa.
EJEMPLO 11
Potenciación de la administración de un péptido a su sitio activo
Lo siguiente se presenta como un método ejemplar para aumentar la administración de un péptido neuroactivo al cerebro. Un péptido de la presente invención que ejerce sus efectos sobre receptores expresados por neuronas del cerebro se sintetiza mediante métodos químicos conocidos por los expertos en la materia. Como alternativa, puede ser expresado por un microorganismo manipulado y recuperarse de un cultivo de dichos organismos, como se detalla en los ejemplos anteriores. Una vez obtenido en una forma purificada, el péptido se utiliza en una serie de reacciones químicas orgánicas para crear un resto conjugado a éster de triglicéridos, unido al péptido. El resto conjugado está constituido por un centro de carbono sustituido cuaternario unido al péptido de la invención a través de un enlace amida con el carbono caboxilo terminal del péptido. Los otros tres grupos unidos al centro de carbono cuaternario están constituidos por enlaces éster a cadenas de ácidos grasos de 16 carbonos. Las propias cadenas de ácidos grasos terminan en un grupo peptídico terminal, conocido como una máscara peptídica, lo que hace a las cadenas más hidrófobas y las dirige a la membrana de células endoteliales de la barrera hematoencefálica específicamente. El procedimiento para esta síntesis se explica detalladamente en el documento Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3): 434, 1997, y utiliza reactivos comunes y equipo familiar para los expertos en la materia.
Una vez introducido en un individuo en una ubicación periférica, el compuesto viaja a través del cuerpo mediante el sistema circulatorio, interactuando con la membrana endotelial de la barrera hematoencefálica. La degradación por etapas de la máscara dipeptídica y las cadenas lipídicas durante el transporte de la molécula a través de la capa epitelial de la barrera hematoencefálica da como resultado la liberación del péptido de la invención en el compartimento del cerebro. Allí el péptido puede interactuar con receptores en la superficie de las neuronas para ejercer su efecto sobre la función cerebral. El tiempo requerido para que el fármaco alcance la barrera hematoencefálica y sea transportado al cerebro, con la degradación concomitante del resto portador, altera la cinética de la actividad del fármaco, creando un efecto más estable y de mayor duración en comparación con la inyección intracerebroventricular del péptido libre.
EJEMPLO 12
Creación de formulaciones peptídicas que son resistentes a la degradación enzimática
Lo siguiente se proporciona como un método ejemplar para crear una formulación de un péptido biológicamente activo para administración oral que es resistente a la actividad de proteasas y peptidasas que se encuentran en y a lo largo de la superficie del tracto digestivo. En este ejemplo, un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 se utiliza en la preparación de una formulación farmacéutica para administración oral a un
5
10
15
20
25
30
35
40
paciente. Como se describe en el documento Larionova et al. (Int. J. Pharma., 189: 171, 1999), el péptido se usa en la creación de micropartículas con almidón soluble y un inhibidor de proteasa, aprotinina, que es un potente inhibidor de diversas proteasas secretadas de forma luminal y unidas a la membrana del borde en cepillo intestinal. En resumen, almidón soluble, el inhibidor de proteasa aprotinina y el péptido de la invención se disuelven en un tampón acuoso. Las proporciones de almidón soluble, aprotinina, y el péptido se determinan mediante métodos experimentales familiares para un experto en la materia; por ejemplo, Larionova et al., utilizaron ensayos de digestión simulada in vitro para determinar las proporciones y las condiciones de preparación más eficaces para la proteína usada en su estudio. La solución acuosa se emulsiona en agitación mecánica en ciclohexano (proporción 1:3, v/v) que contiene el 5% de Span-80, un tensioactivo no iónico. Se añade una solución de cloruro de tereftaloilo en cloroformo a la emulsión y la agitación continúa 30 minutos, durante los cuales las moléculas de almidón se reticulan con la aprotinina y el péptido. Las micropartículas creadas en ese proceso se lavan secuencialmente con ciclohexano, una solución de etanol al 95% con el 2% v/v de detergente Tween 85, el 95% de etanol y agua. Las micropartículas se resuspenden en agua y se liofilizan. El compuesto liofilizado puede colocarse en cápsulas de gelatina para administración oral al individuo que necesita tratamiento.
Una vez ingerido, el compuesto es liberado a medida que la cápsula de gelatina se disuelve. Las micropartículas se descomponen en el intestino delgado mediante la acción de amilasa sobre las moléculas de almidón, conduciendo a la liberación gradual de aprotinina y el péptido de la invención. La liberación concurrente del potente inhibidor de proteasa aprotinina al mismo tiempo y en la misma ubicación que el péptido reduce la degradación enzimática del péptido y aumenta la proporción de péptido intacto disponible para absorción a través de la membrana intestinal.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> CMS Peptides Patent Holding Comapny Limited
<120> Derivados del péptido VAPEEHPTLLTEAPLNPK biológicamente activos
<130> P88671EP01
<140> Solicitud divisional de EP 05743126.4
<141> 25 de abril de 2005
<150> US 60/566.455
<151> 28 de abril de 2004
<150> PCT/EP05/04419
<151> 25 de abril de 2005
<160> 31
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 1
5 <210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> Secuencia peptídica sintética
<400> 2
- 15
- <210> 3
- <211> 17
- <212> PRT
- <213> Secuencia artificial
- 20
- <220>
- <223> Secuencia peptídica sintética
- <400> 3
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintética
<400> 4
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintética
<400> 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintética
<400> 6
<210> 7
<211> 14
<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintética
15 <400> 7
<210> 8
<211> 14
20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintética
25
<400> 8
<210> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintética
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Claims (10)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24.
-
- 2.
- Una composición farmacéutica que comprende un péptido sustancialmente puro y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicho péptido está constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24.
-
- 3.
- Un método de preparación de una composición farmacéutica que comprende proporcionar un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24, y mezclar dicho péptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
-
- 4.
- Un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 para su uso en la reducción de los efectos de una enfermedad humana.
-
- 5.
- Un péptido sustancialmente puro de acuerdo con la reivindicación 4, para su uso en la reducción de los efectos de una enfermedad humana, en el que dicha enfermedad humana es una afección seleccionada entre el grupo constituido por nefritis y un trastorno inmunológico.
-
- 6.
- Uso de un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 en la fabricación de un medicamento para tratar una afección seleccionada entre el grupo constituido por nefritis y un trastorno inmunológico.
-
- 7.
- Un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 para su uso en la modulación del sistema inmunitario.
-
- 8.
- Uso de un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24 en la fabricación de un medicamento para modular el sistema inmunitario.
-
- 9.
- Un péptido sustancialmente puro de acuerdo con la reivindicación 7, para su uso en la modulación del sistema inmunitario o el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha modulación del sistema inmunitario es una modulación seleccionada entre el grupo constituido por transformación de linfocitos T in vivo, transformación de linfocitos T mediante ConA in vitro, supresión de la formación de anticuerpos y supresión de células NK.
-
- 10.
- Uso de un péptido sustancialmente puro como suplemento alimenticio, en el que dicho péptido está constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 24.
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