TWI353252B - Biologically active peptide vapeehptllteaplnpk der - Google Patents

Description

丄乃3252 〆 銻 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明涉及短肽及其應用一 -^具體而5，本發明涉及星 有生物活性的短肽。 ,、 【先前技術】 在本領域中已知肽能治療疾病並用作藥物組合物。例 如，美國專利第6, 191 113 恥么開了一種肽，其具有 平滑肌細胞生長的活性並因 此此用於預防和治療與平滑浙 、讀生長相關的病理狀態’例如動脈硬化、血管重建手術 後的再狹窄、血管遷手術 吕移植後的内腔狹窄和平滑肌 6, 184, 208公開τ另_括叫 々 5 4 了另種肽，發現其能調節生理過程，如 上皮生長區域的重量增加活性和毛髮生長。另外，PCT八 開號 W003/〇〇64q?jfa 蓋 击 t，丄 “ 492和美國專利申請第1 0/237,405號提出 某些肽及其藥物纟且合物且亡 嗯、，且口物具有生物活性並能調節免疫應答。 本發明的目的是提供一種具有生物活性的短肽

或肽。 A 發明内容： 本f明的叫固方面涉及衍生自18個氨基酸的肽，該 18個氨基駄包含已發現具有生物活性的〇Μ3_〇ι〇肽 (VAPEEHPTUTEAPLNPK) _ ID N。· 1)，其中所述肽不包 3 CMS G1 0肽。為了進行測試，這些肽可用氨基酸來化 予合成°本發明的另—個方面包括分離或純化的肽，其包

3、自SE：g ID No· 2-31的序列、基本由或由選自SEQ ID N 〇 · 2 - 31的序列如士 , K且成’其中所述肽不包含CMS-010肽的序

5009-7007-PF 5 ⑧ 1353252 歹j (SEQ ID No. υ。另一方面涉及基本上純的包含選自 SEQ ID Ν。. 2'31肽的肽，其中所述肽不包含CMS-010肽 的序列。 、 ID 發月的另—個方面是給藥一種肽，其包含選自SEQ .2 31的序列、基本由或由選自d N〇 2 31 、、=’且成其中所述肽不包含CMS-010肽的序列，其中所 述。藥的效果選自以下組：該組由抑制免疫細胞轉化、抑 j NK 田胞活性、增強NK細胞活性、抑制抗體在體内形 成、抑制細胞增殖、抑制腫瘤生長、抑制腎炎和減輕蛋白 疒、且成在些具體實施方案中，抑制肽細胞轉化為在 體外通過ConA抑制τ_淋巴細胞轉化。在一些具體實施方 〃 抑制免疫細胞轉化為在體内抑制Τ-淋巴細胞轉化。 在t具體實施方案中，抑制細胞增殖為在體内抑制肉瘤 胞的發I纟一些具體實施方案中，抑制腎炎是抑制由 於抗腎表位抗體而造成的腎炎。 本發明的另外方面涉及—種肽，其包含選自s E Q〗D N 〇. 2-31的序列、基本由或由選自SEQ ID N〇 2_3i的序列組 成，其中所述肽不包含CMS-010肽的序列，該序列由卜氨

基鲅組成。在一些具體實施方案中，肽包含選自ID 2-31的序列、基本由或由選自SEQ ID Ν〇· 2_3i的序列組 成，其中所述肽不包含CMS-010肽的序列，該肽是以基本 上純的形式存在。 本發明的另一個方面涉及包含一種肽的藥物組合物， 所述肽包含選自SEQ ID No_ 2 — 31的序列、基本由或由選 5009-7007-PF 6 ⑧ 1353252 自SEQIDNo. 2-31的序列組成，其中所述肤不包含CMS-010 肽的序列。在一些具體實施方案申，包含一種肽的藥物組 合物包含由L- It基酸組成的肽，所述肽包含選自seq ID No 2-31的序列，其中所述肽不包含CMS-01 〇肽的序列。 而本發明的另一個方面是製備藥物組合物方法，包括 提供一種包含選自SEQ ID No. 2-31序列的肽，其中所述 肽不包含CMS-010肽的序列，並且把該狀與藥學上可接受 的載體混合在一起。 Φ 而本發明的另一個方面是降低人疾病影響的方法，包 括給藥藥學上有效劑量的肽’所述肽包含選自SEQ ID No. 2-31的序列’其中所述肽不包含CMS-010肽的序列。在 一些具體實施方案中，所述的人正遭受細胞增殖和/或免疫 失調。在一些具體實施方案中，細胞增殖失調是癌、肉瘤和 /或腫瘤。 本發明的另外一個方面是一種調節個體免疫系統的方 法’包括給藥藥學上有效劑量的肽，所述肽包含選自SEQ ID _ No. 2-31的序列，其中所述肽不包含CMS-010肽的序列。 本發明的另一個方面是一種肚用作藥物組合物的應 用，所述肽包含選自SEQ ID No. 2-31的序列，其中所述 肽不包含CMS-010肽的序列。在一些具體實施方案中，肽 用於治療細胞增殖失調和/或免疫失調形式的疾病狀況。在 一些具體實施方案中，治療的細胞增殖失調是肉瘤。 而本發明的另一個方面是一種肽用作免疫系統調節劑 的應用，所述肽包含選自SEQ ID No. 2-31的序列，其中 5009-7007-PF ⑧ 1353252 所述肽不包含CMS-0 10肽的序列。在一些具體實施方案 中，調節免疫系統為增強或抑制ΝΚ細胞活性。 本發明的另外一個方面是一種肽用作營養補充劑的應 用’所述肽包含選自SEQ ID No. 2-31的序列，其中所述 肽不包含CMS-010肽的序列。 本發明的另一個方面是一種包含增強的肽衍生物的分 子’所述肽包含選自SEQ ID No· 2-31的序列，該分子包 含與所述肽可操作相連的增強的分子，其中增強分子增強 # 所述肽的治療效果並且所述肽不包含CMS-01 0肽的序列。 【實施方式】 已發現具有VAPEEHPTLLTEAPLNPK序列的CMS-010肽

(SEQ ID No. 1)具有生物免疫調節活性（美國專利申請第 1 0/1 78, 684號）並具有可對人類應用的治療潛力。本發明 涉及具有生物活性的CMS —010片段和衍生物。在特定具體 實施方案中，本發明包括片段和衍生物，其序列由SEQ ID No. 2-31給出。在一些具體實施方案中，片段可以替換和 /或添加分子基團，或可以是VApEEHpTUTEApLNpK (CMS-010)的功能衍生物。CMS_〇1〇片段和衍生物的應用包 括調節細胞和組織。CMS_010片段和衍生物能夠包含在藥 物製品和營養補充劑中。 可以理解’像肽及其功能衍生物的氨基或竣基末端 加額外的氨基酸可能作為實施本發明的另—個方法，所 月太包含選自SEQIDN。. 2—31的序列、基本由或由選自s ID No. 2-31的序肋成，其中所述肽*包含⑽

5009-7007-PF 135325.2 列。在這樣的具體實施方案中，肽及其功能衍生物保持了 在此所述的治療或功能性質中的一種或多種，所述肽包含 選自SEQ ID No. 2-31的序列、基本由或由選自SEQ ID No. 2-31的序列組成，其中所述肽不包含CMS-010序列。例 如，在一些具體實施方案中，可以向公開的肽添加一個或 多個氨基酸而不影響其生物學功能。在一些具體實施方案 中，包含 VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010) —些部分的較小 分子包含了衍生自VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)序列的 # 單個延伸鏈。在其他具體實施方案中，包含 VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)—些部分的較小分子包含 了 衍生自 VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)的分離、非連續 部分序列的兩個或多個延伸鏈。例如，在一些具體實施方 案中，包含VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)某些部分的較 小分子包含了在 VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010) N-末端 附近發現的序列以及在VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010) C-末端附近發現的序列，而VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010) • 中的這兩個序列之間沒有發現任何插入序列。在進一步的 具體實施方案中，也可能添加三個或四個氨基酸而仍舊保 持肽及其功能衍生物的功能，所述肽選自由CMS-010 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段組成的組（其中所述片段不包 含CMS-01 0序列）。這些都被稱為同一個肽的變體。另外， 肽衍生物，例如用一個相同功能種類的氨基酸保守替換另 一個氨基酸，這可用於實施本發明的另一個方面。例如， 具有非極性或疏水性側鏈的肽可能用一個側鏈基團取代另 5009-7007-PF 9 ⑧ 135325.2 個而不減少生物活性。在一些具體實施方案中，^〇 月太片可從序列上截去一個、兩個或多個氣基酸而仍舊保 持原肽片段的活性。例如，可以重新合成長度為1〇個氨基 酸的CMS-010肽的片段，其缺失序列1末端的第5個氨基 酸。由此產生的變體長度僅為9個氨基酸，其卜末端的第 4個教基酸通過共價鍵與原序列N_末端的第6個氨基酸相 連並仍具有與原有〗0個氨基酸的肽片段相同的活性。在一 些具體實施方案中，CMS_010肽片段從序列上截去兩個或 多個氨基酸，在該處截去的氨基酸與原肽片段序列的另一 個氨基酸相鄰接。在其他具體實施方案中，從CMs_〇i〇肽 片段序列上截去兩個或多個氨基酸，在該處的氨基酸不與 原肽片段序列的另一個氨基酸相鄰接，而通過保留在截短 的變體肽中的氨基酸來分隔原序列的另一個氨基酸。在另 外的具體實施方案中，從CMS —010肽片段上載去三個或多 個氨基酸，在該處從原肽片段序列上戴去的一些氨基酸與 另一個氨基酸相鄰接，而從原序列上截去的一個或多個氨 基酸不與截短的原序列上的其他氨基酸相鄰接。在本發明 的其他具體實施方案中，連接分子/空間分子序列可以插入 到肽中以形成變體，而變體仍舊保留本研究所用的原始肽 的活性部分》這些也被認為是肽的變體。在此所用的肽類 似物，包括具有能類比天然氨基酸結構的氨基酸分子的 肽，如具有不同骨架結構的類似物、或D_氨基酸替換。如 進一步實例所述，儘管用於合成肽的氨基酸是以其L型光 學異構的形式存在，但是用D-型替換序列中一個或多個氨 5009-7007-PF 10 1353252 基酸，由此而得的肽可具有相似的生物活性。如申請專利 範圍第中所用的術語“功能衍生物，，指的是包括肽的片 段、變體、類似物或化學衍生物。 “基本上純的肽”指純度至少為1 〇%w/w的肽，純度更 優選20%、更加優選40%，並更優選6〇%，並更加優選9〇% 純。在最優選的具體實施方案中，純度大於99% ^基本上 純的狀能用於製備藥物和營養劑型，該劑型可以是如下所 述的複合混合物。 調節 指通過給藥或暴露於本發明的肽來介導的 細胞效應，其中向細胞給藥或暴露肽能造成細胞活性的改 變。該改變可以增強或抑制細胞活性。增強或抑制細胞活 性可以增強或抑制細胞分裂和複製的速率、增強或抑制細 胞與其他成分的反應、和/或增強或抑制細胞中蛋白質或化 合物的產生和/或分泌速率。 “細胞增殖”指増加存在的細胞數量，並且其可以由 細胞的轉化或永生化造成。細胞増殖失調包括，但不僅限 於，癌、良性增生體、腫瘤和肉瘤，並且其可包括任何數量 的細胞。“免疫失調指免疫細胞或免疫系統其他部分的 故障或有害功能。這種失調可由抑制細胞或分子活性或者 增強細胞或分子活性而造成。 進行肽及其衍生物在藥物配方中的應用，其可能用於 治療免疫失調或疾病，所述肽包含選自SEQ ί d N〇 2 31 的序列、基本由或由選自SEQ ID No_ 2-31的序列組成， 其中所述肽不包含CMS-01 0序列。配方中可以有—種狀及 5009-7007-PF 11 丄353252 其讨生物並混合有其他活性或無活性成分，所述包含選自

SEQIDNo· 2-31的序列、基本由或由選自SEQlDNo. 2-31 的序列組成，其中所述肽不包含CMS_〇丨〇序列，所述成分 包括其他肽，如可以將2至幾（如3-5)種肽與或不與其他成 分一起加入到同一配方中。可選地，肽及其衍生物可與不 在此所列的肽一起用於製備配方，所述肽包含選自SEQ ID

No· 2-31的序列、基本由或由選自seq ID No. 2-31的序 列、且成’其中所述肽不包含CMS-0 1 0序列。它們能以靜脈、 肌肉、皮内、皮下或真皮内給藥的方式進行給藥。給藥的 核式也可以是動脈内注射，其能直接通向有問題的器官。 "、他了藥的模式有通過皮膚給藥、吸入粉末或喷霧劑、和 所屬領域技術人員已知的其他遞送形式。配方也可以是口 服給藥的，而且該配方可以包含载體，所述載體能用於防 止口服攝入後胃對肽的消化，或其他現有技術中已知的載 體（例如通過皮膚遞送的載體，如脂質體）。 在此所用的術語“雜合肽”用於指的是肽，該肽包含 插入到具有上述序列的原始生物活性肽或其功能衍生物中 的附加的肽，但實質上仍舊保持相似活性。該附加的肽包 括則導肽，例如，該前導肽包含一種氨基酸序列，所述氨 基齩序列由一種或多種原核或真核細胞識別，識別作將雜 0蛋白質分泌進入外部或細胞中的信號。分泌可以是直接 分泌、或通過分泌囊泡間接進行 在此所用的術語“基本由.·組成，，指一種肽或多肽 -、力此·衍生物，在其羧基和/或氨基末端還有附加的氨基 5009-7007-pf 12 1353252 酸’而且其保持在此提供的所述肽活性中的一種或多種， 所述肽包含選自SEQIDNq. 2_31的序列、基本由或由選 自SEQ IDNo. 2-31的序列組成，其中所述肽不包含cms_〇i〇 序列H如"非限制性的例子所述，Μ及其功能衍生 物的活性為治療和/或預防細胞增殖或免疫失 述肽包含選自SEQ Π) No 2 …丨 « Mo. 2-31的序列、基本由或由選自 SEQ ID No. 2-31的序列組成，其中所述肽不包含cMS_〇1〇 序列，在這種條件下，“基本由特定肽組成”的肽或多肽 及其功能衍生物將具有在此所述的相關肽的治療和/或預 防失調或疾病的活,1·生，而且不會具有任何以下特徵，該特 徵本身（如，通過吸附到一種或多種生物活性分子上來進行 修飾之前)或在其中會實質上減少肽或多肽的治療或預防 細胞增殖或免疫失調的能力，或對肽用作治療和/或預防以 上失調或疾病的基礎和新的特徵造成實質性的改變，所述 特定肽包含選自SEQ ID N〇. 2_31的序列、基本由或由選 自SEQ ID No. 2-31的序列組成，其中所述肽不包含cMS_〇1〇 序列。因此在前述例子中，全長的天然產生的多肽具有除 了治療和/或預防細胞增殖或免疫失調之外的主要活性並 選自SEQIDNo. 2-31的序列、基本由或由選自SEqID No. 2-31的序列組成（但不包含CMS_〇1〇序列），該全長多 肽及其某些功能衍生物並不能構成“基本由特定肽組成” 的肽或多肽及其功能衍生物，所述肽或多肽包含選自_ ID N〇· 2_31的序列 '基本由或由選自SEQ ID No. 2-31 的序列組成，而且所述衍生物的序列包含在全長的天然產 5009-7007-. pp 13 ⑧ 1353252 =的多肽之中。同樣在前述例子中，基因工程肽或多肽具 勺除了治療或預防細胞增殖或免疫失調之外的主要活性但 L括了種肽的氨基酸序列，該種肽包含選自SEQ ID N〇 2 —31的序列、基本由或由選自SEQ ID Ν〇 2_3ι的序列組 :(但不包含CMS，。序列)，該基因工程肽或多肽及其某 些功能衍生物並不能構纟“基本由特定肽組成，，的肽或多 “力此衍生物，所述肽或多肽包含選自SEq u 2一31的序列、基本由或由選自SEQ ID Ν〇 2 —3ι的序列組 成（但不包含CMS-010序列），而且所述衍生物的序列包含 在基因工程肽或多肽之中。 在則述的疋義下，通過利用治療或預防細胞增殖或免 疫失調的试驗來測定肽或多肽的活性，所述活性在此與 VAPEEHPTLLmPLNPK (CMS-G1 G)肽的片段和衍生物有關了

所屬領域技術人員能方便地確定—種基本由特㈣組成的 肽或多肽及其功能衍生物，所述特定肽包含選自卿㈣〇· 2-31的序列、基本由或由選自Sf；Q ID Ν〇· 2 3ι的序列組 成，其中所述肽不包含CMS-010序列。

在優選的具體實施方案中，術語“基本由.組成” 也可以指具有少於5㈣氨基酸殘基的肽或多肽加上特定 肽及其功能衍生物，所述特定肽包含選自SEQ ID n〇m 的序列、基本由或由選自SEQ ID N〇 2 —31的序列組成， 其中所述肽不包含eMS_Q1G序列。在更多的優選的具體實 施方案中’同樣的術語指具有2個氨基酸殘基的肽加上特 疋肽及其功能衍生物，所述特定肽包含選自seq D 5009-7007-PF l4 ⑧ 丄 2 31的序列、基本由或由選自SEQ ID No 2—31的序列組 ’其中所述肽不包含CMS-010序列。在更多的優選的具 案中同樣的術香指具有1個氨基酸殘基的狀加 特定肽及其功能衍生物，所述特定肽包含選自SEQ丨D N〇. Ο ^ η 1 的序列、基本由或由選自SEQ ID Ν〇. 2 31的序列組 成’其中所述肽不包含CMS-010序列。 藥物配方可以包括任何已知的藥物載體。合適載體的 成例包括任何所屬領域技術人員已知的標準的藥學上可接 文的载體。這些包括但不僅限於，生理鹽溶液、水、包括 :由和水混合物或的甘油三酯乳劑的乳劑、以及其他類型的 j劑、填充劑、包裹的片劑和膠囊。合適的載體可以根據 樂物組合物的給藥模式來選擇。 込自以下組的肽及其功能衍生物可以通過靜脈注 射’肌肉注射，藤妒；、、*自. 主射’皮下注射’和皮下植入來給藥： 所述組包含選自SEQ ID No ? w t ,. 〇· 2-31的序列、基本由或由選 自SEQ ID No. 2-31的庠列細孑甘+ 序列，成，其中所述肽不包含CMS-010 列。肽也可以通過口服給藥形式來給藥像片劑、膠囊、 懸洋液、溶液等，其以不經修改的常用形式或以緩釋形式、 或其以具有或^具有胃腸保護的形式給藥。肽可以在或不 ，辅助穿過皮膚的裝置的幫助下，進-步以局部應用的任 何形式來使用，像荦客、切1 t 1 像樂月、礼〉由、凝膠等。肽也可以以 身或與其他肽序列連接的方式’被翻譯成其基因序列並 隆Ο到表達系統中，從而產生最終的肽分子，用於在 此所述的肽活性的應用中。

5009-7007-PF 15 135325.2 每種肽的劑量可以是每kg體重1 ng - 1 〇g。對於注 射給藥模式來說，優選的劑量是每kg i〇ng - i〇mg，更優 選的是每kg 1μβ - img。可是，由於一種或多種肽通過受 體來起作用’而受體會誘導正常生理應答的級聯反應，所 以有效劑量能夠低至每kg體重lng。可選地，一種或多種 月太正好能作為完整級聯反應的引發劑。對於口服攝入來 s兒’給藥量可以是每天每kg體重lng — 1〇g，優選是每天 每kg體重〇. 1叫-lg，更優選的是每天- 1〇mg。 11 _ 基因治療及治療方法 通過设§十編碼這些肽中之一的核酸序列來進行基於上 述肽序列的基因治療。可以化學合成該核酸並可操作地與 啟動子相連，並克隆進表達載體中。然後以在人細胞中表 達的基因治療的形式，向人體給藥該表達載體。在此所用 的術語“基因載體”包括這些表達載體。能用於基因治 療的載體包括腺相關病毒（Mizuno, M•等（ 1 998). Jpn J Cancer Res 89，76-80 )、LNSX 載體（Miller，A. D.等 (1993) Methods Enzymol 217, 581-599)和慢病毒 (Goldman， M. J.等（ 1 997) Hum 以⑽ g 226卜2268)。 ’ 其他用於肽遞送的媒介包括編碼所需肽的表達載體， 該載體能轉移入生物體中，該生物體能在宿主生物中複 製，在對宿主生物健康沒有顯著有害影響的情況下，可向 其給藥該肽。例如’表達載體可轉移入生物體t，該生物 5009-7007-PF 16 ⑧ 135325.2 體不是要向其給藥該肽的宿主生物的病原體。在一些具體 實施方案中，表達載體在細菌或真菌中產生所需的肽，該 肽並不對向其給藥該肽的宿主生物的健康產生顯著有害影 響。例如，編碼所需肽的表達載體可以是一種在諸如乳酸 菌、E. Col i、或酵母的生物體中產生所需肽的表達載體。 在一個具體實施方案中，在哺乳動物腸裏面常發現的微生 物或哺乳動物消化道耐受性微生物中，表達載體產生所需 的肽。在其中能表達所需肽的一些微生物物種包括，但不 後帳於，Lactobaci 11 us 菌後，例如 L. aci dophi I us, L. amylovorus, L. casei，L. crispatus，L. gallinarum, L. gasseri, L. Johnsonii, L. paracasei, L. plan tarum, L. reuteri，L. rhamnosus 氣实他嵐後Bifidobacterium 菌種，例如 B. ado 1 escentis，β. animalus, B. bifidum, B. breve, B. in f antis, B. 1 act i s，B. Ion gum 或其他 菌種; Enterococcus faecal is ^ En t. faci um\

Sporolactobacil lus inulinus\ Bacillus subti1 is 或 Baci 1 lus cereus·，Escherichia coli ·, Propionibacterium freudenre i chi i; 或 Saccharomyces cerevisiae 或

Saccharomyces bou1ardii 。 編碼本發明任何肽的核酸序列，可化學合成或由其他 方式產生，其包括但不僅限於mRNA反轉錄以產生cDNA分 子，該核酸序列整合進表達載體中，用以通過所屬領域技 術人員熟悉的基因工程方法將基因轉移入所需的生物體 中。表達載體可以是DNA載體或RNA載體。例如，表達載 5009-7007-PF 17 ⑧ ·2 7可以疋以質粒或病毒基因元件為基礎的。表達載體可以 疋在木色體外複製的載體或整合進染色體的載體。 表達載體包含-種與編碼本發明肽的核酸可操作相連 的啟動子。啟動子可以是可調控的啟動子，如誘導型啟動 子，或組成型啟動子。在一些具體實施方案中，可以選擇 啟動子從而獲得所希望的肽表達水平。另外，如果需要， 表達载體可以包含其他序列以促進肽的產生、提呈和，或分 4 °在—些具體實施方案中’編碼本發明肽的核酸可操作 地與指導肽分泌的核酸序列相連。例如，編碼本發明肽的 核酸可以可操作地與編碼信號肽的核酸相連。 在一些具體實施方案中，工程生產的能編碼本發明肽 的表達載體可以是適合在細菌菌種中表達本發明肽的表達 載體’該細菌菌種構成了哺乳動物腸中的普通菌群，如 actobacillus Bac 111 us subt i 1 i s ° H ^ ^ ^ 體的實例可分別在Casas的美國專利第6,⑽，號和 ini的第5,728,571號中找到。這些文獻全文併入本 文作為參考。能夠理解可以使用任何能幫助本發明狀表達 的表達載體，表達在向其給藥該肽而並不顯著有害影響其 健康的宿主生物中進行。 在二具體貫施方案中，工程生產的能編碼本發明肽 的表達載體可以是適合在酵母菌種中表達本發明肽的表達 載體，該酵母菌種很能耐受哺乳動物腸道，如 Sacchar⑽yces cerevisiae; i眚隻，sacchar⑽yces 如其能在人腸中繁殖並用於治療某些形式的腹 18

5009-7007-PF ⑧ 1353252 瀉。酵母表達载體能用於進行組成型地表達異源蛋白質和 肽’該載體高度穩定’因而能在有絲分裂和減數分裂期間 很好地傳遞到後代細胞中，並可以包含信號肽或能指導重 組蛋白高水準分泌的肽的编碼序列。這種酵母載體的實例 如Jang #的美國專利第6,391,585號所述，其全文併入 本文作為參考。 編碼本發明肽的表達載體可以導入到生物體中，在生 物體中通過現有已知的技術來表達肽。這些技術包括傳統 的方法，例如，轉化細菌、酵母或其他微生物，通過應用 化學耐久性的細菌細胞，電穿孔或醋酸鋰轉化（針對酵母）， 以及近期在抗這些過程的細菌菌種的轉化方面的進展。在 一些具體實施方案中，用Leer事（w〇 95/35389)公開的方 法，表達載體可導人到已知抗轉化的乳酸菌中，該文獻全 文併入本文作為參考。導入的序列可以整合在微生物染色 體MA中或可以仍作為染色體外的_元件。

’’’、後將°玄包含表達載體的基因工程微生物接種到消化 道、陰道、氣管等中以獲得持續的免疫治療。在一些且體 實施方案中，以失活的彡 的形式或優選以活體形式來攝取表達 本發明肽的生物體。在藤φ，^ 在腸中這些微生物產生所述肽，通 過分泌或通過微生物的玄结 /函作用將它們細胞腔中，或用其 他方式將肽提供給宿主， 主以此狀對宿主生物產生它們所希 望的效應。在其他具體訾 a , 體實施方案中，肽提供給宿主，加在 鼻孔、陰道或小腸的枯 體用 另一個治療方法是將脂質 作把特定核酸遞送到人

5009-7007-PF 體細胞的工具。如Gao，X·和Huang, L. ( 1 995)的Gene Ther 2，71 0-722和US 6, 207, 456所述，核酸（例如包含 為碼肽及其功能衍生物的核酸序列的表達載體，所述肽包

a選自SEQ ID No. 2-31的序列、基本由或由選自SEQ ID Ν〇· 2-31的序列組成，其中所述肽不包含cMS_〇1〇序列） 被遞达到促進細胞攝取和染色體整合的環境中。可選地， 利用如US 6, 245, 427所述的方法，能用脂質體將肽包入膠 囊中直接遞送。上述所有公開的科學文獻和專利全文併入 _ 本文作為參考。 上述可用於基因治療和治療方法的核酸序列包括編碼 這些肽及其功能衍生物的序列。基於簡並密碼子系統，可 用大量核酸序列中之任一來編碼這些肽及其功能衍生物。 以下文獻全文併入本文作為參考。

Principles of Pre-clinical Research of New Drugs > 中華人民共和國.1993，7:134_135Shuyun Xu，Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological ® exPeriment_ 人民衛生出版社.1991，1221-1234 2. Principle of new drug research in pre —clinic,由中 華人民共和國衛生部頒佈.1 9 9 3, 7 : 1 4 〇 3. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6): 356-358 4. Qian Wang. Modern medical experiment method.人民 衛生出版社.1 998，482-483 5009-7007-PF 20 1353252 5. Principle of new drug research in pre-clinic,由中 華人民共和國衛生部頒佈.1 993，7: 141 6. Principle of new drug research in pre-clinic,由中 華人民共和國衛生部頒佈.1 993，7: 132-133 7. Principle of new drug research in pre-clinic,由中 華人民共和國衛生部頒佈.1 993, 7: 1 28-1 29 8. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmalogical experiment (第二版）人民衛生出版社· 1 998，137-138 9. Jiatai Li，clinical pharmacology(第二版）·人民 衛生出版社· 1 998，1 338-1 339. 111.與特定fl太及其功能衍生物結合和配伍的叶，所述特定

肽包含選自SEQ IDNo. 2-31、基本由或由選自SRQ TD Μ二 2-31組成__其中所述片段不包含CMS-01 0年而丨、 本發明的生物活性肽可與其他生物有效或有用的分子 結合以提供額外效應或應用或增強它們的治療效果。許多 潛在的結合分子、它們的生物效應和將分子連接到肽上的 方法都是現有技術中已知的。對於其他候選結合體，所屬 領域技術人員不需要過度的實驗就能推導出當時結合其他 肽的化學反應。以下將描述有效的分子。也描述了特定實 例，即本發明所述的各種肽如何與有效的分子相結合以及 由此而產生的結合產物的生物學性質。可以理解當前發明 的其他肽也可以用相似的反應來結合。 肽片段及其功能衍生物能對特定細胞或組織類型起顯

5009-7007-PF 135325.2 者的治療效果，所述肽包含選自SEQ lD N〇 2 基本由或由、g .231的序列、 戈：選自SEQIDNo· 2-31的序列組成其中所述肽 重：二I CMS~〇1°序列。將分子與狀藥物相結合的-個 區域。用=㈣向到正在治療的個體身體的料位置或 織類型的 式，肽藥物及其效果可以集中在細胞或組 € 位置上’而該位置正是期望取得治療效果的位 ::法能夠增大用相似摩爾量的游離、未結合肽所取 :旦。反之’靶向於其治療活性位點的結合肽藥物的 “-.、、員者低於以藥物的游離、未結合形式 所需的劑量。 '〜將藥物&向至t需要其活性的位元點上的另一個有 盈效果是減少不想要的副作用。^ 了使得特定細胞或組織 類型改變而進行給藥的肽藥物也可作用於個體的其他位 置，有時候會帶來有害結果。通過結合到乾分子上從而將 肽乾向至所希望的活性位置，可以減少個體中在其他地方 的肽濃·度及由此造成的副作用。 肽及其功能衍生物可以與各種分子相結合以靶向到遍 及個體全身的不同位置上，所述肽包含選自SEQ ID No. 2-31的序列、基本由或由選自SEQ ID Ν〇. 2_3ι的序列組 成，其中所述肽不包含CMS-0 10序列。以下所述的將肽靶 向至所需位置的任何結合技術以及所屬領域技術人員所熟 悉的其他結合技術可以用本發明的肽來實施。例如，已論 證了可將抗乙型肝炎藥物向肝細胞的選擇性遞送 #，Ital J Gastroenterol Hepatol, 29(3):275, 1997 其 5009-7007-PF 22 135325.2 全文併入本文作為參考）。在該研究中，研究人員將腺嘌呤 阿拉伯糖苷單磷酸（ara_AMp)，_種具有抗乙型肝炎病毒活 性的磷酸化的核苷類似物，結合到乳糖氨化的人白蛋白 上’ 一種半乳糖基末端的大分子。肝細胞表達一種受體蛋 白，其高度親和性地與有半乳糖末端殘基的物質相互作 用。通過結合該受體，肝細胞可選擇性地攝取結合的藥物。 吸收之後，將結合的藥物遞送到溶酶體中，在溶酶體中結 合藥物兩個成分之間的鍵斷裂，以其活性形式釋放出 ara-AMP。在以上引用的研究中’結合的藥物與游離的 ara-AMP對於治療慢性乙型肝炎感染的患者都同樣有效， 4s的蕖物不會造成臨床上的由游離給藥造成 的副作用，如神經毒性。這種方法能與本發明的肽—起使 用0 在與以上研究相關的由相同的研究小組進行的研究 (Di Stefano #»Bi〇chem. Pharmacol., 61 (4):459, 2001 ) 中為了將化合物粗相至肝並治療肝微小轉移，將抗癌化 干m療背I，5-氟2-去氧尿苷（FUdR)，與半乳糖基末端的聚

L—賴氨酸相結合。肝細胞選擇性地攝取該藥物，並使FudR 和乾分子之間的鍵齡 aj ,.,. 鍵斷裂。然後一部分游離的FUdR會離開 肝細I並產生出達到局部治療濃度的抗癌劑。該濃度足以 達J 十對β透入肝臟的轉移性細胞的治療活性。因為藥物 在肝臟中選擇性地隼φ 〃 ’所以結合藥物的劑量顯著低於游 離未口的化合物的最小藥物活性劑量。該策略可與本 發明的肽一起使用。如丄⑽ 例如將乳糖氨化的聚L-賴氨酸與肽及

5009-7007-PF 其功此竹生物相結合可顯著減少治療或預防 曰殖失調所必需的劑量，所述肽包 2-31的序列、基本由或由選自SEQ 。· 成(其中所述狀不包…10序列)广·2,的序列組 合物二不同細胞或組織類型來說’已經能實施將化 在：面上表内達？:胞或_，例如 素、-體……準的肽激素受體，例如韓娃皮 〜S，敫㈣放激素、以及生長激素抑制素。在一項研 九中，通過把藥物與牡㈣（octreotide)結合，一種生 長激素抑制素類似物，抗癌化合物paelitaxel(紅豆杉醇） 被選擇性地乾向至高密度表達生長激素抑制素受體的激素 为泌性腫瘤細胞。牡螺脊（octreotide)結合的紅豆杉醇 與游離的紅豆杉醇—樣有效’但減少了對正常細胞的毒性 (Huang #，Chem. 7(7):453, 2000) 〇 Huang 等的技術將本發明的肽與肽激素受體激動劑類似物結 合，會！生出特異性乾向表達高水準特定肽激素受體的細 胞的治療方法。該方法能適於靶向過量表連任何肽激素受 體的細胞。在另一個將藥物靶向至特定組織類型的實例 中，聚（L-天冬氨酸）用作載體分子用以特異性地靶向藥 物遞送至結腸細胞（Leopold筝，j. Pharmac〇kine = Biopharm.， 23(4):397, 1995)。 除了將肽藥物特異性乾向至特定細胞或組織類型，將 肽及其功能衍生物結合到載體分子上能提供另一種增強月太 藥物遞送的方法’從而增加或以其他方式增強它們的治療 5009-7007-PF 24 135325.2 效果’所述肽包含選自SEQ ID No. 2-31的序列、基本由 或由選自SEQ ID No. 2-31的序列組成（其中所述肽不包含 CMS-010序列）。下述任何的結合技術以及所屬領域技術人 員热悉的其他技術可以和本發明的肽一起使用。如果化合 物不能被有效地遞送至其靶位，則會限制藥物的效果。由 於代謝過程或降解，必須積極地或以其他方式將藥物傳送 至其活性位點，而基本不失去活性。肽藥物易受肽酶影響， 而且多電荷分子難以穿過脂質的細胞膜和内皮細胞膜例 • 如血腦屏障。與其他分子的結合提供了一種方法，其防止 肽降解並增強肽藥物吸收進通常將排斥該化合物的細胞或 解剖學區域。 結合技術通過使肽進入通常其會被排斥的體内位置， 就能開發出給藥藥物的新途徑。在Patel事’

Bioconjugate Chem.’ 8(3):434，1 997 中，其會在實施例 5中詳述並將其全文併入本文作為參考，其中，研究人員 將已知為強止痛劑的肽藥物，de丨t〇rph丨n七肽，連接到特 *意設計使肽穿過血腦屏障的有機分子上。該方式使藥物可 進行靜脈給藥，而不必腦腔内注射。 在Pate 1事中所述的载體分子被設計能特異靶向那 些包含血腦屏障的内皮細胞，並使得該肽穿過該屏障。包 括血腦屏障的遍及全身的内皮細胞膜根據序列特異性和出 現在其表面的膜結合内肽酶的濃度而表現出異質性。分子 設計利用了該特點而能使載體分子及其運載體進行靶向。 包含三個脂肪酸鏈的分子，其自由端能用Arg_Pr〇二肽包 5009-7007-PF 25 1353252 蓋’優選其與血腦屏障的内肽酶相互作用。然後能用親脂 的脂肪酸鏈運輸帶電荷的肽藥物分子。因此，二肽包蓋的 甘油三酯分子通過靶向運輸穿過血腦屏障。 結合方法也能增強肽藥物活性的動力學效應。用特定 ，月太及其X力能衍生物f施任何下述增強肽活性動力帛效應的 , 口技術以及其他所屬領域技術人員熟悉的結合技術，所 述特定肽包含選自SEq ID Ν〇· 2_31的序列、基本由或由 選自SEQ ID Νο. 2-31的序列組成（其中所述肽不包含 CMS 〇 1 〇序列）。pate丨事發現止痛肽的結合形式不僅能 =血液進入大腦，而且相對於游離肽能持續作用。靜脈給 樂的藥物相對於顱内注射的游離肽，需要更長時間才能有 =效，但效果持續更久而且減少得更慢。研究人員發現結 合肽分子在灰清中非常穩定，並不在腦腔内注射時起作 用/這顯示載體分子可能降解了並在其從血液中運輸到大 Z中時被去除了。他們懷疑運輸結合體和降解載體分子所 鲁t的時間是動力學改變的原因。無論延遲的機制，在臨床 ^面，結合肽分子的靜脈穩定性以及推遲作用發生和藥物 效果活性代表了其可較不頻繁地給藥。較不頻繁和由此造 成的更方便的服藥計晝增加了藥物作為治療選擇的實踐價 值。 ,·正如所屬領域技術人員所顯而易見的，Patel #的技 術和過程易適於遞送任何有限大小範圍内的狀，包括本發 明的任何肽。例如，本發明治療和/或預防細胞增殖或免疫 失調的肽，如 VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)片段，可結 5〇〇9-7〇〇7-pf 26 ⑧ 135325.2

合到Patel I所用的相同分子上。在感染了影響大腦疾病 的個體的治療方法中，結合分子會使VApEEHpTLLTEApLNpK (CMS-010)片段從血液進入大腦並使 VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)片段對腦中的細胞或組 • 織發揮其作用。改變載體分子靶向的修飾對技術人員來說 . 也是顯而易見的。載體分子的靶向特徵是識別包含包蓋在 脂肪酸鏈末端的二肽中的兩個氨基酸的功能。二 肽優選與在在血腦屏障的内皮膜表面上發現的膜結合内肽 _ 酶相互作用。其他内皮細胞和膜能潛在地由其他二肽組合 所乾向。 研究人員也用結合來產生肽藥物，該藥物能有效從消 化道或經由皮膚而吸收。任何下述增強吸收的結合技術以 及其他所屬領域技術人員熟悉的結合技術可用于增強肽及 其功能衍生物的吸收，所述肽包含選自SEQ ID No. 2-31 的序列、基本由或由選自SEQ ID No· 2-31的序列組成（其 中所述肽不包含CMS-010序列）。Kramer事描述了 一種將 _ 肽藥物偶聯到膽酸的過程。相對於單獨使用肽，口服遞送 化合物後的結合分子的吸收率顯著增強了（J. Bi〇i. chem. 269(14): 10621，1994)。為了增加吸收率並增強抗癌肽向 其活性位點的遞送’ Toth # (J. Med. Chem., 4 2 ( 1 9 ) : 4 01 0， 1 9 9 9 )描述了將具有抗腫瘤性質的肽藥物 結合到氣基酸脂（L A A)或糖脂上（L S)。在他們的研究中，表 現出強抗增殖性並具有減弱藥物動力學效應的生長激素抑 制素衍生物與LAA或LS相結合。由此產生的結合藥物增強 5009-7007-PF 27 135325.2 了穿過皮膚和腸上皮細胞的吸收狀況並增加了抗降解性， 而仍舊保持了抗腫瘤細胞的活性。這些技術與本發明的肽 結合在一起時會非常有用。通過增加分子穿過腸上皮細胞 的吸收率’能將更多肽遞送到血液中並對治療的個體發揮 其作用。 結合也可用於提供一種持續釋放的肽藥物。任何帶來 持續釋放效應的結合技術以及其他所屬領域技術人員熟悉 的結合技術可用於提供一種持續釋放的肽藥物及其功能衍 • 生物’所述肽包含選自SEQ ID No. 2-31的序列、基本由 或由選自SEQ ID No. 2-31的序列組成（其中所述肽不包含 CMS-01 0序列）。參見以上pate 1事的工作，用結合的方法 能實現肽藥物的持續遞送。其他例子有K i m事的工作 (Biomaterials，23:23 1 1，2002)，其中在裝入可生物降解 的聚（乳酸-乙醇酸）（PLGA)微球微膠囊中之前，重組人表 皮生長因數（rhEGF)與聚乙二醇（PEG)相結合。有幾組人員 利用PLGA微膠囊遞送各種生長因數和成形蛋白（Meinei 鲁 事 ’ J· Controlled Rel.，70:1 93，200 1 )。相對於未結合 的、游離的rhEGF，通過結合到PEG上，在用plga形成膠 粒期間，rhEGF變得難以形成能用水溶解的凝集物並吸附 到水-有機相介面。具有結合激素的配方的藥物動力學效應 增強了，顯示比游離激素更持久、更穩定並總體上更高的 樂物活性’研究人員推測运是由於結合了 PEG的激素增強 了物理穩定性而造成的。相似的策略可用來產生持續釋放 本發明肽的配方。例如’參見下述實施例1，特定的 5009-7007-PF 28 ⑧ 1353252 VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)片段和衍生物顯示出了強 抗增殖和免疫調節的效應。通過將PEG結合到該肽上並將 結合藥物裝入PLGA微球中，在作為藥物服用時， VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)片段和衍生物的抗增殖和 免疫調節的效應能更持久並更穩定，其從其PEG結合體中 釋放出來，會變得更平緩，這確保了將肽藥物向感染位點 更恒定的遞送。 延長I太藥物的釋放能顯著增強其活性》任何下述帶來 • 肽延長釋放的結合技術以及其他所屬領域技術人員熟悉的 結合技術可用于提供一種延長釋放的肽及其功能衍生物， 所述肽包含選自SEQ ID No. 2-31的序列、基本由或由選 自SEQ ID No. 2-31的序列組成（其中所述肽不包含cMS_〇1〇 序列）°01dham # (Int. J. 〇ncology，16:125，2〇〇〇)比 較了抗癌劑paclitaxel與一種該藥物的新形式，結合到聚 (L-谷氨酸）上的 paxlitaxel (pG_TXL)。pG_TxL 相對於游 離的pacliUxei，似乎具有更高的抗腫瘤活性，暗示該藥 籲物具有更好的藥物動力學性質或甚至可能有更好的作用方 式。可是，調研人員發現PG —TXL通過與游離藥物相同的作 用機制來發揮其作用，包括通過干擾微管亞基聚合使細胞 週期停滯。該證據暗示了結合藥物更好的抗腫瘤活性是由 來自結合體的游離藥物的持續並穩定的釋放而引起的，相 對於給藥游離肽，其能更長期地保持了其治療濃度。給本 發明具有感染抗性的肽添加聚(L_谷氨酸)尾也可增強該性 質0 5009-7007-PF 29 ⑧ 1353252 礞 在-些情況下，肽的酶降解可降低狀用作藥物的效果 ㈣下述減少狀酶降解的結合技術以及其他所屬領域技術 人員熟悉的結合技術可用於降低肽及其功能衍生物的酶降 解，所述肽包含選自SEQ ID No. 2-31的序列、基本由或 由選自SEQ ID No. 2-31的序列組成（其中所述狀不包含 CMS-〇1G序列）。研究人員已開發出許多方法以防止狀被腸 内腔分泌的蛋白酶以及膜結合肽酶降解。後者被發現在所 有轴膜組織的表面上，通常肽藥物的進入途徑就是穿過該 表面。Bernk〇P-Schurch 事（JDrugTarget.，7:55 i 999) 報導了產生包含胃蛋白酶抑制劑的駄藥物配方。抑胃狀類 似物與枯膜吸附的聚合物共價結合；該新胃蛋白酶抑制劑 包含在包含胰島素的片劑中。在刺激消化的實驗室條件下 口養之後，對照片劑中的所有胰島素都被代謝了，而包含 :制劑的片劑中的約5〇%騰島素沒有被降解。在另一個研 =中，同一個組以通常會造成毒副作用的劑量，利用蛋白 :抑制劑來抑制生物活性肽的降帛（―p_Schnurch :AdV’DrUg Del· Rev.，52:1 27，2001 )。該方法利用了 :聚糖，一種與纖維素相關的氨基多糖，其提取自幾丁質， 要在曱设類和其他生物中發現的結構多糖。通過 沾蛋白酶抑制劑結合到殼聚糖上並在月太藥物配方中包括該 結合分子，路 t .，、'員者抑制消化道蛋白酶，增加了肽的生 物利用度而；;& * _ _ ’个座生用游離蛋白酶抑制劑給藥所預計產生 的副作用。/七七 _ 研九中，單獨和與殼聚糖載體結合而聯合 使用^午多辱》 夕白酶抑制劑。通過結合某些蛋白酶活性所需的 5〇〇9-7〇〇7_ρρ 3〇 ⑧ 1353252 金屬輔助因數，殼聚糖-EDTA結合物也可抑制内源性蛋白 酶。如所屬領域技術人員所能顯見的那樣，能夠產生大量 可此的載體分子與效應部分的結合以提供對肽配方有益的 性質，這些技術都能容易地適合與本發明的肽一起應用。 通過用、’.Q a 了滅聚糖的蛋白酶抑制劑來產生口服遞送肽的 配方，口服遞送本發明的肽能替代肌肉注射而應用。該方 法並不排除在該配方+使用更容易吸收的、結合形式的肽 及，功能衍生4勿（如上一段所述）^生該M及其衍生物 更高水準的生物利用度，所述肽包含選自SEQ ID No. 2-31 的序列、基本由或由選自SEQ ID N〇. 2_31的序列組成（其 中所述肽不包含CMS-0 1 〇序列）。 除了通過另一個分子靶向至一個位置，肽本身就能用 作無向刀子。任何下述用肽將分子乾向至所需位置的結合 技術X及其他所屬領域技術人員熟悉的結合技術都可與特 定肽及其功能衍生物一起使用，所述特定肽包含選自SEQ No. 2-31的序列、基本由或由選自SEQ ID Ν〇. 2_3ι 的序列組成（其中所述肽不包含CMS-010序列）。例如，研 九人員使用抗癌藥物二氟甲基鳥氨酸（DFM〇)並將其結合 到能起靶向作用的肽上。DFM〇是高度細胞度性的試劑，其 能有效地殺死各種腫瘤細胞類型。可是，由於它很快在體内 被’月除’因而限制了它的治療價值。在該研究中，dfm〇結 σ到α促黑激素的特定片段和包含2個氨基酸替換的片段 類似物上’所述類似物顯示出能優先與人黑素瘤細胞系上 的促黑激素受體結合（Suli_Vargha事】叩訂爪Sci， 5009-7007-Pf 31

m 97)為了用氨基肽酶來幫助來自肽片段的DFMO 物，„:、物可與狀的N—末端相結合。研究人員發現結合藥 物比早獨使用未結合的藥物更能有效地殺死黑素瘤細胞。 本發明肽的效果部分可歸因於肽本身固有的乾向能 ~ α促黑激素片段相似，本發明的特定肽可與 殊類型細胞表面上發現的某些受體結合。通過將該肽 用作結合體，筚物w ^ y 的細胞位置上：向至那些用該藥物治療的個體體内 作、。。體的肽能提供除了乾向之外的功能。任何下 2增強肽治療效果的結合技術以及其他所屬領域技術人員 ㈣可用于增強特⑽及其功能料物的治療 效果，所述特定肽包含選自SEQIDN。· 2_31的序列、基 =由或由選自卿IDN。. 2_31的序列組成（其中所述狀不 匕3 CMS 〇1〇序列）。Fitzpatrick事通過利用兩個分子 間的肽空間結構來改進結合的抗癌試劑（Ant i㈣

Design’ 1〇:1’ 1 995)。已經將氨子嗓吟結合到人血清白蛋 广（HSA) ±用以增加腫瘤細胞對其的攝人並增加其抗腫瘤 胞的活性。一旦由細胞攝取，溶酶體中的酶便使一些氨 曱噪％從結合體中釋放出來’然後便能發揮其細胞毒性效 應通過在氨甲喋呤和易由溶酶體酶消化的HSA之間插入 4個氨基酸接頭肽，便在細胞中從結合分子上產生了大量 活性虱甲喋呤。本發明的肽可以通過與特定酶的特異性作 用來揮其效應。通過將本發明的狀整合進結合分子以用 作藥物及其载體分子間的接頭片&，或另加其他接頭片 5〇〇9-7〇〇7-ρρ 32 I35325.2 段’從而能改變其藥物動力學效應。該方法能產生一種前 藥’該前藥更抗或更易受蛋白酶活性的影響，其最終減小 或増加結合體中藥物分子的釋放率。參見如上述化學治療 。式劑的結合實例’改變該藥物分子的遞送率能大大增強藥 物的效果。

藥物對特定細胞的效果可根據其他因數而改變，例如 細胞的活化狀態或在細胞中或其附近其他分子信號的存 在。在某些情況下，為了使藥物具有效果，就需要存在其他 分子或信號。Damjancic 事(Exp. Clin. Endocrin., 95 · 315，1 990)研究了人排泄腔促尿鈉排泄肽（hANp)對内 源糖皮質激素缺乏综合症患者的影響。在停止糖皮質激素 治療期間或在接下來用地塞来松治療的恢復期間，向患者 給藥該肽。僅在伴隨地塞米松治療期給藥肽激素時，患者 才對hANP有反應，增加了多尿現象和鈉排泄。在停止糖皮 +質激素治療期間用hANP治療是無效的。類固醇激素同時給 藥的效果也能增強肽的活性eZhu #(ActaPharm. sinid 28:1 66，1 993)報導，通過小接頭片段與氫化可的松結合，’ 止痛肽ky〇torphin (KTP)的活性相對於肽單獨作用顯=增 強了。用氫化可的松單獨給藥沒有觀察到效果。 B 這些研究的結果表明類固醇激素用作結合分子或用作 配方中成分的能力能使得或增強生物活性M的活性。本發 明任何的肽也可以通過結合或與類固醇激素共同使用來調 節或活化。Zhu事的技術易適用於結合類固醇分子盥本發 明的肽。第！至5圖也提供了示例的逐步合成反應來連接 5009-7007-PF 33 1353252 類固醇激素與本發明的任何肽。 上述實例提供了增加本發明肽有效性和活性的示範性 方法。本領域的進一步發展將幫助克服障礙從而產生有效 的基於肽的臨床治療方法。如所屬領域技術人員顯而易見 的那樣，開發出的應用於肽生物化學、藥學研究和臨床測 5式中的技術、試劑和規程都能方便地應用于任何本發明 肽上。 實施例 預計在 VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)序列中，一些 氨基酸比起另一些對生物活性更重要。在一些本發明具體 實施方案中，通過找出VApEEHPTLLTEAPLNPK (CMS 一 〇1〇)中 的活性部分/多個部分，可以去除那些不對肽活性起作用的 序列中的氨基酸’從而能使生物活性分子變得更短。重組 狀的不同活性部分也能獲得新的具有改變了的生物活性的 狀分子。截短生物活性肽分子具有生物和經濟意義。通過 用較短的序列’能修飾肽的生物性質而且這些修飾可具有 潛在的治療優勢，例如改變生物半衰期、受體親和性、或 副作用狀況。更短的肽生產也更便宜，因而能降低生產成 0 為 了確定 VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)中的活性部 为’我們進行一系列截短實驗。在從氨基端至羧基端的每個 狀鍵處截短CMS-01 0。我們預計假如截在活性部分，則由 5009-7007-pp 34 ⑧ 1353252 此產生的部分肽的生物活性將會減小、消失或以一些方式 而改變（生物活性活化/失活）。在CMS-01 0中定位活性部 分/多個部分之後，可以通過不同活性部分的組合來構建一 套新的肽。 用我們的實驗鑒定了一套截短或重組的肽是否具有潛 在治療人或生物學應用的生物活性。該套肽如以下表1所 列。在表 1之後的實施例中將報導我們的發現。 表1:基於CMS-010序列的裁短或重組的肽

肽 序列 SEQ ID No. CMS-010.02 APEEHPTLLTEAPLNPK 2 CMS-010.03 VAPEEHPTLLTEAPLNP 3 CMS-010.04 PEEHPTLLTEAPLNPK 4 CMS-010.05 VAPEEHPTLLTEAPLN 5 CMS-010.07 VAPEEHPTLLTEAPL 6 CMS-010.08 VAPEEHPTLLTEAP 7 CMS-010.09 EHPTLLTEAPLNPK 8 CMS-010.il HPTLLTEAPLNPK 9 CMS-010.12 VAPEEHPTLLTE 10 CMS-010.13 PTLLTEAPLNPK 11 CMS-010.14 VAPEEHPTLLT 12 CMS-010.15 TLLTEAPLNPK 13 CMS-010.16 VAPEEHPTLL 14 CMS-010.17 LLTEAPLNPK 15 CMS-010.18 VAPEEHPTL 16 CMS-010.19 LTEAPLNPK 17 CMS-010.20 VAPEEHPT 18 CMS-010.21 TEAPLNPK 19 CMS-010.22 VAPEEHP 20 CMS-010.23 EAPLNPK 21 CMS-010.24 APLNPK 22 CMS-010.25 VAPEEH 23 CMS-010.26 PLNPK 24 CMS-010.27 VAPEE 25 CMS-010.28 LNPK 26 CMS-010.29 VAPE 27 CMS-010.31 NPK 28 35

5009-7007-PF 135325.2 —'—1 CMS-010.32 VA 29 ___ CMS-010.103 VALLT 30 ___ CMS-010.105 VANPK 31 ___ 實施例 1 g太針由ConA體外誘導的小鼠 1.1 材料 1. 1. 1 肽 涉及的所有氨基酸都是L型的：cs Bio Co.，美國 1. 1. 2斜照和其他試劑 鹽水：OTSUKA Pharmaceutical C〇.，Ltd,中華人民 共和國。RPMI-1 640培養基和胎牛血清（FBS) : Gibcol Co.，美國.MTT 和 ConA : Si gma C〇.，美國 1.2 動物 BALB/c 小鼠（H-2d，SPF，6-8 周大，體重 18-22g):軍 事醫學科學院，中華人民共和國。 1· 3 方法m 在無菌條件下從健康小鼠中分離出脾並用注射針人工 將其打散於10%FBS RPMI-1 640溶液中。打散的細胞懸浮 液進一步從100-規格的15〇μιη直徑的不銹鋼濾網中過濾。 脾細胞懸浮液調成密度為4xl〇Vml並以1〇〇μ1/孔的量等 刀到96孔細胞培養皿上。將肽溶解在普通I _ 164〇令。 以如下形式設計分組。 脸1〇〇μ1肽操作溶液+ 75μ1脾細胞懸浮液+ 25μ1 ConA操作液。 5009-7007-pp 36 ⑧ 1353252

ConA對照組：ΙΟΟμΙ RPMI-1 640 + 75μ1脾細胞懸浮液 + 25μ1 ConA 操作液。 陰性對照組：125μ1 RPMI-1 640 + 75μ1脾細胞懸浮液。 孔中的ConA的最終濃度為5pg/ml。孔中的肽的最終 濃度為 80pg/ml、16pg/ml、3.2pg/ml、0.64pg/ml、和 0. 128pg/ml。每一個肽組包括3個平行的孔，還有8或12 個對照組的孔。細胞在37°C、 5% C〇2中溫浴68小時。以 ELISA讀數器上63Onm處的值為參考，用MTT法獲得每個 孔OD57〇nm處的讀數。 1.4 結果 表2, 肽對由ConA體外誘導的小鼠T-淋巴細胞轉化的影響。 組 濃度 N OD CMS-010.26 δΟμ^ηιΙ 3 0.353±0.016* CMS-010.26 16pg/ml 3 0.356±0.006* CMS-010.26 3_2pg/ml 3 0.332±0.015* CMS-010.26 0.64μ§/ηι1 3 0.348 ±0.025* CMS-010.26 0.128pg/ml 3 0.354±0.017* CMS-010.105 80pg/ml 3 0.407±0.019* CMS-010.105 0.64μβ/ηι1 3 0.386±0.008* Negative control — 12 0.134±0.011* ConA control 5pg/ml 12 0.467 士 0.043

*:相對於ConA陽性對照組，Ρ<0·05 表3. 肽對由ConA體外誘導的小鼠Τ-淋巴細胞轉化的影響 組 濃度 N OD CMS-010.32 80pg/ml 3 0.276±0.034* CMS-010.32 16pg/ml 3 0.273 土 0.023* 5009-7007-PF 37 ⑧ 135325.2 CMS-010.32 3_2pg/ml 3 0.309 ±0.030* CMS-010.32 〇_64pg/ml 3 0.321 ±0.048 CMS-010.32 〇.128μ^ηι1 3 0.306 ±0.033* Negative control 5pg/ml 8 0.108±0.012* ConA control — 8 0.358 ±0.028 *:相對於ConA陽性對照組，P<〇 〇5 1.5 結論

在合適的濃度下’發現CMS_01 0 26、CMS-010. 32和 CMS-010. 105能抑制由c〇nA體外誘導的小鼠τ —淋巴細胞 轉化，相對於ConA陽性對照組該結果具有統計學意義（p〈 0. 05) 〇 實施例 2 脸對小.鼠體内___T -淋巴細胞轉化和N K細胞活性的影響 2.1 材料 2. 1· 1月太 涉及的所有氨基酸都是L型的：CS Bio Co.，美國。 乙1. 2對照和奚他謎.逾，丨 環孢黴素 A: Novartis Pharma AG.，瑞士。鹽水： OTSUKA Pharmaceutical Co., Ltd,中華人民共和國。 RPMI-1 640培養基和胎牛血清（FBS): GIBC0L.，美國. MTT 和 ConA: Sigma Co.，美國 2 1. 3動物 BALB/c 小鼠（H-2d, SPF，6-8 周大，體重 i8-22g，50% 雌性且50%雄性）：軍事醫學科學院，中華人民共和國. 5009-7007-PF 38 ⑧ 1353252 2. 2 方法 2. 2 · 1動物分乡且和給竿 動物隨機分成兩個肽組（200pg/kg/天和5(^g/kg/ 天）’環孢黴素八組（l〇mg/kg/天），和鹽水組（〇.5ml/天）。 母組包括1 0只小鼠，其中一半為雌性且一半為雄性。所用 的測試物質溶解在05ml鹽水中並每天一次腹腔内給藥， 給藥20天。在最後—次注射後隨即的一天中檢測T-淋巴 細胞轉化和NK細胞活性。 g. 2· 2 T-淋巴細始” <卜11-2) 在最後一次測試物質給藥後的那天，扭斷頸部來處死 小鼠。在無菌條件下分離出脾並用注射針人工將其打散於 10%FBS RPMI-164G溶液中。打散的細胞懸浮液進—μ 1〇〇規格的150μπι直徑的不銹鋼濾網中過濾並調成為 4xl06/ml。脾細胞懸浮液接種在96孔細胞培養皿上，以如 下形式設計使得1〇〇μ1/孔。 1驗孔:1〇0叫細胞懸浮液+ ΙΟΟμΐ ConA 對照、孑L : 1 00μ1細胞懸浮液+ 1 00μ1 RPMI-1 640 為每只動物設立4個試驗和4個對照孔。平皿在3Γ(：、 5% C〇2中溫浴68小時。然後加入MTT，並以EUSA讀數器 63〇nm處的值為參考，讀出平皿〇D 57〇錢處的讀數。刺激 指數SI (%)=(試驗孔0D /對照孔〇D) x 1〇〇% 2 _ 2 _ 3狀對Ν Κ細胞活性的影響[3 - s] 使YAC-1靶細胞處於對數期並調成密度為 lXl〇5/nU。以上2.2.2節中製備的小鼠脾細胞調成密度為

5009-7007-PF 1353252 4x1 06/ml並用作效應器細胞。以如下方式，細胞懸浮液接 種在9 6孔細胞培養皿上： ΙΟΟμΙ 脾細胞懸浮液 + ΙΟΟμΙ RPMI-1640 ΙΟΟμΙ脾細胞懸浮液+ 1〇〇μ1 YAC-1細胞懸浮液 起細胞孔_: 1〇〇μ1 YAC-1細胞懸浮液+ 1〇〇μ1 RPMI-1640 為每隻動物設立3個試驗孔和3個效應器細胞孔，每 個細胞培養皿還設立1 2個靶細胞孔。平皿在37。(：、5% C〇2 中溫浴4小時’然後加入MTT，並以ELISA讀數器630nm _ 處的值為參考’讀出平皿〇D 570nm處的讀數。NK細胞活 性（％) = 1 -[(試驗孔〇D —效應器細胞孔〇D) /靶細 胞 〇D] X 1〇〇% 2. 3_結果 L3. 1 T-淋巴細胞轉化眘驗 表4. 狀對小氣T-淋巴細胞轉化的影響⑴ 組 劑量 N SI CMS-010.24 50pg/kg/天 10 2.40 ±0.31** CMS-010.26 200pg/kg/天 7 2.19 土 0.59** CMS-010.28 20(^g/kg/天 9 2_70±0.37** Saline 〇.5ml/天 8 3.63 ±0.69 相對於鹽水組，Ρ<〇.〇1 表5. 月太對小鼠T 一淋巴細胞轉化的影響（2 ) 組 劑量

N

SI 10 10 2_43±0·69* 3·15±0_83 CMS-010.25 200pg/kg/天 鹽水 〇.5ml/天 相對於鹽水組，P<0.05 5009-7007-PF 40 ⑧ 1353252 表6. 肽對小鼠T-淋巴細胞轉化的影響（3) 組 劑量 N SI CMS-010.04 50pg/kg/天 8 1.56±0.25** 鹽水 0.5ml/天 9 2.24±0.52 **:相對於鹽水組，Ρ<0.01 表7. 肽對小鼠Τ-淋巴細胞轉化的影響（4) 組 劑量 N SI CMS-010.12 50pg/kgAl 10 2·12±0.42** CMS-010.14 50pg/kg/d 9 2.12±0_51** 鹽水 0.5ml/天 10 2·96±0.61

相對於鹽水組，Ρ<0. 01 2. 3. 2 ΝΚ細胞活性實驗 表8. 肽對小鼠ΝΚ細胞活性的影響( 組 劑量 N NK細胞活性（％) CMS-010.24 200pg/kg/天 10 69·0±7·4* CMS-010.24 50pg/kg/天 10 56.0±6.0** CMS-010.26 200pg/kg/天 9 67.7±5.3** CMS-010.26 50pg/kg/天 10 68.5 ±7.2* CMS-010.28 200pg/kg/天 9 70.3 ±6.7* 鹽水 0.5ml/天 10 76_0±4_3 *:相對於鹽水組，P<0.05 * 相對於鹽水組， P<0.01 表9. 肽對小鼠ΝΚ 細胞活性的影響（2) 組 劑量 N ΝΚ細胞活性（％) CMS-010.11 50pg/kg/天 9 63_5±4.7**

5009-7007-PF 41 ⑧ 1353252 CMS-010.13 5(^g/kg/天 10 70.9±17.5* CMS-010.14 200pg/kg/天 8 43.1 ±13.7* CMS-010.14 50pg/kg/天 9 75.3±9·0** 鹽水 0.5ml/天 10 55·3± 6.1 *:相對於鹽水組，P<0.05 相對於鹽水組， Ρ<0·01 2. 4 結論 在合適的劑量下，發現CMS-010. 04、CMS-010. I2、 CMS-010. 14、CMS-G10. 24、CMS-01G. 25、CMS-G10. 26、和 CMS-010.28能抑制小鼠體内T_淋巴細胞轉化，相對於鹽 水對照該結果具有統計學意義（p < 〇 〇5)。 在合適的劑量下，發現CMS_010.24、CMS_〇1〇 26、和 CMS-010.28能抑制小鼠體内NK細胞活性，相對於鹽水對 照該結果具有統計學意義（P < 0 0 5)。 在合適的劑量下，發現CMS_010_U、CMS_〇1〇 13、和 CMS-010.14能增強小鼠體内仉細胞活性，相對於鹽水對 照έ玄結果具有統計學意義（p〈 〇 . 〇 5 )。 實施例 3 肽對小鼠體内抗體形成的影聲 3.1 材料 3. 1. 1 肽 涉及的所有氨基酸都是L型的：CS Bi〇 c〇 美國 3. 1. 2對照和其他試劑 環孢黴素 A: Novartis Pharma AG.，瑞士。趟 ^ OTSUKA Pharmaceutical Co.，Ltd,中華人民共和國 5009-7007-PF 42 1353252 3. 1. 3動物 BALB/c 小既（H-2d，SPF，6-8 周大，體重 i8-22g，50% 雌性且50%雄性）：軍事醫學科學院，中華人民共和國。 3.2 方法 3. 2. 1動物分組和測諸!_與質、給華 小氣隨機分成3個組：肽（2〇(^g/kg/天），環孢黴素A UOmg/kg/天和鹽水（〇.5ml)。每個組包括12隻小鼠， 6隻雌性且6隻雄性。測試物質溶解於Q 5mi鹽水中並每 修天一次腹腔内給藥’連續給藥2〇天。 3. 2. 2抗體培養並定爭[τ] 手灰紅細胞（SRBC)用鹽水重新懸浮以達到2% (v/v) 並在測„式物質、.’。藥後的第】6天將〇 · 2出】重懸的細胞液腹腔 内給藥於每隻小鼠。在最後-次測試物質給藥後的那天’ 從目内#收集血並在室溫放置j小時使得也清渗出來。以 200g離心1〇分鐘之後，用2〇〇倍生理鹽水稀釋血清。 A製備補充操作液，向1體積離心濃縮的SRBC中加 入1 〇體積新鮮豚鼠血清。於4Χ輕輕震盪混合物3〇分鐘。 然後以2〇〇g離心10分鐘去除SRBC。向上清液中加入1〇 體積生理鹽水從而獲得補充操作液。 為測試小鼠抗體滴度，〇· 2ml 1% SRBC懸浮液加入到 來自每隻小鼠的lml稀釋的冰冷的小鼠血清中。然後加入 1 ml操作補充液並將混合物在3rc溫浴別分鐘。將每 個樣。0置於冰上1 0分鐘，急速冷卻以終止反應。然後以 200g離〜樣品1 〇分鐘從而獲得上清液。對於每1『1該上 5009-7〇〇7-pp 43 1353252 清液，要加入3 ml Drabkin溶液，然後置於室溫10分鐘， 然後測量〇D54〇n_。遵循與樣品相同的過程，但此過程除了 用鹽水替換一半SRBC並且不離心去除未溶胞的SRBC，測 疋ODswn•處的參考溶胞_5〇讀數。樣品血清指數（j|c5e)= 樣品的 〇1)54。„· / 溶胞-50 〇β54βη· X 200 結果 表10. 肽對小鼠抗體形成的影響 組 劑量 N hc5〇 CMS-010.26 200pg/kg/天 10 141.3±29.3* 環孢黴素A 10mg/kg/天 12 148.9 土 21.7* 鹽水 0.5ml/天 11 167.6±21.5

3 結論 在合適的劑量下’發現CMS 010· 26能抑制小鼠體内 抗體形成’相對於鹽水對照組該結果具有統計學章義 (P<0.05)。 ’ 實施例 4 肽對體内移植了 S180肉瘤細胞的KM m 4.1 材料 4. 1. 1 肽 涉及的所有氨基酸都是L型的：CS Bio Co ，美國 4. 1· 2對照和其他試劑 5009-7007-PF 44 ⑧ 1353252 鹽水：OTSUKA Pharmaceutica 1 Co.，Ltd,中華'人 民共和國。阿黴素：Zhejiang Haizheng Pharmaceutical h·，Ltd.，中華人民共和國 健康雌性KM小鼠（SPF，6-8周大，體重18_22g):軍 事醫學科學院，中華人民共和國 組、測試物皙給藥以及腫瘤細胞植入m

Sl8〇肉瘤細胞通過腹腔移植入KM小鼠，經過6-8天在 無^條件下收集腹水。細胞濃度用10% FBS RPMI-1 640調 ，每ml 1 X 1〇7 ’並通過腋窩將〇. 2ml細胞懸浮液注射進 每隻KM小鼠中以研製出帶有肉瘤的小鼠模型。移植了 Sl80 肉瘤細胞的小鼠隨機分成5組：肽（2組：50 v g/kg/天和 10 # g/kg/天）’阿黴素（2mg/kg/天），環磷酰胺（40mg/kg/ 天）’和鹽水（〇. 5m 1 /天）。在以腫瘤植入後隨即的一天在腹 腔内注射測試物質並每天進行一次，持續2 0天。 瘤發展的沏丨宁 在最後一次測試物質給藥後的那天，從小鼠中切下肉 瘤並稱重。用遊標卡尺測定每個肉瘤3個面（a，b，c)上的 直控。肉瘤的體積由如下公式計算：V = (1/6)7tABC。腫瘤 生長抑制指數由如下公式計算：腫瘤生長抑制指數=(對 照組的腫瘤重量-治療組的腫瘤重量對照組的腫瘤重 量 X 100% 4.3 結果 表11.肽對體内移植了 Sis。肉瘤細胞的小鼠的發展的影響⑴. 組 劑量 N 肉瘤重量 5009-7007-PF 45 ⑧ 1353252 CMS-010.31 50pg/kg/天 17 1.20±1.60* CMS-010.31 lOpg/kg/天 14 1.05±1.28* CMS-010.103 50pg/kg/天 15 1.48 + 1.44* CMS-010.103 lOpg/kg/天 15 1.72±1.53* 阿黴素 2mg/kg/天 17 1·52±1·75* 鹽水 0.5ml/天 12 5.07 + 5.46 *:相對於生理鹽水組，P<〇.〇5 表12. 肽對體内移植了 S18〇肉瘤細胞的小鼠的發展的影響(2)

組 劑量 N 肉瘤重量 肉瘤體積 CMS-010.02 500pg/kg/天 10 0·97±0·85* 0.65 ±0.67* CMS-010.02 25〇Mg/kg/天 10 0.68±0·72* 0.36 + 0.40* CMS-010.03 500pg/kg/天 10 0.33±0.35*@ 0.27±0_33*@ CMS-010.03 250pg/kg/天 10 0.68 ±0.46* 0_31±0_22* CMS-010.04 500pg/kg/天 10 0.62 土 0.44* 0.40±0·28* CMS-010.04 25C^g/kg/天 10 0.27±0.19*@ 0_17±0·12*@ CMS-010.05 500pg/kg/天 10 0.47±0.29*@ 0.34±0·22* CMS-010.05 250pg/kg/天 10 0.56±0.33* 0_23±0·19*@ CMS-010.07 500pg/kg/天 10 0·52±0.25* 0.37±0.20* CMS-010.07 25(^g/kg/天 10 0.32±0·14*@ 0·24±0.13*@ CMS-010.08 500pg/kg/天 10 1.05 士 0.64* 1.01 ±0.63 CMS-010.08 25(^g/kg/天 10 0·38±0.27*@ 0.20±0_14*@ CMS-010.09 500pg/kg/天 10 0·85±0·70* 0.84±0·84 CMS-010.09 250pg/kg/天 10 0·45±0.38*@ 0_37±0.44* CMS-010.il 500pg/kg/天 10 U4±0.74* 0.95±0_54 CMS-010.il 250pg/kg/天 10 0.64±0‘31* 0‘63±0.40* CMS-010.13 500pg/kg/天 10 0,73 ±0.43* 0_38±0.23* 46

5009-7007-PF 1353252

CMS-010.13 250pg/kg/天 10 0_92±0·56* 0.91 土 0.59 CMS-010.14 500pg/kg/天 9 0.67±0.70* 0.56±0·53* CMS-010.14 250pg/kg/天 10 0.44±0.30*@ 0·29±0.21* CMS-010.15 500pg/kg/天 10 0.68 土 0·36* 0.63±0.35* CMS-010.15 250pg/kg/天 9 0.45±0.35*@ 0_41±0_37 CMS-010.16 500pg/kg/天 10 0.99 ±0.42* 0_92±0_36 CMS-010.16 250pg/kg/天 9 0_63±0.47* 0.61±0_44* CMS-010.17 500pg/kg/天 10 0_91 土 0.46* 0.55±0.34* CMS-010.17 25(^g/kg/天 9 0_65±0.41* 0.40 ±0.24* CMS-010.18 50(^g/kg/天 9 0.59 ±0.48* 0.58 ±0.42* CMS-010.18 250pg/kg/天 9 0.44 ± 0.31*@ 0·27±0.20*@ CMS-010.19 50(^g/kg/天 9 0.68±0.68* 0.40 ±0.42* CMS-010.19 250pg/kg/天 10 0.41±0.45*@ 0.46±0·58* CMS-010.20 500pg/kg/天 10 0.59 ±0.46* 0·54±0·51* CMS-010.20 250pg/kg/天 9 1_00±0.76* 0.88±0.77 CMS-010.21 500pg/kg/天 10 0.44±0.22*@ 0·44±0_21* CMS-010.21 25(^g/kg/天 10 0.51±0_29* 0_44±0·22* CMS-010.22 500pg/kg/天 10 0.85±0.73* 0_73 土 0_87 CMS-010.22 25(^g/kg/天 10 0.28±0.12*@ 0.24±0.08*@ CMS-010.23 250pg/kg/天 9 0.27±0.18@ 0.21±0.15*@ CMS-010.24 50C^g/kg/天 10 1.20 ±0.79* 0_62±0.47* CMS-010.24 250pg/kg/天 10 0.61±0_39* 0.36±0.30* CMS-010.25 500pg/kg/天 10 0.52±0.38* 0_26±0_21*@ CMS-010.25 250pg/kg/天 9 0.65 ±0.53* 0.48±0.37* CMS-010.27 50C^g/kg/天 9 1.05±0.86* 0.51 士 0.33* CMS-010.27 250pg/kg/天 10 0.78±0_68* 0_58±0.58* CMS-010.29 500pg/kg/天 10 0.55±0.41* 0.40 土 0.11* CMS-010.29 250pg/kg/天 10 1·24±0·72* 1.02±0.66 5009-7007-PF 47 ⑧ 1353252

在合適的劑量下，發現 4.4 結論 CMS-010.03, CMS-010.08, CMS-010.14, CMS-010.18, CMS-010. 22, CMS-010.04, CMS-010. 09, CMS-010.15, CMS-010.19, CMS-010. 23, CMS-010.103, CMS-010.05, CMS-010.11, CMS-010.16， CMS-010.20, CMS-010.24, CMS-010.02, CMS-010.07, CMS-010.13, CMS-010. 17, CMS-010.21， CMS-010.25, CMS-010.31 500pg/kg/天 10 0.78±0.89* 0.43 ±0.50* CMS-010.31 250pg/kg/天 10 0.27±0.19*@ 0·25±0·20*@ CMS-010.32 500pg/kg/天 10 0.41±0_35*@ 0_40±0.31* CMS-010.32 ---1 250pg/kg/天 10 0.38±0_24*@ 0.25±0.14*@ 環磷酰胺 ---- 40mg/kg/天 10 1.07 ±0.80* 0.76 ±0.66* 鹽水 0.5ml/天 10 1.87±0_52 1.20±0.28 *:相對於生理鹽水組，p<〇.〇5 @:相對於環4醜組，P<0.05 CMS-010.27，CMS-010.29，CMS-010.31，和 CMS-010.32

能抑制體内移植了 Sud肉瘤細胞的KM小鼠的發展，相對於 生理鹽水對照組該結果具有統計學意義（p<〇 〇5)。 實施例 5 月太對兔的馬衫瞥姿的影響 5.1 材料 5. 1· 1 肽 涉及的所有氨基酸都是L型的：CS Bio Co.，美國。

5009-7007-PF 48

1353252 5. 1 . 2對照和其他試劑

地塞米松鈉磷酸注射液：Tianjin Jinyao Aminophenal Ltd.,中華人民共和國。鹽水：0TSUKA

Pharmaceutical Co. Ltd.，中華人民共和國。BCG疫苗：

Beijing Institute of Biological Products，中華人民 共和國。羊毛月旨：Tianjin sixth chemical product factory，中華人民共和國。液體石壤：Tianjin sixth chemical product factory，中華人民共和國。jk清診斷 _ 試劑BUN : BECKMAN443350 ’美國。血清診斷試劑肌酸針： BECKMAN 443340 美國。 5. 1. 3動物 一隻雄性羊（8個月大）：實驗動物系，Tian j in Medical University，中華人民共和國。兔（MDA，雄性， 2-2. 5kg): Beijing Fuhao Breed Farm，中華人民共和國。 5. 2 方法[9·… '

泛.2. 1製備单抗兔腎臟外虔的抗血涛 備兔腎臟外埤杭厣 5. 2. 通過耳靜脈注射犧2的25% 4基甲酸乙酷以麻醉 ^的兔子，並以⑽_靜脈注射„從而使得系統性 露出來=菌Γ件下切開兔子腹部，使腎動脈和靜脈暴 路出來。將導管插入腎動脈並切斷腎靜 直至腎組織發灰。然後摘除腎。分離腎臟外皮腎用鹽= 積冰冷的鹽水使之均—π ，㈣儲存於H 體 ___製備羊的抗.血_ 5009-7007-pf 135325.2 .5 ml腎臟外皮勻漿與2.5 ml福氏完全佐劑（羊毛 脂比液體石蠟的比率為1:5,並含有5mg/ml BCG疫苗）混 合。在完全乳化後，在5個不同的背部位置上，將抗原注 射入羊中，每個位置1 m 1，每兩週一次，總共進行3輪注射。 第四次免疫開始時，用1體積鹽水使5g腎臟外皮均一化並 肌肉注射進羊的5個位置中，每個位置imi，每兩週一次。 以兩周為基礎’用雙向免疫擴散來監測羊抗兔腎臟外皮的 $體滴度。當滴度達到1:32時，從頸動脈中收集羊抗血 ’月羊抗血清與等體積兔血紅細胞混合並置於4〇c丨2小時 用。以去除抗兔血紅細胞抗體。然後離心收集抗血清並置於 56°C以使補體和蛋白酶失活。抗血清儲存於_ 。 i勿質給藥、杉腎炎椹刑 22隻健康兔隨機分成5組：肽（107. 3/zg/kg/天和 58.5^1^/天，每組4只兔子），地塞米松（〇.1呵/}^/天， 4口只兔子），鹽水治療〇ml/天，7只兔子），和正常健康的 只兔子（3只兔子）。在兔中建立出病態之前，在24小時間 對每隻兔子進行測定企冑BUN、肌酸針、和尿蛋白。如果 在k I則疋中沒有A現$常，通過耳靜脈注射羊抗兔腎臟 外皮的抗血清’每次注射〇.5ml，每30分鐘注射一次，每 又兔子〜主射4次，就可在實驗兔中建立馬杉腎炎模 型。以同樣的方式，用鹽水注射正常健康對照）兔 組。在注射抗血清後的那天開始通過耳靜脈靜脈給藥測試 物質，每天一次，每次注射lml，持續30天。

5. 2 · 3監測治果 5009-7007-PF 50 1353252 5. 2. 3. 1尿蛋白的定量 每週一次在24小時間從每隻兔子中收集尿並用硫代 水楊酸法測定蛋白質含量。 5. 2. 3. 2病理檢測 為了觀察肽對從患馬杉腎炎的兔中清除羊抗兔腎臟外 皮I gG抗體的影響，在最後一次測試物質給藥後的那天， 通過窒息處死兔子並摘除右腎，凍結邊緣，然後用免疫螢 光染色測定羊I gG的存在。對每個腎小球的螢光陽性區域 進行計數。每只兔子檢測30個腎小球並計算每個腎小球的 平均陽性區域。 5. 2. 3. 3統計學 用SPSS軟體通過t-測驗來確定統計學意義。 5.3 結果 表13. 肽對患馬杉腎炎的兔的蛋白尿症的影響（mg/dl) 組 劑量/天 N 第o周 第1周 第2周 第3周 第4周 CMS-010.26 107.3pg/kg 4 9.84±4.29 187±184 114±145 26±24* 28±32* CMS-010.26 58_5pg/kg 4 9.53 ±4.64 77 ±62 150±123 20±12* 36±16* Dexamethasone 0.1mg/kg 4 9.48 ±8.46 29 土 12 13·6±6·3* 13·7±3.1* 25±19 地塞米松 0.5ml 7 11.72±3.18 122±91 160±138 145±33 157±71 鹽水治療 - 3 23.43± 18.42 7.7 土 2.0* — 6.9±4.5* 24 ±7* *:相對於鹽水治療組，P<0.05 表14. 肽對從患馬杉腎炎的兔中清除羊抗兔腎臟外皮IgG抗體 的影響

5009-7007-PF 51 ⑧ 1353252 組 劑量/天 N 陽性區域數/腎小球 CMS-010.26 l〇7.3pg/kg 5 5.6±1.2** CMS-010.26 58.5pg/kg 4 6.3 ±1.4** 地塞米松 0.1mg/kg 4 7.5±1.〇 鹽水治療 0.5ml 7 8.7 ±0.9 正常健康的 - -χ —-- —---------- 本♦·.

在患馬杉腎炎的兔體内，發現CMS 〇1〇· 26能降低的蛋 白尿症的嚴重程度並促進羊抗兔腎臟外皮抗體的清除，相 對於鹽水治療對照組該結果具有統計學意義，p < 〇. 。 實施例 ft 月太對鼠體内Heymann腎炎的和響 6^1 材料 LI, 1 肽

使用的所有教基酸都是L型的：CS Bio Co.，美國。 6. 1 · 2對照和其他試劑 地塞米松納鱗酸注射液：T i an j i n J i nyao

Aminophenal Ltd.，中華人民共和國。鹽水：OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., 中華人民共和國。BCG疫苗： Beijing Institute of Biological Products。羊毛脂： Tianjin sixth chemical product factory，中華人民共 和國。液體石躐：Tianjin sixth chemical product factory，中華人民共和國。血清診斷試劑 BUN: 52

5009-7007-PF 1353252 BECKMAN443350，美國。血清診斷試劑肌酸酐：BECKMAN 443340，美國。 6. 1. 3動物 wi star 鼠（SPF ’ 6-8 周大，體重 1 50-20 0g): Beijing Vital River Laboratory Animal Co.，Ltd·，中華人民共 和國。 6.2 方法⑴ 1製備鼠腎白撖

在無菌條件下切開健康Wi s t er鼠的腹部。使門靜脈和 下腔靜脈暴露出來。將導管插入門靜脈並切斷下腔靜脈。 腎用鹽水沖洗直至腎組織發灰。摘除腎並分離腎臟外皮。 然後在冰上均一化腎臟外皮並儲存於—2。 L2· 2製_逢鼠腎臌外古炕屈 羊毛脂與液體石蠟以1 : 2 v/v的比率混合，震盪並加熱 至70〇C’然後高壓滅菌。向羊毛脂/石蠟混合物加入足夠的 BCG疫為以產生3mg/mi疫苗濃度從而形成福氏完全佐劑。 腎臟外皮勻漿、福氏完全佐劑、和鹽水以i :丨：2的比率混 合’攪拌直至完全乳化。 6. 2. 3動物分組釦模型建立 2〇隻健康的Wistar鼠隨機分成2組：肽（2〇〇"g/kg/ 天）和鹽水治療（2mi/天向每隻鼠腹腔内注射抗 原每2周，主射一次總共注射5輪。在第3次免疫後的那 天開始腹腔内注射給藥測試物質 6. 2 · 4功敎藍泪，丨 每天一次直至實驗結束。 5009-7007-PF 53 ⑧ 1353252 6. 2· 4· 1 尿哥白&定量 疋里尿蛋白的工作開始於模型建立的第3周。每2週 …人2 24小時期間從每只鼠中收集尿樣並用硫代水楊酸 法測定尿蛋白含量。 6. 2· 5統計學 用SPSS軟體通過t_測驗來比較樣品值。 6. 3 結果 表15.肽的給藥對患Heymann腎炎的鼠的24小時尿蛋 白濃度（mg/dl)的影響 N 第3周 第5周 第7周 第9周 組 3_8±2.24 12.6±1.2 CMS-010.26 10 6.2±2_3 3.1±1.4 3.9+1.6* 鹽水治療 丄〇 4_1±1.3 3.1 ±0.8 10.9+2.8 ^相對於鹽水組，P<〇.〇5 6.4 結論_ 在合適的劑量下’發現CMS_010.26能降低患Heymann 腎炎的鼠體内的蛋白尿症的嚴重程度，相對於鹽水治療對 照組該結果具有統計學意義（P<〇. 05)。 實施例 1 - 6的參者文獻 l.ShuyunXu, RulianBian, Xiu Chen. Methodo 1 ogy of pharmacological experiment. 人民衛生出版社. 2002, 1:1426-1428 2. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs，中華人民共和國.1993，7:134-135 5009-7007-PF 54 ⑧ 1353252 3. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. 人民衛生出版社. 2002,1:1429 4. J i nsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6): 356-358 5. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs，中華人民共和國.1993，7:128-129

6. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (第二版）·人民衛生出版社.1 998，137-138 7. Shuyun Xu, Rulian Bian，Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment.人民衛生出版社. 2002,1:1429 8. Principles of Pre-clinical Research of New

Drugs，中華人民共和國.1993，7:137-139 9. Principles of Pre-c1inica 1 Research of New # Drugs，中華人民共和國.1993，7:96 10. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. 人民衛生出版社. 2002, 1 : 1 227-1 228 11. Principles of Pre-c1i n i ca1 Research of New Drugs，中華人民共和國· 1993，7:97 12. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment.人民衛生出版社.2002,1:1227 5009-7007-PF 55 1353252 實施例 7 通過基因工程改造的誌種來遞送叶 以下將提供一種示例的方法將本發明的肽遞送至上述 佰主。用化學方法合成編碼一種肽及其功能衍生物的Dna • 序列，所述肽選自由CMS-010 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段 • 組成的組（其中所述片段不包含CMS-010序列），並且用所 屬領域技術人員所熟悉的標準的基因工程技術將該Dna 序列插入到表達載體中。所選的表達載體包括能在 魯 ""中發揮功能的組成型啟動子、在特定5，至 3方向上用於導入D N A序列的多克隆位點以及能帶來抗 抗生素抗性的選擇標記基因（從而在克隆過程中起輔助作 用）並包s此幫助產生和/或分泌狀的其他序列，如信號肽 序列。這種載體的實例如pav la的美國專利第5, 592, 908 號所述，其全文併入本文作為參考。簡言之該專利討論了 幾種已知的能在種中起作用的啟動子以及 在所述細菌中發現新啟動子的方法，所述啟動子都可以與 • 編碼本發明肽的核酸可操作相連從而在Zac紿如中 表達肽。編碼信號肽的核酸可插在啟動子和編碼本發明肽 的核酸之間，從而使得編碼信號肽的核酸與編碼本發明肽 的核酸位於相同閱讀框内，信號肽如包含16至35個大多 疏水的氨基酸的肽，如以上引用的美國專利第5, 529, 9〇8 號所述’其在/aci/s中具有活性。 除了肽的編碼序列，合成的DNA序列可以包含幫助將 所述DNA連接和克隆到表達載體中的序列。例如，與載體

5009-7007-PF 56 ⑧ 1353252 多克隆位點中所發現的位點相對應的限制酶識別位點能整 合進合成的DNA序列的5’和3’端，從而使序列能克隆 進載體的合適的位置。載體和合成的DNA都可以用特定限 制酶來消化，然後提純。在進行載體和合成DNA的連接反 應後，將其轉化入合適的昃菌株中。轉化的細菌塗 布於包含抗生素的培養基上，而載體具有該抗生素的的抗 性。選出轉化的菌落，在生長培養基培養並進行製備質粒； 確認合成的DNA處於正確的位置上。 然後將該表達載體轉化進菌種的宿 主細胞中，例如Ζ. 。利用載體序列中發現的 選擇標記的特點，選出轉化的細胞’而且可以通過將生長 培養基中所存在的肽進行western印跡、進行凝膠電泳或 其他標準技術來確認該肽的分泌。選出轉化的菌落，並將 其用於製備大規模培養的基因工程菌。表達所需肽的基因 工程菌培養物生長了出纟，將其至少—部分給藥給宿主生 物的消化道、陰道、氣管或其他區域，該菌能在所述宿主 =中複製。如果需要’細菌培養物可用各種方式處理以 產生能由宿主腸吸收的補充劑。這些處理包㈣幹法或伴 存細菌的其他方法，另外還可將細菌與載體試齊"且人在一 起’例如溶液、溶齊卜分散劑、緩釋劑、乳 =些試劑製備補充劑是現有技術中的公知常識。例如:= 菌可用於製造酸乳產品或其他供人食 、 達肽的生物體在宿主生物的腸中繁殖。、’從而使表 6, 036’ 952號中公開了許多不同的方 姓美國專利第 石决來將特定乳酸菌株 5009-7007-pf 57 1353252 混合進諸如乳酪、泡菜、乾酪和黃油的食品中，其全文併 入本文作為參考。通過大量途徑之一來攝食取得細菌，這 樣工程改造的生物體就能在腸中繁殖並通過腸的粘膜層提 呈和/或吸收本發明的肽。 •實施例 8 j|_i§ Bad Hits_的基因工裎改造形式來遞送肽 以下將提供了另一種示例的方法將本發明的肽遞送至 春 上述佰主。用化學方法合成編碼一種肽及其功能衍生物的 DNA 序列’所述肽選自由 CMS_〇1〇 (VApEEHpTLLTEApLNpK) 片4又組成的組（其中所述片段不包含CMS - 01 〇序列），並且 通過基因工程技術、現有技術中已知的所有技術將該dna 序列插入到表達載體中。所選的表達載體包括穿梭載體， 例如 pTZ18R (Pharmacia, Piscataway，NJ)，其能在 κ

6b"和及中繁殖，並包含抗生素抗性基因以 選擇轉化的菌落。該載體可包含在及中有活性 • 的組成型啟動子，如衍生自及Sac B基因的啟 動子，以及編碼在及中有活性的信號肽的核酸 序列，所述信號肽指導表達的異體蛋白質使之能有效地從 細菌細胞中輸出。這種載體的一個實例如Fahnest〇ck的美 國專利第6 ’ 2 6 8，1 6 9號所述，其公開的全文併入本文作為 參考。簡言之，如上所詳細描述的那樣，通過所屬領域技術 人員所熟悉的技術，編碼本發明肽的DNA上可合成有限制 酶位點和/或其他序列以幫助DNA克隆。轉化進K

5009-7007-PF 58 (D 1353252 之後，塗布、篩選並進行質粒擴增從而產生質粒原料，然 後將質粒轉化入及中並利用對塗布在培養基上 的抗生素有抗性的特性來選擇出轉化子。

用所屬領域技術人員所公知的技術來確認由基因工程 改造的昃即“///5產生和分泌的肽，例如在SDS pAGE 分析或Western印跡之後放射性標記肽來進行放射自顯影 檢測。 基因工程菌培養物生長了出來，將其至少—部分給藥 • 給宿主生物的消化道、陰道、氣管或其他區域，該菌能在 所述宿主生物中複製。 實施例 9 通過基因工程 cc力aro/z?Fees酵母菌種來诚诂拜士 以下將提供了另一種示例的方法將本發明的肽遞送至 上述宿主。用化學方法合成編碼一種肽及其功能衍生物的 DNA 序列，所述肽選自由 CMS-010 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK) ® 片段組成的組（其中所述片段不包含CMS-010序列），並且 通過基因工程技術、現有技術中已知的所有技術將該dna 序列插入到表達載體中。所選的表達載體包括能穩定保持 的酵母蛋白質表達載體，包含諸如pADHl的組成型酵母啟 動子、能在酵母和& Co/j·載體中複製的位點、一個或多 個能向酵母營養缺陷型突變體提供營養原的基因從而能用 於篩選、多克隆位點（MCS)和，如果需要，編碼信號月太 的序列。像這樣的載體可從商業途徑獲得並是現有技術中 59 ⑧ 1353252 公知的’或者其能利用標準技術方便地構建。將合成的贏 插入酵母載體之後，轉化進〖⑽中，將轉化的A 塗布於選擇性培養基上，從所述菌落的生長培養基上選擇 出轉化的菌落並製備質粒DNA，通過諸如乙酸鐘轉化或電 穿孔的公知技術將載體轉化進如_厂卿啦“㈣七⑽ 轉化所選用的菌株為營養 缺陷型突變菌株，其需要在質粒上有一種基因從而使其能 =J »養基平凰上生長。將酵母塗布於缺少載體所提供 基因的生長培養基上，以此來分離轉化的酵母克隆。僅有 那些接受了載體及其選擇基因並表達該基因產物的酵母才 能在最小培養基上長成克隆。可以通過將生長培養基令所 存在的肽進行western印跡、進行凝膠電泳或其他標準技 術來確認該肽的分泌。 選擇出轉化的酵母克隆並用於製備大規模的培養物。 表達所需肽的基因工程酵母培養物生&了出I，將其至少 :部分給藥給宿主生物的消化道、陰道、氣管或其他區域， 該菌能在所述宿主生物中複製。如果需要，酵母培養物可 各種方式處理以產生能由宿主腸吸收的補充劑。這些處 理，括殊幹法或保存酵母的其他方法，另外還可將菌與載 體式；，.且。在起，例如溶液、溶劑、分散劑、緩釋劑、 乳劑等等。應用這些試劑製備補充劑是現有技術中的公知 常識。在另-種具體實施方案中，通過所屬領域技術人員 已知的技術’轉化的酵母可用於製造食品，如發酵的乳製 品’像乳絡和酸乳酒。如在這些食品中的活乳酸菌培養物

5009-7007-PF ⑧ 60 1353252 那樣，轉化的酵母至少能在腸中短暫繁殖並通過腸腔將肽 提呈至宿主。 f施例 1 〇 將肽靶向至特定位罟 以下將提供了一種示例的方法將本發明的肽選擇性地 遞送至體内的特定區域、器官、細胞類型或位置上。在該 情況下’通過將一種肽及其功能衍生物靶向至個體腎中的 組織上’以此來治療細胞增殖失調，所述肽選自由CMS-01 0 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段組成的組（其中所述片段不包 含 CMS-010 序列）。例如，CMS-010 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK) 片段（其中所述片段不包含CMS-0 1 0序列）及其功能衍生 物用現有已知的化學反應通過共價鍵與低分子量（LMW)溶 菌酶相連’溶菌酶是一種可商業獲得的蛋白質部分，其能 特異地集中在腎組織中。將分子與LMW溶菌酶相結合的技 術已有。己載（卩〇1§61:七事，81* 】？^1_111(：〇1〇以，136:11〇7, 2002)。該領域中的文獻也教導了將蛋白質或肽結合至另一 個上去的常規技術（Fischer事，Bioconj. Chem.， 12 ·825，2001 )。然後通過諸如陽離子交換FpLC的色譜法 和/或梯度離心，提純新生成的結合肽樣品，去除在連接過 矛中所用的化學έ式劑。提純後，肖需要治療腎細胞增殖失 調的個體給藥結合的肽。對於其抗增殖活性，通過它們和 从W ’合菌酶間連接的特性，即利帛逝溶菌酶對腎近端小 I的親和性特性使其選擇性地集中在腎組織中，優選 5009-7007-ρρ 1353252 將 CMS-010 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段（其中所述片段 不包含CMS-01 0序列）及其功能衍生物乾向至腎組織。相 對於等摩爾量的CMS-010 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段（其 中所述片段不包含CMS-01 〇序列）及其功能衍生物本身來 遞送’該優選的遞送方式形成了更好的抗增殖效果。反過 來看，它能減少為獲得某種水平的抗增殖活性而需要的月太 藥物的量。 實施例 Π 向其活性位點的μ镁 以下提出了 一個示例的方法將增加神經活性肽向大腦 的遞送。用所屬領域技術人員已知的化學方法合成本發明 的能對大腦神經元表達的受體發揮作用的肽。可選地，如 以上實施例所詳細描述的，它能由卫程改造的微生物表達 出並從這些生物體的培養物中獲得。—旦獲得純化的形 式，利用-系列有機化學反應使狀產生出甘油三醋結合部 刀附著於該肽上。結合的部分由連結在本發明月太上的四 取代的：中通過酰胺鍵與肽末端羧基的碳相結合而形 成才著在厌中W上的其他3個基團由碳與“個碳的脂肪 酸_相聯而形成。脂肪酸鏈自身末端連結在二肽末端 的土團中被稱為狀罩，其使得鏈更親水並將它們特異把 二至血障的内皮細胞膜。在Patel事，Bioconjugate =8⑻：434, 1997巾詳細地解釋了該合成過程，而

°“過私僅利用了普通試劑和所屬領域技術人員所熟悉 5009-7007-PF ③ 62 1353252 的設備。 化合物在外周局部導入個體後，其通過循環系統運遍 全身，與血腦屏障的内皮膜互相作用。在將分子運輸穿過 企腦屏障上皮層的過程中，二肽罩和脂肪鏈的逐步降解會 造成本發明的肽釋放進腦部區域中。在那裏肽能與神經元 表面上的受體相互作用從而對大腦功能發揮其作用。藥物 到達血腦屏障並運至大腦所需的時間改變了藥物活性的動 力學效應’相對於游離肽的顱腔内注射，產生了更穩定並 ® 更持久的效果。 實施例 12 產生抗酶降解的壯配方 以下提供一個示例的方法將產生口服給藥的生物活性 肽配方’該配方抗消化道中和其表面上所發現的蛋白酶和 肽酶的活性。在本實施例中，利用肽及其功能衍生物製備 向患者口服給藥的藥物配方，所述肽選自由CMS-010 # (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段組成的組（其中所述片段不包 含 CMS-010 序列）。如 Larionova # (Int. J. Pharma， 18 9 : 171，1 9 9 9 )所述，將肽用於和可溶性澱粉和蛋白酶抑 制劑抑肽酶一起製成微粒，抑肽酶是各種内腔分泌的和刷 狀緣膜結合的蛋白酶的強抑制劑。簡言之，可溶性殿粉、 蛋白酶抑制劑抑肽酶和本發明的肽溶解在緩衝水溶液中。 由所屬領域技術人員熟悉的實驗方法測定可溶性殺粉、抑 肽酶、和肽的比率；例如’ Lar ionova #運用體外刺激消

5009-7007-PF ⑧ 63 1353252 化試驗來確定對它們 # ^ ^ ]研九中所用的蛋白質最有效的比率和 製備條件。在包括π e , 认班 ° ^Pan-80 ( —種非離子表面活性劑） /己& (比率為i : 3 ’ v/v)中’機械攪拌使水溶液乳化。 户對苯二酰I的氣仿溶液加到乳劑中並持續騎分 鐘’在此期間澱粉分子去〇 j η丄& 抑Μ酶和肚父鍵在一起。洗務在 該過程中產生的微粒，括 ’、 刼順序用％己烷、含2% v/v Tween 85去污劑的95%酒精溶泫、οςβ/ ^γ , 、 合夜 9 5 %酒精和水。微粒重懸于水 中並/東幹。凍幹的化合物 切』μ戒隹明膠膠囊中從而口服遞 送給需要治療的個體。 當明膠膠囊溶解時，一旦化合物被消化，其就釋放出 來了。通過《殿粉酶對殿粉分子的作用，微粒在小腸中破 碎’導致逐步釋放抑肽酶和本發明的狀。在與狀相同時間 矛位置協同釋放的強蛋白酶抑制劑抑肽酶降低了肽的酶降 解並增加了能通過腸膜吸收的完整肽的比例。 本發明在一些情況下用前述CMS_010肽 (vAPEEHPTUmPL，片段及其功能衍生物的方法和資 料以及特定實例來描述，但可以理解這只是實例而已，並 不能當作為對本發明的限制。也應當理解CMS_〇l〇 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段（其中所述片段不包含cMS_〇1〇 序列）及其功能衍生物代表本發明特定的具體實施方案， 而本發明同樣的原理也能應用於其他功能等價肽，所述功 能等價肽經修飾而不影響CMS-010片段 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)(其中所述片段不包含CMS〇1 〇序 列）及其功能衍生物的生物功能。例如，CMS_010 5009-7007-PF 64 ⑧ 1353252 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)肽片段（其中所述片段不包含 CMS-01 〇序列）及其功能衍生物的等價物包括那些具有保 守氨基酸替換（如，V，A, P，E，H，L，A，N，K或T之 任種，由另一種具有相同生化類型殘基的氨基酸替代， 例如疏水的、親水的、正或負電荷基團）的。另一個CMS_〇i 〇 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)肽片段（其中所述片段不包含 CMS-010序列）及其功能衍生物的等價肽例子是稍微更長 的肽，例如更長一個或兩個氨基酸，而其保持相同的生物活 •性。另外，儘管上述用於 CMS-0 1 0 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK) 片段（其中所述片段不包含CMS-010序列）及其功能衍生 物的醫學應用的疾病或失調僅明確描述了細胞增殖和免疫 失調和/或疾病，但是這些醫學應用也僅用作非限制性的例 子並且不應當用於限制如申請專利範圍第的範圍。清楚的 是’存在有其他可能的/預期的CMS-010 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段（其中所述片段不包含 CMS-0 1 0序列）及其功能衍生物的應用，例如用作健康食品 補充劑來调即正吊人或患任何免疫和/或細胞增殖_失調和/ 或疾病的患者的免疫糸統。任何這類應用都歸入本發明的 範圍之内。 【圖式簡單說明】 五張附圖的每一張都顯示了連接肽與類固醇分子的典 型化學反應。 第1圖顯示了一系列用共價鍵連接肽與雌崔酮分子的 化學反應》 5009-7007-PF 65 ⑧ 1353252 第2圖顯示了產生與第1圖相同連接的第二套可選的 反應。 第3圖包括一系列設計用共價鍵連接肽與雌留二醇分 子的化學反應。 第4圖包括一系列產生與第3圖相同連接的第二套的 化學反應。 第5圖顯示了一種通過共價鍵連接肽與皮質醇分子的 方法。 【主要元件符號說明】 益

5009-7007-PF 66 1353252

Pro

<210> 4 <211> 16 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223〉合成肽序列 <400> 4

Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro Lys 1 5 10 15

<210> 5 <211> 16 ▲ <212> PRT 籲 <213>人造序列 <220> <223 >合成肽序列 <400> 5

Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn 15 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>合成肽序列 •<400> β

Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu 15 10 15 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>合成肽序列 <400> 7

Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro 15 10 ⑧ -2- 1353252 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223〉合成肽序列 <400> 8

Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro Lys 15 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213>人造序列 <220>

<223>合成狀序列 <400> 9

His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro Lys 15 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>合成肽序列 <400> 10

Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu 15 10 ^ <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>合成肽序列 <400> 11

Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro Lys 15 10 <210> 12 <211> 11 1353252 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 12 Val Ala Pro Glu 1 5 Glu

His Pro Thr Leu Leu Thr 10

<210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 13 Thr Leu Leu Thr 1 5 Glu

Ala Pro Leu Asn Pro Lys 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 14 Val Ala Pro Glu 1 5 Glu

His Pro Thr Leu Leu 10

<210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 15 Leu Leu Thr Glu 1 5 Ala

Pro Leu Asn Pro Lys 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> 人造序列 -4- 1353252 <220> <223>合成肽序列 <400> 16 Val Ala Pro Glu 1 5

Glu His Pro Thr Leu <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 17 Leu Thr Glu Ala 1 5

Pro Leu Asn Pro Lys <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 18 Val Ala Pro Glu 1 5

Glu His Pro Thr

<210> 19 <211> 8 <212> PRT <<213 >人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 19 Thr Glu Ala Pro 1 5

Leu Asn Pro Lys <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 1353252 <400> 20 Val Ala Pro Glu Glu 1 5 His Pro <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 21 Glu Ala Pro Leu Asn 1 5 Pro Lys

<210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 22 Ala Pro Leu Asn Pro 1 5 Lys

<210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 23 Val Ala Pro Glu Glu 1 5 His <210> 24 <211> 5 <212 > PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 24 Pro Leu Asn Pro Lys 1 5 ⑧ -6- 1353252 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>合成肽序列 <400> 25

Val Ala Pro Glu Glu 1 5 <210> 26 <211> 4 <212> PRT <213 >人造序列 <220>

<22 3>合成肽序列 <400> 26 Leu Asn Pro Lys 1 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213 >人造序列 <220> <223 >合成肽序列 <400> 27 Val Ala Pro Glu 1 <210> 28 <211> 3 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>合成肽序列 <400> 28 Asn Pro Lys 1 <210> 29 ⑧ 1353252

<211> 2 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 29 Val Ala 1 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 30 Val Ala Leu Leu Thr 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成肽序列 <400> 31 Val Ala Asn Pro Lys 1 5

Claims (1)

1353.252 100年5月27日修正替換頁 1 第 094Π2390 號 十、申請專利範圍： 1. 一種基本上純的狀，其由SEQ ID No· 24的氨基酸 序列組成。 2. —種藥物组合物，其包含由SEQ ID No. 24的氨基 酸序列組成的一種基本上純的肽。 3. 如申請專利範圍第2項的藥物組合物，其中所述肽 的給藥效果包括選自以下組的效果：調節免疫系統、抑制 腎炎以及減輕蛋白尿症。 4. 如申凊專利範圍第3項的藥物組合物，其中所述的 免疫系統調節是選自以下群組的一種調節：體内τ_淋巴細 胞轉化、由ConA造成的體外Τ-淋巴細胞轉化、Νκ細胞抑 制和抗體形成。 〇。一種田 SEQ ID No. 24的氨基酸序列組成的基本上純的肽，並將 所述肽與藥學上可接受的載體混合在一起。 6. 由SEQ ID NO. 24的氨基酸序列組成的一種基本上 純的肽在製備用於減少人類疾病效果的藥物的用途。 7. 如申請專利範圍第6項的基本上純的肽的用途，其 中所述人類疾病是免疫失調的病態。 8. 由SEQID眺24的氨基酸序列組成的—種基本上 純的肽在製備用於調節免疫系統的藥物的用途。 9·如申請專利範圍第8項的基本上純的肽的用途，1 中所述調節選自以下群組：體内τ_淋巴細胞轉 ： 造成的體外Τ_淋巴細胞轉化，細胞抑制和抗體形成:以 5009-7007-PF1 1 1353252 100年5月27日修正替換頁 ’第 094112396 號 10. 由SEQ ID No. 24氨基酸序列組成的一種基本上 純的肽在製備營養補充劑的用途。 11. 一種分子，其包含一種肽的增強衍生物，所述肽 由SEQ ID No. 24的氨基酸序列組成，所述增強衍生物包 含與所述肽可操作相連的增強分子，所述增強分子增強了 所述肽的治療活性。

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