KR101323771B1 - 생물학적으로 활성인 펩티드ｖａｐｅｅｈｐｔｌｌｔｅａｐｌｎｐｋ 유도체 - Google Patents

생물학적으로 활성인 펩티드ｖａｐｅｅｈｐｔｌｌｔｅａｐｌｎｐｋ 유도체 Download PDF

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Abstract

식 VAPEEHPTLLTEAPLNPK을 갖는 펩티드 CMS-010으로부터 유래된 펩티드는 약학 조성물로서의 이의 용도와 함께 개시된다. CMS-010으로부터 유래된 펩티드를 제공하는 단계 및 상기 펩티드와 약학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이 또한 개시된다.

Description

생물학적으로 활성인 펩티드 ＶＡＰＥＥＨＰＴＬＬＴＥＡＰＬＮＰＫ 유도체{Biologically active peptide VAPEEHPTLLTEAPLNPK derivatives}
본 발명은 짧은 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생물학적 활성을 갖는 짧은 펩티드에 관한 것이다.
펩티드는 질환의 치료를 위해 및 약학 조성물로서 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국특허 제6,191,113호는 평활근세포의 성장에 대해 저해 활성을 가지므로, 평활근세포의 성장과 관련된 병리학적 상태, 예를 들면, 동맥경화증, 혈관성형술 후의 재협착, 혈관 이식 후의 관내 협착 및 평활근 육종을 예방 및 치료하는데 유용한 펩티드를 개시한다. 미국특허 제6,184,208호는 상피 성장 지대의 체중 증가 활성 및 모발 성장과 같은 생리학적 과정을 조절하는 것으로 밝혀진 또 다른 펩티드를 개시한다. 더욱이, PCT 공개공보 WO 03/006492 및 미국특허출원 제10/237,405호는 특정 펩티드 및 이의 약학 조성물이 생물학적으로 활성이며, 면역반응을 조절할 수 있다는 것을 제시하였다.
그러므로, 본 발명의 목적은 생물학적 활성을 갖는 짧은 펩티드(들)을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명의 하나의 양태는 생물학적 활성을 포함하는 것으로 밝혀진 18개 아미노산을 함유하는 펩티드 CMS-010 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK) (서열번호 1)로부터 유래된 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지는 않는다. 시험 목적으로, 상기 펩티드 시료를 L-아미노산을 이용하여 화학적으로 합성하였다. 본 발명의 추가의 양태는 서열번호 2-31으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 분리 또는 정제된 펩티드를 포함하는데, 상기 펩티드는 펩티드 CMS-010 (서열번호 1)의 서열을 포함하지는 않는다. 또 다른 양태는 서열번호 2-31으로부터 선택된 펩티드를 포함하는 실질적으로 순수한 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지는 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2-31으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드의 투여인데, 상기 펩티드는 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지는 않으며, 상기 투여 효과는 면역세포 형질전환의 억제, NK 세포 활성의 억제, NK 세포 활성의 증진, 생체내 항체 형성의 억제, 세포 증식의 억제, 종양 성장의 억제, 신장염의 억제 및 단백뇨의 감소로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 면역세포 형질전환의 억제는 시험관 내에서 ConA의 T-림프구 형질전환의 억제이다. 특정 구현예에서, 면역세포 형질전환의 억제는 생체 내 T-림프구 형질전환의 억제이다. 특정 구현예에서, 세포 증식의 억제는 생체 내 육종 세포의 발생의 억제이다. 특정 구현예에서, 신장염의 억제는 항-신장 에피토프 항체로 인한 신장염의 억제이다.
본 발명의 부가적인 양태는 서열번호 2-31으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드는 L-아미노산으로 이루어진 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지는 않는다. 특정 구현예에서, 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드는 실질적으로 순수한 형태이다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드는 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지는 않는다. 특정 구현예에서, 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 약학 조성물은 L-아미노산으로 이루어진 펩티드를 포함한다.
본 발명의 여전히 또 다른 양태는 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드를 제공하는 단계, 및 상기 펩티드와 약학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법이다.
본 발명의 여전히 또 다른 양태는 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드의 약학적 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하는 인간 질환의 효과를 감소시키는 방법이다. 특정 구현예에서, 상기 인간은 세포 증식성 및/또는 면역성 질환으로 고생한다. 특정 구현예에서, 상기 세포 증식성 질환은 암, 육종 및/또는 종양이다.
본 발명의 부가적인 양태는 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드의 약학적 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하는 개인의 면역계를 조절하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드의 약학 화합물로서의 용도이다. 특정 구현예에서, 상기 펩티드는 세포 증식성 질환 및/또는 면역성 질환의 형태의 질환 상태를 치료하는데 이용된다. 특정 구현예에서, 치료되는 상기 세포 증식성 질환은 육종이다.
본 발명의 여전히 또 다른 양태는 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드의 면역계 조절자로서의 용도이다. 특정 구현예에서, 상기 면역계의 조절은 NK 세포 활성의 증진 또는 억제이다.
본 발명의 부가적인 양태는 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드의 영양 보조제로서의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 펩티드에 작동가능하게 연결된 증진 분자를 포함하는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드의 증진된 유도체를 포함하는 분자로서, 상기 증진 분자는 상기 펩티드의 치료학적 유효성을 증진시키며, 상기 펩티드는 펩티드 CMS-010의 서열을 포함하지 않는다.
발명의 상세한 설명
I. 서론
서열 VAPEEHPTLLTEAPLNPK을 갖는 펩티드 CMS-010 (서열번호 1)는 생물학적 면역 조절 활성을 가지며(미국특허 출원 제10/178,684호), 인간 용도에 대한 치료학적 가능성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 본 발명은 생물학적 활성을 갖는 CMS-010의 단편 및 유도체에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 이의 서열이 서열번호 2-31로서 제공된 단편 및 유도체를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 단편은 치환 및/또는 분자 그룹을 가질 수 있거나, 또는 VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)의 기능성 유도체일 수 있다. CMS-010 단편 및 유도체의 용도는 세포 및 조직의 조절을 포함한다. CMS-010 단편 및 유도체는 약학 제제 및 영양 보조제에 혼입될 수 있다.
CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드, 및 본 발명을 실시하는 또 다른 방법으로서 이의 기능성 유도체의 아미노 또는 카르복실 말단에 부가적인 아미노산을 첨가하는 것이 가능할 수 있다는 것을 이해한다. 상기 구현예에서, CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드, 및 이의 기능성 유도체는 본원에 기재된 하나 이상의 치료학적 또는 기능성 특성을 유지한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 하나 또는 2개의 아미노산이 이의 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 개시된 펩티드에 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)의 특정 부분을 포함하는 더 작은 분자는 VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)로부터 유래된 서열의 단일 스트레치(stretch)를 포함한다. 기타 구현예에서, VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)의 특정 부분을 포함하는 더 작은 분자는 VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)의 별개의, 인접하지 않은 부분으로부터 유래된 서열의 2 이상의 스트레치를 포함한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)의 특정 부분을 포함하는 더 작은 분자는 VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)의 N-말단 근처에서 발견되는 서열뿐만 아니라, VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)의 C-말단 근처에서 발견되는 서열을 포함하나, VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)에서 2개의 서열 사이에 발견되는 임의의 개재 서열(intervening sequence)은 없다. 추가의 구현예에서, 3개 또는 4개의 아미노산을 부가하고, CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(상기 단편은 CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드의 기능을 여전히 유지하는 것이 가능할 수 있다. 이는 모두 동일한 펩티드의 변이체로서 언급된다. 더욱이, 펩티드의 유도체, 예를 들면, 동일한 기능성 클래스 내의 하나의 아미노산의 또 다른 아미노산에 대한 보존 치환이 본 발명의 또 다른 양태를 실시하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 비극성 또는 소수성 측쇄를 갖는 펩티드는 생물학적 활성을 감소시키지 않고 하나의 측면 작용기를 또 다른 것으로 치환하는 것이 가능할 수 있다. 특정 구현예에서, CMS-010의 펩티드 단편은 원래의 펩티드 단편의 활성을 여전히 유지하면서 서열로부터 제거된 하나, 둘 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 예를 들면, 길이가 10개 아미노산인 CMS-010의 펩티드 단편은 상기 서열에서 N-말단 아미노산으로부터 5번째 아미노산이 없이 재합성된다. 그리하여 생성된 변이체는 단지 길이가 9개 아미노산이며, 원래 서열에서 N-말단으로부터 6번째 아미노산에 공유 결합된 N-말단으로부터 4번째 아미노산을 가지며, 10개 아미노산을 갖는 원래 펩티드 단편과 동일한 활성을 가진다. 2 이상의 아미노산이 CMS-010의 펩티드 단편의 서열로부터 제거된 특정 구현예에서, 제거된 아미노산은 원래의 펩티드 서열에서 서로 인접한다. 2 이상의 아미노산이 CMS-010의 펩티드 단편의 서열로부터 제거된 기타 구현예에서, 아미노산은 원래 서열과 서로 인접하지 않으며, 오히려 짧아진 변이체 펩티드에 존재하는 아미노산에 의해 원래의 서열에서 서로 분리된다. 3 이상의 아미노산이 CMS-010의 펩티드 단편으로부터 제거된 부가적인 구현예에서, 원래의 펩티드 단편 서열로부터 제거된 특정 아미노산은 서로 인접한 반면, 원래의 서열로부터 제거된 하나 이상의 아미노산은 제거된 원래의 서열 유래의 임의의 기타 아미노산과 인접하지 않다. 본 발명의 부가적인 구현예에서, 링커/스페이서 서열이 펩티드 내로 삽입되어 변이체를 형성할 수 있으나, 상기 변이체는 여전히 본 연구에 이용된 원래의 펩티드로서 이의 활성 모이어티를 보유한다. 이는 또한 펩티드의 변이체로 고려된다. 본원에 이용된 펩티드 유사체는 천연 아미노산의 구조를 모방하는 아미노산 분자를 갖는 펩티드, 예를 들면, 상이한 골격 구조, 또는 D-아미노산 치환을 갖는 유사체를 포함한다. 추가의 예로서, 펩티드를 합성하기 위해 이용된 아미노산이 이의 L 광학 이성질체 형태이지만, D-형태로 치환된 서열로 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩티드는 유사한 생물학적 활성을 가질 수 있다. 청구항에 이용된 용어 "기능성 유도체"는 펩티드의 단편, 변이체, 유사체 또는 화학 유도체를 포함하는 것을 의미한다.
"실질적으로 순수한 펩티드"는 순도가 10% w/w 이상, 더욱 바람직하게는 20% 이상, 더 더욱 바람직하게는 40%, 더 더욱 바람직하게는 60%, 훨씬 더욱 바람직하게는 90% 이상 순수한 펩티드를 말한다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 순도는 99% 이상이다. 상기 실질적으로 순수한 펩티드는 하기 기재된 복합 혼합물일 수 있는 약학적 및 영양학적 제형물을 제조하기 위해 이용될 수 있다.
"조절"은 본 발명의 펩티드의 투여 또는 펩티드에 노출에 의해 매개된 세포에 대한 효과를 말하는데, 세포에 펩티드의 투여 또는 노출은 세포의 활성에서 변화를 야기한다. 상기 변화는 세포의 활성을 증진 또는 억제할 수 있다. 세포의 활성의 증진 또는 억제는 세포 분열 및 복제의 속도의 증진 또는 억제, 기타 성분에 대한 세포의 반응의 증진 또는 억제, 및/또는 세포로부터 단백질 또는 화합물의 생산 및/또는 분비 속도의 증진 또는 억제일 수 있다.
"세포 증식"은 존재하는 세포 수의 증가를 말하며, 세포의 형질전환 또는 불멸화에 기인할 수 있다. 세포 증식 질환은 암, 양성 성장, 종양 및 육종을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 임의의 수의 세포를 포함할 수 있다. "면역성 질환"은 면역세포 또는 면역계의 기타 부분의 기능장애 또는 유해한 기능을 말한다. 상기 질환은 세포 또는 분자의 활성의 억제 또는 세포 또는 분자의 활성의 증진에 의해 야기될 수 있다.
CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드, 및 이의 기능성 유도체의 약학 제형물에서의 용도는 면역성 질환 또는 질병에 대한 가능한 치료로서 이용될 수 있다. 상기 제형물은 기타 펩티드를 포함하는 기타 활성 또는 불활성 성분과 혼합된, CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드, 및 이의 기능성 유도체를 가질 수 있는데, 예를 들면, 2개 내지 수개(예를 들면, 3-5) 펩티드가 기타 성분의 존재 또는 부재하에 동일한 제형물에 첨가될 수 있다. 대안적으로, CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드, 및 이의 기능성 유도체는 본원에 열거되지 않은 펩티드와 함께 제형물을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 이는 정맥내, 근육내, 피부내, 피하 또는 진피내 형태로 투여될 수 있다. 상기 투여 방식은 또한 문제의 기관으로 직접 인도하는 동맥내 주사일 수 있다. 기타 투여 방식은 경피, 분말 또는 분무로서 흡입, 및 당업자에게 공지된 기타 전달 형태이다. 상기 제형물은 또한 경구로 섭취될 수 있으며, 경구 섭취 후에 펩티드의 위 분해를 막기 위해 이용될 수 있는 담체 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 담체(리포좀과 같은 경피 전달용 담체)를 포함할 수 있다.
본원에 이용된, 용어 "혼성체 펩티드"는 상기 지정된 서열을 갖는 원래의 생물학적으로 활성인 펩티드 또는 이의 기능성 유도체 내로 삽입된 부가적인 펩티드를 포함하나, 여전히 실질적으로 유사한 활성을 보유하는 펩티드를 말한다. 상기 부가적인 펩티드는 예를 들면, 세포 또는 세포 외로 혼성체 단백질의 분비에 대한 신호로서 하나 이상의 원핵 또는 진핵 세포에 의해 인식되는 아미노산 서열을 포함하는 리터 펩티드를 포함한다. 상기 분비는 직접적인 분비, 또는 분비 소포를 통한 간접적일 수 있다.
본원에 이용된, 용어 "본질적으로 이루어진"은 카르복실 및/또는 아미노 말단에 부가적인 아미노산과 함께, 본원에 제공된 펩티드의 하나 이상의 활성을 유지하며, CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드, 및 이의 기능성 유도체를 말한다. 그리하여, CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드, 및 이의 기능성 유도체의 활성이 세포 증식성 또는 면역성 질환 또는 질병을 치료 및/또는 예방하는 비제한적인 예로서, CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드, 및 이의 기능성 유도체로 "본질적으로 이루어진" 펩티드 또는 폴리펩티드는 상기 펩티드에 대해 본원에 제공된 질환 또는 질병을 치료 및/또는 예방하는 활성을 가질 것이며, 세포 증식성 또는 면역성 질환을 치료 또는 예방하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 능력을 실질적으로 감소시키거나 또는 상기 질환 또는 질병의 치료 및/또는 예방제로서 펩티드의 기본적이고 신규한 특성에 대한 실질적인 변화를 구성하는 그 자체로 및 저절로(즉, 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자에 대한 부착에 의한 변형 전에) 임의의 특성을 갖지 않을 것이다. 그리하여, 이전 예에서, 세포 증식성 또는 면역성 질환을 치료 또는 예방하는 것 이외의 일차 활성을 가지며, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 전장 천연적으로 발생하는 폴리펩티드, 및 이의 기능성 유도체는 (CMS-010의 서열을 포함하지 않으나) 이의 서열이 전장 천연적으로 발생하는 폴리펩티드에 포함되는 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드로 "본질적으로 이루어진" 펩티드 또는 폴리펩티드 및 이의 기능성 유도체를 구성하지 않을 것이다. 마찬가지로, 이전의 예에서, 세포 증식성 또는 면역성 질환을 치료 및/또는 예방하는 것 이외의 일차 활성을 가지나, (CMS-010의 서열을 포함하지 않으나) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 유전자 조작된 펩티드 또는 폴리펩티드 및 이의 기능성 유도체는 이의 서열이 유전자 조작된 펩티드 또는 폴리펩티드에 포함된, (CMS-010의 서열을 포함하지 않으나) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드로 "본질적으로 이루어진" 펩티드 또는 폴리펩티드 및 이의 기능성 유도체를 구성하지 않을 것이다.
당업자는 VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010) 펩티드의 단편 및 유도체에 대해 본원에 제공된 세포 증식성 또는 면역성 질환을 치료 또는 예방하는 분석법을 이용하여 펩티드 또는 폴리펩티드의 활성을 측정함으로써, 펩티드 또는 폴리펩티드가 이전의 정의하에 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체로 본질적으로 이루어지는지를 용이하게 결정할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 용어 "본질적으로 이루어진"은 또한 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체 외에 5개 미만의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 말할 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, 동일한 용어는 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체 외에 2개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 말한다. 더 더욱 바람직한 구현예에서, 동일한 용어는 CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체 외에 1개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 말한다.
상기 약학 제형물은 임의의 공지된 약학 담체를 포함할 수 있다. 적당한 담체의 예는 당업자에게 공지된 임의의 표준 약학적으로 허용된 담체를 포함한다. 이는 생리식염수, 물, 오일 및 물 혼합물을 포함하는 에멀션 또는 트리글리세리드 에멀션, 및 기타 유형의 물질, 충전제, 코팅된 정제 및 캡슐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적당한 담체는 상기 약학 조성물의 투여 방식에 기초하여 선택될 수 있다.
CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 및 이의 기능성 유도체는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 및 피하 이식을 통해 투여될 수 있다. 상기 펩티드는 또한 위장 보호의 존재 또는 부재하에 변형 없는 통상적인 형태 또는 서방성 형태로, 정제, 캡슐, 현탁액, 용액 등과 같은 임의의 경구 투여 형태로 투여될 수 있다. 상기 펩티드는 경피 촉진 장치의 존재 또는 부재하에 연고, 크림, 겔 등과 같은 임의의 국부 적용 형태로 적용될 수 있다. 상기 펩티드는 또한 이의 유전적 서열로 해석되고, 독자적으로 또는 기타 펩티드 서열과 조합되어 발현 시스템 내로 클로닝되어 본원에 기재된 펩티드의 활성을 이용하는 펩티드 분자를 생성할 수 있다.
각 펩티드의 투여량은 체중 kg당 lng - 10g 일 수 있다. 바람직한 투여량은 주사 투여 방식에 대해 kg당 lOng - 10mg이며, 더욱 바람직하게는 1㎍ - lmg 이다. 그러나, 유효 투여량은 체중 kg당 lng 만큼 낮을 수 있는데, 이는 하나 이상의 펩티드가 일련의 정상적인 생리학적 반응을 유도할 수용체를 통해 작동할 수 있기 때문이다. 대안적으로, 하나 이상의 펩티드는 전체 일련의 반응에 대한 개시자일 수 있다. 경구 섭취에 대해, 상기 양은 체중 kg당 1일 1ng - 10g, 더욱 바람직하게는 체중 kg당 1일 0.1㎍ - 1g, 더 더욱 바람직하게는 1일 1㎍ - 10mg 일 수 있다.
II. 유전자 요법 및 치료 방법
상기 펩티드 서열에 기초한 유전자 요법은 상기 펩티드 중의 하나를 코딩하는 핵산 서열을 디자인함으로써 수행된다. 상기 핵산은 화학적으로 합성되며, 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 상기 발현 벡터는 이어서 인간 세포에서 발현을 위한 유전자 요법의 형태로서 인체 내로 투여된다. 본원에 이용된 용어 "유전자 벡터"는 상기 발현 벡터를 포함한다. 유전자 요법에 이용될 수 있는 벡터는 아데노-연관 바이러스(Mizuno, M. et al. (1998). Jpn J Cancer Res 89, 76-80), LNSX 벡터 (Miller, A. D. et al. (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) 및 렌티바이러스 (Goldman, M. J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268)를 포함한다.
펩티드 전달을 위한 기타 운반체는 숙주 생물체의 건강에 현저한 유해한 효과 없이 펩티드를 투여하기를 원하는 숙주 생물체에서 복제할 수 있는 생물체 내로 전달될 수 있는 원하는 펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 포함한다. 예를 들면, 상기 발현 벡터는 상기 펩티드를 투여하기를 원하는 숙주 생물체에 병원성이 아닌 생물체 내로 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 발현 벡터는 펩티드를 투여하고자 하는 숙주 생물체의 건강에 현저한 유해 효과를 가지지 않는 박테리아 또는 진균 생물체에서 원하는 펩티드를 생산한다. 예를 들면, 원하는 펩티드를 코딩하는 상기 발현 벡터는 젖산 박테리아, 대장균, 또는 효모와 같은 생물체에서 원하는 펩티드를 생산하는 발현 벡터일 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 발현 벡터는 포유류 창자에서 정상적으로 발견되는 미생물 또는 포유류 소화관에 의해 견디는 미생물에서 원하는 펩티드를 생산한다. 원하는 펩티드가 발현될 수 있는 미생물 종의 일부는 락토바실러스 종, 예를 들면, 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus), 락토바실러스 아밀로보루스(L. amylovorus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus), 락토바실러스 갈리나룸(L. gallinarum), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 존슨아이(L. johnsonii), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 람노수스(L. rhamnosus) 또는 기타; 비피도박테리움 종, 예를 들면, 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis), 비피도박테리움 아니말루스(B. animalus), 비피도박테리움 비피둠(B. bifidum), 비피도박테리움 브레베(B, breve), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 락티스(B. lactis), 비피도박테리움 론굼(B. longum) 또는 기타; 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 엔테로코커스 파시움(Ent. facium); 스포로락토바실러스 이눌리누스(Sporolactobacillus inulinus); 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus); 대장균(Escherichia coli); 프로피오니박테리움 프루덴라이키아이(Propionibacterium freudenreichii); 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 사카로마이세스 불라디아이(Saccharomyces boulardii)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
cDNA 분자를 생산하기 위한 mRNA의 역전사를 포함하나 이에 제한되지 않는 화학적으로 합성되거나 기타 수단에 의해 생산된 본 발명의 임의의 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 당업자에게 친숙한 유전 공학 방법에 의해 원하는 생물체 내로 유전자 전달을 위해 발현 벡터 내로 혼입된다. 상기 발현 벡터는 DNA 벡터 또는 RNA 벡터일 수 있다. 예를 들면, 상기 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 유전자 성분에 기초할 수 있다. 상기 발현 벡터는 염색체 외에서 복제하는 벡터 또는 염색체 내로 통합되는 벡터일 수 있다.
상기 발현 벡터는 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 조절성 프로모터, 예를 들면, 유도성 프로모터, 또는 구성적(constitutive) 프로모터일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 원하는 수준의 펩티드 발현을 제공하기 위해 선택될 수 있다. 또한, 원한다면, 상기 발현 벡터는 펩티드의 생산, 제시(presentation) 및/또는 분비를 촉진하기 위한 기타 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산은 상기 펩티드의 분비를 지시하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산은 신호 펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 펩티드를 코딩하도록 조작된 상기 발현 벡터는 포유류의 정상적인 창자 균총, 예를 들면, 락토바실러스 종 및 바실러스 서브틸리스를 구성하는 박테리아 종에서 본 발명의 펩티드를 발현하는데 적합한 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터의 예는 각각 미국특허 제6,100,388호(Casas) 및 제5,728,571호(Bellini)에서 발견될 수 있다. 상기 문헌은 전체적으로 명백히 본원에 원용에 의해 포함된다. 펩티드를 투여하고자 하는 숙주 생물체의 건강에 유해지 않은 생물체에서 본 발명의 펩티드의 발현을 촉진하는 임의의 발현 벡터가 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 펩티드를 코딩하도록 조작된 상기 발현 벡터는 포유류 창자에 의해 잘 견디는 효모 종, 예를 들면, 인간 창자를 집락(colonize)할 수 있으며, 특정 형태의 설사를 치료하기 위해 이용되는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae); 또는 바람직하게는 사카로마이세스 불라디아이(Saccharomyces boulardii)에서 본 발명의 펩티드를 발현하는데 적합한 발현 벡터일 수 있다. 이종 단백질 및 펩티드를 지속적으로 발현하며, 매우 안정하므로, 유사분열 및 감수분열 동안 자손 세포에 잘 전달되며, 고 수준의 재조합 단백질 분비를 유도하는 신호 펩티드(들)에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있는 효모 발현 벡터가 이용될 수 있다. 상기 효모 벡터의 예는 전체적으로 본원에 명백히 원용에 의해 포함되는 미국특허 제6,391,585호(Jang 등)에 제공된다.
본 발명의 펩티드를 코딩하는 상기 발현 벡터는 당업계에 공지된 기술을 통해 상기 펩티드를 발현하도록 의도된 생물체 내로 도입될 수 있다. 상기 기술은 화학적으로 적격인 박테리아 세포, 전기천공법 또는 리튬 아세테이트 형질전환(효모용)의 이용을 통한 박테리아, 효모, 또는 기타 미생물을 형질전환하는 전통적인 방법뿐만 아니라, 상기 절차에 까다로운 박테리아 종의 형질전환에서 최근의 진전을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 발현 벡터는 이의 개시가 전체적으로 본원에 원용에 의해 포함된 Leer 등 (WO 95/35389)에 의해 개시된 방법을 이용하여 형질전환에 까다로운 것으로 알려진 젖산 박테리아 내로 도입된다. 상기 도입된 서열은 미생물 염색체 DNA 내로 혼입될 수 있거나 또는 염색체 외 DNA 성분으로서 잔존할 수 있다.
상기 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 미생물은 이어서 소화관, 질, 기관 등 내로 접종되어 지속된 면역요법을 달성할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 펩티드를 발현하는 상기 생물체는 불활성 형태 또는 바람직하게는 살아있는 형태로 섭취된다. 상기 창자에서, 상기 미생물은 상기 펩티드를 생산하며, 이를 분비 또는 미생물의 용균(lysis)에 의해 루멘 내로 방출하거나, 또는 그렇지 않으면 상기 펩티드를 숙주에 제공하여, 상기 펩티드가 숙주 생물체에 이의 원하는 효과를 생성한다. 기타 구현예에서, 펩티드는 콧구멍, 질 또는 소장의 점막에서 숙주에게 제공된다.
치료의 또 다른 방법은 인체에서 세포에 특정 핵산을 전달하는 수단으로서 리포좀의 이용이다. 핵산 (예를 들면, CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터)은 [Gao, X. and Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722 및 US 6,207,456]에 기재된 세포 흡수 및 염색체 혼입을 촉진하는 환경에서 전달된다. 대안적으로, 펩티드 자체는 리포좀에 캡슐화될 수 있으며, US 6,245,427에 기재된 방법을 이용하여 직접 전달될 수 있다. 상기 표시된 모든 과학적 공보 및 특허는 전체적으로 본원에 원용에 의해 포함된다.
전술한 유전자 요법 및 치료 방법에 유용한 핵산 서열은 상기 펩티드 및 이의 기능성 유도체를 코딩하는 서열을 포함한다. 임의의 수많은 핵산 서열이 축퇴 코돈 시스템에 기초하여 상기 펩티드 및 이의 유도체를 코딩하기 위해 이용될 수 있다.
하기 참고문헌은 전체적으로 본원에 원용에 의해 포함된다.
Figure 112006077372848-pct00001
Figure 112006077372848-pct00002
III. (CMS-010의 서열을 포함하지 않는) 서열번호 2-31을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체를 갖는 제형 물 및 상기 펩티드에 대한 펩티드 접합
본 발명의 생물학적으로 활성인 펩티드는 기타 생물학적으로 유효하거나 유용한 분자에 접합되어 부가적인 효과 또는 용도를 제공하거나 또는 이의 치료학적 유효성을 증진시킬 수 있다. 많은 잠재적인 접합 분자, 이의 생물학적 효과 및 펩티드에 분자를 접합하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 기타 후보 접합 파트너에 대해, 본 발명의 펩티드를 거기에 접합하는 화학 반응은 부당한 실험화 없이 당업자게 의해 추론될 수 있다.
유효한 분자가 하기에 기재된다. 본 발명에 따른 다양한 펩티드가 이의 유효한 분자에 접합될 수 있는 방법 및 생성된 접합 산물의 생물학적 특성의 특정 예가 기재된다. 본 발명의 기타 펩티드가 또한 유사한 반응으로 접합될 수 있다는 것을 이해한다.
CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 단편 및 이의 기능성 유도체는 특정 세포 또는 조직 유형에 대한 독특한 치료 효과를 가질 수 있다. 펩티드 약물에 분자를 접합하는 하나의 중요한 목적은 치료되는 개인의 체내의 특정 위치 또는 구획에 펩티드의 표적화이다. 상기 방식으로, 펩티드 약물 및 이의 효과는 의도한 치료 효과를 갖는 세포 또는 조직 유형의 위치에 집중될 수 있다. 이는 유리의 접합되지 않은 펩티드의 유사한 몰 양이 가질 수 있는 효과를 확장시킬 수 있다. 역으로, 이의 치료 활성 자리에 표적화된 접합된 펩티드 약물의 투여량은 약물의 유리의 접합되지 않은 형태로부터 동일한 치료 효과를 수득하기 위해 요구되는 투여량보다 현저하게 낮을 수 있다.
이의 활성이 가장 요구되는 자리에 펩티드 약물을 표적화하는 또 다른 유리한 효과는 원하지 않는 부작용의 감소이다. 특정 세포 또는 조직 유형에서 변화를 달성하기 위해 투여되는 펩티드 약물은 또한 종종 유해한 결과와 함께, 개인 내의 기타 위치에서 작용할 수 있다. 표적화 분자에 대한 접합을 통해 활성의 원하는 위치에 펩티드를 표적화함으로써, 개인에서 다른 위치에서 펩티드의 농축 및 이은 부작용이 감소될 수 있다.
CMS-010의 서열을 포함하지 않는, 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체는 개인의 신체를 통해 상이한 위치로 표적화하기 위해 다양한 분자에 접합될 수 있다. 원하는 위치에 펩티드를 표적화하기 위해 하기 기재된 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 본 발명의 임의의 펩티드에 대해 이용될 수 있다. 예를 들면, 간세포에 항-B형 간염 약물의 선택적인 전달이 증명되었다 (전체적으로 본원에 원용에 의해 포함된, Fiume et al., Ital J Gastroenterol Hepatol, 29(3): 275, 1997). 상기 연구에서, 연구가들은 B형 간염 바이러스에 대해 활성인 인산화된 뉴클레오시드 유사체인 아데닌 아라비노시드 모노포스페이트(ara-AMP)를 갈락토실 말단 거대분자인 락토사민화된 인간 알부민에 접합시켰다. 간세포는 높은 친화도로 말단 갈락토실 잔기와 상호작용하는 수용체 단백질을 발현한다. 상기 수용체에 대한 결합을 통해, 접합된 약물은 간세포에 의해 선택적으로 흡수될 것이다. 흡수 후에, 접합된 약물은 리소좀으로 전달되며, 거기에서 접합된 약물의 2가지 성분 사이의 결합이 절단되며, 이의 활성 형태로 ara-AMP를 방출한다. 상기 인용된 연구에서, 접합된 약물은 만성 B형 간염을 갖는 환자를 치료할 때 유리 ara-AMP 만큼 효과적이었으나, 유리 ara-AMP의 투여가 야기하는 신경독성과 같은 임상적인 부작용은 야기하지 않았다. 상기 접근은 본 발명의 임의의 펩티드에 대해 이용될 수 있다.
동일한 연구 팀(Di Stefano et al., Biochem. Pharmacol., 61(4): 459, 2001)에 의한 상기와 관련된 연구에서, 항암 화학요법제인 5-플루오로 2-데옥시우리딘 (FUdR)은 락토사민화된 폴리-L-라이신에 접합되어 상기 화합물을 간에 표적화하고, 간 미소한 전이를 치료하였다. 상기 약물은 FUdR 및 표적화 분자 사이의 결합을 절단하는 간세포에 의해 선택적으로 흡수된다. 유리 FUdR의 부분은 이어서 간세포를 빠져나갈 것이며, 항암제의 국부화된 치료 농도가 생성된다. 상기 농도는 간에 침윤하는 전이성 세포에 대한 약리학적 활성에 대해 충분하다. 상기 약물은 간에 선택적으로 농축되기 때문에, 접합된 약물의 투여량은 유리의 접합되지 않은 화합물의 가장 적은 약리학적으로 활성인 투여량보다 현저하게 적을 수 있다. 상기 전략이 본 발명의 임의의 펩티드에 대해 이용될 수 있다. 예를 들면, (CMS-010의 서열을 포함하지 않는) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체에 락토사민화된 폴리-L-라이신의 접합은 간 조직을 포함하는 세포 증식성 질환을 치료 또는 예방하기 위해 필요한 투여량을 현저하게 감소시킬 수 있었다.
체내의 특정 조직 또는 세포 유형에 화합물의 표적화는 수많은 상이한 조직 또는 세포 유형에 대해 달성되었다. 예를 들면, 종양 세포는 종종 이의 표면 상에 봄베신, 황체형성호르몬 방출 호르몬, 및 소마토스타틴과 같은 비정상적으로 높은 수준의 호르몬 수용체를 발현한다. 하나의 연구에서, 항암 화합물인 파클리탁셀(택솔)이 상기 약물과 소마토스타틴의 유사체인 오스트레오티드와 접합시킴으로써 고 밀도로 소마토스타틴 수용체를 발현하는 호르몬 분비 종양 세포에 선택적으로 표적화되었다. 상기 오스트레오티드 접합된 택솔은 유리 택솔만큼 효과적이었으나, 정상 세포에 대해 감소된 독성이었다 (Huang et al., Chem. Biol., 7(7): 453, 2000). 펩티드 호르몬 수용체 작용제의 유사체에 본 발명의 펩티드를 접합하기 위해 Huang 등의 기술을 이용하는 것은 고 수준의 특정 펩티드 호르몬 수용체를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 치료를 생성할 수 있다. 상기 접근은 임의의 수의 펩티드 호르몬 수용체를 과발현하는 표적 세포에 적합할 수 있다. 약물을 특정 조직 유형에 표적화하는 또 다른 예에서, 폴리(L-아스파르트산)이 결장 세포에 특이적으로 약물 전달을 표적화하기 위한 담체 분자로서 이용되었다 (Leopold et al., J. Pharmacokinet. Biopharm., 23(4): 397, 1995).
특정 세포 또는 조직 유형에 펩티드 약물의 특이적 표적화를 넘어서, 담체 분자에 (CMS-010의 서열을 포함하지 않는) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체의 접합은 펩티드 약물의 전달을 증진하는 기타 방식을 제공할 수 있으며, 이로 인해 이의 치료 효과를 확대 또는 그렇지 않으면 개선할 수 있다. 하기 기재된 임의의 접합 기술이 당업자에게 친숙한 기타 기술에서처럼, 본 발명의 임의의 펩티드에 대해 이용될 수 있다. 임의의 약물의 유효성은 화합물이 이의 표적에 효율적으로 전달될 수 없다면 방해될 것이다. 약물은 대사 프로세싱 또는 분해로 인한 활성의 실질적인 손실 없이 이의 활성 자리로 활동적으로 또는 다른 방법으로 수송되어야 한다. 펩티드 약물은 펩티다아제의 활성을 받기 쉬우며, 매우 하전된 분자로서, 혈액뇌장벽과 같은 지질 세포막 및 내피 세포막을 횡단하여 수송하는 것에 저항성일 수 있다. 기타 분자에 접합은 분해로부터 펩티드를 보호하고, 펩티드 약물의 통상적으로 상기 화합물을 배제하는 세포 또는 해부학적 구획 내로 흡수를 증진시키는 방식을 제공한다.
정상적으로 배제될 수 있는 신체 내의 위치에 펩티드 접근을 허용함으로써, 접합 기술은 약물의 투여에 대한 새로운 경로를 열 수 있다. 이의 화학이 하기 실시예 5에 상술되며, 전체적으로 본원에 원용에 의해 포함되는 [Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3): 434]에서, 연구자들은 강력한 진통제인 헵타펩티드 델토르핀으로 알려진 펩티드 약물을 펩티드가 혈액뇌장벽을 횡단하도록 하기 위해 특이적으로 디자인된 유기 분자에 접합하였다. 이는 상기 약물을 뇌실내 주사 대신에 정맥내로 투여하게 한다.
Patel 등에서 담체 분자는 펩티드가 상기 장벽을 횡단하도록 허용하는 것 외에 혈액뇌장벽을 포함하는 내피 세포를 특이적으로 표적화하도록 디자인되었다. 혈액뇌장벽을 포함하는 신체를 통한 내피 세포막은 서열 특이성 및 이의 표면 상에 나타나는 막 결합 엔도펩티다아제의 농도에 대해 이질적이다. 상기 분자의 디자인은 담체 분자 및 이의 짐(cargo)의 표적화를 허용하는 상기 특성을 이용한다.
상기 분자는 이의 유리 말단이 혈액뇌장벽의 엔도펩티다아제와 우선적으로 상호작용할 디펩티드 Arg-Pro로 캡핑된 3개의 지방산 사슬을 포함한다. 하전된 펩티드 약물 분자의 수송은 이어서 친유성 지방산 사슬에 의해 가능해진다. 그리하여, 상기 디펩티드-캡핑된 트리글리세리드 분자는 혈액뇌장벽을 통한 표적화 및 수송 양자를 허용한다.
접합 방법은 또한 펩티드 약물의 활성의 동력학을 증진할 수 있다. 펩티드 활성의 동력학을 증진하기 위해 하기에 기재된 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 (CMS-010의 서열을 포함하지 않는) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체에 대해 이용될 수 있다. Patel 등은 진통제 펩티드의 접합된 형태가 혈류로부터 뇌로 들어갈 수 있을 뿐만 아니라, 또한 유리 펩티드와 비교하여 지속된 작용을 가진다는 것을 발견하였다. 정맥내로 투여된 약물은 치료 효과를 가지는데 더 긴 시간이 필요하였으나, 효과는 더 장기간 지속되었으며, 두개내로 주사된 유리 펩티드의 효과보다 더욱 천천히 감소되었다. 연구자들은 상기 접합된 펩티드 분자가 혈청에서 현저하게 안정하며, 여전히 뇌실내로 주사될 때 효과가 없다는 것을 발견하였는데, 이는 상기 담체 분자가 아마도 혈류에서 뇌로 수송 동안 분해되며, 제거된다는 것을 나타낸다. 이들은 상기 접합물을 수송하고 담체 분자를 분해하는데 필요한 시간이 변경된 동력학의 원인이라는 것을 의심한다. 임상 세팅에서 지연의 역학과 무관하게, 상기 접합된 펩티드 분자의 정맥내 안정성 및 상기 약물의 효과의 지연된 개시 및 활성은 덜 자주 투여될 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 덜 자주이며, 더욱 편리한 투여 계획은 치료 선택으로서 상기 약물의 실질적인 가치를 증진시킨다.
당업자에게 인식될 수 있는 바와 같이, Patel 등의 기술 및 절차는 본 발명의 임의의 펩티드를 포함하는, 제한된 크기 범위 내에 해당하는 임의의 펩티드의 전달에 용이하게 적용가능하다. 예를 들면, 세포 증식성 또는 면역성 질환을 치료 및/또는 예방하는 본 발명의 펩티드, 예를 들면, VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)의 단편은 Patel 등에 의해 이용된 동일한 분자에 접합될 수 있었다. 뇌에 영향을 주는 감염을 갖는 개인의 치료에서, 상기 접합된 분자는 혈류로부터 뇌에 VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)의 단편의 접근을 허용할 수 잇으며, VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)의 단편이 뇌에서 세포 또는 조직에 이의 효과를 가지게 할 수 있다. 상기 담체 분자의 표적화를 변경하는 변형은 또한 당업자에게 명백할 것이다. 담체 분자의 표적화 특징은 지방산 사슬의 말단에 디펩티드 마스크를 포함하는 2개의 아미노산의 실체의 기능이다. Arg-Pro 디펩티드는 혈액뇌장벽의 내피막의 표면 상에 발견되는 막 결합 엔도펩티다아제의 세트와 우선적으로 상호작용한다. 기타 내피 세포 및 막은 기타 디펩티드 조합에 의해 잠재적으로 표적화될 수 있다.
접합은 또한 소화관을 통해 또는 경피로 효과적으로 흡수될 수 있는 펩티드 약물을 생성하기 위해 연구자들에 의해 이용되어 왔다. 하기 기재된 흡수를 증진시키기 위한 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 (CMS-010의 서열을 포함하지 않는) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체의 흡수를 증진하기 위해 이용될 수 있다. Kramer 등은 담즙산에 펩티드 약물의 커플링에 대한 절차를 기재한다. 화합물의 경구 전달에 따른 접합된 분자에 대한 흡수 속도는 펩티드 단독과 비교하여 현저하게 증진된다 (J. Biol. Chem., 269 (14): 10621, 1994). Toth 등(J. Med. Chem., 42(19): 4010, 1999)은 이의 활성 자리에 항암 펩티드의 흡수 속도를 증가시키고 전달을 증진시키기 위해, 지질아미노산 (LAA) 또는 리포사카라이드 (LS)에 항종양 특성을 갖는 펩티드 약물의 접합을 기재한다. 이들의 연구에서, 강한 항증식성 특성을 보여주나, 손상된 약동학을 갖는 소마토스타틴의 유도체는 LAA 또는 LS에 접합된다. 생성된 접합체 약물은 피부 및 창자 상피를 횡단하여 개선된 흡수 프로필 및 분해에 대한 증가된 내성을 가지는 반면, 여전히 종양 세포에 대해 활성이다. 상기 기술은 본 발명의 임의의 펩티드와 함께 매우 유용할 수 있다. 장 상피를 횡단하여 분자의 흡수 속도를 증가시킴으로써, 더욱 많은 펩티드가 혈류로 전달될 수 있으며, 치료되는 개인에게 효과를 나타낼 수 있다.
접합은 또한 펩티드 약물의 지속된 방출을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 지속된 방출을 제공하기 위한 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 (CMS-010의 서열을 포함하지 않는) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체의 지속된 방출을 제공하기 위해 이용될 수 있다. Patel 등의 연구에서 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 약물의 지속된 전달은 접합된 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 또 다른 예는 Kim 등 (Biomaterials, 23: 2311, 2002)의 연구인데, 여기에서 재조합 인간 표피성장인자 (rhEGF)가 생분해성 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA) 미세구에서 미세캡슐화 전에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합되었다.
PLGA에서 미세캡슐화는 다양한 성장인자 및 형태발생 단백질을 전달하기 위해 수 개의 그룹에 의해 이용되었다 (Meinel et al., J. Controlled Rel., 70: 193, 2001). PEG에 접합을 통해, rhEGF는 수불용성 응집체의 형성 및 비접합된 유리의 rhEGF와 비교하여 PLGA를 갖는 마이셀 형성 동안 물-유기상 경계면에 대한 흡수에 내성이 되었다. 접합된 호르몬을 갖는 제형물의 약동학은 유리 호르몬에 대한 것보다 장기간 지속, 안정되고 전반적으로 더 큰 약물 활성을 보여주면서 개선되었는데, 이는 연구자들이 생각하기에 PEG에 접합된 호르몬의 증진된 물리적 안정성에 기인한 것 같다. 유사한 전략이 본 발명의 임의의 펩티드의 지속된 방출 제형물을 생성하기 위해 이용될 수 있었다. 예를 들면, 하기 실시예 1에서 알수 있는 바와 같이, VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)의 특정 단편 및 유도체는 강력한 항증식성 및 면역조절성 효과를 나타낸다. 상기 펩티드에 PEG를 접합하고, 상기 접합된 약물을 PLGA 미세구에 혼입함으로써, VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010)의 단편 및 유도체의 항증식성 및 면역조절성 효과는 이의 PEG 접합체로부터 방출될 때 상기 약물의 투여에서처럼, 더 장기간 지속되고 더욱 안정할 수 있으며, 더욱 균일하고, 감염 자리로 상기 펩티드 약물의 더욱 일정한 전달을 보장한다.
펩티드 약물의 장기간 방출은 이의 활성을 현저하게 증진시킬 수 있다. 하기 기재된 펩티드의 연장된 방출을 제공하기 위한 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 (CMS-010의 서열을 포함하지 않는) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체의 연장된 방출을 제공하기 위해 이용될 수 있다. Oldham 등 (Int. J. Oncology, 16: 125, 2000)은 약물의 신규 형태인 폴리(L-글루탐산) (PG-TXL)에 접합된 파클리탁셀에 대한 항암제 파클리탁셀을 비교한다. PG-TXL은 유리 파클리탁셀과 비교하여 우수한 항종양 활성을 가진 것 같은데, 이는 상기 약물이 우수한 약동학적 특성을 가지거나 또는 심지어 우수한 작용 방법일 수 있다는 것을 제시한다. 그러나, 연구자들은 PG-TXL이 미세소관 서브유닛의 중합을 방해함으로써 세포 주기 정지(arrest)를 유도하면서, 유리 약물과 동일한 작용 기작에 의해 이의 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다.
증거는 상기 접합된 약물의 우수한 항종양 활성이 유리 펩티드의 투여와 비교하여 장기간 동안 이의 치료학적 농도를 유지하면서, 상기 접합체로부터 유리 약물의 연속적이고 안정한 방출에 기인한다는 것을 제안한다. 감염과 싸우는 특성을 갖는 본 발명의 펩티드에 폴리(L-글루탐산) 꼬리의 첨가는 또한 상기 특성을 증진시킬 수 있었다.
펩티드의 효소 분해는 특정 경우에, 약물로서 펩티드의 유효성을 감소시킬 수 있다. 하기 기재된 펩티드의 효소학적 분해를 감소시키는 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 (CMS-010의 서열을 포함하지 않는) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체의 효소학적 분해를 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 연구자들은 창자에서 루멘으로 분비되는 프로테아제뿐만 아니라 막 결합 펩티다아제로부터 펩티드를 보호하기 위한 수많은 접근법을 개발하였다. 후자는 모든 점액 조직의 표면 상에 발견되며, 이의 횡단은 종종 펩티드 약물에 대한 도입 경로이다. Bernkop-Schurch 등 (J. Drug Target., 7: 55, 1999)은 펩신의 저해제를 포함하는 펩티드 약물 제형물의 생성을 보고한다. 펩스타틴의 유사체는 점막부착 중합체에 공유적으로 부착되었으며; 상기 신규한 펩신 저해제는 인슐린을 포함하는 정제에 포함되었다. 분해를 가장하는 실험실 조건하에 인큐베이션 후에, 대조군 정제 유래의 모든 인슐린은 대사된 반면, 저해제를 포함하는 정제 유래의 거의 50%의 인슐린은 분해로부터 보호되었다. 또 다른 연구에서, 동일한 그룹은 생물학적으로 활성인 펩티드의 분해를 저해하는 독성 부작용을 정상적으로 야기할 수 있는 투여량으로 프로테아제 저해제를 이용하였다 (Bernkop-Schnurch et al., Adv. Drug Del. Rev., 52: 127, 2001). 상기 접근은 키틴으로부터 추출된 셀룰로오스와 관련된 아미노폴리사카라이드이며, 갑각류 및 기타 생물체에서 발견되는 주요 구조적 폴리사카라이드인 키토산을 이용한다. 프로테아제 저해제를 키토산에 접합하고, 상기 접합된 분자를 펩티드 약물의 제형물에 포함함으로써, 유리 프로테아제 저해제의 투여에 대해 예상될 수 있는 부작용 없이, 펩티드의 생체이용율을 증가시키면서, 소화관 프로테아제의 현저한 저해가 관찰되었다. 상기 연구에서, 다양한 프로테아제 저해제 단독 및 조합이 키토산 담체에 접합을 위해 이용되었다. 키토산-EDTA 접합체는 활성을 위해 특정 프로테아제에 의해 요구되는 미네랄 보조인자를 결합함으로써, 또한 내재하는 프로테아제를 저해하였다. 당업자에게 용이하게 명백할 수 있는 바와 같이, 담체 분자 및 효과기(effector) 모이어티 사이의 수많은 가능한 조합이 펩티드 제형물에 유리한 특성을 제공하기 위해 생성될 수 있었으며, 이의 어느 것도 본 발명의 펩티드에 용이하게 이용하기에 적합할 수 있었다. 키토산에 결합된 프로테아제 저해재를 이용하여 펩티드의 경구 전달용 제형물을 생성함으로써, 본 발명의 펩티드의 경구 전달은 근육내 주사 대신에 이용될 수 있었다. 상기 접근은 (CMS-010의 서열을 포함하지 않는) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체에 대한 심지어 더 높은 수준의 생체이용율을 생성하기 위해 제형물에 상기 펩티드 및 이의 유도체의 더욱 흡수가능한 접합된 버전을 이용하는 것을 배제하지 않는다.
또 다른 분자에 의해 위치로 표적화되는 것 외에, 펩티드 스스로는 표적화하는 분자로서 이용될 수 있다. 하기 기재된 원하는 위치에 분자를 표적화하기 위해 펩티드를 이용하는 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 (CMS-010의 서열을 포함하지 않는) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체에 대해 이용될 수 있다. 예를 들면, 연구자들은 항암 약물 디플로오로메틸오르니틴(DFMO)을 취하고, 표적화 목적으로 이를 펩티드에 접합시켰다. DFMO는 다양한 종양 세포 유형을 죽이는데 효과적인 매우 세포독성 물질이다. 그러나, 신체로부터 신속하게 제거되므로, 이의 치료 가치는 제한된다. 본 연구에서, DFMO는 멜라노트로핀의 특정 단편 및 인간 흑색종 세포주 상의 멜라노트로핀 수용체에 우선적으로 결합하는 것을 밝혀진 2개의 아미노산 치환을 포함하는 상기 단편의 유사체에 접합되었다 (Suli-Vargha et al., J. Pharm. Sci., 86: 997, 1997). 아미노펩티다아제에 의해 상기 펩티드로부터 DMFO의 방출을 촉진하기위해, 상기 약물은 상기 펩티드이 N-말단에 접합되었다. 연구자들은 상기 접합된 약물은 비접합된 약물 단독보다 흑색종 세포를 죽이는데 더욱 효과적이라는 것을 발견하였다.
본 발명의 펩티드의 효과는 펩티드 자체에 본질적인 표적화 능력에 부분적으로 기인할 수 있다. 예를 들면, 멜라노트로핀 단편처럼, 본 발명의 펩티드는 독특한 유형의 세포의 표면 상에 발견되는 특정 수용체에 결합할 수 있다. 접합체로서 상기 펩티드를 이용함으로써, 약물은 상기 약물을 이용하여 치료되는 개인의 신체 내의 상기 세포의 위치에 표적화될 수 있었다.
접합체로서 펩티드는 표적화 이외의 기능을 수행할 수 있다. 하기 기재된 펩티드이 치료학적 유효성을 증진하기 위한 임의의 접합 기술뿐만 아니라, 당업자에게 친숙한 기타 접합 기술이 (CMS-010의 서열을 포함하지 않는) 서열번호 2-31로부터 선택된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 펩티드 및 이의 기능성 유도체의 치료학적 유효성을 증진하기 위해 이용될 수 있다. Fitzpatrick 등은 두 분자 사이에 펩티드 스페이서를 이용함으로써 접합된 항암제를 개선하였다 (Anticancer Drug Design, 10: 1, 1995). 메토트렉세이트는 이미 종양 세포에 의한 이의 흡수 및 종양 세포에 대한 활성을 증가시키기 위해 인간 혈청 알부민(HSA)에 접합되었다. 세포에 의해 일단 흡수되면, 메토트렉세이트의 일부는 리소좀에 있는 효소에 의해 상기 접합체로부터 방출되며, 이어서 이의 세포독성 효과를 나타낼 수 있다. 리소좀 효소에 의해 용이하게 분해되는 HSA 및 메토트렉세이트 사이에 4개의 아미노산 링커 펩티드를 삽입함으로써, 상기 접합체 분자로부터 세포 내에 생성된 활성 메토트렉세이트의 양은 증가되었다. 본 발명의 펩티드는 특정 효소와 특정 상호작용을 통해 이의 효과를 나타낼 수 있다. 약물 및 이의 담체 분자 사이에 링커 절편으로서, 또는 또 다른 링커 절편 외에 접합된 분자 내로 본 발명의 펩티드를 혼입함으로써, 약동학이 변경될 수 있다. 이는 프로테아제의 활성에 더욱 내성 또는 더욱 민감한 약물전구체를 생성할 수 있는데, 이는 이어서 상기 접합체로부터 약물 분자 방출의 속도를 감소 또는 증가시킨다. 상기 접합된 화학요법제의 예에서 알 수 있는 바와 같이, 약물 분자 전달의 속도를 변경하는 것은 약물의 유효성을 매우 증진시킬 수 있다.
특정 세포에 대한 약물의 효과는 세포의 활성화 상태 또는 세포 근처 또는 내에 기타 분자 신호의 존재와 같은 기타 인자에 의존하여 변경될 수 있다. 특정 경우에, 약물이 효과를 가지기 위해서는, 또 다른 분자 또는 신호가 존재할 필요가 있다. Damjancic 등 (Exp. Clin. Endocrin., 95: 315, 1990)은 결핍의 내재하는 글루코코르티코이드 합성을 갖는 환자에 대한 인간 심방나트륨이뇨펩티드 (hANP)의 효과를 연구하였다. 상기 펩티드는 글루코코르티코이드 치료의 중지 동안 또는 덱사메타손을 이용한 치료의 재개 동안 환자에게 제공되었다.
펩티드 호르몬이 동시의 덱사메타손 치료 동안 제공되었을 때, 환자는 이뇨 및 단지 나트륨 배출에서 증가와 함께 hANP에 반응하였다. 글루코코르티코이드 치료의 중지 동안 hANP를 이용한 치료는 효과가 없었다. 동시의 스테로이드 호르몬 투여의 효과는 또한 펩티드의 활성을 증진시킬 수 있었다. Zhu 등. (Acta Pharm. Sinica, 28: 166, 1993)의 보고서에서, 진통제 펩티드 키오토르핀(KTP)의 활성은 펩티드 단독의 작용과 비교하여, 짧은 링커 절편을 통한 히드로코르티손에 접합에 의해 현저하게 증진되었다. 히드로코르티손 단독의 투여에 대해 어떠한 효과도 관찰되지 않았다.
상기 연구 결과는 접합된 분자로서 또는 제형물에서 성분으로서 스테로이드 호르몬의 능력은 생물학적으로 활성인 펩티드의 활성을 허용하거나 증진할 수 있다는 것을 예시한다. 본 발명의 임의의 펩티드는 또한 스테로이드 호르몬에 접합 또는 스테로이드 호르몬의 동시 적용에 의해 조절 또는 활성화될 수 있다. Zhu 등의 기술은 본 발명의 펩티드에 스테로이드 분자의 접합에 용이하게 적용될 수 있다. 도 1 내지 5는 또한 본 발명의 임의의 펩티드에 스테로이드 호르몬을 연결하는 전형적인 단계적인 합성 반응을 제공한다.
하기 제시된 실시예는 본 발명의 임의의 펩티드의 유용성 및 활성을 확장하기 위한 전형적인 방식을 제공한다. 상기 분야에서 추가의 개발은 효과적인 펩티드 기재 임상 치료를 생성하는데 대한 장벽을 극복하는 것을 도울 것이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 펩티드 생화학, 약학적 연구 및 임상 시험에 이용하기 위해 개발된 기술, 시약 및 절차가 본 발명의 임의의 펩티드에 모두 용이하게 적용가능하다.
5개의 도면의 각각은 스테로이드 분자에 펩티드를 연결하는 전형적인 화학 반응을 예시한다.
도 1은 공유 결합을 이용하여 에스트론 분자에 펩티드를 연결하는 일련의 화학 반응을 보여준다.
도 2는 도 1에서와 같은 동일한 연결을 생성하기 위한 제2의 대안적인 세트의 반응을 보여준다.
도 3은 공유 결합을 이용하여 에스트라디올의 분자에 펩티드를 연결하기 위해 디자인된 일련의 화학 반응을 포함한다.
도 4는 도 3에서와 같은 동일한 연결을 생성하기 위한 제2의 일련의 화학 반응을 포함한다.
도 5는 히드로코르티손의 분자에 공유 결합을 통해 펩티드를 연결하는 방법을 예시한다.
배경
VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010) 서열 내에, 일부 아미노산은 다른 것보다 생물활성에 대해 더욱 중요할 수 있는 것이 기대된다. 본 발명의 특정 구현예에서, VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010) 내에 활성 모이어티/모이어티들을 발견함으로써, 펩티드의 활성에 기여하지 않는 서열 내의 아미노산은 제거되어 생물활성 분자가 더욱 짧아질 수 있다. 펩티드의 상이한 활성 모이어티의 재조합은 또한 변형된 생물활성을 갖는 신규 펩티드 분자를 수득하기 위해 수행될 수 있다. 생물활성 펩티드 분자의 짧아짐은 생물학적 및 경제적 중요성을 가질 수 있다. 더 짧은 서열을 가짐으로써, 상기 펩티드의 생물학적 특성이 변형되고, 상기 변형은 잠재적인 치료학적 이점, 예를 들면, 변형된 생물학적 반감기, 수용체 친화성, 또는 부작용 프로필을 가질 수 있다. 더 짧은 펩티드는 또한 제조하는데 비용이 저렴하며, 생산 비용을 더 낮출 수 있다.
VAPEEHPTLLTEAPLNPK (CMS-010) 내의 활성 모이어티를 결정하기 위해, 일련의 절단 시험을 수행하였다. CMS-010은 아미노 말단에서 카르복실 말단으로 펩티드 결합의 각각에서 절단되었다. 우리는 활성 모이어티가 절단된다면, 생성된 펩티드 쌍의 생물활성은 특정 방식으로(생물활성의 활성화/불활성화) 감소하거나, 사라지거나 또는 변형될 것이라고 기대한다. CMS-010 내에 활성 모이어티/모이어티들을 위치한 후에, 새로운 세트의 펩티드를 상이한 활성 모이어티의 조합에 의해 구축될 수 있다.
절단된 또는 재조합 펩티드의 세트는 우리의 실험에서 잠재적인 치료학적 인간 또는 생물학적 용도를 갖는 생물활성을 가지는 것으로서 확인되었다. 상기 펩티드 세트는 하기 표 1에 제공된다. 우리의 발견은 표 1에 따른 실시예에서 보고된다.
[표 1]
Figure 112006077372848-pct00003
실시예 1
시험관 내에서 ConA 에 의해 유도된 마우스 T-림프구 형질전환에 대한 펩티드의 효과
1.1 재료
1.1.1 펩티드
관련된 모든 아미노산은 L 형태이었다: CS Bio Co., USA
1.1.2 대조군 및 기타 시약
염수: OTSUKA Pharmaceutical Co., Ltd, PR China. RPMI-1640 배양 배지 및 소태아혈청 (FBS): Gibcol Co., USA. MTT 및 ConA: Sigma Co., USA
1.2 동물
BALB/c 마우스(H-2d, SPF, 6-8 주령, 체중 18-22g): Military Medical Academy of Science, PR China.
1.3 방법 [1]
건강한 마우스 유래의 비장을 무균으로 분리하고, 주사 바늘을 이용하여 10% FBS RPMI-1640 용액에서 인위적으로 분산시켰다. 상기 분산된 세포 현탁액을 100-게이지 150㎛ 직경 스테인레스강 체를 통해 추가로 체질하였다. 상기 비장 세포 현탁액을 4×106/ml의 밀도로 조정하고, 100㎕/웰로 96-웰 세포 배양 플레이트에 분취하였다. 펩티드를 보통의 RPMI-1640에 용해하였다. 그룹핑의 디자인은 하기 제시된 바와 같다.
펩티드 그룹: 100㎕ 작동 펩티드 용액 + 75㎕ 비장 세포 현탁액 + 25㎕ ConA 작동 용액.
ConA 대조군: 100㎕ RPMI-1640 + 75㎕ 비장 세포 현탁액 + 25㎕ ConA 작동 용액.
음성 대조군: 125㎕ RPMI-1640 + 75㎕ 비장 세포 현탁액.
웰에서 ConA의 최종 농도는 5㎍/ml 이었다. 웰에서 펩티드의 최종 농도는 80㎍/ml, 16㎍/ml, 3.2㎍/ml, 0.64㎍/ml, 및 0.128㎍/ml 이었다. 각각의 펩티드 그룹은 3개의 병렬 웰을 포함하였으며, 대조군에 대해 8개 또는 12개의 웰을 포함하였다. 세포를 37℃, 5% C02에서 68시간 동안 인큐베이션하였다. MTT 방법을 이용하여 ELISA 해독기에서 630nm에서 기준이 된 각 웰의 OD570nm의 리딩(reading)을 수득하였다.
1.4 결과
[표 2]
시험관 내에서 ConA에 의해 유도된 마우스 T-림프구 형질전환에 대한 펩티드의 효과.
Figure 112006077372848-pct00004
[표 3]
시험관 내에서 ConA에 의해 유도된 마우스 T-림프구 형질전환에 대한 펩티드의 효과.
Figure 112006077372848-pct00005
1.5 결론
적당한 농도의 CMS-010.26, CMS-010.32 및 CMS-010.105는 ConA 양성 대조군 과 비교하여 통계학적 유의성을 가지면서(P < 0.05), 시험관 내에서 ConA에 의해 유도된 마우스 T-림프구 형질전환을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2
생체 내에서 마우스 T-림프구 형질전환 및 NK 세포 활성에 대한 펩티드의 효과
2.1 재료
2.1.1 펩티드
관련된 모든 아미노산은 L 형태이었다: CS Bio Co., USA.
2.1.2 대조군 및 기타 시약
사이클로스포린 A: Novartis Pharma AG., Switzerland. 염수: OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd, PR China. RPMI-1640 배양 배지 및 소태아혈청 (FBS): GIBCOL, USA. MTT 및 ConA: Sigma Co., USA
2.1.3 동물
BALB/c 마우스 (H-2d, SPF, 6-8 주령, 체중 18-22g, 50% 암컷 및 50% 수컷) : Military Medical Academy of Science, PR China.
2.2 방법
2.2.1 동물의 그룹핑 및 투여
동물을 2개의 펩티드 그룹(200㎍/kg/일 및 50㎍/kg/일)인 사이클로스포린 A 그룹(lOmg/kg/일), 및 염수 그룹(0.5ml/일)으로 임의추출하였다. 각 그룹은 10마 리의 마우스를 포함하였는데, 반은 암컷이며, 반은 수컷이었다. 모든 시험 물질을 0.5ml 염수에 용해하고, 20일 동안 1일 1회 복강내로 투여하였다. T-림프구 형질전환 및 NK 세포 활성을 최종 주사 다음 날에 조사하였다.
2.2.2 T-림프구 형질전환 [1-2]
최종 시험 물질 투여 다음 날에, 마우스를 목뼈 탈구에 의해 희생하였다. 비장을 무균으로 분리하고, 주사 바늘을 이용하여 10% FBS RPMI-1640 용액에서 인위적으로 분산시켰다. 상기 분산된 세포 현탁액을 100-게이지 150㎛ 직경 스테인레스강 체를 통해 추가로 체질하고, 4×106/ml로 조정하였다. 상기 세포 현탁액을 하기 디자인으로 100㎕/웰로 96-웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다.
분석 웰: 100㎕ 세포 현탁액 + 100㎕ ConA
대조군 웰: 100㎕ 세포 현탁액 + 100㎕ RPMI-1640
4개의 분석 및 4개의 대조군 웰을 각 동물에 대해 셋업하였다. 플레이트를 68시간 동안 37℃, 5% C02에서 인큐베이션하였다. MTT를 이어서 첨가하고, 플레이트를 ELISA 해독기를 이용하여 630nm에서 기준이 된 OD 570nm에서 읽었다. 자극지수 SI(%) = (분석 웰 OD / 대조군 웰 OD) x 100%.
2.2.3 NK 세포 활성에 대한 펩티드의 효과 [3-5]
YAC-1 표적 세포를 대수증식기로 가져와서, 1x105/ml의 밀도로 조정하였다. 상기 섹션 2.2.2에서 제조된 마우스 비장 세포를 4x106/ml의 밀도로 조정하고, 효과 기 세포로서 이용하였다. 상기 세포 현탁액을 하기와 같이 96 웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다:
효과기 세포 웰: 100㎕ 비장 세포 현탁액 + 100㎕ RPMI-1640
분석 웰: 100㎕ 비장 세포 현탁액 + 100㎕ YAC-1 세포 현탁액
표적 세포 웰: 100㎕ YAC-1 세포 현탁액 + 100㎕ RPMI-1640
3개의 분석 웰 및 3개의 효과기 세포 웰을 각 동물에 대해 설정하고, 12개의 표적 세포 웰을 세포 배양 플레이트당 설정하였다. 상기 플레이트를 4시간 동안 37℃, 5% C02에서 인큐베이션한 후, MTT를 첨가하고, 플레이트를 ELISA 해독기를 이용하여 630nm에서 기준이 된 OD 570nm에서 읽었다. NK 세포 활성(%) = {1 - [(분석 웰 OD - 효과기 세포 웰 OD)/표적 세포 웰 OD]} x 100%
2.3 결과
2.3.1 T-림프구 형질전환의 실험
[표 4]
마우스 T-림프구 형질전환에 대한 펩티드의 효과(1)
그룹 투여량 N SI
CMS-010.24 50㎍/kg/일 10 2.40±0.31**
CMS-010.26 200㎍/kg/일 7 2.19±0.59**
CMS-010.28 200㎍/kg/일 9 2.70±0.37**
염수 0.5ml/일 8 3.63±0.69
** 염수 대조군과 비교, P<0.01
[표 5]
마우스 T-림프구 형질전환에 대한 펩티드의 효과(2)
그룹 투여량 N SI
CMS-010.25 200㎍/kg/일 10 2.43±0.69**
염수 0.5ml/일 10 3.15±0.83
** 염수 대조군과 비교, P<0.05
[표 6]
마우스 T-림프구 형질전환에 대한 펩티드의 효과(3)
그룹 투여량 N SI
CMS-010.04 50㎍/kg/일 8 1.56±0.25**
염수 0.5ml/일 9 2.24±0.52
** 염수 대조군과 비교, P<0.01
[표 7]
마우스 T-림프구 형질전환에 대한 펩티드의 효과(4)
그룹 투여량 N SI
CMS-010.12 50㎍/kg/일 10 2.12±0.42**
CMS-010.14 50㎍/kg/일 9 2.12±0.51**
염수 0.5ml/일 10 2.96±0.61
** 염수 대조군과 비교, P<0.01
2.3.2 NK 세포 활성의 실험
[표 8]
마우스 NK 세포 활성에 대한 펩티드의 효과(1)
그룹 투여량 N NK 세포 활성(%)
CMS-010.24 200㎍/kg/일 10 69.0±7.4*
CMS-010.24 50㎍/kg/일 10 56.0±6.0**
CMS-010.26 200㎍/kg/일 9 67.7±5.3**
CMS-010.26 50㎍/kg/일 10 68.5±7.2*
CMS-010.28 200㎍/kg/일 9 70.3±6.7*
염수 0.5ml/일 10 76.0±4.3
* 염수 대조군과 비교, P<0.05 ** 염수 대조군과 비교, P<0.01
[표 9]
마우스 NK 세포 활성에 대한 펩티드의 효과(2)
그룹 투여량 N NK 세포 활성(%)
CMS-010.11 50㎍/kg/일 9 63.5±4.7**
CMS-010.13 50㎍/kg/일 10 70.9±17.5*
CMS-010.14 200㎍/kg/일 8 43.1±13.7*
CMS-010.14 50㎍/kg/일 9 75.3±9.0**
염수 0.5ml/일 10 55.3±6.1
* 염수 대조군과 비교, P<0.05 ** 염수 대조군과 비교, P<0.01
2.4 결론
적당한 투여량에서, CMS-010.04, CMS-010.12, CMS-010.14, CMS-010.24, CMS-010.25, CMS-010.26, 및 CMS-010.28은 염수 대조군과 비교하여 통계학적 유의성을 가지면서(P < 0.05), 생체 내에서 마우스 T-림프구 형질전환을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
적당한 투여량에서, CMS-010.24, CMS-010.26, 및 CMS-010.28은 염수 대조군과 비교하여 통계학적 유의성을 가지면서(P < 0.05), 생체 내에서 마우스 NK 세포 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
적당한 투여량에서, CMS-010.11, CMS-010.13, 및 CMS-010.14는 염수 대조군과 비교하여 통계학적 유의성을 가지면서(P < 0.05), 생체 내에서 마우스 NK 세포 활성을 증진하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3
생체 내 마우스 항체 형성에 대한 펩티드의 효과
3.1 재료
3.1.1 펩티드
관련된 모든 아미노산은 L 형태이었다: CS Bio Co., USA.
3.1.2 대조군 및 기타 시약
사이클로스포린 A: Novartis Pharma AG., Switzerland. 염수: OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., PR China
3.1.3 동물
BALB/c 마우스(H-2d, SPF, 6-8주령, 체중 18-22g, 50% 암컷 및 50% 수컷): Military Medical Academy of Science, PR China.
3.2 방법
3.2.1 동물의 그룹핑 및 시험 물질 투여
마우스를 3개의 그룹으로 임의 추출하였다: 펩티드 (200㎍/kg/일), 사이클로스포린 A (10mg/kg/일), 및 염수(0.5ml). 각 그룹은 12마리 마우스, 6마리 암컷 및 6마리 수컷을 포함하였다. 시험 물질을 0.5ml 염수에 용해하고, 20 연속일 동안 1일 1회 복강내로 적용하였다.
3.2.2 항체 형성 및 정량화 [7]
양 적혈구세포 (SRBC)를 염수를 이용하여 2% (v/v)로 재현탁하고, 0.2m1의 재현탁된 세포 용액을 시험 물질 투여의 16일째에 각 마우스에게 복강내로 적용하였다. 최종 시험 물질 투여 다음 날에, 혈액을 내부 눈구석으로부터 수집하고, 혈청 삼출을 위해 1시간 동안 실온에서 방치하였다. 10분 동안 200g에서 원심분리 후에, 혈청을 통상적인 염수로 200배 희석하였다.
보충 작동 용액의 제조를 위해, 10 부피의 신선한 Cavy 혈청을 1 부피의 원 심분리 패킹된 SRBC에 첨가하였다. 상기 혼합물을 4℃에서 30분 동안 부드럽게 교반하였다. 상기 SRBC를 이어서 10분 동안 200g에서 원심분리에 의해 제거하였다. 10 부피의 통상적인 염수를 상층액에 첨가하여 작동 보충 용액을 수득하였다.
마우스 항체 역가의 분석을 위해, 0.2m1의 1% SRBC 현탁액을 각 마우스 유래의 1 ml 희석된 빙냉 마우스 혈청에 첨가하였다. 1 ml 작동 보충 용액을 이어서 첨가하고, 상기 혼합물을 20분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 상기 반응을 각 시료를 10분 동안 얼음 위에서 냉각시킴으로써 종결시켰다. 상기 시료를 이어서 10분 동안 200g에서 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 1ml의 상기 상층액에, 3 ml Drabkin 용액을 첨가하고, 10분 동안 실온에서 방치한 후, OD540nm을 측정하였다. OD540nm에서 기준 용균-50 해독을 용균되지 않은 SRBC의 원심분리 제거 없이 SRBC의 반을 염수로 대체하는 것을 제외하고, 시료와 동일한 하기 절차에 의해 측정하였다. 시료 혈청 지수 (HC50) = 시료의 OD540nm / 용균-50 OD540nm x 200
3.3 결과
[표 10]
마우스 항체 형성에 대한 펩티드의 효과
그룹 투여량 N HC50
CMS-010.26 200㎍/kg/일 10 141.3±29.3*
사이클로스포린 A 10mg/kg/일 12 148.9±21.7*
염수 0.5ml/일 11 167.6±21.5
* 염수 대조군과 비교, P<0.05
3.4 결론
적당한 투여량의 CMS 010.26은 염수 대조군과 비교하여 통계학적 유의성을 가지면서(P < 0.05), 생체 내에서 마우스 항체 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4
생체 내 KM 마우스-이식된 S180 육종 세포의 성장 속도에 대한 펩티드의 효과
4.1 재료
4.1.1 펩티드
관련된 모든 아미노산은 L 형태이었다: CS Bio Co., USA.
4.1.2 대조군 및 기타 시약
염수: OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., PR China. 아드리아마이신: Zhejiang Haizheng Pharmaceutical Co., Ltd., PR China
4.1.3 동물
건강한 암컷 KM 마우스 (SPF, 6-8주령, 체중 18-22g): Military Medical Academy of Science, PR China
4.2 방법
4.2.1 동물의 그룹핑 , 시험 물질 투여 및 종양 세포 이식 [8]
S180 육종 세포를 6-8일 동안 KM 마우스 내로 복강내로 이식하고, 복수를 무균으로 수집하였다. 상기 세포 농도를 10% FBS RPMI-1640을 이용하여 ml 당 1 x 107으로 조정하고, 0.2ml 세포 현탁액을 마우스 모델을 갖는 육종을 발생하기 위해 각각의 KM 마우스 내로 겨드랑이를 통해 주사하였다. S180 육종 세포 이식된 마우스를 5개의 그룹으로 임의 추출하였다: 펩티드 (2개 그룹: 50㎍/kg/일 및 10㎍/kg/일), 아드리아마이신 (2mg/kg/일), 사이클로포스파미드 (40mg/kg/일), 및 염수 (0.5ml/일). 시험 물질의 복강내 주사는 종양 이식 다음 날에 시작하였으며, 20 연속일 동안 1일 1회 계속하였다.
4.2.2 육종 발생 측정
최종 시험 물질 투여 다음 날에, 상기 육종을 마우스로부터 제거하고 무게를 달았다. 3개의 면(A, B, C) 상의 각 육종의 직경을 버니어 캘리퍼스로 측정하였다. 육종의 부피를 식: V = (1/6)πABC에 의해 계산하였다. 종양 성장 저해 지수를 하기 식에 의해 계산하였다: 종양 성장 저해 지수 = (대조군의 종양 중량 - 처리군의 종양 중량)/ 대조군의 종양 중량 x 100%
4.3 결과
[표 11]
생체 내 마우스-이식된 S180 육종 세포의 발생에 대한 펩티드의 효과(1)
그룹 투여량 N 육종 중량
CMS-010.31 50㎍/kg/일 17 1.20±1.60*
CMS-010.31 10㎍/kg/일 14 1.05±1.28*
CMS-010.103 50㎍/kg/일 15 1.48±1.44*
CMS-010.103 10㎍/kg/일 15 1.72±1.53*
아드리아마이신 2mg/kg/일 17 1.52±1.75*
염수 0.5ml/일 12 5.07±5.46
* 통상적인 염수 대조군과 비교, P<0.05
[표 12]
생체 내 마우스-이식된 S180 육종 세포의 발생에 대한 펩티드의 효과(2)
Figure 112006077372848-pct00006
Figure 112006077372848-pct00007
Figure 112006077372848-pct00008
4.4 결론
적당한 투여량의 CMS-010.103, CMS-010.02, CMS-010.03, CMS-010.04, CMS-010.05, CMS-010.07, CMS-010.08, CMS-010.09, CMS-010.11, CMS-010.13, CMS-010.14, CMS-010.15, CMS-010.16, CMS-010.17, CMS-010.18, CMS-010.19, CMS-010.20, CMS-010.21, CMS-010.22, CMS-010.23, CMS-010.24, CMS-010.25, CMS-010.27, CMS-010.29, CMS-010.31, 및 CMS-010.32는 통상적인 염수 대조군과 비교하여 통계학적 유의성을 가지면서(P < 0.05), 생체 내에서 KM 마우스-이식된 S180 육종 세포의 발생을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 5
토끼에서 마수기 신장염에 대한 펩티드의 효과
5.1 재료
5.1.1 펩티드
관련된 모든 아미노산은 L 형태이었다: CS Bio Co., USA.
5.1.2 대조군 및 기타 시약
덱사메타손 소듐 포스페이트 주사: Tianjin Jinyao Aminophenal Ltd., PR China. 염수: OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., PR China. BCG 백신: Beijing Institute of Biological Products, PR China. 라놀린: Tianjin sixth chemical product factory, PR China. 액체 파라핀: Tianjin sixth chemical product factory, PR China. 혈청 BUN에 대한 진단 시약: BECKMAN 443350, USA. 혈청 크레아틴에 대한 진단 시약: BECKMAN 443340, USA.
5.1.3 동물
한 마리의 수컷 양 (8 개월령) : Department of Laboratory Animal, Tianjin Medical University, PR China. 토끼 (MDA, 수컷, 2-2.5kg): Beijing Fuhao Breed Farm, PR China.
5.2 방법 [9-10]
5.2.1 양(sheep) 항-토끼 부신피질 항혈청의 제조
5.2.1.1 토끼 부신피질 항원의 제조
건강한 토끼를 귀 정맥의 정맥내 주사에 의해 4ml/kg 25% 우레탄으로 마취시 키고, 전신성 헤파린화를 위해 1250U/kg의 헤파린으로 정맥내로 주사하였다. 토끼 복부를 무균으로 개복하고, 신장 동맥 및 정맥을 노출시켰다. 신장 동맥을 카테터를 삽입하고, 신장 정맥을 절단하였다. 신장을 신장 조직이 회색으로 변할 때까지 염수로 관수하였다. 신장을 이어서 적출하였다. 부신피질을 분리하고, 0.5 부피의 빙냉 염수에서 균질화한 후, -20℃에서 저장하였다.
5.2.1.2 양 항혈청의 제조
7.5 ml의 부신피질 균질액을 2.5 ml의 프로인드 완전 애주번트(5mg/ml BCG 백신을 갖는 1:5의 비율의 라놀린 대 액체 파라핀)와 혼합하였다. 완전한 유화 후에, 상기 항원을 총 3회의 주사 동안, 2주에 1회, 위치당 1ml, 5가지 상이한 등 위치에서 양에게 주사하였다. 4번째 면역화로 시작하여, 5g 부신피질을 1 부피의 염수로 균질화하고, 2주에 1회, 위치당 1ml, 양의 5가지 위치에서 근육내로 주사하였다. 양 항-토끼 부신피질 항체 역가를 2주 기준으로 이중면역확산에 의해 모니터링하였다. 상기 역가가 1:32에 도달할 때, 양의 항혈청을 목동맥으로부터 수집하였다. 양의 항혈청을 동일한 부피의 토끼 적혈구세포와 혼합하고, 항-토끼 적혈구세포 항체의 제거를 위해 12시간 동안 4℃에서 위치하였다. 이어서, 상기 항혈청을 원심분리로 모으고, 보체 및 프로테아제를 불활성화시키기 위해 56℃에서 위치하였다. 상기 항혈청을 -20℃에서 저장하였다.
5.2.2 동물의 그룹핑 , 시험 물질 투여, 및 마수기 신장염 모델 확립
22마리의 건강한 토끼를 5 그룹으로 임의 추출하였다: 펩티드 (107.3㎍/kg/일 및 58.5㎍/kg/일, 그룹당 4마리 토끼), 덱사메타손 (O.lmg/kg/일, 4마리 토끼), 염수 처리 (1ml/일, 7마리 토끼), 및 정상적으로 건강한 (3마리 토끼). 토끼에서 질환 상태의 확립 전에, 24시간에 걸쳐 혈청 BUN, 크레아틴, 및 뇨단백의 측정을 각 토끼에 대해 수행하였다. 상기 측정에서 이상이 없다면, 마수기 신장염 모델을 토끼당 총 4번의 주사 동안, 30분마다 1회 주사, 주사당 0.5ml, 귀 정맥을 통해 양 항-토끼 부신피질 항혈청의 정맥내 주사에 의해 실험 토끼에서 확립하였다. 정상적인 건강한 (대조군) 토끼 그룹을 동일한 방식으로 염수를 이용하여 주사하였다. 귀 정맥을 통한 시험 물질의 정맥내 투여는 30 연속일 동안 주사당 1ml, 1일 1회, 항혈청의 주사 다음 날에 시작하였다.
5.2.3 치료 효과 모니터링
5.2.3.1 뇨단백의 정량화
소변을 주당 1회 24시간에 걸쳐 각 토끼로부터 수집하고, 단백질 함량을 설포살리실산 방법에 의해 측정하였다.
5.2.3.2 병리학적 조사
최종 시험 물질 투여 다음 날에, 마수기 신장염 토끼로부터 양 항-토끼 부신피질 IgG 항체의 제거에 대한 펩티드의 효과의 관찰을 위해, 토끼를 질식에 의해 희생하고, 우측 신장을 적출하고, 동결하여 간 후 양 IgG의 존재에 대해 면역형광으로 염색하였다. 각 사구체의 형광 양성 영역을 카운팅하였다. 토끼당 30개의 사구체를 조사하고, 사구체당 평균 양성 영역을 계산하였다.
5.2.3.3 통계
통계학적 유의성을 SPSS 소프트웨어의 t-테스트에 의해 측정하였다.
5.3 결과
[표 13]
마수기 신장염 토끼의 단백뇨(mg/dl)에 대한 펩티드의 효과
Figure 112006077372848-pct00009
[표 14]
마수기 신장염 토끼로부터 양 항-토끼 부신피질 IgG 항체의 제거에 대한 펩티드의 효과
그룹 투여량/일 N 양성 영역 수/사구체
CMS-010.26 107.3㎍/kg 5 5.6±1.2**
CMS-010.26 58.5㎍/kg 4 6.3±1.4**
덱사메타손 0.1mg/kg 4 7.5±1.0
염수 처리 0.5ml 7 8.7±0.9
정상적인 건강함 - 3 -
** 염수 처리 대조군과 비교, P<0.01
5.4 결론
CMS-010.26은 염수 처리 대조군과 비교하여 통계학적 유의성을 가지면서(P < 0.05), 생체 내 마수기 신장염 토끼에서 양 항-토끼 부신피질 항체의 제거를 촉진하고 단백뇨의 심각성을 감소시킬 수 있다는 것으로 밝혀졌다.
실시예 6
생체 내에서 Heymann 신장염 래트에 대한 펩티드의 효과
6.1 재료
6.1.1 펩티드
이용한 모든 아미노산은 L 형태이었다: CS Bio Co., USA.
6.1.2 대조군 및 기타 시약
덱사메타손 소듐 포스페이트 주사: Tianjin Jinyao Aminophenal Ltd., PR China. 염수: OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., PR China. BCG 백신: Beijing Institute of Biological Products. 라놀린: Tianjin sixth factory of chemical product, PR China. 액체 파라핀: Tianjin sixth factory of chemical product, PR China. 혈청 BUN에 대한 진단 시약: BECKMAN 443350, USA. 혈청 크레아틴에 대한 진단 시약: BECKMAN 443340, USA.
6.1.3 동물
Wistar 래트 (SPF, 6-8주령, 체중 150-200g): Beijing Vital River Labratory Animal Co., Ltd., PR China.
6.2 방법 [11-12]
6.2.1 래트 신장 균질물의 제조
건강한 Wister 래트 복부를 무균으로 개복하였다. 문맥 및 하대정맥을 노출시켰다. 상기 문맥에 카테터를 삽입하고, 하대정맥을 절단하였다. 신장을 신장 조직이 회색으로 변할 때까지 염수로 세척하였다. 신장을 적출하고, 부신피질을 분리하였다. 상기 부신피질을 이어서 얼음 위에서 균질화하고, -20℃에서 저장하였다.
6.2.2 래트 부신피질 항원의 제조
라놀린을 1:2 v/v 부피비로 액체 파라핀과 혼합하고, 진탕하면서 70℃로 가열한 후, 오토클레이브하였다. 충분한 BCG 백신을 라놀린/파라핀 혼합물에 첨가하여 3mg/ml 의 백신 농도를 생성하여 프로인드 완전 애주번트를 형성하였다. 부신피질 균질물, 프로인드 완전 애주번트, 및 염수를 완전히 유화될 때까지 분쇄하면서 1:1:2 비율로 혼합하였다.
6.2.3 동물의 그룹핑 및 모델 확립
20 마리의 건강한 Wistar 래트를 2개의 그룹으로 임의 추출하였다: 펩티드 (200㎍/kg/일) 및 염수 처리(2ml/일). 2ml의 항원을 총 5회의 주사 동안 2주에 1회 각 래트에 복강내로 주사하였다. 복강내 주사에 의한 시험 물질 투여를 실험의 종료까지 1일 1회 세번째 면역화 다음 날에 시작하였다.
6.2.4 효능 모니터링
6.2.4.1 뇨단백의 정량
뇨단백의 정량을 모델 확립의 세번째 주에 시작하였다. 뇨 시료를 2시간에 1회 24시간에 걸쳐 각 래트로부터 수집하고, 뇨단백 함량을 설포살리실산 방법에 의해 정량하였다.
6.2.5 통계학
시료 값을 SPSS 소프트웨어를 이용하여 t-테스트에 의해 비교하였다.
6.3 결과
표 15. Heymann 신장염을 갖는 래트의 24시간 뇨단백 농도(mg/dl)에 대한 펩티드 투여의 효과
그룹 N 3주 5주 7주 9주
CMS-010.26 10 6.2±2.3 3.1±1.4 3.9±1.6* 3.8±2.2*
염수 처리 10 4.1±1.3 3.1±0.8 10.9±2.8 12.6±1.2
*: 염수 대조군과 비교, P<0.05
6.4 결론
적당한 투여량의 CMS-010.26은 염수 처리 대조군과 비교하여 통계학적 유의성을 가지면서(P < 0.05), 생체 내에서 Heymann 신장염 래트에서 단백뇨의 심각성을 감소하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 1-6에 대한 참고문헌
1. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 2002, 1:1426-1428
2. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:134-135
3. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 2002,1:1429
4. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6): 356-358
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6. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 137-138
7. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 2002,1:1429
8. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:137-139
9. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 96
10. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 2002, 1:1227-1228
11. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:97
12. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 2002, 1:1227
실시예 7
유전자 조작된 락토바실러스 박테리아 종을 통한 펩티드의 전달
전술한 숙주에 본 발명의 펩티드를 전달하는 하나의 전형적인 방법으로서 하기를 제공한다. CMS-010 (VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 화학적 수단에 의해 합성되며, 상기 DNA 서열은 당업자에게 친숙한 유전 공학의 표준 기술을 이용하여 발현 벡터 내로 삽입된다.
상기 선택된 발현 벡터는 락토바실러스에서 기능성인 구성적(구성적) 프로모터, 특정 5'에서 3' 방향으로 DNA 서열의 도입을 위한 다중클로닝 자리뿐만 아니라 (클로닝 절차를 돕기 위해) 항생제에 내성을 부여하는 선택성 마커 유전자를 포함하며, 펩티드의 생산 및/또는 분비를 돕는 기타 서열, 예를 들면 신호 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 벡터의 예는 본원에 전체적으로 원용에 의해 포함된 미국특허 제5,592,908호(Pavla에게 허여)에 의해 제공된다. 간단하게, 상기 특허는 락토바실러스 종에서 기능하는 수 개의 공지된 프로모터뿐만 아니라, 상기 박테리아에서 신규 프로모터를 개발하기 위한 방법을 기재하며, 임의의 상기 프로모터는 락토바실러스에서 상기 펩티드를 발현하기 위해 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다. 신호 펩티드, 예를 들면, 상기 인용된 미국특허 제5,529,908호에 기재된 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis)에서 활성인 16 내지 35개의 대부분 소수성인 아미노산을 포함하는 펩티드를 코딩하는 핵산이 상기 신호 펩티드를 코딩하는 핵산이 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산과 인 프레임이 되도록 프로모터 및 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 사이에 삽입된다.
상기 펩티드의 코딩 서열 외에, 합성된 DNA 서열은 발현 벡터 내로 상기 DNA의 라이게이션 및 클로닝을 돕는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 벡터의 다중클로닝 자리에서 발견되는 것에 해당하는 제한효소 인식 자리는 서열의 5' 및 3' 말단에서 합성된 DNA 내로 혼입되어, 상기 서열이 상기 벡터 내에서 적당한 방향으 로 클로닝될 수 있다. 상기 벡터 및 합성된 DNA 양자는 특정 제한효소로 절단된 후, 정제된다. 상기 벡터 및 합성된 DNA를 이용한 라이게이션 반응에 이어 대장균의 적당한 균주 내로 형질전환된다. 상기 형질전환된 박테리아는 벡터가 내성을 부여하는 항생제를 포함하는 배지 상에서 도말된다. 형질전환된 박테리아의 콜로니는 성장 배양 및 플라스미드 제조를 위해 선발되며; 올바른 방향의 합성된 DNA의 존재가 확인된다.
상기 발현 벡터는 이어서 락토바실러스 종, 예를 들면 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus)의 박테리아 숙주 세포 내로 형질전환된다. 형질전환된 세포는 벡터 서열 내에 발견되는 선택성 마커를 통해 선발되며, 상기 펩티드의 분비는 웨스턴 블롯 성장 배지에 존재하는 펩티드의 겔 전기영동 또는 기타 표준 기술을 수행함으로써 확인될 수 있다. 박테리아의 형질전환된 콜로니가 선발되고, 유전자 조작된 박테리아의 대규모 배양물을 제조하기 위해 이용된다. 원하는 펩티드를 발현하는 유전자 조작된 박테리아의 배양을 키우고, 적어도 이의 일부를 박테리아가 증식할 수 있는 숙주 생물의 소화관, 질, 기관 또는 기타 영역에 투여된다. 원한다면, 상기 박테리아 배양물은 다양한 방식으로 처리되어 숙주에 의한 장 소비에 대한 보조제를 생산할 수 있다.
상기 처리는 박테리아를 담체 물질, 예를 들면, 용액, 용매, 분산 매질, 지연제, 에멀션 등과 조합하는 것 이외에, 동결건조 또는 박테리아를 보존하는 기타 방법을 포함한다. 보조제를 제조하기 위해 상기 물질의 이용은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들면, 상기 박테리아는 펩티드를 발현하는 생물체가 숙주 생물체의 창 자를 집락화하도록, 인간 소비를 위한 배양된 유제품 또는 기타 식품을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 젖산 박테리아의 특정 균주를 요구르트, 김치, 치즈 및 버터와 같은 식품 내로 혼입하는 수많은 상이한 방법이 본원에 전체적으로 원용에 의해 포함된 미국특허 제6,036,952호(Oh에게 허여)에 개시된다. 임의의 수의 경로 중의 하나를 통해 박테리아를 소비할 때, 조작된 생물체는 창자를 집락할 수 있으며, 창자의 점막층을 통해 본 발명의 펩티드의 현시 및/또한 흡수를 허용한다.
실시예 8
바실러스 서브틸리스의 유전자 조작된 형태를 통한 펩티드의 전달
전술한 숙주에 본 발명의 펩티드를 전달하는 또 다른 전형적인 방법으로서 하기를 제공한다. CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 화학적 수단에 의해 합성되며, 상기 DNA 서열은 유전 공학의 기술을 통해 발현 벡터 내로 삽입되며, 모든 기술은 당업계에 공지되어 있다. 상기 선택된 발현 벡터는 대장균 및 바실러스 서브틸리스 양자에서 증식할 수 있으며, 형질전환된 박테리아의 콜로니를 선발하기 위한 항생제 내성 유전자를 포함하는 pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ)와 같은 셔틀 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 바실러스 서브틸리스에서 활성인 구성적 프로모터, 예를 들면, 바실러스 서브틸리스의 Sac B 유전자로부터 유래된 프로모터뿐만 아니라, 박테리아 세포로부터 발현된 이종 단백질의 효율적인 수송을 이끄는 바실러스 서브틸리스에서 활성인 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
상기 벡터의 예는 이의 개시가 전체적으로 본원에 원용에 의해 포함된 미국특허 제6,268,169호(Fahnestock에게 허여)에 개시된다. 간단히 전술한 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 DNA는 당업자에게 친숙한 기술을 통해 DNA의 클로닝을 용이하게 하기 위해 제한효소 자리 및/또는 기타 서열과 함께 합성될 것이다. 대장균으로 형질전환, 도말, 선발 및 플라스미드 스톡을 생성하기 위해 플라스미드의 증식 후에, 상기 플라스미드는 이어서 바실러스 서브틸리스 내로 형질전환되며, 형질전환체는 도말 배지에서 항생제에 대한 내성을 통해 선발된다.
유전자 조작된 바실러스 서브틸리스로부터 펩티드 생산 및 분비는 당업자에게 친숙한 기술, 예를 들면, SDS-PAGE 분석 후의 자기방사 검출 또는 웨스턴 블롯팅을 위해 펩티드의 방사선 표지를 이용하여 증명된다.
유전자 조작된 박테리아의 배양물을 키우고, 적어도 이의 부분을 박테리아가 증식할 수 있는 숙주 생물체의 소화관, 질, 기관 또는 기타 부위에 투여된다.
실시예 9
유전자 조작된 사카로마이세스 효모 종을 통한 펩티드 전달
전술한 숙주에 본 발명의 펩티드를 전달하는 또 다른 전형적인 방법으로서 하기를 제공한다. CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 화학적 수단에 의해 합성되며, 상기 DNA 서열은 유전 공학의 기술을 통해 발현 벡터 내로 삽입되며, 모든 기술은 당업계에 공지되어 있다. 상기 선택된 발현 벡터는 pADHl와 같은 구성적 효모 프로모터, 효모 및 대장균 양자에서 벡터의 복제 자리, 선발 목적을 위한 영양요구 효모에 대한 야생형(prototrophy)을 부여하는 유전자(들), 다중 클로닝 부위(MCS) 및 원한다면, 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는, 안정하게 유지되는 효모 단백질 발현 벡터를 포함한다. 이와 같은 벡터는 시판되며, 당업계에 주지되어 있거나 표준 기술을 이용하여 용이하게 구축될 수 있다. 효모 벡터 내로 합성된 DNA의 삽입, 대장균 내로 형질전환, 형질전환된 대장균의 선발 배지 상에 도말, 형질전환된 박테리아 콜로니의 선발 및 상기 콜로니로부터 박테리아의 성장 배양물로부터 플라스미드 DNA의 제조 후에, 상기 벡터를 리튬 아세테이트 형질전환 또는 전기천공과 같은 주지의 기술을 통해 사카로마이세스 세레비지애 내로 형질전환한다. 형질전환을 위해 선발된 사카로마이세스 세레비지애 균주는 최소 배지 플레이트 상에서 성장하기 위해 플라스미드 상에 유전자를 요구할 돌연변이 영양요구주이다. 형질전환된 효모 콜로니는 상기 벡터 상에 제공된 유전자가 결핍된 성장 배지 상에서 효모를 도말함으로써 분리된다. 상기 벡터 및 이의 선택 유전자를 수용하며, 상기 유전자 산물을 발현하는 효모는 최소 배지 상에서 콜로니로 성장할 것이다. 펩티드 분비의 확인은 웨스턴 블롯을 수행하거나, 성장 배지에 존재하는 펩티드의 겔 전기영동 또는 기타 표준 기술을 수행함으로써 수득될 수 있다.
효모의 형질전환된 콜로니를 선발하고, 대규모 배양물을 제조하기 위해 이용한다. 원하는 펩티드를 발현하는 유전자 조작된 효모의 배양물을 키우고, 적어도 이의 부분을 박테리아가 증식할 수 있는 숙주 생물체의 소화관, 질, 기관 또는 기타 부위에 투여한다. 원한다면, 효모 배양물을 다양한 방식으로 처리하여 숙주에 의한 장 소비를 위한 보조제를 생산할 수 있다. 상기 처리는 담체 물질, 예를 들면, 용액, 용매, 분산 매질, 지연제, 에멀션 등과 박테리아를 조합하는 것 외에, 효모를 보존하는 기타 방법 또는 동결건조를 포함한다. 보조제를 제조하기 위한 상기 물질의 이용은 당업계에 주지되어 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 형질전환된 효모는 당업자에게 친숙한 기술에 의해 식품, 예를 들면 요구르트 및 캐피어(kefir)와 같은 발효 유제품의 생성에 이용된다. 상기 식품에서 젖산 박테리아 배양물에서처럼, 형질전환된 효모는 적어도 일시적으로 창자를 집락화하며, 창자 루멘을 통해 숙주에 펩티드를 제공하는데 이용된다.
실시예 10
특정 위치에 펩티드의 표적화
신체 내의 특정 구획, 기관, 세포 유형 또는 위치에 본 발명의 펩티드를 선택적으로 전달하는 전형적인 방법으로서 하기를 제공한다. 이 경우에, 세포 증식성 질환은 CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 개인의 신장의 조직에 표적화함으로써 치료된다. 예를 들면, CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체는 당업계에 공지된 화학 반응을 통해 공유 결합에 의해 신장 조직에 특이적으로 농축되는 시판되는 단백질 모이어티인 저분자량(LMW) 리소자임에 연결된다. LMW 리소자임에 분자의 접합을 수행하는 기술이 개시된다 (Folgert et al., Br. J. Pharmcology, 136: 1107, 2002). 단백질 또는 펩티드를 서로 접합하는 일반적인 기술은 해당 분야의 문헌에 교시된다 (Fischer et al., Bioconj. Chem., 12: 825, 2001). 새로 생성된 접합된 펩티드 시료는 이어서 양이온 교환 FPLC 및/또는 구배 원심분리와 같은 크로마토그래피 방법에 의해 연결 과정에서 이용된 화학 시약으로부터 정제된다. 일단 정제되면, 상기 접합된 펩티드는 신장 세포 증식성 질환에 대한 치료를 요하는 개인에게 투여된다. 이의 항증식성 활성을 위해, CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체는 이들과 신장의 근위세관의 세포에 대한 LMW 리소자임의 친화성을 통해 신장 조직에 선택적으로 농축되는 MW 리소자임 사이의 연결을 통해 신장 조직에 우선적으로 표적화된다. 상기 우선적인 전달은 스스로 CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체의 몰 동량의 것과 비교하여 더 큰 항증식성 효과를 허용한다. 역으로, 특정 수준의 항증식성 활성을 달성하는데 필요한 펩티드 약물의 양을 감소시킬 수 있다.
실시예 11
이의 활성 부위로 펩티드 전달의 향상
뇌에 신경활성 펩티드의 전달을 증가시키는 전형적인 방법으로서 하기를 제공한다. 뇌의 신경에 의해 발현된 수용체에 이의 효과를 발하는 본 발명의 펩티드는 당업자에게 공지된 화학 방법에 의해 합성된다. 대안적으로, 상기 실시예에 의해 상술한 바와 같이, 조작된 미생물에 의해 발현될 수 있으며, 상기 생물체의 배양물로부터 회수될 수 있다. 정제된 형태로 일단 수득되면, 상기 펩티드는 일련의 유기 화학 반응에 이용되어 펩티드에 부착된 트리글리세리드 에스테르 접합된 모이 어티를 생성한다. 상기 접합된 모이어티는 펩티드의 말단 카르복실 탄소와 아미드 결합을 통해 본 발명의 펩티드에 연결된 4차 치환된 탄소 중심으로 이루어진다. 4차 탄소 중심에 부착된 다른 3개 그룹은 16 탄소 지방산 사슬에 탄소 에스테르 연결로 이루어진다. 상기 지방산 사슬은 스스로 사슬을 더욱 친수성으로 만들고, 이를 혈액-뇌 장벽의 내피 세포막에 특이적으로 표적화시키는 펩티드 마스크로서 알려진 말단 디펩티드 그룹에서 끝난다. 상기 합성 절차는 [Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3): 434, 1997]에서 상세히 설명되며, 당업자에게 친숙한 통상의 시약 및 장치를 이용한다.
말초 위치에서 개인에게 일단 도입되면, 상기 화합물은 순환계를 통해 신체를 통해 돌아다니며, 혈액뇌장벽의 내피막과 상호작용한다. 혈액뇌장벽의 상피층을 횡단하는 분자의 수송 동안 디펩티드 마스크 및 지질 사슬의 단계적인 분해는 뇌 구획으로 본 발명의 펩티드의 방출을 초래한다. 거기에서, 상기 펩티드는 뇌 기능에 이의 효과를 발하기 위해 뉴런의 표면 상의 수용체와 상호작용할 수 있다. 담체 모이어티의 동시 분해와 함께, 약물이 혈액뇌장벽에 도달하여 뇌로 수송되는데 필요한 시간은 약물 활성의 역학을 변경하여, 유리 펩티드의 뇌실내 주사와 비교하여 더욱 안정하고 더 장기간 지속되는 효과를 생성한다.
실시예 12
효소 분해에 저항성인 펩티드 제형물의 생성
소화관의 표면에서 표면을 따라 발견되는 프로테아제 및 펩티다아제의 활성에 저항성인 경구 투여에 대해 생물학적으로 활성인 펩티드의 제형물을 생성하는 전형적인 방법으로서 하기를 제공한다. 본 실시예에서, CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드는 환자에게 경구 투여를 위한 약학 제형물의 제조에 이용된다. Larionova et al. (Int. J. Pharma., 189: 171, 1999)에 기재된 바와 같이, 상기 펩티드는 가용성 전분 및 다양한 루멘으로 분비되는 솔가장자리막 프로테아제의 강한 저해제인 프로테아제 저해제 아프로티닌을 갖는 미세입자의 생성에 이용된다. 간단히, 가용성 전분, 프로테아제 저해제 아프로티닌 및 본 발명의 펩티드는 수성 완충액에 용해된다. 가용성 전분, 아프로티닌, 및 펩티드의 비율은 당업자에게 친숙한 실험 방법에 의해 결정된다; 예를 들면, Larionova 등은 이의 연구에 이용된 단백질에 대해 가장 효과적인 비율 및 제조 조건을 결정하기 위한 시험관 내 가장 소화 분석을 이용하였다. 수용액은 비이온성 계면활성제인 5% Span-80을 포함하는 시클로헥산(1:3 비율, v/v)에서 기계적 교반하에 유화된다. 클로로포름 중의 테레프탈로일 클로라이드 용액은 에멀션에 첨가되며, 교반은 30분 동안 계속되며, 그 동안 전분 분자는 아프로티닌 및 펩티드와 가교된다. 상기 과정에서 생성된 미세입자는 시클로헥산, 2% v/v Tween 85 세제를 포함하는 95% 에탄올 용액, 95% 에탄올 및 물로 연속적으로 세정된다. 미세입자는 물에 재현탁되며, 동결건조된다. 상기 동결건조된 화합물은 치료를 필요로 하는 개인에게 경구 전달을 위해 젤라틴 캡슐 내로 위치화될 수 있다.
일단 섭취되면, 상기 화합물은 용해된 젤라틴 캡슐로서 방출된다. 상기 미세입자는 전분 분자에 대해 아밀라아제의 작용에 의해 소장에서 분해되어, 아프로 티닌 및 본 발명의 펩티드의 점차적인 방출을 초래한다. 강력한 프로테아제 저해제 아프로티닌의 동시 방출 및 상기 펩티드의 위치는 펩티드의 효소 분해를 감소시키며, 창자막을 통한 흡수에 유용한 본래의 펩티드의 비율을 증가시킨다.
본 발명은 특정 경우에 CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체의 전술한 방법 및 데이타 및 구체적인 실시예를 이용하여 기재되었지만, 이는 단지 예시이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해한다. 또한, CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체는 본 발명의 특정 구현예를 나타내며, 본 발명의 동일한 원리는 또한 CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체의 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 변형된 기타 기능적으로 동등한 펩티드에 적용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들면, CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 펩티드 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체의 동등물은 보존 아미노산 치환(즉, 소수성, 친수성, 양전하 또는 음전하 작용기와 같은 동일한 생화학적 유형 내의 잔기를 갖는 또 다른 아미노산에 의해 치환된 V, A, P, E, H, L, A, N, K 또는 T 중의 임의의 하나)을 갖는 것을 포함한다.
CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 펩티드 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체에 대한 동등물 펩티드의 또 다른 예는 동일한 생물학적 활성을 보유하는 하나 또는 2개의 아미노산이 더 긴 약간 더 긴 펩티드이다. 더욱이, CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이 의 기능성 유도체의 의학적 적용에 대해 전술한 질환 또는 질병이 구체적으로 세포 증식성 및 면역성 질환 및/또는 질병을 인용하지만, 상기 의학적 적용은 단지 비제한적인 예로서 이용되며, 본 청구범위를 제한하기 위해 이용되어서는 안 된다. CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)의 단편(CMS-010의 서열을 포함하지 않음) 및 이의 기능성 유도체의 기타 가능한/의도된 용도, 예를 들면, 정상인 또는 임의의 면역 및/또는 세포 증식성 질환 및/또는 질병을 갖는 환자의 면역계를 조절하기 위한 건강 식품 보조제로서 용도가 존재한다는 것은 명백하다. 임의의 상기 용도는 또한 본 발명의 범위 내에 해당한다.
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Claims (37)

  1. 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 분리된 펩티드.
  2. 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 분리된 펩티드를 포함하는, 신장염 또는 단백뇨 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 펩티드의 투여 효과는 신장염의 억제 및 단백뇨의 감소로 이루어지는 군으로부터 선택된 효과를 포함하는 것인 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 분리된 펩티드를 제공하는 단계, 및 상기 펩티드를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 신장염 또는 단백뇨 치료용 약학적 조성물의 제조 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 영양 보조제.
  11. 제5항에 있어서, 상기 펩티드의 투여 효과는 신장염의 억제 또는 단백뇨의 감소로 이루어지는 군으로부터 선택된 효과를 포함하는 것인 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 생체 내 T-림프구 형질전환, 시험관 내 ConA에 의한 T-림프구 형질전환, NK 세포 및 항체 형성을 억제하는 것인 펩티드.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
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