JPH1143445A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 副作用が極めて少なく、かつ熱にも安定であ
り、少量で腫瘍細胞に対して選択的に抗腫瘍効果を有す
る抗腫瘍剤を提供する。 【解決手段】 配列番号１のアミノ酸配列を含む５から
２０個のアミノ酸からなるペプチド、このペプチドの誘
導体、このペプチドもしくは誘導体の薬理学的に許容さ
れる塩類、またはこれらの混合物を有効成分として含有
する抗腫瘍剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、抗腫瘍剤に関す
るものである。さらに詳しくは、この発明は、腫瘍細胞
の増殖抑制作用、制癌作用、癌転移抑制作用および血管
新生抑制作用等を有し、悪性腫瘍の治療に有効な新しい
抗腫瘍剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、悪性腫瘍の治療は、早期発見
および外科的切除が主要な方法とされているが、悪性腫
瘍が外科的に切除し難い部位に発生した場合、または原
発部位以外の部位へ転移した場合および浸潤が惹起され
た場合には、患部への放射線照射、抗腫瘍剤の定期的投
与等による治療法が行われている。

【０００３】抗腫瘍剤の定期的投与による治療法は、薬
剤の １）免疫賦活作用 ２）代謝拮抗作用 ３）腫瘍細胞を直接殺傷する作用 をそれぞれ利用する治療法に大別することができる。

【０００４】前記２）および３）の作用を利用する治療
法には、多くの化学的に合成した薬剤が使用されてい
る。しかしながら、これらの薬剤は、抗腫瘍作用が強い
反面、腫瘍細胞のみならず、正常細胞にも毒性を発揮す
るという副作用も有している。また、固形癌に有効な薬
剤が少ないこと、これらの薬剤の使用により多剤耐性が
惹起されることも指摘されている。（井村裕夫編、「が
んのバイオサイエンス４がんの新しい診断と治療」、第
１０ページ、東京大学出版会、１９９１年）。

【０００５】一方、前記１）の作用を利用する治療法
は、生体の免疫系を賦活化し、腫瘍に対する免疫機能を
高めて治療する方法であり、腫瘍に対する生体反応を増
強する物質ＢＲＭ(biological response modifier)が用
いられている。すなわち、ＢＲＭとしてインターロイキ
ン、サイトカイン、担子菌成分（例えば、シゾフィラ
ン、レンチナン等）等を投与し、抗腫瘍作用を有するリ
ンパ球およびマクロファージを活性化すること、抗腫瘍
作用を有する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を投与すること等
が試みられており、前記２）または３）の作用を有する
化学合成薬剤との併用も臨床上研究されている（矢田純
一著、「医系免疫学」、第３２５ページ、中外医学社、
１９８９年）。

【０００６】なお、従来の抗腫瘍剤における有効成分と
しては、核酸または蛋白質をアルキル化して不活化させ
たアルキル化剤［例えば、シクロホスファミド等。キャ
ンサー・リサーチ(Cancer Research) 、第２１巻、第１
４１２ページ、１９６１年］、核酸合成の拮抗阻害剤
［例えば、５−フルオロウラシル等。キャンサー(Cance
r)、第４５巻、第１１２９ページ、１９８０年］、一部
の抗生物質［例えば、アクチノマイシンＤ等。ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー(Journal of Immunology) 、第
１４５巻、第１８５９ページ、１９９０年］等が知られ
ている。

【０００７】また、抗腫瘍作用を有するポリペプチドと
しては、ヒトインターフェロンγポリペプチド（特開平
５−３２０２００号公報）、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）またはその変換体の一部からなるポリペプチド（特
開平５−２７１２９０号公報、特開平５−２７１２８９
号公報、特開平５−２５５３９３号公報、特開平５−２
７１２８７号公報、特開平４−３６８３９８号公報、特
開平４−３６８３９７号公報、特開平４−３２７５９９
号公報、特開平３−１８０１９４号公報、特開平３−１
８０１９３号公報、特開平３−９８５８７号公報、特開
平３−６５１９６号公報、特開平３−６５１９５号公
報、特開平３−６１４９５号公報、特開平３−３０６９
３号公報、特開平２−７２１２２号公報、特開平２−２
５５０９６号公報、特開平２−１７７８９６号公報、特
開平２−１６３０９４号公報、特開平２−１４５１８８
号公報、特開平２−８６７９３号公報、特開平１−２７
７４８８号公報、特開平１−８５０９５号公報、特開平
１−８５０９４号公報、特開平１−４７３９３号公報、
特開平１−３０５９６号公報、特開平１−３０５９５号
公報、特開平２−９３８９号公報、特開昭６３−２７９
７９９号公報、特開昭６３−２６７２９０号公報、特開
昭６３−１９８９９６号公報、特開昭６３−１４１９９
９号公報、特開昭６３−３２４８６号公報、特開昭６２
−２７２９９１号公報、特開昭６２−２４８４９８号公
報、特開昭６２−４８６３２号公報および特開昭６１−
２８０４３７号公報）、茜草から抽出した特定のアミノ
酸配列を有する環状ペプチド化合物（特開平５−２６２
７９４号公報及び特開平５−３２６９８号公報）、ヒト
インターロイキン２活性を有するポリペプチド（特表平
５−５０２８７６号公報）、ヒトインターロイキン１α
ポリペプチド（特開平４−３３０２８２号公報）、下垂
体からの性腺刺激ホルモンの放出を制御し抗新生生物活
性を有するＬＨＲＨ類似体（特開平４−２２４６００号
公報）、ソマトスタチン類似体（特開平６−４１１９４
号公報）、形質転換性成長因子β−２またはその同族体
の一部からなるポリペプチド（特開平１−６３３９５号
公報）、植物種実抽出蛋白成分から得たポリペプチド
（特開平１−７５４３０号公報）、Ｉ型インターフェロ
ンペプチド（特開昭６１−１８１３８１号公報）、ヒト
組織球性リンパ腫由来細胞株の産生するポリペプチド
（特開昭６１−２８０４３１号公報）、ストレプトマイ
セス属の微生物が産生するポリペプチド（特開昭６１−
２７１９９１号公報）、ヒトインターロイキン２ポリペ
プチド誘導体（特開昭６１−２２５１９９号公報）、サ
フラマイシンＡ誘導体（特開昭６１−５８５９３号公
報）、ヒト免疫インターフェロン（特開昭５８−１８９
１９７号公報）、ヒト線維芽細胞インターフェロン（特
開昭５７−１４０７９３号公報）、少なくとも２−アミ
ノ−３−グアニド−プロピオン酸を含むポリペプチド
（特開昭５６−１４７７９６号公報）等が知られてい
る。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、従来か
ら、抗腫瘍活性を示すポリペプチド等は知られている
が、これらのポリペプチド等の場合には、その抗原性、
熱に対する安定性および化学合成の困難性等の問題を有
していた。従って、抗原性等の副作用を示さず、かつ熱
にも安定であり、特に、腫瘍細胞に選択的に作用し、周
囲の組織に有害な炎症反応を惹起しない抗腫瘍剤が待望
されていた。また、安価であり、化学合成による供給が
可能であり、実用性が高い低分子の抗腫瘍活性を有する
ペプチドの開発が望まれていた。

【０００９】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであり、副作用が極めて少なく、かつ熱に
も安定であり、腫瘍細胞に選択的に作用するペプチドを
含む抗腫瘍剤を提供することを目的としている。また、
この発明は、安価で、しかも化学的合成による供給が可
能であり、実用性が高い抗腫瘍剤を提供することを目的
としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】この発明は、前記の課題
を解決するものとして、配列番号１のアミノ酸配列を含
む５から２０個のアミノ酸からなるペプチド、このペプ
チドの誘導体、このペプチドもしくは誘導体の薬理学的
に許容される塩類、またはこれらの混合物を有効成分と
して含有する抗腫瘍剤を提供する。

【００１１】また、この発明の抗腫瘍剤においては、有
効成分を、最終組成物１ｇ当たり少なくとも５ｍｇ含有
することを望ましい態様としてもいる。

【００１２】

【発明の実施の形態】この発明の抗腫瘍剤の有効成分で
あるペプチド（以下、抗腫瘍性ペプチドと記載する。）
は、配列番号１に記載の５残基のアミノ酸配列からなる
ペプチド、または配列番号１のアミノ酸配列を含む２０
残基までのペプチドである。これらの抗腫瘍性ペプチド
は、固相法、液相法等の公知の方法により、次のとおり
化学的に合成することができる。

【００１３】固相法による場合は、ペプチド合成用固相
樹脂を使用して、アミノ酸ブロックを順次縮合させてペ
プチド鎖を延長し、所望の抗腫瘍性ペプチドを合成す
る。アミノ酸ブロックとして、Ｎ末端および側鎖の反応
性基を９−フルオレニルメトキシカルボニル（以下、Ｆ
ｍｏｃと略記する。）基等の保護基で保護したアミノ酸
誘導体を使用し、Ｃ末端側からの縮合反応およびＮ末端
側の脱保護基反応を反復して目的のペプチド鎖を合成す
る。次いで、Ｎ末端および側鎖の反応性基が保護された
ペプチドを樹脂から切断して取り出し、脱保護反応を行
うことにより、目的とする抗腫瘍性ペプチドを得ること
ができる。

【００１４】なお、以上の操作を機械化、自動化したペ
プチド自動合成装置（例えば、パーキン・エルマー社製
のModel 433A等）を使用して実施することもできる。一
方、液相法による場合は、Ｎ末端、Ｃ末端、および側鎖
の反応性基を保護基で保護したアミノ酸誘導体をアミノ
酸ブロックとし、これを使用して縮合反応、およびＮ末
端またはＣ末端の脱保護基反応を反復して目的の抗腫瘍
性ペプチド鎖を合成する。さらに、液相法においてはＣ
末端側、またはＮ末端側から順次ペプチド鎖を延長する
逐次鎖長延長法に代えて、目的とするペプチド鎖を適当
なフラグメントに分割し、各フラグメント鎖を合成した
後、各フラグメント鎖を縮合させて目的とするペプチド
鎖を合成するフラグメント法を適用することもできる。

【００１５】この発明の抗腫瘍剤の有効成分である抗腫
瘍性ペプチドの誘導体は、前記のとおりの方法によって
化学合成した抗腫瘍性ペプチドの一部置換体、付加化合
物等の誘導体であり、Ｃ末端がアミド化またはアシル化
された抗腫瘍性ペプチドの誘導体を例示することができ
る。例えば、Ｃ末端がアミド化された抗腫瘍性ペプチド
の誘導体を固相法により合成する場合には、前記のとお
り、Ｎ末端および側鎖の反応性基が保護されたペプチド
を樹脂から切断して取り出し、このペプチドのＣ末端の
アミド化を行い、さらに保護反応を行うことによって、
目的とする抗腫瘍性ペプチドの誘導体を得ることができ
る。

【００１６】また、Ｃ末端がアミド化されたペプチド誘
導体を合成する場合には、通常の固相樹脂の代わりにＣ
末端アミドペプチド合成用固相樹脂［例えば、パーキン
・エルマー（Perkin Elmer）社製のＦｍｏｃアミドレジ
ン等］を使用することもできる。この場合には、保護基
の選択によって脱樹脂および脱保護を同時に実施できる
ので便利である。

【００１７】この発明の抗腫瘍の有効成分である抗腫瘍
性ペプチドまたはその誘導体の薬理学的に許容される塩
類は無毒性の塩であり、具体的には酸付加塩、金属錯
体、カルボン酸塩等である。酸付加塩としては、塩酸
塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、りん酸塩、タンニン酸塩、
シュウ酸塩、フマール酸塩、グルコン酸塩、アルギン酸
塩、マレイン酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエ
ン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコ
ルビン酸塩、酒石酸塩等を例示することができる。ま
た、金属錯体としては、例えば、亜鉛、鉄、カルシウ
ム、マグネシウムまたはアルミニウム等の錯体を例示す
ることができる。さらに、カルボン酸塩としては、例え
ば、アルカリ金属とのナトリウム塩、カリウム塩等、ア
ルカリ土金属とのカルシウム塩、マグネシウム塩等、ア
ンモニウム塩等を例示することができる。

【００１８】この発明の抗腫瘍剤は、前記のとおりの抗
腫瘍性ペプチド、抗腫瘍性ペプチドの誘導体、抗腫瘍性
ペプチドまたはその誘導体の薬理学的に許容される塩類
（以下、これらをまとめて「ペプチド類」と記載するこ
とがある。）から選択された任意の１種の化合物または
２種以上の混合物を有効成分として５ｍｇ／ｋｇ以上の
濃度で含有させ、その他の成分とともに製剤化すること
ができる。その他の成分としては、医薬製造分野で通常
使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、
表面活性剤、滑沢剤の希釈剤、賦形剤等を例示すること
ができる。

【００１９】この発明の抗腫瘍剤は、一般的な医薬製剤
の形態、例えば、静注、皮下注または経口によりヒトま
たは動物に投与することができ、これらの投与経路およ
び治療目的に応じて各種の剤形が選択可能である。その
代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、
乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁
剤等）等を例示することができる。例えば、錠剤に成形
する場合、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿
素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロ
ース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノー
ル、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶
液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、
リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、
乾燥デンプン、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナ
トリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビ
タン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステ
アリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、
白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊
抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリ
ウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿
剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイ
ド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、
ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を適宜
使用することができる。また、錠剤は必要に応じて通常
の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包
錠、腸用被錠フィルムコーティング錠または二重錠、多
層錠とすることもできる。

【００２０】注射剤を調製する場合は、液剤、乳剤およ
び懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好まし
く、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピ
レングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコー
ル、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキ
シエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用するこ
とができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製する
に充分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を含有させ
ることも可能であり、また、溶解補助剤、緩衝剤、鎮痛
剤等を配合することもできる。

【００２１】これら各形態の医薬製剤には、さらに必要
に応じて慣用される着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘
味剤等を配合することができ、また、他の医薬品有効成
分を含有させることもできる。さらに、この発明の抗腫
瘍剤は、必要に応じて他の抗腫瘍剤、例えば、癌化学療
法剤として公知の各種制癌剤と併用して使用することも
でき、また、放射線療法と併用して使用することもでき
る。この結果、この発明の抗腫瘍剤は、優れた制癌効果
も奏し得ることから、併用した他の制癌剤の効果を一層
助長し、相乗効果を発揮させることができる。従って、
併用した制癌剤の使用量を通常の使用量より少量とした
場合でも、十分な癌治療効果が得られるので、併用する
制癌剤の副作用を軽減することもできる。

【００２２】この発明の抗腫瘍剤の有効投与量は皮下投
与の場合、マウスによる試験結果から、少なくとも１ｍ
ｇ／体重１ｋｇ／１日であることが判明した。また、こ
の発明の抗腫瘍剤の有効成分であるペプチド類は、マウ
スを用いた静脈投与による急性毒性試験の結果、毒性が
極めて低く、ＬＤ₅₀は１００ｍｇ／体重ｋｇ以上であ
り、ヒトまたは動物に対して安全に、かつ副作用が極め
て少ない状態で使用することができる。

【００２３】なお、この発明の抗腫瘍剤は、制癌剤、癌
転移抑制剤または血管新生抑制剤としても有効である。
次に、試験例を示してこの発明の効果を詳しく説明す
る。 試験例 この試験は、この発明の抗腫瘍剤が腫瘍細胞の増殖抑制
効果を有するか否かを調べるために行った。 （１）試料の調製 実施例１と同一の方法により化学的に合成した配列番号
１のアミノ酸配列を有する抗腫瘍性ペプチドを、生理食
塩水（生理食塩注。大塚製薬社製）に０．３ｍｇ／ｍｌ
の濃度で溶解し、６０℃で２４時間加熱し、のち冷却
し、試料溶液として使用した。また、対照溶液として抗
腫瘍性ペプチドを含まない生理食塩水を同様に処理して
使用した。 （２）試験方法 キリアジス（Kyriazis）らの方法［アメリカン・ジャー
ナル・オブ・パソロジー（American Journal of Pathol
ogy)、第１０６巻、第２５０ページ、１９８２年］に基
づいて次のとおり試験を実施した。

【００２４】ヒト赤芽球性白血病細胞（Ｋ５６２）をダ
ルベッコリン酸緩衝液［ジャーナル・オブ・エクスペリ
メンタル・メディシン（Journal of Experimental Medi
cine）、第９９巻、第１６７〜１８２ページ、１９５４
年］に５×１０⁶ 個／ｍｌの割合で分散させ、この細胞
分散液０．１ｍｌを１週間予備飼育した５週令の雄ヌー
ドマウス（Balb/c nu/nu。日本チャールスリバー社より
購入）２０匹の背部皮下に移植した。

【００２５】移植したマウスを常法により４日間飼育
し、各マウスにおける腫瘍の形成を確認し、無作為に１
群１０匹に分割し、１群に試料溶液、他の１群に対照溶
液を、１日１回０．１ｍｌの割合で毎日腫瘍内投与し、
細胞移植７日後および１０日後にノギスにより各腫瘍の
長径および短径を測定し、腫瘍の容積を次式により算出
した。

【００２６】 腫瘍の容積（ｍｍ³ ）＝短径² ×長径×０．４ なお、この試験に使用したヒト赤芽球性白血病細胞（Ｋ
５６２）は、公知のヒト白血病細胞株であり［ブラッド
(Blood）、第４５巻、第３２１〜３２２ページ、１９７
９年］、この細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション(American Type Culture Collection:ＡＴ
ＣＣ）に、寄託番号ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ−２４３とし
て寄託されており、容易に入手可能である。 （３）試験結果 この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１は、
各群１０匹の平均腫瘍面積を示している。表１から明ら
かなとおり、この発明の抗腫瘍剤を含む試料溶液投与群
は、対照溶液投与群に比較して腫瘍の容積が、７日後で
約３／５であり、１０日後では約１／２以下となった。
この結果から、この発明の抗腫瘍剤は有意にＫ５６２細
胞の増殖を抑制し、顕著な抗腫瘍効果を有することが確
認された。また、６０℃で２４時間加熱後も抗腫瘍効果
が認められたことから、この発明の抗腫瘍剤は熱に安定
であることが判明した。

【００２７】なお、他のペプチド類についても試験を行
ったが、ほぼ同様の結果が得られた。

【００２８】

【表１】

【００２９】次に実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例に限
定されるものではない。

【００３０】

【実施例】

実施例１ ペプチド自動合成装置（パーキン・エルマー社製。Mode
l 433A）を使用し、シェパード等［ジャーナル・オブ・
ケミカル・ソサイエティー・パーキンＩ（Journal of C
hemical Society Perkin I）、第５３８ページ、１９８
１年］による固相法、および同装置の使用説明書に基づ
いて抗腫瘍性ペプチドを次のとおり合成した。

【００３１】ペプチド合成用固相樹脂としてＨＭＰ樹脂
（パーキン・エルマー社製）５００ｍｇ（０．２５ｍｍ
ｏｌ）を使用し、前記ペプチド自動合成装置の合成プロ
グラムにより脱保護基反応および縮合反応を反復してペ
プチド鎖を延長した。詳しくは、２０％ピペリジン含有
Ｎ−メチルピロリドン（パーキン・エルマー社製。以
下、Ｎ−メチルピロリドンをＮＭＰと略記する。）によ
り、上記固相樹脂のアミノ保護基であるＦｍｏｃ基を切
断除去し、ＮＭＰで洗浄し、Ｆｍｏｃ−アミノ酸、具体
的には、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ（パー
キン・エルマー社製）を、ＦａｓｔＭｏｃリージェント
キット（パーキン・エルマー社製。ＦａｓｔＭｏｃは登
録商標）を使用して縮合させ、ＮＭＰで洗浄した。

【００３２】以下、前記Ｆｍｏｃ基の切断、各Ｆｍｏｃ
−アミノ酸の縮合、および洗浄までの操作を反復した。
Ｆｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｏ
Ｈ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａ
ｌ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ（いずれ
もパーキン・エルマー社製）を順次使用した。ペプチド
鎖の伸長反応が完了した後、２０％ピペリジン含有ＮＭ
ＰによりＮ末端のＦｍｏｃ基を切断し、ＮＭＰおよびジ
クロロメタン（パーキン・エルマー社製）で洗浄し、真
空乾燥して保護ペプチド樹脂を約５１３ｍｇ得た。

【００３３】なお、縮合反応条件および脱保護条件は、
フィードバックモニタリングシステムにより自動的に制
御した。前記保護ペプチド樹脂５１０ｍｇにエタンジチ
オール（渡辺化学工業社製）０．５ｍｌ、結晶フェノー
ル（東京化成工業社製）１．５ｇ、チオアニソール（渡
辺化学工業社製）１．０ｍｌ、および精製水１．０ｍｌ
を添加して室温で１５分間撹拌し、のち氷冷し、さらに
１０分間撹拌した。これにトリフルオロ酢酸（渡辺化学
工業社製。以下、ＴＦＡと略記する。）２０ｍｌを添加
して１．５時間撹拌し、グラスフィルターで樹脂を瀘去
し、瀘液を直ちに減圧濃縮し、残渣に予め冷却した無水
ジエチルエーテル（国産化学社製）を添加し、ペプチド
を白色粉末化した。白色粉末化したペプチドを遠沈管に
移し、冷ジエチルエーテルを新たに添加して十分撹拌
し、遠心分離（２５００ｒｐｍで１０分間）し、上清を
廃棄した。さらに冷ジエチルエーテルを新たに添加して
十分撹拌し、遠心分離する操作を３回反復し、ペプチド
沈殿物を真空乾燥し、水に溶解して凍結乾燥し、粗製ペ
プチド約１０５ｍｇを得た。

【００３４】前記粗製ペプチドの全量を精製水に溶解
し、遠心分離（１５０００ｒｐｍで５分間）し、上清を
０．４５μｍフィルターで瀘過し、この瀘液を高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりペプチドの精製
を行なった。ＨＰＬＣは、ガリバーPU-986高圧グラジエ
ントシステム（日本分光社製）を使用し、カラムは逆相
系のLichrospher100RP-18(e) 250×10ｍｍ（メルク社
製）を使用した。溶離液は０．１％ＴＦＡ／精製水をＡ
液、８０％アセトニトリル／Ａ液をＢ液とし、Ａ液から
Ｂ液への濃度直線勾配により溶出した。得られたクロマ
トグムは、ほぼ単一のピークであり、ピークに相当する
画分を分取した。この分取操作を数回反復し、得られた
画分を凍結乾燥し、精製ペプチド約３８．６ｍｇを得
た。分析用カラム［Lichrospher100RP-18(e) 250×4.6
ｍｍ（メルク社製）］を使用し、得られた精製ペプチド
のＨＰＬＣ分析を行ない、精製物が単一であることを確
認した。また、精製ペプチドのアミノ酸配列等を、常法
のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元素分析、質量分
析により確認し、配列番号１で表わされるアミノ酸配列
を有する５残基のアミノ酸配列からなるペプチドが得ら
れていることを確認した。

【００３５】この実施例で得られた精製ペプチドは、試
験例に記載されるとおり、抗腫瘍活性を有していた。 実施例２ 固相樹脂として、ＨＭＰ樹脂（パーキン・エルマー社
製）５００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）に変えてＣ末端ア
ミド化ペプチド合成用固相樹脂であるＦｍｏｃアミドレ
ジン（パーキン・エルマー社製）３９７ｍｇ（０．２５
ｍｍｏｌ）を使用したことを除き、実施例１と同一の方
法によりペプチド自動合成装置でＣ末端がアミド化され
た精製ペプチド誘導体約３４．６ｍｇを得た。

【００３６】分析用カラム［Lichrospher100RP-18(e) 2
50×4.6 ｍｍ（メルク社製）］を使用し、得られた精製
ペプチド誘導体のＨＰＬＣ分析を行ない、精製物が単一
であることを確認した。また、精製ペプチドのアミノ酸
配列等を、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元
素分析、質量分析により確認し、配列番号１で表わされ
るアミノ酸配列を有する５残基のアミノ酸配列からなる
Ｃ末端がアミド化されたペプチドの誘導体が得られてい
ることを確認した。

【００３７】この実施例で得られた精製ペプチドの誘導
体は、試験例と同一の方法により抗腫瘍効果を試験した
結果、有意な抗腫瘍活性を有することが確認された。 実施例３ ペプチド合成用固相樹脂としてＨＭＰ樹脂（パーキン・
エルマー社製）５００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を使用
し、前記ペプチド自動合成装置の合成プログラムにより
脱保護基反応および縮合反応を反復してペプチド鎖を延
長した。詳しくは、２０％ピペリジン含有Ｎ−メチルピ
ロリドン（パーキン・エルマー社製。以下、Ｎ−メチル
ピロリドンをＮＭＰと略記する。）により、上記固相樹
脂のアミノ保護基であるＦｍｏｃ基を切断除去し、ＮＭ
Ｐで洗浄した後、Ｆｍｏｃ−アミノ酸、具体的には、Ｆ
ｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ（パーキン・エルマー社製）
を、ＦａｓｔＭｏｃリージェントキット（パーキン・エ
ルマー社製。ＦａｓｔＭｏｃは登録商標。）を使用して
縮合させ、ＮＭＰで洗浄した。以下、前記Ｆｍｏｃ基の
切断、各Ｆｍｏｃ−アミノ酸の縮合、および洗浄までの
操作を反復した。

【００３８】Ｆｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｌ
−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ
（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆ
ｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−
Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｏ
Ｈ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａ
ｌ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ（いずれも
パーキン・エルマー社製）を順次使用した。ペプチド鎖
の伸長反応が完了した後、２０％ピペリジン含有ＮＭＰ
によりＮ末端のFmoc基を切断し、ＮＭＰおよびジクロロ
メタン（パーキン・エルマー社製）で洗浄し、真空乾燥
して保護ペプチド樹脂を約７６７ｍｇ得た。

【００３９】なお、縮合反応条件および脱保護条件は、
フィードバックモニタリングシステムにより自動的に制
御した。前記保護ペプチド樹脂７６７ｍｇにエタンジチ
オール（渡辺化学工業社製）０．５ｍｌ、結晶フェノー
ル（東京化成工業社製）１．５ｇ、チオアニソール（渡
辺化学工業社製）１．０ｍｌ、および精製水１．０ｍｌ
を添加して室温で１５分間撹拌し、のち氷冷し、さらに
１０分間撹拌した。これにＴＦＡ２０ｍｌを添加して
１．５時間撹拌し、グラスフィルターで樹脂を瀘去し、
瀘液を手早く減圧濃縮し、残渣に予め冷却した無水ジエ
チルエーテル（国産化学社製）を添加し、ペプチドを白
色粉末化した。白色粉末化したペプチドを遠沈管に移
し、冷ジエチルエーテルを新たに添加して十分撹拌し、
遠心分離（２５００ｒｐｍで１０分間）し、上清を廃棄
した。さらに冷ジエチルエーテルを新たに添加して十分
撹拌し、遠心分離する操作を３回反復し、ペプチド沈殿
物を真空乾燥し、水に溶解して凍結乾燥し、粗製ペプチ
ド約２３１ｍｇを得た。

【００４０】前記粗製ペプチドの全量を精製水に溶解
し、遠心分離（１５０００ｒｐｍで５分間）し、上清を
０. ４５μｍフィルターで瀘過し、この瀘液をＨＰＬＣ
によりペプチドの精製を行なった。ＨＰＬＣは、ガリバ
ーPU-986高圧グラジエントシステム（日本分光社製）を
使用し、カラムは逆相系のLichrospher100RP-18(e) 250
×10ｍｍ（メルク社製）を使用した。溶離液は０. １％
ＴＦＡ／精製水をＡ液、８０％アセトニトリル／Ａ液を
Ｂ液とし、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出し
た。得られたクロマトグムは、ほぼ単一のピークであ
り、ピークに相当する画分を分取した。この分取操作を
数回反復し、得られた画分を凍結乾燥し、精製ペプチド
約９０ｍｇを得た。分析用カラム［Lichrospher100RP-1
8(e) 250×4.6 ｍｍ（メルク社製）］を使用し、得られ
た精製ペプチドのＨＰＬＣ分析を行ない、精製物が単一
であることを確認した。また、精製ペプチドのアミノ酸
配列等を、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元
素分析、質量分析により確認し、配列番号２で表わされ
るアミノ酸配列を有する１０残基のアミノ酸配列からな
るペプチドが得られていることを確認した。

【００４１】この実施例で得られた精製ペプチドは、試
験例と同一の方法により抗腫瘍効果を試験した結果、有
意な抗腫瘍活性を有することが確認された。 実施例４ ペプチド合成用固相樹脂としてＨＭＰ樹脂（パーキン・
エルマー社製）５００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を使用
し、前記ペプチド自動合成装置の合成プログラムにより
脱保護基反応および縮合反応を反復してペプチド鎖を延
長した。詳しくは、２０％ピペリジン含有Ｎ−メチルピ
ロリドン（パーキン・エルマー社製。以下、Ｎ−メチル
ピロリドンをＮＭＰと略記する。）により、上記固相樹
脂のアミノ保護基であるＦｍｏｃ基を切断除去し、ＮＭ
Ｐで洗浄した後、Ｆｍｏｃ−アミノ酸、具体的には、Ｆ
ｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（パーキン・エル
マー社製）を、ＦａｓｔＭｏｃリージェントキット（パ
ーキン・エルマー社製。ＦａｓｔＭｏｃは登録商標。）
を使用して縮合させ、ＮＭＰで洗浄した。以下、前記Ｆ
ｍｏｃ基の切断、各Ｆｍｏｃ−アミノ酸の縮合、および
洗浄までの操作を反復した。

【００４２】Ｆｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｌ
−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔ
Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｏ
Ｈ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ
−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）
−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍ
ｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａ
ｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−
ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏ
ｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒ
ｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ
−Ｖａｌ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ（い
ずれもパーキン・エルマー社製）を順次使用した。ペプ
チド鎖の伸長反応が完了した後、２０％ピペリジン含有
ＮＭＰによりＮ末端のＦｍｏｃ基を切断し、ＮＭＰおよ
びジクロロメタン（パーキン・エルマー社製）で洗浄
し、真空乾燥して保護ペプチド樹脂を約１２５０ｍｇ得
た。

【００４３】なお、縮合反応条件および脱保護条件は、
フィードバックモニタリングシステムにより自動的に制
御した。前記保護ペプチド樹脂１２５０ｍｇにエタンジ
チオール（渡辺化学工業社製）０．５ｍｌ、結晶フェノ
ール（東京化成工業社製）１．５ｇ、チオアニソール
（渡辺化学工業社製）１．０ｍｌ、および精製水１．０
ｍｌを添加して室温で１５分間撹拌し、のち氷冷し、さ
らに１０分間撹拌した。これにＴＦＡ２０ｍｌを添加し
て１．５時間撹拌し、グラスフィルターで樹脂を瀘去
し、瀘液を手早く減圧濃縮し、残渣に予め冷却した無水
ジエチルエーテル（国産化学社製）を添加し、ペプチド
を白色粉末化した。白色粉末化したペプチドを遠沈管に
移し、冷ジエチルエーテルを新たに添加して十分撹拌
し、遠心分離（２５００ｒｐｍで１０分間）し、上清を
廃棄した。さらに冷ジエチルエーテルを新たに添加して
十分撹拌し、遠心分離する操作を３回反復し、ペプチド
沈殿物を真空乾燥し、水に溶解して凍結乾燥し、粗製ペ
プチド約４７５ｍｇを得た。

【００４４】前記粗製ペプチドの全量を精製水に溶解
し、遠心分離（１５０００ｒｐｍで５分間）し、上清を
０. ４５μｍフィルターで瀘過し、この瀘液をＨＰＬＣ
によりペプチドの精製を行なった。ＨＰＬＣは、ガリバ
ーPU-986高圧グラジエントシステム（日本分光社製）を
使用し、カラムは逆相系のLichrospher100RP-18(e) 250
×10ｍｍ（メルク社製）を使用した。溶離液は０. １％
ＴＦＡ／精製水をＡ液、８０％アセトニトリル／Ａ液を
Ｂ液とし、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出し
た。得られたクロマトグムは、ほぼ単一のピークであ
り、ピークに相当する画分を分取した。この分取操作を
数回反復し、得られた画分を凍結乾燥し、精製ペプチド
約１４０ｍｇを得た。分析用カラム［Lichrospher100RP
-18(e) 250×4.6 ｍｍ（メルク社製）］を使用し、得ら
れた精製ペプチドのＨＰＬＣ分析を行ない、精製物が単
一であることを確認した。また、精製ペプチドのアミノ
酸配列等を、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、
元素分析、質量分析により確認し、配列番号３で表わさ
れるアミノ酸配列を有する２０残基のアミノ酸配列から
なるペプチドが得られていることを確認した。

【００４５】この実施例で得られた精製ペプチドは、試
験例と同一の方法により抗腫瘍効果を試験した結果、有
意な抗腫瘍活性を有することが確認された。 実施例５ 次の組成の注射剤を常法により製造した。なお、抗腫瘍
性ペプチド以外の成分はいずれも市販品である。

【００４６】 実施例１と同一の方法により得た抗腫瘍性ペプチド ０．５（重量％） 塩化ナトリウム ０．９ 注射用蒸留水 ９８．６ 実施例６ 次の組成の注射剤を常法により製造した。なお、抗腫瘍
性ペプチド以外の成分はいずれも市販品である。

【００４７】 実施例２と同一の方法により得た抗腫瘍性ペプチド ０．５（重量％） アクチノマイシンＤ ０．００５ 塩化ナトリウム ０．９ 注射用蒸留水 ９８．５９５ 実施例７ １錠あたりの組成が次の組成の錠剤を常法により製造し
た。なお、抗腫瘍性ペプチド以外の成分はいずれも市販
品である。

【００４８】 実施例３と同一の方法により得た抗腫瘍性ペプチド １．０（ｍｇ） アクチノマイシンＤ ０．０２ 乳糖 １６２．９８ 結晶セルロース ３０．０ ポリビニルピロリドン ５．０ ステアリン酸マグネシウム １．０ 実施例８ １錠あたりの組成が次の組成の錠剤を常法により製造し
た。なお、抗腫瘍性ペプチド以外の成分はいずれも市販
品である。

【００４９】 実施例４と同一の方法により得た抗腫瘍性ペプチド １．０（ｍｇ） 結晶セルロース ５０．０ コーンスターチ ４０．０ ステアリン酸マグネシウム １．０ ヒドロキシプロピルメチルセルロース １５．０ ポリエチレングリコール（分子量６０００） ３．０ ヒマシ油 ５０．０ メタノール ４０．０

【００５０】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、以下のとおりの効果を奏する新規な抗腫瘍剤が
提供される。 １）副作用が極めて少なく、熱に安定であり、少量で腫
瘍細胞に対して選択的に抗腫瘍効果を示す。 ２）化学合成により安価に供給が可能であり、実用性が
高い。 ３）従来の化学療法、放射線療法等の癌治療に伴う周囲
組織の炎症反応を惹起することなく、抗腫瘍効果を有す
るという利点を有している。

【００５１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ala Val Leu Pro Arg 1 5 配列番号：２ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu 1 5 10 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Thr Tyr Ser Lys 20

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配列を含む５から
   ２０個のアミノ酸からなるペプチド、このペプチドの誘
   導体、このペプチドもしくは誘導体の薬理学的に許容さ
   れる塩類、またはこれらの混合物を有効成分として含有
   する抗腫瘍剤。
2. 【請求項２】 有効成分を、最終組成物１ｇ当たり少な
   くとも５ｍｇ含有する請求項１の抗腫瘍剤。