ES2337321T3

ES2337321T3 - Peptidos especificos neovasculares.

Info

Publication number: ES2337321T3
Application number: ES99947941T
Authority: ES
Inventors: Naoto Oku; Koichi Ogino; Dai Ishikawa; Michinori Tanaka; Takao Taki
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2010-04-22
Anticipated expiration: 2019-10-15
Also published as: ATE453667T1; DK1122262T3; CA2347136A1; EP1783140A3; DE69941877D1; EP1783140A2; US6753310B1; PT1122262E; CA2622786A1; EP1122262A1; WO2000023476A1; JP4439120B2; CY1109881T1; EP1122262B1; EP1122262A4

Abstract

Péptido específico de la angiogénesis que migra selectivamente a los tejidos neovasculares que comprende uno de los elementos presentados a continuación en (a) y (b): (a) péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos representadas en SEC ID nº 5 y 6, o un dendrímero del mismo, (b) péptido que presenta una secuencia de aminoácidos representada en secuencias SEC ID nº 13 a 16 y 28 a 32, o un dendrímero del mismo.

Description

Péptidos específicos neovasculares.

Campo técnico

La presente invención describe moléculas peptídicas que migran específicamente a los tejidos neovasculares y, más particularmente, péptidos específicos de la angiogénesis (específicos neovasculares) que funcionan como ligandos de células endoteliales neovasculares de tejidos cancerosos, por ejemplo, y que resultan útiles como fármacos moleculares y aplicables a preparaciones de sistema de administración de fármaco (DDS) que permiten la administración farmacológica selectiva en tejidos diana y pueden contribuir a mejorar los efectos terapéuticos en el cáncer.

\vskip1.000000\baselineskip

Antecedentes de la técnica

Uno de los factores que dificultan la quimioterapia exitosa del cáncer radica en el hecho de que el fármaco administrado elimina o daña no sólo los tejidos cancerosos diana, sino también tejidos normales, provocando efectos adversos. Los sistemas de administración de fármaco (DDS) han recibido atención en el campo de la terapia del cáncer como medio para minimizar dichos efectos secundarios y conseguir una mejora de la eficacia de los agentes anticáncer.

Los DDS mencionados anteriormente con diana en el cáncer pueden clasificarse en dos tipos: de direccionamiento pasivo y de direccionamiento activo. Debido a que los tejidos neovasculares muestran una permeabilidad vascular incrementada en comparación con los vasos preexistentes, una preparación del tipo de larga retención en sangre se acumula gradualmente en los tejidos cancerosos. El direccionamiento pasivo es el direccionamiento que utiliza esta propiedad. Una preparación de direccionamiento pasivo en la que se utilizan liposomas ya ha sido utilizada en Europa y en América en el tratamiento del sarcoma de Kaposi. Por otra parte, se ha concebido una preparación de direccionamiento activo mediante la modificación del fármaco con un anticuerpo o con algún otro ligando capaz de unirse a un marcador de superficie celular, tal como una proteína, altamente expresado en células cancerosas o tejidos circundantes de las mismas, de manera que el fármaco puede administrarse activa y selectivamente en las células cancerosas sin causar efectos perjudiciales en los tejidos normales.

En el campo de la terapia actual del cáncer, la angiogénesis se ha convertido en un foco de atención. El término "angiogénesis" se refiere al desarrollo de vasos sanguíneos dentro de tejidos cancerosos en paralelo al crecimiento de los tumores en el progreso del cáncer. De esta manera, para la proliferación activa de las células cancerosas, y el crecimiento y metástasis de los tejidos cancerosos, resulta importante que los vasos sanguíneos, que son órganos que actúan en la alimentación con nutrientes y oxígeno y en la eliminación de metabolitos y materiales de desecho, sean construidos nuevamente. A este respecto, el crecimiento de los tejidos cancerosos puede ser altamente dependiente de la angiogénesis.

Se considera que al inhibir dicha angiogénesis, puede evitarse el crecimiento y metástasis de los tejidos cancerosos. Se ha demostrado la inhibición de la angiogénesis inducida tumoralmente por péptidos que se unen a la angiogenina (Gho Yong Song et al., J. Biol. Chem. 272 nº 39: 24294-24299, 1997). Desde este punto de vista, se desea en el campo de la técnica que se desarrolle una terapia del cáncer con diana en tejidos neovasculares, en particular una preparación de direccionamiento activo (preparación de DDS).

\vskip1.000000\baselineskip

Exposición de la invención

La identificación, aislamiento y puesta a disposición de una sustancia que puede actuar como ligando de células endoteliales neovasculares en un tejido canceroso conducirá a su aplicación en preparaciones de DDS y a mejoras adicionales en la eficiencia de la terapia del cáncer.

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar dicho nuevo ligando.

Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar una sustancia capaz de inhibir la angiogénesis.

Durante el curso de investigaciones intensivas realizadas con los objetivos mencionados anteriormente, se obtuvieron los resultados mencionados posteriormente. De esta manera, en primer lugar se indujo la formación de tejidos tumorales neovasculares en el dorso de ratones mediante el método del anillo con cámara (Folkman J. et al., J. Exp. Med. 133: 275-288, 1971). A continuación, se administró en los ratones un fago de expresión de péptidos aleatorios construido mediante la inserción de ADN aleatorios en el gen de la proteína pIII de cubierta del fago, para permitir de esta manera la expresión de péptidos aleatorios que presentan una secuencia de 15 aminoácidos en la cubierta fágica. A continuación, se congelaron los ratones con nitrógeno líquido y se diseccionaron las partes de la piel que presentaban tejidos neovasculares, se homogeneizaron en un medio de cultivo que contenía un inhibidor de proteasa, se lavaron y se centrifugaron, recuperando de esta manera el fago a partir de los tejidos neovasculares. Se introdujo el fago mediante infección en Escherichia coli, que se cultivó en masa. Tras el aislamiento y la purificación, se obtuvo un fago capaz de expresar un péptido que se acumula en el endotelio del tejido neovascular y actúa como ligando. Para una pluralidad de fagos así obtenidos se secuenciaron los péptidos expresados por los mismos.

A continuación, para seleccionar un fago que expresase un péptido con elevada afinidad para los tejidos neovasculares, cada fago obtenido de la manera mencionada anteriormente se administró en la vena de la cola de ratones portadores tumorales preparados mediante implantación de células tumorales. Los ratones se congelaron de la misma manera que se ha indicado anteriormente, se diseccionaron los tejidos tumorales y los fagos se aislaron y se purificaron a partir de los materiales obtenidos y se utilizaron para infectar Escherichia coli, seguido del cultivo. Además, para cada fago se contaron las unidades formadoras de colonia, utilizando el fago antes de la selección como control. Se calculó la afinidad para los tejidos neovasculares en términos de la proporción entre el número de fagos administrado en la vena de la cola y el número de fagos acumulados por 100 mg de tejido tumoral. De esta manera, se obtuvieron péptidos candidatos para ligandos con elevada afinidad para tejidos neovascu-
lares.

Además, se sintetizaron los péptidos mencionados anteriormente, los dendrímeros de los mismos, péptidos parciales de los mismos y similares, y confirmaron que estos los péptidos realmente muestran efectos antitumorales y, simultáneamente, confirmaron que los liposomas modificados con los péptidos, en particular el péptido que contiene la secuencia Trp-Arg-Pro, muestra niveles significativamente más altos de distribución en el tumor en comparación con el control.

La presente invención se llevó a cabo basándose en dichos resultados.

La invención proporciona un péptido específico de la angiogénesis que migra selectivamente a los tejidos neovasculares, que comprende uno de los elementos indicados a continuación en (a) y (b):

(a): un péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos representadas en las secuencias SEC ID nº 5 y 6, o un dendrímero de las mismas,

(b): un péptido que presenta una secuencia de aminoácidos de entre las representadas en las secuencias SEC ID nº 13 a 16 y nº 28 a 32, o un dendrímero de la misma.

En particular, la invención proporciona un péptido específico de la angiogénesis tal como se ha indicado anteriormente que es un péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 5 y 6, o un dendrímero de las mismas, un péptido específico de la angiogénesis tal como se ha indicado anteriormente que es un dendrímero que comprende una pluralidad de péptidos que son iguales o diferentes y que presentan una de las secuencias de aminoácidos mostradas en la secuencia SEC ID nº 5 y 6, un péptido específico de la angiogénesis tal como se ha indicado anteriormente que es un péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 13 a 16, o un dendrímero de las mismas, y un péptido específico de la angiogénesis tal como se ha indicado anteriormente que es un péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 28 a 32, o un dendrímero de las mismas.

La invención proporciona además un péptido específico de la angiogénesis tal como se ha indicado anteriormente que migra selectivamente a tejidos neovasculares desarrollados en tejidos cancerosos/tumorales, por ejemplo sarcoma o melanoma.

La invención todavía proporciona además una composición anticáncer y una composición de inhibidor de la metástasis cancerosa, cada uno de los cuales comprende, como ingrediente activo, por lo menos uno de los péptidos específicos de la angiogénesis anteriormente indicados, preferentemente por lo menos un péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 5, 6, 13, 16 y 28 a 32, o un dendrímero de las mismas, conjuntamente con un portador farmacéutico para las mismas.

La invención proporciona además una preparación de liposomas que comprende, como ingredientes activos, por lo menos uno de los péptidos específicos de la angiogénesis mencionados anteriormente, preferentemente por lo menos un péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 15 y 16, o un dendrímero de las mismas, y un agente anticáncer o inhibidor de la metástasis cancerosa, conjuntamente con un portador farmacéutico para los mismos.

La invención proporciona además una utilización de una cantidad efectiva de por lo menos uno de los péptidos específicos de la angiogénesis anteriormente indicados, para la preparación de un medicamento, una cantidad efectiva de por lo menos un péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 5, 6, 13 a 16 y 28 a 32, o por lo menos un dendrímero de las mismas, para el tratamiento de cáncer/tumores o para la inhibición de metástasis cancerosas.

La invención proporciona además una utilización de una preparación de liposomas que comprende, como ingredientes activos, por lo menos un péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 15 y 16, o por lo menos un dendrímero de las mismas, y un agente anticáncer o un inhibidor de la metástasis cancerosa, conjuntamente con un portador farmacéutico de las mismas, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de cáncer/tumores o a la inhibición de las metástasis.

En adelante, los aminoácidos, péptidos, secuencias de bases, nucleótidos y similares, en el caso de que se indiquen mediante símbolos, se indican según las recomendaciones de las IUPAC-IUB o el documento "Guideline for preparring specifications etc. containing nucleotide sequences or amino acid sequences" (editadas por la oficina de patentes japonesa) y los símbolos convencionales utilizados en el campo relevante de la técnica.

Son ejemplos específicos del péptido específico de la angiogénesis de la invención los que presentan las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 5 y 6, que se obtienen mediante los métodos mostrados en los ejemplos proporcionados a continuación en la presente memoria.

A continuación, se describe la identificación y la afinidad para tejidos neovasculares del péptido específico de la angiogénesis de la invención.

Para identificar el péptido específico de la angiogénesis de la invención, puede utilizarse una técnica de cribado de biblioteca molecular. Un ejemplo preferido de la biblioteca es una biblioteca de expresión fágica. Este tipo de biblioteca puede ser una biblioteca comercializada. El fago que expresa péptidos aleatorios en dicha biblioteca se utiliza para provocar la expresión de un gran número de péptidos, que pueden cribarse in vitro utilizando una molécula diana específica o célula objetivo, para identificar un péptido que se una específicamente a la molécula o célula diana. El cribado utilizando este tipo de biblioteca se utiliza para identificar ligandos o diversos anticuerpos que se unan específicamente a diversos receptores de superficie celular. Para el método de construcción de dicha biblioteca de expresión fágica y el método de cribado in vitro, se hace referencia al método de Scott y Smith (Scott J.M. y Smith G.P., Science 249:386-390, (1990); Smith G.P. y Scott J.K., Methods in Enzymology 217:228-257, (1993)).

Un método que resulta más preferido para utilizar en la identificación del péptido específico de la angiogénesis de la invención como molécula que puede migrar a tejidos neovasculares es, por ejemplo, el método de Ruoslahti et al., descrito en la patente JP nº Kohyo H10-502674 (correspondiente a la patente US nº 5.622.699), que identifica una molécula que migra a un órgano o tejido. El método identifica una molécula que migra específicamente a uno, dos o tres órganos seleccionados o tejidos utilizando el cribado in vivo para el cribado de una biblioteca de moléculas que potencialmente migran a un órgano u órganos y que puede llevarse a cabo de la manera siguiente.

De esta manera, en primer lugar se introducen ADN aleatorios en una biblioteca fágica conocida, y la mezcla diluida de la biblioteca fágica obtenida de esta manera se administra en la vena de cola de un ratón, por ejemplo. Uno a cuatro minutos después, el ratón se congela rápidamente en nitrógeno líquido. Para la recuperación de los fagos, se descongela el cadáver, se extirpa el órgano o tejido deseado y se homogeneiza en un medio de cultivo que contenga un inhibidor de proteasa y la preparación obtenida se lava varias veces con un medio de cultivo enfriado en hielo que contenga albúmina de suero bovino al 1% y se utiliza para infectar Escherichia coli. La bacteria Escherichia coli infectada por fagos se cultiva en un medio que contiene tetraciclina durante varias horas y después se utiliza para prerrecubrir una placa de ágar que contiene tetraciclina. Las colonias que contienen fagos recuperadas se cultivan en un medio apropiado y se aíslan y purifican los fagos. A continuación, se lleva a cabo los segundo y posteriores procedimientos de biocribado en fase sólida. Estos segundo y posteriores biocribados en fase sólida pueden llevarse a cabo de la misma manera que se ha indicado anteriormente, utilizando los fagos obtenidos de la manera indicada anteriormente. De esta manera, puede obtenerse un ADN codificante de un péptido expresado por un fago deseado y seleccionado. Mediante la secuenciación del ADN obtenido, puede identificarse la molécula que migra al órgano o tejido deseado.

La secuenciación del ADN puede llevarse a cabo fácilmente mediante un método bien conocido en la técnica, por ejemplo mediante el método dideoxi [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977] o mediante él método de Maxam-Gilbert (Methods in Enzymology 65:499, 1980). Esta determinación de la secuencia de bases también puede llevarse a cabo con facilidad utilizando un kit comercial de secuenciación o similar.

Como método para detectar la afinidad de una molécula que migra a un órgano o tejido, puede utilizarse, por ejemplo, el método siguiente. De esta manera, en el método anteriormente indicado para identificar una molécula que migre específicamente a un órgano o tejido, el fago que expresa el péptido específico de un órgano o tejido y el fago antes de la selección se administran en la vena de cola de animales experimentales y se realiza un recuento de las unidades formadoras de colonias que contienen fagos mediante el mismo método indicado anteriormente. Mediante la evaluación de la proporción entre el número de fagos acumulados y el número de fagos administrados en la vena de cola por cada 100 mg de órgano o tejido diana, por ejemplo, puede evaluarse la afinidad de la molécula que migra al órgano o tejido deseado.

Además, la especificidad de migración de un péptido puede confirmarse mediante el método competitivo, por ejemplo, mediante la selección de uno de los péptidos que migran al órgano o tejido diana, la síntesis de dicho péptido, la purificación del mismo mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y el examen de los efectos de varios fagos que presentan péptidos entre los que se encuentra un fago que expresa el mismo péptido que el péptido sintético anteriormente indicado y que migra al órgano o tejido diana, mediante la administración simultánea con el péptido sintético (ver la patente JP nº Kohyo H10-502674 y la patente US nº 6.522.699).

Los detalles de los métodos para identificar el péptido específico de la angiogénesis de la invención y para detectar la afinidad para tejidos neovasculares del mismo se proporcionan a continuación en la presente memoria, en los ejemplos. El péptido específico de la angiogénesis de la invención según se identifica mediante cribado in vivo en ratones tal como se muestra posteriormente en un ejemplo, puede unirse a los tejidos neovasculares de tumores sólidos en el ser humano o en otras especies de mamífero. El péptido de la invención que se une a una molécula diana presente en el tejido neovascular cultivado en ratones puede unirse a la molécula correspondiente en los tejidos neovasculares o tumores en el cuerpo humano o en el cuerpo de otros mamíferos. Además, el péptido de la invención puede unirse específicamente in vitro a una muestra obtenida de un paciente. A partir de estos hechos, puede confirmarse que el péptido de la invención presenta la capacidad de unirse a la molécula correspondiente en un paciente humano.

La vascularización en los tejidos cancerosos está caracterizada porque la formación de nuevos vasos sanguíneos que proporcionan soporte al crecimiento se produce continuamente; se distingue, de esta manera, de la vascularización histológica ordinaria (Folkman, Nat. Med. 1: 27-31, 1995; Rak, Anticancer Drugs 6: 3-18, 1995). Por lo tanto, el péptido de la invención que migra específicamente a tejidos neovasculares según se identifica mediante cribado in vivo puede utilizarse como factor inhibidor de la angiogénesis contra el cáncer.

Por otra parte, la probabilidad de que el péptido de la invención que migra específicamente a tejidos neovasculares produzca efectos adversos en órganos y tejidos sanos normales es muy baja.

Además, debido a que el péptido de la invención migra específicamente no a las células cancerosas sino al tejido neovascular, se considera que la probabilidad de que dichas células adquieran resistencia farmacológica, como es el caso de los agentes anticáncer, es reducida.

El péptido de la invención que migra específicamente a tejidos neovasculares puede utilizarse además para el reconocimiento de otros vasos sanguíneos nuevos, tales como los presentes en tejidos inflamatorios o regenerados o en tejidos dañados. Además, la neovascularización también se produce en tejidos uterinos, y el péptido de la invención se considera que pueda unirse a dichos tejidos uterinos y se espera que ejerza una influencia sobre enfermedades tales como el histeromioma.

El péptido de la invención según se ha identificado y establecido de la manera mencionada anteriormente incluye los péptidos especificados en las secuencias SEC ID nº 5 y 6, y todos ellos están caracterizados porque presentan la capacidad de migrar específicamente a tejidos neovasculares.

El péptido de la invención incluye péptidos que presentan una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 5 y 6, así como los péptidos que presentan una secuencia de aminoácidos mostrada en las secuencias SEC ID nº 13 a 16 y 28 a 32.

El grado y posición o posiciones de la "sustitución, deleción o adición" de uno o más aminoácidos no se encuentran restringidos, con la condición de que las proteínas modificadas sean equivalentes que presenten las mismas propiedades que los péptidos específicos de la angiogénesis, comprendiendo respectivamente las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 5 y 6. Aunque la modificación (mutación) de las secuencias de aminoácidos anteriormente indicadas o similares puede producirse naturalmente, por ejemplo tras la mutación o modificación postraduccional, también resulta posible la modificación artificial basada en el gen derivado naturalmente. La invención incluye todos los péptidos modificados según la reivindicación 1 que presentan las características anteriormente indicadas, con independencia de la causa o medio por el que se produce dicha modificación/mutación.

El péptido descrito en la presente memoria incluye además homólogos de los péptidos que presentan las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 5 y 6. Entre los homólogos se incluyen proteínas de mamífero, por ejemplo proteínas de origen humano, caballo, oveja, vaca, perro, mono, gato, oso o roedor (por ejemplo rata o conejo), que presentan las mismas actividades que los péptidos que presentan las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 5 y 6.

Son ejemplos de los péptidos indicados en la presente memoria que presentan secuencias de aminoácidos modificadas los péptidos que presentan secuencias que se han obtenido a partir de las secuencias mostradas en las secuencias SEC ID nº 5 y 6 mediante conservación de las secuencias parcialmente solapantes presentes en las mismas, por ejemplo Trp-Arg-Pro, mediante sustitución de un residuo o residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos restante por otro u otros residuos aminoácidos, mediante deleción de uno o más residuos aminoácidos o adición de algún otro u otros residuos aminoácidos.

Son ejemplos específicos del péptido de la invención que se ha obtenido mediante modificación parcial de una de las secuencias de aminoácidos, los péptidos que comprenden 8 residuos aminoácidos mostrados en las secuencias SEC ID nº 13 y 14, los péptidos que comprenden 5 residuos aminoácidos mostrados en las secuencias SEC ID nº 15 y 16, los péptidos que comprenden 4 residuos aminoácidos mostrados en las secuencias SEC ID nº 28 a 31, y el péptido que comprende 3 residuos aminoácidos (Trp-Arg-Pro) mostrado en la secuencia SEC ID nº 32.

El péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 13 se obtiene de la secuencia que comprende 15 residuos aminoácidos mostrada en SEC ID nº 5, mediante la conservación de 8 residuos aminoácidos del extremo N-terminal y la deleción de los 7 residuos aminoácidos restantes. El péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 14 presenta una secuencia de 8 residuos aminoácidos como resultado de la deleción de los 7 residuos aminoácidos del extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 6. El péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 15 presenta la secuencia entre el 2º y el 6º sexto residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 5. El péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 16 presenta la secuencia entre el noveno y el decimotercer residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 6.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "péptido específico de la angiogénesis" o "péptido de la invención" incluye péptidos que presentan una secuencia de aminoácidos modificada que se ha obtenido a partir de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriormente indicadas que se muestran en las secuencias SEC ID nº 5 y 6 a modo de estándares, según la reivindicación 1.

El péptido específico de la angiogénesis de la invención incluye péptidos que presentan una de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID nº 5 y 6, péptidos cuya secuencia de aminoácidos se deriva de dichas secuencias de aminoácidos mediante modificación y que presenta la propiedad de migrar específicamente a tejidos neovasculares, y además dendrímeros de dichos péptidos, según la reivindicación 1.

El término "dendrímero" se utiliza en la presente memoria para referirse a un péptido que se conoce como macromolécula que presenta una composición específica, un peso molecular específico y una estructura esférica o tridimensional y que también se conoce como péptido antigénico múltiple (MAP). La síntesis de dicho péptido puede llevarse a cabo, por ejemplo, partiendo de una estructura química nuclear que presenta una pluralidad de grupos funcionales, causando la unión de una rama (unidad repetitiva) que terminalmente presenta una pluralidad de grupos funcionales iguales a los de la estructura química nuclear, a cada grupo funcional del núcleo y además introduciendo la misma unidad repetitiva, una a una, en los grupos funcionales terminales. Se proporcionan los detalles en, por ejemplo, las patentes JP nº Kohyo S60-500295, nº Kokai S63-99233, nº Kokai H03-263431, US nº 4.507.466, US nº 4.568.737, Polymer Journal 17: página 117, 1985; Tomalia et al., Angewandte Chem. Int. Engl. vol. 29: páginas 138-175, 1990, y Macromolecules 25: página 3247, 1992.

Los dendrímeros tal como se ha indicado anteriormente comprenden un grupo nuclear que actúa como núcleo de partida para una apariencia esférica que presenta una configuración ramificada o de estrella, capas internas (generaciones de ramificaciones) constituidas por unidades repetitivas que se extienden radialmente hacia el exterior a partir del núcleo de partida, y una superficie externa que comprende grupos funcionales activados unidos a los extremos más exteriores respectivos de las generaciones o ramas respectivas. El tamaño, forma y reactividad de un dendrímero puede ajustarse mediante la selección del grupo nuclear de partida, la generación del dendrímero y la composición y estructura de la unidad repetitiva que se utiliza para cada generación.

Pueden obtenerse dendrímeros de diferente tamaño mediante el incremento de las generaciones utilizadas y, para su producción, puede hacerse referencia a la patente US nº 4.694.064, por ejemplo.

Entre los dendrímeros típicos se incluyen, por ejemplo, dendrímeros que comprenden un átomo de nitrógeno como el grupo nuclear, que actúa como el núcleo de partida, unidades repetitivas que presentan la estructura -CH_{2}CH_{2}CONHCH_{2}CH_{2}- unidas al núcleo, y grupos funcionales activados que se encuentran unidos a los grupos aminoterminales más exteriores de cada rama, los constituyentes de los cuales son los péptidos específicos de la angiogénesis de la invención mostrados en las secuencias SEC ID nº 5 y 6, y 13 a 16; los dendrímeros mostrados posteriormente en los ejemplos, que comprenden un aminoácido, tal como lisina, arginina, ácido glutámico o ácido aspártico como el grupo nuclear, los mismos aminoácidos indicados anteriormente como unidades repetitivas que se encuentran unidas directamente al grupo nuclear; y péptidos específicos de la angiogénesis de la invención que presentan una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 5, 6 y 13 a 16; o péptidos específicos de la angiogénesis de la invención que presentan una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 28 a 32 como grupos funcionales activados.

Pueden producirse dendrímeros con un péptido específico de la angiogénesis de la invención unido al extremo más exterior de cada rama mediante el método de síntesis en fase sólida descrito a continuación en la presente memoria, utilizando un dendrímero que presenta un átomo de nitrógeno que sirve como el grupo nuclear de partida, comercializado por, por ejemplo, Polysciences Inc., 400 Vally Road, Warrington, PA, 18976, U.S.A. De manera similar, pueden producirse dendrímeros que comprenden péptidos específicos de la angiogénesis de la invención unidos al extremo más exterior de cada rama mediante el método de síntesis en fase sólida descrito posteriormente en la presente memoria, utilizando lisina como el grupo nuclear que actúa como sitio de partida, y el mismo aminoácido lisina como unidad repetitiva unida directamente al grupo nuclear. Durante la producción del dendrímero puede utilizarse una resina Fmoc_{6}-Lys_{4}-Lys_{2}-Lys-\beta-Ala-Alko, producida por Watanabe Kagaku Kogyo. En el procedimiento anterior, también resulta posible producir dendrímeros que contienen constituyentes que presentan actividad anticáncer en sustitución de parte de los péptidos específicos de la angiogénesis de la invención unidos al extremo más exterior de cada rama o unidos al grupo nuclear.

Por ejemplo, puede sintetizarse cada uno de los dendrímeros mencionados anteriormente de la manera siguiente. De esta manera, pueden obtenerse dendrímeros mediante la condensación de una resina para la síntesis peptídica en fase sólida, mediante un espaciador o sin ningún espaciador, con un \alpha,\omega-aminoácido como unidad repetitiva, en el que dos grupos amino se encuentran protegidos con el mismo grupo protector o con diferentes grupos protectores, seguido de la desprotección y por repeticiones de la condensación de la unidad repetitiva, seguida cada vez de la desprotección.

Como resina para la síntesis de péptidos en fase sólida pueden utilizarse resinas utilizadas generalmente en la síntesis de péptidos, tales como poliestireno, poliacrilamida, poliestireno-polietilenglicol y resinas similares. Estas resinas se utilizan con grupos terminalmente adicionales de un clorometilo, 4-(hidroximetil)fenoxi, 4-((\alpha-2',4'-dimetoxifenil)-9-fluorenilmetoxicarbonilaminometil)fenoxi o similar.

Como espaciador, puede utilizarse un aminoácido o una pluralidad de aminoácidos. Son ejemplos de los \alpha,\omega-aminoácidos: lisina, ornitina, ácido 1,4-diaminobutírico, ácido 1,3-diaminopropiónico y similares. Entre los grupos protectores se incluyen un grupo Boc, un grupo Fmoc, un grupo Z y similares. Por lo tanto, los grupos funcionales son un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxi y similares. Al repetir n veces el procedimiento que comprende la condensación y desprotección de unidades repetitivas, se obtienen 2n ramas. El número específico de ramas es de 2 a 16.

Dichos dendrímeros pueden purificarse mediante técnicas ordinarias, por ejemplo mediante un procedimiento cromatográfico utilizando una resina capaz de excluir tamaños, por ejemplo en una forma matricial tal como Sephacryl S-300 (producto de Pharmacia).

El péptido dendrímero así obtenido migra selectivamente a los tejidos neovasculares en virtud de la presencia del péptido específico de la angiogénesis de la invención en los grupos situados en las ramas y produce un efecto inhibidor de la angiogénesis, de manera que pueden producirse los efectos deseados anticáncer y de prevención de las metástasis cancerosas. En el caso de que se administre conjuntamente con un agente que presenta actividad anticáncer conocida rellenado en su interior, el péptido dendrímero puede permitir que el agente actúe sobre el sitio angiogénico diana solo, por lo tanto resultando ventajoso en el aspecto de que reduce la capacidad del agente anticáncer de provocar efectos secundarios.

El péptido específico de la angiogénesis presente en los grupos de las ramas del péptido dendrímero mencionado anteriormente no siempre es un péptido ni el mismo péptido para cada rama, sino que puede incluir una pluralidad de péptidos de diferente secuencia de aminoácidos. A título de ejemplo, puede mencionarse la unión combinada a diferentes grupos de rama, de dos o más de los péptidos, que presentan, respectivamente, las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 5 y 6, o de dos o más de los péptidos, que presentan, respectivamente, las secuencias de 15 aminoácidos mostradas en SEC ID nº 5 y 6, presentando los péptidos, respectivamente, las secuencias de 8 aminoácidos mostradas en la secuencia SEC ID nº 13, presentando los péptidos, respectivamente, las secuencias de 5 aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 15 y 16, presentando los péptidos, respectivamente, las secuencias de 4 aminoácidos mostradas en SEC ID nº 28 a 31, y presentando el péptido la secuencia de 3 aminoácidos mostrada en SEC ID nº 32. Estos dendrímeros pueden mostrar una estabilidad mejorada de la diana de administración en sangre y en los tejidos, una actividad específica mejorada de cada molécula unida y similares.

El péptido específico de la angiogénesis de la invención puede sintetizarse mediante un método de síntesis química común basado en la secuencia de aminoácidos del mismo. Dicho método incluye métodos de fase líquida y de fase sólida de síntesis de péptido. Con mayor detalle, entre dichos métodos de síntesis de péptidos se incluyen la técnica de elongación en etapas, que lleva a cabo la extensión de la cadena utilizando los aminoácidos uno a uno basándose en la información de la secuencia de aminoácidos, y la técnica de condensación de fragmentos, que comprende sintetizar fragmentos compuestos de varios aminoácidos previamente y después acoplar entre sí los fragmentos. Cualquiera de las técnicas puede utilizarse para sintetizar el péptido específico de la angiogénesis de la invención.

El método de condensación para la utilización en la síntesis de péptidos anteriormente indicada puede ser cualquiera de entre diversos métodos conocidos. Son ejemplos específicos el método de la azida, el método del anhídrido de ácido mixto, el método del DCC, el método del éster activado, el método de oxidación/reducción, el método de la DPPA (azida de difenilfosforilo), el método del DCC + aditivo (1-hidroxibenzotriazol, N-hidroxisuccinimida, N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida o similar) y el método de Woodward. El solvente que debe utilizarse en cada uno de dichos métodos puede seleccionarse adecuadamente de entre los solventes ordinarios que es bien conocido que resultan útiles en este tipo de reacción de condensación de péptidos. Entre los ejemplos de los solventes se incluyen N-metilpirrolidona (NMP), dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), hexametilfosforamida, dioxano, tetrahidrofurano (THF), acetato de etilo, etc., y mezclas de los mismos.

En la reacción de síntesis de péptidos, el grupo carboxilo de un aminoácido o péptido no implicado en la reacción puede protegerse generalmente mediante esterificación, por ejemplo en forma de éster de alquilo inferior, tal como éster de metilo, éster de etilo o éster de terc-butilo, de éster de aralquilo, tal como éster de bencilo, éster de p-metoxibencilo o éster de p-nitrobencilo, o similar. Respecto a los aminoácidos que presentan un grupo funcional en la cadena lateral, el grupo hidroxilo de la Tyr, por ejemplo, puede protegerse con un grupo acetilo, bencilo, benciloxicarbonilo, terc-butilo o similar; sin embargo, este tipo de protección no resulta necesaria en todos los casos. Además, el grupo guanidino de la Arg, por ejemplo, puede protegerse con un grupo protector apropiado, tal como nitro, tosilo, 2-metoxibencen-sulfonilo, metilén-2-sulfonilo, benciloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo o adamantiloxicarbonilo. La reacción de eliminación de dichos grupos protectores en los aminoácidos, en los péptidos y en el producto final que es el péptido específico de la angiogénesis de la invención, que presenta dichos grupos protectores, puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales, por ejemplo mediante reducción catalítica o utilizando amoníaco líquido/sodio, fluoruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno, cloruro de hidrógeno, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, ácido metansulfónico o similar.

El péptido específico de la angiogénesis de la invención obtenido de esta manera puede purificarse apropiadamente mediante métodos utilizados generalmente en el campo de la química de los péptidos, por ejemplo con resinas de intercambio iónico, cromatografía de partición, cromatografía en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), distribución a contracorriente o similar.

Los péptidos específicos de la angiogénesis de la invención obtenibles de la manera anteriormente indicada (en adelante incluyendo los dendrímeros de los mismos) presentan la capacidad de migrar específicamente a tejidos neovasculares y resultan útiles ellos mismos como inhibidores de la angiogénesis. Además, los péptidos específicos de la angiogénesis de la invención presentan la capacidad de migrar específicamente a tejidos neovasculares de tejidos cancerosos y por lo tanto pueden utilizarse como ligandos de tejidos cancerosos, por ejemplo en combinación con agentes anticáncer, tales como agentes quimioterapéuticos del cáncer, unidos a los mismos.

Entre los ejemplos de diversas enfermedades cancerosas/tumorales diana se incluyen: melanoma, carcinoma de colon y recto, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer mamario, tumor cerebral, cáncer renal, cáncer pancreático, cáncer de cérvix, cáncer esofágico, cáncer pulmonar, cáncer gástrico y similares.

Como agentes anticáncer o componentes que presentan actividad anticáncer que pueden utilizarse como agentes en combinación con los péptidos específicos de la angiogénesis de la invención, se proporcionan a título de ejemplo los diversos agentes quimioterapéuticos del cáncer siguientes, incluyendo el 5-fluorouracilo (5-FU). De esta manera, pueden mencionarse agentes alquilantes tales como ciclofosfamida, melfalán, ranimustina, ifosfamida, hidrocloruro de N-óxido de mostaza nitrogenada, etc.; antagonistas metabólicos tales como 6-mercaptopurina, ribósidos, enocitabina, carmofur, citarabina, ocfosfato de citarabina, tegafur, 5-FU, doxifluoridina, doxifluridina, hidroxicarbamida, fluorouracilo, metotrexato, mercaptopurina, etc.; antibióticos antitumorales tales como actinomicina D, hidrocloruro de aclarubicina, hidrocloruro de idarubicina, hidrocloruro de epirubicina, hidrocloruro de doxorubicina, hidrocloruro de daunorubicina, hidrocloruro de pirarubicina, hidrocloruro de bleomicina, zinostatina estimalámero, sulfato de bleomicina, mitomicina C, neocarzinostatina, sulfato de peplomicina, etc.; preparaciones botánicas antitumorales tales como etopósido, hidrocloruro de irinotecán, hidrato de docetaxel, sulfato de vincristina, sulfato de vindesina, sulfato de vinblastina, paclitaxel, etc., y además, aceglatona, ubenimex, cisplatino, sizofirán, sobuzoxano, crestina, citrato de toremifeno, acetato de medroxi-progesterona, citrato de tamoxifeno, carboplatino, hidrato de hidrocloruro de fadrozol, hidrocloruro de procarbazina, hidrocloruro de mitoxantrona, L-asparaginasa, tretinoína, nedaplatino, picibanilo, flutamida, pentostatina, porfímero sódico, lentinano, etc.

Son ejemplos de citoquinas que presentan actividad antitumoral: IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\gamma, IL-1, IL-2, IL-12, TNF, TGF-\beta, angiostatina, trombospondina, endostatina, etc. Son ejemplos de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra factores implicados en el crecimiento e inducción del cáncer, tales como el anticuerpo anti-VEGF, el anticuerpo anti-FGF, el anticuerpo anti-HGF I y el anticuerpo anti-L-8.

De esta manera, el péptido específico de la angiogénesis de la invención puede utilizarse para producir preparaciones de DDS, por ejemplo mediante acoplamiento o modificación de un agente activo, tal como un agente antineoplásico o una citoquina que presenta actividad anticáncer, con DDS e incluyendo el producto en una preparación de liposomas, y dicha preparación puede utilizarse en el direccionamiento activo hacia el cáncer.

En el caso de que el péptido específico de la angiogénesis de la invención deba acoplarse con una proteína, por ejemplo una citoquina, que presenta actividad anticáncer, puede provocarse que el producto acoplante se exprese en forma de una proteína fusionada compuesta del péptido de la invención y la citoquina o similar mediante la utilización de tecnología de ADN recombinante. La producción y expresión de dicha proteína fusionada puede realizarse mediante la tecnología convencional de la técnica. De esta manera, la proteína fusionada puede prepararse mediante tecnología ordinaria de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Science 224: 1431, 1984; Biochem. Biophys. Res. Comm. 130: 692, 1985; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 5990, 1983). Para la producción y expresión de dicha proteína fusionada puede hacerse referencia al método de Ohno et al., "Tanpaku Jikken Purotokoru 1 Kino Kaiseki Hen, Saibokogaku Bessatsu, Jikken Purotokoru Sirizu ("Protein Experiment Protocols Book 1, Function Analyses", suplemento de Cell Engineering, Experiment Protocols Series), 1997, Shujunsha".

La proteína fusionada recombinante obtenida puede aislarse y purificarse, si se desea, mediante cualquiera de entre diversos procedimientos de separación utilizando las propiedades físicas, químicas y otras propiedades de la misma [ver, por ejemplo, "Seikagaku Deta Bukku II (Biochemistry Data Book II)", páginas 1175-1259, 1ª edición, 1ª impresión, publicado el 23 de junio de 1980 por Tokyo Kagaku Dojin; Biochemistry 25 (25): 8274-8277, 1986; Eur. J. Biochem. 163: 313-321, 1987)]. Entre dichos métodos se incluye específicamente, por ejemplo, el tratamiento ordinario de reconstitución, el tratamiento con un agente precipitador de proteínas (purificación salina), la centrifugación, el procedimiento de choque osmótico, la rotura ultrasónica, la ultrafiltración, la cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), la cromatografía de adsorción, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad, la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), otras diversas técnicas de cromatografía líquida, la diálisis y combinaciones de las mismas. Resulta particularmente preferido de entre los métodos anteriormente indicados la cromatografía de afinidad utilizando una columna con la proteína deseada unida a la misma.

En el caso de que deba utilizarse el péptido específico de la angiogénesis de la invención como ligando mediante acoplamiento del mismo con una sustancia física, química o biológica, ésta puede ser un sistema de administración de fármaco, tal como un microdispositivo que presente células capaces de contener el agente quimioterapéutico del cáncer anteriormente indicado (por ejemplo un agente anticáncer). Entre los ejemplos de estas sustancias de sistema de administración farmacológica se incluyen liposomas, microcápsulas que presentan una membrana permeable o semipermeable, otros microdispositivos que presenten células y sustancias biológicas similares. Estas sustancias generalmente son no tóxicas y preferentemente biodegradables.

El método de acoplamiento de una de las diversas sustancias anteriormente indicadas de sistema de administración farmacológica capaces de contener un agente tal como un agente anticáncer con el péptido de la invención es bien conocido del campo de la técnica relevante. Específicamente, el acoplamiento se lleva a cabo mediante el método de Harlow o de Hermanson (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996).

A continuación se describe en detalle una preparación de liposomas, a título de ejemplo típico de la preparación resultante del acoplamiento de la sustancia anteriormente indicada del sistema de administración farmacológica con el péptido de la invención.

La preparación de liposomas se obtiene provocando que los liposomas, que comprenden un fosfolípido ácido como constituyente membranal o un fosfolípido neutro y un fosfolípido ácido como constituyentes membranales, alojen el péptido de la invención.

El fosfolípido ácido como constituyente membranal se define más exactamente que los fosfolípidos ácidos ordinarios e incluye específicamente los fosfatidilgliceroles (PG) naturales o sintéticos, tales como dilauroilfosfatidilglicerol (DLPG), diamiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG), dioleilfosfatidilglicerol (DOPG), fosfatidilglicerol de yema de huevo (PG de yema de huevo) y fosfatidilglicerol de yema de huevo hidrogenado, así como fosfoatidilinositoles (PI) naturales o sintéticos, tales como dilauroilfosfatidilinositol (DLPI), dimiristoilfosfatidilinositol (DMPI), dipalmitoilfosfatidilinositol (DPPI), diestearoilfosfatidilinositol (DSPI), dioleoilfosfatidilinositol (DOPI), fosfatidilinositol de soja (PI de soja) y fosfatidilinositol de soja hidrogenado. Estos pueden utilizarse individualmente o pueden utilizarse en mezclas de dos o más.

Son ejemplos del fosfolípido neutro: fosfatidilcolinas (PC) naturales o sintéticas, tales como fosfatidilcolina de soja, fosfatidilcolina de yema de huevo, fosfatidilcolina de soja hidrogenada, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dilauroilfosfatidilcolina (DLPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), miristoilpalmitoilfosfatidilcolina (MPPC), palmitoilestearoilfosfatidilcolina (PSPC) y dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), fosfatidiletanolaminas (PE) naturales o sintéticas, fosfatidiletanolamina de yema de huevo, fosfatidiletanolamina de soja hidrogenada, fosfatidiletanolamina de yema de huevo hidrogenada, dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dilauroilfosfatidiletanolamina (DLPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), miristoilpalmitoilfosfatidiletanolamina (MPPE), palmitoilestearoilfosfatidiletanolamina (PSPE), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) y similares. Estos pueden utilizarse individualmente o pueden utilizarse en mezclas de dos o más de los mismos.

La membrana liposómica indicada anteriormente se forma mediante un método convencional utilizando el fosfolípido ácido anteriormente indicado como constituyente individual o los fosfolípidos neutros y ácidos anteriormente indicados en combinación. Es recomendable que el fosfolípido ácido se utilice en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 100 por ciento molar, preferentemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 90 por ciento molar, más preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 por ciento molar, basado en los constituyentes de la membrana liposómica.

Durante la preparación de los liposomas anteriormente indicados, puede añadirse adicionalmente colesterol y/o similar. En el caso de que se añade colesterol, puede ajustarse la fluidez de los fosfolípidos, de manera que pueden prepararse liposomas más rápidamente. Generalmente, dicho colesterol se añade y se incorpora en una cantidad de, como máximo, la cantidad de fosfolípidos, preferentemente en una cantidad de la mitad de la cantidad de los mismos.

Las proporciones de ingrediente activo y fosfolípido ácido en una dispersión de liposomas es recomendable que sean que el fosfolípido ácido constituye entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 100 equivalentes, preferentemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 60 equivalentes, más preferentemente entre aproximadamente 1,5 y aproximadamente 20 equivalentes, respecto al ingrediente activo.

La cantidad del péptido que debe utilizarse en la modificación del péptido según la invención en el lípido completo, expresado en porcentaje molar, puede ser de entre varios y pocos puntos porcentuales molares, preferentemente de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 por ciento molar, generalmente de aproximadamente 5 por ciento molar. En el caso de que el péptido de la invención mismo presente actividad anticáncer, tal como se muestra posteriormente en la presente memoria, en el Ejemplo 4, la cantidad puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 por ciento molar. Para un agente anticáncer soluble en agua o una sustancia soluble en agua que presente actividad anticáncer, que se encuentre incluida en la fase acuosa dentro de los liposomas, se incluye con una eficiencia de entre 10% y 90%. Por el contrario, puede incluirse un agente anticáncer liposoluble o una sustancia liposoluble que presente actividad anticáncer con una elevada eficiencia de inclusión, próxima a 100%, en el caso de que el componente deseado se incluya dentro de la membrana liposómica.

A continuación se describe el método para producir los liposomas anteriormente indicados. Durante la producción de dichos liposomas, pueden utilizarse diversos métodos conocidos. Por ejemplo, el constituyente de la membrana liposómica se disuelve en un solvente orgánico, tal como cloroformo, después se elimina por destilación el solvente bajo presión reducida para causar la formación de una película lipídica, se añade a la misma una fase acuosa con el agente disuelto en la misma, seguido del calentamiento hasta una temperatura superior a la temperatura de transición de fases del lípido y además se aplica un tratamiento de vórtice, homogeneización o tratamiento similar, de manera que se prepara una dispersión de liposomas. También resulta posible preparar una dispersión de liposomas mediante calentamiento de un constituyente pulverulento de membranas liposómicas hasta una temperatura superior a la temperatura de transición de fases y mezclar la misma con una solución acuosa del agente bajo agitación. La solución acuosa de agente que debe añadirse puede ser cualquiera, con la condición de que el agente siga disuelto en la misma y el nivel de adición de la solución acuosa de agente también puede incrementarse o reducirse arbitrariamente.

En caso necesario, puede controlarse mediante ultrafiltración la distribución de tamaños de las partículas de la dispersión de liposomas obtenida de esta manera, por ejemplo mediante la utilización de un filtro de membrana de policarbonato. También resulta posible concentrar la dispersión utilizando una membrana de diálisis.

En la dispersión de liposomas, puede incorporarse, como aditivo o aditivos necesarios desde el punto de vista del diseño de la preparación, una o más de entre diversas sustancias, tales como conservantes, agentes isotónicos, tampones, estabilizadores, solubilizadores y estimuladores de la absorción, o la dispersión de liposomas puede diluirse con una solución que contenga los mismos o agua, en caso necesario. Son ejemplos específicos de los aditivos anteriormente indicados, conservantes tales como cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorhexidina, parabenes (por ejemplo metilparabén, etilparabén), timerosal y conservantes similares que resulten efectivos contra hongos y bacterias; agentes isotónicos tales como D-manitol, D-sorbitol, D-xilitol, glicerol, glucosa, manetosa, sacarosa, propilenglicol, alcoholes polihídricos, cloruro sódico y otros electrolitos; estabilizadores tales como tocoferol, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido etilendiamintetraacético (EDTA) y cisteína, y similares.

Posteriormente se proporcionan ejemplos específicos de la dispersión de liposomas, en los Ejemplos 5, 7 y 8.

Además, el péptido específico de la angiogénesis de la invención puede utilizarse como agente diagnóstico del cáncer o similar mediante la utilización de su capacidad de migrar específicamente a tejidos neovasculares del cáncer mediante el acoplamiento con el mismo de un compuesto radioactivo, sustancia fluorescente, enzima, biotina, agente de contraste, etc., y llevando a cabo el direccionamiento activo hacia el cáncer.

Además, el péptido específico de la angiogénesis de la invención puede utilizarse en el direccionamiento activo hacia el cáncer en forma de una composición farmacéutica que comprende, conjuntamente con un agente anticáncer o una citoquina que presenta actividad anticáncer, liposomas o una emulsión lipídica que contiene dicho péptido en una forma unida a un ácido graso (por ejemplo ácido behénico, ácido esteárico, ácido palmítico, ácido mirístico o ácido oleico), un grupo alquilo, un grupo colesterilo o similar. Los detalles de la producción de preparaciones de liposomas, tales como las indicadas anteriormente se describen, por ejemplo, en la referencia de Woodle et al. (Long Circulating Liposomes: Old drugs, New therapeutics, M.C. Woodle, G. Storm, editores, Springer-Verlag, Berlin, 1998). Los detalles de la producción de composiciones farmacéuticas que contienen una emulsión lipídica tal como se la indicada anteriormente, conjuntamente con un agente anticáncer o una citoquina que presente actividad anticáncer, se proporcionan en la referencia de Namba et al. (Liposomal applications to cancer therapy, Y. Namba, N. Oku, J. Bioact. Compat. Polymers 8: 158-177, 1993).

El péptido específico de la angiogénesis de la invención también puede utilizarse en el diagnóstico del cáncer mediante la unión al mismo de diversos ácidos grasos, grupos alquilo, grupo colesterilo y similares, y uniendo el producto a liposomas o a una emulsión lipídica que contiene los mismos y acoplándolos además con un compuesto radioactivo o con un agente de contraste con el fin de detectar el cáncer y llevar a cabo un direccionamiento activo hacia el cáncer utilizando el producto resultante. De esta manera, el péptido puede servir como agente diagnóstico del cáncer, verificando la presencia del mismo. La utilización de dicho agente diagnóstico resulta ventajosa particularmente en el aspecto de que tumores y lesiones metastásicas en estadio inicial, que podrían no detectarse mediante otros métodos, pueden identificarse. Por lo tanto, también se describe un método de diagnóstico del cáncer, en particular un método diagnóstico para identificar cáncer y lesiones metastásicas en estadio inicial.

Tras establecer de esta manera la presencia del cáncer, se hace posible, según otro aspecto de la presente invención, acoplar el péptido específico de la angiogénesis con un agente anticáncer, por ejemplo un agente quimioterapéutico del cáncer, o con un microdispositivo que contiene un agente quimioterapéutico del cáncer o algún otro factor anticáncer para de esta manera provocar que el agente migre al cáncer; de esta manera, se hace posible llevar a cabo el direccionamiento activo deseado, es decir eliminar selectivamente el cáncer o las células cancerosas, reduciendo simultáneamente el efecto sobre los tejidos o células normales. En este aspecto, también se describe un método para el tratamiento de cáncer o de metástasis cancerosas y la inhibición de metástasis cancerosas.

El inhibidor de la angiogénesis o composición para el tratamiento del cáncer de la invención puede administrarse en los pacientes en forma de una composición de preparación que contiene, como ingrediente activo, el péptido específico de la angiogénesis o una composición del mismo con otro agente anticáncer o similar, conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable.

El portador farmacéuticamente aceptable que debe utilizarse puede seleccionarse convenientemente de entre los bien conocidos en la técnica, dependiendo de la forma de la composición de preparación que debe prepararse. Por ejemplo, en el caso de que la composición deba prepararse en forma de una solución acuosa, puede utilizarse agua o una solución de tampón fisiológico como el portador. En el caso de que la composición deba prepararse en forma de una solución apropiada, puede utilizarse como el portador glicol, glicerol, aceite de oliva o un éster orgánico inyectable similar.

Además, en los casos en los que deba utilizarse el compuesto anteriormente indicado como el ingrediente activo, puede utilizarse un compuesto que sirva, por ejemplo, para estabilizar o para incrementar la absorción del compuesto. Entre este tipo de compuestos se incluyen carbohidratos tales como glucosa, sacarosa y dextrano; antioxidantes, tales como ácido ascórbico y glutatión; agentes quelantes; y estabilizadores y excipientes, tales como proteínas de bajo peso molecular y albúmina.

El contenido de ingrediente activo en el inhibidor de la angiogénesis o en la composición (preparación) terapéutica del cáncer de la invención no se encuentra particularmente limitado, sino que puede seleccionarse de entre un amplio intervalo. En el caso de que el péptido específico de la angiogénesis de la invención se utilice individualmente como el ingrediente activo, resulta generalmente deseable que el contenido del mismo en la preparación se seleccione de entre el intervalo comprendido entre aproximadamente 0,00001% y aproximadamente 70% en peso, preferentemente de entre aproximadamente 0,0001% y aproximadamente 5% en peso. La dosis de la preparación anteriormente indicada tampoco se encuentra particularmente limitada, aunque puede seleccionarse de entre un amplio intervalo según el efecto terapéutico deseado, método de administración (vía de administración), periodo de tratamiento, edad y sexo del paciente y otras condiciones, entre otros. Generalmente, la dosis se selecciona juiciosamente de entre el intervalo comprendido entre aproximadamente 0,01 \mug y aproximadamente 10 mg, preferentemente de entre aproximadamente 0,1 \mug y aproximadamente 1 mg, por kilogramo de peso corporal del paciente por día. La preparación puede administrarse una vez al día o en varias dosis divididas al día.

La dosis del inhibidor de la angiogénesis o la composición de tratamiento del cáncer de la invención que se prepara mediante la utilización del péptido específico de la angiogénesis de la invención acoplado con un agente anticáncer y/o con un inhibidor de la metástasis cancerosas puede determinarse convenientemente dependiendo de la cantidad del agente quimioterapéutico del cáncer requerida para producir el efecto anticáncer deseado, por ejemplo. En el caso de que se utilice, por ejemplo, 5-fluorouracilo (5-FU), que se utiliza generalmente como un agente activo anticáncer en aplicaciones clínicas de este tipo, dicho 5-FU se administra generalmente a una dosis diaria de entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg. El experto en la materia podrá entender fácilmente que la dosis del péptido específico de la angiogénesis de la invención que se utiliza en una forma ligada resultará evidente por sí misma y que dicha dosis puede considerarse la dosis efectiva del péptido de la invención. Además, considerando que la composición farmacéutica de la invención se caracteriza por la capacidad de migrar específicamente a tejidos neovasculares del cáncer, se prevé que, incluso en el caso de que la dosis del agente quimioterapéutico del cáncer sea considerablemente baja en comparación con la dosis clínica en el uso convencional, se producirán efectos
notables.

Tal como se ha indicado anteriormente, el polipéptido específico de la angiogénesis de la invención puede unirse a un compuesto radioactivo, a un medio de contraste o similar para la obtención de imágenes del cáncer, para proporcionar un agente diagnóstico, y pueda llevarse a cabo el direccionamiento activo hacia el cáncer utilizando dicho agente. El polipéptido específico de la angiogénesis de la invención también puede utilizarse para detectar la presencia de angiogénesis en células, tejidos, órganos o partes de los mismos aislados a partir del cuerpo humano. Mediante esta utilización puede detectarse la presencia de cáncer en una muestra aislada a partir del cuerpo humano, como resultado del hecho de que los tejidos neovasculares son tejidos formados por el cáncer. La muestra humana anteriormente indicada puede ser una sección o muestra de tejido obtenida mediante biopsia, o una población celular existente en un cultivo de tejido o adaptada al mismo. La muestra humana puede ser una muestra tratada mediante homogeneización, y esta es la opción preferida.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico de columnas que muestra los resultados de un experimento de inhibición competitiva llevado a cabo en el Ejemplo 3 (3) utilizando los fagos y péptidos sintéticos de 8 residuos especificados en el mismo.

La figura 2 es un gráfico de columnas que muestra los resultados de un experimento de inhibición competitiva llevado a cabo en el Ejemplo 3 (3) utilizando los fagos y los péptidos sintéticos de 5 residuos especificados en el mismo.

La figura 3 es una representación gráfica de los efectos de inhibición de la angiogénesis de los péptidos dendrímeros representados en el Ejemplo 4 (2).

La figura 4 es una representación gráfica de las distribuciones in vivo de las soluciones de liposomas en ratones portadores tumorales representados en el Ejemplo 5 (2).

La figura 5 es una representación gráfica de los efectos de inhibición del crecimiento tumoral de los péptidos dendrímeros representados en el Ejemplo 6 (1).

La figura 6 es una representación gráfica de los efectos de inhibición del crecimiento tumoral de los péptidos de la invención representados en el Ejemplo 6 (2).

La figura 7 es una representación gráfica de los efectos de inhibición del crecimiento tumoral de los péptidos de la invención representados en el Ejemplo 6 (3).

La figura 8 es una representación gráfica de los efectos de inhibición del crecimiento tumoral de los péptidos de la invención representados en el Ejemplo 6 (4).

La figura 9 es una representación gráfica de los efectos de inhibición del crecimiento tumoral de los péptidos de la invención representados en el Ejemplo 6 (5).

Cada una de las figuras 10 y 11 es una representación gráfica de los efectos de inhibición del crecimiento tumoral de los péptidos de la invención representados en el Ejemplo 6 (6).

La figura 12 es una representación gráfica de los efectos de inhibición del crecimiento tumoral de los liposomas modificados con los péptidos de la invención representados en el Ejemplo 7 (1).

La figura 13 es una representación gráfica de las afinidades de los liposomas modificados con los péptidos de la invención representados en el Ejemplo 7 (2) para los tejidos tumorales.

La figura 14 es una representación gráfica de las estabilidades en sangre de los liposomas modificados con los péptidos de la invención representados en el Ejemplo 7 (3).

La figura 15 es una representación gráfica de los efectos de inhibición del crecimiento tumoral de los liposomas que contienen el péptido específico de la angiogénesis de la invención y un agente anticáncer como ingredientes activos según el Ejemplo 8.

\vskip1.000000\baselineskip

Mejores modos de poner en práctica la invención

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar la presente invención con mayor detalle. Sin embargo, en modo alguno son limitativos del alcance de la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Identificación de péptidos específicos de la angiogénesis (1) Preparación de una biblioteca de expresión fágica

Se construyó la biblioteca de expresión fágica deseada, capaz de expresar péptidos aleatorios de secuencia de 15 residuos aminoácidos sobre la superficie de la cubierta fágica, mediante la inserción de ADN aleatorios codificantes de péptidos de 15 residuos que presentaban secuencias aleatorias de aminoácidos en el gen de la proteína pIII de la cubierta fágica, según han informado Nishi, Saya et al. (Nishi T., Saya H. et al., FEBS Lett. 399:237-240,
1996).

Scott et al. informaron de las rasgos característicos de la biblioteca de expresión fágica construida de la manera anteriormente indicada (Scott J.K. y Smith G.P., Science 249:386-390, 1990).

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Angiogénesis

Se utilizó el método del anillo con cámara (Folkman J. et al., J. Exp. Med. 133: 275-288, 1971) para inducir tejidos neovasculares tumorales in vivo para que sirviesen como dianas de los fagos que expresaban péptidos específicos de la angiogénesis.

El método del anillo con cámara es una de las técnicas establecidas para inducir tejidos neovasculares tumorales in vivo. Comprende incluir las células tumorales en un anillo e implantarlo subcutáneamente en un animal para inducir de esta manera tejidos neovasculares dérmicos. Los filtros del anillo presentan propiedades por las que no permiten la permeación de las células, aunque permiten la permeación de factores humorales únicamente. Por lo tanto, mediante dicha técnica resulta posible inducir la angiogénesis sin causar metástasis cancerosa a tejidos del animal y sin provocar que los inmunocitos dañen las células de cáncer.

La técnica se describe en detalle a continuación. En primer lugar, se inyectaron 0,18 ml de una suspensión de células de melanoma B16BL6 (obtenidas del Dr. G.L. Nicolson (Institute for Molecular Medicine, Irvine, CA; ver, por ejemplo, Cancer Res. 57:3612-3619, 1997; FEBS Lett. 427:296-290, 1998) (1x10^{7} células/0,18 ml) en cada anillo (diámetro exterior: 14 mm, diámetro interior: 10 mm, altura: 2 mm, anillo PR0001401 de 0,2 ml de Millipore para el cultivo de carpas, producto de Millipore) a través de la abertura de entrada utilizando una jeringa y se tapó la abertura con barra de nilón (producto de Millipore). A continuación, se implantó el anillo dorsalmente en un ratón C57BL/6 macho de 5 semanas de edad, provocando de esta manera angiogénesis en la piel dorsal del
ratón.

\vskip1.000000\baselineskip

(3) Cribado para fagos que expresan péptido específico de la angiogénesis (biocribado)

Cinco días después del implante del anillo, se anestesió cada ratón con nembutal (administración intraperitoneal de 0,2 ml) y se administraron en la vena de la cola 0,2 ml del fago de expresión de péptidos aleatorios (1x10^{11} unidades formadoras de colonias) obtenidos tal como se ha indicado anteriormente en (1). Cuatro minutos después de la administración se congeló el ratón en nitrógeno líquido. Se descongeló el ratón congelado utilizando un secador y se diseccionó y se pesó la piel que mostraba neovascularización.

A continuación, se trituró la piel obtenida, se añadió a la misma 1 ml de solución de cultivo de Eagle modificado por Dulbecco (A) (producto de Nissui Pharmaceutical, nº de catálogo: código 05915) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (inhibidor de proteasa, producto de Sigma) y la mezcla se homogeneizó sobre hielo. A continuación, el homogenado se transfirió a un tubo Eppendorf y se lavó con tres partes enfriadas con hielo de la solución de cultivo anteriormente indicada (A) que contenía 1% de albúmina de suero bovino (producto de Intergene) (0,1 g de BSA + 100 \mul de PI 100 mM + 10 ml de DMEM). El lavado se llevó a cabo a 12.000 revoluciones/minuto utilizando una centrífuga. A continuación, se separó el sobrenadante y los fagos recuperados del tejido neovascular se utilizaron para infectar Escherichia coli K91KAN (cepa resistente a la canamicina; obsequio de Dr. Hideyuki Saya, Kumamoto University Chair of Tumor Medicine). Tras 60 minutos de reposo, a las cepas infectadas se añadieron 10 ml de medio NZY (preparado mediante la disolución de 10 g de NZ amina A (producto de Wako Pure Chemical; código 541-00241), 5 g de extracto de levadura de cerveza (marca comercial: Ebios, producto de Asahi Brewery) y 5 g de NaCl en 1 litro de agua purificada, añadiendo 1 ml de NaOH 5 N para ajustar el pH a 7,5 y esterilizando mediante autoclavado y almacenando a temperatura ambiente) que contenía 0,2 \mug/ml de tetraciclina y la mezcla se incubó a entre 180 y 200 revoluciones/minuto durante 60 minutos a 37ºC.

A continuación, se desprendió mediante raspado una colonia de Escherichia coli K91KAN de cultivo en estría, se suspendió en 5 ml de medio NZY que contenía canamicina (producto de Wako Pure Chemical, concentración final: 100 \mug/ml) y se incubó durante la noche a 37ºC y a entre 180 y 200 revoluciones/minuto. Además, se suspendieron 100 \mul del fluido del cultivo en 10 ml de medio NZY que contenía canamicina y se incubó a entre 180 y 200 revoluciones/minuto durante 4 horas a 37ºC. Tras 4 horas de cultivo, se confirmó que una muestra preparada mediante dilución de 10 veces del fluido de cultivo mostraba una absorbancia de entre 0,1 y 0,2 a 600 nm (siendo el número de células de 5x10^{9} células/ml). Tras 30 minutos de reposo, se separaron los fagos y se purificaron y se utilizaron para el segundo y posteriores procedimientos de biocribado).

Tras 5 repeticiones del procedimiento anteriormente indicado, se obtuvieron los fagos deseados que expresaban un péptido que se acumulaba en los tejidos neovasculares. Se muestran los resultados de los procedimientos de biocribado anteriores en la Tabla 1.

TABLA 1

1

La Tabla 1 muestra las tasas de recuperación de fagos obtenidas en los biocribados 1º a 5º. Tal como se muestra en la tabla, se observa que la tasa de recuperación de fagos, proporcionada en términos de proporción en porcentaje entre el número de fagos que se acumulan en el sitio de tejido neovascular y el número de fagos administrados en la vena de la cola, se incrementó con el incremento del número de procedimientos de biocribado. Se confirmó que se habían recuperado fagos que expresaban un péptido que se unía específicamente a las células endoteliales de los vasos angiogénicos.

\vskip1.000000\baselineskip

(4) Secuenciación de péptidos específicos de la angiogénesis

Para 15 fagos de entre los fagos obtenidos tal como se ha indicado anteriormente en (3), los péptidos expresados se secuenciaron de la manera siguiente.

Se recolectaron aleatoriamente 50 colonias de cada placa obtenida tras la medición del título tras el 4º biocribado, y se reinocularon en una placa de NZY fresca y, tras incubar durante la noche a 37ºC, las placas se almacenaron a 4ºC como placas matriz.

Cada colonia de placa matriz se suspendió en 20 ml de medio NZY (que contenía 20 \mug/ml de tetraciclina) en un tubo de centrífuga de 50 ml y se cultivó bajo agitación durante la noche a 37ºC y a 200 revoluciones/minuto.

A continuación, se centrifugó el cultivo a 3.000 revoluciones/minuto durante 10 minutos y el sobrenadante se transfirió a un tubo de centrífuga Oak Ridge y se centrifugó a 12.000 revoluciones/minuto durante 10 minutos para eliminar de esta manera la Escherichia coli. Además, el sobrenadante se transfirió a un tubo de centrífuga Oak Ridge y tras la adición de 3 ml de polietilenglicol (PEG 6000, producto de Nakalai Tesque)/NaCl y el mezclado uniforme, se dejó reposar la mezcla a 4ºC durante 4 horas, seguido de 10 minutos de centrifugación a 12.000 revoluciones/minuto para provocar que los fagos precipitasen. Tras la separación del sobrenadante, el sedimento de fagos se suspendió en 1 ml de TBS (solución salina tamponada con Tris). La suspensión se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml, seguido de 10 minutos de centrifugación a 15.000 revoluciones/minuto. Se eliminó el material insoluble y el sobrenadante se transfirió a otro tubo Eppendorf. Al sobrenadante se añadieron 150 \mul de polietilenglicol/NaCl y tras mezclar uniformemente, la mezcla se dejó reposar a 4ºC durante 1 minuto. A continuación, el fago se reprecipitó mediante 10 minutos de centrifugación a 15.000 revoluciones/minuto. Tras eliminar el sobrenadante, el precipitado de fagos se resuspendió en 200 \mul de TBS. El material insoluble se precipitó mediante 10 minutos de centrifugación a 15.000 revoluciones/minuto, el sedimento se transfirió a un tubo Eppendorf de 0,5 ml y el clon fágico se almacenó a 4ºC.

Para extraer ADN del clon fágico obtenido de la manera anteriormente indicada, se añadieron 100 \mul de TBS y 200 \mul de fenol saturado con TE (producto de Nippon Gene) a 100 \mul del clon fágico en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y, tras 10 minutos de agitación vigorosa, se centrifugó la mezcla a 15.000 revoluciones/minuto durante 10 minutos. A continuación, se añadieron 200 \mul de fenol saturado con TE y 200 \mul de cloroformo a 200 \mul de sobrenadante (fase acuosa) y, tras 10 minutos de agitación vigorosa de la misma manera que la indicada anteriormente, la mezcla se centrifugó a 15.000 revoluciones/minuto durante 10 minutos. Además, se añadieron 250 \mul de TE, 40 \mul de acetato sódico 3 M, 1 \mul de 20 mg/ml de glucógeno (producto de Boehringer Mannheim) y 1 ml de etanol a 150 \mul del sobrenadante (fase acuosa) y la mezcla se dejó reposar en un tubo Eppendorf de 1,5 ml a -20ºC durante 1 hora, seguido de centrifugación a 15.000 revoluciones/minuto durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante, se añadió lentamente 1 ml de etanol al 80% (-20ºC) al precipitado y la mezcla se centrifugó a 15.000 revoluciones/minuto durante 10 minutos para eliminar de esta manera la sal restante. Tras eliminar el sobrenadante, se evaporó el agua en el tubo, el ADN precipitado se disolvió en 10 \mul de agua destilada esterilizada y la solución se almacenó a 4ºC. Los ADN fágicos respectivos obtenidos de esta manera se utilizaron para la secuenciación de péptidos.

La secuenciación del péptido codificado por cada ADN fágico se llevó a cabo mediante el método didesoxi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977) utilizando el kit de secuenciación THERMO de Amersham (Amersham Life Science, código US79765, nº de lote: 201503) siguiendo el manual para el usuario adjunto con el equipo. La reacción de elongación del ADN se llevó a cabo en 30 ciclos, comprendiendo cada ciclo 96ºC x 30 segundos, 45ºC x 15 segundos y 60ºC x 4 minutos, y la secuenciación del ADN se llevó a cabo utilizando un secuenciador ABI de ADN (secuenciador de ADN ABI PRISMTM 377).

Las secuencias de aminoácidos obtenidas de esta manera de los péptidos específicos de la angiogénesis se muestran en la Tabla 2 utilizando las abreviaturas de una letra.

TABLA 2

2

Tal como se muestra en la Tabla 2, cinco fagos de entre 15 fagos expresaron la secuencia peptídica mostrada para el fago nº 1. Cada una de las secuencias peptídicas mostradas para los fagos nº 2 a 11 se expresaron en un único fago.

\vskip1.000000\baselineskip

(5) Ensayo de afinidad de fagos que expresan péptido específico de la angiogénesis (ensayo de afinidad 1)

Se prepararon ratones portadores tumorales mediante la implantación de células de melanoma B16BL6 (1x10^{6} células) en el flanco izquierdo de ratones C57BL/6 macho de cinco semanas de edad. Diez días después de la implantación del tumor (al alcanzar el tumor sólido un diámetro de aproximadamente 1 cm), los ratones portadores tumorales se anestesiaron con nembutal (0,2 ml administrados intraperitonealmente) de una manera similar a la indicada anteriormente en (3) y se administraron en la vena de la cola 0,2 ml de uno de los fagos que expresaban los péptidos secuenciados nº 1 a 11 y del fago antes de su administración, respectivamente, en la vena de la cola (1x10^{11} unidades formadoras de colonia). Cuatro minutos después de la administración, los ratones se congelaron en nitrógeno líquido. Los ratones congelados se descongelaron utilizando un secador y los sitios tumorales se diseccionaron y se pesaron.

Se trituró cada tumor y el fago se utilizó para infectar Escherichia coli de una manera similar a la descrita en (3) y después se incubó. A continuación, de manera similar se realizó un recuento de las unidades formadoras de colonia de cada fago acumuladas en el tejido tumoral.

Los resultados (porcentajes de recuperación) obtenidos se muestran en la Tabla 3 en términos de la proporción en porcentaje entre el número de fagos acumulados y el número de fagos administrados en la vena de la cola por cada 100 mg de tejido tumoral. La afinidad para el tejido tumoral de cada fago que expresa péptido específico de la angiogénesis también se muestra en la Tabla 3 en términos de la unión relativa de cada fago que expresa fago considerando que la tasa de recuperación de fagos antes de la separación es de 1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

4

A partir de la tabla anterior, se observa que los fagos nº 5, 6, 1, 2 y 3 muestran una afinidad elevada para tumores en el orden indicado.

\vskip1.000000\baselineskip

(6) Ensayo de afinidad de fagos que expresan péptidos específicos de la angiogénesis (ensayo de afinidad 2)

Se sometió a ensayo de la manera siguiente si los fagos que expresan péptidos separados tal como se ha indicado anteriormente en (5) mostraban una adhesión específica a tejidos neovasculares en una cepa diferente de ratón y también para una cepa tumoral diferente

De esta manera, se prepararon ratones portadores tumorales mediante la implantación de células de sarcoma Meth A (1x10^{6} células) en el flanco izquierdo de ratones BALB/c macho de cinco semanas de edad. A continuación, se llevó a cabo un ensayo similar al descrito en (5).

Los resultados obtenidos se muestran a continuación, en la Tabla 4, de la misma manera que en la Tabla 3.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4

6

A partir de la tabla anterior, se descubrió que los fagos nº 1, 5 y 6 presentaban una afinidad elevada para los tumores, en el orden indicado.

De esta manera, se encontró que los fagos nº 1, 5 y 6 mostraban una afinidad elevada para diferentes tipos tumorales que implicaban neovascularización tal como se ha indicado anteriormente, aunque se observan algunas diferencias menores en el grado de afinidad.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Síntesis en fase sólida de péptidos de la invención

Se preparó cada péptido mediante la síntesis en fase sólida según el método Fmoc/NMP HOBt [Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo, NMP: N-metilpirrolidona, HOBt: 1-hidroxibenzotriazol] utilizando un sintetizador automático de péptidos (ACT357, producto de Advanced ChemTech) y el programa del fabricante, de la manera siguiente.

De esta manera, en primer lugar se prepararon los péptidos de extremo C-terminal libre (OH). Éstos se prepararon según las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 5 y 6 mediante repetición de la reacción de elongación según los programas de síntesis respectivos, partiendo de 0,25 mmoles de resina Fmoc-aminoácido-Alko correspondiente al aminoácido C-terminal de cada péptido y sometiendo a reacción los Fmoc-aminoácidos correspondientes al segundo aminoácido y a los aminoácidos posteriores (desde el extremo C-terminal), uno a
uno.

Se preparó la forma amida C-terminal del péptido mediante la reacción de condensación de 0,25 mmoles de la resina Fmoc-NH-SAL con el Fmoc-aminoácido correspondiente al aminoácido C-terminal, seguido de la reacción de condensación con los Fmoc-aminoácidos correspondientes al segundo aminoácido (desde el extremo C-terminal) y a los aminoácidos posteriores, uno a uno.

Tras completar cada procedimiento de reacción, se eliminaba el grupo Fmoc N-terminal según el programa.

Cada resina con péptidos obtenida de esta manera se recuperó en una minicolumna de polipropileno (producto de Assist), se lavó con metanol y se secó al vacío, y se recortó el péptido de la resina mediante el procedimiento indicado posteriormente, seguido de la reacción de desprotección de cadenas laterales. Después, se añadieron 2 ml de reactivo K (82,5% de TFA, 5% de fenol, 5% de H_{2}O, 5% de tioanisol y 2,5% de etanoditiol) a cada resina y la reacción se llevó a cabo en una minicolumna durante 60 minutos.

A continuación, se terminó la reacción y simultáneamente se precipitó el péptido mediante la adición gota a gota de la mezcla de reacción a 8 ml de éter dietílico frío. Después, la minicolumna se lavó con 2 ml de TFA, se añadieron 5 ml de éter dietílico frío, la mezcla se centrifugó, el precipitado se lavó con cuatro porciones de 10 ml de éter dietílico y se solubilizó a continuación el péptido con aproximadamente 5 ml de acetonitrilo al 50% y se liofilizó. Los procedimientos de solubilización y liofilización se repitieron dos veces, obteniendo de esta manera el liofilizado crudo deseado.

El liofilizado crudo se fraccionó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de fase reversa utilizando una columna de octadecilo (diámetro: 20 x 250 mm, producto de YMC), y se aisló el péptido deseado.

Las resinas y derivados aminoácidos utilizados en los procedimientos anteriormente indicados eran productos de Watanabe Kagaku Kogyo.

Cada péptido aislado de esta manera se identificó mediante análisis de la secuencia de aminoácidos y se realizó la determinación de los pesos moleculares mediante espectrometría de masas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Experimento de inhibición competitiva utilizando péptidos sintéticos (1) Síntesis de péptidos

A partir de los resultados del ensayo obtenidos anteriormente, en el Ejemplo 1, se estudió la secuencia común a los tres péptidos, que mostraban afinidad elevada para los sitios angiogénicos y para los tejidos tumorales; los péptidos mostrados en SEC ID nº 13 a 16 se sintetizaron adicionalmente mediante el método de síntesis de péptidos en fase sólida mostrado en el Ejemplo 2, además de los péptidos mostrados en las secuencias SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención), 5 y 6, que contenían la estructura XRP. En los ejemplos siguientes, los péptidos utilizados eran los péptidos obtenidos de esta manera y que presentaban la estructura de amida C-terminal, a menos que se indique lo contrario.

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Experimento de inhibición competitiva utilizando los fagos y péptidos sintéticos de 15 residuos respectivos

Los péptidos sintéticos que presentaban las secuencias de aminoácidos mostradas en las secuencias SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención), 5 y 6 se administraron simultáneamente con los fagos nº 1, 5 y 6, respectivamente, de una manera similar a la del Ejemplo 1 (5). Se sintetizó cada péptido tal como en el Ejemplo 2.

De esta manera, 10 días después de la implantación del melanoma B16BL6 (1x10^{6} células) en ratones C57BL/6 de cinco semanas de edad (obtenidos de Japan SLC), se administró una solución agitada (0,2 ml) de 0,25 \mumoles de uno de los péptidos sintéticos anteriormente indicados y el fago respectivo (1x10^{8} unidades formadoras de colonia) en la vena de la cola de cada ratón portador tumoral, bajo anestesia, y se realizó un recuento de las unidades formadoras de colonia del fago acumuladas en el tejido tumoral, de manera similar a la indicada anteriormente.

En un grupo de control se administraron soluciones de fago libre de péptido sintético (1x10^{8} unidades formadoras de colonia).

Los fagos acumulados en los tejidos neovasculares en los tejidos tumorales se contaron a partir de la formación de colonias, y se evaluó cada péptido sintético para su efecto inhibidor de la acumulación de fagos, utilizando como valor de referencia la tasa de acumulación de fago expresante de péptido en el tumor sin administración simultánea del péptido sintético.

Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5

7

A partir de la tabla anteriormente proporcionada, se reveló lo siguiente. Los péptidos sintéticos (SEC ID nº 5 y 6) que presentaban la secuencia de aminoácidos común (WRP) mostraron actividad inhibidora cruzada contra los fagos nº 5 y 6, sugiriendo que la secuencia común WRP resulta importante para la afinidad para los sitios angiogénicos.

Por otra parte, la acumulación del fago nº 1 en el tumor resultó inhibida prácticamente en el mismo grado por todos los péptidos sintéticos utilizados.

\vskip1.000000\baselineskip

(3) Experimento de inhibición competitiva utilizando los fagos respectivos y péptidos sintéticos de 8 ó 5 residuos

Mediante la utilización de un método similar al descrito anteriormente en (2) y utilizando los cuatro péptidos de cadena corta (SEC ID nº 13 a 16) obtenidos tal como se ha indicado anteriormente en (2) en sustitución de los péptidos sintéticos de secuencias SEC ID nº 5 y 6, se administraron los péptidos sintéticos y los fagos respectivos y se realizaron recuentos de las unidades formadoras de colonias de los fagos acumulados en el tejido tumoral y se evaluaron los péptidos sintéticos de cadena corta para su efecto inhibidor de la acumulación de fagos. En un grupo de control se administraron soluciones de fagos libres de péptidos sintéticos (1x10^{8} unidades formadoras de colonia).

Los resultados se muestran en las figs. 1 y 2.

En cada figura, el eje de ordenada indica el porcentaje (%) de acumulación de fagos y el eje de abscisas indica el número de fagos. En la figura 1, la columna blanca se refiere al grupo (grupo de control) que recibió el péptido sintético de cadena corta mostrado en SEC ID nº 13 y la columna negra se refiere al grupo que recibió el péptido sintético de cadena corta mostrado en SEC ID nº 14.

Tal como se muestra en la figura 1, los péptidos sintéticos de cadena corta de 8 residuos (SEC ID nº 13 y 14) que contenían la secuencia WRP común a los péptidos sintéticos que presentaban las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID nº 5 y 6 inhibieron la acumulación de los fagos que expresaban los péptidos de 15 residuos correspondientes a los fagos respectivos. Presentaban una actividad inhibidora más alta que los péptidos sintéticos de 15 residuos. Ambos mostraron reactividad cruzada, sugiriendo la importancia de la secuencia común WRP, y se considera que resultaría posible acortar adicionalmente la cadena.

En la figura 2, la columna blanca se refiere al grupo (grupo de control) que recibió el fago solo, sin administración de ningún péptido sintético; la columna negra se refiere al grupo que recibió el péptido de cadena corta mostrado en SEC ID nº 15 (en el que se utilizó el fago nº 5) y la columna sombreada se refiere al grupo que recibió el péptido de cadena corta mostrado en la secuencia SEC ID nº 16 (en el que se utilizó el fago nº 6).

En la figura 2 resulta evidente que los péptidos (5 residuos) que presentan una cadena adicionalmente acortada tal como se muestra en las secuencias SEC ID nº 15 y 16, que presentan la secuencia común WRP, inhiben de manera similar la acumulación en el tumor de los fagos que expresan, respectivamente, los péptidos correspondientes de 15 residuos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Actividad 1 de inhibición del crecimiento tumoral (1) Síntesis de péptidos dendrímeros

Durante el examen de los péptidos para actividad de inhibición del crecimiento tumoral, se llevó a cabo un examen utilizando múltiples péptidos antigénicos (MAP), es decir péptidos dendrímeros, que se esperaba que proporcionasen al péptido que debía administrarse una estabilidad incrementada y una mayor actividad. Los péptidos dendrímeros se prepararon mediante un método de fase sólida similar al mostrado en el Ejemplo 2, en el que se utilizó una resina Fmoc-MAP-Alko. La resina utilizada para la síntesis de los péptidos dendrímeros eran una resina Fmoc_{8}-Lys_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla-Alko (resina Fmoc-MAP-Alko, producto de Watanabe Kagaku Kogyo).

Las estructuras de los dendrímeros obtenidos mediante la utilización de los péptidos sintéticos (obtenidos en el Ejemplo 2) mostrados en las secuencias SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención), 5 y 6, respectivamente, presentan las estructuras siguientes al expresarse siguiendo las abreviaturas de una letra.

Péptidos dendrímeros

(1) Péptido dendrímero derivado del péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 1*: * (no forma parte de la presente invención)

(PRPGAPLAGSWPGTS)_{8}-Lys_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Péptido dendrímero derivado del péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 5:

(DRWRPALPVVLFPLH)_{8}-Lys_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla

\vskip1.000000\baselineskip

(3) Péptido dendrímero derivado del péptido mostrado en SEC ID nº 6:

(ASSSYPLIHWRPWAR)_{8}-Lys_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Efectos de inhibición de la angiogénesis de los péptidos dendrímeros

Se prepararon tumores portadores de tumores sólidos mediante la administración subcutánea de 0,2 ml de células de sarcoma Meth A (5x10^{6} células/ml) en el flanco izquierdo de ratones BALB/c macho de cinco semanas de edad (Japan SLC). Se consideró que 6 a 10 días después de la implantación del sarcoma, cuando el diámetro del tumor posteriormente a la implantación en los ratones portadores tumorales había alcanzado 4 mm, era el día 1 y en los días 1 a 11 se administró subcutáneamente agua destilada (D.W.) como control o 20 mg/kg/día de cada uno de los dendrímeros (1) a (3) anteriormente indicados, durante 11 días consecutivos (se utilizaron 4 ratones en cada grupo).

Se evaluó 6 días después de la implantación y posteriormente el efecto antitumoral de cada péptido dendrímero, a partir del examen del crecimiento tumoral, del cambio de peso corporal y del tiempo de supervivencia (días) a modo de indicador de la presencia de efectos secundarios. Simultáneamente, se midieron el eje menor y el eje mayor de cada tumor y se calculó el volumen tumoral según la fórmula mostrada a continuación. El volumen tumoral calculado mediante la fórmula mostraba una correlación muy elevada con el peso tumoral observado tras la extirpación y pesado de los tumores (r^{2}=0,980).

Volumen tumoral = 0,4 x a x b^{2} (a: eje mayor, b: eje menor).

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 3.

En la figura 3, la ordenada indica el volumen tumoral (cm^{3}) y las abscisas indican el número de días (días) y, en la figura, la curva (1) se refiere al grupo que recibió el dendrímero (1) indicado anteriormente, la curva (2) se refiere al grupo que recibió el dendrímero (2) indicado anteriormente, la curva (3) se refiere al grupo que recibió el dendrímero (3) indicado anteriormente, y la curva (4) se refiere al grupo que recibió agua destilada.

En la figura 3 se observó que, al contrario que al administrar agua destilada, la administración de los péptidos dendrímeros derivados de los péptidos que presentaban las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención), 5 y 6, produjo efectos marcados de inhibición del crecimiento tumoral. A partir de este resultado se confirmó que los péptidos que presentaban las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención), 5 y 6 proporcionaban, en forma de dendrímeros, excelentes efectos de inhibición del crecimiento tumoral.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Distribución in vivo de liposomas modificados con péptidos

Pueden prepararse liposomas modificados con los péptidos específicos de la angiogénesis, en particular con los péptidos que contienen la secuencia WRP o la secuencia PRP (no forma parte de la presente invención), en el caso de que la distribución in vivo de la misma sea específica de tejidos neovasculares en el tumor y/o de sitios circundantes al tumor, en preparaciones DDS, permitiendo el direccionamiento activo hacia el tumor/cáncer en forma de preparaciones farmacéuticas que contienen un agente anticáncer deseado o una citoquina que presenta actividad anticáncer.

Por lo tanto, en el presente ejemplo, se unió ácido esteárico al extremo N-terminal de los péptidos de 5 residuos que contenían la secuencia WRP o la secuencia PRP (no forma parte de la presente invención), y se prepararon liposomas utilizando los productos y se llevó a cabo una investigación de si los liposomas preparados se acumulaban en el tumor diana.

\vskip1.000000\baselineskip

(1) Preparación de dispersiones de liposomas

Para preparar dispersiones de liposomas, se prepararon mediante el método del Ejemplo 2 derivados con ácido esteárico de los péptidos específicos de la angiogénesis (péptidos parciales; SEC ID nº 15: péptido parcial de SEC ID nº 5, SEC ID nº 16: péptido parcial de SEC ID nº 6, y SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención): péptido parcial de SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención) con adición de Ala en el extremo N-terminal del mismo).

A continuación, se prepararon soluciones en cloroformo que contenían el lípido DSPC (diesteroilfosfatidilcolina, producto de Nippon Seika), colesterol (producto de Sigma) y uno de los tres péptidos específicos de la angiogénesis anteriormente indicados (derivados con ácido esteárico de péptidos parciales) en proporciones molares de 10:5:4.

De esta manera, se prepararon soluciones en cloroformo de los ingredientes anteriormente indicados en proporciones molares de 10:5:4 mediante la mezcla de 75 \mul de DSPC 100 mM, 37,5 \mul de colesterol, 30 \mul de cada péptido de la invención y oleato de colesterol marcado con [oleato-1-^{14}C] (555 KBq, producto de Amersham). A continuación, cada solución preparada de la manera mencionada anteriormente se introdujo en un matraz de fondo redondo y se preparó una película delgada de lípidos mediante eliminación del cloroformo bajo presión reducida utilizando un evaporador giratorio. A continuación, se eliminó por completo el cloroformo bajo presión reducida y se secó la película delgada. Tras 60 minutos de secado al vacío, se hidrató la película con glucosa 0,3 M (concentración de DSPC: 5,0 mM).

Habitualmente, en sustitución de la glucosa 0,3 M, se utiliza como ingrediente activo una sustancia anticáncer o un ingrediente que presente actividad antitumoral, tal como 5-FU o doxorubicina, isotonizada con glicerol o similar. Además, en el caso de que el ingrediente que presenta actividad antitumoral sea un plásmido que contenga un fragmento específico de ADN o una proteína, se preparan liposomas mediante la adición de solución salina fisiológica de Dulbecco tamponada con fosfato (PBS)-Mg o una solución que contenga Ca o similar, o tras la preparación de los liposomas, se incluye en los mismos un agente anticáncer, tal como adriamicina, mediante el método de carga remota. Sin embargo, debido a que los péptidos específicos de la angiogénesis de la invención presentan ellos mismos actividad antitumoral, tal como se ha mostrado en el Ejemplo 3, no se añadió sustancia anticáncer ni ingrediente que presentase actividad antitumoral en las etapas de preparación posteriores.

La solución preparada de la manera indicada anteriormente se sometió a tres repeticiones de congelación y descongelación mediante calentamiento a 70ºC y después se sonicó bajo agitación durante 10 minutos utilizando un sonicador de tipo baño (marca comercial: ULTRASONIK 250, producto de Labosco). A continuación, utilizando un extrusor (producto de Lipex), la solución se pasó tres veces a través de una membrana de policarbonato (policarbonato Nucleopore, producto de Coaster) de poro de 100 nm, proporcionando los liposomas deseados (en dispersión) que contenían la molécula resultante del acoplamiento del ácido esteárico con el extremo N-terminal de los péptidos específicos de la angiogénesis (péptido parcial) de la invención. En este producto, el péptido parcial se encontraba en una forma que modificaba la superficie del liposoma.

Las dispersiones de liposomas resultantes contenían DSPC, colesterol y uno de los péptidos específicos de la angiogénesis (tres péptidos parciales, SEC ID nº 15: RWRPA, SEC ID nº 16: HWRPW y SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención): APRPG) en cantidades de 7,5 \mumoles, 3,75 \mumoles y 3 \mumoles, respectivamente, en 1,5 moles.

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Distribución in vivo de liposomas en ratones portadores tumorales

Se formó un tumor sólido mediante la implantación subcutánea de células de sarcoma Meth A (1x10^{6} células/0,2 ml) en el flanco de ratones BALB/c de cinco semanas de edad. Tras 10 días, se administraron 0,2 ml/ratón de cada una de las tres dispersiones de liposomas preparadas tal como se ha indicado anteriormente en (1), en la vena de la cola de los ratones portadores tumorales, bajo anestesia, y se examinaron para la distribución in vivo en el tejido tumoral y en diversos órganos de los ratones. Como control se administró una dispersión de liposomas libre de péptidos sintéticos. Se utilizaron dos o tres ratones portadores tumorales por grupo.

Tres horas después de la administración de la solución de ensayo, se exsanguinaron los ratones portadores tumorales, y después se sacrificaron mediante dislocación cervical y se sometieron a autopsia para recolectar la sangre, el tejido tumoral y los órganos (corazón, pulmones, hígado, bazo y riñones). Se pesó cada órgano. Se transfirió la sangre a un tubo Eppendorf y se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 minutos y se almacenaron en un vial 50 \mul del suero obtenido. Se cortó cada órgano hasta un tamaño de aproximadamente 100 mg, se introdujo en un vial y, tras pesar el órgano, se almacenó (cada muestra de órgano se recogió de dos sitios). A continuación, se trituró cada muestra de órgano en el vial, se añadió 1 ml de una solución lisante de tejidos (Solvable, producto de NEN Research Productions) y se dejó que la mezcla reposase durante la noche en un incubador (Personal DX, producto de Titertek) a 50ºC. Al día siguiente, se añadieron 0,5 ml de isopropanol (producto de Wako Pure Chemical) como agente antiespumante y seguidamente se añadieron 0,5 ml de peróxido de hidrógeno como agente decolorante y se dejó reposar la mezcla durante varias horas.

A continuación, se añadieron 10 ml de un líquido de centelleo (HionicFlow, producto de Packard Bioscience) y el vial se agitó bien y después se dejó reposar adicionalmente durante la noche. Las muestras de ensayo preparadas de esta manera se midieron para la distribución in vivo de los liposomas modificados por péptidos en los órganos respectivos, incluyendo el tejido tumoral, utilizando un contador de centelleo líquido (LSC-3100, producto de Aloka). Para cada medición, se prepararon dos tubos del blanco y de la mezcla preparada mediante la adición de 10 ml del líquido de centello (HionicFlow, producto de Packard Bioscience) a 50 \mul de liposomas.

Los resultados obtenidos de esta manera se muestran en la figura 4. En esta figura, los valores numéricos indican las tasas de recuperación (% de la dosis) de los liposomas modificados con péptidos administrados en 100 mg del tejido tumoral.

Resulta evidente a partir de la figura que los liposomas modificados con los péptidos específicos de la angiogénesis (péptidos parciales, SEC ID nº 15: péptido parcial de SEC ID nº 5; RWRPA, SEC ID nº 16: péptido parcial de SEC ID nº 6; HWRPW y SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención): péptido parcial de SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención); APRPG) mostraron todos niveles significativamente más altos de distribución en el tumor en comparación con el tumor (en la figura, el asterisco * indica que la diferencia es significativa en comparación con el control, p<0,05).

Además se reveló que los liposomas modificados con dichos péptidos específicos de la angiogénesis mostraban una tendencia hacia una retención incrementada en la sangre en comparación con los liposomas no modificados con dichos péptidos (de control, sin adición de péptido).

Respecto a la distribución de cada uno de los péptidos anteriormente indicados en otros órganos, la tendencia mostrada fue globalmente similar a la observada en el control, con una tendencia hacia una ligera reducción en páncreas, pulmones e hígado. Esta tendencia era notable, particularmente con el péptido mostrado en SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Actividad 2 de inhibición del crecimiento tumoral (1) Examen de dendrímeros del péptido mostrado en SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención) para actividad de inhibición dosis-dependiente del crecimiento tumoral

Se administraron subcutáneamente dosis de 10 mg/kg x dos veces/día y 20 mg/kg x dos veces/día del péptido dendrímero derivado del péptido de secuencia SEC ID nº 1 según se sintetizó en el Ejemplo 4 (1) y una dosis de 20 mg/kg x dos veces/día de un péptido dendrímero (SEC ID nº 18 (no forma parte de la presente invención)) derivado de un péptido resultante de la sustitución de una secuencia arbitraria por la secuencia mostrada en SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención), y agua destilada (DW) como control, en ratones los días 1 a 10 tras la implantación de células tumorales según el método del Ejemplo 4 (2), y se examinaron las actividades de inhibición del crecimiento tumoral. Se sometieron al experimento cuatro a seis ratones por grupo. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 5, de la misma manera que en la figura 3 (ordenada: volumen tumoral (cm^{3}), abscisas: días después de la implantación de células tumorales (días)).

En la figura, los círculos blancos se refieren al grupo que recibió 10 mg/kg x dos veces/día del péptido dendrímero, los círculos negros se refieren al grupo que recibió 20 mg/kg x dos veces/día del péptido dendrímero, los cuadrados blancos se refieren al grupo que recibió 20 mg/kg x dos veces/día del péptido dendrímero derivado de un péptido resultante de la sustitución arbitraria de una secuencia y los cuadrados negros se refieren al grupo que recibió agua destilada.

Resulta evidente a partir de la figura 5 que, en comparación con el grupo que recibió el péptido dendrímero derivado de un péptido resultante de la sustitución arbitraria de una secuencia por la secuencia mostrada en SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención) y con el grupo que recibió agua destilada, los grupos que recibieron el péptido dendrímero que contenía la secuencia mostrada en SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención) muestran una actividad de inhibición dosis-dependiente del crecimiento tumoral.

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Examen de los péptidos de cadena corta relacionados con la secuencia SEC ID nº 1 para el efecto de inhibición del efecto tumoral (no forma parte de la presente invención)

En el presente ensayo, se sintetizaron tres péptidos de cadena corta que presentaban una secuencia parcial de la secuencia mostrada en SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención) o que contenían una secuencia parcial de la misma, es decir tres péptidos que presentaban las secuencias de aminoácidos mostradas a continuación, en la Tabla 6, mediante el método de fase sólida de síntesis de péptidos según el método del Ejemplo 2 y se utilizaron.

TABLA 6

8

Los tres péptidos de cadena corta sintetizados y solución salina fisiológica como control se administraron respectivamente por vía subcutánea en ratones los días 1 a 10 tras la implantación de células tumorales según el método del Ejemplo 4 (2) y se examinaron los efectos de inhibición del crecimiento tumoral. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 6 de la misma manera que en la figura 3.

En la figura, los círculos blancos se refieren al grupo que recibió solución salina fisiológica, los círculos negros se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 19 (no forma parte de la presente invención), los cuadrados blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención), y los cuadrados negros se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 20 (no forma parte de la presente invención).

Se confirmó una tendencia hacia la inhibición del crecimiento tumoral a partir de la figura 6, en los grupos que recibieron los péptidos que contenían PRP presente en la primera mitad de la secuencia mostrada en SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención) (el grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 19 (no forma parte de la presente invención) y el grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención)).

\vskip1.000000\baselineskip

(3) Examen de los péptidos de cadena corta relacionados con la secuencia SEC ID nº 5 para el efecto de inhibición del crecimiento tumoral

Los péptidos mostrados a continuación, en la Tabla 7, es decir un péptido que presenta la secuencia completa mostrada en la secuencia SEC ID nº 5, los péptidos que presentan una de entre dos secuencias parciales de la secuencia SEC ID nº 5 (el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 13 y el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 21 (no forma parte de la presente invención)) y un péptido (SEC ID nº 22 (no forma parte de la presente invención)) resultante de la sustitución de una secuencia arbitraria por la secuencia mostrada en la secuencia SEC ID nº 5, se sintetizaron mediante el método de fase sólida de síntesis de péptidos según el método del Ejemplo 2 y se sometieron al ensayo.

TABLA 7

9

Una dosis de 20 mg/kg/día de cada uno de los péptidos sintetizados de la manera anteriormente indicada o agua destilada (DW) como control se administraron subcutáneamente en ratones los días 4 a 9 tras la implantación de células tumorales según el método del Ejemplo 4 (2), y se examinaron las actividades de inhibición del crecimiento tumoral. Se utilizaron tres a cinco ratones por grupo en el experimento. Los resultados se muestran en la figura 7 de la misma manera que en la figura 3.

En la figura, los círculos blancos se refieren al grupo que recibió agua destilada, los círculos negros se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 5, los cuadrados blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 22 (no forma parte de la presente invención) (grupo comparativo, es decir el grupo que recibió el péptido de 15 residuos resultante de la sustitución arbitraria de una secuencia por la secuencia SEC ID nº 5), los cuadrados negros se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 13, y los triángulos blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 21 (no forma parte de la presente invención).

Se confirmó a partir de la figura 7 que el péptido que presentaba la secuencia completa mostrada en la secuencia SEC ID nº 5 y los péptidos de cadena corta que presentaban la primera mitad o la última mitad de dicha secuencia presentaban todos ellos actividad de inhibición del crecimiento tumoral.

\vskip1.000000\baselineskip

(4) Examen de péptidos de cadena corta (péptidos de 5 residuos) relacionados con la secuencia SEC ID nº 5 para el efecto de inhibición del crecimiento tumoral

Con el fin de examinar adicionalmente los efectos de las secuencias peptídicas sobre la actividad productora de efectos de inhibición del crecimiento tumoral a la luz de los resultados indicados anteriormente en (3), se sintetizaron tres péptidos que presentaban una secuencia parcial de SEC ID nº 5, tal como se muestra a continuación en la Tabla 8, mediante el método de fase sólida de síntesis de péptidos según el método del Ejemplo 2 y se sometieron al experimento.

TABLA 8

10

Una dosis de 20 mg/kg/día de cada uno de los péptidos sintetizados de la manera anteriormente indicada, o solución salina fisiológica como control se administraron subcutáneamente en ratones los días 1 a 10 posteriores a la implantación de células tumorales según el método del Ejemplo 4 (2), y se examinaron las actividades de inhibición del crecimiento tumoral. Se utilizaron en el experimento cuatro o cinco ratones por grupo. Los resultados se muestran en la figura 8 de la misma manera que en la figura 3.

En la figura, los círculos blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 23 (no forma parte de la presente invención), los círculos negros se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 24 (no forma parte de la presente invención), los cuadrados blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 25 (no forma parte de la presente invención), y los cuadrados negros se refieren al grupo que recibió solución salina fisiológica.

Se confirmó a partir de la figura 8 que incluso el péptido de cadena corta, de 5 residuos, que comprendía las posiciones 11 a 15 de la secuencia SEC ID nº 5 presentaba actividad antitumoral.

\vskip1.000000\baselineskip

(5) Examen de los péptidos de cadena corta relacionados con la secuencia SEC ID nº 6 para el efecto de inhibición del crecimiento tumoral

Con el fin de examinar las secuencias de péptidos que influían sobre el efecto de inhibición del crecimiento tumoral de los péptidos de cadena corta relacionados con el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 6 de la misma manera que la indicada anteriormente en (3), se sintetizó el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 6, tres péptidos parciales del mismo (SEC ID nº 26 (no forma parte de la presente invención), nº 14 y nº 16) y un péptido comparativo (SEC ID nº 27 (no forma parte de la presente invención)) derivado de la sustitución de una secuencia arbitraria por la secuencia mostrada en SEC ID nº 6, mediante el método de fase sólida de síntesis de péptidos según el método del Ejemplo 2, y se utilizaron en el ensayo.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 9

11

\vskip1.000000\baselineskip

Una dosis de 20 mg/kg/día de cada uno de los péptidos sintetizados de la manera anteriormente indicada, o agua destilada como control, se administró subcutáneamente en ratones los días 1 a 10 posteriores a la implantación de células tumorales según el método del Ejemplo 4 (2) y se examinaron las actividades de inhibición del crecimiento tumoral. Se utilizaron cinco o seis ratones por grupo en el experimento. Los resultados se muestran en la figura 9 de la misma manera que en la Fig. 3.

En la figura, los círculos blancos se refieren al grupo que recibió agua destilada, los círculos blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 6, los cuadrados blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 26 (no forma parte de la presente invención), los cuadrados negros se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 14, los triángulos blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 16 y los triángulos negros se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 27 (no forma parte de la presente invención).

Se confirmó a partir de la figura 9 que los péptidos de cadena corta que contenían la secuencia WRP presentaban actividad antitumoral.

\vskip1.000000\baselineskip

(6) Examen de los péptidos de cadena corta que contenían WRP o que contenían WRP por sustitución de un residuo del mismo para un efecto de inhibición del crecimiento tumoral

Con el fin de examinar adicionalmente la importancia de la secuencia WRP para la actividad antitumoral a partir de los resultados indicados anteriormente en (5), se sintetizaron péptidos de 3 ó 4 residuos que contenían la secuencia WRP derivada de las secuencias SEC ID nº 5, SEC ID nº 6 y ambas, SEC ID nº 5 y nº 6, y péptidos de 5 residuos resultantes de la sustitución de alanina (A: Ala) por uno de los residuos aminoácidos en la secuencia WRP, tal como se muestra a continuación, en la Tabla 10, mediante el método de fase sólida de síntesis de péptidos según el método del Ejemplo 2, y se utilizaron en el ensayo.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 10

12

\vskip1.000000\baselineskip

Una dosis de 20 mg/kg/día de cada uno de los péptidos sintetizados de la manera anteriormente indicada, o agua destilada o solución salina fisiológica como control, se administró subcutáneamente en ratones los días 1 a 10 tras la implantación de células tumorales según el método del Ejemplo 4 (2), y se examinaron las actividades de inhibición del crecimiento tumoral. Se utilizaron cinco o seis ratones por grupo en el experimento. Los resultados se muestran en la figura 10 (resultados con los péptidos de secuencias SEC ID nº 28 a 32) y en la figura 11 (resultados con los péptidos de secuencias SEC ID nº 33 (no forma parte de la presente invención) a 35 (no forma parte de la presente invención)) de la misma manera que en la figura 3.

En la figura 10, los rombos blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 32, los círculos negros se refieren al grupo que recibió agua destilada, los cuadrados blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 28, los cuadrados negros se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 29, los triángulos blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 30, y los triángulos negros se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 31.

Se confirmó a partir de la figura que cada uno de los péptidos de cadena corta que contenían la secuencia WRP presentaba actividad antitumoral, y se descubrió que las intensidades de la actividad antitumoral se ordenaban de la manera siguiente: péptido de secuencia SEC ID nº 28 = péptido de secuencia SEC ID nº 29 > péptido de secuencia SEC ID nº 30 = péptido de secuencia SEC ID nº 31 > péptido de secuencia SEC ID nº 32.

En la figura 11 los círculos blancos se refieren al grupo que recibió solución salina fisiológica, los círculos negros se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 33 (no forma parte de la presente invención), los cuadrados blancos se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 34 (no forma parte de la presente invención), y los cuadrados negros se refieren al grupo que recibió el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 35 (no forma parte de la presente invención).

Se descubrió a partir de la figura 11 que los péptidos de cadena corta que no contenían la secuencia WRP no presentaban actividad antitumoral.

A partir de los resultados anteriormente proporcionados se estableció que la secuencia WRP resulta importante para que un péptido presente actividad antitumoral y que los péptidos de cadena corta que comprenden 4 ó 5 residuos que incluyen dicha secuencia WRP presentan actividad antitumoral.

\newpage

Ejemplo 7

Examen de los liposomas modificados por péptidos (1) Examen de los liposomas modificados por péptidos para el efecto de inhibición del crecimiento tumoral

Se prepararon liposomas modificados con el péptido que presenta la secuencia mostrada en SEC ID nº 15, 16 ó 17 (no forma parte de la presente invención) de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 5 (1) y se examinaron para su efecto de inhibición del crecimiento tumoral. Durante la preparación de cada especie de liposoma modificado por péptido, se omitió la adición de oleato de colesterol marcado con [oleato-1-^{14}C].

Una dosis de 20 mg/kg/día de cada una de las dispersiones de liposomas modificados por un péptido, o solución salina fisiológica como control o una dispersión de liposomas de control (sin adición de péptido), se administró subcutáneamente en ratones tres veces, es decir los días 4, 6 y 8 tras la implantación de células tumorales según el método del Ejemplo 4 (2), y se examinaron las actividades de inhibición del crecimiento tumoral de los liposomas modificados por péptido respectivos. Se utilizaron cinco ratones por grupo en el experimento. Los resultados se muestran en la figura 12 de la misma manera que en la figura 3.

En la figura, los rombos blancos se refieren al grupo que recibió los liposomas de control, los cuadrados blancos se refieren al grupo que recibió solución salina fisiológica, los círculos blancos se refieren al grupo que recibió los liposomas modificados con el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención), los triángulos blancos se refieren al grupo que recibió los liposomas modificados con el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 15, y los cuadrados negros se refieren al grupo que recibió los liposomas modificados con el péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 16.

Se descubrió a partir de la figura 12 que los niveles de efecto antitumoral se ordenaban de la manera siguiente: liposomas modificados con péptido de secuencia SEC ID nº 15 > liposomas modificados con péptido de secuencia SEC ID nº 16 > liposomas modificados con péptido de secuencia SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención). También se confirmó a partir de la figura 12 que dichos péptidos de cadena corta que contenían la secuencia WRP presentaban una actividad antitumoral más potente.

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Influencia de la composición de péptidos sobre la afinidad para el tejido tumoral de los liposomas modificados por péptido

Basándose en los resultados del ensayo de distribución in vivo del Ejemplo 5, que indicaba que los liposomas modificados por un péptido que presentaba la secuencia mostrada en la secuencia SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención) eran los más específicos para tumores, se modificó la proporción molar de dicho péptido en los liposomas con el fin de examinar de esta manera los cambios de especificidad para tumores.

De esta manera, se prepararon dispersiones de liposomas de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 5 (1). En esta ocasión se utilizó el lípido DSPC (diestearoilfosfatidilcolina, producto de Nippon Seika), colesterol (producto de Sigma) y derivado con ácido esteárico del péptido específico de la angiogénesis (SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención), derivado del péptido parcial mostrado en la secuencia SEC ID nº 1* (no forma parte de la presente invención) mediante la adición de Ala al extremo N-terminal del mismo) en proporciones molares de 10:5:2 (en lo sucesivo denominado PRP-20), 10:5:1 (en adelante denominado PRP-10), 10:5:0 (liposomas de control, en adelante denominados control). Se ajustó la concentración de liposomas de manera que la cantidad de DSPC fuese de 5 mM y el tamaño se ajustó a 100 nm.

A continuación, cada dispersión de liposomas preparada de la manera anteriormente indicada se examinó para su afinidad para el tejido tumoral mediante un método similar al del Ejemplo 5 (2). Se utilizaron dos o tres ratones portadores tumorales por grupo en el ensayo.

Los resultados se muestran en la figura 13 (ordenada: % de dosis/100 mg de tejido, abscisas: cada preparación de liposomas sometida a ensayo) de la misma manera que en la figura 4.

Se descubrió a partir de la figura 13 que incluso en el caso de que se redujese hasta 5 por ciento molar la cantidad del péptido específico de la angiogénesis, uno de los ingredientes activos de la preparación de liposomas de la invención, no resulta influida la afinidad deseada para los tumores.

\vskip1.000000\baselineskip

(3) Examen de los liposomas modificados por péptido para la estabilidad en el suero

Mediante la utilización de los liposomas modificados por péptido preparados tal como se ha indicado anteriormente en (2), se examinaron las estabilidades de los liposomas en suero mediante la medición del grado de aglutinación de la manera siguiente:

\newpage

Se preparó una mezcla de 0,15 ml de cada dispersión de liposomas, 0,75 ml de suero de feto bovino inactivo (producto de JRH Bioscience) y 0,6 ml de solución de glucosa 0,3 M. A modo de control se preparó una mezcla de 0,15 ml de la dispersión de liposomas y 1,35 ml de solución de glucosa 0,3 M. Se incubó cada mezcla a 37ºC durante 30 minutos y se midió la absorbancia a 450 nm (utilizando un espectrómetro DU-70, producto de Beckman).

A partir de los valores medidos obtenidos de esta manera se calculó el grado de aglutinación de cada dispersión de liposomas según la fórmula siguiente:

Grado de aglutinación = absorbancia a 450 nm en presencia de suero (turbidez de la dispersión de liposomas)/
absorbancia a 450 nm en ausencia de suero (en solución de glucosa 0,3 M) (turbidez de la dispersión de liposomas)

Los resultados obtenidos referentes a la estabilidad en suero (grado de aglutinación) se muestran en la figura 14 (ordenada: grado de aglutinación, abscisas: cada preparación de liposomas sometida a ensayo).

Se confirmó a partir de la figura 14 que, en lo referente a la aglutinación, la estabilidad en suero de la preparación de liposomas no resulta influida por lo menos en el caso de que la cantidad del péptido específico de la angiogénesis, uno de los ingredientes activos de la preparación de liposomas de la invención, no sea superior a 10 por ciento molar.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

(A título comparativo)

Examen del efecto antitumoral de las preparaciones de liposomas que contienen el péptido específico de la angiogénesis y un agente anticáncer como ingredientes activos

Basándose en los resultados del ensayo para influencias sobre la afinidad para tejido tumoral obtenido tal como en el Ejemplo 7 (2) de los liposomas modificados por péptido de la invención, se examinaron para su efecto antitumoral los liposomas indicados preparados posteriormente mediante la inclusión de adriamicina, que es conocido como agente anticáncer, en liposomas modificados por péptido que contenían 5 por ciento molar del péptido mostrado en la secuencia SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención).

\vskip1.000000\baselineskip

(1) Preparación de liposomas modificados por péptido con adriamicina (ADR) incluida en los mismos

Para reparar una solución de liposomas se sintetizó el derivado con ácido esteárico del péptido específico de la angiogénesis (péptido parcial, SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención), derivado del péptido parcial de secuencia SEC ID nº 1 (no forma parte de la presente invención) mediante la adición de Ala al extremo N-terminal del mismo) mediante el método del Ejemplo 2.

A continuación, se preparó una solución en cloroformo que contenía el lípido DSPC (diestearoilfosfatidilcolina, producto de Nippon Seika), colesterol (producto de Sigma) y el péptido específico de la angiogénesis anteriormente indicado (derivado con ácido esteárico de un péptido parcial) en la proporción molar de 10:5:0,5. De esta manera, se preparó una solución en cloroformo que contenía los ingredientes mencionados anteriormente en la proporción molar de 10:5:0,5 mediante la mezcla de 400 \mul de DSPC 100 mM, 200 \mul de colesterol 100 mM y 100 \mul del péptido de la invención (20 mM). A continuación, se introdujo la solución preparada de la manera anteriormente indicada en un matraz de fondo redondo y se preparó una película lipídica delgada mediante la eliminación del cloroformo bajo presión reducida utilizando un evaporador giratorio. Además, se eliminó por completo el cloroformo bajo presión reducida y se secó la película delgada. Tras 60 minutos de secado al vacío, se hidrató la película con 1 ml de solución 0,3 M de ácido cítrico (pH 4,0) (concentración de DSPC: 40 mM).

La solución preparada de la manera mencionada anteriormente se sometió a tres repeticiones de congelación y descongelación mediante calentamiento a 70ºC y la solución preparada se sonicó a continuación bajo agitación durante 10 minutos utilizando un sonicador de tipo baño (marca comercial: ULTRASONIK 250, producto de Labosco). A continuación, utilizando un extrusor (producto de Lipex), se pasó la solución a través de una membrana de policarbonato (policarbonato de Nucleopore, producto de Coaster) que presentaba un poro de 100 nm tres veces, proporcionando los liposomas deseados (en dispersión) que contenían la molécula resultante del acoplamiento del ácido esteárico con el extremo N-terminal del péptido específico de la angiogénesis (péptido parcial) de la invención. En el producto, el péptido parcial se encuentra en una forma que modifica la superficie del liposoma.

El pH de la fase acuosa exterior a los liposomas se ajustó a 7,5 mediante la adición de solución 0,5 M de carbonato sódico a la dispersión de liposomas. A continuación, la dispersión se diluyó con tampón HEPES 20 mM para obtener un volumen total de 2,0 ml. Además, se añadieron 0,58 ml de una solución 10 mg/ml de adriamicina (producto de Sigma) y la mezcla se incubó a 60ºC durante 1 hora para causar de esta manera que la adriamicina se incluyese en la capa acuosa en el interior de los liposomas.

La dispersión resultante se centrifugó durante 5 minutos (CS120EX, producto de Hitachi Koki, 100.000 g) para precipitar los liposomas y eliminar el sobrenadante que contenía la parte no incluida de adriamicina. El sedimento se redispersó en 1 ml de solución de glucosa 0,3 M y se determinó la cantidad de adriamicina incluida mediante el método de ensayo indicado posteriormente. La dispersión se diluyó a continuación hasta una concentración de adriamicina de 1,1 mg/ml (10 mg/kg), proporcionando una preparación (dispersión) de liposomas específicos para la angiogénesis de la invención con adriamicina incluida en los liposomas.

De esta manera, se obtuvieron liposomas (en dispersión) que contenían DSPC, colesterol y el péptido específico de la angiogénesis (SEC ID nº 17 (no forma parte de la presente invención)) en cantidades respectivas de 40 \muM, 20 \muM y 2 \muM en 5,5 ml (concentración de DSPC: 7,3 mM).

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Ensayos con adriamicina (a) Construcción de una curva estándar para el ensayo con adriamicina

Se midió la absorbancia a 480 nm (espectrómetro Beckman DU-70) de mezclas de 0 \mul, 100 \mul, 200 \mul y 400 \mul de una solución de adriamicina 0,2 mg/ml, de 900 \mul, 800 \mul, 700 \mul y 500 \mul, respectivamente de una solución de glucosa 0,3 M, y 100 \mul de Triton X-100 reducido al 10% (producto de Aldrich) y se obtuvo una curva estándar.

\vskip1.000000\baselineskip

(b) Ensayo de adriamicina en la capa acuosa interior a los liposomas

La dispersión de liposomas (10 \mul), 100 \mul de Triton^{TM} X-100 reducido al 10% y 890 \mul de una solución de glucosa 0,3 M se mezclaron entre sí y después se calentó a 60ºC y se midió la absorbancia a 480 nm.

Mediante la utilización del valor medio obtenido de esta manera y la curva estándar, se calculó el porcentaje de inclusión de adriamicina en la capa acuosa interior a los liposomas. El porcentaje de inclusión no fue inferior a 90%.

\vskip1.000000\baselineskip

(3) Efecto antitumoral de los liposomas modificados con el péptido con adriamicina incluida en los mismos

Se prepararon ratones portadores de tumor sólido mediante la administración subcutánea de células de sarcoma Meth A (1x10^{6} células/ratón) en el flanco izquierdo de ratones BALB/c macho de cinco semanas de edad (Japan SLC). El día de la implantación se consideró el día 1 y, los días 6, 9 y 12, la solución de glucosa 0,3 M (solvente) como control, los liposomas de control que incluían adriamicina (ADR) (liposomas que incluían el agente anticáncer pero que se encontraban libres de cualquier péptido específico de la angiogénesis de la invención), una solución de ADR libre preparada mediante la disolución del agente anticáncer ADR a una concentración de 15 mg/kg (ratón) en glucosa 0,3 M, y los liposomas modificados por péptido específicos de la angiogénesis que incluían ADR preparados tal como se ha indicado anteriormente en (1), se administraron respectivamente en la vena de la cola. En el ensayo, se utilizaron 5 ratones portadores tumorales en cada grupo.

Se evaluó el efecto antitumoral de cada agente administrado mediante el examen, desde 5 días después de la implantación de tumores, del volumen tumoral como indicador del crecimiento tumoral y el cambio de peso corporal de los ratones, así como el periodo de supervivencia (días) como indicador de la presencia de efectos secundarios, de una manera similar a la del Ejemplo 4 (2).

Los resultados se muestran en la figura 15.

En la figura, la ordenada indica el volumen tumoral y las abscisas indican el número de días tras la implantación de tumor. En la figura, (1) se refiere al grupo de solvente, (2) para el control de liposomas de control que incluían ADR, (3) para el grupo de solución de ADR libre, y (4) para el grupo que recibió liposomas modificados por péptido específicos de la angiogénesis que incluían ADR.

A partir de la figura 15 resulta evidente que todos los ratones murieron tras las tres administraciones, los días 6, 9 y 12, en el grupo que recibió la solución de adriamicina (ADR) libre (sin inclusión en liposomas) (grupo (3)), mientras que en el grupo que recibió adriamicina incluida en liposomas (grupo (2)), se evitó la muerte de los ratones. También se descubrió que, en el grupo que recibió liposomas modificados por péptido específico de la angiogénesis que incluían adriamicina (grupo (4)), se inhibió marcadamente el crecimiento de los tumores implantados.

A partir de los resultados anteriores, se estableció que, con la preparación de liposomas derivada de los liposomas modificados por péptido que contenían el péptido específico de la angiogénesis como ingrediente activo mediante la inclusión del agente anticáncer en los mismos, el efecto secundario del agente anticáncer incluido se redujo y se incrementó marcadamente el efecto de inhibición del crecimiento tumoral.

Aplicabilidad industrial

Según la invención, se proporciona un nuevo péptido específico de la angiogénesis y, mediante la utilización de dicho péptido específico de la angiogénesis, resulta posible aplicar el mismo como fármaco molecular que sirva como ligando para células endoteliales angiogénicas del tejido tumoral en preparaciones de DDS, permitiendo la administración selectiva de fármaco en el tejido diana y para proporcionar un agente diagnóstico del cáncer, un método de diagnóstico del cáncer, un método de terapia del cáncer y similares, para contribuir de esta manera a mejorar la eficiencia de la terapia del cáncer.

<110> Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Péptido de afinidad al tejido neovascular tumoral

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> P99-47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP H10-295198 y JP H11-194706

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-10-16 y 1999-07-08

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1 (no forma parte de la presente invención)

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17 (no forma parte de la presente invención)

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33 (no forma parte de la presente invención)

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34 (no forma parte de la presente invención)

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35 (no forma parte de la presente invención)

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> biblioteca de fagos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm

28

Claims

1. Péptido específico de la angiogénesis que migra selectivamente a los tejidos neovasculares que comprende uno de los elementos presentados a continuación en (a) y (b):

(a): péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos representadas en SEC ID nº 5 y 6, o un dendrímero del mismo,

(b): péptido que presenta una secuencia de aminoácidos representada en secuencias SEC ID nº 13 a 16 y 28 a 32, o un dendrímero del mismo.

2. Péptido específico de la angiogénesis según la reivindicación 1, que es un péptido que migra selectivamente a los tejidos neovasculares desarrollados en los tejidos cancerosos/tumorales.

3. Péptido específico de la angiogénesis según la reivindicación 2, en el que los tejidos cancerosos/tumorales son tejidos de sarcoma o de melanoma.

4. Composición anticáncer o inhibidora de la metástasis cancerosa, que comprende por lo menos un péptido específico de la angiogénesis según la reivindicación 2 ó 3 como ingrediente activo, junto con un portador farmacéutico para el mismo.

5. Preparación de liposomas, que comprende por lo menos un péptido específico de la angiogénesis según la reivindicación 2 ó 3, y un agente anticáncer o un inhibidor de la metástasis cancerosa como ingredientes activos, junto con un portador farmacéutico para el mismo.

6. Preparación de liposomas según la reivindicación 5, en la que el péptido específico de la angiogénesis es un péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos representadas en SEC ID nº 15 y 16, o un dendrímero del mismo.

7. Utilización del péptido específico de la angiogénesis según la reivindicación 2 ó 3, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de cáncer/tumores o a la inhibición de la metástasis cancerosa.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que el péptido específico de la angiogénesis es un péptido que presenta una de las secuencias de aminoácidos representada en SEC ID nº 5, 6, 13 a 16 y 28 a 32, o un dendrímero del mismo.

9. Utilización del péptido específico de la angiogénesis según la reivindicación 2 ó 3, para la preparación de una preparación de liposomas según la reivindicación 5 destinada al tratamiento de cáncer/tumores o a la inhibición de la metástasis cancerosa.