WO2000001814A2 - Nicht-menschliches säugetier, bei dem ein für ein scuz-protein kodierendes gen zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann - Google Patents

Nicht-menschliches säugetier, bei dem ein für ein scuz-protein kodierendes gen zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann Download PDF

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Inge Krebs
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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Definitions

  • the present invention relates to a non-human mammal in which a gene coding for a protein is modified, the protein containing an SRCR, a CUB and a ZP domain.
  • the invention further relates to a method for producing such a mammal and its use for testing substances which influence the protein.
  • SRCR domain means "scavenger receptor cysteine rieh” domain. Such a domain comprises about 110 amino acids and is found in many proteins that are linked to elementary processes of the cell, e.g. Cell differentiation, cell-cell contact or immune response have to do, or act as receptors. Furthermore, the terms “CUB” domain and ZP "domain each relate to a defined protein region, which is important for protein / protein interactions.
  • a human protein is known from the applicant's German patent 19730 997, which contains an SRCR, a CUB and a ZP domain. Its gene is called the DMBT1 gene and mapped to chromosome 10q25.3-q26.1. It is a tumor suppressor gene found in brain tumors, e.g. has homozygous deletions in 10% of medulloblastomas and 25% of glioblastomas, as well as in breast tumors (13%). It is also associated with carcinogenesis of lung carcinoma, melanomas, pancreas, endometrial, esophageal, colon and gastric carcinomas, as well as others, since about 40-50% of all tumors have chromosome 10q losses.
  • genes from the mouse CCP-ductin gene
  • the rat Ebnerin gene
  • SCUZ proteins proteins containing such domains
  • the object of the present invention is therefore to provide a means by which this can be investigated.
  • a means should also be provided which can be used to test substances which have an effect on SCUZ proteins.
  • an SCUZ protein can be investigated by means of a non-human mammal in which a gene which codes for an SCUZ protein is changed in such a way that it is either switched off or or tissue-specific can be switched off. He generated such a mammal by homologous recombination, using a vector construct which comprises the promoter and exon 1 of the CRP-ductin gene flanked by loxP sequences (cf. FIG. 2).
  • the knowledge of the applicant is used to provide a non-human mammal in which a gene which codes for an SCUZ protein is changed such that it is switched off or can be switched off in a time-specific or tissue-specific manner.
  • non-human mammal includes any mammal in which a gene may be altered that encodes an SCUZ protein. Examples of such mammals are mouse, rat, rabbit, horse, cattle, sheep, goat, monkey, pig, dog and cat, with mouse being preferred.
  • an SCUZ protein includes any protein that contains at least one SRCR, one CUB and one ZP domain.
  • the protein can be in wild-type or modified form, for example as a fusion protein or as a fragment, the modified form also comprising a modified amino acid sequence.
  • the protein can be homologous or heterologous to the non-human mammal. In the latter case it may be beneficial if this is for the mammal homologous protein is turned off.
  • the protein heterologous to the mammal can come from another mammal or from humans or another organism, for example the fruit fly.
  • the above protein is preferably a human protein, for example the protein encoded by the DMBT1 gene, a mouse protein, for example the protein encoded by the CRP-ductin gene, or a rat protein, for example the protein encoded by the Ebnerin gene.
  • modified gene indicates that a gene which codes for an SCUZ protein has been modified such that it is switched off or can be switched off in a time-specific or tissue-specific manner.
  • the former can e.g. be achieved in that the gene has an insertion or deletion, whereby the gene no longer codes for the functional protein.
  • a selection cassette such as neoTK is available.
  • an exon or part thereof, such as the promoter and exon 1 of the CRP-ductin gene are missing.
  • a time-specific or tissue-specific switching off of the gene e.g. be achieved in that it is under the control of an inducible or tissue-specific promoter.
  • the gene can also have sequences that are recognized by a recombinase, whereby one or more parts of the gene are cut out after its activation, which leads to a deletion.
  • sequences are e.g. loxP sequences recognized by a recombinase Cre.
  • the recombinase can be activated by various measures.
  • the recombinase gene can be under the control of an inducible or tissue-specific promoter and can already be present in the mammal in which the above gene is to be switched off.
  • the recombinase gene can also be delivered to the mammal or its progeny, this being e.g. by conventional transfection methods or by crossing with another mammal that contains the recombinase gene.
  • a non-human mammal according to the invention has the all shown in FIG. 3A! on. Particularly preferred is a non-human mammal that does the All indicated in Fig. 4C, 1st or 4C, 2nd! having. It is very particularly preferred if the non-human mammal is homozygous for the above allele.
  • Another object of the present invention are cells obtained from the above non-human mammal. These cells can be in any form, e.g. in a primary or long-term culture.
  • a non-human mammal according to the invention can be generated by conventional methods.
  • a method is favorable which comprises the following steps:
  • non-human mammal an SCUZ protein
  • modified gene reference is made to the above statements.
  • embryonic stem cells refers to any embryonic stem cells of a non-human mammal that are suitable for modifying a gene that codes for an SCUZ protein.
  • the embryonic stem cells are preferably from the mouse, in particular the cells E14 / 1.
  • Embryonic stem cells which contain a modified gene which codes for an SCUZ protein, the modification being such that the gene has sequences which can be recognized by a recombinase, are also a subject of the present invention.
  • vector construct encompasses any vector construct which, by recombination with the DNA from embryonic stem cells, leads to a change in a gene which codes for an SCUZ protein, the change being such that the gene is switched off or in time - or tissue-specific can be switched off.
  • the vector construct can comprise a DNA comprising an exon or part thereof of the above gene together with a selection marker, these elements being flanked by sequences which are recognized by a recombinase.
  • the vector preferably comprises the promoter and exon 1 of the CRP-ductin gene together with the neoTK selection cassette, these elements being flanked with loxP sequences.
  • DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
  • Another object of the present invention is a nucleic acid, in particular DNA, which comprises the promoter and exon 1 of the CRP-ductin gene.
  • the DNA preferably comprises the sequence of FIG. 1 or a sequence which differs from this by one or more base pairs, the latter sequence hybridizing with the sequence of FIG. 1 and not being a cDNA.
  • hybridization indicates hybridization under customary conditions, in particular at about 20 ° C. below the melting point of the DNA used as the hybridization sample.
  • a nucleic acid according to the invention, in particular DNA can be present as such or in the form of a vector, in particular an expression vector. Vectors are known to the person skilled in the art. A vector containing a nucleic acid according to the invention, in particular DNA, is therefore also the subject of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammal in which a gene is altered which encodes an SCUZ protein, the alteration being such that the gene is switched off or can be switched off in a time-specific or tissue-specific manner.
  • a mammal or cells from it With such a mammal or cells from it, the function or mode of action of an SCUZ protein can be examined. It is also possible to investigate the connection between a switched-off or modified SCUZ protein and the most different diseases, especially carcinomas.
  • carcinomas are e.g. Brain tumors, breast tumors, lung carcinomas, melanomas, pancreas, endometrial, esophageal, colon and gastric carcinomas.
  • the present invention thus also provides the basis for developing active substances with which the above diseases can be countered. Furthermore, it provides genomic sequences of the CRP-ductin gene, which contributes to the further understanding of genes that code for a SCUZ protein. These sequences also give the possibility of developing means with which the detection of such genes is possible or can be interfered with in the expression of the genes. Furthermore, the present invention provides non-human mammals, e.g. Sheep, cows, etc., in which large amounts of SCUZ proteins, especially those of humans, can be produced.
  • FIG. 1 shows a DNA according to the invention, comprising the promoter
  • Exon 1 of the CRP-ductin gene. 2 shows a DNA according to the invention which is present as an insert in the plasmid CRP-ductin KOK-creloxP.
  • the DNA comes from the DNA of FIG. 1, ie it comprises the entire sequence (bp1-9312) of the DNA of FIG. 1. In this fragment, starting from the base pair 4114, there is a loxP sequence and an additional HindIII and Spell Interface comprehensive insert of approximately 74 bp inserted. From base pair 5336, the DNA also has a sequence insert of approximately 3.0 kb, which comprises a neoTK selection cassette with flanking loxP sequences.
  • Fig. 3 shows the homologous recombination event between the inventive DNA of Fig. 2 and the CRP-ductin gene or the genotype obtained therefrom.
  • Figure 4 shows homologous recombination events (1) and (2) that occur after the genotype of Figure 3 has been subjected to Cre recombinase treatment.
  • the invention is illustrated by the example.
  • Example 1 Generation of a non-human mammal according to the invention
  • a mouse is generated in which the CRP-ductin gene is changed.
  • a vector which contains the DNA from FIG. 1.
  • This fragment has exons 1 and 2 of the CRP-ductin gene and its promoter.
  • the fragment is modified in that from the base pair 4114 it has an insert of approximately 74 bp comprising a loxP sequence and an additional Hind III and Spel interface.
  • the fragment from base pair 5336 has a sequence insert of approximately 3.0 kb, which comprises a neoTK selection cassette with flanking loxP sequences (cf. FIG. 2).
  • This vector is generated by electroporation into mouse embryonic stem cells E14 / 1 introduced. This wears a brown fur. Stably transfected cells are obtained by selection with 350 ⁇ g / ml G418. Genomic DNA is isolated from these cells, digested with HindIII, electrophoretically separated and blotted. For the hybridization, a labeled DNA fragment, probe A, from FIG. 3 is used, which is flanking the 5 ′ end of the region that is suitable for homologous recombination on the left side. E14 / 1 cells are identified which are heterozygous, ie which contain a wild-type and a recombined allele (cf. FIGS. 3 and 4).
  • a transient transfection with 5-30 ⁇ g of a Cre expression plasmid, for example pMC-Cre, before 1 ⁇ M Gancyclovir is added to them. This is used to select cells that have lost the neoTk selection cassette. Recombination event 1 or 2 is present in these cells (see FIG. 4).
  • the former has a deletion of the neoTk selection cassette and is referred to as a "floxed allele. In hybridization with probe B, this shows an additional 2.1 kb Spel band in addition to the approximately 15 kb wild-type Spel band.
  • the recombination event 2 has one Deletion of exon I and the neoTK selection cassette and is referred to as the “zero” mutant, which shows a 4 kb wild-type Bglll band and an additional 2.9 kb Bglll band when hybridized with probe B. a 15 kb wild-type spel band and an additional 13.5 kb spel band (see FIG. 4).
  • the cells obtained are injected into C57BL / 6 mouse blastocysts. This wears a black fur.
  • the blastocysts (12-15) are transferred to a sham pregnant mouse, B6D2-F1, and chimeric, black-brown mice are obtained. Chimeric females are crossed with C57B1 / 6 males, which ensures that offspring are preserved.
  • Those with brown fur are analyzed by Southemblotting and / or PCR, whereby mice are identified which are heterozygous for the "floxed" allele or the "zero" mutant. By crossing heterozygous mice, homozygous mice are obtained.
  • mice that contain a Cre recombinase gene under the control of a tissue-specific promoter mice that contain a Cre recombinase gene under the control of a tissue-specific promoter.
  • Mice are obtained which are homozygous for the "floxed” allele and heterozygous for the Cre recombinase gene. It has been shown that a non-human mammal according to the invention can be obtained in which a gene which codes for an SCUZ protein is switched off or can be switched off in a time-specific or tissue-specific manner.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-menschliches Säugetier, bei dem ein für ein Protein kodierendes Gen, wobei das Protein eine SRCR-, eine CUB- und eine ZP-Domäne enthält, derart verändert ist, daß es ausgeschaltet ist (a) oder zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann (b). Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Säugetiers sowie dessen Verwendung zur Testung von das Protein beeinflussenden Substanzen.

Description

NICHT-MENSCHLICHES SÄUGETIER, BEI DEM EIN FÜR EIN SCUZ-PROTEIN KODIERENDES GEN ZEITBZW. GEWEBESPEZIFISCH AUSGESCHALTET WERDEN KANN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-menschliches Säugetier, bei dem ein für ein Protein kodierendes Gen verändert ist, wobei das Protein eine SRCR-, eine CUB- und eine ZP-Domäne enthält. Femer betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Säugetiers sowie dessen Verwendung zur Testung von das Protein beeinflussenden Substanzen.
Der Ausdruck "SRCR" Domäne bedeutet "scavenger receptor cysteine rieh" Domäne. Eine solche Domäne umfaßt etwa 110 Aminosäuren und findet sich in vielen Proteinen, die mit elementaren Prozessen der Zelle, z.B. Zelldifferenzierung, Zell- Zell-Kontakt oder Immunantwort zu tun haben, bzw. als Rezeptoren fungieren. Ferner betreffen die Ausdrücke "CUB" Domäne und ZP" Domäne jeweils einen definierten Proteinbereich, der für Protein/Protein-Interaktionen wichtig ist.
Aus dem deutschen Patent 19730 997 des Anmelders ist ein humanes Protein bekannt, das eine SRCR- eine CUB- und eine ZP-Domäne enthält. Sein Gen wird mit DMBT1-Gen bezeichnet und kartiert auf Chromosom 10q25.3-q26.1. Es ist ein Tumor-Suppressor-Gen, das in Gehirntumoren, z.B. bei 10 % der Medulloblastome und 25 % der Glioblastome, sowie in Brusttumoren (13 %) homozygote Deletionen aufweist. Ferner wird es mit der Karzinogenese des Lungenkarzinoms, von Melano- men, Pankreas-, Endometrial-, Speieseröhren-, Colon- und Magenkarzinomen sowie weiteren in Verbindung gebracht, da bei etwa 40 -50 % aller Tumoren Verluste von Chromosom 10q vorliegen. Desweiteren sind Gene aus der Maus (CRP-ductin-Gen) und der Ratte (Ebnerin-Gen) bekannt, die jeweils für ein Protein kodieren, das eine SRCR-, eine CUB- und eine ZP-Domäne enthält. Proteine, die solche Domänen enthalten, werden nachstehend mit SCUZ-Proteinen bezeichnet.
Die genaue Funktion bzw. Wirkungsweise von SCUZ-Proteinen ist allerdings noch nicht bekannt. Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem dies untersucht werden kann. Ferner sollte ein Mittel bereitgestellt werden, mit dem Substanzen getestet werden können, die einen Einfluß auf SCUZ- Proteine haben.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Der Anmelder hat erkannt, daß die Funktion bzw. Wirkungsweise eines SCUZ- Proteins mittels eines nicht-menschlichen Säugetiers untersucht werden kann, bei dem ein Gen, das für ein SCUZ-Protein kodiert, derart verändert ist, das es entweder ausgeschaltet ist oder zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann. Er hat ein solches Säugetier durch homologe Rekombination generiert, wobei er ein Vektor-Konstrukt verwendet hat, das den Promotor und Exon 1 des CRP-ductin- Gens flankiert von loxP-Sequenzen umfaßt (vgl. Fig. 2).
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein nichtmenschliches Säugetier bereitzustellen, in dem ein Gen, das für ein SCUZ-Protein kodiert, derart verändert ist, daß es ausgeschaltet ist oder zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann.
Der Ausdruck "nicht-menschliches Säugetier" umfaßt jegliches Säugetier, in dem ein Gen verändert sein kann, das für ein SCUZ-Protein kodiert. Beispiele solcher Säugetiere sind Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Rind, Schaf, Ziege, Affe, Schwein, Hund und Katze, wobei Maus bevorzugt ist.
Der Ausdruck "ein SCUZ-Protein" umfaßt jegliches Protein, das zumindest eine SRCR-, eine CUB- und eine ZP-Domäne enthält. Das Protein kann in Wildtyp- oder modifizierter Form, z.B. als Fusionsprotein oder als Fragment, vorliegen, wobei die modifizierte Form auch eine modifizierte Aminosäuresequenz umfaßt. Ferner kann das Protein hinsichtlich des nicht-menschlichen Säugetiers homolog oder hetero- log sein. In letzterem Fall kann es günstig sein, wenn das zu dem Säugetier homologe Protein ausgeschaltet ist. Ferner kann das zu dem Säugetier heterologe Protein von einem anderen Säugetier oder dem Menschen bzw. einem anderen Organismus, z.B. der Fruchtfliege, stammen. Vorzugsweise ist das vorstehende Protein ein humanes, z.B. das durch das DMBT1-Gen kodierte Protein, ein Maus-, z.B. das durch das CRP-ductin-Gen kodierte Protein, oder ein Ratten-Protein, z.B. das durch das Ebnerin-Gen kodierte Protein.
Der Ausdruck "verändertes Gen" weist darauf hin, daß ein Gen, das für ein SCUZ- Protein kodiert, derart verändert ist, daß es ausgeschaltet ist oder zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann. Ersteres kann z.B. dadurch erreicht sein, daß das Gen eine Insertion oder Deletion aufweist, wodurch das Gen nicht mehr für das funktioneile Protein kodiert. Als Insertion kann z.B. eine Selektionskassette, wie neoTK, vorliegen. Ferner kann als Deletion z.B. ein Exon oder ein Teil davon, wie der Promotor und Exon 1 des CRP-ductin-Gens, fehlen. Desweiteren kann ein zeit- bzw. gewebespezifisches Ausschalten des Gens z.B. dadurch erreicht sein, daß es unter der Kontrolle eines induzierbaren oder gewebespezifischen Promotors steht. Auch kann das Gen Sequenzen aufweisen, die von einer Rekombinase erkannt werden, wodurch nach deren Aktivierung ein oder mehrere Teile des Gens herausgeschnitten werden, was zu einer Deletion führt. Solche Sequenzen sind z.B. loxP-Sequenzen, die von einer Rekombinase Cre erkannt werden. Die Aktivierung der Rekombinase kann durch verschiedene Maßnahmen erfolgen. Beispielsweise kann das Rekombinase-Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren oder gewebespezifischen Promotors stehen und bereits in dem Säugetier vorliegen, bei dem das vorstehende Gen ausgeschaltet werden soll. Auch kann das Rekombinase-Gen dem Säugetier bzw. dessen Nachkommen zugeführt werden, wobei dies z.B. durch übliche Transfektionsverfahren oder durch Kreuzung mit einem anderen Säugetier, das das Rekombinase-Gen enthält, erfolgen kann.
In bevorzugter Ausführunsform weist ein erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier das in Fig. 3A angegebene Alle! auf. Besonders bevorzugt ist ein nichtmenschliches Säugetier, das das in Fig. 4C, 1. oder 4C, 2. angegebene Alle! aufweist. Ganz besonders bevorzugt ist es, wenn das nicht-menschliche Säugetier homozygot für das vorstehende Allel ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellen, die aus dem vorstehenden nicht-menschlichen Säugetier erhalten werden. Diese Zellen können in jeglicher Form vorliegen, z.B. in einer Primär- oder Langzeit-Kultur.
Ein erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier kann durch übliche Verfahren generiert werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Transfektion von embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einem Vektor-Konstrukt, das eine Rekombination mit der DNA der embryonalen Stammzellen ermöglicht, wobei die Rekombination zu einer Modifizierung eines Gens führt, das für ein SCUZ-Protein kodiert, und die Modifizierung derart ist, daß das Gen von einer Rekombinase erkennbare Sequenzen aufweist,
(b) Isolierung von in (a) transfizierten Zellen und Behandlung dieser mit einer Rekombinase sowie Einbringung der Zellen in weibliche Tiere eines nichtmenschlichen Säugetiers,
(c) Analyse der in (b) erhaltenen Nachkommen auf ein Gen, das für ein SCUZ- Protein kodiert, wobei das Gen derart verändert ist, daß es ausgeschaltet ist oder zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann, und gegebenenfalls
(d) Behandlung der in (c) analysierten Nachkommen mit Rekombinase.
Hinsichtlich der Ausdrücke "nicht-menschliches Säugetier", "ein SCUZ-Protein" und "verändertes Gen" wird auf die vorstehenden Ausführungen verwiesen. Ferner kennt der Fachmann Bedingungen und Materialien, um die Schritte (a)-(d) durchzuführen. Desweiteren betrifft der Ausdruck "embryonale Stammzellen" jegliche embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers, die sich zur Veränderung eines Gens eignen, das für ein SCUZ-Protein kodiert. Vorzugsweise sind die embryonalen Stammzellen von der Maus, insbesondere die Zellen E14/1. Embryonale Stammzellen, die ein modifiziertes Gen enthalten, das für ein SCUZ-Protein kodiert, wobei die Modifizierung derart ist, daß das Gen von einer Rekombinase erkennbare Sequenzen aufweist, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Der Ausdruck "Vektor-Konstrukt" umfaßt jegliches Vektor-Konstrukt, das durch Rekombination mit der DNA von embryonalen Stammzellen zu einer Veränderung eines Gens führt, das für ein SCUZ-Protein kodiert, wobei die Veränderung dergestalt ist, daß das Gen ausgeschaltet ist oder zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann. Beispielsweise kann das Vektor-Konstrukt eine DNA aufweisen, die ein Exon oder einen Teil davon des vorstehenden Gens zusammen mit einem Selektionsmarker umfaßt, wobei diese Elemente von Sequenzen flankiert sind, die von einer Rekombinase erkannt werden. Vorzugsweise umfaßt der Vektor den Promotor und Exon 1 des CRP-ductin-Gens zusammen mit der neoTK-Selek- tionskassette, wobei diese Elemente mit loxP-Sequenzen flankiert sind. Ein solcher Vektor wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) als Plasmid CRP-ductin-KOK- creloxP unter DSM 12192 am 27. Mai 1998 hinterlegt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, insbesondere DNA, die den Promotor und Exon 1 des CRP-ductin-Gens umfaßt. Vorzugsweise umfaßt die DNA die Sequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der Sequenz von Fig. 1 hybridisiert und keine cDNA ist. Besonders bevorzugt ist die DNA von Fig. 2, d.h. die Insert-DNA des Plasmids CRP-ductin-KOK-creloxP.
Der Ausdruck "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei etwa 20°C unter dem Schmelzpunkt der als Hybridisie- rungsprobe verwendeten DNA hin. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere DNA, kann als solche oder in Form eines Vektors, insbesondere Expressionsvektors, vorliegen. Vektoren sind dem Fachmann bekannt. Einer eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere DNA, enthaltender Vektor ist daher auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-menschliches Säugetier bereitgestellt, bei dem ein Gen verändert ist, das für ein SCUZ-Protein kodiert, wobei die Veränderung dergestalt ist, daß das Gen ausgeschaltet ist oder zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann. Mit einem solchen Säugetier bzw. Zellen daraus kann die Funktion bzw. Wirkungsweise eines SCUZ-Proteins untersucht werden. Femer ist es möglich, den Zusammenhang zwischen einem ausgeschalteten oder modifizierten SCUZ-Protein und den vorschiedensten Erkrankungen, insbesondere Karzinomen, näher zu untersuchen. Solche Karzinome sind z.B. Gehirntumore, Brusttumore, Lungenkarzinome, Melanome, Pankreas-, Endometrial- , Speiseröhren-, Colon und Magenkarzinome. Desweiteren ist es möglich, Substanzen zu testen, mit denen das Protein bzw. seine Funktion oder Wirkungsweise beeinflußt werden kann. Dies umfaßt auch die Testung von Substanzen, mit denen die Funktion bzw. Wirkungsweise des Proteins zumindest teilweise ersetzt werden kann. Damit liefert die vorliegende Erfindung auch die Basis, um Wirkstoffe zu entwickeln, mit denen den vorstehenden Erkrankungen, begegnet werden kann. Desweiteren liefert sie genomische Sequenzen des CRP-ductin-Gens, was zum weiteren Verständnis von Genen beiträgt, die für ein SCUZ-Protein kodieren. Auch geben diese Sequenzen die Möglichkeit Mittel zu entwicklen, mit denen der Nachweis solcher Gene ermöglicht bzw. in die Expression der Gene eingegriffen werden kann. Desweiteren liefert die vorliegende Erfindung nicht-menschliche Säugetiere, z.B. Schafe, Kühe, etc., in denen große Mengen von SCUZ-Proteinen, insbesondere solche von Menschen, hergestellt werden können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen.
Fig. 1 zeigt eine erfindungsgemäße DNA, umfassend den Promotor und
Exon 1 des CRP-ductin Gens. Fig. 2 zeigt eine erfindungsgemäße DNA, die als Insert in dem Plasmid CRP-ductin KOK-creloxP vorliegt. Die DNA stammt von der DNA von Fig. 1 , d.h. sie umfaßt die gesamte Sequenz (bp1-9312) der DNA von Fig. 1. In dieses Fragment ist ab dem Basenpaar 4114 ein eine loxP-Sequenz und eine zusätzliche Hindlll- und Spel-Schnittstelle umfassender Einschub von etwa 74 bp eingefügt. Ferner weist die DNA ab dem Basenpaar 5336 einen Sequenz-Einschub von etwa 3,0 kb auf, der eine neoTK-Selektionskassette mit flankierenden loxP-Sequenzen umfaßt.
Fig. 3 zeigt das homolge Rekombinationsereignis zwischen dererfindngsgemäßen DNA von Fig. 2 und dem CRP-ductin-Gen bzw. den daraus erhaltenen Genotyp.
Fig. 4 zeigt homologe Rekombinationsereignisse (1) und (2), die eintreten nachdem der Genotyp von Fig. 3 einer Cre-Rekombinase-Behandlung ausgesetzt worden ist.
Die Erfindung wird durch das Beispiel erläutert.
Beispiel 1: Generierung eines erfindungsgemäßen nicht-menschlichen Säugetiers
Es wird eine Maus generiert, in der das CRP-ductin-Gen verändert ist. Hierzu wird ein Vektor verwendet, der die DNA von Fig. 1 enthält. Dieses Fragment weist die Exons 1 und 2 des CRP-ductin-Gens sowie dessen Promotor auf. Ferner ist das Fragment darin verändert, daß es ab dem Basenpaar 4114 einen eine loxP-Se- quenz und eine zusätzliche Hind III- und Spel-Schnittstelle umfassenden Einschub von etwa 74 bp aufweist. Desweiteren weist das Fragment ab dem Basenpaar 5336 einen Sequenz-Einschub von etwa 3.0 kb auf, der eine neoTK-Selektionskassette mit flankierenden loxP-Sequenzen umfaßt (vgl. Fig. 2).
Dieser Vektor wird durch Elektroporation in embryonale Stammzellen der Maus E14/1 eingeführt. Diese trägt ein braunes Fell. Stabil transfizierte Zellen werden durch Selektion mit 350 μg/ml G418 erhalten. Aus diesen Zellen wird genomische DNA isoliert, mit Hindlll gespalten, elektrophoretisch aufgetrennt und geblottet. Zur Hybridisierung wird ein markiertes DNA-Fragment, Sonde A, von Fig. 3, eingesetzt, das flankierend zum 5'-Ende der linksseitig für die homologe Rekombination geeigneten Region ist. Es werden E14/1 -Zellen identifiziert, die heterozygot sind, d.h. ein Wildtyp- und ein rekombiniertes Allel enthalten (vgl. Fig. 3 und 4). Diese Zellen werden einer transienten Transfektion mit 5-30 μg eines Cre-Expressions- plasmids, z.B. pMC-Cre, unterzogen, bevor ihnen 1 μM Gancyclovir zugegeben wird. Damit wird auf Zellen selektioniert, welche die neoTk-Selektionskassette verloren haben. In diesen Zellen liegt das Rekombinationsereignis 1 oder 2 (vgl. Fig. 4) vor. Ersteres weist eine Deletion der neoTk-Selektionskassette auf und wird als "gefloxtes Allel bezeichnet. Dieses zeigt in der Hybridisierung mit der Sonde B neben der ca. 15 kb Wildtyp-Spel -Bande eine zusätzliche 2.1 kb Spel-Bande. Das Rekombinationsereignis 2 weist eine Deletion von Exon I und der neoTK-Selek- tionskassette auf und wird als "Null"-Mutante bezeichnet. Dieses zeigt in der Hybridisierung mit der Sonde B eine 4kb Wildtyp Bglll-Bande und eine zusätzliche 2.9 kb Bglll-Bande. Alternativ zeigt sich auch eine 15 kb Wildtyp Spel-Bande und eine zusätzliche 13.5 kb Spel-Bande (vgl. Fig. 4).
Die erhaltenen Zellen werden in Blastozysten der Maus C57BL/6 injiziert. Diese trägt ein schwarzes Fell. Die Blastozysten (12-15) werden in eine scheinschwangere Maus, B6D2-F1 , transferiert und es werden chimäre, schwarzbraune Mäuse erhalten. Chimäre Weibchen werden mit C57B1/6-Männchen gekreuzt, wodurch das Erhalten von Nachkommen gesichert wird. Solche mit braunem Fell werden über Southemblotting und/oder PCR analysiert, wodurch Mäuse identifiziert werden, die heterozygot für das "gefloxte" Allel bzw. die "Null"-Mutante sind. Durch Kreuzung von heterozygoten Mäusen werden homozygote Mäuse erhalten. Solche, die homozygot für das "gefloxte" Allel sind, werden einer Kreuzung mit Mäusen unterzogen, die ein Cre-Rekombinase-Gen unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors enthalten. Es werden Mäuse erhalten, die homozygot für das "gefloxte" Allel und heterozygot für das Cre-Rekombinase-Gen sind. Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier erhalten werden kann, bei dem ein Gen, das für ein SCUZ-Protein kodiert, ausgeschaltet ist oder zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann.

Claims

Patentansprüche
1. Nicht-menschliches Säugetier, bei dem ein Gen, das für ein SCUZ-Protein kodiert, derart verändert ist, daß es ausgeschaltet ist (a) oder zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann (b).
2. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1 , wobei das Gen ein CRP- ductin-Gen ist.
3. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1 , wobei das Gen ein DMBT1- Gen ist.
4. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1 , wobei das Gen ein Ebnerin- Gen ist.
5. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1 oder 2, wobei das CRP- ductin-Gen in (a) eine Deletion aufweist, die den Promotor und Exon 1 umfaßt.
6. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1 oder 2, wobei das CRP- ductin-Gen in (b) loxP-Sequenzen umfaßt, die flankierend zu dem Promotor und Exon 1 vorliegen.
7. Nicht-menschliches Säugetier nach einem der Ansprüche 1 , 2 oder 5, wobei das Säugetier das Allel von Fig. 4C, 2. aufweist.
8. Nicht-menschliches Säugetier nach einem der Ansprüche 1 , 2 oder 6, wobei das Säugetier das Allel von Fig. 4C, 1. aufweist.
9. Zellen, erhalten aus dem nicht-menschlichen Säugetier nach einem der Ansprüche 1- 8.
10. Verfahren zur Bereitstellung eines nicht-menschlichen Säugetiers nach Anspruch 1 , umfassend die folgenden Schritte:
(a) Transfektion von embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einem Vektor, der eine Rekombination mit der DNA der embryonalen Stammzellen ermöglicht, wobei die Rekombination zu einer Modifizierung eines Gens führt, das für ein SCUZ-Protein kodiert, und die Modifizierung derart ist, daß das Gen von einer Rekombinase erkennbare Sequenzen umfaßt,
(b) Isolierung von in (a) transfizierten Zellen und Behandlung dieser mit einer Rekombinase sowie Einbringung der Zellen in weibliche Tiere eines nicht-menschlichen Säugetiers,
(c) Analyse der in (b) erhaltenen Nachkommen auf ein Gen, das für ein SCUZ-Protein kodiert, wobei das Gen dahingehend verändert ist, daß es ausgeschaltet ist oder zeit- bzw. gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann, sowie ggfs.
(d) Behandlung der in (c) analysierten Nachkommen mit einer Rekombinase.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Gen ein CRP-ductin-Gen ist.
12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Gen ein DMBT1-Gen ist.
13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Gen ein Ebnerin-Gen ist.
14. DNA, umfassend die Sequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der Sequenz von Fig. 1 hybridisiert und keine cDNA ist.
15. DNA nach Anspruch 14, wobei die DNA jene von Fig. 2 ist.
16. DNA nach Anspruch 14, wobei die DNA jene von Fig. 3A ist.
17. DNA nach Anspruch 14, wobei die DNA jene von 4B ist.
18. DNA nach Anspruch 14, wobei die DNA jene von 4C, 1. oder 4C, 2. ist.
19. Verwendung des nicht-menschlichen Säugetiers nach einem der Ansprüche 1 - 8 oder der Zellen nach Anspruch 9 zur Testuπg von Substanzen, die ein SCUZ-Protein beeinflussen oder dessen Funktion bzw. Wirkungsweise zumindest teilweise ersetzen.
20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Substanzen zur Behandlung von Karzinomen eingesetzt werden.
21. Verwendung nach Anspruch 11 , wobei die Karzinome Gehimtumore, Brust- tumore, Lungenkarzinome, Melanome, Pankreas-, Endometrial-, Speiseröhren-, Colon- und Magenkarzinome umfassen.
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