WO1999064585A2

WO1999064585A2 - Neuer angiotensin rezeptor, herstellung und verwendung desselben

Info

Publication number: WO1999064585A2
Application number: PCT/EP1999/003249
Authority: WO
Inventors: Holger Heitsch; Jörg-Peter Kleim; Günther Riess; Gertrud Sibenhorn
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 1998-06-08
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 1999-12-16
Also published as: EP1086217A2; BR9912183A; HUP0102540A3; KR20010052703A; PL345949A1; ID27566A; AR020086A1; TR200003662T2; DE19825494A1; WO1999064585A3; HUP0102540A2; CA2330229A1; AU4361699A; CN1304449A; JP2002517237A

Abstract

Die Erfindung betrifft einen neuen Angiotensin-Rezeptor, die Herstellung und Verwendung desselben. Der neue Angiotensin-Rezeptor hat mindestens eine Untereinheit, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 10 enthält.

Description

Beschreibung

Neuer Angiotensin Rezeptor, Herstellung und Verwendung desselben

Die Erfindung betrifft einen neuen Angiotensin Rezeptor, die Herstellung und Verwendung desselben.

Das Renin Angiotensin System ist wesentlich an der Regulation des Herz-Kreislauf- Systems, des Elektrolyt- und des Flüssigkeits-Haushalts beteiligt. Die physiologisch wirksamen Effektorhormone z.B. Angiotensin II (Angll) und Angiotensin 1-7 (Ang1-7) werden durch proteolytische Spaltung des in der Leber synthetisierten Precursers Angiotensinogen bzw. des daraus gebildeten Angiotensin I erzeugt. An diesen Spaltungen sind eine Vielzahl von Proteasen beteiligt (z.B. Renin, Angiotensin Converting Enzyme (ACE)).

Bisher wurden zwei menschliche Angiotensin Rezeptoren beschrieben, die mit AT1 und AT2 bezeichnet wurden. Beide Rezeptoren gehören zu den Angiotensin II (Ang ll)-Rezeptoren, d.h. diese Rezeptoren binden vorzugsweise Ang II. Die cDNA Sequenzen dieser beiden Rezeptoren (Takayanagi, R. et al. (1992). Biochemical and Biophysical Research Communications 183, 910-915; Tsuzuki, S. et al. (1994). Biochemical and Biophysical Research Communications 200, 1449-1454) weisen jeweils sieben hydrophobe Bereiche auf, die potentielle Transmembrandomänen darstellen. Aufgrund dieser charakteristischen Domänenstruktur wird angenommen, daß die Angiotensin-Rezeptoren AT1 und AT2 zur Familie der 7- Transmembranrezeptoren gehören, die die Wirkung ihres Liganden Angiotensin II über intrazelluläre G-Protein gekoppelte Signaltranduktionskaskaden vermitteln.

Aufgrund der pharmakologischen Effekte, die durch andere, von Angll verschiedene Angiotensine bzw. der von Angiotensin I bzw. II abgeleiteten Peptide (endogen gebildete Bruchstücke von Angl und Angll) vermittelt werden, wurde vermutet, daß weitere humane Angiotensin-Rezeptoren existieren. In diesem Zusammenhang wurde kürzlich ein Rezeptor für das Heptapeptid Ang1-7 gefordert (Ferrario, CM et al. (1997) Hypertension 30, 535-541 ).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neuer Angiotensin-Rezeptor, der mindestens eine Untereinheit aufweist, die die Aminosäuresquenz SEQ ID NO. 10 enthält, wobei diese Aminosäuresequenz gegebenenfalls am C-terminalen Ende weitere Aminosäuren aufweist.

Der Angiotensin-Rezeptor ist ein Transmembranrezeptor. Er weist, im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Angiotensin Rezeptoren vorzugsweise weniger als 7 Transmembrandomänen auf. Die Untereinheit, die die Sequenz SEQ ID NO. 10 enthält, weist vorzugsweise eine Transmembrandomäne auf. Diese Transmembrandomäne hat vorzugsweise eine Länge von mehr als 6, vorzugsweise 8 oder 9, besonders bevorzugt 7 Aminosäuren auf. Vorzugsweise hat die Transmembrandomäne die Sequenz „MSIVIPL" (angegeben im Einbuchstabencode für Aminosäuren).

Der Angiotensin-Rezeptor kann eine oder mehrere Untereinheiten aufweisen. Beispielsweise kann der Rezeptor entweder als a) Monomer (eine Untereinheit, die Sequenz SEQ ID NO. 10 enthält) oder als b) Dimer mit einer identischen oder einer anderen Untereinheit oder als c) Tetramer mit drei weiteren identischen Untereinheiten oder mit einer identischen und zwei anderen Untereinheiten vorliegen.

Der Angiotensin-Rezeptor kann aber auch bis zur Bindung des Liganden als Monomer (eine Untereinheit) bzw. als Dimer (zwei verschiedene Untereinheiten) vorliegen und erst durch die Bindung des Liganden in eine dimere bzw. tetramere Form übergehen. Rezeptoren, die eine ähnliche Struktur aufweisen wie der neue Angiotensin- Rezeptor, sind unter anderem der Insulinrezeptor, Wachstumsfaktoren wie nerve growth factor (NGF), endothelial growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), platelet derived growth factor (PDGF), T-Zellen Antigen- Rezeptoren, haematopoietische Cytokin-Rezeptoren (z.B. IL1 , IL5), und Adhesionsmoleküle (Integrine, Selektine).

Der neue Angiotensin-Rezeptor kann gegebenenfalls posttranslational modifiziert sein, beispielsweise kann der Rezeptor glykosyliert und/oder phosphoryliert sein.

Der Angiotensin-Rezeptor kann seinen bzw. seine Liganden binden und die Wirkung dieses Liganden bzw. dieser Liganden intrazellulär vermitteln. Der Angiotensin Rezeptor kann Angiotensin 1-7 und/oder ein Derivat von Angiotensin 1- 7 binden. Derivate von Angiotensin 1-7 sind vorzugsweise verkürzte Peptide, die sich von Ang1-7 ableiten, z.B. Abbauprodukte von Ang1 -7. Beispiele für Derivate von Ang1-7 sind Angiotensin III und Angiotensin IV. Vorzugsweise bindet der Rezeptor Ang 1-7.

Gegenstand der Erfindung ist ein Rezeptor, der die Aminosäuresequenz in Tabelle 2, SEQ ID NO. 10 aufweist bzw. enthält. Der Angiotensin-Rezeptor bzw. die Untereinheit, die die Sequenz SEQ ID NO. 10 enthält, hat eine Länge von mindestens 175 Aminosäuren.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Nukleinsäure, die eine Sequenz aufweist, die für den neuen Angiotensin-Rezeptor („Rezeptor") kodiert. Beispielsweise kann der Rezeptor ganz oder teilweise durch eine Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist, kodiert werden. Eine Nukleinsäure, die für den Rezeptor bzw. eine Untereinheit des Rezeptors kodiert kann die Sequenz SEQ ID NO. 9 erhalten und am 3^'-Ende gegebenenfalls weitere Nukleotide aufweisen, die zur kodierenden Sequenz gehören. Die Nukleinsäure kann beispielsweise eine DNA, eine cDNA oder eine RNA sein. Die Nukleinsäure kann ein Gen sein, wobei dann die Sequenz SEQ ID NO. 9 durch nicht-kodierende Sequenzen (Introns) unterbrochen sein kann.

Die Nukleinsäure kann gegebenenfalls derivatisiert sein. Ein Derivat der Nukleinsäure kann beispielsweise ein Salz sein oder ein Nukleinsäure-Derivat, welches neben den natürlichen Nukleotiden auch modifizierte Nukleotide enthält bzw. vollständig aus modifizierten Nukleotiden aufgebaut ist.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält. Beispielsweise kann eine solche Nukleinsäure in einer PCR amplifiziert werden, in der Oligonukleotide, deren Sequenzen homologen Bereichen (konservierten Bereichen) in den Nukleotidsequenzen der Angiotensin Rezeptoren AT1 und AT2 entsprechen, als Primer und cDNA, die vorzugsweise aus einem Gewebe (bzw. Zellen), auf das Angiotensin 1-7 oder ein Derivat desselben eine Wirkung hat und/oder aus Gewebe (bzw. Zellen), in dem AT1 und/oder AT2 nicht exprimiert werden, hergestellt wird, eingesetzt werden. In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens werden degenerierte Primer eingesetzt, deren Sequenzen sich von den homologen Bereichen der Sequenzen von AT1 und AT2 ableiten. Vorzugsweise werden hierzu die Primer Ang3A und Ang3B verwendet. Als Template kann beispielsweise cDNA, hergestellt aus Endothelzellen verwendet werden. Beispielsweise kann cDNA hergestellt aus HUVECs (Human Umbilical Vein Endeothelial Cells) als Template eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung des neuen Rezeptors. Beispielsweise kann der neue Angiotensin-Rezeptor hergestellt werden, indem eine Nukleinsäure, deren Sequenz für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in einen geeigneten Vektor integriert, der rekombinante Vektor in eine Zelle eingebracht und der Angiotensin Rezeptor in dieser Zelle exprimiert wird.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den neuen Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, beispielsweise in einem Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Angiotensin-Rezeptors, wobei die Nukleinsäure, die unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors steht in eine Zelle eingebracht und exprimiert wird.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den neuen Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, in der der Angiotensin- Rezeptor exprimiert werden kann. Die Erfindung betrifft eine rekombinante Zelle, die einen Angiotensinrezeptor mit der Sequenz SEQ ID NO. 10 exprimiert. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prävention von Krankheiten, die mit einer Fehlregulation des Herz-Kreislauf Systems, des Elektrolythaushalts oder des Flüssigkeitshaushalts einhergehen. Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel, daß eine Nukleinsäure mit der Sequenz ID NO. 9 enthält.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, zur Herstellung eines transgenen Tieres, welches das entsprechende Angiotensin-Rezeptor Gen nicht enthält oder eines transgenen Tieres, welches das entsprechende Angiotensin-Rezeptor Gen überexprimiert. Transgene Tiere können beispielsweise zur Charakterisierung der Spezifität und biochemischen Funktion des Angiotensin-Rezeptors verwendet werden. Die Erfindung betrifft ein nichthumanes transgenes Tier, das den Angiotensin-Rezeptor exprimiert. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Substanzen, die als Antagonisten und Agonisten des Angiotensin-Rezeptors eingesetzt werden können und/oder in Verfahren, in denen Substanzen identifiziert werden, die die funktionelle Expression des kodierten Angiotensin-Rezeptors inhibieren oder aktivieren. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Agonisten oder Antagonisten des Angiotensin-Rezeptors wobei eine Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist, in einer Zelle eingebracht und der Angiotensin-Rezeptor in dieser Zelle exprimiert wird, diese Zelle mit einer zu untersuchenden Substanz inkubiert und der Effekt dieser Substanz auf den Angiotensin-Rezeptor bestimmt wird.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in der Gentherapie oder zur Herstellung eines Arzneimittels, das in der Gentherapie eingesetzt werden kann.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die SEQ ID NO. 9 enthält als Werkzeug in der Molokularbiologie (z.B. als Sonde).

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des neuen Angiotensin-Rezeptors. Beispielsweise kann der Angiotensin Rezeptor in Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Substanzen, die als Agonisten oder Antagonisten des Rezeptors eingesetzt werden können, verwendet werden (z.B. Bindungsassays und funktionelle Assays zum Screening).

Weiterhin kann der Angiotensin-Rezeptor oder Teile desselben z.B. ein Epitop, welches z.B. durch die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 10 bzw. einen Teil derselben vorgegeben wird, zur Herstellung von Antikörpern nach bekannten Verfahren (Harlow und Lane, „Antibodies-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN-0-87969-314-2) eingesetzt werden. Auf diese Weise hergestellt Antikörper, die spezifisch an den neuen Angiotensin-Rezeptor binden, können zum Nachweis des neuen Rezeptors, z.B. in diagnostischen Verfahren und/oder zur weiteren Charakterisierung des Rezeptors eingesetzt werden. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Zur Auffindung des neuen Rezeptors wurden ausgehend von den bekannten Sequenzen, die für die Angiotensin II Rezeptoren AT1 und AT2 kodieren, Oligonukleotide synthetisiert, deren Sequenzen konservierten Bereichen der AT1/AT2 kodierenden Sequenzen entsprechen bzw. die gegen diese konservierten Bereiche gerichtet sind (Ang3A und Ang3B). Diese Oligonukleotide wurden in PCR Reaktionen mit cDNA aus humanen HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) als Template eingesetzt. Diese Zellinie leitet sich von Endothelzellen ab, die die Blutgefäße auskleiden. Diese Zellen exprimieren keine AT1 bzw. AT2- Rezeptoren .

Es wurde ein DNA-Fragment mit einem offenen Leserahmen und einer bisher nicht beschriebenen Nukleotidsequenz (SEQ ID NO. 3) amplifiziert und identifiziert. Diese Nukleotidsequenz zeigte keine Übereinstimmung mit Sequenzen in den Datenbanken EMBL oder Genbank^®. Ein Sequenzvergleich mit Sequenzen in der Lifeseq® Datenbank mit Hilfe der Programm-Module "Blast" und "Assembly" (GGC Programm Paket) ergab eine Überlappung von SEQ ID NO. 3 mit den Lifeseq®- Klonen Nr. 1458429, 3341232, 3440195, 1250818, 2836520, 1310286 und 1362205 (ESTs ohne bekannte Funktion). Das aus diesem virtuellen Contig-(3) abzuleitende theoretische 0,5 kbp DNA-Fragment wurde experimentell bestätigt (Beispiel 2, PCR mit dem Primerpaar Ang4A und Ang4B). Die Sequenz des DNA-Fragments mit dem darin enthaltenen offenen Leserahmen wurde durch 5^'-Verlängerung (Beispiel 3) bis in die Vektorsequenz hinein aufgeklärt (SEQ ID NO. 9). Die SEQ ID NO. 9 enthält auch die 5^'-nichttranslatierte Region bzw. einen Teil derselben.

Eine Analyse des 5^'-Bereichs der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 9 zeigte, daß stromaufwärts vor dem angenommenen Start-Methionin-Triplet (ATG) an Position - 3 ein Purin-Nukleotid und an den Positionen -1 und -4 Cytosin-Nukleotide lokalisiert sind. Die Lokalisation dieser Nukleotide an den Positionen -1 , -3 und -4 entspricht der eukaryotischen Konsensussequenz für den mRNA-Translations- Initiationsstartpunkt.

Der offene Leserahmen in SEQ ID NO. 9 kodiert für ein Protein mit mindesten 175 Aminosäuren (SEQ ID NO. 10). Eine Hydrophobizitätsanalyse dieser Aminosäuresequenz mit Hilfe des GCG Programms zeigte, daß die Sequenz am N- Terminus eine hydrophobe Domäne mit einer Länge von etwa 7 Aminosäuren aufweist. Diese hydrophobe Domäne kann eine Transmembrandomäne darstellen, mit der dieser neue Rezeptor in der Membran verankert ist. Am C-Terminus weist die Sequenz dagegen eine mehr oder weniger hydrophile Domäne auf.

Beispiele:

Beispiel 1 :

Für die erste PCR wurden die Oligonukieotid-Primer Ang3A und Ang3B verwendet, die ein 0,19 kbp-DNA-Fragment - auf Basis der AT1/2-Rezeptorgene -einschließen. Als Template DNA wurde cDNA aus einer käuflichen HUVEC-cDNA-Bank (Stratagene Katalog Nr. 937223, Stratagene GmbH, Heidelberg) eingesetzt.

Nukleotidsequenz von Ang3A:

SEQ ID NO. 1 : 5^'-TTG TKC TKK YCT TYW TCW TTT SCT GGM TTC CC -3^' Nukleotidsequenz von Ang3B:

SEQ ID NO. 2: 5^'-TTΥ CCM ASA AAR CMA TAM ÄRA ARM GGA TT -3^'

wobei M = (A/C)

Y = (C/T)

R = (A/G)

S = (G/C)

K = (G/T

W = (A/T) bedeutet.

Für die PCR Reaktion wurden 1 μg cDNA aus der HUVEC Bank mit rekombinanter Thermus aquaticus (Taq) DNA Polymerase (Boehringer Mannheim, Deutschland) und je 10 pmol Primer Ang3A und Ang 3B pro 50 μl Reaktionsansatz in einem Thermocycler (Perkin Eimer 2400-Thermocycler, Perkin Eimer Applied Biosystems, Weiterstadt) inkubiert. Die PCR Reaktion wurde mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 20^" bei 96°C, 10^" bei 38°C und 20^" bei 72°C (60 Zyklen). Es wurde ein 130 Basenpaare (bp) langes DNA-Fragment amplifiziert.

Dieses 130 bp DNA-Fragment wurde in den Vektor pCR 2.1 TOPO® (Invitrogen BV, NV Leek, Niederlande) ligiert und in E. coli ToplOF^' transformiert. Die Sequenz des im pCR2.1 vorliegenden 130 bp DNA-Fragments wurde mit Hilfe eines Kapillarelektrophorese-Sequencers (ABI 310, Applied Biosystems, Weiterstadt) ermittelt (SEQ ID NO. 3).

Beispiel 2:

Die Sequenz SEQ ID NO. 3 wurde unter Verwendung der Programm-Module FASTA und TFASTA (Software-Paket der University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), USA) mit den Sequenzen, die in den öffentlich zugänglichen Datenbanken (z.B. EMBL, GenBank^®) vorliegen, verglichen. Außerdem wurde die Sequenz für einen entsprechenden Homologievergleich mit den Sequenzen, die in der Lifeseq®-Datenbank der Fa. Incyte (Palo Alto, USA) erfaßt sind, eingesetzt.

In der Lifeseq®-Datenbank wurden Sequenzen von Expressed Sequence Tags (ESTs) identifiziert (Lifeseq^®-Klone Nr. 1458429, 3341232, 3440195, 1250818, 2836520, 1310286 und 1362205), die mit SEQ ID NO. 3 überlappen. Ausgehend von einer Sequenz, die sich von einer Anordung der überlappenden Expressed Sequence Tags (ESTs) nach eigenem Assembly ableitet, wurden die Primer Ang4A und Ang4B synthetisiert. Nukleotidsequenz von Ang4A:

SEQ ID NO.4: 5'-TGG GGG TTG ATA CAG CAG AGA C -3^'

Nukleotidsequenz von Ang4B:

SEQ ID NO. 5: 5^'-GCA CTG CCC TCT CTT TAT CCA AA -3^'

Es wurden PCR Reaktionen mit jeweils 0,1 μg cDNA aus der HUVEC Bank als Template und jeweils 10 pmol Primer Ang4A und Ang4B pro 50 μl Reaktionsansatz durchgeführt, wobei der Advantage-cDNA Polymerase Mix (Clontech, Heidelberg) verwendet wurde. Für die PCR Reaktionen wurde folgendes Temperaturprofil verwendet: 30^" 94°C und 2^'30^" 60°C (60 Zyklen). Es wurde ein 500 bp langes DNA-Fragment erhalten. Dieses wurde wie in Beispiel 1 beschrieben kloniert und sequenziert (SEQ ID NO. 6). Die Sequenz weist einen offenen Leserahmen (Open Reading Frame (ORF)) auf.

Beispiel 3:

Um die Sequenz im 5^' Bereich des 500 bp DNA-Fragments aufzuklären, wurden die Primer Ang5A und Ang5B synthetisiert. Nukleotidsequenz von Ang5A:

SEQ ID NO. 7: 5'-TGG GGA TTG ATA GGC AG-3^*

Nukleotidsequenz von Ang5B:

SQ ID NO. 8: 5^'-ATA ACT GTT GGA TTT CTC AA -3^'

Die Nukleotidsequenz von Ang5A und Ang5B entspricht jeweils einem Teil der Sequenz des 500bp DNA-Fragments. Diese beiden Primer werden in weiteren PCRs mit den Primern M13 Reverse bzw. M13 Forward (-20) eingesetzt. Die Primer M13 Reverse und M13 Forward (-20) entsprechen Sequenzen des zur Herstellung der HUVEC-cDNA-Bank benutzten Uni-ZAP Bakteriophagen-Vektors. Diese PCR Reaktionen wurden mit je 0,1 μg cDNA aus der HUVEC Bank als Template und jeweils 10 pmol Primer Ang5A bzw. Ang5B und M13 Reverse bzw. M13 Forward (-20) (aus dem TOPO-TA cloning-Kit (Clontech)) und Taq Polymerase (Boehringer Mannheim) sowie Taq Start™ Antibody (Clontech) durchgeführt. Die PCR Reaktionen wurden mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 30^" 96°C, 30^" 50°C, und 45^" 72°C (70 Zyklen).

Dadurch wurde ein DNA-Fragment mit einer Länge von insgesamt 660 bp erhalten. Dieseswurde wie in Beispiel 1 beschrieben kloniert und sequenziert. Das DNA- Fragment weist die Sequenz SEQ ID NO. 9 auf. Die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält den gesamten 5'-kodierenden Bereich.

Zusätzlich zu den bereits genannten Software-Modulen wurden für die Durchführung der rechnergestützten Sequenz-Analysen die GCG-Module Assemble, Map, Translate, Plotstructure und Pileup verwendet.

Tabelle 1 : SEQ ID NO. 9

(Partielle) Nukleotidsequenz des Angiotensin-Rezeptors 1 TCGTGTGTGA ACATCACAGG GTTTGTGGAT GCACTTAGAT GTTTGCAATG

51 AGCACTGTGG CTGGCATGCC CCAGTGTTTT GGATACCAAT GCATAGGACT

101 CCATAGTAAT CGAATTTACC AGAGGCGAAC GTCATGAGCA TAGTGATCCC

151 ATTGGGGGTT GATACAGCAG AGACGTCATA CTTGGAAATG GCTGCAGGTT

201 CAGAACCAGA ATCCGTAGAA GCTAGCCCTG TGGTAGTTGA GAAATCCAAC

251 AGTTATCCCC ACCAGTTATA TACCAGCAGC TCACATCATT CACACAGTTA

301 CATTGGTTTG CCCTATGCGG ACCATAATTA TGGTGCTCGT CCTCCTCCGA

351 CACCTCCGGC TTCCCCTCCT CCATCAGTCC TTATTAGCAA AAATGAAGTA

401 GGCATATTTA CCACTCCTAA TTTTGATGAA ACTTCCAGTG CTACTACAAT

451 CAGCACATCT GAGGATGGAA GTTATGGTAC TGATGTAACC AGGTGCATAT

501 GTGGTTTTAC ACATGATGAT GGATACATGA TCTGTTGTGA CAAATGCAGC

551 GTTTGGCAAC ATATTGACTG CATGGGGATT GATAGGCAGC ATATTCCTGA

601 TACATATCTA TGTGAACGTT GTCAGCCTAG GAATTTGGAT AAAGAGAGGG

651 CAGTGCTACT

Tabelle 2: SEQ ID NO. 10

(Partielle) Aminosäuresequenz des neuen Rezeptors

1 MSIVIPLGVDTAETSYLE AAGSEPESVEASPVVVEKSNSYPHQLYTSSS 51 HHSHSYIGLPYADHNYGARPPPTPPASPPPSVLISKNEVG IFTTPNFDET 101 SSATTISTSEDGSYGTDVTRCICGFTHDDGYMICCDKCSV WQHIDCMGID

151 RQHIPDTYLCERCQPRNLDKERAVL

Tabelle 3.: SEQ ID NO. 3

1 CTCCTCCATC AGTCCTTATT AGCAAAAATG AAGTAGGCAT ATTTACCACT

51 CCTAATTTTG ATGAAACTTC CAGTGCTACT ACAACCAGAG CGAG

Tabelle 4.: SEQ ID NO. 6

1 ATTGGGGGTT GATACAGCAG AGACGTCATA CTTGGAAATG GCTGCAGGTT

51 CAGAACCAGA ATCCGTAGAA GCTAGCCCTG TGGTAGTTGA GAAATCCAAC

101 AGTTATCCCC ACCAGTTATA TACCAGCAGC TCACATCATT CACACAGTTA

151 CATTGGTTTG CCCTATGCGG ACCATAATTA TGGTGCTCGT CCTCCTCCGA

201 CACCTCCGGC TTCCCCTCCT CCATCAGTCC TTATTAGCAA AAATGAAGTA

251 GGCATATTTA CCACTCCTAA TTTTGATGAA ACTTCCAGTG CTACTACAAT

301 CAGCACATCT GAGGATGGAA GTTATGGTAC TGATGTAACC AGGTGCATAT

351 GTGGTTTTAC ACATGATGAT GGATACATGA TCTGTTGTGA CAAATGCAGC

401 GTTTGGCAAC ATATTGACTG CATGGGGATT GATAGGCAGC ATATTCCTGA

451 TACATATCTA TGTGAACGTT GTCAGCCTAG GAATTTGGAT AAAGAGAGGG

501 CAGTGCTACT

Claims

Ansprüche:

1. Angiotensin-Rezeptor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Untereinheit aufweist, die die Aminosäuresquenz SEQ ID NO. 10 enthält.

2. Angiotensin-Rezeptor nach Anspruch 1 , wobei die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 10 gegebenenfalls am C-terminalen Ende weitere Aminosäuren aufweist.

3. Angiotensin-Rezeptor nach einem oder mehreren der Ansprüche Anspruch 1 und 2, wobei die Untereinheit, die die Sequenz SEQ ID NO. 10 enthält, eine Transmembrandomäne hat.

4. Angiotensin-Rezeptor nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Rezeptor Angiotensin 1-7 oder ein Derivat von Angiotensin 1 -7 bindet.

5. Angiotensin-Rezeptor nach einem oder mehreren der Ansprüchen 1 bis 4, wobei mindestens eine Untereinheiten des Rezeptors durch eine Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO. 9 kodiert wird und wobei die Sequenz SEQ ID NO. 9 am 3 ^'-Ende gegebenfalls weitere Nukleotide enthält, die zur kodierenden Sequenz gehören.

6. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO. 9, wobei Oligonukleotide, deren Sequenzen homologen Bereichen in den Nukleotidsequenzen der Angiotensin Rezeptoren AT1 und AT2 entsprechen, als Primer und cDNA, hergestellt aus Zellen, in dem AT1 und AT2 Rezeptoren nicht exprimiert werden, als Template in einer PCR Reaktion eingesetzt werden.

. Verfahren zur Herstellung eines Angiotensin-Rezeptors nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei eine Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in einen geeigneten Vektor integriert, der rekombinante Vektor in eine Zelle eingebracht und der Angiotensin-Rezeptor in dieser Zelle exprimiert wird.

8. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in einem Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Angiotensin- Rezeptors, wobei die Nukleinsäure, die unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors steht, in eine Zelle eingebracht und exprimiert wird.

9. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, in der der Angiotensin-Rezeptor exprimiert werden kann.

10. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, die mit einer Fehlregulation des Herz-Kreislauf Systems, des Elektrolythaushalts und/oder des Flüssigkeitshaushalts einhergehen.

11. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, zur Herstellung eines Arzneimittels, das in der Gentherapie eingesetzt werden kann.

12. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in einem Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Substanzen, die als Agonisten oder Antagonisten des Angiotensin-Rezeptors eingesetzt werden können.

3. Verwendung eines Angiotensin-Rezeptors nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 in einem Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Agonisten oder Antagonisten des Angiotensin- Rezeptors.

4. Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Agonisten oder Antagonisten des Angiotensin-Rezeptors, wobei eine Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist, in eine Zelle eingebracht und der Angiotensin-Rezeptor in dieser Zelle exprimiert wird, diese Zelle mit einer zu untersuchenden Substanz inkubiert und der Effekt dieser Substanz auf den Angiotensin-Rezeptor bestimmt wird.

5. Arzneimittel enthaltend eine Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist.

6. Rekombinante Zelle, dadurch hergestellt, daß eine Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO. 9 in diese Zelle eingebracht und exprimiert wird.