EP1086217A2 - Neuer angiotensin rezeptor, herstellung und verwendung desselben - Google Patents

Neuer angiotensin rezeptor, herstellung und verwendung desselben

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Publication number
EP1086217A2
EP1086217A2 EP99926305A EP99926305A EP1086217A2 EP 1086217 A2 EP1086217 A2 EP 1086217A2 EP 99926305 A EP99926305 A EP 99926305A EP 99926305 A EP99926305 A EP 99926305A EP 1086217 A2 EP1086217 A2 EP 1086217A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence seq
angiotensin receptor
nucleic acid
angiotensin
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99926305A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Holger Heitsch
Jörg-Peter Kleim
Günther Riess
Gertrud Sibenhorn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Deutschland GmbH filed Critical Aventis Pharma Deutschland GmbH
Publication of EP1086217A2 publication Critical patent/EP1086217A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the invention relates to a new angiotensin receptor, the production and use thereof.
  • the Renin Angiotensin System is significantly involved in the regulation of the cardiovascular system, the electrolyte and the fluid balance.
  • the physiologically effective effector hormones e.g. Angiotensin II (Angll) and Angiotensin 1-7 (Ang1-7) are produced by proteolytic cleavage of the precursor angiotensinogen synthesized in the liver or the angiotensin I formed therefrom.
  • a large number of proteases are involved in these cleavages (e.g. renin, angiotensin converting enzyme (ACE)).
  • AT1 and AT2 Two human angiotensin receptors have been described, designated AT1 and AT2. Both receptors belong to the angiotensin II (Ang ll) receptors, i.e. these receptors preferably bind Ang II.
  • Ang ll angiotensin II
  • the cDNA sequences of these two receptors (Takayanagi, R. et al. (1992). Biochemical and Biophysical Research Communications 183, 910-915; Tsuzuki, S. et al. (1994). Biochemical and Biophysical Research Communications 200, 1449-1454) each have seven hydrophobic areas, which represent potential transmembrane domains.
  • angiotensin receptors AT1 and AT2 belong to the family of 7-transmembrane receptors, which mediate the action of their ligand angiotensin II via signal transduction cascades coupled via intracellular G protein.
  • the present invention relates to a new angiotensin receptor which has at least one subunit which has the amino acid sequence SEQ ID NO. 10 contains, this amino acid sequence optionally having further amino acids at the C-terminal end.
  • the angiotensin receptor is a transmembrane receptor. In contrast to the angiotensin receptors described so far, it preferably has fewer than 7 transmembrane domains.
  • the transmembrane domain preferably has the sequence “MSIVIPL” (indicated in the one-letter code for amino acids).
  • the angiotensin receptor can have one or more subunits.
  • the receptor can be used either as a) monomer (a subunit that contains sequence SEQ ID NO. 10) or as b) dimer with an identical or another subunit or as c) tetramer with three further identical subunits or with an identical and two other subunits.
  • angiotensin receptor can also be present as a monomer (one subunit) or as a dimer (two different subunits) until the ligand is bound and only change to a dimeric or tetrameric form when the ligand is bound.
  • Receptors that have a similar structure to the new angiotensin receptor include the insulin receptor, growth factors such as nerve growth factor (NGF), endothelial growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), platelet derived growth factor (PDGF) , T-cell antigen receptors, haematopoietic cytokine receptors (eg IL1, IL5), and adhesion molecules (integrins, selectins).
  • the new angiotensin receptor can optionally be post-translationally modified, for example the receptor can be glycosylated and / or phosphorylated.
  • the angiotensin receptor can bind its ligand and mediate the action of this ligand or ligands intracellularly.
  • the angiotensin receptor can bind angiotensin 1-7 and / or a derivative of angiotensin 1-7.
  • Derivatives of angiotensin 1-7 are preferably truncated peptides derived from Ang1-7, e.g. Degradation products from Ang1 -7.
  • Examples of derivatives of Ang1-7 are angiotensin III and angiotensin IV.
  • the receptor preferably binds Ang 1-7.
  • the invention relates to a receptor which the amino acid sequence in Table 2, SEQ ID NO. 10 has or contains.
  • the angiotensin receptor or the subunit that has the sequence SEQ ID NO. 10 contains, has a length of at least 175 amino acids.
  • the invention furthermore relates to a nucleic acid which has a sequence which codes for the new angiotensin receptor (“receptor”).
  • the receptor can be coded in whole or in part by a nucleic acid which has the sequence SEQ ID NO. 9
  • a nucleic acid which codes for the receptor or a subunit of the receptor can have the sequence SEQ ID NO.9 and may have further nucleotides at the 3 ' end which belong to the coding sequence.
  • the nucleic acid can be, for example, a DNA, a cDNA or an RNA.
  • the nucleic acid can be a gene, in which case the sequence SEQ ID NO. 9 can be interrupted by non-coding sequences (introns).
  • the nucleic acid can optionally be derivatized.
  • a derivative of the nucleic acid can be, for example, a salt or a nucleic acid derivative which, in addition to the natural nucleotides, also contains modified nucleotides or is composed entirely of modified nucleotides.
  • the invention also relates to methods for producing a nucleic acid which codes for the angiotensin receptor and which has the sequence SEQ ID NO. 9 contains.
  • a nucleic acid can be amplified in a PCR in which oligonucleotides, the sequences of which correspond to homologous regions (conserved regions) in the nucleotide sequences of the angiotensin receptors AT1 and AT2, as primers and cDNA, which are preferably from a tissue (or cells), on which angiotensin 1-7 or a derivative thereof has an effect and / or is produced from tissue (or cells) in which AT1 and / or AT2 are not expressed.
  • degenerate primers are used, the sequences of which are derived from the homologous regions of the sequences of AT1 and AT2.
  • the primers Ang3A and Ang3B are preferably used.
  • cDNA made from endothelial cells can be used as a template.
  • cDNA made from HUVECs Human Umbilical Vein Endothelial Cells
  • the invention also relates to methods for producing the new receptor.
  • the new angiotensin receptor can be produced by a nucleic acid, the sequence of which codes for the angiotensin receptor and which preferably has the sequence SEQ ID NO. 9 contains, in a suitable vector integrated, the recombinant vector is introduced into a cell and the angiotensin receptor is expressed in this cell.
  • the invention further relates to the use of a nucleic acid which codes for the new angiotensin receptor and which preferably has the sequence SEQ ID NO. 9, for example in a method for producing a recombinant angiotensin receptor, the nucleic acid, which is under the control of a suitable promoter, being introduced into a cell and expressed.
  • the invention further relates to the use of a nucleic acid which codes for the new angiotensin receptor and which preferably has the sequence SEQ ID NO. 9 contains for the production of a recombinant cell in which the angiotensin receptor can be expressed.
  • the invention relates to a recombinant cell which has an angiotensin receptor with the sequence SEQ ID NO. 10 expressed.
  • the invention further relates to the use of a nucleic acid which codes for the angiotensin receptor and which preferably has the sequence SEQ ID NO. 9 contains, for the manufacture of a medicament for the treatment and prevention of diseases which are associated with an incorrect regulation of the cardiovascular system, the electrolyte balance or the fluid balance.
  • the invention relates to a medicament that a nucleic acid with the sequence ID NO. 9 contains.
  • the invention further relates to the use of a nucleic acid which codes for the angiotensin receptor and which preferably has the sequence SEQ ID NO. 9 contains, for the production of a transgenic animal which does not contain the corresponding angiotensin receptor gene or a transgenic animal which overexpresses the corresponding angiotensin receptor gene.
  • transgenic animals can be used to characterize the specificity and biochemical function of the angiotensin receptor.
  • the invention relates to a non-human transgenic animal that expresses the angiotensin receptor.
  • the invention further relates to the use of a nucleic acid which codes for the angiotensin receptor and which preferably has the sequence SEQ ID NO.
  • the invention contains, in methods for the identification and characterization of substances which can be used as antagonists and agonists of the angiotensin receptor and / or in methods in which substances are identified which inhibit or activate the functional expression of the encoded angiotensin receptor.
  • the invention relates to a method for identifying and characterizing agonists or antagonists of the angiotensin receptor, wherein a nucleic acid which has the sequence SEQ ID NO. 9, introduced into a cell and the angiotensin receptor is expressed in this cell, this cell is incubated with a substance to be examined and the effect of this substance on the angiotensin receptor is determined.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid which codes for the angiotensin receptor and which preferably has the sequence SEQ ID NO. 9 contains, in gene therapy or for the manufacture of a medicament that can be used in gene therapy.
  • the invention relates to the use of a nucleic acid which codes for the angiotensin receptor and which preferably has the SEQ ID NO. 9 contains as a tool in molecular biology (e.g. as a probe).
  • the invention also relates to the use of the new angiotensin receptor.
  • the angiotensin receptor can be used in methods for identifying and characterizing substances that can be used as agonists or antagonists of the receptor (e.g. binding assays and functional assays for screening).
  • angiotensin receptor or parts thereof can be, for example, an epitope which is identified, for example, by the amino acid sequence SEQ ID NO. 10 or a part the same is specified, for the production of antibodies by known methods (Harlow and Lane, "Antibodies-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN-0-87969-314-2) are used. In this way, antibodies are produced which are specific bind to the new angiotensin receptor can be used for the detection of the new receptor, eg in diagnostic methods and / or for further characterization of the receptor
  • oligonucleotides were synthesized whose sequences correspond to conserved regions of the sequences coding for AT1 / AT2 or which are directed against these conserved regions (Ang3A and Ang3B ). These oligonucleotides were used as a template in PCR reactions with cDNA from human HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cell). This cell line is derived from endothelial cells that line the blood vessels. These cells do not express AT1 or AT2 receptors.
  • a DNA fragment with an open reading frame and a previously not described nucleotide sequence (SEQ ID NO. 3) was amplified and identified. This nucleotide sequence showed no agreement with sequences in the databases EMBL or Genbank ® .
  • a sequence comparison with sequences in the Lifeseq® database using the program modules "Blast” and “Assembly” (GGC program package) revealed an overlap of SEQ ID NO. 3 with Lifeseq® clones No. 1458429, 3341232, 3440195, 1250818, 2836520, 1310286 and 1362205 (ESTs with no known function).
  • the theoretical 0.5 kbp DNA fragment to be derived from this virtual Contig- (3) was experimentally confirmed (Example 2, PCR with the pair of primers Ang4A and Ang4B).
  • the sequence of the DNA fragment with the open reading frame contained therein was extended by 5 ' (Example 3) to into the vector sequence (SEQ ID NO. 9).
  • the SEQ ID NO. 9 also contains or part of the 5 ' untranslated region.
  • SEQ ID NO. 9 encodes a protein with at least 175 amino acids (SEQ ID NO. 10).
  • a hydrophobicity analysis of this amino acid sequence using the GCG program showed that the sequence at the N-terminus has a hydrophobic domain with a length of about 7 amino acids. This hydrophobic domain can represent a transmembrane domain with which this new receptor is anchored in the membrane. In contrast, the sequence has a more or less hydrophilic domain at the C-terminus.
  • the oligonucleotide primers Ang3A and Ang3B were used, which include a 0.19 kbp DNA fragment - based on the AT1 / 2 receptor genes.
  • CDNA from a commercially available HUVEC cDNA bank (Stratagene Catalog No. 937223, Stratagene GmbH, Heidelberg) was used as template DNA.
  • PCR reaction 1 ⁇ g cDNA from the HUVEC Bank with recombinant Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase (Boehringer Mannheim, Germany) and 10 pmol primer Ang3A and Ang 3B each per 50 ⁇ l reaction mixture in a thermocycler (Perkin Elmer 2400 thermocycler, Perkin Elmer Applied Biosystems, Rothstadt).
  • the PCR reaction was carried out with the following temperature profile: 20 " at 96 ° C, 10 " at 38 ° C and 20 " at 72 ° C (60 cycles). A 130 base pair (bp) long DNA fragment was amplified.
  • This 130 bp DNA fragment was ligated into the vector pCR 2.1 TOPO® (Invitrogen BV, NV Leek, Netherlands) and transformed into E. coli ToplOF ' .
  • the sequence of the 130 bp DNA fragment present in pCR2.1 was determined using a capillary electrophoresis sequencer (ABI 310, Applied Biosystems, Rothstadt) (SEQ ID NO. 3).
  • sequence SEQ ID NO. 3 was created using the FASTA and TFASTA program modules (software package from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), USA) with the sequences found in the public domain Databases (eg EMBL, GenBank ® ) are compared. In addition, the sequence was used for a corresponding homology comparison with the sequences which are recorded in the Lifeseq® database from Incyte (Palo Alto, USA).
  • PCR reactions were carried out with 0.1 ⁇ g cDNA from the HUVEC Bank as a template and 10 pmol primers Ang4A and Ang4B per 50 ⁇ l reaction mixture, using the Advantage-cDNA polymerase mix (Clontech, Heidelberg). For the PCR reactions, the following temperature profile was used: 30 "94 ° C and 2 '30" 60 ° C (60 cycles). A 500 bp DNA fragment was obtained. This was cloned and sequenced as described in Example 1 (SEQ ID NO. 6). The sequence has an open reading frame (ORF).
  • the nucleotide sequence of Ang5A and Ang5B each corresponds to a part of the sequence of the 500bp DNA fragment. These two primers are used in further PCRs with the primers M13 Reverse and M13 Forward (-20).
  • the primers M13 Reverse and M13 Forward (-20) correspond to sequences of the Uni-ZAP bacteriophage vector used to produce the HUVEC cDNA library.
  • PCR reactions were carried out with 0.1 ⁇ g cDNA from the HUVEC Bank as a template and 10 pmol primer Ang5A or Ang5B and M13 Reverse or M13 Forward (-20) (from the TOPO-TA cloning kit (Clontech)) and Taq Polymerase (Boehringer Mannheim) and Taq Start TM Antibody (Clontech).
  • the PCR reactions were carried out with the following temperature profile: 30 " 96 ° C, 30 " 50 ° C, and 45 " 72 ° C (70 cycles).
  • the DNA fragment has the sequence SEQ ID NO. 9 on.
  • the sequence SEQ ID NO. 9 contains the entire 5 'coding area.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen neuen Angiotensin-Rezeptor, die Herstellung und Verwendung desselben. Der neue Angiotensin-Rezeptor hat mindestens eine Untereinheit, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 10 enthält.

Description

Beschreibung
Neuer Angiotensin Rezeptor, Herstellung und Verwendung desselben
Die Erfindung betrifft einen neuen Angiotensin Rezeptor, die Herstellung und Verwendung desselben.
Das Renin Angiotensin System ist wesentlich an der Regulation des Herz-Kreislauf- Systems, des Elektrolyt- und des Flüssigkeits-Haushalts beteiligt. Die physiologisch wirksamen Effektorhormone z.B. Angiotensin II (Angll) und Angiotensin 1-7 (Ang1-7) werden durch proteolytische Spaltung des in der Leber synthetisierten Precursers Angiotensinogen bzw. des daraus gebildeten Angiotensin I erzeugt. An diesen Spaltungen sind eine Vielzahl von Proteasen beteiligt (z.B. Renin, Angiotensin Converting Enzyme (ACE)).
Bisher wurden zwei menschliche Angiotensin Rezeptoren beschrieben, die mit AT1 und AT2 bezeichnet wurden. Beide Rezeptoren gehören zu den Angiotensin II (Ang ll)-Rezeptoren, d.h. diese Rezeptoren binden vorzugsweise Ang II. Die cDNA Sequenzen dieser beiden Rezeptoren (Takayanagi, R. et al. (1992). Biochemical and Biophysical Research Communications 183, 910-915; Tsuzuki, S. et al. (1994). Biochemical and Biophysical Research Communications 200, 1449-1454) weisen jeweils sieben hydrophobe Bereiche auf, die potentielle Transmembrandomänen darstellen. Aufgrund dieser charakteristischen Domänenstruktur wird angenommen, daß die Angiotensin-Rezeptoren AT1 und AT2 zur Familie der 7- Transmembranrezeptoren gehören, die die Wirkung ihres Liganden Angiotensin II über intrazelluläre G-Protein gekoppelte Signaltranduktionskaskaden vermitteln.
Aufgrund der pharmakologischen Effekte, die durch andere, von Angll verschiedene Angiotensine bzw. der von Angiotensin I bzw. II abgeleiteten Peptide (endogen gebildete Bruchstücke von Angl und Angll) vermittelt werden, wurde vermutet, daß weitere humane Angiotensin-Rezeptoren existieren. In diesem Zusammenhang wurde kürzlich ein Rezeptor für das Heptapeptid Ang1-7 gefordert (Ferrario, CM et al. (1997) Hypertension 30, 535-541 ).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neuer Angiotensin-Rezeptor, der mindestens eine Untereinheit aufweist, die die Aminosäuresquenz SEQ ID NO. 10 enthält, wobei diese Aminosäuresequenz gegebenenfalls am C-terminalen Ende weitere Aminosäuren aufweist.
Der Angiotensin-Rezeptor ist ein Transmembranrezeptor. Er weist, im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Angiotensin Rezeptoren vorzugsweise weniger als 7 Transmembrandomänen auf. Die Untereinheit, die die Sequenz SEQ ID NO. 10 enthält, weist vorzugsweise eine Transmembrandomäne auf. Diese Transmembrandomäne hat vorzugsweise eine Länge von mehr als 6, vorzugsweise 8 oder 9, besonders bevorzugt 7 Aminosäuren auf. Vorzugsweise hat die Transmembrandomäne die Sequenz „MSIVIPL" (angegeben im Einbuchstabencode für Aminosäuren).
Der Angiotensin-Rezeptor kann eine oder mehrere Untereinheiten aufweisen. Beispielsweise kann der Rezeptor entweder als a) Monomer (eine Untereinheit, die Sequenz SEQ ID NO. 10 enthält) oder als b) Dimer mit einer identischen oder einer anderen Untereinheit oder als c) Tetramer mit drei weiteren identischen Untereinheiten oder mit einer identischen und zwei anderen Untereinheiten vorliegen.
Der Angiotensin-Rezeptor kann aber auch bis zur Bindung des Liganden als Monomer (eine Untereinheit) bzw. als Dimer (zwei verschiedene Untereinheiten) vorliegen und erst durch die Bindung des Liganden in eine dimere bzw. tetramere Form übergehen. Rezeptoren, die eine ähnliche Struktur aufweisen wie der neue Angiotensin- Rezeptor, sind unter anderem der Insulinrezeptor, Wachstumsfaktoren wie nerve growth factor (NGF), endothelial growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), platelet derived growth factor (PDGF), T-Zellen Antigen- Rezeptoren, haematopoietische Cytokin-Rezeptoren (z.B. IL1 , IL5), und Adhesionsmoleküle (Integrine, Selektine).
Der neue Angiotensin-Rezeptor kann gegebenenfalls posttranslational modifiziert sein, beispielsweise kann der Rezeptor glykosyliert und/oder phosphoryliert sein.
Der Angiotensin-Rezeptor kann seinen bzw. seine Liganden binden und die Wirkung dieses Liganden bzw. dieser Liganden intrazellulär vermitteln. Der Angiotensin Rezeptor kann Angiotensin 1-7 und/oder ein Derivat von Angiotensin 1- 7 binden. Derivate von Angiotensin 1-7 sind vorzugsweise verkürzte Peptide, die sich von Ang1-7 ableiten, z.B. Abbauprodukte von Ang1 -7. Beispiele für Derivate von Ang1-7 sind Angiotensin III und Angiotensin IV. Vorzugsweise bindet der Rezeptor Ang 1-7.
Gegenstand der Erfindung ist ein Rezeptor, der die Aminosäuresequenz in Tabelle 2, SEQ ID NO. 10 aufweist bzw. enthält. Der Angiotensin-Rezeptor bzw. die Untereinheit, die die Sequenz SEQ ID NO. 10 enthält, hat eine Länge von mindestens 175 Aminosäuren.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Nukleinsäure, die eine Sequenz aufweist, die für den neuen Angiotensin-Rezeptor („Rezeptor") kodiert. Beispielsweise kann der Rezeptor ganz oder teilweise durch eine Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist, kodiert werden. Eine Nukleinsäure, die für den Rezeptor bzw. eine Untereinheit des Rezeptors kodiert kann die Sequenz SEQ ID NO. 9 erhalten und am 3'-Ende gegebenenfalls weitere Nukleotide aufweisen, die zur kodierenden Sequenz gehören. Die Nukleinsäure kann beispielsweise eine DNA, eine cDNA oder eine RNA sein. Die Nukleinsäure kann ein Gen sein, wobei dann die Sequenz SEQ ID NO. 9 durch nicht-kodierende Sequenzen (Introns) unterbrochen sein kann.
Die Nukleinsäure kann gegebenenfalls derivatisiert sein. Ein Derivat der Nukleinsäure kann beispielsweise ein Salz sein oder ein Nukleinsäure-Derivat, welches neben den natürlichen Nukleotiden auch modifizierte Nukleotide enthält bzw. vollständig aus modifizierten Nukleotiden aufgebaut ist.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält. Beispielsweise kann eine solche Nukleinsäure in einer PCR amplifiziert werden, in der Oligonukleotide, deren Sequenzen homologen Bereichen (konservierten Bereichen) in den Nukleotidsequenzen der Angiotensin Rezeptoren AT1 und AT2 entsprechen, als Primer und cDNA, die vorzugsweise aus einem Gewebe (bzw. Zellen), auf das Angiotensin 1-7 oder ein Derivat desselben eine Wirkung hat und/oder aus Gewebe (bzw. Zellen), in dem AT1 und/oder AT2 nicht exprimiert werden, hergestellt wird, eingesetzt werden. In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens werden degenerierte Primer eingesetzt, deren Sequenzen sich von den homologen Bereichen der Sequenzen von AT1 und AT2 ableiten. Vorzugsweise werden hierzu die Primer Ang3A und Ang3B verwendet. Als Template kann beispielsweise cDNA, hergestellt aus Endothelzellen verwendet werden. Beispielsweise kann cDNA hergestellt aus HUVECs (Human Umbilical Vein Endeothelial Cells) als Template eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung des neuen Rezeptors. Beispielsweise kann der neue Angiotensin-Rezeptor hergestellt werden, indem eine Nukleinsäure, deren Sequenz für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in einen geeigneten Vektor integriert, der rekombinante Vektor in eine Zelle eingebracht und der Angiotensin Rezeptor in dieser Zelle exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den neuen Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, beispielsweise in einem Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Angiotensin-Rezeptors, wobei die Nukleinsäure, die unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors steht in eine Zelle eingebracht und exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den neuen Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, in der der Angiotensin- Rezeptor exprimiert werden kann. Die Erfindung betrifft eine rekombinante Zelle, die einen Angiotensinrezeptor mit der Sequenz SEQ ID NO. 10 exprimiert. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prävention von Krankheiten, die mit einer Fehlregulation des Herz-Kreislauf Systems, des Elektrolythaushalts oder des Flüssigkeitshaushalts einhergehen. Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel, daß eine Nukleinsäure mit der Sequenz ID NO. 9 enthält.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, zur Herstellung eines transgenen Tieres, welches das entsprechende Angiotensin-Rezeptor Gen nicht enthält oder eines transgenen Tieres, welches das entsprechende Angiotensin-Rezeptor Gen überexprimiert. Transgene Tiere können beispielsweise zur Charakterisierung der Spezifität und biochemischen Funktion des Angiotensin-Rezeptors verwendet werden. Die Erfindung betrifft ein nichthumanes transgenes Tier, das den Angiotensin-Rezeptor exprimiert. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Substanzen, die als Antagonisten und Agonisten des Angiotensin-Rezeptors eingesetzt werden können und/oder in Verfahren, in denen Substanzen identifiziert werden, die die funktionelle Expression des kodierten Angiotensin-Rezeptors inhibieren oder aktivieren. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Agonisten oder Antagonisten des Angiotensin-Rezeptors wobei eine Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist, in einer Zelle eingebracht und der Angiotensin-Rezeptor in dieser Zelle exprimiert wird, diese Zelle mit einer zu untersuchenden Substanz inkubiert und der Effekt dieser Substanz auf den Angiotensin-Rezeptor bestimmt wird.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in der Gentherapie oder zur Herstellung eines Arzneimittels, das in der Gentherapie eingesetzt werden kann.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die SEQ ID NO. 9 enthält als Werkzeug in der Molokularbiologie (z.B. als Sonde).
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des neuen Angiotensin-Rezeptors. Beispielsweise kann der Angiotensin Rezeptor in Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Substanzen, die als Agonisten oder Antagonisten des Rezeptors eingesetzt werden können, verwendet werden (z.B. Bindungsassays und funktionelle Assays zum Screening).
Weiterhin kann der Angiotensin-Rezeptor oder Teile desselben z.B. ein Epitop, welches z.B. durch die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 10 bzw. einen Teil derselben vorgegeben wird, zur Herstellung von Antikörpern nach bekannten Verfahren (Harlow und Lane, „Antibodies-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN-0-87969-314-2) eingesetzt werden. Auf diese Weise hergestellt Antikörper, die spezifisch an den neuen Angiotensin-Rezeptor binden, können zum Nachweis des neuen Rezeptors, z.B. in diagnostischen Verfahren und/oder zur weiteren Charakterisierung des Rezeptors eingesetzt werden. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Zur Auffindung des neuen Rezeptors wurden ausgehend von den bekannten Sequenzen, die für die Angiotensin II Rezeptoren AT1 und AT2 kodieren, Oligonukleotide synthetisiert, deren Sequenzen konservierten Bereichen der AT1/AT2 kodierenden Sequenzen entsprechen bzw. die gegen diese konservierten Bereiche gerichtet sind (Ang3A und Ang3B). Diese Oligonukleotide wurden in PCR Reaktionen mit cDNA aus humanen HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) als Template eingesetzt. Diese Zellinie leitet sich von Endothelzellen ab, die die Blutgefäße auskleiden. Diese Zellen exprimieren keine AT1 bzw. AT2- Rezeptoren .
Es wurde ein DNA-Fragment mit einem offenen Leserahmen und einer bisher nicht beschriebenen Nukleotidsequenz (SEQ ID NO. 3) amplifiziert und identifiziert. Diese Nukleotidsequenz zeigte keine Übereinstimmung mit Sequenzen in den Datenbanken EMBL oder Genbank®. Ein Sequenzvergleich mit Sequenzen in der Lifeseq® Datenbank mit Hilfe der Programm-Module "Blast" und "Assembly" (GGC Programm Paket) ergab eine Überlappung von SEQ ID NO. 3 mit den Lifeseq®- Klonen Nr. 1458429, 3341232, 3440195, 1250818, 2836520, 1310286 und 1362205 (ESTs ohne bekannte Funktion). Das aus diesem virtuellen Contig-(3) abzuleitende theoretische 0,5 kbp DNA-Fragment wurde experimentell bestätigt (Beispiel 2, PCR mit dem Primerpaar Ang4A und Ang4B). Die Sequenz des DNA-Fragments mit dem darin enthaltenen offenen Leserahmen wurde durch 5'-Verlängerung (Beispiel 3) bis in die Vektorsequenz hinein aufgeklärt (SEQ ID NO. 9). Die SEQ ID NO. 9 enthält auch die 5'-nichttranslatierte Region bzw. einen Teil derselben.
Eine Analyse des 5'-Bereichs der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 9 zeigte, daß stromaufwärts vor dem angenommenen Start-Methionin-Triplet (ATG) an Position - 3 ein Purin-Nukleotid und an den Positionen -1 und -4 Cytosin-Nukleotide lokalisiert sind. Die Lokalisation dieser Nukleotide an den Positionen -1 , -3 und -4 entspricht der eukaryotischen Konsensussequenz für den mRNA-Translations- Initiationsstartpunkt.
Der offene Leserahmen in SEQ ID NO. 9 kodiert für ein Protein mit mindesten 175 Aminosäuren (SEQ ID NO. 10). Eine Hydrophobizitätsanalyse dieser Aminosäuresequenz mit Hilfe des GCG Programms zeigte, daß die Sequenz am N- Terminus eine hydrophobe Domäne mit einer Länge von etwa 7 Aminosäuren aufweist. Diese hydrophobe Domäne kann eine Transmembrandomäne darstellen, mit der dieser neue Rezeptor in der Membran verankert ist. Am C-Terminus weist die Sequenz dagegen eine mehr oder weniger hydrophile Domäne auf.
Beispiele:
Beispiel 1 :
Für die erste PCR wurden die Oligonukieotid-Primer Ang3A und Ang3B verwendet, die ein 0,19 kbp-DNA-Fragment - auf Basis der AT1/2-Rezeptorgene -einschließen. Als Template DNA wurde cDNA aus einer käuflichen HUVEC-cDNA-Bank (Stratagene Katalog Nr. 937223, Stratagene GmbH, Heidelberg) eingesetzt.
Nukleotidsequenz von Ang3A:
SEQ ID NO. 1 : 5'-TTG TKC TKK YCT TYW TCW TTT SCT GGM TTC CC -3' Nukleotidsequenz von Ang3B:
SEQ ID NO. 2: 5'-TTΥ CCM ASA AAR CMA TAM ÄRA ARM GGA TT -3'
wobei M = (A/C)
Y = (C/T)
R = (A/G)
S = (G/C)
K = (G/T
W = (A/T) bedeutet.
Für die PCR Reaktion wurden 1 μg cDNA aus der HUVEC Bank mit rekombinanter Thermus aquaticus (Taq) DNA Polymerase (Boehringer Mannheim, Deutschland) und je 10 pmol Primer Ang3A und Ang 3B pro 50 μl Reaktionsansatz in einem Thermocycler (Perkin Eimer 2400-Thermocycler, Perkin Eimer Applied Biosystems, Weiterstadt) inkubiert. Die PCR Reaktion wurde mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 20" bei 96°C, 10" bei 38°C und 20" bei 72°C (60 Zyklen). Es wurde ein 130 Basenpaare (bp) langes DNA-Fragment amplifiziert.
Dieses 130 bp DNA-Fragment wurde in den Vektor pCR 2.1 TOPO® (Invitrogen BV, NV Leek, Niederlande) ligiert und in E. coli ToplOF' transformiert. Die Sequenz des im pCR2.1 vorliegenden 130 bp DNA-Fragments wurde mit Hilfe eines Kapillarelektrophorese-Sequencers (ABI 310, Applied Biosystems, Weiterstadt) ermittelt (SEQ ID NO. 3).
Beispiel 2:
Die Sequenz SEQ ID NO. 3 wurde unter Verwendung der Programm-Module FASTA und TFASTA (Software-Paket der University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), USA) mit den Sequenzen, die in den öffentlich zugänglichen Datenbanken (z.B. EMBL, GenBank®) vorliegen, verglichen. Außerdem wurde die Sequenz für einen entsprechenden Homologievergleich mit den Sequenzen, die in der Lifeseq®-Datenbank der Fa. Incyte (Palo Alto, USA) erfaßt sind, eingesetzt.
In der Lifeseq®-Datenbank wurden Sequenzen von Expressed Sequence Tags (ESTs) identifiziert (Lifeseq®-Klone Nr. 1458429, 3341232, 3440195, 1250818, 2836520, 1310286 und 1362205), die mit SEQ ID NO. 3 überlappen. Ausgehend von einer Sequenz, die sich von einer Anordung der überlappenden Expressed Sequence Tags (ESTs) nach eigenem Assembly ableitet, wurden die Primer Ang4A und Ang4B synthetisiert. Nukleotidsequenz von Ang4A:
SEQ ID NO.4: 5'-TGG GGG TTG ATA CAG CAG AGA C -3'
Nukleotidsequenz von Ang4B:
SEQ ID NO. 5: 5'-GCA CTG CCC TCT CTT TAT CCA AA -3'
Es wurden PCR Reaktionen mit jeweils 0,1 μg cDNA aus der HUVEC Bank als Template und jeweils 10 pmol Primer Ang4A und Ang4B pro 50 μl Reaktionsansatz durchgeführt, wobei der Advantage-cDNA Polymerase Mix (Clontech, Heidelberg) verwendet wurde. Für die PCR Reaktionen wurde folgendes Temperaturprofil verwendet: 30" 94°C und 2'30" 60°C (60 Zyklen). Es wurde ein 500 bp langes DNA-Fragment erhalten. Dieses wurde wie in Beispiel 1 beschrieben kloniert und sequenziert (SEQ ID NO. 6). Die Sequenz weist einen offenen Leserahmen (Open Reading Frame (ORF)) auf.
Beispiel 3:
Um die Sequenz im 5' Bereich des 500 bp DNA-Fragments aufzuklären, wurden die Primer Ang5A und Ang5B synthetisiert. Nukleotidsequenz von Ang5A:
SEQ ID NO. 7: 5'-TGG GGA TTG ATA GGC AG-3*
Nukleotidsequenz von Ang5B:
SQ ID NO. 8: 5'-ATA ACT GTT GGA TTT CTC AA -3'
Die Nukleotidsequenz von Ang5A und Ang5B entspricht jeweils einem Teil der Sequenz des 500bp DNA-Fragments. Diese beiden Primer werden in weiteren PCRs mit den Primern M13 Reverse bzw. M13 Forward (-20) eingesetzt. Die Primer M13 Reverse und M13 Forward (-20) entsprechen Sequenzen des zur Herstellung der HUVEC-cDNA-Bank benutzten Uni-ZAP Bakteriophagen-Vektors. Diese PCR Reaktionen wurden mit je 0,1 μg cDNA aus der HUVEC Bank als Template und jeweils 10 pmol Primer Ang5A bzw. Ang5B und M13 Reverse bzw. M13 Forward (-20) (aus dem TOPO-TA cloning-Kit (Clontech)) und Taq Polymerase (Boehringer Mannheim) sowie Taq Start™ Antibody (Clontech) durchgeführt. Die PCR Reaktionen wurden mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 30" 96°C, 30" 50°C, und 45" 72°C (70 Zyklen).
Dadurch wurde ein DNA-Fragment mit einer Länge von insgesamt 660 bp erhalten. Dieseswurde wie in Beispiel 1 beschrieben kloniert und sequenziert. Das DNA- Fragment weist die Sequenz SEQ ID NO. 9 auf. Die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält den gesamten 5'-kodierenden Bereich.
Zusätzlich zu den bereits genannten Software-Modulen wurden für die Durchführung der rechnergestützten Sequenz-Analysen die GCG-Module Assemble, Map, Translate, Plotstructure und Pileup verwendet.
Tabelle 1 : SEQ ID NO. 9
(Partielle) Nukleotidsequenz des Angiotensin-Rezeptors 1 TCGTGTGTGA ACATCACAGG GTTTGTGGAT GCACTTAGAT GTTTGCAATG
51 AGCACTGTGG CTGGCATGCC CCAGTGTTTT GGATACCAAT GCATAGGACT
101 CCATAGTAAT CGAATTTACC AGAGGCGAAC GTCATGAGCA TAGTGATCCC
151 ATTGGGGGTT GATACAGCAG AGACGTCATA CTTGGAAATG GCTGCAGGTT
201 CAGAACCAGA ATCCGTAGAA GCTAGCCCTG TGGTAGTTGA GAAATCCAAC
251 AGTTATCCCC ACCAGTTATA TACCAGCAGC TCACATCATT CACACAGTTA
301 CATTGGTTTG CCCTATGCGG ACCATAATTA TGGTGCTCGT CCTCCTCCGA
351 CACCTCCGGC TTCCCCTCCT CCATCAGTCC TTATTAGCAA AAATGAAGTA
401 GGCATATTTA CCACTCCTAA TTTTGATGAA ACTTCCAGTG CTACTACAAT
451 CAGCACATCT GAGGATGGAA GTTATGGTAC TGATGTAACC AGGTGCATAT
501 GTGGTTTTAC ACATGATGAT GGATACATGA TCTGTTGTGA CAAATGCAGC
551 GTTTGGCAAC ATATTGACTG CATGGGGATT GATAGGCAGC ATATTCCTGA
601 TACATATCTA TGTGAACGTT GTCAGCCTAG GAATTTGGAT AAAGAGAGGG
651 CAGTGCTACT
Tabelle 2: SEQ ID NO. 10
(Partielle) Aminosäuresequenz des neuen Rezeptors
1 MSIVIPLGVDTAETSYLE AAGSEPESVEASPVVVEKSNSYPHQLYTSSS 51 HHSHSYIGLPYADHNYGARPPPTPPASPPPSVLISKNEVG IFTTPNFDET 101 SSATTISTSEDGSYGTDVTRCICGFTHDDGYMICCDKCSV WQHIDCMGID
151 RQHIPDTYLCERCQPRNLDKERAVL
Tabelle 3.: SEQ ID NO. 3
1 CTCCTCCATC AGTCCTTATT AGCAAAAATG AAGTAGGCAT ATTTACCACT
51 CCTAATTTTG ATGAAACTTC CAGTGCTACT ACAACCAGAG CGAG
Tabelle 4.: SEQ ID NO. 6
1 ATTGGGGGTT GATACAGCAG AGACGTCATA CTTGGAAATG GCTGCAGGTT
51 CAGAACCAGA ATCCGTAGAA GCTAGCCCTG TGGTAGTTGA GAAATCCAAC
101 AGTTATCCCC ACCAGTTATA TACCAGCAGC TCACATCATT CACACAGTTA
151 CATTGGTTTG CCCTATGCGG ACCATAATTA TGGTGCTCGT CCTCCTCCGA
201 CACCTCCGGC TTCCCCTCCT CCATCAGTCC TTATTAGCAA AAATGAAGTA
251 GGCATATTTA CCACTCCTAA TTTTGATGAA ACTTCCAGTG CTACTACAAT
301 CAGCACATCT GAGGATGGAA GTTATGGTAC TGATGTAACC AGGTGCATAT
351 GTGGTTTTAC ACATGATGAT GGATACATGA TCTGTTGTGA CAAATGCAGC
401 GTTTGGCAAC ATATTGACTG CATGGGGATT GATAGGCAGC ATATTCCTGA
451 TACATATCTA TGTGAACGTT GTCAGCCTAG GAATTTGGAT AAAGAGAGGG
501 CAGTGCTACT

Claims

Ansprüche:
1. Angiotensin-Rezeptor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Untereinheit aufweist, die die Aminosäuresquenz SEQ ID NO. 10 enthält.
2. Angiotensin-Rezeptor nach Anspruch 1 , wobei die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 10 gegebenenfalls am C-terminalen Ende weitere Aminosäuren aufweist.
3. Angiotensin-Rezeptor nach einem oder mehreren der Ansprüche Anspruch 1 und 2, wobei die Untereinheit, die die Sequenz SEQ ID NO. 10 enthält, eine Transmembrandomäne hat.
4. Angiotensin-Rezeptor nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Rezeptor Angiotensin 1-7 oder ein Derivat von Angiotensin 1 -7 bindet.
5. Angiotensin-Rezeptor nach einem oder mehreren der Ansprüchen 1 bis 4, wobei mindestens eine Untereinheiten des Rezeptors durch eine Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO. 9 kodiert wird und wobei die Sequenz SEQ ID NO. 9 am 3 '-Ende gegebenfalls weitere Nukleotide enthält, die zur kodierenden Sequenz gehören.
6. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO. 9, wobei Oligonukleotide, deren Sequenzen homologen Bereichen in den Nukleotidsequenzen der Angiotensin Rezeptoren AT1 und AT2 entsprechen, als Primer und cDNA, hergestellt aus Zellen, in dem AT1 und AT2 Rezeptoren nicht exprimiert werden, als Template in einer PCR Reaktion eingesetzt werden.
. Verfahren zur Herstellung eines Angiotensin-Rezeptors nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei eine Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in einen geeigneten Vektor integriert, der rekombinante Vektor in eine Zelle eingebracht und der Angiotensin-Rezeptor in dieser Zelle exprimiert wird.
8. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in einem Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Angiotensin- Rezeptors, wobei die Nukleinsäure, die unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors steht, in eine Zelle eingebracht und exprimiert wird.
9. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, in der der Angiotensin-Rezeptor exprimiert werden kann.
10. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, die mit einer Fehlregulation des Herz-Kreislauf Systems, des Elektrolythaushalts und/oder des Flüssigkeitshaushalts einhergehen.
11. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, zur Herstellung eines Arzneimittels, das in der Gentherapie eingesetzt werden kann.
12. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in einem Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Substanzen, die als Agonisten oder Antagonisten des Angiotensin-Rezeptors eingesetzt werden können.
3. Verwendung eines Angiotensin-Rezeptors nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 in einem Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Agonisten oder Antagonisten des Angiotensin- Rezeptors.
4. Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Agonisten oder Antagonisten des Angiotensin-Rezeptors, wobei eine Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist, in eine Zelle eingebracht und der Angiotensin-Rezeptor in dieser Zelle exprimiert wird, diese Zelle mit einer zu untersuchenden Substanz inkubiert und der Effekt dieser Substanz auf den Angiotensin-Rezeptor bestimmt wird.
5. Arzneimittel enthaltend eine Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist.
6. Rekombinante Zelle, dadurch hergestellt, daß eine Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO. 9 in diese Zelle eingebracht und exprimiert wird.
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