WO1999043325A1

WO1999043325A1 - Remedes preventifs ou therapeutiques contre les maladies associees a une anomalie fonctionnelle vasculaire en relation avec la resistance a l'insuline

Info

Publication number: WO1999043325A1
Application number: PCT/JP1999/000917
Authority: WO
Inventors: Atsunori Kashiwagi; Kazuya Shinozaki; Yoshihiko Nishio; Tomio Okamura; Noboru Toda; Ryuichi Kikkawa
Original assignee: Suntory Limited
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 1999-09-02
Also published as: DK0983765T3; EP0983765A1; EP0983765A4; EP0983765B1; PT983765E; ES2272052T3; ATE340575T1; US6410535B1; JP4306825B2; DE69933347D1; DE69933347T2; JPH11246410A; US20020082261A1

Description

明細書インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患の予防または治療剤発明の分野

本発明は、式（I) ：

[式中、 R¹および R²は、それぞれ水素原子を表すか、または一緒になつて単結合を表し、 R¹および R²が水素原子を表す場合には、 R³は一 CH (OH) CH (OH) CH₃、一 CH (OCOCHs) CH (OCOCHa) CH₃、一 CH₃、一 CH₂OH又はフエ二ル基を表し、 R¹および R²がー緒になって単結合を表す場合には、 R³は— COCH (OH) CH₃を表す]

で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患を予防および/または治療するための薬剤に関する。

発明の背景

インスリン抵抗性は、 2型糖尿病患者に観察される病態で、典型的には高インスリン状態下でも血糖値の下がらない状態または症状である。さらに近年、耐糖能異常、肥満、高血圧、高脂血症が 1個体に重複している病態が報告され、インスリン抵抗性症候群、シンドローム X、内臓脂肪症候群と名付けられている。これらの病態の基盤にはインスリン抵抗性が存在し、各種動脈硬化性疾患の危険因子となることが大規模な疫学的研究により明らかにされており、その病態の解明と予防が重要な臨床的課題となっている。

本発明者らは、血管内皮機能障害ならびにその進展した病態である動脈硬化形成過程、各種動脈硬化性疾患においてィンスリン抵抗性が果たす役割について臨床的に検討してきた。糖尿病以外の疾患、例えば非糖尿病の冠攣縮性狭心症例、においても、他の危険因子とは独立した著明な高インスリン血症、即ちインスリン抵抗性を認めることを初めて見出した（S h i n 0 z a k i , K e t a 1 , C i r c u l a t i on 1 995， 92 : 1749— 1757) 。また、労作性狭心症や脳血管撮影で有意狭窄性病変を伴う症例でも著明なィンスリンの抵抗性の存在を明らかにした（S h i n o z a k i , K e t a 1 , D i a b e t e s C a r e 1 996, 1 9 : l - 7 ; S h i n o z a k i , K e t a 1， S t r o k e 1996, 27 : 37— 43) 。さらに、 i n v i v oでのインスリン抵抗性と初期動脈硬化の存在も明らかにした（S h i n 0 z a k i , K e t a l , A r t e r i o s c l e r. Th r omb. Va s e. B i o 1. , 1 997, 17 : 3302 33 10) 。

一方、血管内皮は血管トーヌスゃ血栓の形成に重要な役割を果たす場であることが知られていたが、 1 980年に初めて内皮由来弛緩因子（e n d o t h e 1 i um— d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r : EDRF) の存在が報告された。その後、 1987年に EDRFの本体が一酸化窒素（NO) であることが証明された。 NOはガス状ラジカルであり、細胞膜を簡単に通り抜け、循環制御、神経伝達、血小板凝集阻止、殺菌あるいは抗ガン作用など極めて多彩な作用を示すことが明らかにされつつある。 NOは、ヘム酵素や SH酵素群などど反応して代謝を制御するのみならず、スーパーォキシド（〇₂— ) を初めとする活性酸素種、生体チオール、ァスコルビン酸などとクロストークしながら生理機能と病理活性を発揮している。しかしながら、これらの分子種はいずれも不安定なため、生体内でのその分子論的実体はなお不明な点が多い。

上述したように多彩な作用を有する NOは、 L一アルギニンが酸化され、 N^c— ヒドロキシルー L一アルギニンから L—シトルリンになる際に産生され、その反応は N〇合成酵素（NO s yn t h a s e : N〇S) という酵素によって触媒される。 NOSは、血管内皮、神経系、腎臓、血小板、心筋、平滑筋など幅広く存在し、既にその遺伝子がクロ一ニングされ、構造解析が行われている。その結果、 NOS遺伝子には補酵素として、カルモジュリン（C aM) 、フラビン、 NAD PHの結合部位に加えて、本発明の有効成分である式（ I) の化合物に含まれる、 (6 R)— L—エリス口一 5， 6， 7， 8—テトラヒドロピオプテリン（以下、「BH4」という）の結合部位が存在することが判明した。さらに、 BH4が実際に NO Sの機能制御に関与することも示唆されている。

本発明者らは、インスリン抵抗性状態では活性酸素種の産生亢進によって、血管トーヌスの異常及び血管内皮細胞障害をきたしているのではないか、との仮説をたて、高インスリン状態が i n v i v oでスーパーォキシド生成に及ぼす影響と共に、内皮依存性血管弛緩能に及ぼす影響について検討した。その結果、外部からインスリンを投与した外因性の高ィンスリン状態では、血管内皮での NO Sの活性化を生じ、結果として血管弛緩能は保たれるが、インスリン抵抗性状態では何らかの機構により NO Sの活性化が障害されていることがわかった。よつて、ィンスリン抵抗性状態では NOの低下により相対的に血管壁でのスーパ一ォキシド過剰効果が生じることにより、動脈硬化促進及び血管収縮性の宂進をきたすのでは、と考えられる（S h i n o z a k i , K. ， Ka s h iwa g i , A. e t a 1. ： S u p e r ox i d e an i on i mp a i r e s e n d t h e l i um— d e p e nd e n t v a s c u l a r r e l ax a t i on i n i n s u l i n r e s i s t an t r a t a o r t a s . J a . J. P h a rma c o 1 o gy 75 ( 1 997) s u p p l . 1， l l p) 。

このように、ィンスリン抵抗性状態と血管内皮障害との関連性を示唆するような結果が得られるようになつてきた。しかしながら、インスリン抵抗性に起因する血管機能異常を改善し、それに関連した種々の疾患を予防または治療するための薬剤については、種々の検討がなされ、チアゾリジンジオン誘導体がその候補薬剤として挙げられているが、未だ確実な結論には至っていない（L aw, R. E . e t a 1. , T r o g l i t a z on e i nh i b i t s v a s c u 1 a r smo o t h mu s c l e c e l l g r owt h and i n t ima 1 hyp e r p l a s i a, J. C l i n. I nv e s t . 98 : 1897, 1996) 。

また、近年、種々の血管疾患についての分子レベルからの究明により、内皮細胞をはじめとする血管を治療の場とする治療戦略が考えられており、そこでの E DRFの本体である N Oの産生制御、あるいは抗酸化作用を有する物質の適用が最も期待される治療法のひとつであることが提唱されている（G i b b o n s, G. H. , D z au V. J. S c i e n c e. Vo l . 272, 689-693, 1996年）。例えば、経皮経管冠動脈形成術（PTCA) や冠動脈バイパス術 (CABG) 後に惹起することが知られている酸化作用を有する代謝物質による冠動脈再狭窄に対し、ビタミン E類ゃプロブコール等の抗酸化作用を有する物質が酸化的ストレスに対抗するものとして期待され（T a r d i f J . C. e t a 1. : N . En g. J . Me d. 1 997, 337 : 365— 372) 、また、狭心症の治療に外因性の NO供与剤としてニトログリセリン製剤などの硝酸剤が使用されているが、未だこの治療戦略を満足する薬剤や治療法は確立していない。

また、治療の目的はインスリン抵抗性に起因する血管系の合併症を予防して患者の生命を延長し、かつ充実した生活を送らせることにある。このためには生涯にわたる長期的な管理が必要であり、薬物療法が長期間にわたって行われることとなる。上述したようにインスリン抵抗性の治療薬としては、様々な検討がなされているが、副作用や長期連用の安全性、また、 Q〇L (q u a l i t y o f l i f e) の改善といった点で、まだ全てを充分に満たした薬剤は存在しないというのが現状である。よって、真に望ましい条件を備えた治療薬の開発が切望されている。

なお、本発明の治療剤の有効成分である式（ I) の化合物は公知化合物であり、悪性高フエ二ルァラニン血症、うつ病、パーキンソン病、その他の治療薬としての用途が知られている。例えば、特開昭 59 - 25323号公報、同 59— 76 086号公報、同 6 1— 277618号公報、同 63— 267781号公報を参昭。

発明の概要

本発明は、インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患に対し、その病態の進展を抑制し、諸合併症の進展を抑制し、患者の日常生活の質を高めるベく、副作用がなく安全な治療剤を提供することを目的とする。

本発明者らはインスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患の治療に対し、活性酸素種の産生亢進および NO産生低下の双方を制御し、正常化ならしめればィンスリン抵抗性状態に因る内皮機能障害を改善できるのではないかとの仮説をたてた。そして、内皮依存性血管弛緩反応の改善を指標に鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに NOSの補酵素である BH4がィンスリン抵抗性状態での内因性 NOの産生低下を抑制するとともに、活性酸素種の産生亢進を抑制し、内皮依存性血管弛緩反応の低下を有意に改善することを認め、 B H 4のインスリン抵抗性状態における血管機能異常改善作用を見出し、本発明を完成するに至った本発明は、 BH4類製剤による、インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患の効果的な治療に関するものである。

発明の詳細な説明

本発明は、式（ I) ：

[式中、 1^ぉょび1^²は、それぞれ水素原子を表すか、または一緒になつて単結合を表し、 R¹および R²が水素原子を表す場合には、 R³は— CH (OH) CH

(OH) CH₃、一 CH (OCOCH3) CH (OCOCHa) CH₃、 — CH₃、 - CH₂OH又はフエ二ル基を表し、 R¹および R²がー緒になつて単結合を表す場合には、 R³は一 COCH (OH) CH₃を表す]

で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ィンスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患を予防または治療するための薬剤である。

本明細書において、インスリン抵抗性とは、一定の分泌されるインスリンによる末梢糖利用の亢進が減弱し、一方、肝臓より放出されるグルコース量の抑制が減弱して耐糖能異常が誘導される他、インスリンによる脂肪分解の抑制も減弱している病態である。特徴的には高インスリン血症を伴う場合が多いが、高インスリン血症は必須の現象ではない。また、インスリン感受性細胞だけでなく、血管壁細胞でもインスリン抵抗性が存在することが、報告されている。インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患とは、インスリン抵抗性が原因となって発症する疾患、インスリン抵抗性が症状を悪化させる疾患、インスリン抵抗性が治癒を遅らせる疾患等を含む。例えば高血圧、高脂血症、動脈硬化、冠攣縮性狭心症、労作性狭心症、脳血管狭窄性病変、脳循環不全、脳血管攣縮、末梢循環障害、経皮経管冠動脈形成術（PTCA) または冠動脈バイパス術（CABG) 後の冠動脈再狭窄、肥満、インスリン非依存型糖尿病、高インスリン血症、脂質代謝異常、冠動脈硬化性心疾患などにおいて、インスリン抵抗性が関与する場合が挙げられる。

BH4は、これらの疾患を有する患者に投与されたとき、体内での NO Sの機能を賦活し、 NO産生を亢進するとともに活性酸素種の産生を抑制して、血管内皮細胞障害の改善によりこれらの疾患を予防または治療することができる。したがって、本発明の治療または予防対象は、血管トーヌスの異常や内皮機能障害を有する血管機能異常に関与するィンスリン抵抗性の疾患である。

本発明の有効成分である式（I) で表される化合物には次のものおよびそれらの薬学的に許容される塩が含まれる：

(6 R) 一 L—エリス口一 5, 6, 7, 8—テトラヒドロピオプテリン（BH

4)

(6 R, S) 一 5, 6， 7, 8—テトラヒドロピオプテリン

Γ, 2'—ジァセチルー 5, 6, 7, 8—テトラヒドロピオプテリン

セピアプテリン

6—メチルー 5, 6, 7， 8—テトラヒドロプテリン

6—ヒドロキシメチル一 5, 6， 7, 8—テトラヒドロプテリン

6—フエニル一 5， 6, 7， 8—テトラヒドロプテリン

以上の化合物で、好ましい化合物は 5， 6， 7， 8—テトラヒドロビォプテリン類又はその塩であり、更にそのうちでも最も好ましい化合物は BH 4又はその塩である。

本発明で有効成分として使用する式（ I ) で表される化合物は公知化合物である。例えば、特開昭 59 - 2 5 32 3号公報、同 59— 7 6086号公報、同 6 1 - 2 7 7 6 1 8号公報、同 6 3— 2 6 7 7 8 1号公報参照。これらは適当な塩として用いてもよく、そのような塩としては薬理的に無毒性の酸、例えば、塩酸、リン酸、硫酸、ホウ酸等の鉱酸、及び、酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマル酸、メシル酸等の有機酸との塩が例示される。

本発明の薬剤は前記した疾患に有効である。例えば、限定されるわけではないが、インスリン抵抗性が関与する高血圧、高脂血症、動脈硬化、冠攣縮性狭心症、労作性狭心症、脳血管狭窄性病変、脳循環不全、脳血管攣縮、末梢循環障害、経皮経管冠動脈形成術（P T C A) または冠動脈バイパス術（C A B G) 後の冠動脈再狭窄、肥満、インスリン非依存型糖尿病、高インスリン血症、脂質代謝異常、冠動脈硬化性心疾患などの疾患に有効である。

本発明の治療剤は、式（ I ) で表される化合物を一般の医薬製剤に用いられる担体と、常法によって経口、直腸又は非経腸（静脈内、髄液中への投与を含む）投与に適する製剤形態にすることにより製造される。

これら医薬製剤に用いられる担体としては、用いられる剤形によるが、一般的に賦形剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。

賦形剤の代表的な例としては澱粉、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、セルロース等があり、結合剤としてはポリビニルピロリドン、澱粉、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴムなどがある。又、崩壊剤の例としてはデンプン、寒天、ゼラチン末、セルロース、 C M Cなどがあるが、一般に用いられている賦形剤、結合剤、崩壊剤であればこれら以外でもよい。

本発明の治療剤は、好ましくは上記担体以外に、有効成分を安定化するための酸化防止剤を含有する。酸化防止剤は医薬製剤に一般に使用されているものから適宜選択され、例えば、ァスコルビン酸、 N—ァセチルシスティン、 L—システイン、 d 1 —ひ—トコフエロール、天然トコフエロール等があげられる。使用する量は、活性成分（1種またはそれ以上）を安定化させる量であればよいが、一般的には活性成分 1に対し重量で 0 . 2ないし 2 . 0が好ましい。

経口投与に適する本発明の製剤は各々所定量の活性成分（1種またはそれ以上）を含有する錠剤、舌下錠、カプセル剤、粉末、散剤、顆粒剤もしくは細粒剤として、またはシロップ、ェマルジヨン若しくは頓服剤のような非水性液中の懸濁液として提供できる。

例えば、顆粒剤は、活性成分（1種またはそれ以上）と 1種またはそれ以上の前記担体、酸化防止剤等の補助成分を均一に混合して造粒し、ふるいを用いてメッシュをそろえることにより提供される。錠剤は、活性成分（1種またはそれ以上）を、場合により 1種またはそれ以上の補助成分と共に、圧縮または成形により製造できる。カプセル剤は、活性成分（1種またはそれ以上）を、場合により 1種またはそれ以上の補助成分と均一に混合した粉末または顆粒を適当なカプセルに充填機等を用いて充填して製造する。直腸投与用の製剤は、カカオ脂などの慣用の担体を使用し、座薬として提供できる。非経腸投与用製剤は、殺菌窒素浄化容器中に活性成分（1種またはそれ以上）を乾燥固体として密封して提供できる。この乾燥固体製剤は非経腸投与時に、所定量の無菌水に分散もしくは溶解して患者に投与することができる。

これらの製剤の製造においては、有効成分及び通常の担体の他に前述の酸化防止剤を加えて製剤することが好ましく、又所望により緩衝剤、風味付与剤、表活性剤、増粘剤、潤滑剤、滑沢剤等から選ばれる 1種またはそれ以上の補助成分をさらに含有してもよい。

活性成分、すなわち、式（ I ) で表される化合物の投与量は投与経路、処置される症状、および処置を受ける患者によって変わることは勿論のことであるが、最終的には医師の判断にまかせられる。

例えば、インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患を処置するのに適当な投与量は、投与の目的、対象者の年齢、体重、状態等により異なるが、経口投与の場合、 0 . l〜5 0 m g / k g (体重） Z日の範囲にあり、代表的な好適投与量は 0 . 5〜： L 0 m g / k g (体重） Z日である。

所望の投与量は上記の活性成分を 1日 1回投与してもよいが、 1日中の適当な間隔で 2〜4回分割投与してもよい。

活性成分は単独で、そのまま他の成分と混合せずに投与することもできるが、投与量の調節を容易にするため等の理由から適用疾患に応じた他の活性成分を医薬製剤として投与することもできる。

また、本発明の製剤は、有効成分として式（ I ) で表される化合物と共に、 N O Sの基質または補酵素もしくは補因子の、例えば L—アルギニン、 (例えば、 FAD、 FMN等）およびカルシウムよりなる群から選ばれる少なくとも 1種を補助的有効成分として含有してもよい。これら、有効成分の混合により、式（ I) で表される化合物の単独使用に比べて、一層優れた治療効果を期待できる。本発明製剤中における上記各成分の比率は特に限定されないが、例えば、重量で式（ I ) で表される化合物の 1に対して、 L—アルギニン、フラビン類およびカルシウムよりなる群から選ばれる少なくとも 1種を 0. 1〜 1 0の範囲、好ましくは 0. 5〜2の範囲とすることができる。

この混合製剤により、例えばィンスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患を治療する際の適当な投与量は、投与の目的、対象者の年齢、体重、状態等により異なるが、経口投与の場合、有効成分の合計量として 0. l〜50mgノ k g (体重） /日の範囲にあり、好ましくは 0. 5〜； L OmgZk g (体重） / 日である。

治療に当たり、式（ I ) で表される化合物を単独で有効成分として含む製剤および他の有効成分とともに含む製剤の選択は、年齢、症状等に応じて医師により適宜選択される。

本発明に用いられる活性成分は、（6 R) —L—エリスロー 5， 6， 7， 8— テトラヒドロピオプテリン（BH4) およびその塩が最も好ましいが、（6 R, S) - 5, 6， 7， 8—テトラヒドロピオプテリン、 , 2 '—ジァセチルー 5， 6, 7, 8—テトラヒドロピオプテリン、セピアプテリン、 6—メチル一 5, 6， 7, 8—テトラヒドロプテリン、 6—ヒドロキシメチルー 5， 6, 7， 8—テトラヒドロプテリンまたは 6—フエ二ルー 5， 6, 7, 8—テトラヒドロプテリンおよびそれらの塩等の類似化合物でもよい。しかし、生体内に存在する天然体である BH4が好ましいことは言うまでもない。この B.H4 · 2塩酸塩のラットに対する急性毒性は経口投与で 2 g/k g (体重）以上であり、ほとんど毒性は見い出されない。また、光学活性体でない（6 R, S) — 5， 6， 7， 8—テトラヒドロビォプテリンも、特開昭 59 - 25 323号公報におけるパーキンソン病の治療にも見られるように毒性は弱く、本発明の治療に用いられることは可能である。これら以外の式（ I ) に属する化合物も、急性毒性は殆ど見いだされない。以下の実施例に従ってさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。実施例

実施例 1 (顆粒剤、細粒剤）

ポリビニルピロリドン（コリドン 30) 1部（重量部）を滅菌精製水に溶かし、これにァスコルビン酸 1 0部および L—システィン ·塩酸塩 5部を加え均一な溶液とした後、 BH4 · 2塩酸塩 1 0部を加え均一とした。

この溶液を賦形剤（マンニトールまたは乳糖） 5 9部および崩壊剤 [コーンスターチまたはヒドロキシプロピルセルロース（LH— 22) ] 1 5部に加え、練合、造粒、乾燥した後、篩別した。

実施例 2 (錠剤）

実施例 1で作った活性成分の均一溶液に乳糖 58部、微結晶セルロース 1 5部を混合したのち、さらにステアリン酸マグネシウム 1部を加え混合し打錠した。実施例 3 (カプセル剤）

実施例 1で作成した剤形のものをカプセルに充填した。但し滑沢剤としてステァリン酸マグネシウムを 0. 2 %添加して製剤したものを用いた。

実施例 4 (注射用剤）

BH4 - 2塩酸塩 1.5g

ァスコルビン酸 1.5g

L—システィン '塩酸塩 0.5g

マンニトール 6.5g

上記成分を滅菌精製水に溶かし、 1 00m 1 とし除菌したものを、 1m l又は 2 m 1ずつバイアル又はアンプルにとり凍結乾燥密封した。

実施例 5 (注射用剤）

BH4 · 2塩酸塩 2. 0 gを無酸素で滅菌精製水に溶かし、 1 0 Om l とした溶液を、除菌し、実施例 4と同様に密封した。

実施例 6 (座薬用剤）

BH4 - 2塩酸塩 150部ァスコルビン酸 150部

L—システィン ·塩酸塩 50部

上記成分を用い、均一な粉末にしたものをカカオ脂 9950部に分散させた。実施例 7 (顆粒剤）

BH4 · 2塩酸塩 5部

ァスコルビン酸 5部

L—システィン ·塩酸塩 2部

上記成分を用いて均一な溶液とした。

一方マンニトール 55部、ポリビニルピロリドン 1部、ヒドロキシプロピルセルロース 14部、ならびに L—アルギニンもしくはカルシウム 5部を均一に混合したものに上記の溶液を加え、練合、造粒、乾燥した後、篩別した。

実施例 8 (顆粒剤）

BH4 · 2塩酸塩 5部

ァスコルビン酸 5部

L—システィン '塩酸塩 5部

マンニトール 52部

ポリビニルピロリドン（コリドン 30 ) 1部

ヒドロキシプロピルセルロース（LH— 22)

12部

L—アルギニンまたはカルシウム 10部

上記成分を用い実施例 7と同様に造粒し、篩別した。

実施例 9 (顆粒剤）

BH4 · 2塩酸塩 5部

ァスコルビン酸 5部

L—システィン '塩酸塩 2部

上記成分を使用し均一溶液とした。

一方、 L—アルギニンまたはカルシウム 10部、マンニトール 50部、ポリビニルピロリドン（コリドン 30) 1部およびヒドロキシプロピルセルロース（L H- 22) 9部を均一に混合したものに上記溶液を練合、造粒、乾燥した後、篩別した。

実施例 10

の S p r a gu e— D aw l e yラット (1 50 g、 Ch a r l e s R i v e rから入手）を用い、 Hwan gら（Hwan g, I— H. e t a 1. , H yp e r t e n s i on 10 : 5 12, 1987) に記載された方法に従い、フルクト一ス食負荷によりインスリン抵抗性を伴うモデル群（以下、「FR群」とレう) を作成した (ィンスリンペレツト、 L i n s h i n C an a d a I n c. 社製、オンタリオ、カナダ）。また、スターチ食で飼育した対照群（以下、「C TR群」という）を作成した（FR群、 n= 16 ; CTR群： n= 16) 。食餌としては、 FR群には、炭水化物 67% (重量％、以下同様）（このうち、フルクトース 98%、オリエンタル酵母社製）、脂肪 13 %およびタンパク質 20% を、 CTR群には、炭水化物 58%、脂肪 12 %およびタンパク質 30 %を与えた。 F R群と CTR群の各々 8匹ずつに BH4 · 2塩酸塩を 1 Omg/k g (体重） Z日経口投与した（各々「FR + BH4群」と「CTR + BH4群」と言う）。 8週間後に胸部大動脈を採取した。各群につき内皮を剥離した切片（EC (一） ) 、剥離しない切片（EC ( + ) ) を作成し、以下のようにスーパ一ォキシドア二オン（0₂— ) 生成量、内皮型 NO S (e NOS) 活性および内皮依存性血管弛緩能の検討を行った。

統計

統計解析は群間の統計については、 on e— way ANOVAにより行い、 pく 0. 05を有意水準とした。さらに多重比較を B o n f e r r 0 n 1 /Du nnにより行い、 p<0. 05を有意水準とした。

胸部大動脈組織片におけるスーパーォキシドア二オン（ΟΓ ) 生成量

〇 ₂—生成量の測定は、ルシゲニン化学発光法（Oh a r a e t a 1. ， J . c l i n. I nv e s t . 91 ： 2546, 1993) を用いて行った。 F R群、 CTR群、 FR + BH4群および CTR + BH4群の 4群の EC ( + ) についての結果を、以下の表 1に示す。 W

表 1 0₂—生成量（100 c pm/mg乾燥重量）群例数平均値

CTR 4 123. 1 34. 5

CTR+BH4 4 189. 3 39. 2

F R 4 263. 6 35. 9

F R + BH4 4 1 18. 0 24. 5 表 1に示したように、 BH4を投与しない場合、 EC ( + ) では FR群の 0₂一生成量は CTR群と比較し 2倍以上の有意（pく 0. 00 1) な高値を示したが、 FR群では BH4投与により〇₂—生成量が有意（p<0. 001) に低下した。

EC (一）では 4群間に有意差を認めなかった。

内皮型 NO S活性

eNOS活性の測定は、 Re e s, D. e t a l . , Hyp e r t e n s i o n 28 : 367, 1 996に従って行った。各 4群の EC ( + ) についての結果を、以下の表 2に示す。表 2 eNOS活性（pmo l /分/ m g夕ンパク質）群例数平均値準偏差

CTR 5 63. 4 1 3 - 0

CTR+BH4 4 57. 0 8. 5

F R 5 22. 3 1 0. 9

FR+BH4 4 60. 2 1 8. 5

表 2に示したように、 ΒΗ4を投与しない場合、 FR群は CTR群と比較して e NO S活性が 50 %以下に有意（pぐ 0. 001) に低下したが、 BH4投与により有意（Pく 0. 00ユ）に改善した。

内皮依存性血管弛緩能

内皮依存性血管弛緩能の測定は、 i n k— wr i t i n g o s c i l l o g r a ph (日本光電工業社製）、圧トランスデューサー（日本光電工業社製）を用いて、等尺張力試験（To d a, N. e t a 1. ， S t r o k e 24 : 1 5 84， 1993) により行った。数値は、大動脈片を 1— 3 X 10— ⁷Mの 1ーフェニレフリンで部分収縮した後、 10_⁴Mのパパべリンによる最大弛緩能に対する％最大弛緩能で示した。各 4群の EC ( + ) でのアセチルコリン（10— ⁵M) およびカルシウムィオノフォア（A 23 187、シグマ社製）（3 X 10— ⁷M) による内皮依存性血管弛緩能をそれぞれ表 3および表 4に示した。表 3 ァセチルコリンによる内皮依存性血管弛緩能

(%最大弛緩能）群例数平均値偏差

CTR 5 89. 0 3. 9

CTR+BH4 5 92. 9 2. 9

FR 8 65. 9 6. 9

FR+BH4 8 82. 6 2. 9 表 4 による内皮依存性血管弛緩能

(%最大弛緩能）群例数平均値偏差

CTR 8 85. 6 7. 1

CTR+BH4 8 86. 4 8. 0

F R 8 66. 9 7. 9

F R + BH4 8 8 1. 8 2. 7 表 3および表 4に示したように、 BH4を投与しない場合、 FR群は CTR群と比較してァセチルコリンおよびカルシウムィオノフォアによる内皮依存性の血管弛緩反応が有意（Pく 0. 00 1) に低下したが、 BH4投与により有意（p <0. 00 1) に回復した。以上、 FR群では、 BH4の投与により〇₂—生成量の低下、 eN〇S活性の亢進および内皮依存性血管弛緩反応の回復が認められ、血管機能の異常が改善された。これに対し、 CTR群では BH4を投与しても上記のいずれにおいても有意な変化が認められなかった。

以上説明したように、本発明はインスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患を有効に予防およびまたは改善する治療剤を提供するものである。また、本発明の治療剤の有効成分は生体内にもともと存在する物質なので長期間使用しても副作用等の心配がない。

Claims

請求の範囲

1. 式（ I) ：

[式中、 R¹および R²は、それぞれ水素原子を表すか、または一緒になつて単結合を表し、 R¹および R²が水素原子を表す場合には、 R³は— CH (OH) CH (OH) CH₃、一 CH (OCOCHs) CH (〇C〇CH₃) CH₃、一 CH₃、一 CH₂OH又はフエ二ル基を表し、 R¹および R²が一緒になつて単結合を表す場合には、 R³は— COCH (OH) CH₃を表す]

で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患の予防または治療剤。

2. インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患が、活性酸素の産生亢進がある疾患である、請求項 1に記載の予防又は治療剤。

3. インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患が、 NO産生減少がある疾患である、請求項 1に記載の予防または治療剤。

4. 式（ I ) の R³が L—エリスロー CH (OH) CH (OH) CH₃である、請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記載の予防または治療剤。

5. 冠攣縮性狭心症の予防または治療剤である、請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の予防または治療剤。

6. 労作性狭心症の予防または治療剤である、請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の予防または治療剤。

7. 経皮経管冠動脈形成術（PTCA) または冠動脈バイパス術（CAB G) 後の冠動脈再狭窄の予防または治療剤である、請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の予防または治療剤。

8. 動脈硬化の予防または治療剤である、請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の予防または治療剤。

9. 脳血管狭窄性病変の予防または治療である、請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の予防または治療剤。

10. 式（ I) ：

[式中、 1^ぉょび1^²は、それぞれ水素原子を表すか、または一緒になつて単結合を表し、 R¹および R²が水素原子を表す場合には、 R³は _CH (OH) CH

(OH) CH₃、 - CH (OCOCHa) CH (〇COCH₃) CH₃、一 CH₃、一 CH₂OH又はフエ二ル基を表し、 R¹および R²が一緒になつて単結合を表す場合には、 R³は一 COCH (OH) CH₃を表す]

で表される化合物又はその薬学的に許容される塩の、ィンスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患の予防または治療剤の製造のための使用。

1 1. 式（ I ) ：

[式中、 R¹および R²は、それぞれ水素原子を表すか、または一緒になつて単結合を表し、 R¹および R²が水素原子を表す場合には、 R³は _CH (OH) CH

(OH) CH₃、一 CH (OCOCHa) CH (OCOCHa) CH₃、 _CH₃、一 CH₂〇H又はフエ二ル基を表し、 R¹および R²が一緒になつて単結合を表す場合には、 R³は— COCH (OH) CH₃を表す]

で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む薬剤を投与することを含む、インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患の予防または治療方法。