WO1999016885A1 - Recepteur de lymphocyte t tueur reconnaissant le vih - Google Patents

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WO1999016885A1
WO1999016885A1 PCT/JP1998/004345 JP9804345W WO9916885A1 WO 1999016885 A1 WO1999016885 A1 WO 1999016885A1 JP 9804345 W JP9804345 W JP 9804345W WO 9916885 A1 WO9916885 A1 WO 9916885A1
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dna
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PCT/JP1998/004345
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Hidemi Takahashi
Takashi Saito
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • DNA encoding a polypeptide capable of hybridizing under stringent conditions and capable of specifically damaging a cell infected with a human immunodeficiency virus is the above-mentioned (8) or (9).
  • DNA as a probe means DNA obtained by colony hybridization, plaque hybridization, or Southern blot hybridization, etc.
  • DNA derived from colonies or plaques After performing hybridization at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1.OM NaCl using a filter immobilized with, 0.1 to 2 times concentration of SSC (saline-sodium citrate) solution Wash the filter at 65 ° C using a 1x concentration of SSC solution consisting of 15 OmM sodium salt and 15 mM sodium citrate. It can be mentioned D N A that can be more identified.
  • SSC saline-sodium citrate
  • polypeptide according to any one of (1) to (7), wherein the polypeptide is a polypeptide having a human-type constant region site.
  • the spleen of the immunized animal is removed, and erythrocyte removal is performed to obtain sensitized lymphocytes.
  • sensitized lymphocytes antigen-expressing or antigen-bound antigen-presenting cells, fibroblasts, etc., irradiated or treated with mitomycin-1C are used.
  • these cells are syngeneic with the immune cells.
  • a P18-specific killer T cell clone can be established.
  • the killer T cell clones that damage HIV-infected cells of the present invention include RT_1, RT-2, RT-3 and the like.
  • Methods for confirming T cells include FACScan using an antibody against a molecular marker expressed on the cell surface.
  • T cell ⁇ receptor is a heterodimer protein in which ⁇ -chain and / 3 chain polypeptide are formed by disulfide bonds.
  • the receptor forms a complex with CD3 and is expressed on the surface of ⁇ cells.
  • Specific ⁇ cell ⁇ (3 receptors are composed of a number of different V- (D) -J-C regions, The other is thought to be defined by the amino acid sequence of the V region, and the specificity for foreign substances is mainly defined by the amino acid sequence of the D and J regions. Therefore, as a method for identifying a T cell receptor gene from a P18-specific killer T cell clone, the V region of the ⁇ . Chain and i3 chain of the T cell receptor was determined, and the entire gene sequence was identified from those results. I do.
  • guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method As methods for preparing total RNA from T cell clones, guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzyraology, 154, 3 (1987)], acid-based guanidine thiocinone phenol The Holm (AGPC) method [Analytic al Biochemistry, 162, 156 (1987), Experimental Medicine 9, 1937 (1991)] and the like can be used.
  • Methods for preparing mRNA as poly (A) + RNA from total RNA include oligo (dT) -immobilized cellulose column method (molecular cloning, 2nd edition) and a method using oligo dT latex. .
  • a fragment obtained by amplifying a part of cDNA by a method using PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] using primers based on a nucleotide sequence that has been partially identified, Oligonucleotides based on the known nucleotide sequence can be used.
  • a primer prepared based on the base sequence can be used as the primer.
  • CDNA is synthesized from mRNA from the cDNA clone having the DNA of the present invention selected as described above, according to the method described above.
  • the nucleotide sequence of DNA obtained by the above method can be obtained by digesting the DNA fragment as it is or by using an appropriate restriction enzyme or the like and then incorporating the DNA fragment into a vector by a conventional method. Sanger) et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] or Perkin Elmer: 373A DNA Sequencer, Pharmacia, Lycoa
  • the desired DNA can be prepared.
  • the DNA synthesizer include a DNA synthesizer manufactured by Shimadzu Corporation using the thiophosphite method, and a DNA synthesizer mode1392 manufactured by Perkin'Elma Inc. using the phosphoramidite method.
  • nucleotide sequence database such as GenBank, EMBL and DDBJ using a homology search program such as BLAST.
  • the homology is searched by searching an amino acid sequence database such as GenPept, PIR, Swiss-Prot using a homology search program such as FASTA or FrameSearch. Existing genes with gender can be searched.
  • a recombinant vector in which the DNA of the present invention is inserted downstream of a promoter of an appropriate expression vector is constructed, and the vector is introduced into a host cell to thereby express a polypeptide expressing the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention can be produced.
  • any cells that can express the target gene such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells
  • a transformant obtained by introducing the recombinant vector into which the DNA of the present invention has been inserted into peripheral blood T cells of a healthy person can be used for gene therapy of HIV-infected patients.
  • those capable of autonomous replication in the host cell or integration into the chromosome and containing a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed are used.
  • the T cell receptor component gene expression vector of the present invention is capable of autonomous replication in a prokaryote, and has a promoter, a ribosome binding sequence, and a DNA of the present invention.
  • transcription termination sequence Force S preferably more configuration recombinant vector.
  • a gene that controls a promoter may be included.
  • expression vectors examples include PSE280 (manufactured by Invitrogen), P GEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-8 (manufactured by QIAGEN), pKYPIO
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host cell. If for example, E. coli as a host, I £ E promoter (P ££), cited lac Buromota one, P L promoter one coater, T7 promoter, such as P R promoter, the promoter Chief derived from Escherichia coli or phage, etc. be able to. Alternatively, a promoter in which two Ptrps are arranged in tandem (P ⁇ £ 2 x2), a promoter designed and modified artificially such as a tac promoter, a T7 lac promoter, a let I promoter, etc. can also be used. When Bacillus subtilis is used as a host, examples thereof include promoters of Bacillus subtilis SP ⁇ 1 and SP ⁇ 2, penP promoter and the like.
  • the ribosome binding sequence it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention. It is preferable to arrange a transcription termination sequence immediately below a force structural gene.
  • Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., for example, Escherichia coli XLl-Blue Escherichia coli XL2-Blue Escherichia coli DH1 Escherichia coli MC1000 Escherichia coli KY3276 Escherichia coli W1485 Escherichia coli JM109 Escherichia coli HB101 Escherichia coli No. 49 Escherichia coli W3110 Escherichia coli NY49 Serratia ficaria ⁇ Serratia fonticola x Serratia liquefaciens
  • Any method for introducing the recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 , 2110 (1972)], the protoplast method (JP-A-63-248394), the electrolysis method [Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, HI (1979)]. it can.
  • Examples of the plasmid containing the DNA encoding the component polypeptide of the killer T cell receptor of the present invention include, for example, pH-RTla containing DNA encoding the ⁇ chain of killer T cell receptor, killer T cell Escherichia coli TGl / pH-RTla, which is Escherichia coli containing Plasmid K PH-RTIa, and Escherichia, which is Escherichia coli containing Plasmid K PH-RTI ⁇ coli TGI / pH-RTl0 was published on August 26, 1997 by the National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (Ibaraki, Japan).
  • FERM BP-6078 and FERM BP-6079 have been deposited with Higashi 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Prefecture, respectively.
  • YE Pl3 ATCC37115
  • YEp24 ATCC37051
  • YC P 50 ATCC37419
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains. Examples thereof include PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1, promoter, gal10 promoter, and heat shock. Promoters such as polypeptide promoter, MFal promoter, CUP 1 promoter and the like can be mentioned.
  • host cells examples include yeast strains belonging to the genera Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluybium mycetes, Trichosporon, Schizinomyces, Pichia, etc.
  • Saccharomyces cerevisiae examples include yeast strains belonging to the genera Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluybium mycetes, Trichosporon, Schizinomyces, Pichia, etc.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • electroporation Methods in Enzymology, 194, 182 (1990)
  • spheroplast method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)]
  • lithium acetate method Journal of Bacteriology, 153, 163 (1983)] and the like.
  • expression vectors include PCD NA I / Amp (manufactured by Invitrogen), pc DNAI, pAMoERC3Sc, pCD M8 [Nature, 329, 840 (1987)], pAGE 107 (JP-A-3-22979,
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • the promoter of the cytomegalovirus (CMV) IE (i-hiddenate early) gene, the SV40 early promoter or the metallotionin promoter can be used.
  • the EN gene of human C A sensor may be used with the promoter.
  • animal cells examples include mouse myeloma cells, rat myeloma cells, mouse hybridoma cells, Namalwa cells or Namalwa KJM-1 cells that are human cells, human fetal kidney cells, and human cells.
  • Leukemia cells African green monkey kidney cells, Chinese hamster cells such as CH0 cells, HBT5637 (JP-A-63-299), and the like.
  • Mouse 'myeloma cells include SP2 / 0 and NS0
  • rat's myeloma cells include YB2 / 0, etc.
  • human fetal kidney cells include HEK293 (ATCC: CR1573)
  • human leukemia cells include BALL- Examples of African green monkey kidney cells include COS-1 and COS-7.
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electoporation method can be used.
  • Baculovirus Exclusion 'Vectors a laboratory' manual [Baculovirus
  • a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain a recombinant virus in an insect cell culture supernatant, and the recombinant virus is further infected into insect cells to express the polypeptide. be able to.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include PVL1392, PVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitrogen) and the like.
  • Baculoviruses are, for example, viruses that infect night roth moths Autographa californi force, Nuclea polyhedrosis. Virus
  • insect cells ovarian cells of Spodoptera frugiperda, ovary cells of Trichoplusia ni, cultured cells derived from silkworm ovary, and the like can be used.
  • the ovarian cells of Spodoptera frugiperda include Sf9 and Sf21 (Baculovirus Expression, Solution Vectors, A Laboratory 'Manual) etc.
  • the ovarian cells of Trichoplusia ni are High 5, BTI-TN-5B1-4 (Invitrogen) And cultured cells derived from the silkworm ovary, such as Botnbyx mori N4.
  • Examples of a method of co-introducing the recombinant gene introduction vector and the baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include a calcium phosphate method.
  • a sugar or a sugar chain-added polypeptide When expressed by yeast, animal cells or insect cells, a sugar or a sugar chain-added polypeptide can be obtained.
  • the T-cell receptor constituent polypeptide can be expressed in vivo in a patient.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained by using a microorganism such as Escherichia coli or yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like, which can be used by the microorganism, and efficiently cultivates the transformant.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and other inorganic or organic acid ammonium salts or other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, and corn starch. Plyka, casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells or digests thereof are used.
  • potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like are used as the inorganic substances.
  • the cultivation is usually carried out at 15 to 40 ° C for 16 to 96 hours under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • RPMI 1640 medium Eag 1e MEM medium or these mediums can be used.
  • a medium to which fetal calf serum or the like is added is used.
  • Cultures, 5% C 0 2 presence usually performed 3-7 days at 3 5 to 3 7 ° C, the culture if necessary, kanamycin, be added to the antibiotic penicillamine phosphorus in the medium Good.
  • the polypeptide of the present invention can be produced as a fusion protein with another protein, and purified using affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein.
  • affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein.
  • the method of Low et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)] JP-A-05-336963, JP-A-06-823021
  • the polypeptide of the present invention can be produced as a fusion protein with protein A, and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G.
  • Poribe peptide of the present invention F 1 produced as a fusion protein with ag peptide can be force s purified by Afi two tee one chromatography using anti F 1 ag antibody [Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)]. Further, the polypeptide can be purified by affinity chromatography using an antibody against the polypeptide itself.
  • polypeptide of the present invention may be prepared based on amino acid sequence information of the polypeptide, such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) and the like. It can also be manufactured by the chemical synthesis method of (1).
  • Chemical synthesis can also be performed using peptide synthesizers such as (Protein Technology Instrument), Synthecell-Vega, PerSeptive and Shimadzu.
  • peptide synthesizers such as (Protein Technology Instrument), Synthecell-Vega, PerSeptive and Shimadzu.
  • Structural analysis of the purified polypeptide of the present invention is described in a method commonly used in protein chemistry, for example, protein structural analysis for gene cloning (Hisashi Hirano, published by Tokyo Kagaku Dojin, 1993). The method can be implemented by the following method.
  • a transgenic animal is an animal obtained by introducing a foreign gene into an animal at an early stage of its development.
  • the production of transgenic mice is described below.
  • the transgenic mice of the present invention are described in Hogan, B. et al. [Manupulating the mouse embryo. A laboratory manual. 2nd ed. 1994. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 96, 357-363 (1984)]. That is, after hormonally-treated female C57BL / 6 mice are mated, the fertilized eggs are removed, and the prepared transgene fragment not containing the vector portion is placed in a microglass pipe in the male pronucleus of the fertilized eggs. And microinjection. Transgenic mice are produced by transplanting several hundred surviving pseudopregnant female mice out of the obtained transgenic eggs into oviducts.
  • an antibody that recognizes the polypeptide of the present invention can be prepared as follows.
  • the protein obtained above is immunized as an antigen.
  • the antigen may be administered subcutaneously, intravenously or intraperitoneally to the animal, but may be administered by binding a carrier protein having high antigenicity, or the antigen may be administered together with an appropriate adjuvant. Is preferred.
  • Carrier proteins include keyhole limpet mosquito, keyhole lysine mossin, bovine serum albumin, and bovine thyroglobulin.
  • Adjuvants include Freund's complete adjuvant (Co immediately lete Freund's Adjuvant), Aluminum hydroxide gel and B. pertussis vaccine. Examples of the immunized animal include non-human mammals such as rabbits, goats, mice aged 30 to 20 weeks, rats, and hamsters.
  • the antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration.
  • the dosage of the antigen is preferably 50 to 100/1 g per animal.
  • Blood is collected from the fundus venous plexus or tail vein of the immunized animal 3 to 7 days after each administration, and the reactivity of the serum with the antigen is determined by enzyme immunoassay [enzyme immunoassay (ELISA)]. Confirmed in the Medical Shoin Publishing (1976).
  • a non-human mammal whose serum shows a sufficient antibody titer is used as a source of serum or antibody-producing cells.
  • a monoclonal antibody is prepared by fusing the antibody-producing cells with myeloma cells derived from a non-human mammal to produce a hybridoma, and culturing the hybridoma or administering the hybridoma to an animal to cause the cells to become ascites tumor, It can be prepared by separating and purifying the culture solution or ascites.
  • Antibody-producing cells are collected from spleen cells, lymph nodes, peripheral blood, and the like of a non-human mammal to which antigen has been administered.
  • mice 8-azaguanine-resistant mice (derived from BALB / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-Ul (P3-U1), a cell line obtained from mice [G. Kohler et al. ⁇ Journal ⁇ Journal 'Ebop Immunology. (Europ. J. Immunol.), 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [ ⁇ . Shulman et al .; Nature, 276 , 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) [JF Kearney et al .; Journal of Immunology, J.
  • a cell-aggregating medium such as polyethylene glycol-1000 (PEG-1000) is added, and the cells are fused and suspended in a medium.
  • PEG-1000 polyethylene glycol-1000
  • MEM medium or PBS 1.83 g of sodium phosphate, 0.21 g of phosphate monophosphate, 7.65 g of salt, 1 liter of distilled water, pH 7.2
  • a medium for suspending the fused cells a HAT medium ⁇ normal medium [1.5 mM glutamin, 5 ⁇ 10 " 5 2- in RPMI-1640 medium, so that only the desired fused cells can be selectively obtained.
  • a part of the culture supernatant is removed, and a sample that reacts with the antigen protein but does not react with the non-antigen protein is selected by enzyme immunoassay. Subsequently, cloning is performed by the limiting dilution method, and those that have a stable and high antibody titer determined by enzyme immunoassay are selected as monoclonal antibody-producing hybridoma strains.
  • the antigen protein or cells expressing the antigen protein are coated on a 96-well plate, and the hybridoma culture supernatant or purified antibody is reacted as the primary antibody.
  • the plate After the first antibody reaction, the plate is washed and the second antibody is added.
  • the second antibody is an antibody obtained by labeling an antibody capable of recognizing the immunoglobulin of the first antibody with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, a radiation compound, or the like. Specifically, if a mouse was used for preparing the hybridoma, an antibody capable of recognizing mouse immunoglobulin is used as the second antibody.
  • a reaction according to the substance labeled with the second antibody is performed, and the antibody is selected as a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically reacts with the antigen.
  • Monoclonal antibodies were cultured in a culture solution obtained by culturing Hypridoma cells or treated with pristane (0.5 ml of 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (Pristane) was intraperitoneally administered and bred for 2 weeks).
  • Monoclonal antibody-producing hybridoma cells can be intraperitoneally administered to mice or nude mice of 10 to 10 weeks of age to separate and purify the ascites from ascites cancer.
  • Methods for separating and purifying monoclonal antibodies include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, cabrylic acid precipitation, DEAE-Sepharose column, anion exchange column, protein A or G-column or gel filtration column. And the like, which may be performed alone or in combination. According to this method, an IgG or IgM fraction can be collected to obtain a purified monoclonal antibody.
  • FIG. 1 shows the results of observing which peptides the established T cell clones RT-1, RT-2 and RT-3 recognize.
  • Figure 2 shows that the established killer T cell clone RT-1 derived cells were 1) treated with complement alone, 2) treated with complement and anti-CD8 antibody, 3) treated with complement and anti-CD4 antibody, 4) 4 is a graph showing changes in cytotoxic activity when untreated.
  • FIG. 3 shows the results of experiments examining the ability to perform S-specific recognition when P18 was presented with any class I HC molecule.
  • Class I HC The KDL, in mice, the class I MHC molecules that present antigens may, K, D, consists regions of L, such in mouse B10 D2, K a, D a , that the L d Show.
  • FIG. 4 shows the results obtained by agarose gel electrophoresis of V) 38.1 DNA obtained from the killed T cell clone RT-1 amplified by PCR.
  • FIG. 5 shows the results of staining the T cell clone RT-1 with the anti-) 38.1 antibody and analyzing it using flow cytometry.
  • FIG. 6 shows the results of confirming the Va 42Hll DNA obtained from the killer T cell clone RT-1 amplified by PCR by agarose gel electrophoresis.
  • V region The 13-chain V region (hereinafter referred to as V region) of the mouse T cell receptor is one of V01-V (317). Therefore, based on the characteristic sequence of each 5 'end, A primer (CB04E; SEQ ID NO: 2) based on the designed primer group and the sequence of the mouse T cell receptor 3-chain C region (hereinafter referred to as the C0 region) commonly found in all
  • RT-PCR was performed to amplify the clone-derived mRNA, and agarose gel electrophoresis of the obtained sample revealed that cDNA was amplified for the primer of V
  • nested PCR was performed by combining a primer of the V] 38 subclass having a sequence different from that of the primer used above with the CB04E primer (SEQ ID NO: 2).
  • Agarose gel Electrophoresis result amplification of the cDNA for the primer V 138.1 (SEQ ID NO: 3) was observed (Fig. 4) Furthermore, the RT- 1 anti V
  • PCR buffer (xiO) 2 l dGTP, dATP, dTTP and dCTP 2 "each 1, RNase inhibitor 11 1, reverse Add 1 l of transcriptase, 3'-end primer (CB04E) 11 and mRNA 21 and mix with a voltex mixer for several seconds, then cycle at 42 ° C for 15 minutes, 99 at 5 minutes, 5 ° C for 5 minutes for 1 cycle As a result, one cycle of PCR was performed.
  • PCR reaction solution a solution of Mg 2 4 1, PCR buffer (X10) 2 w 1, distilled water 65.51, and AmbriTac (AmpliTaq) DNA polymerase 0.51, and a 5′-end primer was added.
  • the RT-1 derived mRNA, the primer (SEQ ID NO: 3) from the 5 'end of VJ38.1, the CB04E primer (SEQ ID NO: 2), and the 13-chain cDNA obtained using reverse transcriptase were 1.0% agarose gel containing the entire PCR reaction solution (501-100 / xl)
  • Escherichia coli TGI / pH-RTl3 which has been transformed with Escherichia coli TGI / pH-RTl3 transfected with a plasmid pH-RTl / 3 containing DNA encoding the / 3 chain of the T-cell receptor, was released on August 26, 1997 by It has been deposited as FERM BP-6079 at the Institute of Biotechnology, Industrial Technology (1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan).
  • the ⁇ -chain V region (hereinafter referred to as the Va region) of mouse ⁇ cell receptor contains 12 V regions of Val-V ⁇ 12 and its subtypes; considerably more complex than the three chains It is said that about 80 types of V regions exist.
  • a primer group designed based on each characteristic sequence and a primer of the C ⁇ region commonly found in all ⁇ chains (Exon-1 3Ca-R; SEQ ID NO: 5)
  • mRNA derived from clone RT-1 was amplified by RT-PCR in the same manner as in Example 2-2. Although the experiment was repeated many times, amplification was not performed with any of the primers.
  • the mRNA derived from RT-1 and Va42Hll (SEQ ID NO: 4), exon-1 3C ⁇ -R (SEQ ID NO: 5), and the a chain obtained using reverse transcriptase were used.
  • cDNA was prepared, dideoxyribose labeled with a dye was added to the purified DNA, and the gene sequence was determined using a gene sequence analyzer.
  • the nucleotide sequence of the T-cell receptor a-chain of RT-1 was Va42Hl-Ja25-Ca.
  • the amino acid sequence of the T-cell receptor a chain of RT-1 is shown in SEQ ID NO: 9, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the plasmid pH-RTla containing DNA encoding the a-chain of the T cell receptor was introduced.
  • Escherichia coli TG1 / PH -RT1 ⁇ which is Escherichia coli, was submitted to the Ministry of International Trade and Industry, Ministry of Industry and Industry's Institute of Biotechnology and Industrial Technology on August 26, 1997 (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). Deposited as FERM BP-6078.
  • the T cell receptor a chain often has several subfamilies within the same V region, and it is known that a single T cell expresses two a chains. Even if the V region sequence near the VJC binding site detected by PCR is the same as V ⁇ 42 ⁇ 11, it may be a different subfamily of the same family, with a mutation at the 5 'upstream, and another completely different a-chain. It may have been expressed. Therefore, using the primers of any sequence at the Ca site (GSP-1 and GSP-2 in Fig. 7) and oligo dT primers, the cDNA of the upstream part of Ca from the RT-1 tnRNA was subjected to the 5 'RACE method.
  • the V] 3 region does not have a subfamily like the V ⁇ region. Without determining the sequence using the 5 ′ RACE method, the VDJ region and the C region were amplified using RT-PCR, and each was joined to give a total length of V 08.1.
  • Example 4 Transgenic mice expressing RT-1 T cell receptor 1. Preparation of transgenic mice expressing T cell receptor
  • 3-DNA DNAs encoding T cell receptor ⁇ and / 3 chains
  • transgenic mouse mosquitoes into which TCRa and TCR3 as the transgenes were respectively incorporated were obtained.
  • These RTlTCRa- and RTCRiS- transgenic mice were combined with wild-type mice. Furthermore, they were crossed with Balb / c mice.
  • For MHC genotypes should match the type having the original RT- 1 clone, as with back- Undo the H-2 d, to multiplying the RTlTCRa and RT1TCR0 is H- 2 a Therefore, to produce a mouse that expresses the background of H-2 a, and RTlTCRa] 3.
  • TCRa chains and chains in the thus established transgenic mice was examined. The results are shown in FIG. Fluorescent staining with the anti-V (38 antibody (F23.1, manufactured by Pharmindin)) described above resulted in approximately 0% of the 0 chain in normal mice, but almost all CD8-positive cells in transgenic mice were V ] 38 + was found to be 5 ', whereas TCRa chain expression was not possible due to the absence of specific antibodies Therefore, mRNA expression was analyzed by RT-PCR using a primer corresponding to the binding region. RT-1 TCRa chain was hardly detectable in thymus and spleen cells of normal mice. It was found that the expression was considerably high in thymus and spleen cells of transgenic mice.
  • Transgenic mice expressing only the TCR chain were analyzed. ⁇ Since antigen recognition by cells is performed by both the TCRa chain and the
  • the repertoire of TCR ⁇ chains of T cells induced by in vitro stimulation was examined by RT-PCR.
  • the TCR chain before stimulation with HIV gp160 the TCR ⁇ chain of T cells derived from transgenic mice was almost unchanged after stimulation with mosquito using a random ⁇ chain.
  • CD8 + T cells were found to have a TCRa chain completely consistent with RT-1. That is, in the case of HIV gp16 ⁇ specific T cells, even if not ⁇ cells having both TCR ⁇
  • a component polypeptide of a killer T cell receptor that specifically damages cells infected with human immunodeficiency virus, a DNA encoding the polypeptide, a vector containing the DNA, and a transformation transformed with the vector
  • the present invention provides a body, a method for producing a polypeptide constituting a component of a T cell receptor, a transgenic animal expressing a polypeptide constituting a component of a T cell receptor, and an antibody against the polypeptide.
  • the component polypeptide of the killer T cell receptor is useful as an anti-HIV agent.
  • SEQ ID NO: 2 Oligonucleotide synthesized based on the sequence of C ⁇ 04 ⁇ SEQ ID NO: 3: V of cell receptor

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Description

明 細 書 ヒト免疫不全ゥィルスを認識するキラー T細胞レセプター 技術分野
本発明は、 ヒ卜免疫不全ウィルス感染細胞を特異的に傷害するキラー T細胞 レセプターの構成成分ポリペプチド、 該ポリペプチドをコードする D N A、 該 D N Aを含むベクター、 該ベクターで形質転換された形質転換体、 T細胞レセプ ターの構成成分ポリぺプチドの製造方法、 該ポリぺプチドを発現させた卜ランス ジ工ニック動物、 該ポリべプチドに対する抗体ならびに該キラ一 T細胞レセプ ターの構成成分ポリペプチドを含有する抗 H I V剤に関する。 目：
近年、 ヒ卜免疫不全ウィルス （HIV ) の初期感染防御 [Koup, R. A. et al. , Nature, 370 , 416 (1994) ] 、 発病の遅延 [Levy, J. A. et al. , Immunol . Today, 17, 217 (1996) ] 、 及び感染抵抗性 [Rowland -Jones, S. et al. , Nature Med. , 1, 59 (1995) ] に関する CD8 分子陽性のキラー T細胞の重要性、 更には該細胞が分泌する液性因子の HIV抑制能 [Cocchi, F. et al. , Science, 270, 1811 (1995)； Baier, M. et al. , Nature, 378, 563 (1995) ] 力報告され ている。
Hoらは、 HIV 感染者のウィルス量及びウィルスによる免疫応答を経時的に追跡 した結果、 生体内で、 ウィルスは感染後一時的に増殖するが、 ウィルス特異的な CD8+キラ一 T細胞前駆細胞 (cytotoxic T lymphocyte precursor; 以下、 CTL-p と称す） の出現に伴って速やかに減少し、 ほとんどウィルスがクリア一された 6 〜δ 週間後に初めて、 ウィルス特異的 IgG抗体が出現することを報告し、 初期感 染防御における CD8 +キラー T細胞を主体とした細胞性免疫の重要性を指摘した [Nature, 370, 416 (1994) ] 。 その後、 に感染しても 10数年に亘り CM T 細胞が減少せず、 AIDSの発病を見ない長期未発症患者が存在し、 こうした感染者 の生体内では、 CD8 陽性 T細胞及び Thl タイプのヘルパー T細胞を主体とした細 胞性免疫が、 抗体産生を担う体液性免疫よりも優位に働き、 HIV増殖抑制能のあ る MIP-1 α、 β [Science, 270, 1811 (1994) ] あるいは Iい 16 [Nature, 378' 563 (1995) ] を分泌する CD8 陽性 T細胞が認められることが報告されている。 それ以降、 感染防御及び発病予防におけるキラー T細胞を含めた CD8 陽性 T細胞 あるいは細胞性免疫の重要性が、 より一層注目されてきている [Immunol. Today, 17, 217 (1996)] 。
HIV の細胞内への侵入は、 例えば、 T細胞上では、 細胞表面上の fusin
[Feng, Y. et al. , Science, 272, 872 (1996) ] 、 マクロファージ上では、 CC-CKR-5 [Deng, H. et al. , Nature, 38^, 661 (1996)； Drajic, T. et al. , Nature, 381, 667 (1996) ] 等のケモカインレセプ夕一により規定されてい る。 そして、 各種ケモカイ ンレセプターに特異的に結合するケモカイ ン、 MIP-1 a、 ]3あるいは IL- 16 等が HIV の細胞内への侵入を阻害することが報告さ れ [Cocchi, F. et al. , Science, 270, 1811 (1995) ; Bleul, C. C. et al. , Nature, 382, 829 (1996) ] 、 また、 先天的に CC-CKR- 5の遺伝子に欠損のある 人種は、 ΗΠ 感染から免れること [Nature, 382, 722 (1996)； Cell, 86, 367
(1996) ] 等から、 HIV 侵入部位が CC- CKR-4や CC- CKR- 5等のケモカインレセプ ターであることも報告されている [Science, 272, 872 (1996)； Nature, 381> 661 (1996)] 。 すなわち、 CD8+CTL 力放出する MIP- 1 α、 ]3や RANTES等の因子が ケモカインレセブターを塞ぎ、 Η の細胞内への侵入を阻止することによって、 細胞内での HIV 増殖が抑制されることが判明した。
また、 ケモカインレセプターを介し細胞内へ侵入するウィルス側の部分が、 HIV エンベロープタンパク質 gP160 V3 領域であることも明らかとなった
[Nature, 384, 179 (1996)； Nature, ， 184(1996)] 。 HIV エンベロープタン パク質 gpl60 V3領域は、 ウィルスが感染する細胞の種類 （トロピズム） を決定す る部分であるといわれている。 特に、 HIV ΠΙΒ株由来の HIV エンベロープタンパ ク質 gpl60 V3領域の 315 -329 番目のアミノ酸配列である Env- Kl (18IIIB:RIQRG PGRAFVTIGK P18ともいう） [Takahashi, H. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3105 (1988)]は、 マウスにおいてクラス I MHC分子 （Dつ とともに 細胞表面に提示され、 特異的キラ一 T細胞レセプターによつて認識されるが [Takahashi, H. et al. , J. Exp. Med. , 170, 2023 (1989) ] 、 同時にヒトにお いて比較的広範囲に認められるクラス I MHC分子である HLA- A2、 HLA- A3等ととも に Env- K1は細胞表面に提示され、 HIV感染者の体内に Επν-Klを認識するキラ一 Τ 細胞の存在が確認されている [Clerici, . et al. , J. Immunol. , 146, 2214 (1991)； Dadaglio, G. et al. , 147, 2302 (1991) ] 。
更に、 健常人の生体内に、 HIV envelope (gpl60)遺伝子を組換えたワクチニァ ウィルスを接種した場合、 種々の HLA により抗原提示された ENV- K1を特異的に認 識するキラー T細胞が誘導され、 該キラー T細胞は gpl60 組換えワクシニアウイ ルスを感染させた自己の細胞を特異的に傷害した [Achour, A. et al, Fifth International Conference on AIDS, p. 546 (Abstract) (1989) ] 0 しかしなが ら、 キラー T細胞クローンの作製は行われていない。
また、 Env- K1を含むエンベロープ gpl60内の V3領域は、 HIV に対する特異的 中和抗体の認識部位 [ Palker, T. J. et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1932 (1988)； Rusche, J. R. et al .， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3198 (1988)； Goudsmit, J. et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4478
(1988) ] あるいはヘルパー T細胞の認識部位 [Takahashi, H. et al.， J.
Exp . Med. , 171 , 579 (1990)； Clerich, M. et al . , Nature, 339 , 383 (1989)； Takeshita, T. et al. , J. Immunol. , 154, 1973 (1995) ] であること も知られている。
抗 V3抗体は、 HIV に対する中和活性を有しているものの、 HIV 増殖を抑制する には生体内への大量投与が必要となるが、 抗体は高分子であるため、 大量投与は 好ましくない。 した力 sつて、 V3、 特に Erw- K1を特異的に認識するキラ一 T細胞ク ローンの確立、 該 T細胞レセブターの分子構造の詳細な検討は、 HIV の侵入をブ ロックする、 次世代のウィルス侵入阻害剤の開発に有用であると思われる。
以上の点から、 HIV 特異的キラー T細胞クローンの解析、 及びこうしたキラ一 T細胞の機能的レセプタ一遺伝子を発現する個体としてのトランスジヱニック動 物の開発は、 エイズ治療及び研究に極めて有益な情報をもたらすこと力期待され てきたが、 これまでのところ、 これらに関する報告はない。
ヒ卜免疫不全ゥィルスの体内動態の探索ならびにエイズの治療及び薬剤等の開 ― 発に使用するとともに、 こうした遺伝子を予め発現させることによる感染予防へ の効果、 及び感染後に発現させることによるウイルス封じ込めによる治療効果を 検討すること力 S求められる。 そこで、 ヒ卜免疫不全ウィルス感染細胞を特異的に 傷害する CD8 陽性キラー T細胞クローンの解析、 該キラー T細胞レセプ夕—遺伝 子を発現した卜ランスジェニック動物の開発が望まれている。 発明の開示
本発明は以下の （1) 〜 （17) に関する。
( 1 ) ヒト免疫不全ウィルス感染細胞を特異的に傷害することができるキラー T 細胞レセプターの構成成分ポリぺプチド。
(2) ヒト免疫不全ウィルスが HIV- 1 である前記 （1) 記載のポリペプチド。
(3) HIV-1 が HIV- 1 IIIBである前記 (2) 記載のポリペプチド。
(4) ポリペプチドが、 ヒ卜免疫不全ウィルスエンベロープタンパク質 gpl60 を特異的に認識するキラー T細胞レセプターを構成するポリペプチドである、 前 記 （1) 〜 （3) のいずれかに記載のポリペプチド。
(5) ヒト免疫不全ウィルスエンベロープタンパク質 gpl60 を特異的に認識する キラー T細胞レセプターの認識領域が gpl60 の V3領域である前記 （4) 記載のポ リベブチド。
(6) 認識領域がヒト免疫不全ウィルスエンベロープタンパク質 gpl60 V3領域の 315〜329番目のアミノ酸配列から成る領域である前記 （5) 記載のポリべプチ
(7) 配列番号 7又は 9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、 又は、 該 ポリぺプチドの有するァミノ酸酉己列において一個以上のアミノ酸が置換、 欠失も しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 力っヒ卜免疫不全ウィルス感染細胞を特 異的に傷害することができるポリぺプチド。
前記のアミノ酸の置換、 欠失もしくは付加は、 出願前周知技術である部位特異 的変異誘発法により実施することができ、 また、 一個以上のアミノ酸とは、 部位 特異的変異誘発法により置換、 欠失もしくは付加できる程度の数のアミノ酸を意 味する。 かかる一個以上のァミノ酸が置換、 欠失もしくは付加されたァミノ酸配列から なり、 力つヒ卜免疫不全ウィルス感染細胞を特異的に傷害するポリペプチドは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (以下、 モレキュラー 'クローニング第 2版と 略す) 、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38， John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カレン卜 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュ ラ一 'バイオロジーと略す） 、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982) 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, ， 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985) 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662 (1984) 、 Science, 224, 1431 (1984) 、 PCT W085/00817 (1985) 、 Nature, 316^ 601 (1985) 等に記 載の方法に準じて調製することができる。
(8) 前記 （1) 〜 （7)のいずれ力に記載のポリペプチドをコードする DNA。
( 9 ) 配列番号 6又は 8で表される塩基配列を有する D N A。
( 10) 前記 （8) 又は （9) 記載の DNAとストリンジヱン卜な条件下でハイ ブリダィズし、 力っヒ卜免疫不全ウィルス感染細胞を特異的に傷害することがで きるポリペプチドをコードする DNA。
前記の 「ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 かつヒト免疫不全 ウィルス感染細胞を特異的に傷害することができるポリべプチドをコードする DNA」 とは、 前記 （8) 又は （9) 記載の DN Aをプローブとして、 コロニ一 •ハイブリダイゼ一ション法、 プラーク 'ハイブリダイゼーション法あるいはサ ザンブロッ トハイプリダイゼ一ション法等を用いることにより得られる DN A を意味し、 具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化したフ ィルターを用いて、 0. 7〜1. OMのNaC l存在下、 65 °Cでハイブリダィ ゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC (saline-sodium citrate ) 溶液 （1倍濃度の SSC溶液の組成は、 15 OmM塩ィヒナトリウム、 15mMク ェン酸ナトリウムよりなる） を用い、 65 °C条件下でフィルタ一を洗浄すること により同定できる D N Aをあげることができる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 モレキュラー 'クロ一ニング第 2版、 カレント ' プロ 卜コールズ · イン 'モレキュラー 'バイオロジー、 DN A Cloning 1: し ore iechniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能な D N Aとして具体的には、 配列番号 6又は 8で表される 塩基配列と少なくとも 80%以上の相同性を有する DNA、 好ましくは 95%以 上の相同性を有する DN Aをあげることができる。
( 1 1 ) 前記 （8) 〜 （ 10) のいずれかに記載の DN Aとベクターとからなる 組換えベクター。
f 12) 前記 （1 1 ) 記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質 転換体。
( 13) 前記 （12) 記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に前記 （ 1 ) 〜 （7) のいずれかに記載のポリペプチドを生成蓄積させ、 該培養物からポリべ プチドを採取することを特徴とする前記 （1) 〜 （7) のいずれかに記載のポリ ペプチドの製造方法。
(14) 前記 （1) 〜 （7) のいずれかに記載のポリペプチドと特異的に反応す る饥体。
(15) ポリぺプチドが、 ヒト型の定常領域部位を有するポリぺプチドである前 言己 （1) 〜 （7) のいずれ力 こ記載のポリペプチド。
( 16) 前記 （1) 〜 （7) のいずれかに記載のポリペプチドを発現させたトラ ンスジヱニック動物。
( 17) 前記 （1) 〜 （7) のいずれかに記載のポリペプチドを含有する抗 H I V剤。
HIV感染細胞を傷害するキラ一 T細胞クローンの樹立は、 抗原を調製して、 動 物に投与することにより免疫し、 免疫した動物の細胞から感作リンパ球を摘出し て刺激することにより得られる。
HIV感染細胞を傷害するキラー T細胞クローンを作製する際に用いる HIV株と しては、 ΗΠ_1 III3株等があげられる。 それらのェピト一プとしては、 HIV- 1 ェ ンべロープ蛋白質 gpl60 内の V3領域に存在する 315〜329番目のアミノ酸配 列からなる Env- K1 [アミノ酸配列； RIQRGPGRAFVTIGK (Takahashi, H. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3105 (1988)) 、 以下、 P18 と称す] があげら れる。
抗原の投与方法としては、 一般の純化したタンパク抗原等ではキラー T細 胞の誘導が困難であることが知られているため、 特殊な免疫賦活物質 （アジュ ノ、ン卜 ) である ISCOM (I龍 unostinmlating complex) [Takahashi, H. et al. , Nature, A, 873 (1990) ] を用いる方法、 ISCOM の成分のひとつである QS-21 と HIV エンベロープタンパク質 gpl60 との複合物を用いる方法 [Wu, J. et al. , J. Immunol. , 148, 1438 (1992) ] 、 該 gpl60 遺伝子を組換えたワクシニア ウィルス [Takahashi, H. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, .85, 3105 (1988)] 、 該 gpl60 遺伝子を導入した自己細胞及び Erw-Klを結合した自己樹状細 胞 [Takahashi, H. et al. , Int. Immunol. , 5, 849 (1993) ] を用いた投与方法 等があげられる。
免疫する動物としては、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 サル等があげられる。 例え ばマウスであれば、 B10.PL (H-2u), B10.P(H-2p) 、 B10. Q(H-29) 、 B10.A(H-2a) 等種々の遺伝形質を有したマウスがあげられるが、 好ましくは、 P18 に対して高 い反応性を示す B ALB/c (H-2a)マウスがあげられる。
免疫した動物の脾臓を摘出し、 赤血球除去等の操作を行い、 感作リンパ球が得 られる。 感作リ ンパ球を刺激するためには、 抗原を発現している、 あるいは抗原 が結合した、 抗原提示細胞、 線維芽細胞等を放射線照射あるいはマイトマイシン 一 C処理した細胞等が用いられる。 これらの細胞は免疫細胞と同系であることが 好ましい。 該細胞で刺激を継続することにより、 P18 特異的キラー T細胞クロ一 ンを確立することができる。 本発明の HIV 感染細胞を傷害するキラ一 T細胞クロ ーンとしては、 RT_1、 RT-2、 RT-3等があげられる。 T細胞の確認方法としては、 細胞表面に発現している分子マーカーに対する抗体を用いた FACScan等があげら れる。
T細胞 α βレセブターは、 α鎖と /3鎖のポリべプチドがジスルフィ ド結合によ り形成されたへテロダイマータンパク質である。 該レセプタ一は CD3 と複合体を 形成し、 Τ細胞の表層に発現している。 特定の Τ細胞 α (3レセプ夕一は、 多数の 異なる V - (D) - J - C領域によって構成されており、 レセブターそのものの種 別は V領域のァミノ酸配列によって、 また異物に対する特異性は主として D及び J領域のアミノ酸配列によって規定されていると考えられている。 そこで、 P18 特異的キラー T細胞クローンから、 T細胞レセプタ一遺伝子を同定する方法とし ては、 T細胞レセプターの α.鎖及び i3鎖の V領域を決定し、 それらの結果より全 遺伝子配列を同定する。
T細胞レセプターの α鎖及び /3鎖の V領域は、 Τ細胞クローンから mRNAを抽出 し、 得られた mRNAと各 V領域の遺伝子配列に基づいて作製されたプライマーとで ポリメラーゼ 'チェイン ' リアクション （Polymerase Chain Reaction ；以下、 PCR法と称す） を行うことにより、 同定する。 前記で得られた mRNAにリバ一 ス ' トランスクリプション （Reverse Transcription ) -PCR法 （RT- PCR法） を行 つて、 cDNAを作製して、 配列を決定する。
更に、 全遺伝子配列を決定するために、 リコンビナン卜 PCR法を用いて pl8特 異的なジャンクショナル領域を有する全長 DNAを作製する。
T細胞クローンから全 RN Aを調製する方法として、 チォシアン酸グァニジン 一トリフルォロ酢酸セシウム法 [Methods in Enzyraology, 154, 3 (1987)] 、 酸 性グァニジンチオシァネ一卜 ·フエノ一ル' クロ口ホルム （AGPC) 法 [Analytic al Biochemistry, 162, 156 (1987)、 実験医学 9, 1937 (1991) ] 等を用いるこ とができる。
全 RN Aからポリ （A) + RN Aとして mRNAを調製する方法として、 オリ ゴ （dT) 固定化セルロースカラム法 （モレキュラー · クローニング第 2版） や オリゴ dTラテックスを用いる方法等を用いることができる。
ファース卜 ' トラック . mRN A単離キット [Fast Track mRNA Isolation Kit ； インビトロジェン （Invitrogen) 社製〗 、 クイック 'プレップ · m R N A 精製キット [Quick Prep mRNA Purification Kit；フアルマシア （Pharmacia ) 社製〕 等のキッ トを用いて組織や細胞から直接 mRNAを調製することもでき る。
得られた全 RNAあるいは mRNAを用い、 常法により c DNAライブラリ一 を作製する。
c DNAライブラリ一作製法として、 モレキュラー ' クローユング第 2版 やカレン卜 ·フ°ロトコールズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー、 DNA Clonmgl: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995) 等に記載された方法、 あるいは市販のキット、 例えば スーパースクリプト ·プラスミド ·システム ·フォー · cDNA ·シンセシス · アンド 'プラスミド ·クロ一ニング [Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning ；ギブコ BRL (Gibco BRL ) 社製] やザップ 一 c D N A ·シンセシス 'キット 〔ZAP_cDNA Synthesis Kit, ストラタジーン社 製] を用いる方法等をあげることができる。
c DNAライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、 大腸 菌 K 12株中で自律複製できるものであれば、 ファージベクター、 プラスミドべ クタ一等いずれでも使用できる。
具体的には、 ZAP Express 〔ストラタジーン社製、 Strategies, 5, 58 (1992) ] 、 Bluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989) ] 、 La mbda ZAP II (ストラタジーン社製） 、 ilgtlO、 ^gtll [DNA Cloning, A Pr actical Approach, 1, 49 (1985)] 、 ； LTriplEx (クローンテック社製） 、 ん Ex Cell (フアルマシア社製） 、 PT7T318U (フアルマシア社製） 、 pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983) ] 、 pUC 18 [Gene, 33, 103 (1985)] 、 pAMo 〔 J. Biol. Chem. , 268, 22782-22787 (1993) 、 別名 pAMoPRC3Sc (特開平 05- 33696 3 ) ] 等を挙げることができる。
宿主微生物としては、 大腸菌 Escherichia coliに属する微生物であればレゝずれ も用いることができる。 具体的には、 Escherichia coli XL卜 Blue MRF' 〔ストラ 夕ジーン社製、 Strategies, 5, 81 (1992)] 、 Escherichia coli C6Q0 (Geneti cs, 39, 440 (1954)] 、 Escherichia coli Y1Q88 [Science, 222, 778 (1983)] 、 Escherichia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983) ] 、 Escherichia coli N 522 [J. Mol. Biol. , 166, 1 (1983)] 、 Escherichia coli K802 (J. Mol. Bi ol. , 16, 118 (1966) ] 、 Escherichia coli J 105 [Gene, 38' 275 (1985)] 、 Escherichia coli SOLRTM Strain (ス卜ラタジーン社製） 、 Escherichia coli L E392 (モレキュラー ·クローニング第 2版） 等を用いることができる。
前記方法により作製した c D N Aライブラリ一に加え、 市販の c D N Aライブ ラリーも利用することができる。
前記で作製した cDNAライブラリーより、 本発明の DNAを有する cDNA クローンを、 ァイソ卜ープあるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー ·ハ ィブリダイゼ一ション法あるいはブラーク ·ハイブリダイゼーシヨン法 〖モレキ ユラ一 ·クローニング第 2版〗 等により選択することができる。
プローブとしては、 一部明らかになつている塩基配列に基いたプライマーを用 いて、 PCR 〔PCR Protocols, Academic Press (1990) ] を利用した方法で c DNAの一部を増幅した断片や、 一部明らかになつている塩基配列に基いたォ リゴヌクレオチドを利用することができる。
プライマーとして、 全長 cDNAの 5' 末端側及び 3' 末端側の両方の塩基配 列が EST等により明らかになつている場合には、 その塩基配列に基いて調製し たプライマーを用いることができる。
前記により選択された本発明の DN Aを有する c DN Aクローンより、 前記の 方法に準じて mRNAから c DNAを合成する。
また、 該 cDN Aの両端にアダプターを付加し、 このアダプターの塩基配列と 一部明らかになつている塩基配列に基づいたプライマーで PC Rを行う 5' — R AC E (rapid amplification of cDNA ends)及び 3 ' -RACE [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988) ] により、 プライマーに用いた配列よりも 5' 末端側及び 3' 末端側の cDNA断片を得ることができる。
得られた c D N A断片をつなぎあわせることにより、 本発明の全長 D N Aを取 得することができる。
前記の方法により取得された DN Aの塩基配列は、 該 DN A断片をそのままあ るいは適当な制限酵素等で切断後常法によりベクターに組み込み、 通常用いられ る塩基配列解析方法、 例えばサンガー（Sanger)らのジデォキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977) ] あるいはパーキン 'エルマ一社 （Perkin Elmer ： 373 A · DNAシ一クェンサ一） 、 フアルマシア社、 ライコア
(LI-C0R) 社等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することが できる。
前記方法により得られた塩基配列情報に基づき、 D N A合成機で化学合成する ことにより目的とする D N Aを調製することもできる。 D N A合成機としては、 チォホスファイト法を利用した島津製作所社製の D N A合成機、 フォスフォアミ ダイト法を利用したパーキン' エルマ一社製の D N A合成機 m o d e 1 3 9 2等 をあげることができる。
得られた塩基配列の新規性に関しては、 BLAST等の相同性検索プログラムを用 いて、 GenBank 、 EMBL及び DDBJ等の塩基配列データベースを検索することにより 確認することができる。
新規な塩基配列については、 アミノ酸配列に変換した後、 F A S T A、 フレー ムサーチ （FrameSearch ) 等の相同性検索プログラムを用いて、 GenPept 、 PIR 、 Swiss- Prot等のアミノ酸配列データベースを検索することにより、 相同性をも つ既存の遺伝子を検索することができる。
前記記載の方法により取得した本発明の D N Aを宿主細胞中で発現させ、 本発 明のポリペプチドを製造するために、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレ ン卜 ·プロ卜コールズ.インモレキユラ— .バイオロジー等に記載された方法を 用いることができる。
すなわち、 本発明の D N Aを適当な発現べクタ一のプロモーター下流に挿入し た組換えベクターを造成し、 該ベクタ一を宿主細胞に導入することにより、 本発 明のポリぺプチドを発現する形質転換体を取得し、 該形質転換体を培養すること により、 本発明のポリべプチドを製造することができる。
宿主細胞としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的とす る遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。 特に、 健常人 の末梢血 T細胞に、 本発明の DNA を挿入した組換えべクタ一を導入して得られる 形質転換体は、 HIV感染者の遺伝子治療に用いることができる。
発現べクタ一としては、 前記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中 への組込みが可能で、 本発明の D N Aを転写できる位置にプロモーターを含有し ているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、 本発明の T細胞レセプターの 構成成分ポリぺプチド遺伝子発現ベクターは原核生物中で自律複製可能であると 同時に、 プロモーター、 リボソーム結合配列、 本発明の D N A及び転写終結配列 より構成された組換えベクターであること力 S好ましい。 プロモーターを制御する 遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、 例えば、 PSE280 (インビトロジェン社製） 、 P GEMEX- 1 (Promega社製） 、 pQE - 8 (QIAGEN社製） 、 pKYP I O
(特開昭 58- 1 10600) 、 p KY P 200 (Agric. Biol. Chem. , 48, 669 (1984)] 、 ρ L S A 1 [Agric. Biol. Chem. , 53' 277 (1989)] 、 pGEL 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 82, 4306 (1985)] 、 pBluescript II SK (-）
(STRATAGENE社） 、 pTr s30 (FERM BP-5407) , PTr s 32
(FERM BP - 5408) 、 pGHA2 (FERM BP— 400) 、 pG KA2 (FERM B-6798) , pTe rm2 (特開平 3— 22979、 U S 468619 K US4939094, US5160735) 、 pKK233 - 3 (アマシャム ' フアルマシア 'バイオテク社製） 、 pGEX (Pharmacia 社製） 、 P E Tシステム （Novagen 社製） 、 p S upe x、 pTrxFu s
(Invitrogen社） 、 MAL- c 2 (New England Biolabs社） 等をあげること ができる。
プロモーターとしては、 宿主細胞中で発現できるものであればいかなるもので もよい。 例えば大腸菌を宿主とした場合は、 ί£Εプロモーター （P ££ ) 、 lac ブロモータ一 、 PLプロモ一ター、 T7プロモーター、 PR プロモーター 等の、 大腸菌やファージ等に由来するプロモータ一等をあげることができる。 ま た Ptrpを 2つ直列させたプロモーター （P^£2 x2) , tacプロモータ一、 T7 lac プロモーター、 let I プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモ 一夕一等も用いることができる。 枯草菌を宿主とした場合は、 枯草菌のファージ である SP〇 1や S P〇 2のプロモーター、 penPプロモーター等をあげるこ とができる。
リボソーム結合配列としては、 シャイン-ダルガノ （Shine- Dalgarno) 配列と 開始コドンとの間を適当な距離 （例えば 6〜18塩基） に調節したプラスミドを 用いることが好ましい。
本発明の D N Aの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではない力 構造遺伝 子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。 宿主細胞としては、 ェシヱリヒア属、 セラチア属、 バチルス属、 ブレビバクテ リウム属、 コリネバクテリウム属、 ミクロバクテリウム属、 シユードモナス属等 に属する微生物、 例えば、 Escherichia coli XLl-Blue Escherichia coli XL2 -Blue Escherichia coli DH1 Escherichia coli MC1000 Escherichia coli KY3276 Escherichia coli W1485 Escherichia coli JM109 Escherichia coli HB101 Escherichia coli No. 49 Escherichia coli W3110 Escherichia coli NY49 Serratia ficaria^ Serratia fonticolax Serratia liquefaciens
Serratia marcescens Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefacienS Brevibacterium am oniagenes Brevibacterium immariophilum ATCC14068 Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium glutamicum ATCC14067 Corynebacterium glutamicum ATCC13869 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354 Pseudomonas sp. D- 0110等をあげる ことができる。
組換えべクタ一の導入方法としては、 前記宿主細胞へ D N Aを導入する方法で あればいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 〔Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) ] 、 プロトプラスト法 （特開昭 63 -248394 ) 、 エレクトロボレ一シヨン法 [Gene, 17, 107 (1982)、 Molecular & General Genetics, 168, HI (1979) ] 等を挙げることができる。
なお、 本発明のキラー T細胞レセプターの構成成分ポリべプチドをコードする DNA を含むプラスミドとして、 例えば、 キラー T細胞レセプ夕一の α鎖をコード する DNA を含む pH- RTl aや、 キラー T細胞レセブターの (3鎖をコードする pH- RT1 ]3などがあげられる。 プラスミ K PH-RTI aを含む大腸菌である Escherichia coli TGl/pH- RTl a及びプラスミ K PH-RTI βを含む大腸菌である Escherichia coli TGI /pH-RTl 0は、 平成 9年 8月 2 6日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術 研究所 (National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology ) (日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3 号） にそれぞれ FERM BP- 6078及び FERM BP- 6079として寄託されている。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 YE Pl3 (ATCC37115 ) 、 YEp24 (ATCC37051 ) 、 YCP50 (ATCC37419 ) 、 PHS19 、 PHS15 等を用いることができる。
プロモーターとしては、 酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 PH05プロモーター、 PGK プロモーター、 GAP プロモータ 一、 ADH プロモーター、 gal 1 プロモーター、 gal 10プロモーター、 ヒー卜ショ ヅクポリペプチドプロモーター、 MFal プロモーター、 CUP 1 プロモータ一等の プロモータ一を挙げることができる。
宿主細胞としては、 サッカロマイセス属、 シゾサッカロマイセス属、 クルイべ 口ミセス属、 トリコスポロン属、 シヮニォミセス属、 ピヒア属等に属する酵母菌 株をあげること力 Sでき、 具体的には、 Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe 、 Kluyveromyces lactis、 Trichosporon pullulans 、 Schwanniomyces alluvius 、 Pichia pastoris等をあげることがで きる。
組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DN Aを導入する方法であればい ずれも用いることができ、 例えば、 エレクトロボレ一シヨン法 [Methods in Enzymology, 194, 182 (1990) ] 、 スフエロプラス卜法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984) 〗 、 酢酸リチウム法 [Journal of Bacteriology, 153, 163 (1983) ] 等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 P C D NA I/Amp (インビ卜ロジェン社製） 、 p c D N A I、 pAMoERC3Sc、 pCD M8 [Nature, 329, 840 (1987) ] 、 pAGE 107 〔特開平 3- 22979 、
Cytotechnology, 3, 133 (1990) ] 、 PREP4 (インビトロジェン社製） 、 P AGE 103 (Journal of Biochemistry, 101, 1307 (1987) ] 、 pAMo、 p AMoA、 pAS 3 - 3 (特開平 2-227075) 等が用いられる。
プロモーターとしては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイトメガロウィルス （CMV ) の IE (i隱 ediate early ) 遺伝子のプロモーター、 SV40の初期プロモーターあるいはメタロチォネィンのプ 口モーター、 レトロウイルスのプロモーター、 ヒー卜ショックプロモーター、 S Raプロモータ一等をあげることができる。 また、 ヒ卜 C の IE遺伝子のェンハ ンサーをプロモータ一と共に用いてもよい。
動物細胞としては、 マウス ·ミエ口一マ細胞、 ラット · ミエローマ細胞、 マウ ス ·ハイブリ ドーマ細胞、 ヒ卜の細胞であるナマルバ （Namalwa ) 細胞又は Namalwa KJM- 1 細胞、 ヒ卜胎児腎臓細胞、 ヒト白血病細胞、 アフリカミドリザル 腎臓細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH0 細胞、 HBT5637 (特開昭 63-299) 等をあげることができる。
マウス ' ミエローマ細胞としては、 SP2/0 、 NS0等、 ラット ' ミエローマ細胞 としては YB2/0等、 ヒ卜胎児腎臓細胞としては HEK293 (ATCC : CRい 1573)等、 ヒト 白血病細胞としては、 BALL- 1等、 アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS- 1 、 COS- 7等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 動物細胞に D N Aを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法
[Cytotechnology, 3, 133 (1990) ] 、 リン酸カルシウム法 （特開平 2-227075) 、 リポフエクシヨン法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, U, 7413 (1987) ] 、 Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばバキュロウィルス ·イクスブレ ヅシヨン 'ベクターズ、 ァ♦ ラボラトリ一 'マニュアル [Baculovirus
Expression Vectors, A Laboratory Manual, . H. Freeman and し ompany, New York (1992) ] 、 モレキュラー 'バイオロジー、 ァ 'ラボラトリー 'マニュアル (Molecular Biology, A Laboratory Manual ) 、 カレン卜 ·プロ卜コー レズ ·ィ ン .モレキュラー 'バイオロジー、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載され た方法によって、 ポリぺプチドを発現することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入し て昆虫細胞培養上清中に組換えゥィルスを得た後、 さらに組換えゥィルスを昆虫 細胞に感染させ、 ポリぺプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 PVL1392 、 PVL1393 、 pBlueBacIII (ともにインビトロジヱン社製） 等をあげることができ る。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスである アウ トグラファ · カリフォルニ力， ヌクレア一 · ポリへドロシス . ウィルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用レ、ることができ る。
昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、 Trichoplusia ni の 卵巣細胞、 カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としては Sf9 、 Sf21 (バキュロウィルス · イクスプレ、ソション ·ベクターズ、 ァ ·ラボラトリー 'マニュアル） 等、 Trichoplusia ni の卵巣細胞としては High 5、 BTI- TN- 5B1- 4 (ィンビ卜ロジェン 社製） 等、 カイコ卵巣由来の培養細胞としては Botnbyx mori N4等をあげること力 できる。
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への前記組換え遺伝子導入べクタ 一と前記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法
(特開平 2- 227075) 、 リボフヱクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84^ 7413 (1987) ] 等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー · クローニング第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融合蛋白質発現等を行うこと ができる。
酵母、 動物細胞又は昆虫細胞により発現させた場合には、 糖あるいは糖鎖が付 加されたポリぺプチドを得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中に本発明の T 細胞レセプターの構成成分ポリべプチドを生成蓄積させ、 該培養物から採取する ことにより、 本発明の T細胞レセブターの構成成分ポリぺプチドを製造すること ができる。
また、 患者の生体内から採取した細胞に、 適切な本発明の T細胞レセブ夕一の 構成成分ポリペプチドを発現させるための発現ベクターを導入した後、 細胞を生 体内に戻すことにより、 本発明の T細胞レセプ夕一の構成成分ポリペプチドを患 者の生体内で発現させることもできる。 ， 本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の 方法に従って行われる。 大腸菌あるいは酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培 地としては、 微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転 換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いて もよい。
炭素源としては、 グルコース、 フルクトース、 スクロース、 糖蜜、 デンプン、 デンプン加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノー ル、 プロパノ一ル等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸ァ ンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩又 はその他の含窒素化合物の他、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチ一 プリカ一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕及び大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体又 はその消化物等が用いられる。
無機物としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシ ゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸 銅、 炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、 通常振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下、 1 5〜4 0 °C で 1 6〜9 6時間行う。 培養期間中、 P Hは 3 . 0〜9 . 0に保持する。 p Hの 調整は、 無機又は有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニア 等を用いて行う。
培養中は必要に応じて、 アンピシリンゃテトラサイクリン等の抗生物質を培地 に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現べクタ一で形質転換し た微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデューサーを培地に添加しても よい。 例えば、 lac プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を 培養するときにはイソプロピル一 0— D—チォガラクトビラノシド （I P T G ) 等を、 trp プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはインドール酢酸 （I A A ) 等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使 用されている R P M I 1 6 4 0培地、 E a g 1 eの M E M培地又はこれら培地に 牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。 培養は、 通常 5 % C 0 2 存在下、 3 5〜3 7 °Cで 3〜7日間行い、 培養中は必要に応じて、 カナマイシン、 ぺニシ リン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されている TN - FH培地 [ファーミンジヱン （Pharmingen) 社製] 、 Sf900I ISFM [ライフテクノロジーズ （Life Technologies ) 社製] 、 ExCell400 、 ExCe 11405 [いずれも JRH バイオサイエンシーズ （JRH Biosciences ) 社製] 等が用 いられる。
培養条件は、 pH6〜7、 培養温度 2 5〜3 0 °Cがよく、 培養時間は通常 1〜5 日間である。 また、 培養中は必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地 に添加してもよい。
前記形質転換体の培養液から、 前記方法により発現させた本発明の T細胞レセ プタ一の構成成分ポリペプチドを単離精製するためには、 通常の酵素の単離、 精 製法を用いればよい。
例えば、 本発明のポリペプチドが、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培 養終了後、 細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、 超音波破砕機、 フ レンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破 砕し、 無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、 通常の酵素の単 離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈 殿法、 ジェチルアミノエチル （DEAE) —セファロース、 DIAION HPA- 75 (三菱化 学社製） 等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S- Sepharose FF
(フアルマシァ社製） 等のレジンを用いた陽ィォン交換クロマトグラフィ一法、 ブチルセファロ一ス、 フヱニルセファロ一ス等のレジンを用いた疎水性クロマト グラフィ一法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティークロマトグラフィー 法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独 あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることができる。
また、 該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細 胞を回収後破砕し、 遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、 通常の方 法により該ポリぺプチドを回収後、 該ポリぺブチドの不溶体を蛋白質変性剤で可 溶化する。 '
該可溶化液を、 蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質 が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、 該ポリペプチドを正常 な立体構造に構成させた後、 前記と同様の単離精製法により精製標品を得ること ができる。
本発明のポリぺプチドあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された 場合には、 培養上清に該ポリぺプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収 することができる。
即ち、 該培養物を前記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可 溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 前記と同様の単離精製法を用いることに より、 精製標品を得ることができる。
また、 本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生 産し、 融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティークロマ トグラフィ一を利用して精製することもできる。 例えば、 ロウらの方法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop. , 4, 1288 (1990) ] 、 特開平 05- 336963 、 特開平 06-823021 に記載の方法に準じて、 本発明のポリぺプ チドをプロティン Aとの融合タンパク質として生産し、 ィムノグロプリン Gを用 いるァフィ二ティークロマトグラフィーにより精製することができる。 また、 本 発明のポリべプチドを F 1 a gぺプチドとの融合タンパク質として生産し、 抗 F 1 a g抗体を用いるァフィ二ティ一クロマトグラフィーにより精製すること力 s できる [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989) 、 Genes Develop. , 4, 1288 (1990) ] 。 更に、 該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたァフィ二ティ 一クロマトグラフィーで精製することもできる。
更に、 本発明のポリペプチドは、 該ポリペプチドの有するアミノ酸配列情報に 基づいて、 F m o c法 （フルォレニルメチルォキシカルボニル法） 、 t B o c法 ( t -プチルォキシカルボニル法） 等の化学合成法によつても製造することがで きる。
また、 アドバンス卜 'ケムテック （Advanced ChemTech ) 社、 パーキン ·ェ ルマ一社、 フアルマシア社、 プロテイン ' テクノロジー ' インストウルメン卜
(Protein Technology Instrument ) 社、 シンセセノレ ·ベ刀 (Synthecell— Vega) 社、 パーセプティブ （PerS印 tive) 社、 島津製作所等のペプチド合成機を利用し 化学合成することもできる。
精製した本発明のポリべプチドの構造解析は、 蛋白質化学で通常用いられる方 法、 例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析 （平野久著、 東京化 学同人発行、 1 9 9 3年） に記載の方法により実施可能である。
トランスジュニック動物とは、 外来遺伝子を動物の発生初期に導入して得られ る動物のことであり、 例えばマウス、 ラッ 卜、 あるいはゥシ、 ヒッジなどの家畜 などがあげられる。 以下にトランスジエニックマウスの作製について述べる。 本発明のトランスジヱニックマウスは Hogan, B. ら [Manupulating the mouse embryo. A laboratory manual. 2nd ed. 1994. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. ] 及び Yamamura, K. ら [丄 Biochem. , 96, 357-363 (1984) ] の方法に準じて製造することができる。 すなわち、 ホルモン処理した雌の C57BL/ 6 マウスを交配させた後、 受精卵を取り出し、 受精卵の雄性前核内に、 調製した ベクター部分を含まない導入遺伝子のフラグメントをマイクロガラスピぺットを 用いてマイクロインジェクションする。 得られた遺伝子導入卵のうち、 生き残つ た数百個の偽妊娠雌マゥスの卵管に移植し、 トランスジヱニックマウスを作製す る。
更に、 本発明のポリペプチドを認識する抗体は、 以下のようにして作製するこ とができる。
まず、 前記で得られた該蛋白質を抗原として免疫する。 免疫する方法として は、 動物の皮下、 静脈内又は腹腔内に抗原をそのまま投与してもよいが、 抗原性 の高いキャリアタンパク質を結合させて投与したり、 あるいは適当なアジュバン 卜とともに抗原を投与することが好ましい。
キャリアタンパク質としては、 スカシガイへモシァニン、 キーホールリンぺッ 卜へモシァニン、 牛血清アルブミン、 牛チログロブリン等があげられ、 アジュバ ンドとしては、 フロインドの完全アジュバン卜（Co即 lete Freund ' s Adjuvant)、 水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン等があげられる。 免疫動物としては、 ゥサギ、 ャギ、 3〜2 0週令のマウス、 ラッ 卜、 ハムス ターなどの非ヒト哺乳動物があげられる。
抗原の投与は、 1回目の投与の後、 1〜2週間毎に 3〜1 0回行う。 抗原の投 与量は動物 1匹当たり 5 0〜1 0 0 /1 gが好ましい。 各投与後、 3〜7 日目に免 疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、 該血清の抗原との反応性につ いて、 酵素免疫測定法 [酵素免疫測定法 （ELISA法） ：医学書院刊 （ 1 9 7 6 年） ] などで確認する。
そして、 該血清が十分な抗体価を示した非ヒ卜哺乳動物を、 血清又は抗体産生 細胞の供給源とする。
ポリクロ一ナル抗体は、 該血清を分離、 精製することにより調製することがで きる。
モノクローナル抗体は、 該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞と を融合させてハイプリ ドーマを作製し、 該ハイプリ ドーマを培養するか、 動物に 投与して該細胞を腹水癌化させ、 該培養液又は腹水を分離、 精製することにより 調製することができる。
抗体産生細胞は、 抗原投与された非ヒト哺乳動物の脾細胞、 リンパ節、 末梢血 などから採取する。
骨髄腫細胞としては、 マウスから得られた株化細胞である、 8-ァザグァニン耐 性マウス （BALB/c由来） 骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8- Ul (P3-U1) [G. Kohlerら； ョ一 口ビアン♦ジャーナル'ォブ ·ィムノロジィ （Europ. J. Immunol. ) , 6, 511 (197 6) ] 、 SP2/0-Agl4 (SP-2) [Μ. Shulman ら；ネイチヤー（Nature)， 276, 269 (1978) ] 、 P3-X63-Ag8653 (653) [J. F. Kearney ら；ジャーナル'ォブ ·ィムノロジィ (J . Immunol. ) ， 123, 1548 (1979) ] 、 P3-X63-Ag8 (X63) [G. Kohlerら；ネィチヤ - (Nature) , 256, 495 (1975) ] など、 イン . ビトロ （in vitro) で増殖可能な骨 髄腫細胞であればいかなるものでもよい。 これらの細胞株の培養及び継代につい てはアンチボディーズ ·ァ ·ラボラトリ一 'マニュアル [Antibodies -A Labora tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988、 iiT アンチボアイーズ •ァ ·ラボラ卜リ一 ·マニュアルと略す。 ] に従い、 細胞融合時までに 2 107 個以上の細胞数を確保する。 前記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄した後、 ポリエチレングリ コール- 1000 (PEG- 1000)などの細胞凝集性媒体を加え、 細胞を融合させ、 培地中 に懸濁させる。 細胞の洗浄には M E M培地又は P B S (リン酸ニナトリゥム 1. 83 g 、 リン酸一力リゥム 0. 21g 、 食塩 7. 65g 、 蒸留水 1 リットル、 pH7. 2 ) などを 用いる。 また、 融合細胞を懸濁させる培地としては、 目的の融合細胞のみを選択 的に得られるように、 HAT培地 {正常培地 [RPMI- 1640 培地に 1. 5mM グルタミ ン、 5 X 10" 5 2-メルカプトエタノール、 10 u g/mlジヱンタマイシン及び、 10% 牛胎児血清 (FCS) (CSL社製） を加えた培地] に 10— 4M ヒポキサンチン、 1. 5 x 10" SM チミジン及び 4 X 10" 7M アミノプテリンを加えた培地 } を用いる。
培養後、 培養上清の一部をとり、 酵素免疫測定法により、 抗原蛋白質に反応 し、 非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。 ついで、 限界希釈法により クローニングを行い、 酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたも のをモノクローナル抗体産生ハイブリ ド一マ株として選択する。
酵素免疫測定法
抗原蛋白質あるいは抗原蛋白質を発現した細胞などを 9 6ゥュルプレー卜に コートし、 ハイプリ ドーマ培養上清もしくは精製抗体を第一抗体として反応させ る。
第一抗体反応後、 プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
第二抗体とは、 第一抗体のィムノグロブリンを認識できる抗体を、 ピオチン、 酵素、 化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗体である。 具体的には ハイプリ ドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、 第二抗体としては、 マウ スィムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。
反応後、 第二抗体を標識した物質に応じた反応を行ない、 抗原に特異的に反応 するモノクローナル抗体を生産するハイプリ ドーマとして選択する。
モノクローナル抗体は、 ハイプリ ドーマ細胞を培養して得られる培養液、 又は プリスタン処理 〔2, 6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン（Pristane) 0. 5ml を腹腔 内投与し、 2 週間飼育する] した 8 〜10週令のマウス又はヌードマウスに、 モノ クロ一ナル抗体産生ハイブリ ドーマ細胞を腹腔内投与して腹水癌化させた腹水か ら、 分離、 精製することにより調製できる。 モノクローナル抗体を分離、 精製する方法としては、 遠心分離、 40〜50%飽和 硫酸アンモニゥムによる塩析、 カブリル酸沈殿法、 DEAE- セファロースカラム、 陰イオン交換カラム、 プロテイン A又は G - カラムあるいはゲル濾過カラム等を 用いるクロマトグラフィー等を、 単独又は組み合わせて行う方法があげられる。 この方法により、 IgG あるいは IgM画分を回収し、 精製モノクローナル抗体を取 得することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 樹立した T細胞クローンである RT-1、 RT- 2及び RT- 3が、 どのペプチド を認識するかを観察した結果を示す。
図 2は、 樹立したキラー T細胞クローン RT-1由来細胞を、 1 ) 補体のみで処 理、 2 ) 補体と抗 CD8抗体で処理、 3 ) 補体と抗 CD4抗体で処理、 4 ) 未処理し たときの細胞傷害活性の変化を表したグラフである。
図 3は、 P18がどのようなクラス I HC分子とともに提示されたときに、 キラ —T細胞クローン RT-1力 S特異的認識を行う力を調べた実験結果を示す。 Class I HC:KDL とは、 マウスにおいて、 抗原を提示するクラス I MHC分子は、 K、 D、 Lの領域よりなり、 例えばマウス B10. D2 では、 K a 、 D a 、 L d であることを 示す。
図 4は、 PCR で增幅されたキラ一 T細胞クローン RT-1より得られた V )3 8. 1 DNAをァガロースゲル電気泳動により確認した結果を示す。
図 5は、 T細胞クローン RT-1を抗 )3 8. 1抗体で染色し、 フローサイトメトリ一 を用いて解析した結果を示す。
図 6は、 PCRで増幅されたキラ一 T細胞クローン RT-1より得られた V a 42Hll DNAをァガロースゲル電気泳動により確認した結果を示す。
図 7は、 RT-1の TCR α鎖の全長 cDNAの作製についての概略図である。 α鎖は 5 ' RACE法によって V αを検索した。
図 8は、 RT-1の TCR J3鎖の全長 cDNAの作製についての概略図である。 3鎖は RT -1のジャンクショナル領域（junctional region) の PCR産物を既知の V /3 8. 1 を 含む /3鎖にリコンピナン卜 PCR法を用いて組み込んだ。
図 9は、 RT- 1TCR α鎖及び / 鎖の In vitroトランスフユクシヨン用発現べク ター BCMGSNeoを示す。
図 1 0は、 RT-1TCR α鎖及び /3鎖のトランスジエニック用発現べクタ一 PHSE3 ' を示す。
図 1 1は、 樹立した TCR αと ]3鎖のトランスジエニックマウスの tail DNAのサ ザンブロットを示す。
図 1 2は、 RT-1 TCRa鎖及び )3鎖のトランスジエニックマウスにおけるトラン スジーンの発現を解析した結果を示す。 TCR α鎖の発現については、 TCR α鎖に 対する抗体がないため、 RT-PCRで確認した。 トランスジヱニックマウスの胸腺及 び脾臓を摘出して mRNAを抽出し、 RT- PCRを行つたところ、 どちらの組織でも TCR α鎖に相当するバンド力5'見られた （上図） 。 TCR )3鎖は特異抗体としての抗 V j3 8 (F23. 1) にて CD8 + T細胞を FACS解析した (下図) 。
図 1 3は、 トランスジエニックマウス由来細胞の特異的細胞傷害活性を示すグ ラフである。 LINE-OVAとは、 卵白アルブミンに特異的に反応する T細胞株 （ネガ ティブコントロール） 、 LINE-IIIB とは、 HIV-IIIB株に特異的に反応する T細胞 株 （ポジティブコントロール） 、 TG- spe (fresh/CD8 rich)とは、 トランスジェニ ックマウスの脾臓細胞で、 未培養 CD8+細胞、 TG-spe (fresh/whole) とは、 トラン スジュニックマウスの脾臓細胞で、 未培養全細胞を指す。 標的細胞で、 Neo と は、 Neo 遺伝子導入 BALB/c. 3T3細胞 （コントロール細胞） 、 Neo*18MNとは、 HIV MN株由来の P18 ペプチドをパルスした Neo遺伝子導入 BALB/c. 3T3細胞、 Neo*18IIIBとは、 HIV-IIIB株由来の P18 ペプチドをパルスした Neo遺伝子導入 BALB/c. 3T3細胞をそれぞれ指す。
図 1 4は、 トランスジヱニックマウス由来細胞を、 1 ) 補体のみで処理、 2 ) 補体と抗 CD8抗体で処理、 3 ) 補体と抗 CD4抗体で処理したときの細胞傷害活性 の変化を表したグラフである。 15-12 とは、 BALB/c. 3T3細胞に HIVの env gP160 遺伝子を導入したトランスフヱクタン卜、 Neo*18IIIBとは、 HIV-ΙΠΒ株由来の P18 ペプチドをパルスした Neo遺伝子導入 BALB/c. 3T3細胞、 Neo とは、 Neo遺伝 子導入 BALB/C. 3T3細胞をそれぞれ指す。 2 ) で、 抗 CD8抗体と補体処理により細 胞傷害活性が消失したことより、 CD8 + T細胞が特異的キラ一活性を有しているこ とがわかる。
図 1 5は、 各種卜ランスジエニックマウスの脾臓細胞を BALB/c. 3T3細胞に ΗΠ の env遺伝子を導入したトランスフヱクタント（15-12) で刺激した後、 誘導され たキラ一 T細胞を 15-12 、 Neo遺伝子導入 BALB/c. 3T3細胞に ΠΙΒ株由来の P18ぺ プチドをパルスした細胞 (Neo*18IIIB)及び BALB/c. 3T3細胞に Neo遺伝子を導入し た細胞 (Neoコン卜ロール細胞） でそれぞれ刺激した後の細胞傷害活性を示した図 である。 TCR α |3発現卜ランスジエニックマウスで細胞傷害活性が見られるのみ ならず、 TCR 3発現トランスジエニックマウスでも細胞傷害活性が見られた。 図 1 6は、 細胞傷害活性を有する TCR 3発現トランスジエニックマウスの HIV gpl60 で刺激する前後での α鎖のレパートリー （型） について RT-PCR法を用い て調べた結果を示す。 刺激前の α鎖はさまざまな型を有しているものの、 刺激後 は単一の型 （V a 4 2 H l 1 J α 2 5 ) になる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれらの実 施例に限定されるものではない。
実施例 1 P18特異的なキラ一 Τ細胞クローン （RT- 1、 RT-2、 RT-3) の樹立
P18特異的なキラ一 T細胞クローン （RT- 1、 RT-2、 RT-3) を樹立するため、 P18 に対し高い反応性を示すこと力 s'知られている BALB/cマウス （Η-2·ν、プロタイ プ） （6週齢、 雌性） [PNAS, 85, 3105 (1988) ] の尾静脈より、 マウスあたり 107PFUとなるように HIV- 1 ΠΙΒ株のエンベロープタンパク質 gpl60 を発現させる 組換えゥクシニアウィルス [Nature, 320, 535 (1986) ] を投与し免疫した。 4 週間後、 免疫マウスより脾臓を摘出し、 赤血球除去等の操作を経て感作リンパ球 を作製した。 該感作リンパ球を、 P18力 S結合した同系抗原提示細胞を放射線照射 したもの （3，300rad) 、 あるいは P18 を発現している同系線維芽細胞 [PNAS, 85, 3105 (1988) ] (以下、 P18発現線維芽細胞と称す） をマイ卜マイシン- Cで 不活化したもので刺激することにより、 P18結合細胞を特異的に傷害するキラ一 T細胞株を樹立した。 更に、 RPMI1640に 10¾FCS (ゥシ胎児血清) 、 2mM Lーグル タミン、 100U/tnl ペニシリン、 10 /i g/ml ストレプトマイシン、 5 x lO_5M 2 一メルカブトエタノール、 10 HEPES バッファ一を加えた培地 [以下、 C T M (Complete T cell medium) と称す] を用いて限界希釈法を行い、 キラー T細胞 含有培地を 96ゥエルの丸底マイクロタイタープレートに 0. 3 /ゥエルになるよう にまき、 それぞれのゥエルに前記の不活化線維芽細胞を 104 ウエルずつ添加し 再刺激した。 そして 3〜4曰ごとに 10% ラッ 卜 T- STIM (コラボレーティブ · リサ ーチ社製） 含有 CB1 で培養液の半量を交換し、 更に 2週間に一回の割合で P18 発 現線維芽細胞による刺激を継続することにより、 約 1000ゥエルの中より、 P18 特 異的なキラー T細胞クローンを 3クローン （RT-1, RT-2, RT-3) 樹立した （図 1 ) 。 図 1は、 HIV env をカバーする種々の合成ペプチド （No. 1〜55) を用い て、 どのペプチドを提示するかを観察したところ、 No. 18に相当する P18 を結合 させた細胞に対して、 RT- 1、 RT- 2及び RT-3 はそれぞれ特異的に認識しているこ とを示す。 またこれらのクローンはすべて CD8 分子陽性の Daクラス I MHC分子に 拘束されたキラー T細胞であることを確認した。 結果を図 2及び図 3に示す。 図 2は、 樹立したキラー T細胞クローン RT-1由来細胞を、 1 ) 補体のみで処 理、 2 ) 補体と抗 CD8 抗体で処理、 3 ) 補体と抗 CD4抗体で処理、 4 ) 未処理し たときの細胞傷害活性の変化を表したグラフである。 グラフを見て明らかなよう に、 細胞傷害活性は補体と抗 CD8 抗体の処理により除去されることより、 CD8 + T 細胞が P18 特異的キラー活性を有していることがわかる。
また図 3は、 P18 がどのようなクラス I MHC分子とともに提示されたときに、 キラ一 T細胞ク口一ン RT- 1が特異的認識を行うかを調べた実験結果を示す。 マウスにおいて、 抗原を提示するクラス I MHC分子は、 K、 D、 Lの領域よりな る力 図では D a 拘束性である B10. D2 マウスのみ選択的に認識し、 細胞傷害活 性を有していることがわかる。 したがって、 キラ一 T細胞クローン RT- 1は、 P18 を D。 クラス MHC拘束性によって細胞を傷害することがわかる。
実施例 2 P18 特異的なキラー T細胞クローンからの T細胞レセブター遺伝子 の単離
まず P18 特異的な T細胞レセプターの α鎖及び 0鎖の V 領域を決定し、 続いて 結果に基づいて、 それぞれの T細胞レセプター領域の遺伝子配列を同定していつ た。
1 . P18 特異的なキラー Τ細胞クローン RT-1からの mRNAの抽出
まず、 樹立した P18 特異的なキラー T細胞クローンの中より比較的増殖性及び キラー活性の強い RT- 1を、 実施例 1記載の刺激を繰り返すことにより、 約 6か月 を経て細胞を 1 X 108 個まで増殖させることができた。 そして、 5 X 107 個の細 胞ペレットから mRNAを効率よく抽出するため、 ファーストトラック バージョン
2. 0 mRNA アイソレーション [Fast TrackVersion2. 0 mRNA Isolation；ィンビト ロジユン（Invitrogen ) 社製] を使用し、 以下に述べる a)〜g)の手順で、 界面活 性剤を添加することにより融解させた細胞溶解物から、 オリゴー dTカラムを用い て mRNAを抽出した。
a) 50ml のチューブに移した細胞のペレツ 卜に 15mlのライシス ·バッファー ( lysis buffer) (キッ ト内のストツク ·バッファー （stock buffer) 15mlに
0. 3ml の RNase protein degraderを加えたもの） を添加し、 10〜20秒間撹拌す る。
b) a) で得られた細胞溶解物を 21Gの針の付いた 20mlの注射器を数回通し、 45 °Cの恒温槽中で 60分間緩やかに振盪し、 蛋白及び RNA分解酵素を分解する。
c) b) で得られた溶液 15mlに 0. 95mlの 5M NaCl を加えよく撹拌した後、 キット に添付されている mRNAに直接結合するオリゴ (dT)夕ブレットを 1錠入れ、 室温に て 60分間緩やかに振盪する。
d) 溶液を 2, 000rpm、 5 分間遠心分離し、 上清を捨て、 ペレツ卜にキット内の 結合バッファー (binding buffer) を 20ml添加し、 数回 2, 000rpm、 5 分間遠心洗 浄したものをオリゴ— dTカラムに通塔する。
e) 低塩バッファー （low salt buffer ) 300 1 を添加したオリゴ— dTカラ ムを、 5, 000rpm、 10 秒間遠心を繰り返した後、 オリゴ— dTカラムに溶出バッフ ァー （elution buffer) を総計 400 1 を添加し、 5, 000rpm、 10秒間遠心分離後 に mRNA抽出液を得る。
f) 該 mRNA液に 2 M酢酸ナトリウム 60 1 と 1 , 150 1 の 100 %エタノールを 加え- 70 で〜- 80 °Cのフリーザー中に一昼夜保存する。 g) mRNAペレツ卜の入ったエツペンドルフチューブを 15， 000rpm数秒間遠心分 離し、 ペレツ卜に溶出バッファ一 50 ill を加え、 吸光度を 260nm で測定し、 抽 出された mRNAの量を算出して、 以下の T細胞レセプ夕一シークェンスの決定実験 へと進んだ。
2. |3鎖の種別及びシークェンスの決定
RNase によって容易に分解される不安定な mRNAは、 逆転写酵素と基質である核 酸の存在によつて容易に安定な cDNAに変換される。 このことを利用したジーンァ ンプ' RNA · PCRキッ ト [GeneAmp RNA PCR Kit ； パーキンエルマ一 ·シー タス （Perkin Elma Cetus ) 社製〗 を用いて以下の解析を行った。 マウス T細胞 レセプターの 13鎖 V領域 （以下、 V (3領域と称す） は V 01- V (317のうちのいず れかである。 そこで、 それぞれの 5' 末端の特徴的配列に基づいてデザインされ たプライマー群と、 すべての |3鎖に共通して見られるマウス T細胞レセプターの 3鎖 C領域 （以下、 C 0領域と称す） の配列に基づいたプライマ一 （CB04E;配列 番号 2) とで、 クローン由来の mRNAを増幅させる RT-PCR法を行った。 得られた試 料をァガロースゲル電気泳動した結果、 V |38 のプライマ一 （配列番号 1 ) につ いて cDNAの増幅がみられた。 続いて、 のサブクラスを同定するため、 上述 で用いたプライマーとは異なる配列を有する V ]38 サブクラスのブライマーと CB04E プライマー （配列番号 2) とを組み合わせて、 nested PCRを行った。 得ら れた試料をァガロースゲル電気泳動した結果、 V 138.1 のプライマー （配列番号 3) について cDNAの増幅が認められた （図 4) 。 更に、 RT- 1を抗 V |38.i 抗体
(ファーミンジェン社製） で染色し、 フローサイトメトリ一も用いて、 発現して いる T細胞レセプター (3鎖の V領域が 08.1 であることを確認した （図 5) 。 また、 PCR産物より DNA を回収精製し、 それにダイデォキシ ·ターミネータ一
(DyeDeoxy Terminator ) を添加した後、 電気泳動を行い遺伝子配列自動解析装 置 ABI (Applied Biosystem社製） を用いて、 配列番号 6に示す T細胞 ]3鎖の遺伝 子配列を決定した。
以下に詳細を述べる。 ， 0.5ml マイクロチューブに、 25mM MgCl2溶液 4 1、 PCR バッファ一 （xiO) 2 l dGTP、 dATP、 dTTP及び dCTP各 2 " 1、 RNase インヒビタ一 1 1、 逆 転写酵素 1 l、 3 ' 末端プライマー（CB04E) 1 1、 mRNA2 1を入れ voltex mixer で数秒間撹拌後、 42°Cで 15分間、 99 でで 5分間、 5 °Cで 5分間を 1サ ィクルとして、 1サイクルの PCR を行った。 続いて、 該 PCR反応液に Mg 2 4 1 、 PCR ノ ツファ一 （ X 10) 2 w 1 、 蒸留水 65.5 1 、 アンブリ タック (AmpliTaq) D N Aポリメラーゼ 0.5 1 の溶液を添加するとともに、 5' 末端 プライマ一 （Vi3 ト V β 17)をそれぞれの試料に 2 ul ずつ添加し、 95°Cで 2 分間を 1サイクル、 95°Cで 1分間、 60°Cで 1分間を 35サイクル、 5 °Cで 7分間を 1サイクルで PCR を行った。
得られたそれぞれの 5' 末端プライマー（Vj3 l〜V 3 Π)に対応した溶液中に おいて、 2¾ァガロースゲル電気泳動を行い、 バンドの有無を確認した。 今回の結 杲では、 V j38 (配列番号 1 ) と CB04E (配列番号 2) のプライマーで挟まれた 部分に DNAのバンドが確認された。
次に、 RT- 1由来の mRNAと V J38.1 の 5 '末端からのプライマー （配列番号 3) ならびに CB04E プライマー （配列番号 2) 、 及び逆転写酵素を用いて得られた 13鎖の cDNAを含む PCR反応液全量 （50 1 〜100 /xl)を 1.0% ァガロースゲル
(SeaKem™ GTG Agarose) 電気泳動し、 切り出した。 切り出したゲルはヨウ化 ナトリウム （Nal)溶液に溶かし、 DNA 回収用ガラスパウダー （EASY TRAP TM Ver.2，宝酒造社製） を添加した。 室温で 5 分間放置し、 DNA を吸着させた後、 PBS で洗浄し、 ペレツ卜に滅菌蒸留水あるいは TE Buffer を加え 55°Cで 5 分間培 養し、 DNA を抽出した。 上清中の純化した DNA を回収し、 DNA の遺伝子配列を決 定した。 以下に方法を示す。
回収された DNA約 50〜200ng に V |38.1 の 5'末端からのプライマー （配列番号 3) ならびに CB04E プライマー （配列番号 2) 各 3.2pmol を添加し、 更に、 レ ィディ · リアクション ' ダイデォキシ ·ターミネータ一 ·サイクル ·シークェ ンス ·キッ 卜 (Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit ) PRISM™ (PERKIN ELMER CETUS社製） に含まれる、 色素でラベルしたターミネ一 ター （terminator) であるデォキシリボースとアンプリタック （AmpliTaq) DNAポ リメラーゼ及び H20 を添加し、 96°Cで 10秒間、 50°Cで 5 秒間、 60°Cで 4分間を 1 サイクルとして 25サイクル PCR を行った。 PCR産物を 6.75% Long Ranger™ Gel (宝酒造社製） にのせ、 およそ 40ワットの電力で 14時間泳動し、 遺伝子配列解 析装置 (ABI373 タイプ、 Applied Biosystem社製） で読みとり、 全遺伝子配列を 決定した。 その結果、 RT-1の T細胞レセブター )3鎖の塩基配列は、 V 38.1- D 3 - J 32.1 —C )32であった。 RT-1の T細胞レセプター /3鎖のアミノ酸配列を配 列番号 7、 塩基配列を配列番号 6に記す。 T細胞レセプターの /3鎖をコードする DN Aを含むプラスミド pH-RTl/3を導入した大腸菌である Escherichia coli TGI /pH-RTl 3は、 平成 9年 8月 26日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術 研究所 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に FERM BP-6079として寄託さ れている。
3. α鎖の種別及びシークェンスの決定
マウス Τ細胞レセブ夕一の α鎖 V領域 （以下、 Va領域と称す） は、 Val-V α 12の 12種類の V領域及びそのサブタイプを含み、 ；3鎖に比較してかなり複雑な 様相を呈しており、 約 80種類もの V領域が存在することカ¾1られている。 ；3鎖の 場合と同様、 それぞれの特徴的配列に基づいてデザィンされたプライマ一群と、 すべての α鎖に共通して認められる C α領域のプライマ一 （ェクソン一 3 Ca-R ；配列番号 5) とでクローン RT-1由来の mRNAを RT-PCR法を用いて、 実施例 2の 2 と同様に増幅させた。 実験を何度も繰り返したが、 いずれのプライマーでも増幅 がかからなかったため、 データベース （Geneバンク） より更に多数の例外的な Vaのブライマーを作成して検討した結果、 Va42Hll ブライマー （配列番号 4) により増幅がみられること力確認された。 更に、 Va42Hll の種々の部分の ブライマ一を使用して nested PCRを行った。 增幅後、 電気泳動を行い、 バンドが 検出されたことより、 Va42Hll 力 T-1の構成要素であること力 ^確認された （図 6) 。
/3鎖の場合と同様、 RT-1由来の mRNAと Va42Hll (配列番号 4) ならびにェク ソン一 3 C α-R (配列番号 5 ) 、 及び逆転写酵素を用いて得られた a鎖の cDNAを 作成し、 精製した DNAに色素でラベルしたダイデォキシリボースを添加し、 遺 伝子配列解析装置を用いてその遺伝子配列を決定した。 その結果、 RT-1の T細胞 レセプ夕一 a鎖の塩基配列は、 Va42Hl卜 J a25— Caであった。 RT-1の T細胞 レセプター a鎖のアミノ酸配列を配列番号 9、 塩基配列を配列番号 8に記す。 T 細胞レセプ夕一の a鎖をコードする DN Aを含むプラスミド pH- RTlaを導入した 大腸菌である Escherichia coli TG1/PH-RT1 αは、 平成 9年 8月 2 6日付で通商 産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に FERM BP-6078として寄託されている。
実施例 3 T細胞レセプターの発現と機能解析
1 . クローン RT- 1の TCR a及び ( 鎖全長 cDNAの調製
次に、 機能的な T細胞レセプター発現のために、 全長 cDNAクローンを以下の方 法で調製した。
A . T細胞レセプター a鎖
実施例 2より明らかとなった V a 42H11 を含む a鎖の全長 cDNAを得るために、 既知である V α 42Η11 を使用しているィンシュリン特異的な T細胞クローン由来 の全長 cDM [Mol. Cell. Biol. , 7, 1865-1872 (1987) ] の VJC結合領域 （J領 域と、 その両端の V及び C領域の一部） をコードする DNAを RT- 1の VJC結合領域 をコードする DNAと置換することによって、 P18 特異的な結合領域を有する全長 TCR a鎖 cDNAを作製した （図 7 ) 。
一方、 T細胞レセプタ一 a鎖は、 同一の V領域のなかに数種のサブファミリ一 を有するものが多いとともに、 単一 T細胞が二つの a鎖を発現することも知られ ているため、 PCR で検出した VJC結合部分付近の V領域配列が V α 42Η11 と同一 でも 5' 上流に変異のある、 同一ファミリ一の異なるサブファミリーである可能 性、 更には、 全く異なるもう一つの a鎖を発現している可能性がある。 そこで、 C a部位の任意の配列のプライマー （図 7中の G S P - 1及び G S P - 2 ) と oligo dTプライマーを用いて、 RT- 1の tnRNAから C aより上流部分の cDNAを 5' RACE法にて作製し、 その塩基配列を決定した （配列番号 8 ) 。 その結果、 得られ たクローンの大部分は V a 42H11 そのものと同一の塩基配列であることが判明し た。 し力 し、 少数のクローンは V aの 5 '側に 2アミノ酸の変異を有するサブファ ミリ一 （既に V a 5. 3. 18として知られるやはりインシュリン特異的な T細胞クロ ーン由来） [Mol. Cell. Biol. , 7, 1865-1872 (1987) ] と考えることができる a鎖の配列を示した。 少数クローンの RT- 1の T細胞レセプター a鎖のアミノ酸配 列を配列番号 1 1、 塩基配列を配列番号 1 0に記す。 両者が特異的な TCR a鎖を コードしている可能性が考えられる力 当面、 大部分のクローンと一致した V a 42H11 (ァミノ酸配列；配列番号 9、 塩基配列；配列番号 8 ) 力 P18 特異性を決 めている T細胞レセプター α鎖の V α領域として、 その発現を以下に試みた。 Β. Τ細胞レセプター 13鎖
V ]3領域については V α領域のようにサブファミリ一がない。 5' RACE法を用 いて配列を決めず、 RT- PCRを用いて V- D J領域及び C領域を増幅して、 それ ぞれを繋ぎ合わせて全長 V 08.1 とした。 そこで、 V 38.1 を発現している LCMV (lymphocytic choriomengitis virus)ウィルス特異的な T細胞クローンの全長 TCR j3鎖 cDNA (pl4 TCR /3 ) [E廳 0 J. , 8, 719-727 (1989) ] の VDJC結合領域 (D— J領域と、 その両端の V及び C領域の一部） をコードする DNA を、 RT- 1の j3鎖の VDJC結合領域をコードする DNA とをリコンピナン卜 PCR 法を用いて置換 し、 全長 TCR |3cDNAを作製した （図 8) 。 アミノ酸配列を配列番号 7に、 塩基配 列を配列番号 6に示す。
2. P18 特異的 T細胞レセプター α及び T細胞レセプター 13鎖遺伝子の発現べク ターの作製
実施例 3の 1で作製した RT- 1由来の P18 特異的 Τ細胞レセプター α鎖 （1.3 kb) 及び T細胞レセプター /3鎖（1.1 kb)の全長 cDNAの遺伝子配列を確認した後、 それぞれを発現ベクターに揷入した。 細胞株への in vitroトランスフヱクショ ン用には、 サイ トメガロウィルス （CMV ) プロモーターを有する発現ベクター BCMGS Neo [J. Exp. Med. , 169, 13-25 (1989) ] を用いた （図 9 ) 。 またトラ ンスジエニックマウス作製用には、 Η- 2Kb プロモーター/ Ig ェンハンサーを有す る発現ベクター PHSE3' [EMBO J. , 8， 719-727 (1989) ] を用いた (図 1 0 ) 。 前 者は Xholサイ卜に、 後者では BamHl/Sallサイ卜に平滑末端ライゲ一シヨンをして T細胞レセプター α鎖 （1.3 kb) 及び T細胞レセプター 13鎖（1.1 kb)を挿入し、 組換えベクターである BCMG- RTla、 BCMG- RT1 j3、 pH_RTl α及び pH- RT113をそれぞ れ作製した。
3. RT- IT細胞レセプター遺伝子の Τ細胞株への導入と in vitroにおける発現 BCMG-RT1 a及び BCMG- RT1 βを Τ細胞レセプタ一 α、 β鎖両者を欠く変異 Τ細胞 ハイブリ ドーマ TG40 [J. Immunol. , 146, 3742-3746 (1991) ] にエレクトロボ レーシヨン法により遺伝子導入した。 T細胞レセプター は、 キラー Τ細胞由 来であるため、 CD8 を共役レセプターとして要求する。 そこで、 発現べクタ一 BCMGSNeoに CD8 α及び β遺伝子を組み込み、 TG40にエレクト口ポレーシヨン法に より遺伝子導入した。 Τ細胞レセプタ一複合体の発現は、 及び CD3 εに 対する抗体 （F23.1, 2C11) (ファーミンジヱン社製） による FACS染色で調べた。 その結果、 CD8 及び Τ細胞レセプターがともに発現するクローン力 s得られた。 ま た、 抗 Τ細胞レセプター抗体で刺激して活性化されること、 CD3 複合体と会合し ていることなど、 作製した全長の RT-1 TCRa及び 3鎖が機能的に発現することが 強く示唆された。
実施例 4 RT- 1 T細胞レセプターを発現するトランスジヱニックマウス 1. T細胞レセプターを発現する卜ランスジエニックマウスの作製
T細胞レセブター α及び /3鎖をコードする DNA (以下、 それぞれ TCRa - DNA、 TCR |3- DNAと称す） を pHSE3' に組み込んだ pH-RTl a及び pH- RT1 j3のベクター部 分を除いて、 それぞれ、 又は一緒に C57BL/6 (H-2b) マウスの受精卵にマイクロ インジヱクシヨンした。 すなわち、 第一サイクルでは TCRa_DNA及び TCRI3-DNA を別々に、 第二サイクルは (TCRa-DNA) 及び (TCR]3 -DNA) を一緒の形でインジェ クシヨンした。 生まれたマウスの tail DNAを調製し、 PCR及びサザンブロッ卜に よる解析を行った。 結果を図 1 1に示した。 導入遺伝子としての TCRa及び TCR 3を各々、 組み込んだトランスジエニックマウスカ S得られたことが確認できる。 これら RTlTCRa -及び R TCRiS- トランスジヱニックマウスを野生型マウスにか けあわせた。 更に、 Balb/cマウスとのかけあわせを行った。 MHC遺伝子型がもと の RT- 1クローンが有した型と一致しなければならないために、 H-2 dのバックグラ ゥンドを持つように、 H- 2aである RTlTCRa及び RT1TCR0を掛け合わせることに よって、 H-2aのバックグラウンドで、 かつ RTlTCRa ]3を発現するマウスを作製し た。 - ■
こうして樹立したトランスジェニックマウスにおける TCRa鎖及び 鎖の発現 を調べた。 結果を図 1 2に示す。 0鎖は前述した抗 V (38 抗体 （F23.1 、 ファー ミンジヱン社製） による蛍光染色によって、 正常マウスでは 4割程度であるとこ ろが、 トランスジヱニックマウスでは CD8 陽性細胞のほとんどが V ]38 +であるこ と力5'判明した。 一方、 TCRa鎖の発現は、 特異的な抗体がなく、 染色ができない ので、 mRNA発現を結合領域に相当するブラィマーを使った RT- PCR法によつて解析 した。 正常マウスの胸腺及び脾臓細胞では RT-1 TCRa鎖がほとんど検出できない 力 卜ランスジェニックマウスの胸腺及び脾臓細胞ではかなり高発現しているこ とがわかった。
2. HIVgP160env特異的 TCR-トランスジエニックマウスの機能
次に、 発現した TCRa |3の機能を解析した。 TCRa |3の両方を発現するマウス からリンパ節及び脾臓細胞を調製し、 その P18特異的細胞傷害活性を、 無処置及 び CD8 陽性細胞を濃縮した群を用いて解析した。 標的細胞として、 あらかじめ P18 を遺伝子導入したトランスフエクタン卜及び P18 をパルスした細胞の両者を 用いた。 その結果、 図 13に示したように、 陽性コントロールとしての特異的 CTL ラインと比較した場合、 トランスジヱニックマウスより直接分離した細胞で は、 CD8+細胞を濃縮したとしても、 特異的なキラー活性は認められなかった。 し かしながら、 この分離細胞群を in vitroで HIV- 1 gP160 遺伝子を導入し発現させ た同系細胞と共培養することによって再刺激した場合には、 図 14のように、 P18特異的キラー活性が観察された。 更に、 その活性は抗 CD8抗体と補体の処理 によって除去されることから、 CD8 + T細胞力特異的キラー活性を担っていること 力判明した。 すなわち、 樹立した RT-ITCR 卜ランスジエニックマウスは期待した ように、 もとの RT- 1と同じ HIVgpl60特異的な細胞傷害活性を有するキラー T細胞 を発現するマウスであることが明らかになった。
実施例 5 H I V gp 160特異的 TCR (3鎖—トランスジエニックマウスによ る H I V gp 160特異的キラー T細胞の誘導
TCR 鎖のみを発現したトランスジヱニックマウスの解析を行った。 Τ細胞 による抗原認識は TC R a鎖と |3鎖の両者によって行われるために、 通常では TCRa]3—トランスジエニックマウスでのみ特異的認識が行われ、 T C R ]3鎖 のみや T C R a鎖のみを発現するトランスジヱニックマウスからは特異的な T細 胞は誘導されないと考えられていた。 ところ力 H I V gp l 60特異的 TCR ]3鎖を発現させたトランスジヱニックマウスの脾細胞を分離し、 in vitroにて H I Vgp l 60を発現した細胞で刺激することによって、 図 15に示すように P 18ペプチド特異的なキラー T細胞が誘導された。 その抗原特異性は TCR を単離したもとのキラー T細胞クロ一ン RT— 1と同一であった。 そこで、 in vitro刺激で誘導されてくる T細胞の TC R α鎖のレパ一トリ一を RT - PCR法によって調べた。 その結果、 図 16に示すように、 H I V gp 160 で刺激する前の TCR 鎖—卜ランスジュニックマウス由来の T細胞の TCR α鎖はランダムな α鎖を使用しているカ^ 刺激後ではほとんどの CD 8+ T細胞 が RT— 1と完全に一致した TCRa鎖を有していることが判明した。 即ち、 H I V g p 16◦特異的 T細胞においては、 T C R α |3両鎖を持つ Τ細胞でなく とも、 TCR 鎖のみを有する Τ細胞を刺激することによって均一で RT— 1と 同じ TCRa 0鎖を持つ ρ 18—特異的キラー T細胞が誘導できることが明らか になった。 産業上の利用の可能性
本発明により、 ヒト免疫不全ウィルス感染細胞を特異的に傷害するキラー T細 胞レセプターの構成成分ポリペプチド、 該ポリペプチドをコードする DNA、 該 DNAを含むベクター、 該ベクターで形質転換された形質転換体、 T細胞レセプ ターの構成成分ポリぺプチドの製造方法、 T細胞レセプ夕一の構成成分ポリぺプ チドを発現させた卜ランスジヱニック動物ならびに該ポリぺプチドに対する抗 体が提供される。 前記キラー T細胞レセプターの構成成分ポリペプチドは、 抗 H I V剤として有用である。 配列表フリーテキス卜
配列番号 1 ： T細胞レセプターの V β 8の配列に基づいて合成したォリゴヌク レ才チド
配列番号 2 ： C Β 04 Εの配列に基づいて合成したォリゴヌクレオチド 配列番号 3 ： Τ細胞レセプターの V |38. 1の配列に基づいて合成したォリゴ 配列番号 4 ： Τ細胞レセプターの V α 42 Η 1 1の配列に基づいて合成したォ リゴヌクレオチド
配列番号 5 ：ェクソン— 3Ca— Rの配列に基づいて合成したオリゴヌクレオ さ<ΚΛΙ3 OAV.

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ヒ卜免疫不全ウィルス感染細胞を特異的に傷害することができるキラー τ細 胞レセプタ一の構成成分ポリぺプチド。
2 . ヒ卜免疫不全ウィルスが HIV- 1 である請求の範囲第 1項記載のポリべプチ ド、。
3 . HIV-1 力 1 ΙΠΒである請求の範囲第 2項記載のポリペプチド。
4 . ポリペプチドが、 ヒト免疫不全ウィルスエンベロープタンパク質 gpl60 を特 異的に認識するキラー T細胞レセプターを構成するポリペプチドである請求の範 囲第 1〜3項のいずれか 1項に記載のポリぺプチド。
5 . ヒ卜免疫不全ウィルスエンベロープタンパク質 gpl60 を特異的に認識するキ ラ一 T細胞レセプターの認識領域が gpl6(3 V3領域である請求の範囲第 4項記載の ポリペプチド。
6 . 認識領域がヒ卜免疫不全ウィルスエンベロープタンパク質 gpl60 の V3領域の 315 〜329 番目のアミノ酸配列から成る領域である請求の範囲第 5項記載のポリ ぺプチド。
7 . 配列番号 7又は 9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、 又は、 該ポ リぺプチドの有するアミノ酸配列において一個以上のァミノ酸が置換、 欠失もし くは付加されたアミノ酸配列を含み、 力っヒト免疫不全ウィルス感染細胞を特異 的に傷害することができるポリぺプチド。
8 . 請求の範囲第 1〜 7項のいずれか 1項に記載のポリべプチドをコ一ドする D N A。
9 . 配列番号 6又は 8で表される塩基配列を有する D N A。
1 0 . 請求の範囲第 8又は 9項記載の D N Aとストリンジヱントな条件下でハイ ブリダィズし、 力つヒ卜免疫不全ウィルス感染細胞を特異的に傷害することがで きるポリべプチドをコ一ドする D N A。
1 1 . 請求の範囲第 8〜1 0項のいずれか 1項に記載の D N Aとベクターとから なる組換えべクタ一。
1 2 . 請求の範囲第 1 1項記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる 形質転換体。
1 3 . 請求の範囲第 1 2項記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に請求の 範囲第 1〜 7項のいずれか 1項に記載のポリぺプチドを生成蓄積させ、 該培養物 からポリぺプチドを採取することを特徴とする請求の範囲第 1〜 7項のいずれか 1項に記載のポリぺプチドの製造方法。
1 4 . 請求の範囲第 1〜 7項のいずれか 1項に記載のポリぺプチドと特異的に反 応する抗体。
1 5 . ポリペプチドが、 ヒ卜型の定常領域部位を有するポリペプチドである請求 の範囲第 1〜 7項のいずれか 1項に記載のポリぺプチド。
1 6 . 請求の範囲第 1〜7項のいずれか 1項に記載のポリペプチドを発現させた トランスジヱニック動物。
1 7 . 請求の範囲第 1〜 7項のいずれか 1項に記載のポリぺプチドを含有する抗 H I V剤。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7745180B2 (en) 2002-04-24 2010-06-29 Hitachi Chemical Co., Ltd. Device and method for high-throughput quantification of mRNA from whole blood
US20050277121A1 (en) * 2004-06-11 2005-12-15 Ambion, Inc. Crude biological derivatives competent for nucleic acid detection
US20060127377A1 (en) * 2004-08-03 2006-06-15 Stanislav Vukmanovic T cell receptors with enhanced sensitivity recognition of antigen
CN102220280A (zh) * 2005-02-11 2011-10-19 新加坡科技研究局 增殖干细胞的方法
US20080064631A1 (en) * 2006-01-13 2008-03-13 Jeffrey Molldrem T-cell receptors for use in diagnosis and therapy of cancers and autoimmune disease
EP2102236B1 (en) * 2007-01-12 2014-08-06 Government of the United States of America, Represented by the Secretary, Department of Health and Human Services GP100-specific T cell receptors and related materials and methods of use
WO2011064664A2 (en) * 2009-11-24 2011-06-03 Chrontech Pharma Ab T cell receptors specific for immunodominant ctl epitopes of hcv
EP2550362B1 (en) 2010-03-25 2017-01-04 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
CA2832109C (en) 2011-06-10 2021-07-06 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
CA2789539A1 (en) 2011-09-12 2013-03-12 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
EP2679596B1 (en) 2012-06-27 2017-04-12 International Aids Vaccine Initiative HIV-1 env glycoprotein variant
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
US9925258B2 (en) 2015-10-02 2018-03-27 International Aids Vaccine Initiative Replication-competent VSV-HIV Env vaccines

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985003947A1 (en) * 1984-03-01 1985-09-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. U T-cell receptor-specific for antigen polypeptides and related polynucleotides
JPS61257998A (ja) * 1984-10-31 1986-11-15 マサチユ−セツツ・インステイテユ−ト・オブ・テクノロジ− ヘテロダイマ性ｔリンパ球レセプタ
JPS63276496A (ja) * 1987-05-07 1988-11-14 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 哺乳類Ｔ細胞受容体β鎖定常領域ポリペプチド
JPH08149981A (ja) * 1993-12-13 1996-06-11 La Jolla Inst For Allergy & Immunology Ｔ細胞α鎖による抗原特異的免疫制御の方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4874845A (en) * 1984-06-13 1989-10-17 Massachusetts Institute Of Technology T lymphocyte receptor subunit
ATE323756T1 (de) * 1997-04-30 2006-05-15 Hans Klingemann Natürliche killerzelllinien und verfahren zu ihrer verwendung

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985003947A1 (en) * 1984-03-01 1985-09-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. U T-cell receptor-specific for antigen polypeptides and related polynucleotides
JPS61257998A (ja) * 1984-10-31 1986-11-15 マサチユ−セツツ・インステイテユ−ト・オブ・テクノロジ− ヘテロダイマ性ｔリンパ球レセプタ
JPS63276496A (ja) * 1987-05-07 1988-11-14 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 哺乳類Ｔ細胞受容体β鎖定常領域ポリペプチド
JPH08149981A (ja) * 1993-12-13 1996-06-11 La Jolla Inst For Allergy & Immunology Ｔ細胞α鎖による抗原特異的免疫制御の方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CEFAI D., ET AL.: "HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS-1 GLYCOPROTEINS GP 120 AND GP 160 SPECIFICALLY INHIBIT THE CD3/T CELL-ANTIGEN RECEPTOR PHOSPHOINOSITIDE TRANSDUCTION PATHWAY.", JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, AMERICAN SOCIETY FOR CLINICAL INVESTIGATION, US, vol. 86., no. 06., 1 January 1990 (1990-01-01), US, pages 2117 - 2124., XP002915343, ISSN: 0021-9738, DOI: 10.1172/JCI114950 *
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