WO1998057668A1

WO1998057668A1 - Agents de diagnostic et medicaments pour tumeurs malignes

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Publication number: WO1998057668A1
Application number: PCT/JP1998/002648
Authority: WO
Inventors: Tohru Tanaka; Hiroshi Sasaki
Original assignee: Cosmo Research Institute; Cosmo Oil Co., Ltd.
Priority date: 1997-06-18
Filing date: 1998-06-16
Publication date: 1998-12-23
Also published as: NO996253D0; JPH1112197A; NO316056B1; US20030065029A1; EP0995448B1; DE69841121D1; US7135162B2; CA2294593A1; EP0995448A4; US6905671B1; EP0995448A1; NO996253L

Description

明細書悪性腫瘍診断剤及び治療剤技術分野

本発明は、同位体置換された化合物を用いる悪性腫瘍診断用薬剤及び光動力学的悪性腫瘍治療剤に関する。背景技術

多くの感染症が克服された現代において悪性腫瘍は人類が直面している最大の疾病の一つである。悪性腫瘍の治療方法が次々に提案されており、治癒率も向上してきたが、悪性腫瘍を治療する上で最も大切なのは悪性腫瘍を早期に発見することであるといわれている。このため悪性腫瘍の早期発見のために各種のガンマーカーが提案されており、すでに様々な診断薬が発売されているが、その有効性には問題が残されており、また、ガンマーカーの値が高ければ悪性腫瘍の疑いが高いと言うものの悪性腫瘍が存在する位置については何の情報も得られない。

最近、へマトポルフィリンやその誘導体（いわゆるポルフィリン類）が悪性腫瘍に特異的に集積することが知られ、更に、これらの化合物が光照射により蛍光を発する事からこの性質を利用した悪性腫瘍の診断方法も開発された。これらポルフィリン類のうち代表的な化合物であるフォトフリンは光照射により活性酸素を発生し悪性腫瘍を破壊することが知られており、悪性腫瘍の治療薬として認可され、これを用いた治療は光動力学的治療として注目されている（ポルフィリン 'ヘムの生命科学、ポルフィリン研究会編、東京化学同人（ 1 9 9 5 ) )。

1 9 9 4年に入って、 5—ァミノレブリン酸を投与すると誘導されるプロトポルフィリン IX が腫瘍に集積してポルフィリン類と同様な効果をもつことが見出され、上記ボルフイリン類に比べて毒性や光毒性が低く体内での代謝も早いことから注目されている。そして、このことを応用し、 5—アミノレブリン酸の一部の水素を重水素（D ) で置換し、 M R I (磁気共鳴画像）用造影剤として用いるという報告がある（WO 9 7 Z 0 3 0 4 2 )₀

しかしながら、この造影剤を用いた M R Iは、感度が必ずしも十分ではなかった。従って、本発明の目的は、悪性腫瘍に良好に集積し、核磁気共鳴法を用いて感度よく、腫瘍の位置を特定し得る診断剤及び光動力学的悪性腫瘍治療剤を提供することにある。発明の開示

斯かる実情に鑑み本発明者は 5—アミノレプリン酸の代謝やポルフィリン類の性質等について鋭意研究を行った結果、 5—ァミノレブリン酸の炭素原子又は窒素原子をそれらの同位体で置換した化合物を用いれば、前記重水素置換化合物に比べて感度よく悪性腫瘍を検出できること、更にこの同位体置換化合物は非置換体と同等の光動力学的な悪性腫瘍の治療効果を有することを見出し本発明を完成した。

すなわち本発明は、 5 —アミノレプリン酸の 1以上の炭素原子が炭素同位体であるかおよびノまたはァミノ基の窒素原子が窒素同位体である化合物、又は該化合物のエステル、アミド若しくは塩、水和物、または溶媒和物を有効成分とする悪性腫瘍診断剤、並びに光動力学的悪性腫瘍治療剤を提供するものである。

さらに、本発明は、 5 —アミノレブリン酸の 1以上の炭素原子が炭素同位体であるかおよび Zまたはァミノ基の窒素原子が窒素同位体である化合物、又は該化合物のエステル、アミド、若しくは塩、水和物、または溶媒和物、および診断剤上許容される担体または製薬上許容される担体からなる組成物を提供するものである。図面の簡単な説明

第 1 図は製造例 4で得た^{1 3} C置換 5—アミノレブリン酸の NM Rスペクトルを示す図である。発明を実施するための最良の様態

5—アミノレブリン酸を用いれば、そのままでも、核磁気共鳴法を利用して、これが全く投与されない場合に比べれば感度よく悪性腫瘍が検出できる。しかし、 5—ァミノレブリン酸の炭素原子や窒素原子をその同位体に置換した化合物を用いれば、更に感度よく悪性腫瘍が検出される。

本発明において、炭素同位体としては¹³ C、 ¹⁴ Cが挙げられるが、 ¹³ Cが被爆のおそれがなく、安定性に優れるためより好ましい。また窒素同位体としては、 ^{I 3}N、 ¹⁵Nが挙げられるが、同様の理由で¹⁵ Nが好ましい。

炭素同位体として¹³ Cを用いた化合物としては、 5—ァミノレブリン酸の炭素のうち、 2、 3、 4、 5位のうちのいずれか一つ若しくは二つ以上の炭素が¹³ Cに置換された 5 ーァミノレブリン酸が挙げられる。

この化合物を用いた場合には ¹³ C— NM Rを測定することにより高感度での悪性腫瘍の診断が可能である。天然界における¹³ Cの存在比は小さいため悪性腫瘍は正のシグナルとして検出される。 ¹³ C— NMRの原理を用いた画像診断装置を用いれば画像診断が容易なことは言うまでもない。

また、窒素同位体で置換された 5—アミノレブリン酸としては、 5—アミノレブリン酸のアミノ基の窒素が¹⁵ Nである 5—ァミノレブリン酸が挙げられる。

この化合物を用いた場合には ¹⁵ N— NM Rを測定することにより高感度での悪性腫瘍の診断が可能である。天然界における¹⁵ Nの存在比は小さいため悪性腫瘍は正のシグナルとして検出される。 ¹⁵N— NMRの原理を用いた画像診断装置を用いれば画像診断が容易なことは言うまでもない。

また、上記¹³ C置換体と ¹⁵ N置換体とを組み合せ、炭素同位体と窒素同位体の両方を含む 5—アミノレブリン酸を用い、複数の NMRを測定することにより、更に正確な診断を行うこともできる。

なお、 5—アミノレブリン酸の水素のうち、 2、 3、 5位の水素、ァミノ基の水素のうちの 1つもしくは 2つ以上の水素が重水素（²H又は D) である 5—アミノレブリン酸を用いた場合でも H— NM Rを測定することにより悪性腫瘍の診断が可能である。しかしながら重水素がプロトポルフィリンに取り込まれる率は、炭素原子や窒素原子よりも少ない。

また、 ³ H ( T) や^{1 4} C等の放射性の同位体を含む場合はオートラジオグラフィ一との組み合せも可能であり、研究目的には極めて有効であるが人体に使用する場合は内部被爆の影響を考慮する必要がある。更に、 5—アミノレブリン酸が含有するカルボン酸上の酸素の同位体についても同様の応用が可能であるが 5—ァミノレブリン酸のカルボン酸の酸素原子がプロトポルフィリン IX に残存する確率は 2 5 %と他の原子の場合より小さい。

参考のため、 5—アミノレブリン酸のそれぞれの原子がプロトポルフィリン IX に残存する確率と 5—ァミノレブリン酸から誘導されたプロトポルフィリンの原子比を表 1に示す。

*：交換反応のため実質上は 0となる _c 表 1の残存確率が高い方が利用効率が高く、原子比が高い方が測定時の感度が高い。複数の同位体が置換している化合物の原子比は加算によって求められる。表中の値はそれぞれ原子 1個当たりの値である。

表 1から明らかなように、本発明に用いる炭素同位体又は窒素同位体置換 5—ァミノレブリン酸は、重水素置換体に比べて測定感度が高い。

本発明に用いる同位体置換された 5—ァミノレブリン酸は、自体公知の方法で製造することができるが、同位体置換されたグリシンを 5—アミノレプリン酸産生微生物又はこの微生物由来の酵素に作用させて製造するのが好ましい。

原料同位体置換グリシンとしては、メチレン基の炭素原子が¹³ Cであるもの、窒素原子が¹⁵ Nであるものが好ましい。これら原料同位体置換グリシンは、 1力所が同位体で置換されていても良いし、複数の箇所が同位体で置換されていても良い。このような同位体置換グリシンは公知の方法で製造することができ、また市販品（昭光通商（株）製、 G l y c i n e— ¹⁵N N 1 5— 0 1 1 9、 G l y c i n e— 2— ^{1 3} C C 1 3 - 0 1 1 9、 G l y c i n e— 2— ^{1 3}C， ¹⁵N M- 00 1 9 ；アルドリッチ社製、 G 1 y c i n e— ^{1 5} N 29， 9 2 9— 4、 G 1 y c i n e— 2— ^{1 3} C 2 7, 943— 9、 G 1 y c i n e— 2— ¹³C， ^{1 5}N 29， 9 3 2— 4を用いてもよレ、。

ここで用いる 5—ァミノレブリン酸産生微生物としては、 5—ァミノレブリン酸の生合成に C 4経路を使うものが好ましい。

このような微生物は酵母、カビ、光合成細菌、リゾビゥム等多岐にわたるがこれらの微生物の中でとりわけ光合成細菌は高い 5—ァミノレブリン酸生産能力を有しており、特に口ドスピリゥム属 Oihodospirillum )~、口ドシユウドモナス属 Rhodopseudomonas 属）、クロマチゥム属、Chroimtiuni )、ロドバクタ一属 hodobacter氟、更に口ドノくクターセファロィデス ( hodobacter sphaeroides) が高い能力を有している。

また、 5—アミノレブリン酸の生産性を向上させた変異株を用いることもできる。このような変異株としては、例えば通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に寄託された Rhodobacter sphaeroides C R— 5 20 (F E RM BP— 5255 ;国際寄託日： 1 995年 1 0月 2日）、 CR— 450 (F E R P— 1 4085)、 CR— 386 (F E RM P— 1 3 1 59)、 CR- 2 86 (FERM P— 1 2542) 等を挙げることが出来る。

5—ァミノレブリン酸を産生する微生物を用いて目的物である同位体置換 5—ァミノレブリン酸を製造するには、上記微生物を前記同位体置換グリシン及びレブリン酸等の存在下培養し、その培養物から目的とする同位体置換 5—ァミノレブリン酸を採取すればよレ、。同位体置換グリシンの培地への添加量は 1 mM〜 50 OmM、特に 5mM〜240mM とすることが望ましく、レブリン酸の添加量は親株を用いる場合は 1 0mM〜30 OmM、特に 2 OmM〜l 8 OmM とすることが望ましく、上述の変異株を用いる場合は 0. 1 mM〜 1 0 OmM, 特に lmM〜3 OmMとすることが望ましレ、。

上記微生物の培養条件は、特に制限されるものではなく、例えば、上記 CR— 450 の場合は、通常のロドバクタ一属の微生物と同様な条件で培養できる（特開平 7— 24 6088号公報)。すなわち、 CR— 450の培養条件は、特に限定されるものではなく、一般には 1 0〜40°C、好ましくは 20〜 35°Cの好気条件において培養すればよく、また、上記培地の pH は 5〜8、特に 5. 5〜7. 5とすることが好ましい。なお、 5— アミノレブリン酸の生産時に pH が変化する場合には、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリゥム等のアルカリ溶液や塩酸、硫酸、リン酸等の酸を用いて pH を調整することが好ましい。

また、同位体置換 5—ァミノレブリン酸の生産はこれらの微生物の増殖と同時に行うこともでき、菌体の増殖と独立して行うこともできる。この場合、使用する微生物は、増殖基菌体、休止菌体のいずれでもよく、そのまま同位体置換 5—アミノレブリン酸の生産に使用することができるが、遠心分離等の方法により集菌し、培地やリン酸緩衝液等の適当な溶媒に再懸濁させるなどの方法を採用することにより、菌濃度を高くして用いることもできる。培養物から同位体置換 5—アミノレブリン酸を採取するには、培養により同位体置換 5—アミノレブリン酸は菌体外に分泌されるので通常、培養液から、イオン交換樹脂を用いる等の手段により分離すればよい。

上記以外に本発明に適用できる同位体置換 5—ァミノレブリン酸の生産方法としては、例えば特開平 3— 1 7 2 1 9 1号公報、特開平 6— 1 6 9 7 5 8号公報、特開平 ₅ — 9 5 7 8 2号公報、特開平 6— 1 4 1 8 7 5号公報、特開平 6— 1 5 3 9 1 5号公報、特開平 8— 1 6 8 3 9 1号公報等に記載の方法が挙げられる。

一方、 5—アミノレプリン酸産生微生物由来の酵素を用いて同位体置換 5—ァミノレプリン酸を製造するには、原料として同位体置換グリシンを用いる以外は公知の方法 (特開平 6— 1 6 9 7 5 8号公報）により行うことができる。

詳細には、例えば次の様にして同位体置換 5—ァミノレブリン酸を製造することがでさる。

まず、酵素としては、 5—アミノレブリン酸産生微生物の培養物をそのまま用いるか、又は遠心分離器等で菌体分離したものを用いる。なお、分離した菌体は、更に、リン酸緩衝液等の溶液で洗浄し、該溶液に懸濁させて使用することもできる。

また、菌体由来の酵素は、常法により精製したものを使用することが望ましい。

すなわち、例えば、上記した菌体の懸濁液を、超音波、フレンチプレス、高圧ホモジナイザ等により破砕処理して得られた菌体破砕物を、遠心分離等により固液分離した後、カラム精製、電気泳動等の一般的精製手段により精製酵素としたものを使用する。

更に、これらの休止菌体ゃ菌体由来の酵素は、固定化すると単位体積当たりの酵素量が多くなるため、固定化したものを使用すると、効率良く反応を行うことができる。この固定化は、アルギン酸カルシウム法、ポリアクリルアミドゲル法、ポリウレタン樹脂法、光架橋樹脂法等の常法により行うことができる。

これらの休止菌体ゃ菌体由来の酵素に、同位体置換グリシンとコハク酸等を、リン酸緩衝液中で接触させると、反応が生じて同位体置換 5—ァミノレブリン酸が製造される。このときの反応条件は、 C R— 1 7株の変異 '分離の場合の条件（特開平 6— 1 6 9 7 5 8号公報）と同様とするのが好ましい。なお、酵素を使用する場合は、光照射は不要である。

この反応において、エネルギー源として、 A T P (アデノシン三リン酸）、ピリドキサールリン酸、 C o A (コェンザィム A)、またメタノール、エタノール、水素、ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（N A D )、ホルムアルデヒド、蟻酸等の電子供与体を適宜添加するのが好ましい。

なお、この反応において、 5—アミノレブリン酸デヒドラターゼの活性阻害物質を添加することができる。

以上の如くして得られた同位体置換 5—アミノレブリン酸は、粗精製物をそのまま用いてもよいし、目的に応じて常法により精製してもよレ、。

同位体置換 5—アミノレブリン酸は、投与後、体内において、同様な作用を示す誘導体にして用いてもよい。このような化合物としては、 5—アミノレブリン酸のエステル、アミド又は塩が挙げられる。このうち、エステル又はアミドとしては具体的には、例えば、 5—アミノレブリン酸メチルエステル、 5—アミノレブリン酸ェチルエステル、 5 一アミノレブリン酸プロピルエステル、 5—アミノレブリン酸ブチルエステル、 5—ァミノレブリン酸ペンチルエステル、 5—アミノレブリン酸へキシルエステル、 5—アミノレブリン酸へプチルエステル、 5—アミノレブリン酸ォクチルエステル、 5—ァミノレブリン酸ノニルエステル、 5—アミノレブリン酸ドデシルエステル、 5—ァミノレブリン酸へキサデシルエステル、 5—アミノレブリン酸イソプロピルエステル、 5—アミノレブリン酸シクロへキシルエステル、 5—アミノレブリン酸べンジルエステル、 5— ァミノレブリン酸フエネチルエステル、 5—アミノレブリン酸ー 3—フエニルプロピルエステル、 5—アミノレブリン酸エトキシェチルエステル、 5—アミノレブリン酸一 2 一（ヒドロキシメチル）テトラフラニルエステル、 5—アミノレブリン酸一 2— (ヒド口キシメチル）テトラヒドロビラニルエステル、 5—アミノレブリン酸ァセトアミド、 5—アミノレブリン酸ー n—へキサノィックアミド、 5—アミノレブリン酸一 n—ノナノイツクアミド等が挙げられる。また塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ョゥ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、コハク酸塩、シユウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、クェン酸塩、酢酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等の有機酸塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニゥムあるいはアルキルアンモニゥム塩等が挙げられる。更に、これらの同位体置換 5—アミノレブリン酸、そのエステル、アミド又は塩は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよい。これらの化合物及びその合成方法は特開平 4 - 9 3 6 0号公報に記載されている。

本発明の悪性腫瘍診断剤及び治療剤は、上記同位体置換 5—アミノレプリン酸等を有効成分とするものであり、被検体に害を及ぼさないものであれば特に剤型は限定されなレ、。ただし、水溶液とする場合は、投与時の pHに留意することが必要である。すなわち、 pH が 8以上のアルカリ条件下では、有効成分が酸化的に分解するので長時間アルカリ条件下に置くことは好ましくなく、静注用の薬剤の調製等がアルカリ性とする場合は短時間で処理することが好ましい。また、やむを得ず長時間の保存が必要な場合は窒素パージなどの方法で溶液中の溶存酸素を低下させておくことが望ましい。

好ましい pHは 8以下、特に 7以下、更に 6 . 1以下である。 pHの下限については特に制限がないが 2〜 3程度が好ましい。

本発明の悪性腫瘍診断剤又は治療剤の投与方法は特に限定されず、例えば経口投与しても静脈注射により投与しても良いし、患部やその周辺に塗布して用いたエアロゾルとして吸入により投与しても良い。更に、坐薬として投与する事も可能である。

投与量は診断に加え治療も目的とする場合は全身への投与の場合、体重 l kg 当たり 1 O mg〜l 0 g、より望ましくは 1 0 O mg〜l g必要であるが塗布等による局所投与の場合は更に減ずることが可能である。また、診断のみを目的とする場合は投与する物質の同位体純度や測定機の感度により異なるが投与量をかなり減ずることができる。現有の機器を用い、同位体純度が 1 0 0 %の場合には治療の場合の 1 1 0以下の投与量で十分である。診断時の投与量は今後の測定器の感度向上により減少させられることが予想できるが、投与量が多い場合に問題はない。ただし、治療の場合の薬量以上の投与は経済的に不利である。診断と治療を同時に行う場合は同位体を含まない 5—ァミノレブリン酸を添加し同位体純度を下げることで経済的な負担を軽減することもできる。

投与後測定、治療までの時間は投与方法や対象とする腫瘍によつて若干異なるが投与後 1〜8時間の間でポルフィリン類の存在比が最大になることが多い。経済的にみればポルフィリン類の蓄積量は腫瘍で早く正常組織で遅い傾向がある。治療を行う場合は被検者の腫瘍の種類毎にポルフィリン類の存在比が最大になる時間を測定し、その後に最大存在比となる時間において光動力学的治療を行うのが最も効果的である。

光動力学的治療に関しては同位体で置換されていない 5—ァミノレブリン酸を用いた場合と全く同じ手法を用いることができる。（C. S. Loh et al. , Br. J. Cancer, 68, 41-51 (1993) )。すなわち、 5 —アミノレブリン酸の投与で誘導され、かつ癌細胞に特異的に蓄積したポリフィリン類に光を照射することにより、癌細胞を選択的に死滅させる方法を用いることができる。

ここで、治療に用いる光照射はどの様な光であっても有効であるがポルフィリンの吸収波長を含むことが望ましい。このような波長の範囲は 4 0 Ο ηπ！〜 8 0 O nmが好ましく、より好ましくは 6 0 0 nm〜7 0 O nm である。照射する光の照度は強ければ強いほど殺癌力が強いが強すぎた場合、正常細胞にも傷害を与えるので、癌の大きさや深さに応じて照射することが肝心である。肺癌、胃癌、喉頭癌、直腸癌、大腸癌、十二指腸癌、膀胱癌等の場合は内視鏡と組み合せてレーザー光を照射する事で手術を伴わずに P D T治療を行うことが出来る。レーザー光を用いる場合は照射時間で照射を加減することが出来る。また、ここではパルス照射も有効である。 5—アミノレブリン酸及びその誘導体の投与で誘導され、癌細胞に特異的に蓄積するポルフィリン類が増感剤として働くため、光照射で正常細胞より癌細胞がより多くのダメージを受けるが、治療時にはなるべく癌細胞に多くの光が照射されるように操作することが望ましいのは当然である。レーザー光の場合は焦点が絞りやすいためこの点でも有利な光源である。

治療は 1回でも良いし複数回繰り返して行うこともできる。治療による効果が十分であったかどうかに本発明の診断剤が有効に使えることは言うまでもない。即ち、本願発明は診断剤としても治療剤としても使用しうる診断剤兼治療剤の発明と言うこともできる。

同位体置換による影響は実用上無視して良い。

本発明診断剤を用いた診断法の原理は、 5—ァミノレブリン酸を投与した時に代謝物であるプロトポルフィリン IX に代表されるポルフィリン類が悪性腫瘍に集積することに基づいている。この現象が現れる理由については様々な研究機関で研究が進んでおり、悪性腫瘍においてはプロトポルフィリン IX をヘムに代謝するフエ口キラターゼの性が低いのではないかと言われているが今のところはっきりとした事は解っていない。実施例

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなレ、。製造例 1

表 2に示した組成の培地（培地 1 ) 1 Lを、 2 Lの発酵槽に入れ、 1 2 1°Cで 1 5分間滅菌し、室温に冷却した。

上記の発酵槽に、あらかじめ培地 20 Omlを入れた 1 L容の坂口フラスコでしんとう培養して増殖させた光合成細菌変異株 CR— 520 (F ERM B P— 5255) を接種し、 30°C、通気量 0. Ι νΖνΖπκ 攪拌数 200回転で培養を行った。培養開始後 48時間後にグリシン—¹⁵ Νを 3 g (A t om%— 99、昭光通商（株）製、レブリン酸、グルコース、酵母エキスがそれぞれ 5mM、 5 OmM、 1重量％になるように加え、また、 pH が 6. 5から 7になるように 1 N水酸化ナトリウム及び 1 N硫酸で調整した。更に、通気量を 0. 01 4 v/v/mに減少させ窒素ガスを◦. 086 vZv/mにて供給した。攪拌数は 500回転とした。この条件で培養を 84時間まで行った。培養後の 5—アミノレブリン酸の濃度は 2. 3 gZLであった。得られた培養液を Biochem. J. , 219, 883-889 (1984)に記載の前処理方法に基づき前処理し、 2—メチルー 3—ァセチル— 4一（3—プロピオン酸ペンタフルォ口べンジルエステル）ピロールを生成せしめ、 GC/MS分析により得られた¹⁴ Νを有する 5—ァミノレブリン酸由来の 1 36 (M ⁺— (C₇H₂F₅ + CH₂C0₂)) の分子ピークと¹⁵ N を有する 5—アミノレブリン酸由来の 1 3 7 (M⁺- (C₇H₂F₅ + CH₂C0₂)) の分子ピークの比を比較し、ラベル化率を求めたところラベル化率は 4 8%であった。

本実施例より目的通りグリシンの含有した同位体が生産された 5—ァミノレブリン酸に移行していることがわかる。表 2

gZ L (蒸留水）

グ /レコース 9. 0

グノレタミン酸ナトリウム 3. 8

リン酸 1水素力リゥム 0. 5

リン酸 2水素力リゥム 0. 5

硫酸アンモニゥム 1. 3

硫酸マグネシウム 0. 2

塩化マグネシウム 0. 0 5 3

硫酸マンガン 1. 2 X 1 0 -³

ニコチン酸 1. 2 X 1 0- 3

ピオチン 1. 0 X 1 0 -⁵

チアミン 1. 0 X 1 0 -³

酵母エキス 2. 0 製造例 2

加えるグリシン一 ¹⁵ Nの量を 6 gとする以外は製造例 1 と同様に実施したところ生産された 5—アミノレブリン酸の濃度は 2. 6 g/L、ラベル化率は 88%であった。本製造例より添加するラベルグリシンの濃度が高いほど得られる 5—ァミノレブリン酸のラベル化率は高くなることがわかる。製造例 3

グリシン一 2— ' ³ Cを 6 g (A t om%- 99, 昭光通商（株）製）を用いた以外は製造例 2と同様に実施したところ、得られた 5—アミノレブリン酸の濃度は 2. 5 g/ Lであり、 ¹²Cを有する 5—アミノレブリン酸由来の 1 36 (M⁺- (C₇H₂F₅ + CH ₂C〇₂)) の分子ピークと¹³ Cを有する 5—アミノレブリン酸の 1 37 (M ⁺— (C₇H₂ F₅ + CH₂C0₂)) の分子ピ一クの比により計算したラベル化率は 9 1 %であった。製造例 4

製造例 3と同様に培養した菌体をトリス塩酸バッファー（pH8. 1 ) で 3回洗浄し、フレンチプレスにより破砕し蛋白質濃度 1 OmgZml の粗酵素液を調整した。これに AT P 1 OmM、 C oA— SH lmM、ピリドキサールリン酸 1 mM、スクシニル C o A 2 mM、塩化マグネシウム 1 0mM、トリス塩酸バッファー 5 OmM、ダルタチオン 0. 3 g/L、グリシン一 2— ¹³ C (A t om%- 99、昭光通商（株）製）を 1 g/Lとなるように添加し、 33°Cで 3時間インキュベートした。インキュベート後、得られた 5—アミノレブリン酸の濃度は 0. 1 8 gZLであった。製造例 3と同様の方法で求めたラベル化率は 98%であった。図 1にその結果の NMRスぺクトルを示す。

以上より酵素法によっても同位体を含む 5—ァミノレブリン酸が製造可能なことがわかる。この製造例からは生産量は培養法よりも低下しているがラベル化率が高いという利点がある。更に、酵素法は一般に生体よりも放射線障害に強いので放射線同位体を含む 5—ァミノレブリン酸の生産に有利であることが予想される。実施例 1

(実験動物の作成）

右体側部皮下に、 1匹当たり 2 X 1 0⁶個ずっヒ卜卵巣癌由来シスブラチン耐性培養細胞 A 2480 C P細胞を移植し、 3週間を経たヌードマウス（BALB C n u/n u 雌、癌直径約 8國）を用いた。

Γ ³ Cラベル 5—アミノレプリン酸水溶液の調製）

5位の炭素を¹³ Cで置換した 5—アミノレブリン酸塩酸塩（製造例 4) を用いた。この、 5位の炭素が¹³ Cで置換された 5—ァミノレブリン酸塩酸塩を 25 g/Lの割合で蒸留水に溶解し水酸化ナトリウムで pH 7に中和した。この溶液は中和により食塩濃度が 0. 88%となった。

(投与実験及び測定）

中和した溶液を直ちに 0. 22 / mのフィルターを通すことで滅菌し、体重 1 g当たり 1 2 / 1の割合でマウス尾静脈より投与した。この投与量は体重 l kg 当たり 5—アミノレブリン酸塩酸塩 30 Omg 投与に相当する。投与後 2時間、 4時間及び 8時間後にマウスを尊殺し、瀉血後癌細胞及び大腿部を摘出し 1 0画 φの NMR試料管に同体積となるようにつめ、日本電子社製、超伝導 NMR、 J NM— A400により、観測周波数 1 00. 50MH z、プロトンデカップリング法を用いて¹³ C— NMRを測定した。

測定後、 90〜1 6 Oppm までのピーク面積を積算し、投与後 8時間の 1匹目を 1 0 0とした相対値を算出した。実験は各条件 2匹ずつで行った。結果を表 3に示す。

表 3

表 3からは筋肉に比べ癌細胞で^{1 3} Cの存在が高いことが明らかである。この結果から¹ ³ Cラベル 5—ァミノレブリン酸を投与し^{1 3} C— N M Rで測定し' ³ Cの集積場所を調べることで悪性腫瘍の診断が可能である事が示された。本実施例は動物を用いたモデル実験であるが本実施例の結果より医療用の M R I技術と組み合せ、人間で悪性腫瘍の画像診断に応用できることは容易に類推される。産業上の利用可能性

本発明の診断薬を用いれば悪性腫瘍を効果的に診断できる。とりわけ従来からの技術では難しかった組織深部の悪性腫瘍に関しても対応可能である。また、非破壊的にしかも画像診断できる技術として画期的な悪性腫瘍診断方法への応用の途を与えるものである。更に、本発明の同位体で置換された 5—アミノレブリン酸を用いれば光動力学的治療も可能である。

Claims

請求の範囲

1 . 5—ァミノレブリン酸の 1以上の炭素原子が炭素同位体であるかおよび/またはァミノ基の窒素原子が窒素同位体である化合物、又は該化合物のエステル、アミド、若しくは塩、水和物、または溶媒和物を有効成分とする悪性腫瘍診断剤。

2 . 5—アミノレプリン酸の 1以上の炭素原子が炭素同位体であるかおよび /またはァミノ基の窒素原子が窒素同位体である化合物、又は該化合物のエステル、アミド、若は塩、水和物、または溶媒和物を有効成分とする光動力学的悪性腫瘍治療剤。

3 . 5 —ァミノレブリン酸の 1以上の炭素原子が炭素同位体であるかおよびノまたはァミノ基の窒素原子が窒素同位体である化合物、又は該化合物のエステル、アミド、若しくは塩、水和物、または溶媒和物、および診断剤上許容される担体からなる組成物。

4 . 5—ァミノレブリン酸の 1以上の炭素原子が炭素同位体であるかおよびノまたはァミノ基の窒素原子が窒素同位体である化合物、又は該化合物のエステル、アミド、若しくは塩、水和物、または溶媒和物、および製薬上許容される担体からなる組成物。