NO316056B1 - Middel for diagnose og fotokinetisk behandling av maligne tumorer, preparat samt anvendelse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et middel for å diagnostisere maligne tumorer og et middel for fotokmetisk behandling av maligne tumorer som hvert omfatter 5-aminolevulmsyre hvor minst ett karbonatom er erstattet med en isotop

Oppfinnelsen vedrører også et preparat som omfatter nevnte 5-aminolevulmsyre samt anvendelse derav

Selv nå når en rekke infeksjonssykdommer er bekjempet, er maligne tumorer en av de mest alvorlige sykdommer som menn-eskeheten er konfrontert med Skjønt behandlingsmetoder for maligne tumorer er blitt foreslått, den ene etter den andre, og det terapeutiske forhold har økt, er tidlig diagnose av maligne tumorer den viktigste faktor for behandling av maligne tumorer Følgelig er forskjellige typer av tumormarkører blitt foreslått for å diagnostisere maligne tumorer på et tidlig tidspunkt og forskjellige diagnostiske midler er alle-rede kommet på markedet, men de har problemer med hensyn til effektivitet som fremdeles er uløste Skjønt en høyere verdi av en tumormarkør indikerer større mulighet for en malign tumor, kan ingen informasjon oppnås på stedet hvor den maligne tumor er tilstede

Man har nylig funnet at hematoporfyrin og derivater derav (såkalte porfyriner) akkumulerer spesifikt i maligne tumorer, og fremgangsmåter for å diagnostisere maligne tumorer er blitt utviklet ved å anvende disse forbindelsers egenskap med hensyn til å danne fluorescens ved lysbestråling Det er kjent at photophrin som en typisk forbindelse av porfyriner danner et aktivt oksygen ved lysbestråling for å ødelegge maligne tumorer, og det er således blitt akseptert som et terapeutisk legemiddel for maligne tumorer, og en terapeutisk metode ved anvendelse av denne forbindelse har fått oppmerksomhet som en fotokmetisk terapi (Life Science of Porphyrin and Heme, edited by Porphyrin Research Society, Tokyo Kagaku Dojm (1995))

I 19 94 ble det funnet at protoporfyrm IX som induseres ved administrering av 5-aminolevulinsyre akkumulerer i tumorer og viser liknende effekter som porfyriner, og denne forbindelse har tiltrukket seg oppmerksomhet pga dens lave toksisitet og fototoksisitet og raske metabolisme i kroppen sammenliknet med dem for de ovenfor angitte porfyriner Det er brakt for dagen at ved å anvende denne effekt brukes 5-aminolevulinsyre som et kontrastmedium for MRI (magnetresonanstomografi) ved å erstatte en del av hydrogenatomet derav med deuterium (D) (WO 97/03042)

Sensitiviteten av MRI ved anvendelse av dette kontrastmedium er imidlertid ikke alltid tilfredsstillende

Det er følgelig et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et diagnostisk middel som akkumulerer passende i maligne tumorer og som kan spesifisere tumorsetet med høy sensitivitet ved anvendelse av kjernemagnetisk resonans og et middel for fotokmetisk behandling av maligne tumorer

På bakgrunn av det foregående har man nå utført omfattende studier på hovedsakelig metabolismen av 5-aminolevulinsyre og egenskapene til porfyriner, og som et resultat har man funnet at maligne tumorer kan detekteres med høy sensitivitet sammenliknet med den ovenfor angitte forbindelse med deuterium-erstatnmg ved anvendelse av en forbindelse som er oppnådd ved å erstatte minst ett av karbonatomene i 5-aminolevulinsyre med en tilsvarende isotop Denne forbindelse med iso-toperstatnmg har en effekt for fotokinetisk behandling av maligne tumorer som er ekvivalent med den til forbindelsen uten erstatning Den foreliggende oppfinnelse er gjennomført på dette grunnlag

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således et middel for diagnose av maligne tumorer samt et middel for fotokinetisk behandling av maligne tumorer, som begge er kjennetegnet ved at det som aktiv bestanddel omfatter 5-ammolevulinsyre hvor minst ett av karbonatomene i 2-, 3-, 4- og 5-stillingen er erstattet med <13>C, eller en ester, et amid, et salt, et hydrat eller et solvat av forbindelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et preparat som er kjennetegnet ved at det omfatter 5-aminolevulmsyre hvor minst ett av karbonatomene i 2-, 3-, 4- og 5-stillingen er erstattet med <13>C, eller en ester, et amid, et salt, et hydrat eller et solvat av forbindelsen og en diagnostisk aksepterbar bærer eller en farmasøytisk aksepterbar bærer

Endelig vedrører oppfinnelsen anvendelse av 5-aminolevulinsyre hvor minst ett av karbonatomene i 2-, 3-, 4- og 5-stillingen er erstattet med <13>C, eller en ester, et amid, et salt, et hydrat eller et solvat derav for fremstilling av et terapeutisk middel for fotokmetisk behandling av maligne tumorer

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGEN

Fig 1 er en graf som viser NMR spekteret av <13>C-erstattet 5-ammolevulmsyre oppnådd i fremstillingseksempel 4

Når 5-ammolevulmsyre anvendes som sådan, kan maligne tumorer detekteres ved anvendelse av kjernemagnetisk resonans med høy sensitivitet sammenliknet med et tilfelle hvor denne forbindelse ikke administreres Maligne tumorer kan imidlertid detekteres med høyere sensitivitet ved anvendelse av en forbindelse hvor minst ett karbonatom i 5-aminolevulmsyre er erstattet med en tilsvarende isotop

I henhold til den foreliggende oppfinnelse anvendes karbon-lsotopen <13>C pga liten eller ingen fare for strålmgsekspo-nering og med overlegen stabilitet

Når denne forbindelse anvendes kan maligne tumorer diagnostiseres med høy sensitivitet ved å måle <13>C-NMR Da den naturlig forekommende andel av <13>C er liten, detekteres maligne tumorer som positive signaler Som en selvfølge kan diagnostisk avbildning lett gjennomføres ved anvendelse av et diagnostisk avbildnmgsapparat hvor <13>C-NMR prinsippet anvendes 5-aminolevulinsyre kan også ha en nitrogenisotoperstatnmg hvor et mtrogenatom i ammogruppen derav er erstattet med <15>N eller <13>N, eller foretrukket 15N

Når denne forbindelse anvendes kan maligne tumorer diagnostiseres med høy sensitivitet ved å måle <15>N-NMR Fordi den naturlig forekommende andel av <15>N er liten, detekteres maligne tumorer som positive signaler Diagnostisk avbildning kan selvfølgelig lett gjennomføres ved anvendelse av et diagnostisk avbildningsapparat hvor prinsippet med <15>N-NMR anvendes

I tillegg kan mere nøyaktig diagnose gjennomføres ved å måle flere NMR'er ved å anvende 5-aminolevulinsyre som inneholder både karbonisotop og nitrogenisotop ved å kombinere forbindelser med henholdsvis <13>C- og <15>N-erstatning

Det er også mulig å gjennomføre diagnose av maligne tumorer ved å måle H-NMR ved anvendelse av 5-aminolevulinsyre hvor minst ett av hydrogenatomene i 2-, 3- og 5-stilling i 5-ammolevulmsyre og hydrogenatomene i ammogruppen er deuterium (<2>H eller D) Andelen av deuterium for innlemmelse i protoporfyrm er imidlertid mindre enn tilfellet med karbonatom eller mtrogenatom

En kombinasjon av autoradiografi er også mulig når forbindelsen inneholder radioaktive isotoper slik som <3>H (T) og <14>C, som er svært nyttige for forskningsformål, men det er nød-vendig å ta hensyn til indre eksponering for stråling ved anvendelse i menneskekroppen I tillegg kan det samme gjelde for en oksygenisotop på karboksylsyren av 5-ammolevulinsyre, men den gjenværende forekomst av oksygenatomer av karboksylsyren av 5-ammolevulmsyre i protoporfyrin IX er 2 5% som er mindre enn tilfellet for andre atomer

Som en referanse, er den gjenværende forekomst av respektive atomer av 5-aminolevulmsyre i protoporfyrin IX og atomforholdet av protoporfyrin indusert fra 5-ammolevulmsyre vist i tabell 1

I tabell 1 betyr en høyere gjenværende forekomst en høyere anvendelseseffektivitet, og et høyere atomforhold betyr en høyere sensitivitet Atomforholdet for en forbindelse hvor en rekke isotoper er erstattet beregnes ved addisjon Hver verdi i tabellen er pr ett atom

Som det fremgår fra tabell 1 har 5-ammolevulinsyre med karbonisotoperstatnmg for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse en høyere målesensitivitet enn forbindelsen med deuteriumerstatning

5-ammolevulinsyre med karbonisotoperstatnmg for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved hjelp av nevnte metode, men det er foretrukket å fremstille denne ved at glycm med isotoperstatning reagerer med en mikroorganisme som produserer 5-aminolevulinsyre eller med et enzym avledet fra mikroorganismen

Foretrukket eksempel på glycm med isotoperstatning som utgangsmateriale for anvendelse i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse inkluderer det hvor karbonatomet i metylengruppen derav er <13>C I glycm med isotoperstatning som utgangsmateriale kan en enkel posisjon erstattes med en isotop eller flere posisjoner kan erstattes med isotoper Slike isotop-erstattede glycmmaterialer kan fremstilles ved hjelp av kjente metoder eller oppnås som kommersielle pro-dukter Man kan f eks nevne Glycin-2-<13>C C13-0119 produsert av Shoko Tsusho, og Glycm-2-<13>C 27,943-9 produsert av Aldrich

Foretrukne eksempler på 5-aminolevulinsyreproduserende mikroorganisme inkluderer dem med anvendelse av C4-syklusen i bio-syntesen av 5-ammolevulinsyre

Skjønt der er en rekke mikroorganismer som har en slik funksjon, inkluderende gjær, sopp, fotosyntetiske bakterier og slekten Rhizobium, har fotosyntetiske bakterier en høy 5-aminolevulinsyreproduksjonsevne blant disse mikroorganismene Særlig slekten Rhodospirillum, slekten Rhodopseudomonas, slekten Chromatium og slekten Rhodobacter, mer spesielt Rhodobacter spaeroides, har høyere produktivitet

I tillegg kan en mutant med forbedret produktivitet av 5-aminolevulmsyre også anvendes Eksempler på en slik mutant inkluderer Rhodobacter sphaeroides CR-520 (FERM BP-5255, dato for internasjonal deponering 2 oktober 1995), CR-450 (FERM P-14085), CR-38S (FERM P-13159) og CR-286 (FERM P-12542), som er blitt deponert ved National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology

(Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan)

For fremstilling av 5-aminolevulmsyren med isotoperstatning av interesse ved anvendelse av en 5-aminolevulinsyreproduserende mikroorganisme, dyrkes mikroorganismen i nærvær av det ovenfor angitte glycin med isotoperstatning, levulinsyre o 1 , og 5-aminolevulinsyren med isotoperstatning av interesse utvinnes fra den oppnådde kulturblanding Glycinet med isotoperstatning tilsettes til mediet i en mengde som foretrukket er fra 1 mM til 50 0 mM, mer foretrukket fra 5 mM til 240 mM, og levulinsyren tilsettes i en mengde som foretrukket er fra 10 mM til 300 mM, mer foretrukket fra 20 mM til 180 mM, når moderstammen anvendes, eller er foretrukket fra 0,1 mM til 100 mM, mer foretrukket fra 1 mM til 30 mM når den ovennevnte mutant anvendes

Dyrkingsbetmgelser for de ovenfor angitte mikroorganismer er ikke spesielt begrenset, og den ovenfor angitte CR-450 kan f eks dyrkes under liknende betingelser som gjelder for de generelle mikroorganismer som tilhører slekten Rhodobacter (JP-A-7-246088) Det vil si at dyrkingsbetmgeIsene for CR-450 ikke er spesielt begrenset, og den kan dyrkes under aerobe betingelser, generelt ved 10 til 40°C, foretrukket 20 til 3 5°C, og ved en medium pH som foretrukket er 5 til 8, mer foretrukket fra 5,5 til 7,5 Når medium pH verdien forandres under dannelsen av 5-ammolevulinsyre, er det foretrukket å innstille pH ved anvendelse av en alkalisk oppløsning av natriumhydroksyd, ammoniakk, kaliumhydroksyd e 1 , eller en syre slik som saltsyre, svovelsyre, fosforsyre e 1

I tillegg kan produksjon av 5-ammolevulmsyren med isotoperstatning gjennomføres samtidig med mikroorganisme-veksten eller separat fra selve veksten I dette tilfellet kan mikroorganismen for anvendelse enten være celler i vokse-fase eller hvilende celler, og slike celler kan anvendes som sådan for fremstilling av 5-aminolevulinsyren med isotoperstatning eller etter øking av celletettheten, f eks ved å separere cellene ved hjelp av et passende middel slik som sentrifugenng e 1 , og med påfølgende suspendering av de resulterende celler i et passende løsningsmiddel slik som et dyrkingsmedium, en fosfatbuffer e 1

Da 5-aminolevulinsyren med isotoperstatning utskilles fra cellene ved dyrking, kan den isoleres fra den resulterende dyrkingskultur ved hjelp av visse midler som f eks ved anvendelse av en lonebytterharpiks e 1

Eksempler på andre metoder for fremstilling av 5-aminolevulinsyren med isotoperstatning som kan anvendes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen inkluderer dem som er beskrevet 1 JP-A-3-172191, JP-A-6-169758, JP-A-5-95782, JP-A-6-141875, JP-A-6-153915 OG JP-A-8-168391

På den annen side kan produksjonen av 5-aminolevulinsyre med isotoperstatning ved anvendelse av et enzym dannet ved hjelp av en 5-aminolevulmsyreproduserende mikroorganisme gjennom-føres ved hjelp av en kjent metode (JP-A-6-169758), unntatt at glycin med isotoperstatning anvendes som et material

5-aminolevulinsyre med isotoperstatning kan fremstilles på følgende måte som et typisk eksempel

Som enzymet anvendes et dyrkingsmedium av en 5-aminolevulinsyreproduserende mikroorganisme som sådan, eller celler separert fra dyrkingsmediet ved hjelp av spesielle midler slik som sentrifugermg eller liknende anvendes De sepa-rerte celler kan også anvendes etter at de er vasket i en oppløsning, slik som fosfatbuffer el, og hvoretter de suspenderes i oppløsningen

Videre kan enzymet i cellene foretrukket anvendes etter rensing derav på vanlig måte

Den ovenfor angitte cellesuspensjon behandles således med en celle-nedbryter, slik som en sonikator, en "French press", en høytrykkshomogenisator e 1 , og de således nedbrutte celler separeres til et faststoff og en væske, f eks ved sentrifugermg e 1 , og deretter oppnås rensete enzym fra den resulterende enzymoppløsning ved generelt anvendte rensemetoder, slik som ved kolonnerensmg, elektroforese e 1

I tillegg kan enzymreaksjonen gjennomføres med høy effektivitet når disse hvilende celler og celle-skapte enzym immobili-seres, fordi mengden enzym pr enhetsvolum økes med deres immobilisering

Immobiliseringen kan gjennomføres ved hjelp av en vanlig anvendt metode, slik som en kalsiumalgmatmetode, en polyakryl-amidgelmetode, en polyuretanharpiksmetode, en foto-fornettbar harpiksmetode e 1

Når det isotoperstattede glycin, ravsyre og liknende tillates å komme i kontakt med slike hvilende celler eller enzymer avledet fra celler, begynner reaksjonen å produsere 5-aminolevulmsyre med isotoperstatning

Reaksjonsbetingelsen er foretrukket de samme betingelser som for mutasjon og isolering av CR-17 (JP-A-6-169758) Lysbestråling er ikke nødvendig når enzympreparatet anvendes

Det er foretrukket å gjennomføre denne reaksjon ved eventuelt å tilsette en energikilde slik som ATP (adenosintrifosfat), pyridoksalfosfat, CoA (koenzym A) e 1 , en elektrondonor, slik som metanol, etanol, hydrogen, nikotmamidadenm-dmukleotid (NAD) , formaldehyd, maursyre e 1

En substans som inhiberer 5-aminolevulmat-dehydrataseaktivi-tet kan også tilsettes i reaksjonen

Den isotoperstattede 5-aminolevulmsyre oppnådd på denne måte kan anvendes direkte som et urent produkt eller den kan renses på vanlig måte avhengig av hvert formål

5-aminolevulmsyren med isotoperstatning kan anvendes ved å omdanne denne til et derivat som viser den samme funksjon i kroppen etter administrering Eksempler på en slik forbindelse inkluderer estere, amider eller salter av 5-aminolevulmsyre Blant disse forbindelser inkluderer eksempler på esterne og amidene 5-ammolevulinsyremetylester, 5-ammo-levulmsyreetylester, 5-aminolevulinsyrepropylester, 5-ammo-levulinsyrebutylester, 5-aminolevulmsyrepentylester, 5-aminolevulinsyreheksylester, 5-aminolevulmsyreheptylester, 5-aminolevulmsyreoktylester, 5-aminolevulmsyrenonylester, 5-aminolevulmsyredodecylester, 5-aminolevulinsyreheksadecyl-ester, 5-ammolevulinsyreisopropylester, 5-ammolevulinsyre-cykloheksylester, 5-ammolevulinsyrebenzylester, 5-ammo-levulmsyrefenetylester, 5-aminolevulmsyre-3-fenylpropyl-ester, 5-aminolevulinsyreetoksyetylester, 5-aminolevulinsyre-2-(hydroksymetyl)tetrafuranylester, 5-aminolevulinsyre-2-(hydroksymetyl)tetrahydropyranylester, 5-aminolevulinsyre-

acetamid, 5-aminolevulmsyre-n-heksanamid, 5-ammolevulinsyre-n-nonanamid o 1 Eksempler på salter inkluderer uorgan-iske salter slik som hydroklorid, hydrobromid, hydrojodid, nitrat, fosfat o 1 , organiske salter som succinat, oksalat, fumarat, maleat, laktat, tartarat, citrat, acetat, glykolat, metansulfonat, toluensulfonat o 1 , alkalimetallsalter, jordalkalimetallsalter, ammoniumsalter, alkylammoniumsalter ol I tillegg kan denne isotoperstattede 5-aminolevulinsyre og estere, amider og salter derav danne hydrater eller solvater Disse forbindelser og metoder for deres synteser er beskrevet i JP-A-4-9360

Middelet for diagnose eller behandling av maligne tumorer i henhold til oppfinnelsen inneholder den ovenfor angitte 5-aminolevulinsyre med isotoperstatning eller et derivat derav som den aktive bestanddel, og deres doseformer er ikke spesielt begrenset med den betingelse at de ikke har dårlig innvirkning på kroppen Det er imidlertid nødvendig å være oppmerksom på pH ved anvendelse som en oppløsning Siden den aktive bestanddel nedbrytes oksydativt under alkaliske betingelser ved pH 8 eller mer, er det ikke foretrukket å bringe oppløsningen til alkaliske betingelser over lengre tid Når fremstilling av et legemiddel for injeksjon krever alkaliske betingelser, gjennomføres behandlingen foretrukket innen kort tid Når en langtidspreservering er uunngåelig, er det også foretrukket å redusere oppløst oksygen i opp-løsningen ved hjelp av et passende middel, slik som ved nitrogenspyling e 1

pH er foretrukket 8 eller lavere, mer foretrukket 7 eller lavere, mest foretrukket 6,1 eller lavere Skjønt ikke spesielt begrenset, er den nedre grense for pH foretrukket fra 2 til 3

Middelets administrermgsmetode for å diagnostisere eller behandle maligne tumorer i henhold til oppfinnelsen er ikke spesielt begrenset, det kan f eks administreres ved oral administrering, intravenøs injeksjon, absorpsjon ved dets påføring på det berørte sted og dets perifere område eller ved mhalasjon i form av aerosoler Det kan også administreres som stikkpiller

Når behandling også er et formål i tillegg til diagnose, kan dosen foretrukket vøre fra 10 mg til 10 g, mer foretrukket 100 mg til l g pr kg kroppsvekt i tilfellet av en administrering til hele kroppen, men en slik dose kan reduseres i tilfellet av en topisk administrering, slik som påføring e 1 Når diagnose er det eneste formål kan dosen reduseres til et betydelig mindre nivå, skjønt den avhenger av renheten av isotopen av forbindelsen som skal anvendes og følsomheten av måleapparatet Når eksisterende instrumenter anvendes og isotoprenheten er 100%, kan 1/10 eller mindre av dosen til behandlmgstilfellet være tilstrekkelig Det forventes at dosen på diagnosetidspunktet vil reduseres med forbedringen av instrumentenes følsomhet i fremtiden, men der vil ikke være noe problem i tilfellet med en større dose Admini-streringen med en større dose enn behandlingstilfellet er imidlertid økonomisk ufordelaktig Når diagnosebehandling gjennomføres samtidig, kan den økonomiske byrde reduseres ved å nedsette isotoprenheten gjennom tilsetting av isotopfri 5-aminolevulinsyre

Med hensyn til tidsperioden etter administrering av lege-middelet og inntil måling eller behandling, vil den eksisterende andel av porfyriner bli maksimal 1 til 8 timer etter administrering i en rekke tilfeller, skjønt dette varierer noe avhengig av hver tumor av interesse Sett ut fra et tidsforløpsaspekt, er akkumulering av porfyriner hurtig i tumorer og sakte i normale vev Når en behandling gjennom-føres, er det mest effektivt å måle tidspunktet for en maksimalt eksisterende andel av porfyriner i hver pasients tumor og deretter gjennomføre fotokmetisk behandling på tidspunktet med maksimalt eksisterende andel

Med hensyn til den fotokmetiske behandling, kan de samme teknikker anvendes som i tilfellet med bruk av 5-ammolevulinsyre som ikke har isotoperstatning {C S Loh et al, Br J Cancer, 68 41-51 (1993)) Dvs at det kan anvendes en metode hvor cancerceller drepes selektivt ved å bestråle porfyriner med lys indusert ved administrering av 5-ammolevulinsyre og akkumulert i cancercellene spesifikt

I dette tilfellet kan lysbestråling for anvendelse i behandlingen være effektiv med en hvilken som helst lyskilde, men det er foretrukket at lyskilden inneholder porfyrinenes absorpsjonsbølgelengde En slik bølgelengde er foretrukket i området fra 400 nm til 800 nm, mere foretrukket fra 600 nm til 700 nm Den karcinostatiske effekt blir sterk når lllumi-nenn<g>sintensiteten i bestrålingslyset øker, men en for sterk intensitet vil også ødelegge normale celler, slik at det er vesentlig å gjennomføre bestrålingen sett på bakgrunn av størrelse og dybde av hver cancer I tilfellet av visse cancere, slik som lungecancer, gastrisk cancer, faryngeal-cancer, rektumcancer, tykktarmscancer, duodenalcancer, blære-cancer o 1 , kan PDT behandling gjennomføres uten kirurgisk inngrep ved stråling med laserstråler i kombinasjon med et endoskop Når laserstråler anvendes, kan graden av bestrål-ing reguleres ved bestrålmgstiden Puls-bestrålmg er også effektiv i dette tilfellet Da porfyriner indusert ved administrering av 5-aminolevulinsyre eller et derivat derav og akkumulert i cancerceller virker spesifikt som et sensi-biliseringsmiddel, vil cancerceller ødelegges ved lysbestråling i større grad enn normale celler, men det er foretrukket, som en selvfølge, å gjennomføre operasjonen på en slik måte at lys bestråles mot så mange cancerceller som mulig på behandlingstidspunktet Sett på bakgrunn av dette, er laserstråler en fordelaktig lyskilde fordi fokus lett kan innsnevres

Behandlingen kan gjennomføres en gang eller repeteres flere ganger

Det er unødvendig å si at det diagnostiske middel i henhold til oppfinnelsen kan anvendes effektivt for å se om effekten av behandlingen er tilstrekkelig Med andre ord er den foreliggende oppfinnelse en oppfinnelse av et diagnostisk middel som også samtidig er et terapeutisk middel, som kan anvendes både som et diagnostisk middel og som et terapeutisk middel

Innvirkninger bevirket ved isotoperstatningen kan praktisk talt neglisjeres

Prinsipielt er den diagnostiske metode ved anvendelse av det diagnostiske middel i følge oppfinnelsen basert på fenomenet at porfyriner, som protoporfyrin IX er et typisk eksempel på, som metabolitter akkumuleres i maligne tumorer når 5-aminolevulinsyre administreres Grunnen til forekomsten av dette fenomen er blitt studert ved forskjellige forskningsorganisa-sjoner men klare resultater er til nå ikke oppnådd, skjønt det er en hypotese at aktiviteten av ferrochelatase som metaboliserer protoporfyrin IX til dets tilsvarende hem kan være lav i maligne tumorer

Den foreliggende oppfinnelse er forklart mer detaljert på bakgrunn av de etterfølgene eksempler

UNDEREKSEMPEL 1

Inn i en 2 1 fermentor, ble 1 1 av et medium som har en sammensetning som vist i tabell 2 (medium 1) innført, sterilisert ved 121°C i 15 min og deretter avkjølt til romtemperatur

En mutant av en fotosyntetisk bakterie, CR-52 0 (FERM BP-52 55) , som på forhånd har blitt dyrket ved rystmg ved anvendelse av en 1 1 Sakaguchi kolbe inneholdende 200 ml av mediet ble mokkulert mn i fermentoren, og fermentering ble gjennomført ved 3 0°C med en luftgjennomstrømningsmengde på 0,1 v/v/m under omrøring ved 200 opm Etter 48 timers dyrking ble 3 g glycm-<15>N (atom%-99, produsert av Shoko Tsusho) , 5 mM levulmsyre, 50 mM glukose og 1% gjærekstrakt tilsatt til mediet, og pH i mediet ble justert til en verdi fra 6,5 til 7 med l N natriumhydroksyd og 1 N svovelsyre

Luftgjennomstrømnmgsmengden ble redusert til 0,014 v/v/m, og nitrogengass ble tilført ved 0,086 v/v/m Omrøringshastig-heten ble forandret til 500 opm Dyrkingen ble fortsatt i 84 timer under disse betingelser Konsentrasjonen av 5-aminolevulmsyre etter dyrking var 2,3 g/l

Det således oppnådde dyrkingsmedium ble forbehandlet i henhold til den forbehandlingsmetode som er beskrevet i Biochem J , 219 883-889 (1984) for å fremstille 2-metyl-3-acetyl-4-(3-propionatpentafluorbenzylester)pyrrol, og forholdet mellom den således oppnådde molekylære topp på 13 6 (M<+> - (C7H2F5 + CH2C02)) avledet fra 5-aminolevulmsyre med <14>N og den molekylære topp på 13 7 (M<+> - (C7H2F5 + CH2C02)) avledet fra 5-ammolevulinsyre med <15>N ble sammenliknet for å beregne merkmgsandelen som var 48%

Fra dette eksempel fremgår det at isotopen inneholdt i glyein ble overført til den således fremstilte 5-aminolevulinsyre som tilsiktet

UNDEREKSEMPEL 2

Prosedyren i undereksempel l ble gjentatt unntatt at mengden glycm-<15>N ble forandret til 6 g Konsentrasjonen av den således produserte 5-aminolevulmsyre var 2,6 g/l og merkings-andelen var 88%

Fra dette eksempel fremgår det at desto høyere konsentrasjon av merket glycin, desto høyere er merkmgsandelen av produsert 5-aminolevulinsyre

FREMSTILLINGSEKSEMPEL 1

Prosedyren i undereksempel 2 ble gjentatt med unntak av at 6 g glycm-2-<13>C (atom%-99, produsert av Shoko Tsusho) ble anvendt, og konsentrasjonen av den således fremstilte 5-ammolevulinsyre var 2,5 g/l og merkmgsandelen som beregnet ut fra forholdet mellom en molekylær topp på 13 6 (M<+> - (C7H2F5 + CH2C02) ) avledet fra 5-aminolevulinsyre med <12>C og en molekylær topp på 137 (M<+> - (C7H2F5 + CH2C02)) avledet fra 5-ammolevulinsyre med <13>C var 91%

FREMSTILLINGSEKSEMPEL 2

Dyrkede celler oppnådd på samme måte som i fremstillingseksempel 1 ble vasket 3 ganger i Tris-HCl buffer (pH 8,1) og nedbrutt ved anvendelse av en "French press" for å fremstille en uren enzymoppløsning med en proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml Denne ble blandet med 10 mM ATP, 1 mM CoA-SH, 1 mM pyridoksalfosfat, 2 mM succmyl-CoA, 10 mM magnesiumklorid,

50 mM Tris-HCl buffer, 0,3 g/l glutation og l g/l glycin-2-13C (atom%-99, produsert av Shoko Tsusho), og blandingen ble in-kubert ved 33°C i 3 timer Etter inkubasjon ble konsentrasjonen av den således oppnådde 5-aminolevulmsyre målt til å være 0,18 g/l Merkmgsandelen beregnet ved den samme metode som i fremstillingseksempel 1 var 98% Resultatene av NMR spekteret er vist i fig 1

Det fremgår således at 5-aminolevulinsyre inneholdende en isotop også kan fremstilles ved hjelp av en enzymatisk metode Dette fremstillingseksempel har en fordel med en høy merkmgsandel, skjønt produktiviteten er lavere enn ved dyrk-mgsmetoden I tillegg, siden den enzymatiske metoden generelt er resistent overfor bestrålmgsskade sammenliknet med biologiske legemer, vil den være fordelaktig for fremstilling av 5-aminolevulinsyre inneholdende en radioaktiv isotop

EKSEMPEL 1

Fremstilling av et forsøksdyr

Nakne mus (BALB hunn-mus Cnu/nu, med cancer med diameter på omtrent 8 mm) ble brukt 3 uker etter den subkutane transplan-tasjon av 2xl0<6> celler/dyr av human ovariecancer cisplatm-resistent dyrket celle A248 0CP til den høyre siden av kroppen

Fremstilling av vandig oppløsning av <13>C-merket 5-aminolevu-1insyre

5-aminolevulinsyrehydroklorid hvor karbonet i 5-stillingen var erstattet med <13>C (fremstillingseksempel 2) ble anvendt 5-aminolevulinsyrehydrokloridet hvor karbonet i 5-stillingen var erstattet med <13>C ble oppløst i destillert vann i en mengde på 25 g/l, og oppløsningen ble nøytralisert til pH 7 med natriumhydroksyd Natriumkloridinnholdet i denne opp-løsning ble 0,8 8% ved nøytralisering

ADMINISTRERINGSTEST OG MALING

Den således nøytraliserte oppløsning ble sterilisert ved at den ble passert umiddelbart gjennom et 0,22 ptm filter og administrert gjennom halevenen hos mus i en mengde på 12 fil pr g kroppsvekt Denne dose svarer til en 3 00 mg administrering av 5-ammolevulinsyrehydroklorid pr 1 kg kroppsvekt 2, 4 og 8 timer etter administrering, ble mus avlivet og underkastet blodtapping, og deretter ble cancercellene og den femorale del skåret ut og pakket i NMR prøverør med diameter 10 mm til det samme volum for å måle <13>C-NMR ved super-ledende NMR, JNM-A4 00 produsert av JEOL, ved en observasjons-frekvens på 100,50 MHz ved anvendelse av en proton avkob-lmgsmetode

Etter måling ble topparealer fra 90 til 160 ppm integrert, og de relative verdier ble beregnet basert på verdien 100 for det første dyr 8 timer etter administrering Testen ble gjennomført ved anvendelse av to dyr for hver betingelse Resultatene er vist i tabell 3

Som det fremgår fra tabell 3 er den eksisterende forekomst av <13>C høyere i cancerceliene enn i muskel På grunnlag av disse resultater ble det indikert at maligne tumorer kan diagnostiseres ved å administrere <13>C-merket 5-aminolevulinsyre og undersøke det området hvor <13>C akkumuleres med hjelp av måling av <13>C-NMR Skjønt et modellforsøk ble gjennomført ved anvendelse av et dyr i dette eksempel, kan det ut fra resul-tatet fra dette eksempel absolutt forventes at denne metode kan anvendes for diagnostisk avbildning av maligne tumorer i mennesker ved å kombinere denne med medisinske MRI teknikker

Diagnose av maligne tumorer kan således effektivt gjennom-føres ved anvendelse av det diagnostiske middel ifølge oppfinnelsen Det kan særlig anvendes for maligne tumorer som eksisterer i dype regioner av vev, og som ikke lett kan diagnostiseres ved hjelp av de tidligere kjente teknikker Det kan også anvendes på en epokedannende metode for diagnose av maligne tumorer som en ikke-destruktiv teknikk hvor diagnostisk avbildning også kan gjennomføres I tillegg kan fotokmetisk behandling gjennomføres ved anvendelse av 5-ammolevulmsyren med isotoperstatning ifølge oppfinnelsen

Claims (5)

1 Middel for diagnose av maligne tumorer, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel omfatter 5-aminolevulmsyre hvor minst ett av karbonatomene i 2-, 3-, 4- og 5-stillingen er erstattet med <13>C, eller en ester, et amid, et salt, et hydrat eller et solvat av forbindelsen

2 Middel for fotokmetisk behandling av maligne tumorer, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel omfatter 5-aminolevulinsyre hvor minst ett av karbonatomene i 2-, 3-, 4- og 5-stillingen er erstattet med <13>C, eller en ester, et amid, et salt, et hydrat eller et solvat av forbindelsen

3 Preparat, karakterisert ved at det omfatter 5-aminolevulinsyre hvor minst ett av karbonatomene i 2-, 3-, 4-og 5-stillingen er erstattet med <13>C, eller en ester, et amid, et salt, et hydrat eller et solvat av forbindelsen og en diagnostisk aksepterbar bærer

4 Preparat, karakterisert ved at det omfatter 5-aminolevulinsyre hvor minst ett av karbonatomene i 2-, 3-, 4-og 5-stillingen er erstattet med <13>C, eller en ester, et amid, et salt, et hydrat eller et solvat av forbindelsen og en farmasøytisk aksepterbar bærer

5 Anvendelse av 5-ammolevulmsyre hvor minst ett av karbonatomene i2-, 3-, 4- og 5-stillingen er erstattet med <13>C, eller en ester, et amid, et salt, et hydrat eller et solvat derav for fremstilling av et terapeutisk middel for fotokmetisk behandling av maligne tumorer