JP6417477B2

JP6417477B2 - Ａｌａ−ｐｄｔ又はａｌａ−ｐｄｄにおける光線力学的効果の増強剤

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Publication number: JP6417477B2
Application number: JP2017525180A
Authority: JP
Inventors: 昌宏石塚; 仁中川; 麗太田; 智樹市川
Original assignee: SBI Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: SBI Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2015-06-16
Filing date: 2016-06-09
Publication date: 2018-11-07
Anticipated expiration: 2036-06-09
Also published as: WO2016204060A1; JPWO2016204060A1

Description

本発明は、ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤにおける光線力学的効果の増強剤に関する。

抗がん剤治療や放射線療法とは異なるがん治療の選択肢の１つとして、光線力学的治療（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃｔｈｅｒａｐｙ；ＰＤＴ）が挙げられる。ＰＤＴによるがん治療は、がん細胞に集積する性質を有する光感受性物質（光増感剤）を対象に投与し、がん組織に特定の波長の光を照射することによりがんの治療を行う治療方法であり、低侵襲かつ治療跡が残りにくい治療法であるため、近年注目を集めている。

また、近年、がん、イボ、ニキビのような疾患組織の診断方法として、光線力学的診断（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃｄｉａｇｎｏｓｉｓ、以下、ＰＤＤと略す）が注目されている。ＰＤＤは、標的組織に集積する性質を有する光感受性物質（光増感剤）を対象に投与し、特定の波長の光を照射することにより標的箇所の特定を行う診断方法であり、これまでの診断法と比較して、低侵襲で副作用が少ないため、患者に対する負担が少ないという利点がある。

上述のとおり、ＰＤＴやＰＤＤにおいては、治療または検出の対象となる組織に集積する性質をもつ、光に反応する化合物（光増感剤）を利用する。ＰＤＴやＰＤＤにおいて好適に用いられる光増感剤については、様々なものが検討されているが、近年、ポルフィリンの前駆物質であり、生体物質である５−アミノレブリン酸類（本明細書において、「ＡＬＡ類」ともいう）を対象に投与し、ＰＤＴまたはＰＤＤと組み合わせる、「ＡＬＡ−ＰＤＴ」または「ＡＬＡ−ＰＤＤ」が注目されている（例えば、特許文献１）。

ＡＬＡ類それ自体には光感受性はないものの、ＡＬＡ類は、細胞内で、ヘム生合成経路の一連の酵素群により代謝活性化されてポルフィリン（主としてプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ））となる。ポルフィリン類は腫瘍細胞に取り込まれて蓄積される性質を有し、また、ＰｐＩＸは、４１０ｎｍ、５１０ｎｍ、５４５ｎｍ、５８０ｎｍ、６３０ｎｍ等にピークを有する光増感剤であるため、ＰＤＴまたはＰＤＤに利用することができる。ＡＬＡは生体内で代謝され、４８時間以内に排泄されるため、全身の光感受性にはほとんど影響しないという特徴がある。

特開平１１−１２１９７号公報

ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤにおいては、対象にＡＬＡ類を投与し、治療又は検出の対象となる組織にＰｐＩＸが蓄積することにより、光線力学的反応を用いた治療又は検出が可能となる。しかし、本発明者らは、臨床現場においてＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤを実施する際に、対象の体質や体調等によっては、対象となる組織にＰｐＩＸが十分蓄積せず、光線力学的反応の効果が満足に得られない場合があるという課題の存在に気付いた。
また、これまでの方法では、ＡＬＡ類を生理食塩水等に溶解させて対象へ経口投与していたが、ＡＬＡ類には苦みがあり、投与後に対象が嘔吐してしまうなど、対象への負担が大きかった。そこで、本発明者らは、ＡＬＡ類と併用することでＡＬＡ類の苦みを軽減することができ、さらに、ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤの効果を増強させる（すなわち、上記の２つの課題を同時に解決し得る）効果を有する食品や飲料を鋭意検討した。

本発明者らは、驚くべきことに、ＡＬＡ類と柑橘類エキスとを併用することにより、ＡＬＡ類を単独で用いる場合と比較して、ＰＤＴ又はＰＤＤにおける、光線力学的反応が増強されることを見出した。さらに、本発明者らは、前述の効果を引き起こす因子を探るため、柑橘類エキスに含まれる成分をスクリーニングしたところ、柑橘類エキスに含まれるノビレチンが、組織におけるＰｐＩＸの蓄積を増強させ、それによりＰＤＴ又はＰＤＤにおける、光線力学的反応が増強されることを見出した。

すなわち本発明は、一実施形態において、光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための医薬であって、前記医薬は、下記式（Ｉ）で示される化合物：
（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）又はその塩、を含み、前記医薬は、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物と併用されることを特徴とする。

また、本発明の他の実施形態は、光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための医薬であって、（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：
（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）又はその塩と、（Ｂ）ノビレチン又はノビレチンを含む組成物とを含むことを特徴とする、医薬に関する。

また、本発明の他の実施形態は、光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための、同時又は異時に投与される、組み合わせ医薬であって、（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：
（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）又はその塩と、（Ｂ）ノビレチン又はノビレチンを含む組成物、との組み合わせ医薬に関する。

また、本発明の一実施形態においては、上記の医薬において、Ｒ^１が、水素原子、炭素数１〜８のアルカノイル基、及び、炭素数７〜１４のアロイル基からなる群から選択され、Ｒ^２が、水素原子、直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、及び、炭素数７〜１５のアラルキル基からなる群から選択されることを特徴とする。

また、本発明の一実施形態においては、上記の医薬において、Ｒ^１及びＲ^２が、水素原子であることを特徴とする。

また、本発明の一実施形態においては、上記の医薬において、前記ノビレチンを含む組成物が、柑橘類抽出物を含む組成物であることを特徴とする。

また、本発明の一実施形態においては、上記の医薬において、前記柑橘類抽出物が、ミカン属、キンカン属、カラタチ属、クリメニア属、エレモシトラス属及びミクロシトラス属からなる群から選択される柑橘類の抽出物であることを特徴とする。

また、本発明の一実施形態においては、上記の組み合わせ医薬において、前記（Ａ）と前記（Ｂ）とが、キットとして準備されることを特徴とする。

なお、上記に述べた本発明の一又は複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。

図１は、１ｍｇ／ｍＬ柑橘エキス溶液のクロマトグラムを示す。図２は、癌細胞へ柑橘類エキスとＡＬＡを投与した場合の、ＰｐＩＸの蓄積を測定したグラフを示す（ｎ＝３）。図３は、癌細胞へノビレチンとＡＬＡを投与した場合の、ＰｐＩＸの蓄積を測定したグラフを示す（ｎ＝３）。図４は、癌細胞へノビレチンとＡＬＡを投与した場合の、ＰＤＴの効果（細胞生存率）を測定したグラフを示す（ｎ＝３）。図５は、腫瘍移植鶏卵におけるノビレチンのＡＬＡ−ＰＤＴ増強効果を評価する実験の方法を示す。図６は、腫瘍移植鶏卵におけるノビレチンのＡＬＡ−ＰＤＴ増強効果を評価する実験の結果を示す。

本明細書において、ＡＬＡ類とは、ＡＬＡ若しくはその誘導体又はそれらの塩をいう。

本明細書において、ＡＬＡは、５−アミノレブリン酸を意味する。ＡＬＡは、δ−アミノレブリン酸ともいい、アミノ酸の１種である。

ＡＬＡの誘導体としては、下記式（Ｉ）で表される化合物を例示することができる。式（Ｉ）において、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。なお、式（Ｉ）において、ＡＬＡは、Ｒ^１及びＲ^２が水素原子の場合に相当する。

ＡＬＡ類は、生体内で式（Ｉ）のＡＬＡ又はその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、生体内の酵素で分解されるプロドラッグ（前駆体）として投与することもできる。

式（Ｉ）のＲ^１におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル基等の炭素数７〜１４のアロイル基を挙げることができる。

式（Ｉ）のＲ^２におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基を挙げることができる。

式（Ｉ）のＲ^２におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１−シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３〜８のシクロアルキル基を挙げることができる。

式（Ｉ）のＲ^２におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６〜１４のアリール基を挙げることができる。

式（Ｉ）のＲ^２におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７〜１５のアラルキル基を挙げることができる。

好ましいＡＬＡ誘導体としては、Ｒ^１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物が挙げられる。また、好ましいＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ^２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が挙げられる。また、好ましいＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ^１とＲ^２の組合せが、（ホルミルとメチル）、（アセチルとメチル）、（プロピオニルとメチル）、（ブチリルとメチル）、（ホルミルとエチル）、（アセチルとエチル）、（プロピオニルとエチル）、（ブチリルとエチル）の各組合せである化合物が挙げられる。

ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡ又はその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。

以上のＡＬＡ類のうち、もっとも望ましいものは、ＡＬＡ、及び、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩である。とりわけ、ＡＬＡ塩酸塩、ＡＬＡリン酸塩を特に好適なものとして例示することができる。

上記ＡＬＡ類は、例えば、化学合成、微生物による生産、酵素による生産など公知の方法によって製造することができる。また、上記ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またＡＬＡ類を単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることもできる。

上記ＡＬＡ類を水溶液として調製する場合には、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要がある。アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐことができる。

本明細書において、ＡＬＡ−ＰＤＴとはＡＬＡ類を用いる光線力学的治療（ＰＤＴ）を意味し、最も典型的には、ＡＬＡを用いるＰＤＴを意味する。また、ＡＬＡ−ＰＤＤとはＡＬＡ類を用いる光線力学的診断（ＰＤＤ）を意味し、最も典型的には、ＡＬＡを用いるＰＤＤを意味する。

上記ＡＬＡ−ＰＤＴは、標的組織に集積する性質を有する光感受性物質（光増感剤）を対象に投与し、特定の波長の光線を照射することにより標的箇所を治療するＰＤＴを行う際に、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を対象へ投与する。対象の体内において、色素生合成経路を経てＡＬＡ類から誘導されたポルフィリン（主にＰｐＩＸ）を標的箇所に集積させ、集積したＰｐＩＸを励起させることで、周囲の酸素分子を光励起させる。その結果生成する一重項酸素が、その強い酸化力による殺細胞効果を有する。ＡＬＡ−ＰＤＴには、例えば、４００ｎｍ〜４２０ｎｍにピークを持つ光線、又は、６００ｎｍ〜６５０ｎｍにピークを持つ光線を用いるのが好ましい。

一方、上記ＡＬＡ−ＰＤＤは、標的組織に集積する性質を有する光感受性物質（光増感剤）を対象に投与し、光線を照射することにより標的箇所を治療するＰＤＤを行う際に、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を対象へ投与する。対象の体内において、色素生合成経路を経てＡＬＡ類から誘導されたポルフィリン（主にＰｐＩＸ）を標的箇所に集積させ、集積したＰｐＩＸを励起させて蛍光を検出することで、標的組織の存在の有無を検出もしくは診断する。ＡＬＡ−ＰＤＤには、例えば、４００ｎｍ〜４２０ｎｍにピークを持つ光線を用いるのが好ましい。

ノビレチンは、柑橘類の果皮等に多く含まれるフラボノイドであり、下記式（ＩＩ）によって示される化合物である。

本発明において用いられるノビレチンを含む組成物は、液体（例えば、飲料として調製されたもの）であってもよく、固体（例えば、粉末状）であってもよい。

本発明において用いられる柑橘類抽出物は、ノビレチンを含むものであれば、どのような柑橘類のエキスであってもよいが、例えば、ミカン属、キンカン属、カラタチ属、クリメニア属、エレモシトラス属及びミクロシトラス属からなる群から選択される柑橘類の抽出物であることが好ましい。

本発明において用いられる最も好ましい柑橘類はミカン属の柑橘類であり、ミカン属の柑橘類の例としては、メキシカンライム（Ｍｅｘｉｃａｎｌｉｍｅ）、タヒチライム（Ｔａｈｉｔｉｌｉｍｅ）、ベルガモット（Ｂｅｒｇａｍｏｔ）、ビロロ（Ｂｉｒｏｒｏ）、シトロン（Ｃｉｔｒｏｎ）、ユーレカレモン（Ｅｕｒｅｋａｌｅｍｏｎ）、スイートレモン（Ｓｗｅｅｔｌｅｍｏｎ）、ルミー（Ｌｕｍｉｅ）、ヒラドブンタン（Ｈｉｒａｄｏｂｕｎｔａｎ）、シャテンユ（Ｓｈａｔｅｎｙｕ）、マーシュグレープフルーツ（Ｍａｒｓｈｇｒａｐｅｆｒｕｉｔ）、キヌカワ（Ｋｉｎｕｋａｗａ）、ハッサク（Ｈａｓｓａｋｕ）、ナツダイダイ（Ｎａｔｓｕｄａｉｄａｉ）、サンボウカン（Ｓａｎｂｏｋａｎ）、サワーオレンジ（Ｓｏｕｒｏｒａｎｇｅ）、バレンジアオレンジ（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、モリタネーブル（Ｍｏｒｉｔａｎａｖｅｌ）、イヨカン（Ｉｙｏ）、ヒュウガナツ（Ｈｙｕｇａｎａｔｓｕ）、シュンコウカン（ｓｈｕｎｋｏｋａｎ）、ユズ（Ｙｕｚｕ）、スダチ（Ｓｕｄａｃｈｉ）、カボス（Ｋａｂｏｓｕ）、キング（Ｋｉｎｇ）、サツマ（ウンシュウ）（Ｓａｔｓｕｍａ）、ヤツシロ（Ｙａｔｓｕｓｈｉｒｏ）、ケラジ（Ｋｅｒａｊｉ）、オートー（Ｏｔｏ）、ポンカン（Ｐｏｎｋａｎ）、ダンシータンゼジェリン（Ｄａｎｃｙｔａｎｇｅｒｉｎｅ）、クレメンティン（Ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｅ）、ジミカン（Ｊｉｍｉｋａｎ）、シカイカン（Ｓｈｉｋａｉｋａｎ）、タチバナ（Ｔａｃｈｉｂａｎａ）、コベニミカン（Ｋｏｂｅｎｉｍｉｋａｎ）、キシュウ（Ｋｉｓｈｕ）、サンキツ（Ｓｕｎｋｉ）、シークワーサー（Ｓｈｉｉｋｕｗａｓｈａ）、コウジ（Ｋｏｊｉ）、シキキツ（Ｓｈｉｋｉｋｉｔｓｕ）、等が挙げられる。

本発明はＡＬＡ類と、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物との組み合わせに関するが、その組み合わせの態様は特に限定されず、ＰＤＴまたはＰＤＤの実施態様に応じて、当業者が様々な方法でＡＬＡ類と、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物とを組み合わせることができる。

本発明において、ＡＬＡ類と、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物とは、同時又は異時に対象に投与してもよい。また、本発明において、ＡＬＡ類と、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物とは、それぞれを含む配合剤として準備し、対象へ投与してもよい。また、本発明において、ＡＬＡ類と、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物とを、それぞれを別々に備えるキットとして準備し、使用時にそれぞれを同時に又は異時に対象に投与してもよい。

本発明において、ＡＬＡ類と、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物を同時に投与する態様としては、例えば、ノビレチンを含む液体（例えば、柑橘類の果汁、または、精製されたノビレチンを溶解させた液体）にＡＬＡ類を溶解させて対象へ投与する態様であってよく、ＡＬＡ類を含む液体にノビレチンを含む組成物（例えば、柑橘類エキス粉末、精製されたノビレチン）を溶解させて対象へ投与する態様であってよく、ノビレチンを含む液体とＡＬＡ類を含む液体とを混合させて対象へ投与する態様であってよく、ＡＬＡ類と、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物とを含む配合剤を対象へ投与する態様であってもよい。

本発明において、ＡＬＡ類と、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物を異時に投与する態様としては、例えば、ＡＬＡ類と、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物とを、時間をずらしてそれぞれ投与する態様であってよく、また、例えば、ＡＬＡ類と、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物とを異なる投与経路から投与する態様であってよい。

本発明におけるＡＬＡ類の投与経路、及び、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物の投与経路は、いずれも限定されず、全身投与であっても、局所投与であってもよい。投与経路としては、例えば、舌下投与も含む経口投与、あるいは吸入投与、カテーテルによる、標的組織又は臓器に対する直接投与、点滴を含む静脈内投与、貼付剤等による経皮投与、座薬、又は、経鼻胃管、経鼻腸管、胃ろうチューブ若しくは腸ろうチューブを用いる強制的経腸栄養法による投与等の非経口投与などを挙げることができる。また、上述のとおり、ＡＬＡ類と、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物とを、別々の経路から投与してもよい。

本発明において用いられる、ＡＬＡ類、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物、または、これらを組み合わせた配合剤、の剤型は、前記投与経路に応じて適宜決定してよく、限定はされないが、注射剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ等に溶解した水剤、貼付剤、座薬剤等を挙げることができる。

本発明に係る医薬は、必要に応じて他の薬効成分、栄養剤、担体等の他の任意成分を加えることができるのは言うまでもない。任意成分として、例えば結晶性セルロース、ゼラチン、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性及び動物性脂肪、油脂、ガム、ポリアルキレングリコール等の、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、溶剤、分散媒、増量剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。

本発明における、ＡＬＡ類の対象への投与量は、ＰＤＴまたはＰＤＤの実施態様に応じて、当業者が適宜決定することができる。限定はされないが、ＡＬＡ換算で対象の体重１ｋｇあたり、１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜３０ｍｇ、さらに好ましくは１５ｍｇ〜２５ｍｇ投与することができる。

ＡＬＡ類の投与頻度としては、一日一回〜複数回の投与又は点滴等による連続的投与を例示することができる。

ＡＬＡ類の投与期間は、例えば、対象の、予防又は治療しようとする症状又は状態等に鑑みて、種々の臨床学的指標等に基づいて、当該技術分野の薬理学者や臨床医が既知の方法により決定することができる。

本発明において、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物は、ＡＬＡ類が代謝されて精製されるＰｐＩＸの対象組織への蓄積を増強させる目的で投与されることから、ＡＬＡ類を投与する際にあわせて投与することが好ましいが、必ずしも完全に同時に投与する必要はない。

本発明における、ノビレチン又はノビレチンを含む組成物の投与量は、ＰＤＴまたはＰＤＤの実施態様に応じて、当業者が適宜決定することができる。限定はされないが、ノビレチン換算で対象の体重１ｋｇあたり、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５ｍｇ〜２０ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ投与することができる。

本発明を用いたＡＬＡ−ＰＤＴまたはＡＬＡ−ＰＤＤは、例えば、腫瘍の治療又は診断、感染症の治療又は診断に好適に用いることができる。本発明を腫瘍の治療又は診断に用いる場合、腫瘍の種類は特に限定されないが、例えば、ＰＤＴの対象としては、疣、子宮頸部がん、皮膚がん、甲状腺がん、悪性脳腫瘍などの表在性のがんや皮下性のがん、中でも皮下数ｍｍのがんを好適に例示することができ、ＰＤＤの対象としては、センチネルリンパ節を好適に例示することができる。また、ＰＤＤにより摘出前リンパ節転移診断を行うことが可能になる。本発明を感染症の治療または診断に用いる場合、例えば、感染症は、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症または寄生虫感染症であってよく、好ましくは、細菌感染症に対して用いることができ、さらに好ましくは、黄色ブドウ球菌感染症または緑膿菌感染症に用いることができる。

本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。

また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。

異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。

以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。

実施例１：柑橘類（柑橘エキス粉末）中のノビレチン含量の定量

本発明者らは、ＡＬＡ類と併用することでＡＬＡ類の苦みを軽減することができ、さらに、ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤの効果を増強させる効果を有する食品や飲料を鋭意検討した。

上記検討過程において、本発明者らは、ＡＬＡを溶解させる溶媒を生理食塩水から柑橘類エキス（オレンジジュース）に代えて患者に投与したところ、飲みやすくなり、患者の負担が減少しただけでなく、驚くべきことに、ＡＬＡを単独で投与する場合よりも、ＡＬＡ−ＰＤＤおよびＡＬＡ−ＰＤＴの感度が向上することを見出した（データ図示せず）。

本発明者らは、上記の知見を基に、ＡＬＡとの併用によりＡＬＡ−ＰＤＤおよびＡＬＡ−ＰＤＴの感度を向上させる因子を探索するため、まずは、柑橘類エキスに含まれる物質をスクリーニングした。

本実施例においては、柑橘類成分として、柑橘エキス粉末（「温州ミカンエキス−Ｐ」、オリザ油化株式会社製）を用いた。柑橘エキス粉末を１ｇ秤量し、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬社製）５ｍＬを加え、撹拌、超音波処理により完全に溶解させた。その後、ＤＭＳＯで１０ｍＬにメスアップしたものを１００ｍｇ／ｍＬ柑橘エキス溶液、さらにメタノール（和光純薬社製、ＨＰＬＣグレード）で１００倍に希釈したものを本実施例において用いる１ｍｇ／ｍＬ柑橘エキス溶液とし、これをＨＰＬＣに５μＬ注入した。

ＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ社製のＡｇｉｌｅｎｔ１２９０シリーズ、検出器は同社の１２９０ＤＡＤを用い、波長２８０ｎｍでの吸収を測定した。移動相はＡ液をアセトニトリル、Ｂ液をｍｉｌｌｉＱ水、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとし、０〜１０分はＡ液２２％で保持、１０〜３５分はリニアグラジエントでＡ液６１％、３５〜４０分はリニアグラジエントでＡ液１００％、４０〜４０．１分はリニアグラジエントでＡ液２２％、４０．１〜５５分はＡ液２２％で保持した。カラムはＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８（３．９ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ、ｗａｔｅｓ社製）を用い、カラム温度は２５℃とした。

１ｍｇ／ｍＬ柑橘エキス溶液のクロマトグラムを図１に示した。図１に示すとおり、１ｍｇ／ｍＬ柑橘エキス溶液からは６つのピークが得られた。６つのピークのうち、保持時間２４．１分である「ピーク４」はノビレチンであることが判明した。また、１ｍｇ／ｍＬ柑橘エキス溶液中のノビレチン含量は３．８μＭ（１．５２μｇ／ｍＬ）であり、柑橘エキス粉末１ｇあたり１．５２ｍｇのノビレチンを含有することがわかった。なお、定量のためのノビレチン標準品は、和光純薬社製の生化学用試薬を用いた。溶媒はメタノールとし、２ｍＭ−ノビレチン標準液を作成し、標準添加法により１ｍｇ／ｍＬ柑橘エキス溶液中のノビレチン含量を求めた。

これらの結果から、柑橘類エキスに含まれるノビレチンが、ＡＬＡとの併用によりＡＬＡ−ＰＤＤにおける癌診断の感度を向上させた要因であった可能性が示唆された。

実施例２：柑橘類成分の癌細胞内ＰｐＩＸ蓄積に対する増強効果

実験方法
癌細胞として、ヒト胃がん細胞株であるＴＭＫ−１を用いた。培地は、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｗａｋｏ社製）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したものを用いた（以下ＲＰＭＩ培地と表記する）。柑橘類成分として、柑橘エキス粉末（温州ミカンエキス、オリザ油化株式会社製）を用いた。

柑橘エキス粉末１ｇに対してジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ、Ｗａｋｏ社製）５ｍＬを加え、混合後、超音波処理で溶解し、２００ｍｇ／ｍＬ柑橘エキス溶液とした。２００ｍｇ／ｍＬ柑橘エキス溶液を等量のＤＭＳＯで段階希釈し希釈系列を７点作製した。これらの柑橘エキス溶液をＲＰＭＩ培地、または、１ｍＭアミノレブリン酸（ＡＬＡ）塩酸塩を含むＲＰＭＩ培地１ｍｌに対して１０μｌ添加し、柑橘エキス含有培地（柑橘エキス最終濃度０−１ｍｇ／ｍＬ）を作成した。ＦｕｍｉｔｒｅｍｏｒｇｉｎＣ（ＦＴＣ、フナコシ社製、商品コードＢＶＴ−０１８９−Ｃ２５０）をＤＭＳＯに溶解し１ｍＭＦＴＣ溶液を作成後、１ｍＭＡＬＡ塩酸塩を含むＲＰＭＩ培地で希釈、１ｍＭＡＬＡ塩酸塩＋１０μＭＦＴＣ培地を作製し、これをポジティブコントロール（ＰＣ）とした。なお、ＦＴＣはＡＢＣＧ２（ＰｐＩＸを細胞外に排出する際のトランスポーター）の阻害剤であり、ＰｐＩＸの細胞外排出阻害効果（ＰｐＩＸ蓄積増強効果）を検討する際のポジティブコントロールとして用いることができる。

癌細胞を９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、３７℃で一晩培養した。一晩培養した癌細胞の９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅから培養上清を除去後、各ｗｅｌｌに上記の柑橘エキス含有培地を１００μＬ添加し、３７℃で４．５時間培養した。続いて培養上清を除去し、細胞をりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｗａｋｏ社製）で洗浄後、ｗｅｌｌあたり１００μＬの１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、Ｗａｋｏ社製）水溶液を加えて可溶化、細胞内分画とした。プロトポルフィリンＩＸ標品（ＰｐＩＸ、商品コードＰ５６２−９、フナコシ社製）をＤＭＳＯに溶解し１ｍＭＰｐＩＸストック溶液とした。１ｍＭＰｐＩＸストック溶液を１％ＳＤＳ溶液で最終濃度０−５００ｎＭに希釈し、細胞内ＰｐＩＸ標準液とした。これらのＰｐＩＸ標準液をそれぞれ、細胞内分画のプレートの未使用ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加した。マイクロプレートリーダー（テカン社製）を用いて、これらのプレートの各Ｗｅｌｌの蛍光強度を、励起波長４０５ｎｍ、測定波長６３５ｎｍの条件で測定した。測定後、ＰｐＩＸ標準液の蛍光強度から検量線を作成、各ｗｅｌｌのＰｐＩＸ量を検量線から算出した。結果を図２に示す。

結果
図２に示すように、ＡＬＡ塩酸塩単独処理と比べて、柑橘エキスを併用すると、添加量依存的に細胞内ＰｐＩＸが増加し、ＡＬＡ塩酸塩＋１ｍｇ／ｍＬ柑橘エキス（ノビレチン３．８μＭ相当量）の添加により、最大で２倍増加した。この結果から、ＡＬＡと柑橘類成分の併用により、ＡＬＡ単独使用の場合と比較して、細胞内ＰｐＩＸの蓄積が増強されることが示された。また柑橘エキスはノビレチンを含んでいることから、柑橘エキス中のノビレチンがＰｐＩＸ蓄積増強効果に関与している可能性が示唆された。

実施例３：ノビレチンの癌細胞内ＰｐＩＸ蓄積に対する増強効果

方法
癌細胞としてヒト胃がん細胞株であるＴＭＫ−１を用いた。ノビレチン（Ｗａｋｏ社製）はＤＭＳＯに溶解し、１ｍＭノビレチン溶液とした。１ｍＭノビレチン溶液を等量のＤＭＳＯで希釈、２倍希釈系列を作成し、ノビレチン溶液とした。これらのノビレチン溶液をＲＰＭＩ培地、または、２．３ｍＭＡＬＡ塩酸塩を含むＲＰＭＩ培地で１００倍希釈し、０−１０μＭノビレチン含有培地を作成した。ＦＴＣをＤＭＳＯに溶解し１ｍＭＦＴＣ溶液を作成後、２．３ｍＭＡＬＡ塩酸塩を含むＲＰＭＩ培地で希釈し、２．３ｍＭＡＬＡ塩酸塩＋１０μＭＦＴＣ培地を作製しこれをポジティブコントロール（ＰＣ）とした。

癌細胞を９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、３７℃で一晩培養した。一晩培養した癌細胞の９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅから培養上清を除去後、各ｗｅｌｌに上記の０−１０μＭノビレチン含有培地、１０μＭＦＴＣ含有培地を１００μＬ添加し、３７℃で４時間培養した。続いて培養上清を除去した後、細胞を、ＰＢＳで洗浄、ｗｅｌｌあたり１００μＬの１％ＳＤＳ水溶液を加えて可溶化し細胞内分画とした。ＰｐＩＸ標準品を、ＤＭＳＯに溶解し１ｍＭＰｐＩＸストック溶液とした。１ｍＭＰｐＩＸストック溶液を１％ＳＤＳで最終濃度０−５００ｎＭに希釈し、細胞内ＰｐＩＸ標準液とした。これらのＰｐＩＸ標準液をそれぞれ、細胞内分画のプレートの未使用ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加した。マイクロプレートリーダー（テカン社製）を用いて、これらのプレートの各Ｗｅｌｌの蛍光強度を、励起波長４０５ｎｍ、測定波長６３５ｎｍの条件で測定した。測定後、ＰｐＩＸ標準液の蛍光強度から検量線を作成、各ｗｅｌｌのＰｐＩＸ量を検量線から算出した。結果を図３に示す。

結果
図３から明らかなように、ＡＬＡ塩酸塩単独添加と比べて、ノビレチンを併用すると細胞内ＰｐＩＸが濃度依存的に増加し、１０μＭノビレチンの添加により最大で２倍増加した。この結果から、ＡＬＡとノビレチンとの併用により、ＡＬＡ単独使用の場合と比較して、細胞内ＰｐＩＸの蓄積が増強されることが示された。

実施例４：ノビレチンの癌細胞の光線力学治療（ＰＤＴ）に対する増強効果

方法
癌細胞としてヒト胃がん細胞株であるＴＭＫ−１を用いた。癌細胞は５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種後、３７℃で一晩培養した。培養後、１３．８ｍＭＡＬＡ塩酸塩を含むＲＰＭＩ培地と、６０μＭノビレチンを含むＲＰＭＩ培地とを１／６量ずつ添加し、２．３ｍＭＡＬＡ塩酸塩と１０μＭノビレチン共存下で４時間培養した。４時間培養後、培養上清を除去、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬのＲＰＭＩ培地を各ウェルに添加、ＰＤＴ照射装置を用いて波長６３１ｎｍにて５分間照射し、ＰＤＴを行った。

殺細胞効果の測定は、Ｃｅｌｌ−ＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（同仁化学研究所社製）を用い下記のように行った。ＲＰＭＩ培地とＣｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８溶液を１０：１の割合で混合しＷＳＴ−８反応液を作成した。ＡＬＡ−ＰＤＴ処理２４時間培養後のプレートから、培地を除去、１００μＬのＰＢＳで洗浄後、ＷＳＴ−８反応液を各ｗｅｌｌに１１０μＬ分注し、さらにＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。マイクロプレートリーダー（テカン社製）を用いて、ＷＳＴ−８ホルマザン色素の４５０ｎｍの吸光度を、吸光度が１付近になるまで経時的に測定した。各処理区の細胞生存率は、薬剤未処理サンプルの吸光度に対する相対値から算出した。結果を図４に示す。

結果
図４から明らかなように、ＰＤＴ処理群の細胞生存率は、２．３ｍＭＡＬＡ塩酸塩単独処理区が６３％であったのに対し、２．３ｍＭＡＬＡ塩酸塩＋１０μＭノビレチン併用処理区は１８％と顕著に低下していた。一方、ＰＤＴ未処理群は、いずれの処理区も９５％以上の細胞生存率を示した。この結果から、ＡＬＡとノビレチンとの併用により、ＡＬＡ単独使用の場合と比較して、ＡＬＡ−ＰＤＴの殺細胞効果が増強されることが示された。

実施例５：腫瘍移植鶏卵モデルに対するノビレチンのＡＬＡ―ＰＤＴ増強効果

実験方法
癌細胞として、マウスの乳腺腫瘍であるＥＭＴ−６を用いた。培地は、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓＭＢ７５２／１Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したものを用いた（以下Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ培地と表記する）。ノビレチンは、ノビレチン粉末（フナコシ社製）を用いた。

腫瘍移植鶏卵モデルを用いた試験のスケジュール及び処理区の条件の概要を図５に示す。
白色有精卵（後藤鶏卵場）の卵殻を７０％エタノール綿で消毒後、３７℃のインキュベーターに卵を縦置き（気室部位を上）にしてＤａｙ１１までインキュベートした。培養中、適時転卵を行った。

Ｄａｙ１１の発育鶏卵の気室部からライトをあて、卵殻下の漿尿膜に存在している太い血管とその周囲の約２×２ｃｍの枠をマークした。卵殻を７０％エタノール綿で消毒後、グラインダーで枠の一か所に深い切り込みを入れた後、枠に沿って卵殻にグラインダーで浅く切り込みを入れた。深く削った部位から卵殻をピンセットで除いた後、漿尿膜と卵殻膜をピンセットで剥離し人工気室を作成した。気室部位を覆うようにオプサイト（Ｓｍｉｔｈ＆Ｎｅｐｈｅｗ社製）を張り付けた後、開口部のオプサイトのみをはさみで除去した。

血管の分岐部位にテフロンリングを置いた後、テフロンリング内に２０μＬのＥＭＴ−６の細胞懸濁液（１．２５×１０^７Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、２．５×１０^５Ｃｅｌｌｓ／ｅｇｇで細胞を鶏卵に移植した。開口部をテガダーム（３Ｍ社製）で覆った後、鶏卵をインキュベーターに戻し２日間培養した。ＥＭＴ−６細胞懸濁液移植２日後、テフロンリングの除去を行い、再びインキュベーターに戻した。

ノビレチン粉末８１．２１ｍｇに対してジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ、Ｗａｋｏ社製）１ｍＬを加え、混合後、３７℃で加熱して溶解し、８１ｍｇ／ｍＬノビレチン溶液とした。ＡＬＡ塩酸塩１０ｍｇに対して生理食塩水を８５０μＬ、８．４％炭酸水素ナトリウムを１５０μＬ添加し、１０ｍｇ／ｍＬＡＬＡ塩酸塩溶液とした。８１ｍｇ／ｍＬノビレチン溶液１０μＬと、１０ｍｇ／ｍＬＡＬＡ塩酸塩溶液１０００μＬとを混合し、１０ｍｇ／ｍＬＡＬＡ塩酸塩＋８１０μｇ／ｍＬノビレチン溶液とした。生理食塩水１ｍＬにＤＭＳＯ１０μＬを添加してＣｏｎｔｒｏｌ溶液とした。Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液、１０ｍｇ／ｍＬＡＬＡ塩酸塩溶液、１０ｍｇ／ｍＬＡＬＡ塩酸塩＋８１０μｇ／ｍＬノビレチン溶液をシリンジで採取し、Ｄａｙ１５の腫瘍移植鶏卵の血管に１００μＬ／ｅｇｇで静脈注射した。鶏卵をインキュベーターに戻して４時間培養後、１００ｍＷ／ｃｍ^２、２５０秒、光照射し、再度培養した。光照射３日後（Ｄａｙ１８）に腫瘍を摘出し、微量電子天秤で腫瘍重量を測定した。

結果
図６に示すように、ＡＬＡ塩酸塩単独処理と比べて、ノビレチンを併用すると、腫瘍重量が減少した。この結果から、ＡＬＡとノビレチンの併用により、ＡＬＡ単独使用の場合と比較して、ＡＬＡ−ＰＤＴによる抗腫瘍効果が増強されることが示された。

Claims

光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための医薬であって、
前記医薬は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはその塩、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、または、ＡＬＡペンチルエステル、
を含み、
前記医薬は、ノビレチンと併用されることを特徴とする、
医薬。
光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための医薬であって、
（Ａ）５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはその塩、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、または、ＡＬＡペンチルエステル、と、
（Ｂ）ノビレチンと
を含むことを特徴とする、
医薬。
光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための、同時又は異時に投与される、組み合わせ医薬であって、
（Ａ）５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはその塩、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、または、ＡＬＡペンチルエステル、と、
（Ｂ）ノビレチンと
の組み合わせ医薬。
請求項３に記載の組み合わせ医薬であって、
前記（Ａ）と前記（Ｂ）とが、キットとして準備されることを特徴とする、
組み合わせ医薬。