KR20210104830A - 항노화를 위한 삼중 조합 요법 - Google Patents

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KR20210104830A
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KR
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mitochondrial
doxycycline
vitamin
azithromycin
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KR1020217022471A
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마이클 피. 리산티
페데리카 소트지아
마르코 피오릴로
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루넬라 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

본 접근법은 정상 세포를 억제하지 않으면서, 유도된 미토콘드리아 산화성 스트레스 동안 미토콘드리아 생물발생(biogenesis)을 억제함으로써, 노쇠 세포 및 노화와 관련된 특징을 가진 세포를 효과적으로 제거한다. 실시양태는 미토콘드리아 생물발생을 억제하고 큰 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 치료제, 미토콘드리아 생물발생을 억제하고 작은 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 치료제, 및 산화촉진제로서 작용하거나 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 치료제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태는 항균 항생제 농도 미만의 항생제 농도를 포함함으로써, 항생제 내성 문제를 최소화한다.

Description

항노화를 위한 삼중 조합 요법
본 개시는 다른 유리한 치료 용도 중에서 항노화 조성물 및 방법에 관한 것이다.
노화(aging)의 생물학적 과정은 과학 및 의학 연구계에서 계속 상당한 주목을 받고 있다. 생리학적 노화는 적어도 부분적으로 DNA, 지질, 단백질 등을 포함하는 세포 성분들의 산화성 손상률의 증가와 관련되어 있다. 증가된 산화성 손상은 세포 수준에서 자가 조절 과정을 파괴하는 불균형을 초래한다. 또한, 노화는 신경 세포질에서의 리포퓨신(lipofuscin)의 축적과 상관관계를 가진다. 현대 연구도 노화가 시간의 경과에 따라 축적되는, 비정상적인 DNA 변경을 야기하는 천연 생성 DNA 손상의 결과임을 시사한다. 미토콘드리아 및 핵 DNA 손상은 아폽토시스 및 세포 노쇠(senescence)를 증가시킴으로써 간접적으로, 그리고 세포 기능장애를 증가시킴으로써 직접적으로 노화에 기여할 수 있다. 축적된 DNA 손상은 세포의 손실로 이어질 수 있고 생존 세포에서 유전자 발현의 손실 및 돌연변이로 이어질 수 있다 - 잘 분열하지 않는 세포에서 노화의 징후를 생성하는 효과. 자주 분열하는 세포의 경우, 축적된 DNA 손상은 암의 주요 원인이 될 수 있다.
노화는 암의 발생 확률도 증가시키고, 연구원들은 신규 항암 치료를 개발하기 위해 고군분투하고 있다. 통상의 암 요법(예를 들면, 방사선조사, 알킬화제, 예컨대, 사이클로포스프아미드 및 항-대사물질, 예컨대, 5-플루오로우라실)은 세포 생장 및 DNA 복제에 관여하는 세포 기작을 방해함으로써 신속히 생장하는 암 세포를 선택적으로 검출하고 제거하고자 하였다. 다른 암 요법은 신속히 생장하는 암 세포 상의 돌연변이체 항원에 선택적으로 결합하는 면역요법(예를 들면, 단일클론 항체)을 사용하였다. 불운하게도, 종양은 종종 동일한 또는 상이한 부위(들)에서 이 요법들 후 재발하는데, 이것은 모든 암 세포들이 박멸되지는 않음을 시사한다. 특히, 암 줄기 세포는 다양한 이유로 생존하고 치료 실패를 유발한다. 재발은 불충분한 화학치료제 용량 및/또는 요법에 대한 내성을 띤 암 클론의 출현에 기인할 수 있다. 따라서, 통상의 요법의 결점을 극복하는 신규 암 치료 전략이 필요하다.
돌연변이 분석의 진일보는 암 발생 동안 일어나는 유전적 돌연변이의 심층 연구를 가능하게 하였다. 게놈 분야의 지식을 갖고 있음에도 불구하고, 현대 종양학은 암 하위유형들 전체에 걸쳐 일차 동인 돌연변이를 확인하는 데 있어서 어려움을 갖고 있다. 냉혹한 현실은 각각의 환자의 종양이 독특하고 단일 종양이 다수의 서로 상이한 클론 세포들을 함유할 수 있다는 점인 듯하다. 따라서, 필요한 것은 상이한 암 유형들 사이의 공통점을 강조하는 새로운 접근법이다. 종양 세포와 정상 세포 사이의 대사 차이를 표적화하는 것은 신규 암 치료 전략으로서 유망하다. 인간 유방암 샘플로부터의 전사 프로파일링 데이터의 분석은 미토콘드리아 생물발생(biogenesis) 및/또는 미토콘드리아 번역과 관련된 95개 이상의 상승된 mRNA 전사체들을 보여주었다[Sotgia et al., Cell Cycle, 11(23):4390-4401 (2012)]. 추가로, 95개의 상향조절된 mRNA들 중 35개 이상은 미토콘드리아 리보좀 단백질(MRP)을 코딩한다. 인간 유방암 줄기 세포의 단백질체학 분석도 여러 미토리보좀 단백질들 및 미토콘드리아 생물발생과 관련된 다른 단백질들의 유의미한 과다발현을 보여주었다[Lamb et al., Oncotarget, 5(22):11029-11037 (2014)].
특정 정균성 항생제 또는 OXPHOS 억제제의 오프(off)-표적 효과를 이용한 미토콘드리아 생물발생의 기능적 억제는 기능적 미토콘드리아가 암 줄기 세포의 증식을 위해 요구된다는 추가 증거를 제공한다. 본 발명자들은 미토콘드리아 형광 염료(MitoTracker)가 살아있는 세포의 불균질한 집단으로부터 암 줄기 유사 세포를 농후화하고 정제하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 최근에 보여주었다[Farnie et al., Oncotarget, 6:30272-30486 (2015)]. 미토콘드리아 질량이 가장 높은 암 세포는 통상적으로 전이력과 관련된 특징인 고정 독립적 생장을 겪는 가장 강한 기능적 능력을 가졌다. 'Mito-high' 세포 하위집단은 임상 전 모델의 사용에 의해 밝혀진 바와 같이, 생체내에서 가장 높은 종양 시작 활성도 가졌다. 본 발명자들은 여러 부류의 무독성 항생제들이 암 줄기 세포(CSC) 증식을 중단하는 데 사용될 수 있다는 것도 입증하였다[Lamb et al., Oncotarget, 6:4569-4584 (2015)]. 호기성 세균과 미토콘드리아 사이에 보존된 진화적 유사성이 있기 때문에, 특정 부류의 항생제 또는 항생제 활성을 가진 화합물은 오프-표적 부작용으로서 미토콘드리아 단백질 번역을 억제할 수 있다. 현대 의학은 일반적으로 항-미토콘드리아 부작용을 바람직하지 않은 효과로서 간주하고, 종종 이 오프-표적 결과는 상이한 약물을 사용하게 만든다.
따라서, 세포 수준에서 노화를 치료하여, 축적된 산화성 및 DNA 손상 및 다수의 원하지 않는 노화 효과를 극복하는 신규 항노화 조성물 및 방법이 필요하다.
상기 배경기술을 고려할 때, 본 접근법의 목적은 노화 효과를 늦추고 많은 경우 일부 노화 효과를 역전시키는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다. 본 접근법의 조성물 및 방법은 축적된 산화성 및 DNA 손상의 영향을 극복할 수 있고, 노화와 관련된 많은 부작용을 완화시킬 수 있다. 본 접근법은 노화의 효과를 치료하고/하거나 감소시키는 데 사용될 수도 있다. 일례로서, 실시양태는 건강수명 및 수명을 개선하는 데 사용될 수 있다.
본 접근법의 실시양태는 유도된 미토콘드리아 산화성 스트레스 동안 미토콘드리아 생물발생을 억제함으로써 노쇠 세포에서 미토콘드리아 파멸을 유도한다. 본 접근법의 일부 실시양태에 따라, 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제1 항생제 및 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제2 항생제는 산화촉진제 또는 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 작용제와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, FDA에 의해 승인된 하나 이상의 항생제가 하나 이상의 일반적인 식이 보충제와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 산화촉진제는 산화촉진제 효과를 가진 치료제일 수 있다. 예를 들면, 산화촉진제는 치료제가 환원제로서 작용하게 하는 농도로 존재하는 치료제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 표적화 신호와 접합될 수 있다. 본 접근법의 실시양태는 노화 효과를 지연시키는 것 및 이 효과의 대부분을 역전시키는 것 중 하나 이상을 위해 사용될 수 있다. 본 접근법은 항노화 이외에 다른 유리한 요법들 중에서 암, 종양 재발, 전이, 화학요법 또는 약물 내성, 방사선요법 내성, 및 암 또는 다른 원인으로 인한 악액질의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 본 접근법의 기작은 노쇠 세포를 유사하게 표적화하고, 축적된 DNA 손상의 처분에 유리한 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 아지쓰로마이신(azithromycin)은 노쇠 섬유모세포를 선택적으로 사멸시키고 제거하는 세놀라이틱(senolytic)으로서 작용하는 항노화 약물이다.
일부 실시양태는 유리하게는 건강한 정상 세포에 비해 노쇠 세포를 표적화하고 사멸시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 노쇠 관련 분비 표현형의 획득을 방해한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 조직 복구 및 재생을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 유기체의 수명 및 건강수명 중 적어도 하나를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본 접근법은 탈모, 청력 손실, 시력 손실, 기억력 손실, 정신적 둔화, 관절 경직, 근육 손실, 힘 손실, 속도 손실, 균형 손실, 지구력 손실, 민첩성 손실, 성기능장애, 정력 손실, 테스토스테론 감소, 리포퓨신 침착 및 염증 중 하나 이상을 감소시킬 수 있다. 본 접근법은 모발 재생, 청력, 시력, 기억력, 정신적 명민함, 관절 이동성, 근육 성장, 근력, 근지구력, 속도, 균형, 민첩성 및 성기능 중 하나 이상을 개선할 수 있고/있거나 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 본 접근법은 모발 성장 및 천연 모발 색상을 회복시키고, 근육 조정력 및 보행을 회복시키고, 전반적인 이동성을 회복시키고, 근육량을 증가시키고, 악력을 증가시키고, 집중력 및 정신적 명석함을 증가시키고, 학습 및 기억력을 증가시키고, 노화 부작용으로 고통받을 포유류에서 전반적인 행복감 및 긍정적인 에너지를 야기하는 잠재력을 가진다. 본 접근법의 일부 실시양태는 백발, 전반적인 노쇠함, 건망증, 및 전신 동통 및 통증의 감소를 나타내었다. 본 접근법의 조성물 및 방법의 이점을 더 철저히 이해하고 정량하기 위해 추가 연구 및 시험을 진행하고 있다.
본 접근법의 항노화 활성은 본 접근법의 항암 효능과 관련되어 있다. CSC는 과다대사성을 띠고, 관련 출원에 개시된 바와 같이, CSC 대사 활성의 방해는 CSC를 제거하는 효과적인 전략이다. 노쇠 세포는 유사한 대사 약화를 가질 수 있다. 예증적 항암 실시양태에서, 독시사이클린(doxycycline), 아지쓰로마이신 및 비타민 C의 조합물은 미토콘드리아를 효과적으로 표적화하고 CSC 증식을 강력히 억제한다. 암 줄기 세포는 적어도 부분적으로 암 줄기 세포 내의 미토콘드리아의 상승된 양으로 인해 정상 세포에 비해 대사적으로 과다활성 상태이므로, 이 접근법은 CSC 집단을 선택적으로 표적화한다. 아지쓰로마이신은 오프-표적 부작용으로서 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제한다. 또한, 독시사이클린은 오프-표적 부작용으로서 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제한다. 비타민 C는 유리 라디칼을 생성할 수 있는 약한 산화촉진제로서 작용하고, 결과적으로 미토콘드리아 생물발생을 유도한다. 놀랍게도, 본 접근법의 한 실시양태에 따른 독시사이클린(1 μM), 아지쓰로마이신(1 μM) 및 비타민 C(250 μM)의 조합물을 사용한 치료는 MCF7 ER(+) 유방암 세포주를 모델 시스템으로서 사용할 때 CSC 증식을 약 90%까지 매우 강력히 억제하였다. 미토콘드리아 산소 소비 및 ATP 생성에 대한 이 삼중 조합 요법의 강한 억제 효과는 대사적 유동 분석을 이용함으로써 직접적으로 입증되었다. 따라서, 미토콘드리아 생물발생의 억제와 커플링된, 약한 미토콘드리아 산화성 스트레스의 유도는 효과적인 치료적 항암 전략을 나타낸다. 이러한 주장과 일치하여, 비타민 C는 나트륨 커플링된 방식으로 특정 수송제, 즉 SCVCT2에 의해 미토콘드리아 내부에 고도로 농축되어 있는 것으로 공지되어 있다. 본 접근법의 한 실시양태에 따른 조성물은 미토콘드리아 산소 소비 및 ATP 생성의 감소를 확인시켜주면서, 예비 연구 동안 MCF7 ER(+) 세포주에서 CSC 증식을 약 90%까지 억제하였다. 추가로, 일부 실시양태는 항균 항생제 미만 농도(sub-antimicrobial antibiotic concentration)를 사용함으로써, 항생제 내성 문제를 최소화할 수 있거나 피할 수 있는데, 이것은 의료계에 상당한 이점이 된다.
일부 실시양태에서, 본 접근법은 (i) 에리쓰로마이신(erythromycin) 패밀리의 구성원, (ii) 테트라사이클린(tetracycline) 패밀리의 구성원 및 (iii) 산화촉진제를 가진 조성물의 형태를 취할 수 있다. 이하에 논의된 실시양태들 중 일부에서, 조성물은 치료제로서 아지쓰로마이신, 독시사이클린 및 비타민 C를 포함하였다. 아지쓰로마이신은 널리 사용되는 항생제이고, 큰 미토콘드리아 리보좀의 억제라는 종종 원하지 않는 부작용을 가진다. 독시사이클린은 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는데, 이것 또한 원하지 않는 부작용이다. 이 오프-표적 효과는 빈번히 의사가 다양한 적응증들에 대한 다른 약물을 선택하게 만든다. 그러나, 본 접근법은 이러한 오프-표적 미토콘드리아 억제 효과를 유리하게 사용하여, 노쇠 세포 및 CSC를 선택적으로 표적화하고 박멸한다. 비타민 C는 특정 상황에서 약한 산화촉진제로서 작용하고, 산화촉진제로서 유리 라디칼 및 반응성 산소 종의 생성을 통해 노쇠 세포 및 CSC에서 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도한다. (다른 아스코르베이트 유도체도 특히 저농도에서 유사한 산화촉진제 효과를 가질 수 있음을 인지해야 한다.) 이 세포들은 미토콘드리아 생물발생을 통해 미토콘드리아 산화성 스트레스에 반응한다. 그러나, 아지쓰로마이신 및 독시사이클린과 같은 미토콘드리아 생물발생 억제제의 존재 하에서, 이 세포들은 유도된 미토콘드리아 산화성 스트레스에 적용하여 살아남을 수 없다. 본 접근법은 건강한 정상 세포에는 영향을 미친다 하더라도 거의 미치지 않으면서 노쇠 세포 및 CSC를 선택적으로 표적화한다.
항노화에 대한 예시적 실시양태에서, 본 접근법에 따른 치료는 재발 주기에 걸쳐 처방되었다. 조성물은 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제1 항생제로서의 아지쓰로마이신, 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제2 항생제로서의 독시사이클린 및 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 촉진제로서의 비타민 C를 포함하였다. 5주 기간에 걸쳐, 아지쓰로마이신은 주당 2회 250 mg 투여되었고, 독시사이클린은 일당 2회 100 mg 투여되었고, 비타민 C는 일당 1회 500 mg 투여되었다. 피험자(77세 남성)는 증가된 모발 성장, 정신적 지각 및 명민함, 힘 및 체력, 및 성욕뿐만 아니라, 개선된 시력, 청력, 언어능력, 조정력 및 균형, 전반적인 행복감 및 긍정적인 에너지도 보고하였다. 수혜자는 임의의 다른 약물치료 또는 식습관, 운동 및 일상생활의 변화 없이, 본 접근법에 따른 치료 후 임상적으로 촉진 가능한 전립선 결절의 사라짐도 보고하였다.
항암에 대한 예시적 실시양태에서, 독시사이클린(1 μM), 아지쓰로마이신(1 μM) 및 비타민 C(250 μM)의 조합물을 사용한 치료는 MCF7 ER(+) 유방암 세포에서 CSC 증식을 약 90%까지 억제하였다. 미토콘드리아 산소 소비 및 ATP 생성에 대한 이 삼중 조합 요법의 강한 억제 효과는 대사적 유동 분석을 이용함으로써 직접 입증되었다. 본원에 기재된 바와 같이, 미토콘드리아 생물발생의 억제와 커플링된, 약한 미토콘드리아 산화성 스트레스의 유도는 강력한 항암 요법을 나타낸다. 또한, 본원에서 논의된 예에서 사용된, 항균 항생제 농도 미만의 항생제 농도는 항생제 내성의 발생과 관련된 문제를 일으킨다 하더라도 거의 일으키지 않을 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제1 항생제 및/또는 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제2 항생제는 항균 농도 미만의 농도로 투여될 수 있다. 예를 들면, 독시사이클린의 일반적인 항균 용량 미만의 용량은 본 접근법의 일부 실시양태에서 적합할 수 있는 20 mg이다. 또 다른 예로서, 혈액, 혈청 및 혈장 중 적어도 하나에서 약 1 μM의 피크 독시사이클린 농도를 생성하기에 충분한 독시사이클린의 양은 일부 실시양태에서 충분할 수 있다. 또 다른 예로서, 아지쓰로마이신의 일반적인 경구 항균 용량 미만의 용량은 본 접근법의 일부 실시양태에서 적합할 수 있는 250 mg이다. 또 다른 예로서, 혈액, 혈청 및 혈장 중 적어도 하나에서 약 1 μM의 피크 아지쓰로마이신 농도를 생성하기에 충분한 아지쓰로마이신의 양은 일부 실시양태에서 충분할 수 있다. 최적화는 특정 실시양태를 위해 추가 개선을 요구할 수 있으나, 이러한 개선은 당분야의 통상의 기술 수준 이내에 있음을 인식해야 한다.
FDA에 의해 승인된 항생제, 특히 테트라사이클린 패밀리 구성원, 예컨대, 독시사이클린, 및 에리쓰로마이신 패밀리 구성원, 예컨대, 아지쓰로마이신은 미토콘드리아 생물발생의 억제라는 오프-표적 효과를 가진다. 그러나, 항-미토콘드리아 성질을 가진 항생제는 단독으로 사용될 때 모든 노쇠 세포 또는 CSC의 박멸을 보장하지 않는다. 큰 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 하나 이상의 치료제와, 작은 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 하나 이상의 치료제의 조합물은 본원에서 입증된 바와 같이 더 효과적이다. 그러나, 미토콘드리아 생물발생 억제제에 노출된 후 생존 세포 하위집단에서 산화성 대사로부터 해당작용성 대사로의 대사 전환이 있을 수 있고, 이로 인해 대사 경직성이 초래될 수 있다. 다른 한편으로, 산화촉진제 화합물은 이 세포들을 미토콘드리아 생물발생 쪽으로 전환시키는 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도한다. 미토콘드리아 생물발생을 억제하면서 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 이중 접근법은 대체 생존 기작이 없는 이 세포들을 남긴다. 결과적으로, 큰 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 치료제와 작은 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 치료제 및 산화촉진제의 삼중 조합물은 매우 강력한 항노화 및 항암 전략을 가능하게 한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 항암 삼중 조합물은 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제1 항생제 및 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제2 항생제, 및 산화촉진제를 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 상기 삼중 조합물은 테트라사이클린 패밀리로부터의 적어도 하나의 항생제, 에리쓰로마이신 패밀리로부터의 적어도 하나의 항생제 및 비타민 C를 포함한다. 유리하게는, 본 접근법의 일부 실시양태는 항균 용량 미만의 용량으로 항생제 농도를 요구한다. 예를 들면, 독시사이클린 및 아지쓰로마이신은 소정의 제형에 대해 당분야에서 공지되어 있는 항균 용량 미만의 용량, 예컨대, 독시사이클린의 경우 경구로 20 mg, 그리고 아지쓰로마이신의 경우 경구로 250 mg으로 투여될 수 있다. 또 다른 예로서, 독시사이클린 및 아지쓰로마이신은 혈액, 혈청 및 혈장 중 적어도 하나에서 일부 실시양태에서 약 0.05 μM 내지 약 5 μM, 일부 실시양태에서 0.5 μM 내지 약 2.5 μM, 일부 실시양태에서 약 1 μM의 피크 독시사이클린 농도를 야기하기에 충분한 용량으로 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에 적합한 투약의 추가 평가는 진행 중이고, 본 접근법을 벗어나지 않으면서 다른 양 및 농도를 사용할 수 있음을 인식해야 한다.
항노화 조성물, 화합물 및 방법의 예가 본원에 기재되어 있다. 본 접근법은 노화의 다양한 효과를 극복하기 위한 항노화 요법으로서 사용될 수 있고, 다른 요법, 예컨대, 항암 화학요법 및/또는 방사선요법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 접근법은 전이 확률을 예방하거나 감소시키기 위해 수술적 종양 제거 전, 동안 및/또는 후에 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 본 접근법은 성공 확률을 향상시키기 위해 화학요법 전, 동안 또는 후에 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 본 접근법은 이점을 지속시키고 노화 부작용의 시작을 감소시키기 위해 반복적으로(예를 들면, 매년) 사용될 수 있다. 반복적 사용은 유리하게는 재발 및/또는 전이 확률을 예방하고/하거나 감소시킬 수도 있다. 본 접근법의 실시양태는 노쇠 세포 이외에 암 줄기 세포를 표적화함으로써, 종양 재발, 전이, 약물 내성 및/또는 방사선요법 내성에 대한 잠재력을 직접 해결하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 표적 암 세포 표현형은 CSC, 활동성 암 줄기 세포(eCSC), 순환 종양 세포(CTC) 및 요법 내성 암 세포(TRCC) 중 적어도 하나일 수 있다.
추가로, 항생제의 항-미토콘드리아 성질은 하나 이상의 막 표적화 신호 및/또는 미토콘드리아 표적화 신호로 항생제를 화학적으로 변형시킴으로써 향상될 수 있다. 예를 들면, 지방산 표적화 신호는 항생제와 접합될 수 있고 본 접근법 하에서 개선된 효능을 가진 화합물을 생성할 수 있다. 치료제는 친유성 양이온, 예컨대, TPP 모이어티와 접합될 수 있고, 개선된 미토콘드리아 흡수 및 CSC 억제 활성을 가질 수 있다. 예를 들면, 독시사이클린-미리스테이트 접합체의 실시양태는 독시사이클린보다 더 우수한 CSC 억제성 및 더 낮은 독성을 보인다. 지방산과 접합되었고 TPP와도 접합된 다른 테트라사이클린 및 에리쓰로마이신 패밀리 구성원을 사용할 때 유사한 결과가 발견된다. 예증적 예는 이하에 논의되어 있다. 예를 들면, 전체적으로 본원에 각각 참고로 포함된, 2018년 5월 18일에 출원된 국제 특허출원 제PCT/US2018/033466호, 2018년 11월 21일에 출원된 국제 특허출원 제PCT/US2018/062174호 및 2019년 11월 29일에 출원된 국제 특허출원 제PCT/US2018/062956호에 개시된 접근법을 참조한다. 치료제에의 하나 이상의 표적화 신호의 추가는 표적 세포소기관에서 그 치료제의 효능을 유의미하게, 일부 경우 100배 이상까지 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 접근법의 일부 실시양태는 표적화 신호에 의해 화학적으로 변형된 하나 이상의 치료제를 가질 수 있다. 이러한 변형은 본 접근법의 또 다른 유리한 이점인 보다 작은 농도 또는 용량을 가능하게 할 수 있다.
막 표적화 신호의 예는 지방산, 예컨대, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 올레산, 단쇄 지방산(즉, 화학구조에서 5개 이하의 탄소 원자를 가짐), 중쇄 지방산(화학구조에서 6개 내지 12개의 탄소 원자를 가짐), 및 다른 장쇄 지방산(즉, 화학구조에서 13개 내지 21개의 탄소 원자를 가짐)을 포함한다. 이 개시는 이 표적화 신호를 이의 염 또는 에스테르 형태(예를 들면, 미리스트산, 미리스테이트, 테트라데카노에이트)로서 교환 가능하게 지칭할 수 있고, 지방산의 카르보아실은 아미드 결합에 의해 치료제에 부착될 수 있음을 인식해야 한다. 예를 들면, 미리스토일화된 단백질을 형성하는, 당분야에서 공지되어 있는 미리스토일화 방법을 이용하여 본 접근법에 따른 치료제를 형성할 수 있다. 미토콘드리아 표적화 신호의 예는 친유성 양이온, 예컨대, 트리페닐-포스포늄(TPP), TPP 유도체, 구아니디늄, 구아니디늄 유도체 및 10-N-노닐 아크리딘 오랜지를 포함한다. 탄소 스페이서 아암 및/또는 연결 기를 사용하여 미토콘드리아 표적화 신호를 치료제에 부착시킬 수 있다. 이 예들은 총망라한 것이 아님을 인식해야 한다.
본 개시는 하나 이상의 약학적 조성물의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물은 노화, 노화 관련 부작용, 암, 암 세포의 약물 내성, 암 세포의 화학요법 내성, 종양 재발, 전이 및 방사선요법 내성 중 하나 이상을 치료하고/하거나 예방하기 위한 것일 수 있다. 구체적으로, 본 접근법은 노쇠의 시작을 지연시키는 데 사용될 수 있다. 본 접근법의 실시양태는 노쇠의 치료, 노쇠의 예방 및/또는 노쇠 시작의 지연 중 하나 이상을 위한 약학적 조성물의 제조를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태는 항바이러스 활성, 항세균 활성, 항균 활성, 광감작 활성 및 방사선감작 활성 중 하나 이상을 가질 수 있다. 일부 실시양태는 암 세포를 화학치료제에 감작시킬 수 있고/있거나, 암 세포를 천연 물질에 감작시킬 수 있고/있거나, 암 세포를 칼로리 제한에 감작시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 약학적 유효량의 하나 이상의 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 제3 작용제는 반응성 산소 종의 생성 및/또는 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 화학치료제 또는 방사선요법으로 대체될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 예를 들면, 미토콘드리아 억제제를 화학요법 또는 방사선 치료와 함께 사용하여, 미토콘드리아 생물발생을 억제하고 CSC 증식을 방해하는 그의 능력을 통해 종양 재발, 전이 및 치료 실패의 발생을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들면, 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제1 항생제와 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제2 항생제의 조합물을 전통적인 화학요법과 함께 투여하여, 재발 및/또는 전이를 감소시킬 수 있거나 예방할 수 있다. 방법은 다수의 노화 효과들 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 노화 관련 부작용을 감소시키고/시키거나 제거하는 것을 포함한다. 추가로, 본 접근법은 노화 및 노화 관련 부작용의 시작을 지연시키는 방법에 사용될 수 있다.
도 1a 내지 1c는 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 다양한 농도 및 조합물에 대한 맘모스피어(mammosphere) 형성 데이터를 요약한다.
도 2a 내지 2d는 1 μM의 농도에서 독시사이클린, 아지쓰로마이신, 및 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물로 전처리된 MCF7 세포에 대한 대사 프로파일 데이터를 요약한다.
도 3a 내지 3d는 1 μM의 농도에서 독시사이클린, 아지쓰로마이신, 및 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물로 전처리된 MCF7 세포에 대한 세포외 산성화율(ECAR), 해당작용, 해당작용성 비축, 및 해당작용성 비축 용량 데이터를 요약한다.
도 4a는 1 μM 독시사이클린과 1 μM 아지쓰로마이신의 조합물에 대한 ECAR 데이터를 대조군과 비교하고, 도 4b는 상기 조합물의 OCR 및 ECAR 비를 대조군과 비교한다.
도 5는 독시사이클린, 아지쓰로마이신, 및 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물로 처리된 정상 세포에 대한 독성 데이터를 요약한다.
도 6은 본 접근법의 한 실시양태에 따른 동시적 치료 후 맘모스피어 형성을 요약한다.
도 7a 및 7b는 본 접근법의 실시양태에 의한 산화성 미토콘드리아 대사(도 7a) 및 해당작용성 기능(도 7b)의 억제를 보여주는 Seahorse 프로파일이다.
도 8a 내지 8f는 본 접근법의 한 실시양태에 따라 전처리된 MCF7 세포에 대한 대사 프로파일 데이터를 보여준다.
도 9a 및 9b는 대조군에 비해, 250 μM 비타민 C만으로 처리된 MCF7 세포에 대한 Seahorse 프로파일(각각 OCR 및 ECAR 데이터)을 요약한다.
도 10a 내지 10f는 3일 동안 250 μM 비타민 C로 전처리된 MCF7 세포에 대한 대사 프로파일 데이터를 보여준다.
도 11a 및 11b는 저용량 비타민 C 및 본 접근법의 한 실시양태에 따른 치료제들의 삼중 조합물에 대한 Seahorse 프로파일(각각 OCR 및 ECAR 데이터)을 보여준다.
도 12a 내지 12f는 저용량 비타민 C를 본 접근법에 따른 삼중 조합물의 실시양태와 비교하는 대사 프로파일 데이터를 나란히 보여준다.
도 13은 본 접근법의 한 실시양태에 따른 치료 기작을 예시한다.
도 14는 독시사이클린 및 독시사이클린-지방산 접합체에 대해, MCF7 세포에 대한 맘모스피어 어세이로부터의 결과를 비교하는 막대 그래프이다.
도 15는 독시사이클린 및 독시사이클린-지방산 접합체에 대해 다양한 농도에 걸쳐 맘모스피어 어세이 결과를 보여주는 선 그래프이다.
도 16a 내지 16c는 치료제와 표적화 신호의 접합체의 세포 보유를 비접합된 치료제와 비교하는 영상이다.
도 17a 및 17b는 각각 MCF7 및 BJ 세포에서 치료제와 표적화 신호의 접합체에 대한 세포 생존율 데이터를 비접합된 치료제와 비교한다.
도 18은 본 접근법의 한 실시양태에 따른 항노화 키트를 예시한다.
도 19는 다양한 농도에서 BrdU 전처리 단독을, 아지쓰로마이신-지방산 접합체를 사용하는 BrdU 전처리와 비교하는, MRC-5 세포주에 대한 xCELLigence 실시간 세포 건강 모니터링으로부터의 최종 세포 지수 결과 및 대표적인 세포 추적을 보여준다.
하기 설명은 본 접근법의 실시를 가능하게 할 정도로 충분히 상세하게 본 접근법의 실시양태를 예시한다. 본 접근법이 이 특정 실시양태를 참고함으로써 기재되어 있지만, 본 접근법이 상이한 형태로 구현될 수 있고 이 설명이 임의의 첨부된 청구범위를 본원에 기재된 특정 실시양태로 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 됨을 인식해야 한다. 오히려, 이 실시양태는 본 개시가 철저하고 완전하며 당분야에서 숙련된 자에게 본 접근법의 범위를 완전히 전달하기 위해 제공된다.
이 설명은 당분야에서 통상의 기술 수준을 가진 자에 의해 이해될 다양한 용어들을 사용한다. 의심을 피하기 위해 다음과 같이 명확히 정의한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 유도체는 기준 화학적 모이어티로부터 유도되거나 합성된 화학적 모이어티이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 접합체는 2개 이상의 화학적 화합물들의 연결에 의해 형성된 화합물이다. 예를 들면, 독시사이클린과 지방산의 접합체는 독시사이클린 모이어티 및 지방산으로부터 유도된 모이어티를 가진 화합물을 생성한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 지방산은 포화된 또는 불포화된, 지방족 쇄를 가진 카르복실산이다. 지방산의 예는 단쇄 지방산(즉, 화학구조에서 5개 이하의 탄소 원자를 가짐), 중쇄 지방산(화학구조에서 6개 내지 12개의 탄소 원자를 가짐), 및 다른 장쇄 지방산(즉, 화학구조에서 13개 내지 21개의 탄소 원자를 가짐)을 포함한다. 포화된 지방산의 예는 라우르산(CH3(CH2)10COOH), 팔미트산(CH3(CH2)14COOH), 스테아르산(CH3(CH2)16COOH) 및 미리스트산(CH3(CH2)12COOH)을 포함한다. 올레산(CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH)은 천연 생성 불포화된 지방산의 일례이다. 지방산의 염 또는 에스테르뿐만 아니라 이의 지방 아미드 모이어티도 언급될 수 있다. 예를 들면, 미리스트산은 미리스테이트로서 지칭될 수 있고, 올레산은 올레에이트로서 지칭될 수 있다. 지방산 모이어티는 지방산의 카르보아실, 즉 카르복실산의 하이드록사이드 기의 상실에 의해 형성된 기일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 모이어티는 아미드 결합을 통해 치료제에 결합될 수 있다. 일례로서, 미리스트산 접합체는 지방산 모이어티 CH3(CH2)12CO-NH-를 가질 수 있고, 이때 삼차 질소는 치료제에 결합되고:
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, n은 1 내지 20의 정수이고 바람직하게는 10 내지 20이다. 이것은 미리스테이트 모이어티가 미리스토일화를 통해 접합되어, 테트라데칸아미드(또는 미리스트아미드) 기를 생성할 때 일어날 수 있다.
다수의 화학적 스페이서 아암들 및 연결 기는 화학분야에서 공지되어 있고 입수될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "스페이서 아암"은 치료제를 연결 기 및 표적화 신호 모이어티 중 하나에 연결하는 선형, 분지된 및/또는 환형 모이어티를 지칭한다. 당분야에서 공지되어 있는 다수의 스페이서 아암들이 존재하고, 달리 특정되어 있지 않은 한, 이 개시에서 상기 용어의 사용은 바람직하게는 유연하다. 스페이서 아암은 치환된 또는 비치환된 C1-C20 알킬 및 알케닐을 포함할 수 있다. 예증적 스페이서 아암은 -(CH2)m-, -(CH2)m-O-(CH2)m-, -(CH2)m-(NRaRb)-(CH2)m-, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 모이어티를 포함한다. 소정의 스페이서 아암에서 Ra 및 Rb는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴 또는 이들의 조합물일 수 있거나; 질소 보호기일 수 있다. 일부 실시양태에서, Ra 및 Rb 중 적어도 하나는 부재할 수 있다. 일부 버전에서, 스페이서 아암은 (-(CH2)2-O)m-(CH2)2-와 같은 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 소정의 스페이서 아암에서 아래첨자 'm'은 1 내지 20의 양의 정수이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "연결 기"는 치료제, 스페이서 아암 및 표적화 신호 모이어티를 포함하는 또 다른 모이어티 상의 작용기와 공유반응할 수 있는(또는 공유반응하는) 작용기를 포함하는 모이어티를 지칭한다. 예시적 연결 기는 치환된 또는 비치환된 C1-C4 알켄, -O-, -NRc-, -OC(O)-, -S-, -S(O)2-, -S(O)-, -C(O)NRc- 및 -S(0)2NRc-를 포함하고, 이때 c는 1 내지 3의 정수이다.
용어 "항노화"는 광범위하게 지칭하기 위한 것이고, 노쇠 세포를 억제하고/하거나 사멸시키는 것, 노쇠 세포의 발생을 지연시키는 것, 노쇠 관련 분비 표현형의 획득을 방해하는 것, 조직 복구 및 재생을 용이하게 하는 것, 유기체의 수명 및 건강수명 중 적어도 하나를 증가시키는 것, 및 노화 관련 질병 및 효과의 발생을 지연시키는 것을 포함한다. 물론, 노화는 다수의 원하지 않는 효과를 야기한다. 본 접근법은 탈모, 청력 손실, 시력 손실, 기억력 손실, 정신적 둔화, 관절 경직, 근육 손실, 힘 손실, 속도 손실, 균형 손실, 지구력 손실, 민첩성 손실, 성기능장애, 정력 손실, 테스토스테론 감소, 리포퓨신 침착 및 염증 중 하나 이상을 감소시킬 수 있다. 본 접근법은 모발 재생, 청력, 시력, 기억력, 정신적 명민함, 관절 이동성, 근육 성장, 근력, 근지구력, 속도, 균형, 민첩성 및 성기능 중 하나 이상을 개선할 수 있고/있거나 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 본 접근법은 모발 성장 및 천연 모발 색상을 회복시키고, 근육 조정력 및 보행을 회복시키고, 전반적인 이동성을 회복시키고, 근육량을 증가시키고, 악력을 증가시키고, 집중력 및 정신적 명석함을 증가시키고, 학습 및 기억력을 증가시키고, 노화 부작용으로 고통받을 포유류에서 전반적인 행복감 및 긍정적인 에너지를 야기하는 잠재력을 가진다. 본 접근법의 실시양태는 백발, 전반적인 노쇠함, 건망증 및 전신 동통 및 통증의 감소를 나타낸다.
미토콘드리아는 암부터 세균 및 진균 감염 및 노화에 이르기까지 다수의 질병들을 치료하는 미개척된 관문이다. 기능적 미토콘드리아는 노화와 관련된 세포, 예컨대, 노쇠 세포, 축적된 DNA 손상 및/또는 산화성 손상을 가진 세포, 및 암 줄기 세포의 증식을 위해 요구된다. 이 세포들에서 미토콘드리아 생물발생 및 대사의 억제는 이 세포들의 증식을 방해하고, 축적된 DNA 및 산화성 손상을 감소시킨다. 따라서, 미토콘드리아 억제제는 신규 부류의 항노화 및 항암 치료제를 대표한다.
본 발명자들은 광범위한 암 유형들에 걸쳐 표적화될 수 있는 CSC의 표현형적 성질을 분석하였고, CSC의 클론 증폭 및 생존을 위해 CSC가 미토콘드리아 생물발생에 엄격히 의존한다는 것을 확인하였다. 세포 대사를 공격하는 이 전략은 본 접근법 하에서 노쇠 세포를 표적화하는 데 사용될 수도 있다. 본 발명자들에 의한 종래 연구는 FDA에 의해 승인된 상이한 부류의 항생제들, 특히 테트라사이클린, 예컨대, 독시사이클린, 및 에리쓰로마이신이 미토콘드리아 생물발생을 억제하는 오프-표적 효과를 가짐을 입증하였다. 결과적으로, 이러한 화합물은 CSC 및 노쇠 세포를 제거하는 효능을 가진다. 그러나, 이 일반적인 항생제들은 미토콘드리아를 표적화하도록 디자인되지 않았으므로, 그들의 항암 효능을 개선할 상당한 여지가 남았다. 유사하게, 현대 의학은 이 오프-표적 효과를 바람직하지 않은 효과로서 간주하였다. 본 접근법 하에서, 고유의 항-미토콘드리아 성질을 가진 기존 항생제를 하나 이상의 산화촉진제와 함께 사용하여, 미토콘드리아 산화성 스트레스 하에서 CSC 및 노쇠 세포에서 미토콘드리아 생물발생 및 대사를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 치료제를 막 표적화 신호 또는 미토콘드리아 표적화 신호로 화학적으로 변형시켜, CSC 또는 노쇠 세포 미토콘드리아에서 치료제의 흡수를 더 증가시킬 수 있다. 미토콘드리아 표적화 신호는 이 표적화된 흡수를 유의미하게 증가시킬 수 있고, 그 이상은 아니더라도 종종 100배까지 증가시킬 수 있다.
독시사이클린은 2 내지 10 μM의 IC50으로 CSC 증식을 억제함으로써 암 성장에 영향을 미친다. 유방암에 대한 항생제(ABC) 시험은 피사 대학 병원에서 수행되었다. ABC 시험은 초기 유방암 환자에서 독시사이클린의 항-증식 및 항-CSC 대사 작용을 평가하는 것을 목적으로 삼았다. ABC 시험의 일차 종점은, 수술적 절제 시 기준(치료 전)부터 치료 후까지 종양 Ki67의 감소에 의해 측정되었을 때, I 내지 III 기 초기 유방암 환자들의 경구 독시사이클린을 사용한 단기간(예를 들면, 2주) 수술 전 치료가 종양 증식 마커의 억제를 야기하였는 지를 확인하는 것이었다. 이차 종점은 상기 유방암 환자들에서 독시사이클린을 사용한 수술 전 치료가 CSC 증식의 억제 및 미토콘드리아 마커의 감소를 야기하였는 지를 확인하는 데 사용되었다.
ABC 시험의 파일럿 연구는 독시사이클린 치료가 유방암 종양 샘플에서 CSC 마커의 발현을 성공적으로 감소시킴을 확인하였다. 독시사이클린 후 종양 샘플은 독시사이클린 전 종양 샘플과 비교될 때 줄기세포능(stemness) 마커 CD44의 통계적으로 유의미한 40% 감소를 나타내었다. 독시사이클린으로 치료받은 9명의 환자들 중 8명의 환자들에서 CD44 수준은 17.65% 내지 66.67% 감소되었다. 대조적으로, 1명의 환자만이 CD44의 15% 상승을 보였다. 이것은 90% 양성 반응률을 나타낸다. 특히 HER2(+) 환자에서 줄기세포능의 또 다른 마커인 ALDH1을 사용하였을 때에도 유사한 결과가 수득되었다. 대조적으로, 2개의 군들 사이에 미토콘드리아, 증식, 아폽토시스 및 네오혈관신생의 마커는 모두 유사하였다. 이 결과는 독시사이클린이 유방암 환자의 생체내에서 CSC를 선택적으로 제거할 수 있음을 암시한다.
본 접근법은 CSC 및 노쇠 세포에서 큰 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 제2 항-미토콘드리아 생물발생 치료제 및 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 산화촉진제로 독시사이클린의 영향을 증폭시킴으로써 ABC 시험을 확장한다. 본 접근법의 실시양태는 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 적어도 하나의 항생제, 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 적어도 하나의 항생제 및 적어도 하나의 산화촉진제를 가진 삼중 조합 요법을 통해 미토콘드리아 생물발생을 억제하는 항생제, 예컨대, 독시사이클린의 CSC 증식 억제 효과를 유의미하게 향상시킨다. 이하에 논의된 예증적 실시양태에서, 치료제는 아지쓰로마이신, 독시사이클린 및 비타민 C를 포함한다. 다른 미토콘드리아 생물발생 억제제 및 미토콘드리아 산화성 스트레스의 공급원이 사용될 수 있음을 인식해야 한다.
하기 단락은 본 접근법의 선택된 실시양태에 대한 실험실 데이터 및 분석을 논의한다. 독시사이클린 및 아지쓰로마이신을 저농도에서 단독으로 시험하고 조합물 형태로도 시험하여, 맘모스피어 형성에 대한 생성된 억제 효과를 평가하였다. 도 1a 내지 1c는 다양한 농도 및 조합물에 대한 맘모스피어 형성 데이터를 요약한다. 구체적으로, 도 1a는 0.1 μM 내지 100 μM의 농도에서 아지쓰로마이신에 대한 맘모스피어 형성 어세이 결과를 보여준다. 도 1b는 필적할만한 농도의 아지쓰로마이신("azi") 및 독시사이클린("dox")에 대한 맘모스피어 형성 어세이 결과를 비교한다. 도 1c는 맘모스피어 형성 어세이에서 아지쓰로마이신과 독시사이클린의 조합된 효과를 보여준다. 확인할 수 있는 바와 같이, 저농도(0.1 μM 및 1 μM)의 독시사이클린 및 아지쓰로마이신 단독은 맘모스피어 형성의 억제에 대한 효과를 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. 그러나, 도 1c는 1 μM 독시사이클린과 1 μM 아지쓰로마이신의 조합물이 맘모스피어 형성에 대한 매우 유의미한 억제 효과를 발휘하였음을 보여준다.
독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물은 이 약물들이 단독으로 사용될 때에 비해 맘모스피어 형성의 억제에 있어서 현저히 증가된 효능을 가진다. 예를 들면, 상기 조합물에 대한 IC50은 아지쓰로마이신 단독에 대한 IC50보다 약 50배 더 낮고 독시사이클린 단독에 대한 IC50보다 2배 내지 5배 더 낮다. 이 결과는 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물이 단독으로 사용된 어느 한 치료제보다 더 높은 치료 효능을 가짐을 입증한다.
맘모스피어 형성에 대한 상기 조합물의 억제 효과는 미토콘드리아 기능과 관련된다. 3일 동안 1 μM 독시사이클린과 1 μM 아지쓰로마이신의 조합물, 또는 이 약물들 단독으로 전처리된 MCF7 세포 단일층의 대사 프로파일을 조사하여, 이 관계를 확인하였다. 도 2a 내지 2d는 1 μM의 농도에서 독시사이클린, 아지쓰로마이신, 및 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물로 전처리된 MCF7 세포에 대한 대사 프로파일 데이터를 요약한다. 도 2a는 시간에 따른 산소 소비율을 보여주고, 도 2b 내지 2d는 각각 기초 호흡, 최대 호흡 및 ATP 생성을 보여준다. 흥미롭게도, 산화성 미토콘드리아 대사 및 해당작용 둘 다의 속도는 Seahorse XFe96 분석기를 이용하여 평가하였을 때 조합물 전처리에 의해 유의미하게 감소되었다. 이것은 호흡(기초 및 최대)의 유의미한 감소를 야기하였을뿐만 아니라 ATP 수준도 감소시켰다. 도 3a 내지 3d는 1 μM의 농도에서 독시사이클린, 아지쓰로마이신, 및 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물로 전처리된 MCF7 세포에 대한 각각 세포외 산성화율(ECAR), 해당작용, 해당작용성 비축 및 해당작용성 비축 용량 데이터를 요약한다. 해당작용 및 해당작용성 비축 둘 다가 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물에 의해 감소되었다. 이 감소는 미토콘드리아 생물발생 억제제를 사용한 치료의 급성 효과인 것으로 이해된다. 시간의 경과에 따라, 생존 CSC 또는 노쇠 세포 집단은 해당작용성 대사 프로파일을 가질 것으로 예상될 것이다. 도 4a는 상기 조합물의 ECAR을 대조군과 비교하고, 도 4b는 상기 조합물의 OCR 및 ECAR 비를 대조군과 비교한다. 도 4a 및 4b의 데이터는 MCF7 암 세포가 조합물 치료 후 고활동성 프로파일로부터 대사적 무활동성 상태로 전환하였음을 보여준다.
독성과 관련하여, 본 접근법의 실시양태는 건강한 정상 세포에 대한 독성을 나타내지 않는다. 도 5는 1 μM의 독시사이클린, 1 μM의 아지쓰로마이신, 및 1 μM의 독시사이클린과 1 μM의 아지쓰로마이신의 조합물로 처리된 샘플에서 고정 독립적 생장 조건 하에서 남아있는 생존 세포의 퍼센트의 형태로 예증적 독성 데이터를 요약한다. 48시간 동안 독시사이클린 단독, 아지쓰로마이신 단독, 또는 상기 조합물로 단일층을 처리한 후, CSC 집단을 저부착 플레이트 상에 시딩함으로써 농후화하였다. 이 조건 하에서, 비-CSC 집단은 아노이키스(anoikis)(세포-기질 부착의 결여에 의해 유도된 아폽토시스의 한 형태)를 겪고 CSC는 생존하는 것으로 생각된다. 그 다음, FACS 분석으로 생존 CSC 분율을 측정하였다. 요약하건대, 1 X 104개의 MCF7 단일층 세포를 6웰 플레이트에서 48시간 동안 항생제 또는 비히클 단독으로 처리하였다. 이어서, 세포를 트립신처리하고 맘모스피어 배지에서 저부착 플레이트 내에 시딩하였다. 12시간 후, MCF7 세포를 회전시켜 침전시켰다. 세포를 2회 린싱하고 10분 동안 생존/사멸 염료(고정 가능한 사멸 바이올렛 반응성 염료; 인비트로겐(Invitrogen))와 함께 인큐베이션하였다. 그 다음, 샘플을 FACS(Fortessa, 비디 바이오사이언스(BD Bioscence))로 분석하였다. 그 후, 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 생존/사멸 염료 염색 어세이를 이용하여 생존 집단을 확인하였다. FlowJo 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다. 도 5는 시험된 치료제에 대한 최소 세포 사멸을 보여준다. 확인할 수 있는 바와 같이, 1 μM 독시사이클린과 1 μM 아지쓰로마이신의 조합물은 고정 독립적 생장 조건 하에서 독성을 나타내지 않는다. 종합하건대, 실험 결과는 특히 저용량에서 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물이 CSC 박멸에 있어서 독시사이클린 단독보다 더 효과적임을 보여준다.
본원에 기재된 화합물은 노쇠 MRC-5 세포에서 강력한 세놀라이틱 작용을 나타내었다. BrdU로서도 공지되어 있는 브로모데옥시우리딘(5-브로모-2'-데옥시우리딘)을 사용하여 노쇠를 유도하였다. BrdU는 증식 세포를 확인하는 데 통상적으로 사용되는 뉴클레오사이드 타이미딘의 유사체이다. BrdU는 조절된 DNA 손상을 유도하고, 고효율로 세포의 노쇠를 유도한다. 본 접근법의 BrdU 어세이는 조절된 DNA 손상 및 노쇠를 유도하기 위해 100 μM의 BrdU의 존재 하에서 정상 섬유모세포를 장기간(8일) 배양한다. 예증적 실시양태에서, 본 발명자들은 BrdU 기반 어세이에서 2종의 독립적 정상 비-불멸화된 인간 섬유모세포주인 MRC-5 폐 세포(스크리닝을 위해) 및 BJ 피부 세포(검증을 위해)를 사용하였다. 이어서, 세놀라이틱 활성을 가진 약물을 확인하기 위해 정상 섬유모세포 및 노쇠 섬유모세포의 동질유전자형 일치 배양물을 약물 스크리닝에 사용할 수 있다. 당분야에서 SRB 어세이로서도 공지되어 있는 설포로다민 B 어세이를 이용하여 세놀라이틱 활성을 검출할 수 있다. 이 어세이는 조직 배양 접시에 부착된 상태로 남아있는 단백질의 양을 측정하고, 세포 생존율에 대한 대용 마커이다. 이 접근법은 임상적으로 승인된 약물, 예를 들면, 항생제를 비롯한 화합물을 신속히 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 실시양태에서, 본 접근법을 사용하여, 다른 화합물들 및 접합체들 중에서 아지쓰로마이신 및 록시쓰로마이신을 비롯한 에리쓰로마이신 패밀리 구성원을 스크리닝하였다. 본 접근법은 다른 화합물을 스크리닝하는 데 사용될 수 있음을 인식해야 한다.
도 19는 미리스테이트와 접합된 다양한 농도의 아지쓰로마이신에 대한 xCELLigence 어세이로부터의 대표적인 데이터를 보여준다. 도 19의 데이터는 5일 후 최종 세포 지수를 강조하고, 노쇠 세포(BrdU로 처리된 MRC-5 섬유모세포)가 접합체에 의해 효과적으로 사멸되었음을 보여준다. 확인할 수 있는 바와 같이, 아지쓰로마이신-지방산 접합체는 심지어 25 μM만큼 낮은 농도에서도 거의 100%의 노쇠 MRC-5 세포를 표적화하였다.
상기 조합물에의 산화촉진제의 도입은 훨씬 더 강한 항암 및 항노화 효과를 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물 및 본원에 기재된 접합된 화합물에 제공한다. 그러나, 본 접근법은 아지쓰로마이신, 독시사이클린 및 비타민 C의 사용으로 제한되지 않는다. 다양한 실험 결과들은 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제1 항생제, 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제2 항생제 및 산화촉진제의 삼중 조합물이 강력한 항암성 및 항노화성을 가짐을 확인시켜준다. 3개의 치료제들의 조합물은 항암 활성 면에서 이들 중 임의의 치료제를 개별적으로 또는 쌍으로 사용할 때보다 유의미하게 더 효과적이다. 예증적 예에서, 독시사이클린, 아지쓰로마이신 및 비타민 C의 조합물을 가진 실시양태는 CSC 및 노쇠 세포 증식을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다. 도 6a는 1 μM 독시사이클린, 1 μM 아지쓰로마이신 및 250 μM 비타민 C를 가진 조성물로 동시에 처리한 후 MCF7 세포에서의 맘모스피어 형성을 요약한다. 도 6b는 한 데이터 세트에서 5 μM 독시사이클린, 5 μM 아지쓰로마이신 및 250 μM 비타민 C를 가진 제1 조성물, 및 또 다른 데이터 세트에서 10 μM 독시사이클린, 10 μM 아지쓰로마이신 및 250 μM 비타민 C를 가진 제2 조성물로 동시에 처리한 후 MDA-MB-468 세포(삼중 음성 인간 유방암 세포주)에서의 맘모스피어 형성을 비교한다. 데이터는 본 접근법의 삼중 조합물 실시양태가 대조군에 비해 CSC 증식을 약 90%만큼 많이 억제하였음을 입증한다. 따라서, 3D 종양-구체 형성 능력의 거의 완전한 제거를 매우 낮은 치료제 농도에서 달성하였는데, 이것은 CSC가 본 접근법의 실시양태에 취약함을 입증한다. 본원에 기재된 치료제 농도가 예증적이고 치료제의 다른 농도가 약학적으로 효과적일 수 있음을 인식해야 한다. 유리하게는, 본 접근법의 실시양태는 항생제의 항균 농도 미만의 농도에서 조차도 효과적인 상태로 유지된다.
추가 데이터는 CSC 미토콘드리아 기능에 대한, 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제1 항생제, 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제2 항생제 및 산화촉진제의 삼중 조합물의 억제 효과를 확인시켜준다. 도 7a 및 7b, 및 도 8a 내지 8f는 3일 동안 1 μM 독시사이클린, 1 μM 아지쓰로마이신 및 250 μM 비타민 C의 조합물로 전처리된 MCF7 세포 단일층에 대한 각각 시간에 따른 산소 소비율, 기초 호흡, 최대 호흡, ATP 생성 및 여분의 호흡 용량을 포함하는 대사 프로파일을 보여준다. 도 7a 및 7b는 본 접근법의 한 실시양태에 의한 산화성 미토콘드리아 대사(도 7a) 및 해당작용성 기능(도 7b)의 억제를 보여주는 Seahorse 프로파일이다. 확인할 수 있는 바와 같이, 삼중 조합물은 산화성 미토콘드리아 대사(OCR에 의해 측정됨)를 억제하였고 해당작용성 기능(ECAR에 의해 측정됨)을 유도하였다. 도 8a 내지 8f는 1 μM 및 250 μM 비타민 C의 농도에서 독시사이클린, 아지쓰로마이신, 및 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물로 전처리된 MCF7 세포에 대한 대사 데이터를 요약한다. 산화성 미토콘드리아 대사 및 해당작용 둘 다의 속도는 Seahorse XFe96 분석기를 이용하여 평가하였을 때 조합물 전처리에 의해 유의미하게 감소되었다. 특히, Seahorse XFe96 분석기를 이용하여 평가하였을 때, 산화성 미토콘드리아 대사의 속도는 50% 이상 감소되었고, ATP 수준은 현저히 감소되었다. 종합하건대, 이것은 기초 호흡 및 최대 호흡 둘 다의 유의미한 감소를 야기하였다. 대조적으로, 시험된 삼중 조합물 실시양태로 전처리된 세포 단일층에서 해당작용은 증가되었으나, 해당작용성 비축은 감소되었다.
산화촉진제의 포함은 본 접근법의 실시양태에 대한 예상되지 않았으나 귀중한 효과를 나타낸다. 도 9a 및 9b는 대조군에 비해, 250 μM 비타민 C만으로 처리된 MCF7 세포에 대한 OCR 및 ECAR 데이터를 요약한다. 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 250 μM 비타민 C(단독)를 사용한 처리는 MCF7 암 세포에서 미토콘드리아 대사 및 해당작용 둘 다를 유의미하게 증가시켰다. 도 10a 내지 10f는 3일 동안 250 μM 비타민 C로 전처리된 MCF7 세포에 대한 대사 프로파일 데이터를 보여준다. 250 μM 비타민 C를 사용한 처리는 기초 호흡, ATP 생성 및 최대 호흡을 유의미하게 증가시켰다. 250 μM 비타민 C를 사용한 처리는 해당작용성 비축 용량을 감소시키면서 해당작용 및 해당작용성 비축을 유의미하게 증가시켰다. 이 관찰결과는 비타민 C 단독이 약한 산화촉진제로서 작용하고 치료제가 미토콘드리아 산화성 스트레스를 통해 암 세포에서 미토콘드리아 생물발생을 자극하여, 미토콘드리아 대사의 증가(예를 들면, 미토콘드리아 단백질 합성 및 ATP 생성의 증가)를 유도함을 시사한다. 핵 미토콘드리아 단백질 및 mt-DNA 코딩된 단백질 생성은 상기 세포에서 증가된다. 이 해석은 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 하나 이상의 항생제, 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 하나 이상의 항생제 및 산화촉진제를 가진 실시양태가 암 세포를 효과적으로 제거함을 직접 보여주는 실험 데이터와 일치한다. 특히, 미토콘드리아 생물발생 억제제는 비타민 C에 의해 유도된 증가된 미토콘드리아 대사를 방해한다. 상기 조합물은 미토콘드리아 DNA(mt-DNA)에 의해 코딩된 단백질의 합성을 억제하여, CSC에서 OXPHOS에 필수적인 필수 단백질 성분의 고갈을 유발한다. 이 단백질들이 없는 경우, CSC 및 노쇠 세포는 비정상적인 미토콘드리아 생물발생 및 심각한 ATP 고갈을 겪는다.
도 11a 및 11b는 저용량 비타민 C 및 본 접근법의 한 실시양태에 따른 삼중 조합물에 대한 Seahorse 프로파일(각각 OCR 및 ECAR 데이터)을 보여준다. 이처럼 나란히 대사를 비교하는 것은 저용량 비타민 C가 산화성 미토콘드리아 대사를 증가시킨 반면, 삼중 조합물이 심각한 ATP 고갈을 야기하였음을 보여준다. 저용량 비타민 C(예를 들면, 혈액, 혈청 및 혈장 중 적어도 하나에서 약 500 μM 이하의 피크 비타민 C 농도를 달성하기에 충분함) 및 상기 삼중 조합물 둘 다가 해당작용을 증가시켰다. 도 12a 내지 12f는 도 11a 및 11b에서의 비교에 대한 대사 데이터를 보여준다. 저용량 비타민 C는 기초 호흡, ATP 생성 및 최대 호흡을 증가시킨 반면, 상기 삼중 조합물은 3개의 이 파라미터들 모두를 감소시켰다. 또한, 저용량 비타민 C 및 삼중 조합물 둘 다가 해당작용성 비축 용량을 감소시키면서 해당작용을 증가시켰다. 이 결과는 비타민 C와 함께 2개의 미토콘드리아 생물발생 억제제들, 즉 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 억제제 및 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제2 억제제를 포함시키는 것이 비타민 C에 의해 유도된 미토콘드리아 산화성 대사 증가를 차단하고 역전시킨다는 것을 보여준다. 모든 3개의 치료제들의 조합물은 항암 및 항노화 활성을 유의미하게 개선시킨다. 본 접근법의 일부 실시양태에서, (환원제로서 작용할 수 있는 아스코르베이트 유도체를 포함하는) 비타민 C는 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 또 다른 작용제, 예컨대, 특정 화학치료제 및 방사선 치료로 대체될 수 있다.
측정치로서 CSC 증식을 이용하여, 본 접근법의 효능에 대한 전처리의 일시적인 효과를 임상 전 환경에서 평가하였다. 이 평가는 부분적으로, 3D 맘모스피어 줄기 세포 어세이를 시작하기 전에 전처리 어세이를 통해 3개의 치료제들(예를 들면, 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 항생제, 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 항생제 및 이 실시양태에서 비타민 C)의 동시 공-투여의 효능을 고려하였다. 7일의 기간 동안, MCF7 세포를 단일층 배양물로서 생장시키고 비타민 C 단독("Vit C", 250 μM), 또는 독시사이클린과 아지쓰로마이신("D+A", 각각 1 μM)으로 먼저 전처리하였다. 그 다음, MCF7 세포를 트립신으로 채취하였고 비타민 C, 독시사이클린 및 아지쓰로마이신의 다양한 조합물들의 존재 하에서 고정 독립적 생장 조건 하에서 재플레이팅하였다. 하기 표 1은 비타민 C 단독 또는 독시사이클린과 아지쓰로마이신의 조합물(D + A)을 사용한 7일의 전처리가 상기 삼중 조합물의 후속 투여를 유의미하게 덜 효과적으로 만들었음을 보여준다. 기작 면에서, 상기 전처리는 MCF7 세포를 독시사이클린, 아지쓰로마이신 및 비타민 C의 삼중 조합물의 효과에 효과적으로 사전컨디셔닝한 것으로 보인다. 이것은 산화성 스트레스를 유도하여, 항산화제 반응을 유발하는 MCF7 세포의 능력에 기인할 수 있다. 이 임상 결과를 고려할 때, 모든 3개의 치료제들을 동시에 공-투여하는 본 접근법의 실시양태는 CSC 집단에 대한 가장 유의미한 영향을 미치는 듯하고, 바람직하다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 독시사이클린(1 μM), 아지쓰로마이신(1 μM) 및 비타민 C(250 μM)를 동시에 공-투여하는 것은 상기 성분들을 순차적으로 투여하는 것보다 더 효과적일 것이다. 그러나, 일부 실시양태는 여러 날(예를 들면, 일부 실시양태에서 3일 내지 7일, 일부 실시양태에서 4일 내지 14일)에 걸쳐 좁은 시간대, 예컨대, 1시간 내지 3시간 이내에 치료제들을 투여할 것을 요구할 수 있다. 항생제는 경구 형태(예를 들면, 환제 또는 정제)로 투여될 수 있는 반면, 비타민 C는 일부 실시양태에서 정맥내로 투여된다. 다른 경우, 모든 3개의 치료제들은 별개의 환제 또는 탭으로서, 또는 각각의 치료제를 함유하는 단일 혼합물로서 경구 투여될 수 있다.
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이 결과는 CSC 집단에 대한 독시사이클린의 억제 효과가 FDA에 의해 승인된 또 다른 항생제, 즉 아지쓰로마이신 및 식이 보충제인 비타민 C(약한 산화촉진제)와의 조합에 의해 증강될 수 있음을 입증한다. 따라서, 본 접근법은 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 하나 이상의 항생제, 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 하나 이상의 항생제 및 하나 이상의 산화촉진제를 가진 약학적 조성물을 제공한다. 실시양태는 예를 들면, 아지쓰로마이신, 독시사이클린 및 비타민 C를 포함할 수 있다. 본원에 개시되어 있고 암시되어 있는 실시양태에 대한 추가 데이터를 생성하기 위해 향후 임상 시험 및 추가 평가를 계획한다.
항노화에 대한 예시적 실시양태에서, 본 접근법에 따른 치료는 수개월에 걸쳐 처방되었다. 조성물은 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제1 항생제로서의 아지쓰로마이신, 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제2 항생제로서의 독시사이클린, 및 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 산화촉진제로서의 비타민 C를 포함하였다. 5주 기간에 걸쳐, 아지쓰로마이신은 주당 2회 250 mg 투여되었고, 독시사이클린은 일당 2회 100 mg 투여되었고, 비타민 C는 일당 1회 500 mg 투여되었다. 피험자(77세 남성)는 증가된 모발 성장, 정신적 지각 및 명민함, 힘 및 체력, 및 성욕뿐만 아니라 개선된 시력, 청력, 언어능력, 손-눈 조정력 및 균형, 및 전반적인 행복감 및 긍정적인 에너지도 보고하였다. 3개월의 삼중 조합물 치료 후, 수혜자는 임의의 다른 약물치료 또는 식습관, 운동 및 일상생활의 변화 없이, 본 접근법에 따른 치료 후 임상적으로 촉진 가능한 전립선 결절의 사라짐을 보고하였다.
일부 실시양태는 약학적 유효량의 각각의 치료제를 가진 조성물, 예컨대, 약학적 조성물의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물은 노쇠 치료, 노쇠 예방 및/또는 노쇠 시작의 지연 중 하나 이상을 포함하는 항노화 요법을 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 활동성 암 줄기 세포, 순환 종양 세포 및 요법 내성 암 세포를 비롯한 암 줄기 세포의 박멸을 통해 암을 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 암 줄기 세포를 방사선요법, 광요법 및/또는 화학요법에 감작시키기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 종양 재발, 전이, 약물 내성, 방사선요법 내성 및 악액질을 치료하고/하거나 예방하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물의 실시양태는 미토콘드리아 생물발생을 억제하고 큰 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 제1 치료제, 미토콘드리아 생물발생을 억제하고 작은 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 제2 치료제 및 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 제3 치료제를 활성 성분으로서 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 제1 치료제는 아지쓰로마이신이고, 제2 치료제는 독시사이클린이고, 제3 치료제는 비타민 C(또는 아스코르브산 유도체)이다. 제1 치료제 및 제2 치료제 중 적어도 하나의 농도 및 일부 실시양태에서 이들 둘 다의 농도는 항균 농도 미만의 농도일 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 아지쓰로마이신 및 독시사이클린 둘 다의 농도는 항균 농도 미만의 농도이다. 일부 실시양태에서, 제3 치료제는 혈액, 혈청 및 혈장 중 적어도 하나에서 100 μM 내지 250 μM의 피크 비타민 C 농도를 달성하기에 충분한 농도의 비타민 C이다. 예증적 항노화 예에서, 아지쓰로마이신은 주당 2회 250 mg 투여될 수 있고, 독시사이클린은 일당 2회 100 mg 투여될 수 있고, 비타민 C는 일당 1회 500 mg 투여될 수 있다. 투약은 환자 체질량 및 대사에 맞게 조절될 수 있고, 본 접근법으로부터 벗어나지 않으면서 시판되는 용량이 사용될 수 있음을 인식해야 한다.
본 접근법 하에서, 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 하나 이상의 항생제 및 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 하나 이상의 항생제가 사용될 수 있다. 에리쓰로마이신, 아지쓰로마이신, 록시쓰로마이신(roxithromycin), 텔리쓰로마이신(telithromycin) 및 클라리쓰로마이신(clarithromycin)을 포함하는, 에리쓰로마이신(또는 마크롤라이드(macrolide)) 패밀리 내의 항생제는 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제한다. 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 다른 치료제는 마크롤라이드 패밀리의 다른 구성원, 케톨라이드(ketolide) 패밀리의 구성원, 암페니콜(amphenicol) 패밀리의 구성원, 린코사마이드(lincosamide) 패밀리의 구성원, 플류로무틸린(pleuromutilin) 패밀리의 구성원뿐만 아니라 이 화합물들의 유도체도 포함한다. 유도체는 본원에서 논의된 바와 같이 하나 이상의 미토콘드리아 표적화 신호를 포함할 수 있음을 인식해야 한다. 테트라사이클린, 독시사이클린, 티게사이클린(tigecycline), 에라바사이클린(eravacycline) 및 미노사이클린(minocycline)을 포함하는, 테트라사이클린 패밀리 내의 항생제는 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제한다. 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 다른 치료제는 테트라사이클린 패밀리의 다른 구성원, 글리실사이클린(glycylcycline) 패밀리의 구성원, 플루오로사이클린(fluorocycline) 패밀리의 구성원, 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 패밀리의 구성원, 옥사졸리디논(oxazolidinone) 패밀리의 구성원뿐만 아니라, 이 화합물들의 유도체도 포함한다. 유도체는 하나 이상의 막 표적화 신호 및/또는 미토콘드리아 표적화 신호를 포함할 수 있음을 인식해야 한다. 다른 항생제가 사용될 수 있음을 인식해야 하지만, 본 접근법의 바람직한 실시양태는 아지쓰로마이신 및 독시사이클린을 포함한다. 추가로, 일부 실시양태에서, 항생제들 중 하나 이상은 적어도 하나의 막 표적화 신호 및/또는 미토콘드리아 표적화 신호에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 본 접근법의 실시양태는 하나 이상의 산화촉진제를 포함할 수 있다. 산화촉진제는 항산화제 시스템의 억제 및/또는 반응성 산소 종의 생성을 통해 유기체에서 산화성 스트레스를 유도하는 화합물이다. 미토콘드리아 산화성 스트레스는 세포를 손상시킬 수 있고, CSC 및 노쇠 세포에서 미토콘드리아 생물발생으로의 전환을 야기할 수 있다. 일부 비타민은 환원제로서 작용할 때 산화촉진제이다. 예를 들면, 비타민 C는 지질 및 다른 거대분자에의 산화성 손상을 방지하는 강력한 항산화제이나, 다양한 조건에서 산화촉진제로서 작용한다. 예를 들면, 저농도의 비타민 C(예를 들면, 경구 투여용 약학적 조성물에서)는 혈액, 혈청 및 혈장 중 적어도 하나에서 약 500 μM 내지 약 100 μM, 일부 실시양태에서 약 400 μM 내지 약 150 μM, 일부 실시양태에서 약 300 μM 내지 약 200 μM, 일부 실시양태에서 약 250 μM의 피크 비타민 C 농도를 달성하기에 충분한 양 또는 농도로 투여될 수 있고, 금속 이온의 존재 하에서 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도한다. 경구 투여로부터 혈액/혈청/혈장 중의 피크 비타민 C 농도는 약 250 μM인 반면, 정맥내 투여를 통한 피크 농도는 유의미하게 더 높을 수 있을 것으로 이해된다. 따라서, 본 접근법의 또 다른 예로서, 비타민 C가 경구 투여되는 일부 실시양태는 혈액, 혈청 및/또는 혈장 중의 약 100 μM 내지 약 250 μM의 비타민 C 농도를 달성하기에 충분한 비타민 C를 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "약"은 ± 10 μM의 근사치로서 이해되어야 하나, 혈액, 혈청 및/또는 혈장 농도를 측정하는 데 이용되는 방법의 정확도 및 정밀도에 의해 좌우될 수 있다. 일부 실시양태는 혈액, 혈청 및/또는 혈장 중의 100 μM 내지 250 μM의 비타민 C 농도를 달성하기에 충분한 비타민 C를 포함할 수 있다. 비타민 C의 적합한 용량은 본 접근법에서 사용된 다른 성분에 의해 좌우될 수 있으므로, 통상의 기술을 가진 자는 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용하여 소정의 실시양태를 위한 적절한 용량을 평가할 수 있음을 인식해야 한다. 비타민 C 이외에, 다수의 아스코르베이트 유도체들이 특정 조건에서 산화촉진제 작용을 할 수 있다. 예를 들면, 아스코르베이트는 금속 이온을 환원시킬 수 있고 펜톤(fenton) 반응을 통해 유리 라디칼을 생성할 수 있다. 아스코르베이트 라디칼은 일반적으로 매우 안정하나, 특히 철(Fe)을 비롯한 금속 이온의 존재 하에서 더 높은 반응성을 갖게 되어, 아스코르베이트 라디칼로 하여금 훨씬 더 강력한 산화촉진제가 될 수 있게 한다. 미토콘드리아에 특히 철이 풍부하기 때문에, 미토콘드리아는 비타민 C의 산화촉진제 효과의 핵심 표적이 될 수 있었다. 비타민 C는 미토콘드리아 내부에 고도로 농축된다. 예를 들면, U937 세포(인간 백혈병 세포주)가 3 μM 비타민 C를 함유하는 배지에서 단지 15분 동안 인큐베이션되었을 때, 비타민 C는 미토콘드리아로 효율적으로 수송되어, 5 mM의 수준(용량에 비해 대략 1,700배 증가를 표시함)에 도달하였다. 다른 신규 미토콘드리아 수송제들이 제안되었지만, 비타민 C의 미토콘드리아 수송은 SLC23A2로서도 공지되어 있는 나트륨-커플링된 비타민 C 수송제 2(SCVCT2)에 의해 달성된다.
다른 산화촉진제 치료제가 비타민 C와 함께 사용될 수 있거나, 비타민 C의 대체물로서 사용될 수 있다. 많은 현재의 화학치료제들뿐만 아니라 표적화된 방사선도 그들의 산화촉진제 작용을 통해 암 세포를 사멸시키기 때문에, 미토콘드리아 생물발생의 조합된 억제는 통상의 요법의 보조요법(add-on)으로서 사용될 수 있었고 그들의 효능을 개선할 것으로 예상될 것이다. 암 세포에서 산화촉진제로서 작용하여 반응성 산소 종을 생성하는 것으로 공지되어 있는 다른 치료제가 있다. 산화성 스트레스와 관련된 9개 부류의 화학치료제들이 있다: 안쓰라사이클린(anthracycline), 백금/팔라듐 착물, 알킬화제, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 캄포테신(camptothecin), 푸린/피리미딘 유사체, 항-대사물질, 탁산(taxane) 및 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid). 예를 들면, 항암 치료제 아드리아마이신(adriamycin)(및 다른 안쓰라사이클린), 블레오마이신(bleomycin) 및 시스플라틴(cisplatin)은 암 세포에 대한 특이적 독성을 나타내었다. 따라서, 일부 실시양태에서, 작용제는 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 항생제 및 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 항생제와 함께 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 데 사용된다. 산화촉진제 효과를 가진 추가 치료제뿐만 아니라, 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 대안적 작용제를 투여하는 시기도 확인하기 위해 추가 연구를 계획한다. 그러나, 비타민 C는 분명히 더 적은 부작용을 갖고 일반적으로 화학치료제보다 더 우수한 안전성 프로파일을 가진다. 본 접근법을 벗어나지 않으면서 산화촉진제를 사용할 수 있음을 인식해야 한다.
CSC는 고정 독립적 생장을 겪는 그의 능력에 기여하는, 유의미하게 증가된 미토콘드리아 질량을 가진다. 따라서, 표적 세포가 새로운 미토콘드리아를 재합성할 수 없을 것이기 때문에, 비타민 C와 함께 미토콘드리아 생물발생 억제제를 사용하는 것은 궁극적으로 CSC 미토콘드리아가 비타민 C의 산화촉진제 효과로부터 완전히 회복하지 못하게 할 수 있다. 대사적으로 제한된 조건 하에서, 암 세포는 "좌절된" 또는 "불완전한" 미토콘드리아 생물발생을 겪을 것이다. 이 주장은 i) 감소된 미토콘드리아 대사, ii) 증가된 보상적 해당작용성 기능, 및 iii) 심각한 ATP 고갈을 보여주는, 도 11a, 11b 및 12a 내지 12f에 표시된 Seahorse 유동 분석 데이터에 의해 직접 뒷받침된다. 종래 연구는 비타민 C 단독이 저산소증 조건 하에서 래트 심장에서 미토콘드리아 ATP 생성을 1.5배까지 증가시킴을 보여주었다. 추가로, 비타민 C는 미토콘드리아 베타 산화를 위해 요구되는 필수 미세영양분인 내생성 L-카르니틴 생합성의 양성 조절제이다. 따라서, 이 발견은 비타민 C 단독이 실제로 MCF7 세포에서 미토콘드리아 ATP 생성을 2배까지 증가시키기에 충분함을 보여주는 본 결과와 일치한다.
도 13은 본 접근법의 한 실시양태에 따른 치료 기작을 예시한다. 이 과정은 예를 들면, 샘플 또는 유기체에서의 CSC 박멸, 항암 요법, 재발 및 전이의 예방 및/또는 제거, 노쇠의 치료, 및 샘플 또는 유기체에서의 노쇠 세포의 박멸을 위해 이용될 수 있다. 이 과정은 항노화 요법을 위해 이용될 수도 있다. 이 기작 하에서, 비타민 C는 산화촉진제 작용을 촉진하는 조건 하에서 존재한다(S1301). 투여되는 비타민 C의 농도는 상대적으로 저용량으로서 간주될 수 있다. 예를 들면, 100 μM 내지 250 μM의 혈액/혈장/혈청 수준을 달성하기에 충분한 경구 비타민 C는 적절할 수 있다. 미토콘드리아에는 철이 풍부하고, CSC는 높은 미토콘드리아 농도를 가진다. 높은 철 함량으로 인해, 비타민 C는 CSC 또는 노쇠 세포에서 산화촉진제로서 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하여(1303), 반응성 아스코르베이트 라디칼을 생성한다. CSC 및 노쇠 세포는 미토콘드리아 산화성 스트레스에 반응하여 미토콘드리아 생물발생 쪽으로 전환한다(1305). 그러나, 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 항생제 및 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 항생제(1307), 예컨대, 아지쓰로마이신 및 독시사이클린의 존재는 CSC 및 노쇠 세포가 미토콘드리아 산화성 스트레스로부터 회복하기 위해 충분한 미토콘드리아 생물발생을 하지 못하게 한다. 이것은 CSC 또는 노쇠 세포에서 미토콘드리아 파멸을 초래한다(1309). 그 후, CSC 및 노쇠 세포는 ATP 고갈을 겪고(1311), 궁극적으로 (예를 들면, 아폽토시스를 통해) 사멸한다(1313).
본 접근법의 한 실시양태에서 치료제는 하나 이상의 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 제조될 수 있는 통상의 약학적 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 예를 들면, 약학적 조성물은 당분야에서 공지되어 있는 희석제 또는 부형제, 예를 들면, 하나 이상의 충전제, 증량제, 결합제, 습윤화제, 붕해제, 표면활성제, 윤활제 등을 사용함으로써 제조될 수 있다. 치료 목적(들)에 따라 다양한 유형의 투여 유닛 제형이 선택될 수 있다. 약학적 조성물을 위한 제형의 예는 정제, 환제, 산제, 액체, 현탁액, 유화액, 과립제, 캡슐제, 좌약제, 주사 제제(용액 및 현탁액), 국소 크림, 나노입자, 리포좀 제제, 및 당분야에서 공지되어 있을 수 있는 다른 제형을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 치료제는 함께 캡슐화될 수 있다. 추가 예로서, 나노입자 또는 나노담체 형태의 용량, 예컨대, 지방산, 콜레스테롤, 인지질(예를 들면, 포스파티딜-세린, 포스파티딜-콜린), 메소다공성 실리카 및 헬리센-스쿠알렌 나노조립체가 본 접근법 하에서 사용될 수 있다. 약학적 조성물을 정제의 형태로 성형하기 위해, 공지되어 있는 임의의 부형제, 예를 들면, 담체, 예컨대, 락토스, 백당, 염화나트륨, 글루코스, 우레아, 전분, 탄산칼슘, 고령토, 사이클로덱스트린, 결정성 셀룰로스, 규산 등; 결합제, 예컨대, 물, 에탄올, 프로판올, 단미 시럽, 글루코스 용액, 전분 용액, 젤라틴 용액, 카르복시메틸 셀룰로스, 셸락(shelac), 메틸 셀룰로스, 인산칼륨, 폴리비닐피롤리돈 등이 사용될 수 있다. 추가로, 붕해제, 예컨대, 건조된 전분, 알긴산나트륨, 한천 분말, 다시마 분말, 탄산수소나트륨, 탄산칼슘, 폴리옥시에틸렌 소르비탄의 지방산 에스테르, 라우릴황산나트륨, 스테아르산의 모노글리세라이드, 전분, 락토스 등이 사용될 수 있다. 붕해 억제제, 예컨대, 백당, 스테아린, 코코넛 버터, 수소첨가된 오일; 흡수 가속화제, 예컨대, 사차 암모늄 염기, 라우릴황산나트륨 등이 사용될 수 있다. 습윤화제, 예컨대, 글리세린, 전분, 및 당분야에서 공지되어 있는 기타 습윤화제가 사용될 수 있다. 흡착제, 예를 들면, 전분, 락토스, 고령토, 벤토나이트, 콜로이드성 규산 등이 사용될 수 있다. 윤활제, 예컨대, 정제된 활석, 스테아레이트, 붕산 분말, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있다. 정제가 요구되는 경우, 정제를 통상의 코팅 물질로 더 코팅하여, 정제를 당 코팅된 정제, 젤라틴 필름 코팅된 정제, 장코팅으로 코팅된 정제, 필름으로 코팅된 정제, 이중층 정제 및 다층 정제로 만들 수 있다. 국소 투여에 적합한 약학적 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 산제, 용액, 페이스트, 겔, 폼, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로서 제제화될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 보존제, 약물 침투를 보조하는 용매, 보조용매, 연화제, 추진제, 점도 변경제(겔화제), 계면활성제 및 담체를 포함하나 이들로 제한되지 않는 통상의 첨가제를 포함할 수 있다. 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이, 비타민 C 또는 또 다른 아스코르베이트 화합물은 주사기 또는 정맥내 카테터를 통해 정맥 순환계 내로 직접 투여되는 용액을 통해 투여될 수 있음을 인식해야 한다.
본 접근법은 종양 재발, 전이, 약물 내성, 악액질 및/또는 방사선요법 내성을 치료하고/하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 특히 수술 후 종양이 재발하거나 전이하기 때문에, 항암 치료는 종종 실패한다. 또한, 약물 내성 및 방사선요법 내성은 암 치료 실패의 흔한 원인이다. CSC 미토콘드리아 활성은 적어도 부분적으로 치료 실패의 이 원인이 될 수 있다고 생각된다. 본 접근법의 실시양태는 통상의 암 요법이 실패하는 상황에서 사용될 수 있고/있거나, 종양 재발, 전이, 화학요법 내성, 약물 내성 및/또는 방사선요법 내성으로 인한 실패를 방지하기 위해 항암 치료와 함께 사용될 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 접근법의 실시양태는 암 세포에서 약물 내성을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나 역전시키는 데 사용될 수도 있다. 약물 내성은 적어도 부분적으로 암 세포에서의 증가된 미토콘드리아 기능에 근거한 것으로 생각된다. 특히, 내분비 요법, 예컨대, 타목시펜에 대한 내성을 나타내는 암 세포는 증가된 미토콘드리아 기능을 가질 것으로 예상된다. 본 접근법의 실시양태는 미토콘드리아 기능을 억제하므로, 암 세포에서 약물 내성을 감소시키고 일부 경우 역전시키는 데 유용하다. 따라서, 약물 내성이 표시되는 경우, 본 접근법의 실시양태가 투여될 수 있다. 본원에서 논의된 약학적 조성물은 통상의 화학요법 치료 전에, 및/또는 통상의 화학요법 치료와 함께, 및/또는 통상의 화학요법 치료 후에 투여될 수 있다. 추가로, 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 미토콘드리아 기능 억제제는 세균 및 병원성 효모를 표적화할 수도 있고, 노쇠 세포를 표적화할 수도 있고(따라서 항노화 이점을 제공할 수 있음), 방사선감작제 및/또는 광감작제로서 작용할 수도 있고, 덩어리 암 세포 및 암 줄기 세포를 화학요법제, 약제 및/또는 다른 천연 물질, 예컨대, 식이 보충제 및 칼로리 제한에 감작시킬 수도 있다.
상기 논의된 바와 같이, 본 접근법은 항노화 효능도 가진다. 항노화 이점과 관련하여, 노쇠 세포는 신체의 건강한 정상 생태계에 대한 독성을 나타낸다. 본 접근법은 정상 조직 세포를 남겨두면서, 노쇠 세포를 선택적으로 사멸시키고 축적된 산화성 손상 및/또는 손상된 DNA를 가진 세포의 집단을 감소시키는 항노화 치료제 및 세놀라이틱으로서 사용될 수 있다. 노쇠 세포를 선택적으로 사멸시키는 것은 1) 노쇠 섬유모세포를, 종양 진행을 촉진하는 능력을 가진 전구염증 세포로 바꾸는 노쇠 관련 분비 표현형(SASP)의 획득을 방해함으로써 노화 관련 염증을 예방할 수 있고/있거나; 2) 조직 복구 및 재생을 용이하게 할 수 있고/있거나; 3) 유기체의 수명 및 건강수명을 증가시킬 수 있다. 실시양태는 발암성 스트레스의 시작 때문에 발암유전자에 의해 유도된 노쇠를 겪는 노쇠 암 세포를 선택적으로 사멸시키는 데 사용될 수도 있다.
세포 축적된 산화성 손상 및 손상된 DNA의 감소는 건강한 정상 세포가 증식할 수 있게 한다. 결과적으로, 본 접근법은 포유류에서 모발 재생, 청력, 시력, 기억력, 정신적 명민함, 관절 이동성, 근육 성장, 근력, 근지구력, 속도, 균형, 민첩성 및 성기능 중 하나 이상을 개선하고/하거나 증가시키는 데 사용될 수 있다. 이 개선은 더 높은 정도의 연령 관련 부작용을 나타내는 환자 및 노인 환자에서 더 현저할 수 있다. 일례로서, 70세 인간은 50세 인간보다 더 큰 개선 및 증가를 경험할 수 있다. 또 다른 각도에서 보면, 본 접근법은 모발 성장 및 천연 모발 색상을 회복시키고, 근육 조정력 및 보행을 회복시키고, 전반적인 이동성을 회복시키고, 근육량을 증가시키고, 악력을 증가시키고, 집중력 및 정신적 명석함을 증가시키고, 학습 및 기억력을 증가시키고, 노화 부작용으로 고통받을 포유류에서 전반적인 행복감 및 긍정적인 에너지를 야기하는 잠재력을 가진다. 이러한 활력 회복은 적어도 부분적으로 본 접근법에 의해 제공된, 노쇠 세포, CSC, 및 축적된 산화성 손상 및 손상된 DNA를 가진 세포의 선택적 제거의 조합으로부터 일어난다. 건강한 정상 세포가 증식될 수 있기 때문에, 본 접근법의 일부 실시양태는 백발, 전반적인 노쇠함, 건망증, 및 전신 동통 및 통증의 감소를 나타내었다. 본 접근법의 조성물 및 방법의 이점을 더 철저히 이해하고 정량하기 위해 추가 연구 및 시험을 진행하고 있다.
본 접근법의 실시양태는 건강수명 및 수명의 개선에도 영향을 미친다. 아지쓰로마이신은 그 자체가 노쇠 섬유모세포, 예컨대, 근섬유모세포를 표적화하고 제거하는 현저한 세놀라이틱 활성을 가진, FDA에 의해 승인된 약물이다. 이 세놀라이틱 활성은 거의 97%에 근접하는 상당한 효율을 가진다. 예를 들면, 전구염증성 노쇠 세포의 축적은 많은 노화 관련 질환들, 예컨대, 심장 질환, 당뇨병, 치매 및 암의 일차 원인인 것으로 생각된다. 암 관련 섬유모세포(CAF)가 종양 촉진 활성을 가진 노쇠 근섬유모세포이기 때문에, 아지쓰로마이신을 사용한 본 접근법의 삼중 조합물 실시양태는 공격적인 전이성 암, 특히 대사 특징인 "리버스 워버그 효과(Reverse Warburg Effect)"를 가진 암의 해당작용성 종양 기질도 효과적으로 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 노쇠 관련 분비 표현형의 획득을 방해한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 조직 복구 및 재생을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 유기체의 수명 및 건강수명 중 적어도 하나를 증가시킨다.
일부 실시양태는 항노화 키트의 형태를 취할 수 있다. 항노화 키트는 본 접근법에 따른 하나 이상의 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 항노화 키트는 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제1 항생제, 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제2 항생제, 및 산화촉진제 또는 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 작용제를 함유할 수 있다. 항노화 키트는 특정 치료 기간 또는 소정의 시간, 예컨대, 1주 또는 1개월 동안 충분한 용량의 각각의 성분을 함유할 수 있다. 도 18은 한 실시양태에 따른 예시적 항노화 키트(1401)를 보여준다. 이 실시양태에서, 항노화 키트(1801)는 1주의 용량을 포함한다; 2개의 아지쓰로마이신 정제("Azith"), 14개의 독시사이클린 정제("Doxy") 및 7개의 비타민 C 정제("Vit C"). 각각의 성분의 양은 본원에 기재된 바와 같을 수 있다. 항노화 키트(1401)는 각각의 성분이 복용되어야 할 때를 확인시켜주기 위한 시간, 날짜 또는 일 표시알림뿐만 아니라, 적절할 수 있는 다른 알림도 포함할 수 있다. 항노화 키트는 더 짧거나 더 긴 기간, 예컨대, 2주 치료 또는 1개월 치료를 위한 충분한 용량을 포함할 수 있음을 인식해야 한다.
본 접근법은 또한 유리하게는 건강한 정상 세포에 비해 CSC 및 노쇠 세포 표현형을 표적화한다. 표적 암 세포는 노쇠 세포, CSC, 활동성 암 줄기 세포(e-CSC), 순환 종양 세포(CTC, 대부분의 암 관련 사망의 원인이 되는 기작인, 멀리 떨어져 있는 장기에서의 추가 종양의 후속 성장을 유발하는 시드 세포) 및 요법 내성 암 세포(TRCC, 화학요법, 방사선요법 및 다른 통상의 암 치료 중 하나 이상에 대한 내성을 발생시킨 세포) 중 적어도 하나일 수 있다. 전체적으로 참고로 포함된, 본 출원인의 동시계류 미국 가특허출원 제62/686,881호(2018년 6월 19일 출원) 및 제62/731,561호(2018년 9월 14일 출원)에 기재된 바와 같이, e-CSC는 증식과 관련된 CSC 표현형을 나타낸다. 덩어리 암 세포 및 CSC 이외에, 본 접근법은 줄기세포능 마커(ALDH 활성 및 맘모스피어 형성 활성)의 점진적인 증가, 고도로 상승된 미토콘드리아 질량, 및 증가된 해당작용 및 미토콘드리아 활성을 보이는, 본 발명자들이 e-CSC로서 지칭하는 과다증식성 세포 하위집단을 표적화하는 데 사용될 수 있음을 인식해야 한다. 큰 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제1 항생제 및 작은 미토콘드리아 리보좀을 억제하는 제2 항생제를 가진 조성물은 산화촉진제와 함께 투여되어, 이러한 암 세포 표현형을 표적화할 수 있고, 유리하게는 종양 재발, 전이, 약물 내성, 방사선요법 내성 및/또는 악액질을 예방할 수 있고/있거나, 치료할 수 있고/있거나 감소시킬 수 있다. 이 치료제들 중 하나 이상을 막 표적화 신호 및/또는 미토콘드리아 표적화 신호로 화학적으로 변형시키는 것은 미토콘드리아에서 변형된 치료제의 흡수를 향상시키고, 결과적으로 그 치료제의 효능을 향상시킨다.
따라서, 본 접근법의 일부 실시양태는 막 표적화 신호 및/또는 미토콘드리아 표적화 신호에 의해 화학적으로 변형된 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다. 막 표적화 신호는 지방산일 수 있고, 바람직한 실시양태에서 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산 및 올레산 중 하나일 수 있다. 미토콘드리아 표적화 신호의 예는 친유성 양이온, 예컨대, TPP 및 TT 유도체를 포함한다. 2018년 11월 21일에 출원된 본 출원인의 동시계류 국제 특허출원 제PCT/US2018/062174호는 전체적으로 참고로 포함된다. 트리페닐-포스포늄 및 이의 유도체는 건강한 정상 세포를 사멸시키지 않으면서, "덩어리" 암 세포, 암 줄기 세포 및 "정상" 노쇠 세포(섬유모세포)를 표적화하는 데 있어서 효과적인 미토콘드리아 표적화 신호이다. TPP 유도체의 예는 (1) 2-부텐-1,4-비스-TPP; (2) 2-클로로벤질-TPP; (3) 3-메틸벤질-TPP; (4) 2,4-디클로로벤질-TPP; (5) 1-나프틸메틸-TPP를 포함한다. TPP 유도체도 유도체를 가질 수 있다는 것도 인지해야 한다. 예를 들면, 미토콘드리아 표적화 화합물은 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-클로로벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP; 1-나프틸메틸-TPP; p-크실릴렌비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; 및 p-크실릴렌비스-TPP의 유도체 중 적어도 하나인 TPP 유도체일 수 있다. 친유성 양이온 10-N-노닐 아크리딘 오랜지도 일부 실시양태에서 미토콘드리아 표적화 신호로서 사용될 수 있다. 이 표적화 신호 예는 총망라한 것이 아님을 인식해야 한다.
하기 단락들은 막 표적화 신호와 접합된 치료제에 관한 것이다. 막 표적화 신호의 예는 지방산, 예컨대, 팔미테이트, 스테아레이트, 미리스테이트 및 올레에이트를 포함한다. 단쇄 지방산, 즉 6개 미만의 탄소 원자를 가진 지방산도 막 표적화 신호로서 사용될 수 있다. 단쇄 지방산의 예는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 이소부티르산, 발레르산 및 이소발레르산을 포함한다. 막 표적화 신호는 6개 내지 12개의 탄소 원자를 가진 하나 이상의 중쇄 지방산일 수도 있다. 접합된 치료제의 바람직한 실시양태는 적어도 11개의 탄소 내지 최대 21개의 탄소를 가진 지방산 모이어티를 가진다.
일부 실시양태에서, 접합체 화합물에서 지방산 모이어티는 일반 화학식
Figure pct00003
를 포함할 수 있고, 이 식에서 X는 지방산 모이어티가 결합되는 치료제 상의 치환 위치를 표시하고, 'n'은 1 내지 20, 바람직하게는 10 내지 20의 정수이다. 본원에 기재된 바와 같이 본원의 용어 "지방산 모이어티"의 사용을 고려할 때, 본 접근법의 일부 실시양태는 일반 화학식
Figure pct00004
를 가진 지방산 모이어티를 포함하는 접합체 화합물을 포함할 수 있고, 이 식에서 X는 지방산 모이어티가 결합되는 치료제 상의 치환 위치를 표시하고, 'n'은 1 내지 20, 바람직하게는 10 내지 20의 정수이다.
지방산 모이어티를 가진 접합체는 당분야에서 이용될 수 있는 기법을 이용함으로써 합성될 수 있다. 예를 들면, 독시사이클린과 미리스트산의 접합체는 미리스토일화를 통해 합성될 수 있다. 당분야에서 공지되어 있는 다른 접합체 합성 기법이 이용될 수 있다. 이것은 막 표적화 신호의 포괄적인 목록이 아니고 나열되지 않은 막 표적화 신호가 본 접근법을 벗어나지 않으면서 사용될 수 있음을 인식해야 한다. 지방산 표적화 신호는 약물 전달과 관련하여 추가 이점을 제공한다. 지방산은 접합된 화합물을 지질 기반 나노입자, 또는 하나 이상의 동심원 인지질 이중층으로 구성된 소포 내로 혼입하는 것을 용이하게 한다. 예를 들면, 1988년 8월 2일에 발행된 미국 특허 제4,761,288호는 일부 실시양태에서 사용될 수 있는 리포좀 약물 전달 시스템을 기술하고 전체적으로 참고로 포함된다. 이 리포좀 약물 전달 실시양태는 전달 및 초기 대사 동안 더 적은 활성 성분이 소비되기 때문에 더 효과적인 약물 전달을 제공한다.
지방산 모이어티와 같은 막 표적화 신호와 접합된 하나 이상의 치료제는 본 접근법의 실시양태에서 사용될 수 있다. 단쇄 지방산 및 중쇄 지방산이 표적화 신호로서 사용될 수 있지만, 적어도 11개의 탄소 내지 최대 21개의 탄소를 가진 지방산은 치료제의 CSC 억제에 있어서 가장 많은 개선을 제공한다. 라우르산, 미리스트산, 팔미트산 및 스테아르산을 가진 접합체는 치료제의 억제 및 우선적인 보유 성질의 유의미한 개선을 보인다. 예증적 예로서, 독시사이클린-미리스테이트 접합체의 실시양태는 독시사이클린 단독보다 더 우수한 효능을 보여주었다. 도 14는 독시사이클린("Dox") 및 하기 화합물 [1](이 개시는 화합물 [1]을 독시사이클린과 미리스트산의 접합체로서도 지칭함을 인지함)로서 표시된 독시사이클린-미리스테이트 접합체("Dox-M")에 대해 MCF7 세포에 대한 맘모스피어 어세이로부터의 결과를 비교한다. 데이터는 화합물에의 노출 후 맘모스피어 총수를 대조군의 퍼센트로서 표시한다. 화합물을 1.5 μM, 3 μM, 6 μM 및 12 μM의 농도에서 시험하였다. 각각의 농도에서 독시사이클린-미리스테이트 접합체는 비접합된 독시사이클린보다 더 강력하였음을 확인할 수 있다. 효능은 3 μM 이상의 농도에서 유의미하게 더 현저하였다. 지방산, 특히 총 11개 내지 21개의 탄소를 가진 지방산 모이어티와 접합된 다른 테트라사이클린 패밀리 구성원 및 에리쓰로마이신 패밀리 구성원을 사용할 때 유사한 작용이 확인된다.
도 15는 독시사이클린 및 화합물 [1]로서 표시된 독시사이클린-미리스테이트 접합체에 대해 더 넓은 범위의 화합물 농도에 걸쳐 맘모스피어 어세이 결과를 보여주는 선 그래프이다. 위 곡선은 독시사이클린에 노출된 MCF7 세포에 대한 맘모스피어 총수(대조군에 비해 퍼센트로서)를 표시한다. 아래 곡선은 독시사이클린-미리스테이트 접합체에 노출된 MCF7 세포에 대한 맘모스피어 총수를 표시한다. 2.5 μM에서 독시사이클린 단독은 MCF7 세포에 대한 맘모스피어 어세이에서 효과를 거의 또는 전혀 갖지 않았다. 대조적으로, 2.5 μM에서 독시사이클린-미리스테이트 접합체는 MCF7 맘모스피어 형성을 대조군에 비해 40% 내지 60% 억제하였다. 이 데이터에 근거할 때, 독시사이클린에 대한 절반 최대 억제 농도(IC50)는 18.1 μM이고, 독시사이클린-미리스테이트 접합체에 대한 IC50는 3.46 μM이다. 이것은 독시사이클린-미리스테이트 접합체가 CSC 증식을 억제하는 데 있어서 독시사이클린보다 5배 이상 더 강력함을 입증한다.
Figure pct00005
도 16a 내지 16c는 독시사이클린-미리스테이트 접합체의 세포 보유를 비접합된 독시사이클린과 비교하는 영상이다. MCF7 세포를 72시간 동안 10 μM의 농도에서 치료제(즉, 독시사이클린-미리스테이트 접합체 또는 비접합된 독시사이클린)의 존재 하에서 조직 배양 배지에서 배양하였다. 그 다음, 상기 세포를 PBS로 세척하였고, 세포 내부에 보유된 임의의 치료제를 테트라사이클린 고리 구조의 여기로부터의 녹색 자동형광으로 가시화하였다. 대조군 세포를 비히클 단독과 함께 인큐베이션하였다. 도 16a는 처리되지 않은 대조군이고, 도 16b는 독시사이클린-미리스테이트 접합체 화합물 [1]의 보유를 보여주고, 도 16c는 독시사이클린의 보유를 보여준다. 재현성을 개선하기 위해 영상에서 원래의 색상을 반전시켰고, 도 16b의 더 어두운 영역은 접합된 치료제의 증가된 세포 보유를 표시한다. 도 16a 내지 16c의 비교를 통해 알 수 있는 바와 같이, 도 16b의 어두운 정도 및 강도는 독시사이클린-미리스테이트 접합체가 독시사이클린 단독에 비해 유의미하게 개선된 세포 보유를 가짐을 표시한다. 다른 표적화 신호와 접합된 다른 치료제의 사용 시 필적할만한 결과가 예상될 것이다.
표적화 신호와 접합된 치료제의 실시양태는 비접합된 치료제에 비해 덩어리 암 세포 및 정상 섬유모세포에서 더 낮은 독성을 보여주었다. 예를 들면, 도 17a 및 17b는 각각 덩어리 MCF7 세포 및 덩어리 BJ 세포에 대해 독시사이클린 및 화합물 [1]로서 표시된 독시사이클린-미리스테이트 접합체에 대한 세포 생존율 데이터를 보여준다. 상기 데이터는 대조군의 퍼센트로서 표현된 세포 생존율을 표시한다. 도 17a 및 17b 둘 다에서 확인할 수 있는 바와 같이, 독시사이클린-미리스테이트 접합체는 시험된 농도 범위에 걸쳐, 심지어 20 μM의 농도에서도 독시사이클린보다 더 낮은 독성을 나타낸다. 표적화 신호와 접합된 다른 치료제에서도 유사한 작용이 관찰되었다.
독시사이클린-미리스테이트 접합체인 화합물 [1]은 본 접근법에 따른 접합된 치료제의 일례이고, 다수의 다른 접합된 치료제들이 예상됨을 인식해야 한다. 하기 표시된 화합물 [2]는 지방산 모이어티와 접합된 독시사이클린의 일반 구조를 표시한다. 'n'은 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 10 내지 20이다. 예를 들면, 'n'이 12이면 미리스트산 모이어티를 가진 접합체가 생성된다. 독시사이클린이 이 예에서 사용되지만, 예를 들면, 티게사이클린, 미노사이클린을 포함하나 이들로 제한되지 않는 테트라사이클린 패밀리의 다른 구성원(즉, 작은 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 나프타센 코어를 가진 항생제)가 치료제로서 사용될 수 있음을 인식해야 한다. 화합물 [3]은 본 설명에서 사용될 나프타센 코어 고리 상의 표지를 가진, 테트라사이클린 유도체에 대한 일반 화학구조이다. 테트라사이클린 유도체들은 나프타센 코어에 부착된 상이한 작용기를 갖고 화합물 [3]은 주로 치환 위치를 예시하고 표지부착 시스템을 제공하는 데 사용됨을 이해해야 한다. 화합물 [3]에서 표시된 표지를 사용할 때, 화합물 [2]에서 표시된 지방산 모이어티는 나프타센 코어의 D 고리 상의 R9 위치로서 지칭되는 위치에서 치환된다. 다른 치환 위치도 사용될 수 있음을 인식해야 한다. 예를 들면, 화합물 [3]의 일반 구조에서 표시된 바와 같이, 예를 들면, D 고리의 R7 및 R8 위치는 치환을 위한 추가 옵션이다. 그러나, 일반적으로, A 고리 상의 디메틸아미노 및 아미드 기는 B 고리 및 C 고리를 따라 입체화학적 배열에 의해서도 좌우될 수 있는 항생제 활성에 중요하다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
상기 표시된 화합물 [4]는 본 접근법에 따라 독시사이클린 및 지방산 모이어티를 가진 접합된 치료제의 또 다른 예이다. 이 실시양태에서, 지방산 모이어티는 D 고리의 R8 위치에서 치환된다. 'n'은 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 10 내지 20이다. 하기 표시된 화합물 [5A]는 본 접근법의 또 다른 실시양태에 따른 테트라사이클린-지방산 접합체의 일례를 예시한다. 이 예에서, 지방산 모이어티는 D 고리의 R9 위치에서 치환되나, 이미 기재된 바와 같이, 지방산 모이어티가 다른 위치에서 치환될 수 있음을 이해해야 한다. 하기 화합물 [5B]는 막 표적화 신호와 접합된 테트라사이클린 패밀리 구성원의 또 다른 실시양태를 나타낸다. 화합물 [5B]에서, 미노사이클린 구조는 D 고리의 R9 위치에서 치환된 지방산 모이어티를 가진다. 물론, 지방산 모이어티는 상기 논의된 바와 같이 다른 위치에서 치환될 수 있다. 화합물 [5A] 및 [5B] 둘 다의 경우, 'n'은 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 10 내지 20이다.
Figure pct00009
Figure pct00010
치료제 접합체의 이전 예는 테트라사이클린 패밀리 구성원을 포함하였다. 에리쓰로마이신 패밀리 구성원과 막 표적화 신호의 접합체도 본 접근법에 의해 예상됨을 인식해야 한다. 하기 화합물 [6], [7] 및 [8]은 당분야에서 공지되어 있는 에리쓰로마이신 패밀리에서 FDA에 의해 승인된 항생제의 예인 아지쓰로마이신, 록시쓰로마이신 및 텔리쓰로마이신에 대한 구조를 보여준다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
마크롤라이드 구조는 여러 잠재적인 치환 위치들을 제공한다. 이 설명은 에리쓰로마이신 패밀리 접합체에 대한 2개의 일련의 화학식을 다룬다. 하기 화합물 [9A], [9B], [10A], [10B], [11A] 및 [11B]는 각각 아지쓰로마이신 접합체, 록시쓰로마이신 접합체 및 텔리쓰로마이신 접합체에 대한 일반 구조를 보여준다. 각각의 일반 구조는 잠재적인 치환 위치를 나타내는 다수의 R 기들을 가진 것으로 표시된다. 본 접근법의 일부 실시양태에서, 1개의 R 기는 표적화 신호, 예컨대, 막 표적화 신호 또는 미토콘드리아 표적화 신호일 수 있고, 그 후 남은 R 기는 (예를 들면, 화합물 [6] 내지 [8]에서 표시된 바와 같이) 구조에 통상적으로 존재하는 모이어티일 것이다. 일부 경우, NH-R 기는 하기 논의된 바와 같이 N(CH3)2일 수 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
에리쓰로마이신 패밀리 접합체에 대한 첫 번째 일련의 일반 화학식은 화합물 [9A], [10A] 및 [11A]로 표시된다. 화합물 [9A]로 출발하여, 아지쓰로마이신 접합체인 화합물 [9A]에서 R2는 지방산 모이어티일 수 있고, 그 다음 R1, R3, R4 및 R5 각각은 화합물 [6]에서 표시된 바와 같이 이지쓰로마이신에 통상적으로 존재하는 모이어티, 즉 각각 H, H, 데옥시 당(데소사민) 및 데옥시 당(클라디노스)일 수 있다. 표적화 신호 모이어티는 이 예에서 사용된 R2 대신에 또 다른 위치에서 치환될 수 있음을 인식해야 한다. 화합물 [10A]는 록시쓰로마이신 접합체에 대한 첫 번째 일반 화학식을 보여준다. 화합물 [10A]에서 R1은 지방산 모이어티일 수 있고, 그 다음 R2 내지 R6 각각은 화합물 [7]에서 표시된 바와 같이 록시쓰로마이신에 통상적으로 존재하는 모이어티일 수 있다. 또 다른 예로서, 화합물 [11A]의 텔리쓰로마이신 접합체에서 R3은 표적화 신호를 포함할 수 있고, 그 다음 R1 및 R2는 화합물 [8]에서 표시된 바와 같이 록시쓰로마이신에 통상적으로 존재하는 모이어티일 수 있다(예를 들면, R1은 카르바메이트 고리 상의 아릴-알킬 모이어티이고, -NHR2는 -N(CH3)2, 즉 데소사민 당 고리가 된다).
상기 표시된 두 번째 일련의 일반 화학식들은 본 접근법의 추가 실시양태에 따른 접합체를 나타낸다. 화합물 [9B]는 일부 실시양태에 따른 아지쓰로마이신 접합체에 대한 두 번째 일반 화학식을 보여주고, 이때 작용기 R1 및 R2는 동일할 수 있거나 상이할 수 있고, 이들 중 하나 또는 둘 다가 표적화 신호이다. 예를 들면, R1 및/또는 R2는 표적화 신호일 수 있고, 동일하지 않은 경우, 다른 R은 화합물 [6]에서 표시된 바와 동일한 상태로 남아있다. 예를 들면, R1은 메틸일 수 있고, R2는 표적화 신호, 예컨대, 지방산 모이어티일 수 있다. 또 다른 예로서, R1은 표적화 신호일 수 있고, NH-R2는 -N(CH3)2일 수 있다.
화합물 [10B]는 일부 실시양태에 따른 록시쓰로마이신 접합체에 대한 두 번째 일반 화학식을 보여주고, 이때 작용기 R1 및 R2는 동일할 수 있거나 상이할 수 있고, 이들 중 하나 또는 둘 다가 표적화 신호일 수 있다. 예를 들면, R1 및/또는 R2는 상기 논의된 바와 같이 지방산 모이어티일 수 있고, 나머지는 화합물 [7]에서 표시된 바와 동일할 수 있다. 화합물 [10B]를 사용하는 또 다른 예로서, R1은 메톡시, 예컨대, 록시쓰로마이신에 존재하는 O-CH2-O-(CH2)2-OCH3일 수 있고, R2는 지방산 모이어티와 같은 표적화 신호일 수 있다. 또 다른 예로서, R1은 표적화 신호일 수 있고, NH-R2는 N(CH3)2일 수 있다.
화합물 [11B]는 텔리쓰로마이신 접합체에 대한 두 번째 일반 화학식을 보여주고, 이때 작용기 R1 및 R2는 동일할 수 있거나 상이할 수 있고, 이들 중 하나 또는 둘 다가 표적화 신호일 수 있다. 예를 들면, R1 및/또는 R2는 상기 논의된 바와 같이 막 표적화 신호 또는 미토콘드리아 표적화 신호일 수 있다. 예를 들면, R1은 알킬-아릴 기, 예컨대, 텔리쓰로마이신 카르바메이트 고리 상에 존재하는
Figure pct00020
일 수 있고, R2는 표적화 신호일 수 있다. 또 다른 예로서, R1은 표적화 신호일 수 있고, -NH-R2는 -N(CH3)2일 수 있다.
하기 화합물 [12A], [13A] 및 [14A]는 전술된 접합체들에 대한 첫 번째 일련의 일반 구조를 사용하여, 본 접근법에 따른 에리쓰로마이신 패밀리 구성원 접합체의 구체적인 예를 나타낸다. 화합물 [12]에서, R5는 지방산 모이어티에 대한 일반 구조로 치환되고, 다른 치환 위치는 아지쓰로마이신 구조 상에서 발견되는 일반적인 구성요소를 가진다. 화합물 [13]에서, R5는 지방산 모이어티에 대한 일반 구조로 치환되고, 다른 치환 위치는 록시쓰로마이신 구조 상에서 발견되는 일반적인 구성요소를 가진다. 화합물 [14]에서, R3은 지방산 모이어티에 대한 일반 구조로 치환되고, 다른 치환 위치는 텔리쓰로마이신 구조 상에서 발견되는 일반적인 구성요소를 가진다. 이 예들에서, 'n'은 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 10 내지 20이다. 지방산 모이어티가 예를 들면, 미리스테이트인 화합물 [12A], [13A] 및 [14A]의 실시양태는 비접합된 항생제에 비해 CSC 억제 활성 및 세포 보유의 개선을 나타내었다. 이 접근법을 이용하여 에리쓰로마이신 패밀리 구성원과 표적화 신호 모이어티의 많은 접합체들을 형성할 수 있음을 인식해야 한다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
하기 화합물 [12B], [13B] 및 [14B]는 상기 표시된 두 번째 일련의 일반 구조를 사용하여 본 접근법에 따른 에리쓰로마이신 패밀리 구성원 접합체의 구체적인 예를 나타낸다. 화합물 [12B]에서, R1은 지방산 모이어티
Figure pct00024
에 대한 일반 구조로 치환되고, 이 식에서 'n'은 1 내지 20, 바람직하게는 10 내지 20의 정수이고, 다른 치환 위치는 아지쓰로마이신 구조 상에서 발견되는 일반적인 구성요소를 가진다. 화합물 [13B]에서, R2는 화합물 [12B]와 동일한 지방산 모이어티 일반 구조로 치환되고, 다른 치환 위치 R1은 록시쓰로마이신 구조 상에서 발견되는 일반적인 구성요소를 가진다. 두 번째 텔리쓰로마이신 접합체 일반 화학식에 기반한 예로서, 화합물 [14B]는 R1에서 동일한 지방산 일반 구조를 갖고, 대신에 NH-R2는 텔리쓰로마이신 구조 상에서 발견되는 N(CH3)2이다. 이 예에서, 'n'은 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 10 내지 20이다. 에리쓰로마이신과 지방산의 접합체, 예컨대, 지방산 모이어티가 예를 들면, 미리스테이트인 화합물 [12A], [12B], [13A], [13B], [14A] 및 [14B]로 표시된 접합체의 실시양태는 비접합된 항생제에 비해 CSC 억제 활성 및 세포 보유의 개선을 나타내었다. 이 접근법을 이용하여 에리쓰로마이신 패밀리 구성원과 표적화 신호 모이어티의 많은 접합체들을 형성할 수 있음을 인식해야 한다.
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
상기 화학식 [11B]로 표시된 일반 구조를 사용하여 텔리쓰로마이신과 지방산 모이어티의 접합체의 구체적인 예의 실시양태를 아래에 표시한다. 화학식 [14C]로서 표시된 이 예에서, R1은 비접합된 텔리쓰로마이신의 R1과 동일한 상태로 유지되고, 지방산 모이어티는 R2에 위치하고, 이때 n은 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 10 내지 20이다. 화학식 [14C]의 바람직한 실시양태에서, n은 12이고, 생성된 접합체는 비접합된 항생제에 비해 CSC 억제 활성 및 세포 보유의 유의미한 개선을 나타내었다.
Figure pct00028
하기 표시된 화합물 [15]는 미리스테이트와 접합된 에리쓰로마이신 패밀리 구성원인 아지쓰로마이신의 한 실시양태를 예시한다. 지방산 모이어티는 화합물 [9B]의 R2 위치에서 치환되고, R1은 메틸 기로 남아있다. 화합물 [15]로서 표시된 접합체는 아지쓰로마이신 단독에 비해 CSC에 대한 개선된 효능 및 선택성을 나타내었고, 본 접근법의 실시양태에서 치료제로서 사용될 수 있다.
Figure pct00029
친유성 양이온을 가진 접합체로 화제를 돌리기 전, 지방산을 가진 아스코르브산(비타민 C) 접합체를 다음과 같이 간단히 논의한다. 일부 실시양태는 막 표적화 신호와 접합된 산화촉진제 치료제를 사용할 수 있다. 다른 치료제도 막 표적화 신호와 접합될 수 있다. 구체적으로, 비타민 C의 유도체(예를 들면, 아스코르베이트)는 지방산 모이어티와 접합될 수 있다. 예를 들면, 아스코르빌 팔미테이트는 지용성 비타민 C 공급원 및 항산화제 식품 첨가제로서 큰 용량으로 통상적으로 사용되는, 아스코르브산과 팔미트산의 에스테르이다. 본 접근법의 실시양태는 산화촉진제로서 아스코르빌 팔미테이트를 사용할 수 있다. 본 접근법의 일부 실시양태는 표적화 신호 모이어티를 가진 치료제와 함께 또는 이러한 치료제 없이, 표적화 신호와 접합된 비타민 C의 유도체를 사용할 수 있다. 치료제 화합물이 리포좀 약물 전달을 위해 지방산과 접합되어 있는 실시양태는 실시양태에서 각각의 치료제의 포장 및 전달의 총체적인 개선을 위해 아스코르빌 팔미테이트, 또는 지방산을 가진 다른 접합체를 포함할 수 있다. 하기 화합물 [S]는 지방산과 접합된 비타민 C 유도체에 대한 일반 구조이고, 이때 n은 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 10 내지 20이다.
Figure pct00030
상기 논의된 바와 같이, 하나 이상의 치료제 화합물은 미토콘드리아 표적화 신호와 접합된 항생제의 형태를 취할 수 있다. 하기 단락들은 치료제가 종종 스페이서 아암 및/또는 연결 기의 사용을 통해 미토콘드리아 표적화 신호와 접합되어 있는 실시양태를 기술한다. 미토콘드리아 표적화 신호의 예는 친유성 양이온, 예컨대, TPP, TPP 유도체, 구아니디늄 기반 모이어티, 퀴놀리늄 기반 모이어티 및 10-N-노닐 아크리딘 오랜지를 포함한다. 콜린 에스테르, 로다민 유도체, 피리디늄, (E)-4-(1H-인돌-3-일비닐)-N-메틸피리디늄 요오다이드(F16) 및 설포닐-우레아 유도체, 예컨대, 디아족사이드도 일부 실시양태에서 미토콘드리아 표적화 신호로서 사용될 수 있다. TPP 유도체의 예는 예를 들면, 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-클로로벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP; 1-나프틸메틸-TPP; 또는 p-크실릴렌비스-TPP를 포함한다. TPP 유도체 화합물 2-부텐-1,4-비스-TPP는 일부 바람직한 실시양태에서 사용될 수 있다. 이것은 미토콘드리아 표적화 신호의 포괄적인 목록이 아니고, 나열되지 않은 미토콘드리아 표적화 신호가 본 접근법을 벗어나지 않으면서 사용될 수 있음을 인식해야 한다.
하기 예는 테트라사이클린 화합물과 미토콘드리아 표적화 신호의 접합체를 나타내기 위해 사용된다. (예를 들면, 화합물 [3] 및 [9A] 내지 [11B]에 대한) 잠재적인 치환 위치의 이전 설명은 미토콘드리아 표적화 신호를 가진 접합체에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전술된 바와 같이 연결 기 및/또는 화학적 스페이서 아암을 사용하여 치료제를 TPP와 접합시킬 수 있다. 추가로, 다수의 연결 기들이 당분야에서 공지되어 있고 본원에 기재된 바와 같이 미토콘드리아 표적화 신호와 함께 접합체를 형성하는 데 사용될 수 있음을 인식해야 한다. 예를 들면, 1998년 11월 25일에 출원되었고 전체적으로 본원에 참고로 포함된 국제 특허출원 제PCT/NV98/00172호에 상응하는 국제 특허출원 공개 제WO 99/26582호는 식 TPP-X-R Z--의 사용을 기술하고, 이때 Z는 음이온이고, X는 연결 기이고, R은 치료제이다. 일부 실시양태에서, X는 C1-6 알킬일 수 있다. 또 다른 예로서, 2010년 4월 16일에 출원되었고 전체적으로 참고로 포함된 국제 특허출원 제PCT/US2010/031455호에 상응하는 국제 특허출원 공개 제WO 2010/141177호는 본 접근법에서 사용될 수 있는 다양한 "연결 모이어티" 예를 기술한다.
화합물 [16A]는 D 고리 상의 R9 위치로서 지칭되는 위치의 연결 기 -NHC(O)- 및 스페이서 아암 (CH2)n을 통해 미토콘드리아 표적화 신호(이 경우, TPP)와 접합된 테트라사이클린 유도체(이 경우, 테트라사이클린)에 대한 일반 화학식을 예시하고, 이때 'n'은 1 내지 20의 정수이다. 하기 화합물 [16A]는 R9 위치에서 예증적 5-탄소 스페이서 아암 및 아미드 연결 기를 통해 연결된, TPP 양이온과 접합된 독시사이클린의 일례를 예시한다.
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
화합물 [9A] 내지 [11B]에서 표시된 치환 위치를 이용하여, 에리쓰로마이신 패밀리 구성원과 미토콘드리아 표적화 신호의 접합체도 형성할 수 있다. 요약하건대, 이 구조들은 반복되지 않을 것이고, 하나의 예증적 실시양태만이 제공될 것이다. 하기 표시된 화합물 [17]은 예증적 4-탄소 스페이서 아암 및 아미드 연결 기를 통해 TPP와 접합된 에리쓰로마이신 패밀리 구성원인 아지쓰로마이신을 예시한다. 에리쓰로마이신 패밀리 구성원과 미토콘드리아 표적화 신호의 많은 다른 접합체들을 전술된 바와 같이 형성할 수 있음을 인식해야 한다.
Figure pct00034
하기 단락들은 본 접근법에 따른 접합체를 합성하는 방법의 예를 기술한다. 먼저, 분취 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)를 위해 두 방법들이 이용될 수 있었다. 방법 A는 페노메넥스 키네텍스(Phenomenex Kinetex)로부터의 LC 컬럼 5 ㎛ EVO C18 100 250x21.2 mm을 이용하였다. 구배 용출제: 0.1% 포름산을 함유하는 20% 내지 80% 아세토니트릴/물. 시간: 0분 내지 25분. 파장: 246 nm. 방법 B도 페노메넥스 키네텍스로부터의 LC 컬럼 5 ㎛ EVO C18 100 250x21.2 mm을 이용하였다. 구배 용출제: 0.015 M NaH2PO4 및 0.015 M 옥살산(pH 7)을 함유하는 20% 내지 80% 아세토니트릴/물. 시간: 0분 내지 25분. 파장: 254 nm. LC 컬럼을 통해 분석 액체 크로마토그래피를 수행하였다. 워터스 선파이어(Waters Sunfire) C18 30x4.6 mm. 구배 용출제: 0.05% 포름산을 함유하는 3% 내지 97% 아세토니트릴/물. 시간: 0분 내지 6분.
하기 약어가 실시예에서 사용된다: N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)유로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), N-메틸모르폴린(NMM), 디클로로메탄(DCM), 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU), 메탄올(MeOH), 암모니아(NH3).
실시예 1 - 독시사이클린과 지방산의 접합체. (4S,5S,6R,12aS)-4-(디메틸아미노)-3,5,10,12,12a-펜타하이드록시-6-메틸-1,11-디옥소-9-(테트라데카노일아미노)-4a,5,5a,6-테트라하이드로-4H-테트라센-2-카르복스아미드(즉, 앞서 기재되어 있고 하기 화합물 [18]로서 표시된 바와 같이 R9에서 미리스트산과 접합된 독시사이클린). DCM(12 ㎖)과 DMF(4 ㎖)의 혼합물 중의 9-아미노독시사이클린(문헌[Barden, Timothy C. et al. "Glycylcyclines". 3. 9-Aminodoxycycline carboxamides. J.Med.Chem. 1994, 37, 3205-3211]에 기재된 바와 같이 제조됨)(0.70 g, 1.5 mmol), 테트라데칸산(0.36 g, 1.5 mmol), HBTU(0.85 g, 2.25 mmol) 및 NMM(0.33 ㎖, 3.0 mmol)의 용액을 72시간 동안 실온에서 질소 대기 하에서 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 생성된 잔사를 아세토니트릴(40 ㎖)로 분쇄하였고, 침전물을 여과로 모으고 아세토니트릴(10 ㎖) 및 디에틸 에테르(20 ㎖)로 세척하고 진공 하에서 건조하였다. 미정제 생성물을 DMSO에 용해시키고 분취 HPLC(방법 A)로 정제하여, (4S,5S,6R,12aS)-4-(디메틸아미노)-3,5,10,12,12a-펜타하이드록시-6-메틸-1,11-디옥소-9-(테트라데카노일아미노)-4a,5,5a,6-테트라하이드로-4H-테트라센-2-카르복스아미드(0.086 g)를 수득하였다. LC-MS 670.2 [M+H]+, RT 2.78분.
Figure pct00035
실시예 2 - 독시사이클린과 지방산의 접합체. (4S,5S,6R,12aS)-4-(디메틸아미노)-9-(헥사데카노일아미노)-3,5,10,12,12a-펜타하이드록시-6-메틸-1,11-디옥소-4a,5,5a,6-테트라하이드로-4H-테트라센-2-카르복스아미드. 실시예 1의 방법에 따라 하기 표시된 화합물 [19]를 제조하였다. LC-MS 698.2 [M+H]+, RT 3.02분.
Figure pct00036
실시예 3 - 독시사이클린과 지방산의 접합체. (4S,5S,6R,12aS)-4-(디메틸아미노)-9-(도데카노일아미노)-3,5,10,12,12a-펜타하이드록시-6-메틸-1,11-디옥소-4a,5,5a,6-테트라하이드로-4H-테트라센-2-카르복스아미드. 실시예 1의 방법에 따라 하기 표시된 화합물 [20]을 제조하였다. LC-MS 642.1 [M+H]+, RT 2.42분.
Figure pct00037
실시예 4 - 독시사이클린과 (옥살레이트 염으로서) TPP의 접합체. [6-[[(5R,6S,7S,10aS)-9-카르바모일-7-(디메틸아미노)-1,6,8,10a,11-펜타하이드록시-5-메틸-10,12-디옥소-5a,6,6a,7-테트라하이드로-5H-테트라센-2-일]아미노]-6-옥소-헥실]-트리페닐-포스포늄 옥살레이트. 분취 HPLC(방법 B)로 정제하였다는 점을 제외하고 실시예 1의 방법에 따라 하기 표시된 화합물 [21]을 제조하였다. LC-MS 409.7 [M ½]+, RT 1.53분.
Figure pct00038
실시예 5 - 아지쓰로마이신 접합체에 대한 전구체. 2R,3S,4R,5R,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-2-에틸-3,4,10-트리하이드록시-13-[(2S,4R,5S,6S)-5-하이드록시-4-메톡시-4,6-디메틸-테트라하이드로피란-2-일]옥시-11-[(2S,3R,4S,6R)-3-하이드록시-6-메틸-4-(메틸아미노)테트라하이드로피란-2-일]옥시-3,5,6,8,10,12,14-헵타메틸-1-옥사-6-아자사이클로펜타데칸-15-온. 화합물 [22]를 문헌[Vujasinovic, Ines et al. Novel tandem Reaction for the Synthesis of N'-Substituted 2-Imino-1,3-oxazolidines from Vicinal (sec- or tert-) Amino Alcohol of Desosamine. Eur. J. Org.Chem. 2011, 2507-2518]에 따라 제조하였다. LC-MS 735.3 [M+H]+, RT 0.97분.
Figure pct00039
실시예 6 - 아지쓰로마이신-지방산 접합체. N-[(2S,3R,4S,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-2-에틸-3,4,10-트리하이드록시-13-[(2S,4R,5S,6S)-5-하이드록시-4-메톡시-4,6-디메틸-테트라하이드로피란-2-일]옥시-3,5,6,8,10,12,14-헵타메틸-15-옥소-1-옥사-6-아자사이클로펜타데크-11-일]옥시]-3-하이드록시-6-메틸-테트라하이드로피란-4-일]-N-메틸-테트라데칸아미드. HBTU 대신에 HCTU를 사용하였고 실리카 겔(MeOH(7 M)/DCM 중의 2.5% NH3) 상에서 최종 정제를 수행하였다는 점을 제외하고 실시예 1의 방법에 따라 화합물 [23]을 (2R,3S,4R,5R,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-2-에틸-3,4,10-트리하이드록시-13-[(2S,4R,5S,6S)-5-하이드록시-4-메톡시-4,6-디메틸-테트라하이드로피란-2-일]옥시-11-[(2S,3R,4S,6R)-3-하이드록시-6-메틸-4-(메틸아미노)테트라하이드로피란-2-일]옥시-3,5,6,8,10,12,14-헵타메틸-1-옥사-6-아자사이클로펜타데칸-15-온으로부터 제조하였다. LC-MS 946.4 [M+H]+, RT 2.48분.
Figure pct00040
일부 실시양태에서, 치료제들 중 하나 이상의 치료제는 사이클로덱스트린 화합물, 예컨대, 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 감마-사이클로덱스트린 및 이들의 유도체와의 포접 착물의 부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 사이클로덱스트린 유도체는 이전 단락에 기재된 표적화 신호들 중 하나 이상의 표적화 신호를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사이클로덱스트린 포접 착물은 표적 조직으로의 치료제의 전달을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 치료제에 대한 적절한 수의 용량을 가진 치료제는 사전포장된 용기 내의 키트 내에 소정의 기간(예를 들면, 1주, 1개월 등) 동안 함유될 수 있다. 예를 들면, 도 18은 블리스터 팩 내에 2회 용량의 제1 치료제인 아지쓰로마이신("Azith"), 14회 용량의 제2 치료제인 독시사이클린("Doxy") 및 7회 용량의 비타민 C("Vit C")를 가진 키트(1801)를 보여준다. 도 18에 나타낸 예는 1주의 치료를 위해 충분할 수 있고, 각각의 수직열은 하루분의 치료제를 표시한다. 물론, 구체적인 키트의 내용물은 구체적인 실시양태에 대한 선택된 용량, 치료 지속기간 등에 따라 달라질 수 있다.
본 접근법의 실시양태는 항노화 및 항암 활성 이외에 유리한 이점을 가질 수 있음을 인식해야 한다. 일부 실시양태에서, 예를 들면, 조성물은 방사선감작 활성 및 광감작 활성 중 적어도 하나의 활성을 가진다. 일부 실시양태에서, 조성물은 암 세포를 화학치료제, 천연 물질 및 칼로리 제한 중 적어도 하나에 감작시킨다.
본 접근법의 실시양태는 노쇠, 종양 재발, 전이, 약물 내성, 악액질 및 방사선요법 내성 중 적어도 하나를 치료하는 방법의 형태를 취할 수도 있다. 본 접근법은 노쇠, 종양 재발, 전이, 약물 내성, 악액질 및 방사선요법 내성 중 적어도 하나를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 화합물을 제공하는 데 사용될 수 있음을 인식해야 한다. 일부 실시양태에서, 본 접근법에 따른 방법은 통상의 암 치료 후에 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 접근법은 예를 들면, 재발, 전이 및/또는 내성의 확률을 예방하거나 감소시키기 위해 통상의 암 치료보다 선행할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 접근법은 통상의 암 치료와 함께 사용될 수 있다.
하기 단락들은 상기 제공된 실험실 결과 및 분석과 관련하여 사용된 방법 및 재료를 기술한다. 세포주 및 시약: ER(+) 인간 유방암 세포주인 MCF7 세포는 원래 어메리칸 타입 컬처 콜렉션(ATCC)로부터 카탈로그 번호 HTB-22로서 구입되었다. 독시사이클린, 아지쓰로마이신 및 아스코르브산(비타민 C)은 시그마-알드리치 인코포레이티드(Sigma-Aldrich, Inc.)로부터 상업적으로 입수되었다.
맘모스피어 형성 어세이: 효소(1x 트립신-EDTA, 시그마 알드리치, #T3924) 및 수동 분해(25 게이지 바늘)를 이용하여 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 비부착 조건 하에서 세포를 "종양-구체 플레이트"로서 지칭되는, (2-하이드록시에틸메타크릴레이트)(폴리-HEMA, 시그마, #P3932)로 미리 코팅한 배양 접시 내의 맘모스피어 배지(DMEM-F12 + B27 + 20 ng/㎖ EGF + PenStrep)에 500개 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하였다. 비히클 단독(DMSO) 대조군 세포를 병행 처리하였다. 세포를 5일 동안 생장시키고 37℃에서 가습 인큐베이터 내에서 유지하였다. 5일의 배양 후, 접안렌즈("격자선")를 이용하여 50 ㎛ 초과의 3D 맘모스피어의 총수를 세었고, 구체를 형성한, 플레이팅된 세포의 퍼센트를 계산하였고 퍼센트 맘모스피어 형성(MFE)으로서 지칭하고, 1로 정규화하였다(1 = 100% MSF).
대사 유동 분석: Seahorse 세포외 유동(XFe96) 분석기(시호스 바이오사이언스(Seahorse Bioscience), 미국 소재)를 이용하여 MCF7 세포에서 실시간 산소 소비율(OCR) 및 세포외 산성화율(ECAR)을 측정하였다. 요약하건대, 웰당 1.5 x 104개의 세포를 XFe96 웰 세포 배양 플레이트에 시딩하고 하룻밤 동안 인큐베이션하여 세포가 부착되게 하였다. 그 다음, 세포를 72시간 동안 항생제로 처리하였다. 비히클 단독 대조군 세포를 병행 처리하였다. 72시간의 인큐베이션 후, 세포를 예열된 XF 어세이 배지(또는 OCR 측정의 경우 10 mM 글루코스, 1 mM 피루베이트 및 2 mM L-글루타민으로 보충되었고 7.4 pH로 조절된 XF 어세이 배지)로 세척하였다. 이어서, 세포를 1시간 동안 37℃의 비-CO2 인큐베이터 내의 175 ㎕/웰의 XF 어세이 배지에서 유지하였다. 인큐베이션 시간 동안, 본 발명자들은 XF 어세이 배지 중의 25 ㎕의 80 mM 글루코스, 9 μM 올리고마이신 및 1 M 2-데옥시글루코스(ECAR 측정의 경우) 또는 10 μM 올리고마이신, 9 μM FCCP, 10 μM 로테논 및 10 μM 안티마이신 A(OCR 측정의 경우)를 XFe96 센서 카트리지 내의 주입구에 로딩하였다. 측정치를 단백질 함량(브래드포드(Bradford) 어세이)으로 정규화하였다. XFe96 소프트웨어 및 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하고 일원 ANOVA 및 스튜던트 t-검정 계산을 이용하여 데이터 세트를 분석하였다. 모든 실험들을 독립적으로 3회씩 5중으로 수행하였다.
아노이키스 내성에 대한 생존/사멸 어세이: 48시간 동안 독시사이클린 단독, 아지쓰로마이신 단독 또는 조합물로 단일층을 처리한 후, 저부착 플레이트 상에 시딩하여 CSC 집단을 농후화하였다. 이 조건 하에서, 비-CSC 집단은 아노이키스(세포-기질 부착의 결여에 의해 유도된 아폽토시스의 한 형태)를 겪고 CSC는 생존하는 것으로 생각된다. 그 다음, FACS 분석으로 생존 CSC 분율을 측정하였다. 요약하건대, 1 X 104개의 MCF7 단일층 세포를 6웰 플레이트에서 48시간 동안 항생제 또는 비히클 단독으로 처리하였다. 이어서, 세포를 트립신처리하고 맘모스피어 배지에서 저부착 플레이트 내에 시딩하였다. 12시간 후, MCF7 세포를 회전시켜 침전시켰다. 세포를 2회 린싱하고 10분 동안 생존/사멸 염료(고정 가능한 사멸 바이올렛 반응성 염료; 인비트로겐)와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 생존/사멸 염료 염색 어세이를 이용하여 생존 집단을 확인하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
본 접근법의 실시양태의 설명에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이고 제한하기 위한 것이 아니다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형 용어는 복수형도 포함하기 위한 것이다. 본 접근법은 상기 상세한 설명을 고려할 때 자명해질 다수의 대체물, 변형물 및 균등물을 포괄한다.
용어 "제1", "제2", "제3", "a)", "b)" 및 "c)" 등이 본 접근법의 다양한 요소들을 기술하기 위해 본원에서 사용될 수 있지만, 청구범위는 이 용어들에 의해 제한되어서는 안 된다는 것을 이해할 것이다. 이 용어들은 본 접근법의 한 요소를 또 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용된다. 따라서, 본 접근법의 교시를 벗어나지 않으면서, 하기 논의된 제1 요소는 요소 양태로서 지칭될 수 있고, 제3 요소도 유사하게 지칭될 수 있다. 따라서, 용어 "제1", "제2", "제3", "a)", "b)" 및 "c)" 등은 반드시 관련 요소에 대한 순서 또는 다른 등급을 전달하기 위한 것이 아니라, 확인 목적으로만 사용된다. 작업(또는 단계)의 순서는 청구범위에서 제시된 순서로 제한되지 않는다.
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 용어들(기술 용어 및 과학 용어를 포함함)은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 통상적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어와 같은 용어들은, 본원에서 명시적으로 정의되어 있지 않은 한, 본원의 문맥 및 관련 분야에서 그들의 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하고 이상화된 또는 지나치게 형식적인 의미로 해석되어서는 안 된다는 것도 이해할 것이다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허출원, 특허 및 다른 참고문헌은 전체적으로 참고로 포함된다. 용어의 불일치가 있는 경우, 본 명세서가 우선한다.
또한, 본원에서 사용된 바와 같이, "및/또는"은 관련 나열된 항목들 중 하나 이상의 항목의 임의의 모든 가능한 조합들뿐만 아니라, 대안적("또는")으로 해석될 때 조합의 결여도 지칭하고 포괄한다.
문맥이 달리 표시하지 않은 한, 본원에 기재된 본 접근법의 다양한 특징들은 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것이 특별히 의도된다. 더욱이, 본 접근법은 일부 실시양태에서 예증적 실시양태와 관련하여 기재된 임의의 특징 또는 특징의 조합이 배제될 수 있거나 누락될 수 있다는 것도 예상한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 전환 어구 "본질적으로 구성된"(및 문법적 이형)은 언급된 물질 또는 단계 및 청구항의 "기본 특성(들) 및 신규 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계"를 포괄하는 것으로서 해석되어야 한다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "본질적으로 구성된"은 "포함하는"과 동등한 것으로서 해석되어서는 안 된다.
측정 가능한 값, 예를 들면, 양 또는 농도 등을 언급할 때 본원에서 사용된 용어 "약"은 특정된 양의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5% 또는 심지어 ± 0.1%의 편차를 포괄하기 위한 것이다. 측정 가능한 값에 대한 본원에서 제공된 범위는 그 내의 임의의 다른 범위 및/또는 개별 값을 포함할 수 있다.
따라서, 본 접근법의 특정 실시양태가 기재되어 있지만, 첨부된 청구범위는 이하에 청구된 그의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 그의 많은 자명한 변경이 가능하기 때문에 상기 설명에 기재된 특정 세부사항에 의해 제한되지 않아야 함을 이해해야 한다.

Claims (50)

  1. 미토콘드리아 생물발생(biogenesis)을 억제하고 큰 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 제1 치료제, 미토콘드리아 생물발생을 억제하고 작은 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 제2 치료제, 및 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 제3 치료제를 포함하는 항노화 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 치료제는 아지쓰로마이신(azithromycin)을 포함하고, 상기 제2 치료제는 독시사이클린(doxycycline)을 포함하고, 상기 제3 치료제는 비타민 C를 포함하는 항노화 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 치료제는 제1 지방산과 접합된 에리쓰로마이신(erythromycin) 패밀리 구성원을 포함하고, 상기 제2 치료제는 제2 지방산과 접합된 테트라사이클린(tetracycline) 패밀리 구성원을 포함하고, 상기 제3 치료제는 비타민 C 및 아스코르빌 팔미테이트 중 적어도 하나를 포함하는 항노화 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 제1 지방산 및 제2 지방산 중 적어도 하나는 미리스트산을 포함하는 항노화 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    적어도 하나의 치료제는 지방산 모이어티와의 접합체를 포함하는 항노화 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 치료제는 하기 화학식의 화합물들 중 하나를 포함하는 항노화 조성물:
    Figure pct00041

    Figure pct00042

    Figure pct00043

    Figure pct00044

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00045

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00046

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다); 및
    Figure pct00047

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다).
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 치료제 및 제2 치료제 중 적어도 하나는 TPP 모이어티와의 접합체를 포함하는 항노화 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 치료제는 제1 TPP 모이어티와 접합된 에리쓰로마이신 패밀리 구성원을 포함하고, 상기 제2 치료제는 제2 TPP 모이어티와 접합된 테트라사이클린 패밀리 구성원을 포함하고, 상기 제3 치료제는 비타민 C 및 아스코르빌 팔미테이트 중 적어도 하나를 포함하는 항노화 조성물.
  9. 청구항 2에 있어서,
    아지쓰로마이신 및 독시사이클린 중 적어도 하나의 농도는 항균 농도 미만인인 항노화 조성물.
  10. 청구항 2에 있어서,
    아지쓰로마이신 및 독시사이클린 둘 다의 농도는 항균 농도 미만인 항노화 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 제3 치료제는 혈액, 혈청, 및 혈장 중 적어도 하나에서 100 μM 내지 250 μM의 피크 비타민 C 농도를 달성하기에 충분한 농도로 경구 투여되는 비타민 C를 포함하는 항노화 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 치료제는 에리쓰로마이신 패밀리의 구성원, 또는 에리쓰로마이신 패밀리의 구성원과 지방산의 접합체인 항노화 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 치료제는 테트라사이클린 패밀리의 구성원, 또는 독시사이클린 패밀리의 구성원과 지방산의 접합체인 항노화 조성물.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 치료제는 하기 화학식의 화합물들 중 적어도 하나를 포함하는 항노화 조성물:
    Figure pct00048

    Figure pct00049

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00050

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00051

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00052

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00053

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00054

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다); 및
    Figure pct00055

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다).
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 제3 치료제는 비타민 C, 아스코르빌 팔미테이트, 아스코르베이트 유도체, 및
    Figure pct00056
    중 적어도 하나이고, 이때 n은 1 내지 20의 정수인 항노화 조성물.
  16. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 치료제는 아지쓰로마이신과 미리스트산의 접합체이고, 상기 제2 치료제는 독시사이클린과 미리스트산의 접합체이고, 상기 제3 치료제는 비타민 C 또는 아스코르빌 팔미테이트인 항노화 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 제3 치료제는 아스코르빌 팔미테이트이고, 상기 제1 치료제, 제2 치료제, 및 제3 치료제는 리포좀 약물 전달 시스템 내에 캡슐화되는 항노화 조성물.
  18. 청구항 1에 있어서,
    적어도 하나의 치료제는 TPP; TPP 유도체; 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-클로로벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP; 1-나프틸메틸-TPP; p-크실릴렌비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; p-크실릴렌비스-TPP의 유도체; 구아니디늄; 구아니디늄 유도체; 퀴놀리늄; 퀴놀리늄 기반 모이어티; 콜린 에스테르; 로다민; 로다민 유도체; 피리디늄; (E)-4-(1H-인돌-3-일비닐)-N-메틸피리디늄 요오다이드(F16); 설포닐-우레아 유도체; 디아족사이드; 및 10-N-노닐 아크리딘 오랜지; 중 적어도 하나에 의해 화학적으로 변형되는 항노화 조성물.
  19. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 항암 활성, 및 방사선감작 활성 및 광감작 활성 중 적어도 하나를 가진 항노화 조성물.
  20. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 암 세포를 화학치료제, 천연 물질, 및 칼로리 제한 중 적어도 하나에 감작시키는 항노화 조성물.
  21. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 노쇠 세포를 선택적으로 사멸시키는 항노화 조성물.
  22. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 노쇠 관련 분비 표현형의 획득을 방해하는 항노화 조성물.
  23. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 조직 복구 및 재생을 용이하게 하는 항노화 조성물.
  24. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 유기체의 수명 및 건강수명 중 적어도 하나를 증가시키는 항노화 조성물.
  25. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 탈모, 청력 손실, 시력 손실, 기억력 손실, 정신적 둔화, 관절 경직, 근육 손실, 힘 손실, 속도 손실, 균형 손실, 지구력 손실, 민첩성 손실, 성기능장애, 정력 손실, 테스토스테론 감소, 리포퓨신 침착, 및 염증 중 하나 이상을 감소시키는 항노화 조성물.
  26. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 모발 재생, 청력, 시력, 기억력, 정신적 명민함, 관절 이동성, 근육 성장, 근력, 근지구력, 속도, 균형, 민첩성, 및 성기능 중 하나 이상을 개선하는 항노화 조성물.
  27. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 모발 성장을 회복시키고, 천연 모발 색상을 회복시키고, 근육 조정력 및 보행을 회복시키고, 전반적인 이동성을 회복시키고, 근육량을 증가시키고, 악력을 증가시키고, 집중력을 증가시키고, 정신적 명석함을 증가시키고, 기억력을 증가시키는 것 중 적어도 하나인 항노화 조성물.
  28. 미토콘드리아 생물발생을 억제하고 큰 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 유효량의 제1 치료제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계, 미토콘드리아 생물발생을 억제하고 작은 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 유효량의 제2 치료제를 투여하는 단계, 및 제3 치료제 또는 방사선 치료를 통해 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 단계를 포함하는 노화 효과를 치료하는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 제1 치료제는 아지쓰로마이신을 포함하고, 상기 제2 치료제는 독시사이클린을 포함하고, 암 세포에서 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 단계는 비타민 C를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 청구항 28에 있어서,
    암 세포에서 미토콘드리아 산화성 스트레스는 비타민 C 및 아스코르빌 팔미테이트 중 적어도 하나를 포함하는 제3 치료제에 의해 유도되고, 상기 제1 치료제는 제1 지방산과 접합된 에리쓰로마이신 패밀리 구성원을 포함하고, 상기 제2 치료제는 제2 지방산과 접합된 테트라사이클린 패밀리 구성원을 포함하는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 제1 지방산 및 제2 지방산 중 적어도 하나는 미리스트산을 포함하는 방법.
  32. 청구항 28에 있어서,
    적어도 하나의 치료제는 지방산 모이어티와의 접합체를 포함하는 방법.
  33. 청구항 28에 있어서,
    상기 제1 치료제는 아지쓰로마이신과 미리스트산의 접합체를 포함하고, 상기 제2 치료제는 독시사이클린과 미리스트산의 접합체를 포함하는 방법.
  34. 청구항 28에 있어서,
    적어도 하나의 치료제는 TPP 모이어티와의 접합체를 포함하는 방법.
  35. 청구항 28에 있어서,
    암 세포에서 미토콘드리아 산화성 스트레스는 방사선요법, 및 비타민 C 및 아스코르빌 팔미테이트 중 적어도 하나를 포함하는 제3 치료제 중 하나에 의해 유도되는 방법.
  36. 청구항 28에 있어서,
    아지쓰로마이신 및 독시사이클린 중 적어도 하나의 농도는 항균 농도 미만이고, 상기 제3 치료제는 혈액, 혈장, 및 혈청 중 적어도 하나에서 100 μM 내지 250 μM의 피크 비타민 C 농도를 달성하기에 충분한 농도의 비타민 C인 방법.
  37. 청구항 28에 있어서,
    주당 2회 250 mg의 아지쓰로마이신, 일당 2회 100 mg의 독시사이클린, 및 주당 1회 500 mg의 비타민 C를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  38. 큰 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 제1 치료제로 미토콘드리아 생물발생을 억제하는 단계;
    작은 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 제2 치료제로 미토콘드리아 생물발생을 억제하는 단계; 및
    제3 치료제로 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 단계;를 포함하는 항노화 치료 방법.
  39. 청구항 38에 있어서,
    상기 제1 치료제는 아지쓰로마이신을 포함하고, 상기 제2 치료제는 독시사이클린을 포함하고, 상기 제3 치료제는 비타민 C를 포함하는 방법.
  40. 청구항 39에 있어서,
    아지쓰로마이신 및 독시사이클린 중 적어도 하나의 농도는 항균 농도 미만이고, 비타민 C의 농도는 혈액, 혈장, 및 혈청 중 적어도 하나에서 100 μM 내지 250 μM의 피크 비타민 C 농도를 달성하기에 충분한 방법.
  41. 청구항 38에 있어서,
    상기 제3 치료제는 비타민 C, 아스코르베이트 유도체, 화학치료제, 및 방사선 중 적어도 하나인 방법.
  42. 청구항 38에 있어서,
    적어도 하나의 치료제는 막 표적화 신호 및 미토콘드리아 표적화 신호 중 하나에 의해 화학적으로 변형되는 방법.
  43. 청구항 38에 있어서,
    상기 방법은 노쇠 세포를 사멸시키고, 노쇠 관련 분비 표현형의 획득을 방해하고, 및 조직 복구 및 재생을 용이하게 하는 것 중 적어도 하나인 방법.
  44. 청구항 38에 있어서,
    상기 제1 치료제는 아지쓰로마이신과 제1 지방산의 접합체를 포함하고, 상기 제2 치료제는 독시사이클린과 제2 지방산의 접합체를 포함하고, 상기 제3 치료제는 비타민 C, 아스코르빌 팔미테이트, 및 아스코르베이트 유도체 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
  45. 청구항 44에 있어서,
    상기 제1 지방산 및 제2 지방산 중 적어도 하나는 미리스트산인 방법.
  46. 아지쓰로마이신 및 아지쓰로마이신과 제1 지방산의 접합체로부터 선택된 제1 치료제, 독시사이클린 및 독시사이클린과 제2 지방산의 접합체로부터 선택된 제2 치료제, 및 비타민 C, 아스코르빌 팔미테이트 및 아스코르베이트 유도체로부터 선택된 제3 치료제를 포함하는 약학적 조성물.
  47. 청구항 46에 있어서,
    상기 제1 치료제는 하기 화학식의 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아지쓰로마이신과 제1 지방산의 접합체인 약학적 조성물:
    Figure pct00057

    Figure pct00058

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00059

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00060

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00061

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00062

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00063

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다); 및
    Figure pct00064

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다).
  48. 청구항 46에 있어서,
    상기 제2 치료제는 하기 화학식의 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 독시사이클린과 제2 지방산의 접합체인 약학적 조성물:
    Figure pct00065

    Figure pct00066

    Figure pct00067

    Figure pct00068

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00069

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다);
    Figure pct00070

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다); 및
    Figure pct00071

    (상기 식에서, n은 1 내지 20의 정수이다).
  49. 큰 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 제1 치료제로 미토콘드리아 생물발생을 억제하는 단계;
    작은 미토콘드리아 리보좀을 표적화하는 제2 치료제로 미토콘드리아 생물발생을 억제하는 단계; 및
    제3 치료제로 미토콘드리아 산화성 스트레스를 유도하는 단계;를 포함하는 노쇠의 시작을 예방하거나 지연시키는 방법.
  50. 청구항 49에 있어서,
    상기 제1 치료제는 아지쓰로마이신 및 아지쓰로마이신과 제1 지방산의 접합체 중 하나이고, 상기 제2 치료제는 독시사이클린 및 독시사이클린과 제2 지방산의 접합체 중 하나이고, 상기 제3 치료제는 비타민 C, 아스코르빌 팔미테이트, 및 아스코르베이트 유도체 중 하나인 방법.
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