WO1998039438A1 - Composes antisens diriges contre cd14 - Google Patents

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WO1998039438A1
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nucleic acid
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base
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PCT/JP1998/000953
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Shoji Furusako
Yoshifumi Horisawa
Takeshi Kusuyama
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Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide containing a sequence complementary to a part of a gene encoding human CD14. Further, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the oligonucleotide and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Bacterial infection-associated sepsis is a fatal disease that kills 500,000 people and kills 175,000 people in the United States, and has no established effective treatment.
  • LPS lipopolysaccharide
  • antibiotics are used to protect against bacterial infections, but it has also been reported that these antibiotics destroy cells and release large amounts of LPS into the blood (Scand. J. Infect. Dis., Volume 101, page 3, 1996). This means that the use of antibiotics can instead cause septic shock or endotoxin shock. Therefore, it is important to block LPS stimulation together with antibiotics to prevent shock.
  • CD14 is a phosphatidylinositol-linked glycoprotein with a molecular weight of 55 kd that is expressed as bone marrow cells undergo differentiation and maturation. -Verlag, pp. 424-433, 1984). At present, CD14 has been found to be present on macrophages, monocytes, Kupffer cells and neutrophil membranes.
  • the DNA sequence of human CD14 was reported by Goyert et al. In 1988 (Nucleic Acid Research, Vol. 16, No. 9, pp. 417, 1988).
  • the mouse CD14 DNA sequence was reported by Yamamoto et al. (1988) (Somat. Cell Mol. Genet., 14, 427, 1988).
  • the CD14 gene is involved in the differentiation and maturation of hematopoietic tissues, which is present in gene clusters containing hematopoietic tissue differentiation and growth factors such as chromosome I3 and GM-CSF and G-CSF It was suggested that the details of the function are unknown. In 1990, Wright et al.
  • CD14 was a receptor for LPS of Gram-negative bacillus endotoxin (Wright et al., Science 249: 1431, 1991). It has been clarified that 14 binds not only to LPS but also to proteoglycan (Gupta et al., J. Biol. Chem. 271, 38, 231, 310, 1996). It has also been reported that the cell components of Gram-negative and Gram-positive bacteria activate cells via CD14 (Jerome et al., I recitation unityl vol.
  • CD14 when a living body is infected with a bacterium, CD14 binds to a cell component, thereby activating macrophages ⁇ monocytes expressing CD14, and various inflammatory factors (inflammation). Sex cytokines, such as TNFa,
  • LPS aggregates derived from bacterial cells form a complex with LPS-binding protein (LBP) in blood, and can efficiently bind to CD14 molecules on macrophages one-to-one as single LPS.
  • LBP LPS-binding protein
  • Become like LPS bound on the cell surface transmits a signal to cells via an unidentified pathway similar to ceramide, activates the transcription factor NFB in the cell, and activates various proteins including TNF.
  • Induction of tocaine is induced (UlevUh et al., Annual Review of Immunology, 13, 437, 1995).
  • CD14 molecules there are two types of CD14 molecules, a membrane-bound type and a soluble type.
  • the production of soluble CD14 is thought to be a soluble form when the membrane-bound CD14 is cleaved by a protease (Philip et al., Eur. J. Immunol. 25: 604).
  • Japanese Patent Application Publication No. 5-501139 discloses a method for treating sepsis using an anti-CD14 antibody.
  • Anti-CD14 antibody blocks binding of CD14 to LPS, allows to block CD14-mediated signals, suppresses inflammatory cytokines, and thus treats sepsis .
  • W093 / 19.772 and W096 / 2057 disclose the treatment of sepsis using a soluble form of CD14.
  • the present inventors have repeatedly studied to provide a pharmaceutical composition having a higher effect on septic shock.
  • the prognostic role of inflammatory cytokines produced by liver cells from LPS stimulation by LPS stimulation was predicted to play an important role, and soluble CD1 involved in LPS removal was predicted.
  • Alveolar macrophages ⁇ peritoneal macrophages that contribute to the protection of bacterial infection at each site, and CD14 on other macrophages in a manner that does not affect CD14.
  • blocking specifically the binding of CD14 to LPS would be therapeutically effective.
  • using antisense oligonucleotides that accumulate in the liver would act with high selectivity on CD14 on liver Kupffer cells.
  • Mouse liver Kupffer cells normally express CD14 extremely weakly, but are known to express CD14 strongly when stimulated by LPS.
  • the liver is the organ most susceptible to shock, and it is known that a decrease in liver function has a major effect on systemic symptoms.
  • the present inventors have been based on a new viewpoint of selectively suppressing CD14 of liver Kupffer cells whose expression is induced by LPS stimulation, and mainly suppressing the production of inflammatory cytokines from Kupffer cells.
  • antisense oligonucleotides of CD14 can suppress the expression of CD14 to the extent that they can be used as pharmaceuticals and can be applied to the treatment of sepsis
  • the present inventors have eagerly studied.
  • CD 14 It was confirmed that solidigonucleotides can be used as pharmaceuticals.
  • the present inventors have succeeded in determining a region that is particularly effective as a target of antisense oligonucleotide among the approximately 1.4 kb gene encoding CD14 by the following method.
  • the 5 'untranslated region and translation initiation region were tested for translation inhibition experiments using the human CD14 luciferase fusion protein expression system, CD14 protein expression inhibitory activity by recombinant HeLa cells, and TNFa by human macrophage-like cultured cells.
  • the active region was identified by combining the production inhibitory activities.
  • the active region is introduced by introducing screening using RNaseH, which specifically cleaves the bond between the target RNA and the antisense oligonucleotide. Successfully identified.
  • RNaseH specifically cleaves the bond between the target RNA and the antisense oligonucleotide.
  • the present invention provides an oligonucleotide that hybridizes with at least a part of the gene encoding human CD14.
  • oligonucleotides containing a sequence complementary to at least a part of the gene encoding human CD14 are preferred.
  • the present invention provides an oligonucleotide comprising a sequence complementary to each of at least a part of the 5 ′ untranslated region, translation initiation region, translated region or 3 ′ untranslated region of human CD14 mRNA.
  • Base position 23 40 bases from cytosine at position 3 to adenine at position 62 Array
  • Base position 22 Base sequence from guanine at position 1264 to cytosine at position 1285
  • the present invention provides an oligonucleotide that hybridizes with at least one selected sequence or at least a part of any one selected sequence, or an oligonucleotide having a base sequence complementary thereto.
  • oligonucleotides that can suppress the expression of human CD14 are preferred.
  • an oligonucleotide having high binding activity to the human CD14 gene in an RNaseH cleavage experiment and an oligonucleotide capable of suppressing the expression of human CD14 by 30% or more in a translation inhibition experiment are preferable.
  • the number of bases of the oligonucleotide of the present invention is preferably any of 10 to 50, and particularly preferably any of 15 to 30.
  • the present invention also provides oligonucleotides in which at least one of the internucleotide linking groups comprises an iodo atom.
  • the present invention relates to SEQ ID NOS: 10, 11, 12, 13, 16, 19, 20; 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 , 58, 59, 61, 62, 63, 64, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 83, 85, 86 , 87, 88, 89, 90, 102, 103, 109, 123, 124, 125, 130, 135, 136, 137, 138, 144, 155 , 1 56, 1 59, 1 60, 1 61, 1 62, 1 63, 1 64, 1 65,
  • the present invention provides an oligonucleotide comprising at least one base sequence selected from the group consisting of 246, 247, and 248 and comprising 30 or less bases.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an oligonucleotide that hybridizes to a gene encoding CD14 as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may contain, in addition to the oligonucleotides that hybridize to the gene encoding CD14, In addition, it contains a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition is preferably a prophylactic / therapeutic agent for sepsis or septic shock or a disease caused by an inflammatory factor induced via CD14.
  • FIG. 1 shows the CD14 translation inhibitory activity of antisense oligonucleotides against a gene encoding human CD14.
  • FIG. 2 shows the effect of the antisense oligonucleotide on the gene encoding human CD14 depending on the nucleotide length.
  • FIG. 3 is a view showing human TNF production inhibitory activities of antisense oligonucleotides against the 5 ′ untranslated region of mRNA for human CD14 and the region near AUG.
  • FIG. 4 is a diagram showing the activity of an antisense oligonucleotide against the 3 ′ untranslated region of mRNA for human CD14 to suppress the production of human TNF.
  • FIG. 5 is a graph showing the mouse TNF ⁇ production inhibitory activity of antisense oligonucleotides against the 5 ′ untranslated region of mRNA for mouse CD14 and the region near AUG.
  • FIG. 6 shows the effect of oligonucleotide SM0105A in an endotoxin shock model.
  • FIG. 7 shows the effect of oligonucleotide SM0105A on liver function in an endotoxin shock model.
  • FIG. 4 is a graph showing the activity of inhibiting human CD14 luciferase fusion protein expression in humans.
  • FIG. 9 is a graph showing the inhibitory activity of antisense oligonucleotides against the translation region of mRNA on human CD14 for human TNF production.
  • FIG. 10 is a diagram comparing the nucleotide sequences of a human antisense oligonucleotide and a mouse antisense oligonucleotide in the vicinity of the translation initiation region. '
  • FIG. 11 shows the activity of the consensus oligonucleotide to inhibit the expression of human CD14 luciferase fusion protein.
  • FIG. 12 is a diagram showing the activity of the consensus oligonucleotide to suppress mouse TNF ⁇ production. Summary of the Invention
  • the oligonucleotide of the present invention hybridizes to at least a part of the gene encoding human CD14.
  • oligonucleotides containing a sequence complementary to at least a part of the gene encoding human CD14 are preferred.
  • oligonucleotide includes all oligonucleotides having a plurality of nucleotides consisting of a base, a phosphate, and a sugar, and all derivatives thereof.
  • Representative oligonucleotides are DN ⁇ and RN ⁇ .
  • Oligonucleotide derivatives include all those whose three-dimensional structure and function are similar to those of oligonucleotides.
  • a substance in which another substance is bonded to the 3 'end or 5' end of the oligonucleotide, a substance in which substitution or modification has occurred in at least one of the base, sugar, and phosphate of the oligonucleotide, and a natural substance Does not exist in Examples thereof include those having a base, sugar, and phosphoric acid, and those having a skeleton (backbone) other than the sugar monophosphate skeleton.
  • gene means chromosomal DNA or its transcript (mRNA and its precursor), and “gene encoding CD14” defines the amino acid sequence of CD14. And the intervening sequence (intron) in the middle of the structural gene, and the base sequence upstream of the structural gene (such as promoter and operator) and the base sequence downstream of the structural gene involved in CD14 expression. means. Representative sequences of the gene encoding human CD14 are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing.
  • hybridize means to form a specific bond between bases to DNA or RNA.
  • the strength of the hybrid solution is 0.15 M phosphate buffer having a Tm value of 45 ° C. or more, and more preferably a Tm value of 55 ° C. or more.
  • Specific binding is generally formed by complementary binding, but here, the binding mode does not matter. That is, the oligonucleotide of the present invention does not necessarily need to have a sequence completely complementary to the target sequence as long as it specifically binds to at least a part of a gene encoding human CD14. It may contain a universal base typified by inosine or 5-nitroindole, or may partially contain a base or sequence that is not a complementary sequence.
  • complementary sequence refers to a sequence that forms a base-specific complementary base pair with the base sequence of DNA or RNA. Refers to base pairs. In general, complementary base pairs are formed between C (cytosine) and G (guanine), between T (thymine) and A (adenine), and between U (peracyl) and A (adenine). You.
  • the oligonucleotides of the present invention preferably hybridize to at least a portion of the human CD14mRNA or mRNA precursor.
  • the length of the oligonucleotide of the present invention is not particularly limited. In general,
  • a base sequence containing 10 or more bases is considered a specific sequence. Therefore, if the oligonucleotide of the present invention contains a nucleotide sequence consisting of 10 bases or more, it is expected to specifically hybridize to the gene encoding human CD14.
  • the oligonucleotide of the present invention may be of any length, but considering that the oligonucleotide of the present invention is taken up into cells and suppresses the expression of human CD14, the gene encoding human CD14 is considered. Those having a base number of 10 to 50 bases, preferably 15 to 30 bases are preferable.
  • the oligonucleotide of the present invention may target a gene encoding human CD14, preferably any site of mRNA encoding human CD14 or a precursor thereof. That is, the site to which the oligonucleotide of the present invention binds is not particularly limited.
  • the oligonucleotide is used for the translation initiation region, translation region, 5 'untranslated region, 3' untranslated region, ribosome binding region, cabbing region, splicing region, hairpin of mRNA or pre-mRNA. It is preferable to bind to any of the loop portions forming the loop structure.
  • the translation initiation region of human CD14 mRNA is suitable as a target of the oligonucleotide of the present invention in terms of its effect, and the translation region is assumed to accumulate the oligonucleotide of the present invention in the nucleus. preferable.
  • the oligonucleotide of the present invention comprises a human CD shown in SEQ ID NO: 1.
  • the target is designed to target a region consisting of any sequence selected from the following (1) to (19) in the mRNA for 14:
  • Base position 23 Base sequence of 40 bases from cytosine at position 3 to adenine at position 62
  • Nucleotide sequence of 40 bases from adenine No. 1 to No. 1 guanine at No. 1 Nucleotide sequence of 22 bases from guanine at position 1264 to cytosine at position 1285
  • the region consisting of the nucleotide sequence of (19) is considered to be particularly effective as a target of the oligonucleotide of the present invention.
  • oligonucleotide of the present invention include oligonucleotides that hybridize with any of the sequences selected from the above (1) to (19), or any of the oligonucleotides selected from the above (1) to (19)
  • An oligonucleotide that hybridizes with at least a part of the sequence preferably (1), (2), (4), (5), (7), (8), (11), (16), (1), (2), (4), (5), (7), (8), (11), oligonucleotides selected from the base sequence of (19) and hybridizing with any sequence.
  • (16) and (19) are oligonucleotides that hybridize with at least a part of the sequence.
  • These oligonucleotides are preferably oligonucleotides consisting of 10 to 50 bases.
  • a preferable example of the oligonucleotide of the present invention hybridizes to a continuous base sequence of 10 or more in the base sequence of any of the above (1) to (19) or has a complementary base sequence Oligonucleotides.
  • (1) to (3) are located in the region from the 5 'untranslated region of the mRNA for human CD14 to the translation initiation site, and (8)
  • (19) is in the translation region, and (4) to (7) are in the 3 'untranslated region.
  • the oligonucleotide of the present invention preferably has an activity of suppressing the expression of human CD14.
  • the present inventors have found that the RNaseH cleavage experiment is effective as an index for selecting a more effective oligonucleotide in suppressing the expression of CD14 as shown in Example 13. Was. Therefore, the oligonucleotides of the present invention can be used in an RNaseH cleavage experiment in an oligonucleotide that hybridizes with at least a part of the mRNA of human CD14 or has an complementary sequence. Those described above are preferred.
  • human CD 14 Oligonucleotides that can suppress human CD14 expression by 20% or more, preferably 40% or more in experiments to inhibit the expression of luciferase fusion protein. Oligonucleotides and oligonucleotides that can inhibit the translation of CD14 by 30% or more in a CD14 translation inhibition experiment by an in vitro translation reaction are preferred. '
  • the present invention relates to SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 16, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 3 3, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 5 7, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 102, 1 103, 109
  • an oligonucleotide having at least one base sequence selected from the group consisting of 246, 247, and 248.
  • the oligonucleotide is an oligonucleotide having the above base sequence and preferably having 30 or less bases.
  • oligonucleotide derivatives having high binding strength to target DNA or mRNA, tissue selectivity, cell permeability, nuclease resistance, and high intracellular stability have been obtained.
  • the oligonucleotides of the present invention include all kinds of derivatives, including those composed of bases, sugars, phosphates, and backbone structures that do not exist in nature.
  • Examples of the derivatives included in the present invention include, as a backbone structure, a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a methylphosphonate bond, Phosphoramidate bond, phosphorocthioate bond, derivative having morpholino group, etc. (Yoko Tokai Hayashi, etc., Cancer and Chemotherapy, Vol. 20, 1989-1989) P., 1993).
  • deoxyribonucleotide guanidine (Robert P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6097, 1995) and 2 ′ of sugar Derivatives are also examples of derivatives in which the sugar moiety is modified, such as those in which the position is substituted by another atom or substituent, or -ribose (Bertrand JR. Biochem. Biophys. Res. Commun). 16 4th volume, 311 pages, 1989).
  • the sugar moiety has been replaced with another substance, and some bases have Substituted with a reversal base (base that binds to any of A, T, C, and G), cholesterol diacridine, poly-L-lysine, at the 5 'end or 3' end or inside of the oligonucleotide Oligonucleotide derivatives such as those having psoralen, long-chain alkyl, etc. bound thereto are also included in the present invention.
  • the present invention provides, as a preferable example of the above derivative, a derivative having a phosphorothioate bond as a backbone structure, that is, an oligonucleotide in which at least one of the bonding groups between nucleotides contains an ⁇ atom.
  • the oligonucleotide of the present invention hybridizes to the above-mentioned target sequence, it completely matches the partial base sequence of the target region. It need not contain complementary sequences. Conversely, considering that animal experiments are indispensable for drug development, hybrids that hybridize to the gene encoding human CD14 and hybridize to the gene encoding CD14 in model animals are also considered. Rigonucleotides will be useful. Such oligonucleotides can be prepared by targeting a region of high homology in the nucleotide sequence of the gene encoding CD14 of human and model animals. For example, the nucleotide sequence of the gene encoding mouse CD14 is shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing.
  • the gene encoding mouse CD14 can be Oligonucleotides that also hybridize to the gene encoding CD14 can be made.
  • an oligonucleotide can be produced that hybridizes to the gene encoding CD14 of any two or more species of human and non-human animals.
  • those that can be expected to have the activity of suppressing the expression of CD14 can be designed by targeting a region consisting of the following nucleotide sequences (1) to (9).
  • oligonucleotide in order to increase the complementarity of the oligonucleotide to CD14 of humans and non-human animals, it may be a target including several bases downstream and several bases upstream of these regions.
  • antisense oligonucleotides include a base sequence complementary to any one of the following base sequences (1) to (9), and at least one or more of the base sequences Oligonucleotides having a base sequence in which a group is substituted on a universal base are mentioned.
  • a base sequence complementary to an arbitrary portion consisting of a continuous base sequence of 10 or more in any base sequence selected from the following (1) to (9) one or more Oligonucleotides having a base sequence in which a base is substituted on a universal base are mentioned. '
  • SEQ ID NO: 1 20 bases from adenine at position 24 to cytosine at position 343
  • oligonucleotide having an entire partial sequence selected from the following (10) to (18), or an arbitrary partial sequence consisting of 10 or more continuous bases therein: . These sequences have been designed to hybridize to human, mouse, and monkey CD14mRNA. '
  • oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256 and 257 are No.
  • Oligonucleotides and derivatives thereof can be produced by known methods (for example, S. A grawal et al., Protocols, etc., Protocolforoli go nu cleotidesand An alogs.Methodin Molecular Biologyseries, Vol. 20, Huma na Press, S. Agrawal et al. Antisense Research and Develo pment 4, 185, 1994).
  • Natural DNA and RNA can be synthesized using a chemical synthesizer, or the oligonucleotide of the present invention can be obtained by the PCR method using a gene encoding human CD14 as type III.
  • Some derivatives such as methylphosphonate type and phosphorothioate type, can be synthesized using a chemical synthesizer (for example, Model 394, manufactured by PerkinElmer Japan Co., Ltd.). In this case, it is also possible to carry out the operation according to the manual attached to the chemical synthesizer and to purify the obtained synthetic product by the HPLC method using reverse phase chromatography or the like.
  • the target oligonucleotide derivative can be obtained.
  • Oligonucleotides that hybridize with at least a part of the gene encoding human CD14 were synthesized from the oligonucleotides synthesized by the method described above in a translation inhibition experiment using a human CD14 luciferase fusion protein expression system. The effect can be confirmed. In addition, the effect of suppressing the expression of inflammatory factors induced through human CD14 can be confirmed using a cell evaluation system.
  • This cell evaluation system treats THP-1 cells with PMA and vitamin D3 to induce differentiation into macrophage-like cells, stimulates TNF production by LPS stimulation, and induces various oligonucleotides. To evaluate the effectiveness of the oligonucleotide using as an index whether TNF ⁇ production is inhibited.
  • the oligonucleotides of the present invention are evaluated and selected using recombinant cells that express human CD14, using the activity of inhibiting the expression of human CD14 as an indicator. Alternatively, evaluation and selection are performed using the binding activity value in the RNaseH cleavage experiment as an index. '
  • the oligonucleotide of the present invention is characterized by binding to a gene encoding human CD14, it can be used as a diagnostic probe for detecting the human CD14 gene in a sample.
  • the oligonucleotides of the present invention are labeled with a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance or the like according to a known method.
  • DNA or mRNA is prepared from the cells of the patient whose CD14 expression is to be examined by a known method, and this is used as a test substance. Remove the probe. If the test substance contains human CD14 DNA or RNA, the labeling probe binds to them. The presence or absence of bond formation can be determined by using, as an index, luminescence, fluorescence, radioactivity, or the like by a labeled enzyme, fluorescent substance, luminescent substance, or radioisotope.
  • the oligonucleotide of the present invention can be used as a diagnostic probe to detect an increase or decrease in the expression level of CD14 in each tissue or cell in response to an external stimulus, or to detect a disease caused by an inflammatory factor generated through CD14.
  • a disease caused by an inflammatory factor generated through CD14 Specifically, systemic inflammatory response syndrome, sepsis and shock, ulcerative colitis, Crohn's disease, autoimmune reactions and diseases, allergic diseases, cancer, graft-versus-host disease, periodontal disease or osteoporosis, etc. It can be used for diagnosis. It can also be used for diagnosis to determine the degree of inflammation, treatment, and prognosis.
  • the oligonucleotide of the present invention When used for pharmaceutical applications, it is administered to the human body with a purity suitable for use as a pharmaceutical, together with pharmacologically acceptable additives, if necessary. Use in a dosage form suitable for The details are described in the section of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the above-described oligonucleotide of the present invention as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention also contains, as an active ingredient, an oligonucleotide capable of binding to a gene encoding human CD14 and suppressing the expression of human CD14.
  • the pharmaceutical composition may be used by dissolving or suspending an oligonucleotide having a purity suitable for use as a pharmaceutical directly in an appropriate solvent, or may be encapsulated in ribosomes or incorporated in an appropriate vector. May be used.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is added to the oligonucleotide of the present invention, and an appropriate agent such as an injection, tablet, capsule, eye drop, cream, suppository, spray, cataplasm, etc. It may be used as a mold.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include solvents, bases, stabilizers, preservatives, solubilizers, excipients, buffers and the like.
  • CD14 is an LPS receptor present on macrophages, monocytes, Kupffer cells and neutrophil membranes. Bacterial infection is thought to activate macrophages and neutrophils via CD14 and induce inflammatory factors. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention containing an oligonucleotide that suppresses the expression of human CD14 as an active ingredient is induced by inflammatory factors generated through CD14.
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • endotoxemia is a typical example.
  • intestinal mucosa may increase intestinal mucosal permeability and endogenous LPS may enter (Ravin A. et al., F. Ed. Proc. 21: 1, 65, 1962).
  • posttraumatic shock can decrease mesenteric arterial blood flow, disrupt the intestinal physiologic barrier, and cause bacterial translocation to cause endotoxemia due to endogenous LPS.
  • the oligonucleotide of the present invention When the oligonucleotide of the present invention is in the above-described dosage form, its administration method and dosage can be set and used according to the age, sex, type and degree of disease of the patient. . That is, an amount suitable for regulating CD14 expression and improving the disease state is orally or parenterally administered. For example, 0.001 to 2000 mg / kg is administered continuously, or once or several times a day. In the case of intravenous injection, 0.01 to 10 Omg / kg is preferable. In addition, the oligonucleotide of the present invention is sufficiently safe at the above-mentioned dosage. Oral administration includes sublingual administration.
  • Parenteral administration is appropriate from inhalation, transdermal administration, ophthalmic administration, vaginal administration, intraarticular administration, rectal administration, intraarterial administration, intravenous administration, topical administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, etc. Choose and administer.
  • THP-1 cells 7. 1 X 1 0 5 eells / we ll 2 Ueru and fin incubation at 6 Ueru play Bok to implantation overnight 3 7 ° C. 1 a, 25_DihydroxyvitaminD 3 (manufactured by BIOMOL Research) was added to a final concentration of 0.1 M, and the cells were further cultured overnight. Collect THP-1 cells and lml IS OG EN
  • RNA was extracted using (TE LTE ST) according to the protocol.
  • a cDNA library was prepared using Superscript Preamplification System (manufactured by GIBCO) with the RNA extracted using oligo dT primers as type III.
  • the pUC118 cut fragment and the PCR amplified DNA fragment were mixed at a ratio of 2: 1 and a ligation reaction was carried out using a Ligation kit (Takara).
  • this reaction solution was transfected into JM109 cells, seeded on an agar plate, and incubated at 37 ° C. The resulting plaque was collected and confirmed to be the target recombinant (PUCH14P-4 plasmid) by PCR.
  • p GEM1 uc H14—9 plasmid was used as type III, and a sense primer (5 'CCCAAGCTTAAGTGTGAAGCCTGAA GCCGCCGG 3'; SEQ ID NO: 7), an antisense primer (5 'ATGGCGCCGGGCCTTTC TTTATGTTTTTGGCGTCTTCCAGTTGC 3; SEQ ID NO: 8) were used. PCR reaction was performed.
  • the reaction product was ethanol precipitated and digested with Bbe I and Hind I I restriction enzymes, respectively.
  • the PGEM1u cDNA fragment previously treated with both restriction enzymes and the PCR amplification product were ligated according to a conventional method, cloned using HB101 cells, and pGEM1uc (ctg) H14-3 was obtained. Obtained.
  • Phosphodiester oligonucleotides and phosphoroyl used in the following examples As for the oligonucleotide, a preparation purified by a 0PC column was obtained by outsourcing synthesis to Sadei Technology Co., Ltd. In addition, the phosphorothioate oligonucleotide used in Examples 10 and 11 was obtained from Micro Bondasphere C8.
  • control oligonucleotides used in the following examples a random sequence of phosphodiester oligonucleotides obtained by mixing four types of amidites and performing random DNA synthesis without specifying the sequence was used. Or a mixture of phosphorothioate oligonucleotides.
  • the in vitro transcription reaction was performed using a Ribo max system (promega) according to the attached method.
  • pGEM1uc (ctg) H14—3 plasmid was digested with Xh0I and the ends were blunt-ended with Klenow fragment. Then, using this 20 g of pGEM1uc (ctg) H14-3 as a template and incubating with SP6 polymerase in the presence of 7-methylguanidine at 37 ° C for 4 hours, in vitro A transcription reaction was performed. The reaction was treated with DNase and extracted with phenol. The reaction solution was precipitated with ethanol, and the resulting RNA pellet was air-dried and dissolved in distilled water. The synthesized RNA was confirmed to be a 1.4 kb single band by denaturing agarose electrophoresis.
  • the in vitro translation reaction was performed according to the attached method using a Promega Rabbit Reticulocyte Lysate System. That is, the synthesized pGEM1uc (ctg) HI4-3 RNA and the unmodified oligonucleotide to be tested were mixed at a ratio of 1 to 10, and heated at 60 ° C for 2 minutes. Thereafter, an amino acid and Rabbit Reticulocyte Lysate were added to the mixture, and the mixture was incubated at 30 ° C for 2 hours.
  • the reaction mixture of 101 and an equivalent amount of a luminescent substrate solution (luciferase assay system: Promega) were mixed, reacted at room temperature for 5 seconds, and the luminescence intensity of the reaction solution was measured using a luminometer (LumatLB96P).
  • Figure 1 shows the results. Translation inhibition activity was calculated assuming that the amount of fluorescence upon treatment with a control oligonucleotide (20-mer phosphodiester oligonucleotide having a random sequence) was 100%.
  • the cells were again transformed to 40 ng / m 1 of 1a, 25-Dihydroxy v ami nD 3 (BI0M0L (Manufactured by Research Inc.) in the presence of 10% RPMI 1640 medium containing inactivated fetal bovine serum for 20 hours. After washing the cells, the cells were replaced with RPMI1640 containing 2% human serum supplemented with 1 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) (E. coli 055: B5. Difco). After incubation for 4 hours, the culture supernatant was collected. TNF in the culture supernatant was measured using a human TN Fa ELISA System (Amersham). '
  • TNF ⁇ was measured according to the protocol attached to the human TNF ELISA SYSTEM. That is, the appropriately diluted culture supernatant 50a1 was transferred to a reaction plate, a 50 ILL 1 biotinylated antibody solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. The reaction solution was removed, and each well was washed three times with a washing solution of 400 zl / we11. 1001 of an appropriately diluted peroxidase-labeled streptavidin solution was added, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes. After washing, the chromogenic substrate 1001 was added and reacted for 15 minutes. A stop solution 1001 was added to stop the reaction, the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured, and the TNF value in the sample was calculated. Figure 3 shows the results.
  • the TN Fa production inhibitory activity is as follows: Detected in SH0124A and SH0126A. This result correlated well with the result of the oligonucleotide showing the translation inhibitory activity of Example 4.
  • Active region 1 was indicated by an oligonucleotide that binds complementarily to a portion of the sequence of CUGGAAGCCGCCGGGUGCCGCUGUGUAGGAAAGAAGCUAAA.
  • Active area 2 is GGUUCGGAAGACUUAUCGACCA It was indicated by an oligonucleotide that binds complementarily to a part of the sequence of UGGAGCGCGCGUCCUGC.
  • the active region 3 overlaps with the active region 2 and is indicated by an oligonucleotide that complementarily binds to a part of the sequence of GAGCGCGUCCUGCUUG UUGCUGCUGCU.
  • FIG. 4 shows the results of an experiment on the inhibition of TNF ⁇ production of an oligonucleotide on the 3 ′ untranslated region of human CD14mRNA in the same manner as in Example 7.
  • the TNF production inhibition activity was as follows: SH1241A, SH1256A, SH1259A, SH1261A, SH1264A, SH1265A, SH1266A, SH1267A, SH1268A, SH1269A, SH1270A, SH1271A, SH1273A, SH1276A, SH1281A, SH1281A, SH1281A, SH1291A, SH1281A and SH1281A.
  • Active region 4 was indicated by an oligonucleotide that complementarily binds to part of the sequence of AGAUCCAAGACAGAAUAAUGAAUGGACUCAAACU GCCUUG.
  • Active region 5 was indicated by an oligonucleotide that binds complementarily to a portion of the sequence of GGACUCAAACUGCCUUGGCUU. Further, active region 6 overlaps with active region 5 and is indicated by an oligonucleotide that complementarily binds to a part of the sequence of CUCA AACUGCCUUGGCUUCAGGGGAGUCCCGUCAGGACGUUGAGGACUUUUCGA. Furthermore, active region 7 was indicated by an oligonucleotide that complementarily binds to a part of the sequence of GGACGUUGAGGA CUUUUCGACCAAUUCAACCCUUUGCCCCACCUUAUUA.
  • J774A.1 Cells were suspended in DMEM medium containing 10% inactivated fetal bovine serum, and And cultured implant 2 4 hours 2 4 Uwerupureto in 1 0 5 eel ls / well. The medium was replaced, and the oligonucleotide solution was added to the culture solution to a final concentration of 100 nM. After incubation for 4 hours, the culture supernatant was removed and the cells were washed. The cells were cultured for 20 hours in RPMI 1640 medium containing 10% inactivated fetal bovine serum. After washing the cells, lipopolysaccharide (LPS) (E.
  • LPS lipopolysaccharide
  • coli 0111: B4, manufactured by DIFC0 was added to a final concentration of 100 ng / 'm1. It was replaced with DMEM containing 2% mouse serum. After incubation for 4 hours, the culture supernatant was collected. TN Fa in the culture supernatant was measured using a mouse TNFa ELISA system (Amersham).
  • TNF ⁇ The measurement of TNF ⁇ was performed according to the protocol attached to the mouse TNF aELISA SYSTEM. That is, 50 n1 of the appropriately diluted culture supernatant was transferred to a reaction plate, and a 50i1 biotinylated antibody solution was added thereto, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. The reaction solution was removed, and each well was washed three times with a washing solution of 4001 / we11. A strobavidin solution labeled with appropriately diluted peroxidase was added in a quantity of 1001, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes. After washing, 1001 of the chromogenic substrate was added and reacted for 15 minutes. The reaction was stopped by adding 100 l of stop solution, and the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured to calculate the TNF maximum value. The results are shown in FIG.
  • Mouse TNF production inhibitory activity is determined by antisense compounds having a complementary sequence near the translation initiation region of mouse CD14 mRNA, such as SM0101-0220A, SM0102A-25mer, SM0103A-25mer, SM0104A-25mer, SM0105A-25mer, Strong activity was detected with SM0106A-25mer, SM0107-0226A_25mer and SM0109-25mer.
  • Antisense oligonucleotides to the gene encoding mouse CD14 The following experiment was performed using SMO105A-21mer.
  • mice Six-week-old B a 1 b / c male mice (manufactured by Charles River Japan Co., Ltd.) were divided into seven groups (10 mice per group) based on body weight. After that, SMO105A oligonucleotide was 3 mg / kg to 0.3 mg / kg, and control mouth / oligonucleotide / nucleotide (21-mer phosphoronucleotide oligonucleotide having random sequence) was 3 mg / kg. 0.3 mgZkg or physiological saline 10 ml / kg (for negative control, Otsuka Pharmaceutical) was administered once via the tail vein.
  • the method was performed according to the method of Matsumoto, T. et al. (FBMS Immunology and Medical Microbiology 17, 171-178 (1997)).
  • CPA cyclophosphamide
  • 5 mg of iota carrageenan (Sigma) dissolved in physiological saline was intraperitoneally administered.
  • LPS LPS
  • coli 127: B8, manufactured by Difco was administered from the tail vein at a dose of 30 g / kg in the tail vein 12 hours after administration of i-carrageenin, and heparin was administered 1 and 24 hours after LPS administration.
  • Plasma was collected by centrifuging blood collected from the fundus vein using a glass capillary (Dru-Ond Scientific Company) that had been treated with a solution (1000 IU / mK Mochida Pharmaceutical) to collect GPT activity.
  • a solution 1000 IU / mK Mochida Pharmaceutical
  • mice compared to the 50% survival rate in the solvent administration group, the SM0105A administration group and the prednisolone administration group showed a 100% survival rate.
  • the SM 0105 A administration group significant suppression of GTP in the liver and suppression of elevation were found, but such an effect could not be confirmed in the prednisolone administration group (FIG. 7).
  • Example 11 Acute toxicity in mice
  • mice Six-week-old B a 1 b / c male mice (manufactured by Charles River Japan, Inc.) were divided into two groups (four in each group) based on body weight. Then, add SM0105A and control oligonucleotide (21-mer phosphorothioate oligonucleotide with random sequence) to 30 mg / kg or saline 1 Oml / kg (for negative control), respectively. , Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) was administered once via the tail vein. Thereafter, the survival rate or blood G0T value was measured over time until day 7.
  • a human CD14 luciferase fusion protein expression plasmid (pMl651) was constructed. That is, the gene fragment cut with HindiII and XhoI from pGEM1ucH14-9 prepared in Example 2 was transformed into HindIII / pcDNA3.1 (+) (Invitrogen). It was inserted into an XhoI site according to a conventional method, and cloned using JM109 cells to obtain pM1651.
  • HeLa cells a cell derived from human cervical cancer, to establish a HeLa recombinant cell line that expresses the human CD14 luciferase fusion protein.
  • the PML 6 5 1 1 0 ⁇ G after Ichi ⁇ cultures were introduced in calcium phosphate method.
  • the cells were cultured overnight in a DMEM medium containing 10% fetal calf serum.
  • Cells were seeded on a 96-well plate at 100 or 500 cells / well, and the following day, recombinant cell lines were selected in a medium containing G418.
  • G-4 ⁇ 8-resistant strains He1651d3-20 clones exhibiting luciferase activity were used to conduct an antisense protein expression inhibition experiment using antisense oligos.
  • HeLa recombinant cells (He1651d3-20) prepared in (1) were suspended in a DMEM medium containing 10% fetal calf serum and 0.6 mg / mL G-418. Then, the cells were inoculated into 24 ⁇ el plate at 1 ⁇ 10 5 ce 11 s / we 11 and cultured overnight. After washing twice with Otsuka physiological saline, Opti-MEM medium (Gibco BRL) was added at 450 zL / we11.
  • ribofectin and SEQ ID NOS: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, Oligonucleotides of 28, 29, 30, 32, 33, 35, and 37 were added to a final concentration of 100 nM, incubated at 37 ° C for 6 hours, and the culture supernatant was removed and washed.
  • the cells were further cultured again in DMEM medium containing 10% fetal calf serum and 0.6 mg / mL G-418. After washing the cells, the cells were lysed in Passive Lysis Buffer (Promega). Of these, 20 ⁇ L was used to measure the luciferase activity in the cell lysate.
  • Luciferase activity measurement was performed by Pr0mega Mouth protocol was followed. That is, the cell lysate and Luciferase Assay Reagent II (Promega) were mixed in a fluorescence measurement plate (Dynex, Microlite 2 plate), and the reaction was started. The emission intensity was measured. Luminome Yuichi (LB966P) from berth 01d was used for the measurement. The protein expression inhibitory activity of each oligonucleotide was calculated assuming that the luminescence intensity of the sample to which no oligonucleotide was added was 100%. Figure 8 shows the results.
  • Antisense oligonucleotides that exhibited 40% or more inhibitory activity in the 5 'untranslated region were SH0023A, SH0033A, SH0038A and SH0043A.
  • antisense oligonucleotides that exhibited 40% or more inhibitory activity in the translation initiation region are SH0102A, SH0104A, SH0105A, SH0106A, SH0107A, SH0108A, SH0109A, SH0112A, SH0114A, SH0117A, SH0118A, and SH0122A.
  • SH0126A The results of the protein expression inhibitory activity using these cells were in good agreement with the results of the CD14 translation inhibitory activity by the in vitro translation reaction of Example 5.
  • RNA for human CD14 obtained in Example 4 was mixed with the unmodified oligonucleotides to be tested shown in Table 3 at a molar ratio of 1: 1, and a 5-fold concentration of RNaseH buffer 11 and an appropriate amount were mixed.
  • distilled water was added to prepare a mixed solution of 41. This mixture was heated at 75 ° C., cooled, and 0.05 U of RNaseH was added, followed by a reaction at 37 ° C. for 15 minutes. The reaction was stopped by adding a stop solution (95% formamide, 0.5 mM EDTA pH 8.0, 0.025% SDS, 0.025% Xylene CyanoK 0.025% BPB) having a concentration twice as high as that of 10 ⁇ 1.
  • a stop solution (95% formamide, 0.5 mM EDTA pH 8.0, 0.025% SDS, 0.025% Xylene CyanoK 0.025% BPB
  • J8uigj 0 d 100V10V9DV10003ismism v ⁇ OHO
  • the antisense oligonucleotides for the translation initiation region were 0H0102A-15mer, 0H0104A-15mer, and 0H0114A-15mer. They were OH1254A-15mer, 0H1264A-15mer, 0H1304A-15mer, and 0H1314A-15mer. These oligonucleotides have a sequence complementary to a part of the active regions 2, 4, and 7, which are considered to be effective for inhibiting TNF ⁇ production from the results of the measurement of the human TNF d production inhibitory activity of Examples 7 and 8. It has. Therefore, the results of the RNaseH cleavage experiment were in good agreement with the results of the TNF ⁇ production inhibitory activity.
  • Example 13 With respect to the antisense oligonucleotide-binding region revealed in Example 13, a representative antisense oligonucleotide (see Table 5) was synthesized in each region by the method of Example 3 and the method described in Example 7 was used. evaluated. That is, SH0108A, SH0184A, SH0324A, SH0394A, SH0444A, SH0457A, SH0470A, SH0534A, SH0649 ⁇ , SH0714A, SH0720A, SH0809A, SH0864A, SH0899A, SH1014A, SH1074 ⁇ , SH1A, SH1199A, SH1A1 ⁇ ⁇ ⁇ —1 cells were treated at a concentration of 30 ⁇ ⁇ . After incubation for 4 hours, the culture supernatant was collected. TNF ⁇ in the culture supernatant was measured using a human TNF ELISA system (Amersham). I 9
  • ⁇ ZZ S d OVV3V0100V031031V311 V box HS
  • Active region 8 was demonstrated by the oligonucleotide SH0184A, which binds complementarily to a portion of the sequence of CUUGUGAGCUGGACGA.
  • Active region 9 was demonstrated by oligonucleotide SH0324A, which complementarily binds to a portion of the sequence of AAGCGCGUCGAUGCGGACGCCGACCCGCGGCAGUA.
  • Active region 10 was demonstrated by oligonucleotide SH0394A, which binds complementarily to a portion of the sequence of UCACAGUGGGAGCCG.
  • Active region 11 was represented by oligonucleotides SH0444A, SH0457A and SH0470A that complementarily bind to a portion of the sequence of CGUGUGCUAGCGUACUCCCGCCUCAAGGAACUGACGCUCGAGGAC.
  • the active region 12 was represented by the oligonucleotide SH0534A, which binds complementarily to a part of the sequence of GGACUUGCACUUUCC.
  • the active region 13 was represented by the oligonucleotide SH0649A, which binds complementarily to part of the sequence of UACUGAGCAUUGCCCAAGCACACUCGCCUGCCUUU.
  • the active region 14 was represented by oligonucleotides SH0714A and SH0720A that complementarily bind to a portion of the sequence of CGCGCCUUCCCGGCCCUUACCAGCCUAGACCUGUCUGACAAUCCUGGACUGGGCGA ACGCGGACUGAUGGCGGCU.
  • the active region 15 was indicated by the oligonucleotide SH0809A, which complementarily binds to part of the sequence of UCCAGAAUCUAGCGCUGCGCAACACAGGAAUGGAGACGCCCACAG.
  • Active region 16 is indicated by the oligonucleotide SH0899A, which complementarily binds to a part of the sequence of CCCCACAGCCUAGACCUCAGCCACAACUCGCUGCGCGCCACCGUAAACCCUAGCG.
  • the active region 17 was represented by the oligonucleotide SH1014A, which complementarily binds to part of the sequence of GACUGCCAGCCAAGCUCAGAGUGCUCGAUCUCAGCUGCAACAGACUGAACAGGGC.
  • Active region 18 was shown by SH1074A, which complementarily binds to a part of the sequence of GCUGCCCGAGGUGGAUAACCUGACACUGGACGGGAAUCCCUUCCU, and active region 19 was shown by oligonucleotides SH1199A and SH1204A, which complementarily bind to a part of the sequence of GUGUCGGGAACCCUGGUGCUGCUCC.
  • Oligonucleotides that bind to both the gene encoding human CD14 and the gene encoding CD14 from non-human animals are prepared by the following method. did.
  • the consensus oligonucleotides that exhibited an inhibitory activity of 40% or more were SU0103A-21mer, SU0104A-21mer, SU0105A-21mer, SU0106A-21mer, SU0107A-21mer, SU0108A-21mer, and SU0109A-21mer.
  • mice TNF ⁇ production inhibitory activity of SU0104A-21mer, SU0105A-21mer, SU0106A-21mer and SU0108A-21mer was measured.
  • the measurement was performed according to the method of Example 9 using RAW264.7 cells instead of J774A.1 cells, and TN Fa in the culture supernatant was measured using a mass TNF EUSA SYSTEM (manufactured by Amersham). .
  • the results are shown in FIG.
  • SU0104A-21mer, SU0105A-21mer, SU0106A-21mer and SU0108A_21nier had mouse TNF ⁇ production inhibitory activities of 24%, 33%, 54% and 69%, respectively.
  • the control oligonucleotide had 3% inhibition. From these results, it was found that SU0104A-21mer, SU0105A-21mer, SU0106A-21mer, and SU0108A-21mer are oligonucleotides having an effect on both mice and humans.
  • an oligonucleotide comprising a sequence that hybridizes with a part of the gene encoding human CD14 is provided, and a pharmaceutical composition comprising the oligonucleotide and a pharmaceutically acceptable carrier is further provided.
  • This can effectively suppress inflammatory factors. That is, oligonucleotides that suppress the expression of human CD14 are used for diseases caused by inflammatory factors generated through CD14, specifically, systemic inflammatory response syndrome, endotoxemia and shock, and ulcerative colon. It can be used as a prophylactic or therapeutic agent for inflammation, Crohn's disease, autoimmune reaction, allergic disease, cancer, graft-versus-host disease, periodontal disease or osteoporosis.
  • Sequence type nucleic acid 'Number of strands: single strand
  • Organism name h u m a n
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name h u m a n
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name m 0 u s 6
  • Organism name m 0 u se e 'sequence
  • CCTCCTGGCA CAGAATGCCC TAATGCCACT CTGAATTCTT CCTGTTTTTC GTCCCTCCCT 480
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: 1 strand
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: 1 strand
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
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Description

明 細 書
CD 1 4に対するアンチセンス化合物 技術分野 ' 本発明は、 ヒト CD 1 4をコードする遺伝子の一部と相補的な配列を含むオリ ゴヌクレオチドに関する。 さらに、 該オリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容し うる担体を含む医薬組成物に関する。 背景技術
細菌感染に伴い発症する敗血症は、 米国では 5 0万人がかかり 1 7万 5千人が 死亡する致死性の高い疾患でありまた有効な治療法の確立していない疾患である
(Science 誌、 264 卷、 365 頁、 1994年） 。 そしてその原因は、 細菌からのリポ ポリサッカライ ド （lipopoly succharide 、 以下 LPSと呼ぶ、 LPSはエンド トキシンとほぼ同義である。 ） による直接作用であると考えられてきた。 1985年 に Beutler 等が抗 TN F抗体を投与したマウスは致死量のェンドトキシンに耐性 を示すことを報告し （Science 誌、 229 巻、 869 頁、 1995年） 、 一方 Tracy 等は 組換え T N F αを投与した動物にェンドトキシン類似のショックと臓器障害が発 生すること （Science 誌、 234 巻、 470 頁、 1996年） を明らかにし、 敗血症 性ショックが L P Sによる直接作用ではなく、 LP Sの刺激により活性化したマ クロファージの過剰なサイ トカイン産生、 すなわち高サイ トカイン血症に因るこ とが判明した。 このことが契機となり、 LPSの刺激によって過剰に産生される TNF を標的とした治療法が試みられた。 し力、しな力くら、 1990年代前半に行わ れた TNF を標的とした臨床試験は 28日後の生存率の改善などの指標で良好な 結果が得られず失望した結果に終わっている （Nature Medicine 、 3 巻、 1193頁、 1997年） 。
現在、 細菌感染を防御する目的では抗生物質が用いられているが、 一方でこれ らの抗生物質により菌体が破壊され多量の L P Sが血中に放出されることも報告 されている （Scand. J. Infect. Dis.、 101 巻、 3頁、 1996年） 。 このことは、 抗生剤の使用がかえつて敗血症性ショックまたはエンドトキシンショックを引き 起こす原因になりかねないことを意味している。 したがってショックを予防する には抗生物質の投与と共に L P Sの刺激を遮断することが重要である。
CD 1 4は、 骨髄細胞が分化成熟するに伴い発現する分子量 5 5kdのホスファ チジルイノシトール結合型糖蛋白質であり、 ヒト末梢血単核球の表面抗原として Todd等により報告された (NewYork, Springer-Verlag, 424-433 頁， 1984年） 。 現 在では、 CD 1 4は、 マクロファ一ジ、 単球、 クッパー細胞および好中球膜上に 存在することが判っている。
ヒ卜 CD 1 4の DNA配列は Goyert等により 1988年に報告され (Nucleic Acid Research 、 1 6巻、 9号、 4 1 7 3頁、 1988年） またマウス CD 1 4 DN A配列は、 山本等により 1988年に報告された （Somat. Cell Mol. Genet. 、 14巻、 427 頁、 1988年） 。 CD 1 4遺伝子は、 第 5番染色体の Iい 3や GM- CSF、 G - C SF などの造血組織の分化増殖因子群が存在する遺伝子クラスターの中に存在し 造血組織の分化成熟に関与することが示唆されていたが、 その機能の詳細は不明 であつ丁乙。 1990年、 Wright等により CD 1 4がグラム陰性桿菌内毒素の L P Sの受容体で あることが報告され （Wright等、 サイエンス 249巻 1 43 1頁 1 9 9 0年） 、 さらに最近の研究で CD 1 4は LPSばかりでなくプロテオグリカンとも結合す ることが明らかにされた （Gupta等、 J. Biol.Chem.27 1巻 38号 2 3 3 1 0頁 1 9 96年） 。 またグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の菌体成分が CD 1 4 を介して細胞を活性化することも報告されている （Jerome等、 I誦 unityl 卷
509頁 1 994年） 。 すなわち、 生体が細菌感染を受けた場合には、 CD 1 4 が菌体成分と結合することによって、 CD 1 4を発現しているマクロファージゃ 単球が活性化され、 種々の炎症性因子 （炎症性サイ トカイン、 例えば TNFa、
I L— 1、 I L一 6、 I L— 8、 PA I— 2、 MCP— 1など、 やァラキドン代 謝物、 P A Fおよび一酸化窒素など） が放出、 誘導されることにより、 感染初期 には細菌感染防御に寄与していると考えられている (Matthew等、 J. Biol. Chem.
60巻 728頁 1 996年） 。 一方で、 敗血症のような病的状態では、 細菌から の大量の LPSによるマクロファージの活性化が、 血中への大量の T N F 放出 につながり、 ショックが惹起されるとも考えられている （Fearn.S等、 J. Exp. Med.， 1 8 1巻、 857頁、 1 99 5年） 。
現在、 CD 1 4を介した、 LPSによるサイ ト力イン産生機構については、 以 下のように考えられている。 すなわち、 菌体由来の LPS凝集物が血中で LPS 結合蛋白質 （LBP) と複合体を形成する事により単体 LPSとして効率的にマ クロファ一ジ上の CD 1 4分子と 1対 1で結合できるようになる。 細胞表面上で 結合した L P Sはセラミ ドと類似のまだ未同定の経路で信号が細胞内に伝え られ、 細胞内で転写因子である NF Bが活性化し、 TNFひを含む種々のサイ トカインの産生が誘導される （UlevUh 等 Annual Review of Immunology 、 13、 437, 1995) 。 これらのことは、 細菌感染では宿主の一次応答が単球 Zマクロ ファージ上の CD 1 4が LPSもしくはグラム陽性菌菌体成分に応答する事から 反応が開始されることを意味している。
ところで、 CD 1 4分子には膜結合型と可溶型の 2種の分子が存在する。 可溶型 CD 1 4の生成は膜結合型 CD 1 4がプロテアーゼにより切断され可 溶型となると考えられている （Philip等、 Eur. J. Immunol. 2 5巻 6 0 4頁
1 9 9 5年） 。
そして、 可溶型分子は、 血中の LP S分子と結合しこれを HDLに輸送するこ とにより L P Sのクリアランスに役立っているとの報告がある （Wurfel等、 J. Exp. Med. 1 8 6巻 1 7 4 3頁 1 9 9 5年） 。 一方、 膜結合型分子は L P Sと結 合しシグナルを細胞内に伝達させ炎症性サイ トカインを誘導すると考えられてい る。 即ち、 CD 1 4には LPSを除去する作用と炎症性因子を誘導する作用との 相反する機能が存在すると考えられている。
特表平 5— 5 0 1 3 9 9号公報は抗 CD 1 4抗体を用いた敗血症の治療方法を 開示している。 抗 CD 1 4抗体は CD 1 4と LPSの結合を阻害し、 CD 1 4を 介するシグナルを遮断することを可能にし、 炎症性サイ トカインの発現を 抑制し、 その結果敗血症を治療するものである。 また W093/19.772、 W096/2057 に は、 可溶型の CD 1 4を使用した敗血症の治療が開示されている。
しかし、 敗血症性ショックの死亡率の高さ、 患者数を考えると、 より効果の高 、医薬品を提供することが望まれている。 発明の開示
本発明者等は、 敗血症性ショックに対してより効果の高い医薬組成物を提供す ベく研究を重ねてきた。 そして、 敗血症性ショ ックの発症には、 L P S刺激 によって肝臓のクツバ一細胞から産生される炎症性サイ トカインが重要な役割を 果たしていると予見し、 LPSの除去に関与している可溶性 CD 1 4や、 それぞ れの部位で細菌感染防御に寄与している肺胞マクロファージゃ腹腔マクロファー ジ、 その他のマクロファージ上のの C D 1 4には影響を与えない方法で、 クッ '一細胞上の C D 1 4と L P Sの結合を特異的に遮断することが治療上有効 であろうと考えた。 そして肝臓に蓄積性のあるアンチセンスオリゴヌクレオチド を用いれば、 肝クッパー細胞上の CD 1 4に高い選択性で作用すると考えた。 マウスの肝クッパー細胞は、 平常時には CD 1 4を極めて弱く発現しているだ けだが、 LP Sによって刺激されると、 CD 1 4を強く発現するようになること が知られている。 一方、 肝臓は、 ショックにおいて最も影響を受けやすい臓器で あり、 肝機能の低下が、 全身症状に大きな影響を与えることも知られている。 本 発明者等は、 LPS刺激により発現が誘導される肝クッパー細胞の CD 1 4を選 択的に抑制し、 主にクッパー細胞からの炎症性サイ トカインの産生を抑制すると いう新しい観点に基づく、 敗血症または敗血症性ショックに有効な治療薬を提供 する。 すなわち、 本発明者らは CD 1 4に対するアンチセンスオリゴヌクレオチ ドを、 敗血症または敗血症性ショックに有効な医薬品として提供する。
CD 1 4のァンチセンスォリゴヌクレオチドが、 医薬品として利用可能な程度 に CD 1 4の発現を抑制し、 敗血症の治療に応用できるかについては全く不明で あつたが、 本発明者らは、 鋭意研究を行った結果、 CD 1 4に対す- スォリゴヌクレオチドが医薬品として使用可能であることを確認した。 さらに、 本発明者等は以下の方法によって、 CD 1 4をコードする約 1. 4 k bの遺伝子の 中でもアンチセンスォリゴヌクレオチドの標的として特に効果の高い領域を決定 することに成功した。
すなわち、 5' 非翻訳領域および翻訳開始領域については、 ヒト CD1 4ルシ フェラーゼ融合蛋白発現系を用いた翻訳阻害実験、 組換え HeLa細胞による CD 1 4蛋白発現阻害活性およびヒトマクロファージ様培養細胞による TNFa 産生阻害活性を組み合わせることにより活性領域を特定した。 また、 容易には活 性領域を特定できない翻訳領域および 3' 非翻訳領域については、 標的 RNAと アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合を特異的に切断する RNaseHを用いるスク リーニングを導入することにより、 活性領域を特定することに成功した。 次にこ れらの活性領域の効果と毒性を、 培養細胞もしくは動物を使用した系で確認し本 発明を完成させた。
すなわち、 本発明はヒト CD 1 4をコードする遺伝子の少なくとも 1部とハイ ブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。 このうちヒト CD 1 4をコード する遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むォリゴヌクレオチドが好まし い。
さらに、 ヒト CD 1 4mRNAの 5' 非翻訳領域、 翻訳開始領域、 翻訳領域ま たは 3 ' 非翻訳領域のそれぞれまたはその少なくとも一部と相補的な配列を含む ォリゴヌクレオチドを提供する。
さらに、 配列番号 1の塩基配列の
(1) 塩基位置 2 3番のシトシンから 6 2番のアデニンまでの 4 0塩基の塩基 配列
(2) 塩基位置 93番のグァニンから 1 3 1番のシ卜シンまでの 3 9塩基の塩 基配列
(3) 塩基位置 1 1 7番のグァニンから 1 45番のゥリジンまでの 29塩基の 塩基配列 '
(4) 塩基位置 1 24 1番のアデニンから 1 2 8 0番のグァニンまでの 4 0塩 基の塩基配列
(5) 塩基位置 1 264番のグァニンから 1 2 8 5番のシトシンまでの 2 2塩 基の塩基配列
(6) 塩基位置 1 267番のシトシンから 1 320番のアデニンまでの 5 4塩 基の塩基配列
(7) 塩基位置 1 30 1番のグァニンから 1 3 50番のアデニンまでの 5 0塩 基の塩基配列
(8) 塩基位置 1 84番のシトシンから 203番のアデニンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(9) 塩基位置 324番のアデニンから 343番のシトシンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(10) 塩基位置 394番のゥリジンから 4 1 3番のグァニンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(11) 塩基位置 444番のシトシンから 489番のシトシンまでの 4 6塩基の 塩基配列
(12) 塩基位置 534番のグァニンから 5 5 3番のゥリジンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(13) 塩基位置 6 4 4番のゥリジンから 6 6 8番のゥリジンまでの 2 5塩基の 塩基配列
(14) 塩基位置 6 8 4番のシトシンから 7 5 8番のゥリジンまでの 7 5塩基の 塩基配列 '
(15) 塩基位置 7 9 4番のアデニンから 8 2 8番のグァニンまでの 3 5塩基の 塩基配列
(16) 塩基位置 8 6 4番のシトシンから 9 1 8番のグァニンまでの塩基の 5 5 塩基配列
(17) 塩基位置 9 9 4番のグァニンから 1 0 4 8番のシトシンまでの 5 5塩基 の塩基配列
(18)塩基位置 1 0 6 4番のグァニンから 1 1 0 8番のゥリジンまでの 4 5塩基 の塩基配列、 および
(19)塩基位置 1 1 9 4番のグァニンから 1 2 2 3番のグァニンまでの 3 0塩基 の塩基配列塩基
力、ら選ばれるいずれか 1つの配列またはいずれか 1つの配列の少なくとも一部と ハイプリダイズするオリゴヌクレオチド、 またはそれらと相補的な塩基配列を有 するオリゴヌクレオチドを提供する。
これらのうち、 ヒト C D 1 4の発現を抑制しうるオリゴヌクレオチドが好まし い。 例えば、 さらに RNaseH切断実験でヒト C D 1 4遺伝子との結合活性が高いォ リゴヌクレオチドゃ翻訳阻害実験でヒト C D 1 4の発現を 3 0 %以上抑制しうる オリゴヌクレオチドが好ましい。 本発明のォリゴヌクレオチドの塩基数は、 好ましくは 1 0から 50のいずれか であり、 特に好ましくは 1 5から 30のいずれかである。
本発明はまた、 ヌクレオチド間の結合基の少なくとも 1つがィォゥ原子を含む ォリゴヌクレオチドも提供する。
さらに、 本発明は配列番号 1 0， 1 1 , 1 2, 1 3， 1 6， 1 9; 2 0， 2 1， 22， 23， 24， 25， 2 6, 27， 28， 29， 32， 3 3， 34， 3 5， 36， 37, 39， 40, 4 1， 42， 45， 46， 47， 48， 49， 5 0， 5 1、 5 2， 53， 54， 5 5， 56， 57， 5 8， 59， 6 1， 6 2， 63， 64， 7 0， 7 1， 72， 73， 74， 7 5， 7 6， 77， 7 8， 7 9， 8 1， 83， 85， 86， 87, 88， 89， 9 0， 1 02， 1 03， 1 0 9， 1 23, 1 24, 1 25， 1 30， 1 35, 1 3 6， 1 37, 1 38, 1 44, 1 55, 1 56, 1 5 9， 1 60， 1 6 1, 1 6 2， 1 63， 1 64, 1 65，
1 70, 1 7 1, 1 7 2， 1 77, 1 78, 1 7 9， 1 80, 1 8 1, 1 90, 1 9 1， 1 92, 1 93, 1 94, 1 96, 1 9 7， 1 9 8， 1 99， 20 9,
2 1 0， 2 1 5， 2 1 6， 220, 22 1, 224, 2 25, 22 6, 227, 228, 229, 230, 23 1, 232, 233, 234, 23 5, 2 3 6， 237, 238, 23 9, 240, 24 1、 242, 2 43, 244, 245,
246, 247， 248からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を含 み、 30塩基以下の塩基からなるォリゴヌクレオチドを提供する。
また、 本発明は C D 1 4をコードする遺伝子にハィブリダイズするオリゴヌク レオチドを有効成分とする医薬組成物を提供する。 当該医薬組成物は、 CD 1 4 をコードする遺伝子にハイプリダイズするォリゴヌクレオチドに加え、 必要に応 じて、 薬学的に許容しうる担体を含むものである。 当該医薬組成物は、 好ましく は敗血症または敗血症性ショックもしくは CD 1 4を介して誘導される炎症性因 子によって引き起こされる疾患の予防/治療薬である。 図面の簡単な説明 ' 図 1はヒト CD 1 4をコ一ドする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオ チドの CD 1 4翻訳阻害活性を示す図である。
図 2はヒト CD 1 4をコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオ チドの塩基長による効果を示す図である。
図 3はヒト CD 1 4に対する mRNAの 5' 非翻訳領域および A U G近傍領域 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのヒト TNF 産生抑制活性を示す図 である。
図 4はヒ ト CD 1 4に対する mRNAの 3' 非翻訳領域に対するアンチセンス オリゴヌクレオチドのヒ ト TNFひの産生抑制活性を示す図である。
図 5はマウス CD 1 4に対する mRNAの 5' 非翻訳領域および A U G近傍領 域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのマウス TNF α産生抑制活性を示 す図である。
図 6はェンドトキシンショックモデルにおけるオリゴヌクレオチド SM0105Aの 効果を示す図である。
図 7はェンドトキシンショックモデルにおけるオリゴヌクレオチド SM0105Aの 肝機能に対する効果を示す図である。
図 8はヒト CD 1 4をコ一ドする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオ チドのヒ ト C D 1 4ルシフェラ一ゼ融合蛋白発現阻害活性を示す図である。
図 9はヒト C D 1 4に対する m R N Aの翻訳領域に対するアンチセンスオリゴ ヌクレオチドのヒト T N Fひ産生抑制活性を示す図である。
図 1 0は翻訳開始領域近傍に対するヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドとマ ウスアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を比較した図である。 '
図 1 1はコンセンサスオリゴヌクレオチドのヒ ト C D 1 4ルシフェラ一ゼ融合 蛋白発現阻害活性を示す図である。
図 1 2はコンセンサスオリゴヌクレオチドのマウス T N F α産生抑制活性を示 す図である。 発明の概要
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明のォリゴヌクレオチドはヒト C D 1 4をコードする遺伝子の少なくとも 一部とハイブリダィズする。 このうちヒト C D 1 4をコードする遺伝子の少なく とも一部と相補的な配列を含むォリゴヌクレオチドが好ましい。
本発明の説明において、 「オリゴヌクレオチド」 とは塩基、 リン酸、 糖からな るヌクレオチドが複数結合したォリゴヌクレオチドとその誘導体の全てが含まれ る。 オリゴヌクレオチドの代表的なものが D N Αと R N Αである。 オリゴヌクレ ォチド誘導体には、 その立体構造や機能がォリゴヌクレオチドと類似するものは すべてが含まれる。 例えば、 オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端もしくは 5 ' 末端に 他の物質が結合したものや、 オリゴヌクレオチドの塩基、 糖、 リン酸の少なくと もいずれか 1つにおいて、 置換や修飾が生じた物質、 天然には存在しないよ うな、 塩基、 糖、 リン酸を有するものや糖一リン酸骨格以外の骨格 （バックボ一 ン） を有するものでなどが挙げられる。
本発明の説明において 「遺伝子」 とは、 染色体 DN Aまたはその転写物 （mR NAおよびその前駆体） を意味し、 「CD 1 4をコードする遺伝子」 とは CD 1 4のァミノ酸配列を規定している構造遺伝子、 構造遺伝子の途中に存在する介在 配列 （イントロン） 、 および CD 1 4の発現に関与する、 構造遺伝子上流の塩基 配列 （プロモーターやオペレータ一など） や構造遺伝子下流の塩基配列を意味す る。 ヒト CD 1 4をコードする遺伝子の代表的な配列を配列表の配列番号 1およ び 2に示す。
本発明の説明において 「ハイブリダィズする」 とは DNAもしくは RNAに対 して塩基間で特異的結合を形成することをいう。 ハイプリダイズの強さとしては 0. 1 5Mリン酸緩衝液で、 4 5 °C以上の Tm値を持つものであればよく、 55°C以上の Tm値を持つものがより好ましい。 特異的結合は、 一般的には相補 的結合により形成されるがここでは、 その結合様式は問わない。 つまり、 本発明 のォリゴヌクレオチドはヒト C D 1 4をコ一ドする遺伝子の少なくとも一部に特 異的に結合するものであれば必ずしも標的配列に完全に相補的配列を持つ必要は なく、 またィノシンや 5—二トロインドールに代表されるユニバーサルベースを 含んでいてもよいし、 その一部に相補的配列でない塩基もしくは配列を含んでい てもよい。 また、 Wa t s on C r i c k型、 もしくは Ho o g s t e e n型 またはその両方の結合様式で、 二重鎖もしくは三重鎖を形成するような場合も、 本発明の 「ハイブリダィズする」 に包含される。 また、 「相補的な配列」 とは、 D N Aや R N Aの塩基配列に対して塩基特異的な相補的塩基対を形成するような 塩基対をいう。 一般的には C (シトシン） と G (グァニン） の間、 T (チミ ン） と A (アデニン） の間、 および U (ゥラシル） と A (アデニン） との間で相補的 塩基対が形成される。
本発明のォリゴヌクレオチドは、 好ましくはヒ ト C D 1 4 m R N Aまたは mR N A前駆体の少なくとも一部分にハイブリダィズするものである。 '
本発明のオリゴヌクレオチドは、 その長さは特に限定されない。 一般的には、
1 0塩基以上の塩基を含む塩基配列であれば、 特異的配列と考えられている。 し たがって、 本発明のォリゴヌクレオチドは 1 0塩基以上からなる塩基配列を含む ものであれば、 ヒト C D 1 4をコードする遺伝子に特異的にハイブリダィズする ことが期待される。
一方、 オリゴヌクレオチドを細胞内に取り込ませるには、 その長さが余り長す ぎても不適当である。 本発明のオリゴヌクレオチドはいかなる長さのものでもよ いが、 本発明のオリゴヌクレオチドを細胞内に取り込ませ、 ヒト C D 1 4の発現 を抑制することを考慮すると、 ヒト C D 1 4をコードする遺伝子にハイブリダィ ズし、 1 0塩基以上 5 0塩基以下、 好ましくは 1 5塩基以上 3 0塩基以下の塩基 数からなるものが好ましい。 すなわち、 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチ ドは、 例えば、 配列番号 1または 2の配列の n番から n + 1 0番、 n番から n + 1 1番、 n番から n + 1 2番、 n番から n + 1 3番、 n番から n + 1 4番、 n番 から n + 1 5番、 n番から n + 1 6番、 n番から n + 1 7番、 n番から n + 1 8 番、 n番から n + 1 9番、 n番から n + 2 0番、 n番から n + 2 1番、 n 番から n + 2 2番、 n番から n + 2 3番、 · · · n番から n + 5 0番 （ n = 1〜 1 3 4 1 ) 番までのそれぞれの配列にハイブリダィズする、 または相補的である オリゴヌクレオチドである。
本発明のォリゴヌクレオチドは、 ヒト C D 1 4をコ一ドする遺伝子、 好ましく はヒ ト CD 1 4をコードする mRNAもしくはその前駆体のいかなる部位を標的 とするものであってもよい。 すなわち、 本発明のオリゴヌクレオチドが結合する 部位は特には限定されない。 し力、しな力くら、 当該オリゴヌクレオチドは 'mRNA もしくは mRNA前駆体の翻訳開始領域、 翻訳領域、 5' 非翻訳領域、 3' 非翻 訳領域、 リボソーム結合領域、 キヤッビング領域、 スプライシング領域、 ヘアピ ン構造を形成するループ部分のいずれかに結合することが好ましい。 中でも、 ヒ ト C D 1 4 mRNAの翻訳開始領域は、 その効果の面で本発明のォリゴヌクレオ チドの標的としてふさわしく、 又、 本発明のオリゴヌクレオチドを核内に蓄積さ せることを想定すると翻訳領域が好ましい。
具体的には、 本発明のオリゴヌクレオチドは、 配列番号 1で示されるヒト CD
1 4に対する mRNA中の、 下記 （1) から （1 9) より選ばれる、 いずれかの 配列からなる領域を標的として設計することが好ましい。
(1) 塩基位置 2 3番のシトシンから 6 2番のアデニンまでの 4 0塩基の塩基 配列
(2) 塩基位置 9 3番のグァニンから 1 3 1番のシトシンまでの 3 9塩基の塩 基配列
(3) 塩基位置 1 1 7番のグァニンから 1 4 5番のゥリジンまでの 2 9塩基の 塩基配列
(4) 塩基位置 1 2 4 1番のアデニンから 1 2 8 0番のグァニンまでの 4 0塩 基の塩基配列 ( 5 ) 塩基位置 1 2 6 4番のグァニンから 1 2 8 5番のシトシンまでの 2 2塩 基の塩基配列
( 6 ) 塩基位置 1 2 6 7番のシトシンカ、ら 1 3 2 0番のアデニンまでの 5 4塩 基の塩基配列
( 7 ) 塩基位置 1 3 0 1番のグァニンから 1 3 5 0番のアデニンまでの 5 0塩 基の塩基配列
( 8 ) 塩基位置 1 8 4番のシトシンから 2 0 3番のアデニンまでの 2 0塩基の 塩基配列
( 9 ) 塩基位置 3 2 4番のアデニンから 3 4 3番のシトシンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(10) 塩基位置 3 9 4番のゥリジンから 4 1 3番のグァニンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(11) 塩基位置 4 4 4番のシトシンから 4 8 9番のシトシンまでの 4 6塩基の 塩基配列
(12) 塩基位置 5 3 4番のグァニンから 5 5 3番のゥリジンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(13) 塩基位置 6 4 4番のゥリジンから 6 6 8番のゥリジンまでの 2 5塩基の 塩基配列
(14) 塩基位置 6 8 4番のシトシンから Ί 5 8番のゥリジンまでの 7 5塩基の 塩基配列
(15) 塩基位置 7 9 4番のアデニンから 8 2 8番のグァニンまでの 3 5塩基の 塩基配列 (16) 塩基位置 8 6 4番のシトシンから 9 1 8番のまでのグァニン塩基の 5 5 塩基配列
(17) 塩基位置 9 9 4番のグァニンから 1 0 4 8番のシトシンまでの 5 5塩基 の塩基配列
(18)塩基位置 1 0 6 4番のグァニンから 1 1 0 8番のゥリジンまでの' 4 5塩基 の塩基配列、 および
(19)塩基位置 1 1 9 4番のグァニンから 1 2 2 3番のグァニンまでの 3 0塩基 の塩基配列塩基
上記 （ 1 ) ないし （1 9) の塩基配列のなかでも、 （ 1 ) ， （ 2 ) ， (4) , (5) , (7) , ( 8 ) , (1 1) , (1 6) ， (1 9) の塩基配列からなる領 域は、 本発明のォリゴヌクレオチドの標的として特に有効であると考えられ る。
したがって、 本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい例は、 上記 （1 ) ないし ( 1 9 ) より選ばれるいずれかの配列とハイブリダィズするオリゴヌクレ ォチド、 または上記 （1) ないし （1 9) より選ばれるいずれかの配列の少なく とも一部とハイブリダィズするオリゴヌクレオチドであり、 好ましくは （ 1 ) , (2) ， （4) , (5) ， （7) ， (8) , (1 1) , (1 6) ， （ 1 9 ) の塩 基配列より選ばれる 、ずれかの配列とハイプリダイズするオリゴヌクレオチド、 ( 1 ) , (2 ) , (4) , (5) , (7) , (8) , ( 1 1 ) , ( 1 6 ) , ( 1 9) より選ばれる 、ずれかの配列の少なくとも一部とハイブリダィズするォ リゴヌクレオチドである。 より好ましくは、 上記 （1) ないし （1 9) より選ば れるいずれかの配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、 または上 記 （ 1 ) ないし （ 1 9) より選ばれるいずれかの配列の少なく とも一部と相 捕的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、 好ましくは （ 1 ) ，
(2) , (4) , (5) ， （7) ， （8) ， （1 1) ， (1 6) , ( 1 9 ) の塩 基配列より選ばれるいずれかの配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオ チド、 上記 （ 1 ) ， （2) ， （4) ， （5) ， （7) ， （8) ， C 1 1 ) ,
(1 6) ， (1 9) より選ばれるいずれかの配列の少なくとも一部と相補的な塩 基配列を有するオリゴヌクレオチドである。 これらのォリゴヌクレオチドは 1 0 以上 50以下の塩基からなるオリゴヌクレオチドであることか好ましい。 例えば 本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい例は上記 （1) ないし （1 9) のいずれ かの塩基配列中の 1 0以上の一続きの塩基配列にハイブリダイズする、 または相 補的な塩基配列を有するォリゴヌクレオチドである。
なお、 上記配列のうち、 （1) から （3) は、 ヒ ト CD 1 4に対する mRNA の 5' 非翻訳領域から翻訳開始部位にかけての領域内に位置し、 （8) から
(1 9) は翻訳領域内に、 （4) から （7) は 3' 非翻訳領域内に位置する配列 こ'、ある。
本発明のォリゴヌクレオチドは、 ヒト C D 1 4の発現を抑制する活性を有する ことが好ましい。 本発明者らは、 実施例 1 3で示したように RNaseH切断実験が、 CD 1 4の発現を抑制するうえでより効果的なオリゴヌクレオチドを選択するた めの指標として有効であることを見出した。 したがって、 本発明のオリゴヌクレ ォチドは、 ヒト CD 1 4の mRNAの少なくとも一部とハイブリダィズする、 ま たは相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのなかで、 RNaseH切断実験でスコ ァ 1以上、 好ましくは 2以上であるものが好ましい。 また、 ヒ ト C D 1 4ル シフ ラ一ゼ融合蛋白質発現阻害実験で、 ヒト C D 1 4の発現を 2 0 %以上、 好 ましくは 40 %以上抑制しうるオリゴヌクレオチド、 T N F α産生阻止実験で、 TNF αの産生を阻止しうるオリゴヌクレオチド、 in vitro translation反応 による C D 1 4翻訳阻害実験で C D 1 4の翻訳を 3 0 %以上阻害しうるオリゴヌ クレオチドが好ましい。 '
さらに、 本発明は配列番号 1 0 , 1 1， 1 2， 1 3， 1 6， 1 9, 2 0， 2 1， 22， 23， 24， 25， 26， 27， 28, 29， 32， 3 3， 3 4， 3 5， 36， 37， 39， 40， 4 1， 42， 4 5， 46， 47， 48， 49， 5 0， 5 1、 52， 53， 54， 5 5， 56， 5 7， 5 8， 59， 6 1， 6 2， 6 3， 64， 70， 7 1， 72， 73， 7 4， 7 5， 7 6， 77， 7 8， 7 9， 8 1， 8 3, 85， 86, 87， 88, 89， 9 0， 1 0 2， 1 0 3, 1 0 9,
1 23, 1 24, 1 25， 1 30， 1 35， 1 36， 1 37， 1 38， 1 44, 1 5 5， 1 56, 1 59, 1 60, 1 6 1， 1 6 2， 1 6 3, 1 64, 1 6 5， 1 7 0， 1 7 1, 1 72, 1 77， 1 7 8， 1 79, 1 80, 1 8 1, 1 9 0， 1 9 1， 1 92， 1 9 3， 1 9 4， 1 96, 1 9 7， 1 98, 1 99， 209,
2 1 0， 2 1 5， 2 1 6， 220, 22 1, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 23 1, 232, 23 3, 2 34， 23 5, 23 6, 2 37, 238, 239, 240, 24 1, 242, 243， 244, 24 5,
246, 247， 248からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有 するオリゴヌクレオチドを提供する。 なお、 上記配列表には P = S体、 P = 0体 のォリゴヌクレオチドが混在するが、 修飾の有無、 誘導体の種類にかかわらず、 こでは上記配列番号に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを意味す る。 当該ォリゴヌクレオチドは、 上記塩基配列を有し好ましくは塩基数 3 0以下 のォリゴヌクレオチドである。
アンチセンス技術の進歩とともに、 オリゴヌクレオチドの医薬品としての効果 を高めることを目的として様々な誘導体が見いだされてきた。 現在、 目的の DN Aや mRNAとの結合力、 組織選択性、 細胞透過性、 ヌクレアーゼ耐性、 細胞内 安定性の高い、 様々なオリゴヌクレオチド誘導体が得られている。 前述の ように、 本発明のオリゴヌクレオチドには、 天然には存在しないような、 塩基、 糖、 リン酸、 バックボーン構造からなるものも含めて、 あらゆる種類の誘導 体が含まれる。 本発明に含まれる誘導体の例としては、 バックボーン構造 として、 その全部または一部にフォスフォジエステル （phosphodiester) 結合、 フォスフォロチォェ一 ト （phosphorothioate) 結合、 メチルフォスフォネー ト （methylphosphonate ) 結合、 フォスフォロアミア—ト （phosphoroamidate) 結合、 フォスフォロジチォエート（phosphorocHthioate)結合、 モルホリノ基を有 する誘導体等 （東海林洋子等、 癌と化学療法、 2 0巻、 1 8 9 9— 1 9 0 7頁、 1 9 9 3年） が挙げられる。
また、 デォキシリボヌクレオチドグァニジン （DNG) (R o b e r t P等、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 9 2巻、 6 0 9 7頁、 1 9 9 5年） や、 糖の 2' 位が、 他の原子あるいは置換基に置換されたものや ーリボース等、 糖 部分を修飾したものも誘導体の例として挙げられる （B e r t r a n d JR. B i o c h e m. B i o p h y s . R e s . C o mm u n . 1 6 4巻、 3 1 1頁、 1 9 8 9年） 。
さらに、 糖部分が他の物質に置換されたもの、 一部の塩基がイノシンゃュ 二バーサルベース （A、 T、 C、 Gのいずれにでも結合する塩基） に置換さ れた物、 オリゴヌクレオチドの 5' 末端もしくは 3' 末端もしくは内部にコレス テロールゃァクリジン、 ポリ一 L—リジン、 ソラレン（psoralen), 長鎖アル キル等が結合したもの等のォリゴヌク レオチド誘導体も本発明に含まれる
(G. D e g o l s等、 N u c l e i c A c i d R e s e a r c h. 1 7巻、 9 3 4 1頁、 1 9 8 9年 A. Mc C o n n a g h i e等、 J. Me d. C h em. 3 8巻、 3 4 8 8頁、 1 9 9 3年 G. G o d a r d等
Eu r. J. B i o c h em. 2 3 2巻、 4 0 4頁。 1 9 9 5年） 。
本発明では、 上記誘導体の好ましい一例としてフォスフォロチォエート結合を バックボーン構造として有する誘導体、 すなわち、 ヌクレオチド間の結合基の少 なくとも 1つがィォゥ原子を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
このようなォリゴヌク レオチ ドの好適な例は、 配列番号 1 0， 1 1 , 1 2， 1 3， 1 6， 1 9， 2 0， 2 1， 2 2， 2 3， 2 4， 2 5， 2 6， 2 7， 2 8， 2 9， 3 2， 3 3， 3 4， 3 5， 3 6， 3 7， 3 9， 4 0， 4 1， 4 2， 4 5， 4 6， 4 7, 4 8， 4 9， 5 0， 5 1、 5 2， 5 3， 5 4， 5 5， 5 6， 5 7， 5 8， 5 9， 2 2 5 , 2 2 6， 2 2 7, 2 2 8 , 2 2 9 , 2 3 0, 2 3 1, 2 3 2, 2 3 3, 2 3 4， 2 3 5, 2 3 6, 2 3 7, 2 3 8, 2 3 9, 2 4 0, 2 4 1, 2 4 2, 2 4 3, 2 4 4， 2 4 5, 2 4 6, 2 4 7, 2 4 8よ り選ばれるいずれかのオリゴヌクレオチド （すなわち、 上記配列番号より選ばれ るいずれかの配列を有し、 P = S体であるオリゴヌクレオチド） である。
先にも延べたように、 本発明のオリゴヌクレオチドは、 上述の標的配列に対し てハイブリダイズするものであれば、 標的となる領域の一部の塩基配列と完全に 相補的な配列を含んでいる必要はない。 逆に、 医薬品開発に動物実験が欠かせな いことを考慮すると、 ヒト C D 1 4をコードする遺伝子にハイブリダィズし、 力、 つ、 モデル動物の C D 1 4をコードする遺伝子にもハイブリダィズするようなォ リゴヌクレオチドが有用になる。 このようなオリゴヌクレオチドは、 ヒ トとモデ ル動物の C D 1 4をコードする遺伝子の塩基配列のうち、 相同性の高い領域を標 的として作成することが可能である。 例えば、 マウスの C D 1 4をコードする遺 伝子の塩基配列を配列表の配列番号 3および 4に示したが、 ヒトとマウスとで相 同性の高い部分を調べ、 ヒトとマウスとで一致する部分については、 それに相補 的な塩基配列を、 一致しない部分については、 イノシンや 5—二トロインドール に代表されるユニバーサルベースを使用することにより、 マウス C D 1 4をコー ドする遺伝子にも、 ヒト C D 1 4をコードする遺伝子にもハイブリダィズするォ リゴヌクレオチドを作成することができる。 同様の方法で、 ヒトおよびヒト以外 の任意の 2種以上の動物の C D 1 4をコードする遺伝子の 、ずれにもハイプリダ ィズするようなオリゴヌクレオチドを作成することができる。 もちろん、 必要に 応じて、 バックボーンにフォスフォロチォェ一ト結合を導入しても良い。 このよ うなオリゴヌクレオチドのうち、 C D 1 4の発現を抑制する活性が期待できる好 ましいものは、 下記の （1 ) ないし （9 ) の塩基配列からなる領域を標的として 設計することができる。 ただし、 オリゴヌクレオチドの、 ヒトおよびヒト以外の 動物の C D 1 4に対する相補性を高める目的で、 これらの領域よりも数塩基 下流、 数塩基上流までを含めて標的としてもよい。 このようなアンチセンスオリ ゴヌクレオチドの具体例としては、 下記の （1 ) ないし （9 ) より選ばれるいず れかの塩基配列に相補的な塩基配列において、 その中の少なくとも 1つ以上の塩 基がユニバーサルベースに置換された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙 げられる。 もしくは下記 （1) ないし （9) より選ばれるいずれかの塩基配列中 の、 1 0以上の一続きの塩基配列からなる任意の部分に相補的な塩基配列におい て、 その中の 1つ以上の塩基がユニバーサルベースに置換された塩基配列を有す るォリゴヌクレオチドが挙げられる。 '
(1) 配列番号 1の 1 03番のアデニンから 1 3 1番のシトシンまでの 2 9塩 基
(2) 配列番号 1の 1 84番のシトシンから 203番のアデニンまでの 20塩 基
(3) 配列番号 1の 3 24番のアデニンから 343番のシトシンまでの 20塩 基
( 4 ) 配列番号 1の 444番のシトシンから 489番のシトシンまでの 46塩 基
( 5 ) 配列番号 1の 6 84番のシトシンから 7 58番のゥリジンまでの 7 5塩 基
(6) 配列番号 1の 7 94番のアデニンから 828番のグァニンまでの 3 5塩 基
(7) 配列番号 1の 864番のシトシンカ、ら 908番のアデニンまでの 4 5塩 基
(8) 配列番号 1の 994番のグァニンから 1 046番のグァニンまでの 53 S
(9) 配列番号 1の 1 064番のグァニンから 1 1 08番のゥリジンまでの 4 5塩基
より具体的には、 下記の （1 0 ) から （1 8 ) より選ばれる塩基配列の全部、 もしくはその中の 1 0以上の一続きの塩基からなる任意の部分配列を有するオリ ゴヌクレオチドである。 これらの配列はヒト、 マウス、 サルの C D 1 4 m R N A のいずれにもハイプリダイズするように設計されたものである。 '
(10) CAA CAA GCX XXX XXC XCG CTC CAT GGT CGX TAX XT
(11) TTC XTC GTC XAG CTC XCA XGG
(12) ACT GCC XCX GXT CXG CXT CXG XXT CXA CXC GCX TTA GAA
(13) AGX TXX TCX AGX GTC AGT TCC TXG AGG CXG GAX XXC XCX AGX ACA CGC AXG GC
(14) GCX GXX ATC AGT CCX CXX TCG CCC AXT XCA GGA TTG TCA GAC AGG TCT AXG XTG GXX AGG GCX GGG AAX XCG CG
(15) GCA CAC GCC XXT GGG CGT CTC CAT XCC XGX GTT XCG CAG CGC TA
(16) TXC XGX XXC XCG CAG XGA XTT GTG XCT XAG GTC TAG XCX XTG
(17) CTG TTG XAX CTG AGA TCX AGC ACX CTG AGC TTG GCX GGC AGX CCT TTA GG
(18) CCA XXA AGG GAT TXC CXT XXA GTG XCA GGT TXX CCA CXT XGG GCA GCT C (ただし上記 （ 1 0 ) から （ 1 8 ) において Xは、 ユニバーサル塩基を示 す）
より具体的には配列番号 242 、 243 、 244 、 245 、 246 、 247 、 248 、 249 、 250 、 251 、 252 、 253 、 254 、 255 、 256 および 257 に示した塩基配列を有す るオリゴヌクレオチドが挙げられる。
以下に、 本発明のォリゴヌクレオチドの製造方法を説明する。 ォリゴヌクレオチ ドやその誘導体は、 公知の方法で製造することができ る （例えば、 S. A g r a w a l等 P r o t o c o l f o r o l i go nu c l e o t i d e s a n d An a l o g s. Me t h o d i n Mo l e c u l a r B i o l o g y s e r i e s 2 0巻、 H uma n a P r e s s, S . A g r aw a l等 An t i s e n s e R e s e a r c h a n d D e v e l o pm e n t 4巻、 1 8 5頁、 1 994年） 。
天然の DNAや RNAであれば、 化学合成機を使用して合成したり、 ヒト CD 1 4をコ一ドする遺伝子を铸型として P CR法により本発明のォリゴヌクレオチ ドを得ることができる。 また、 メチルフォスフォネート型やフォスフォロチ ォエート型等、 誘導体の中には、 化学合成機 （たとえばパーキンエルマ一ジャパ ン （株） 製、 394型） を使用して合成できるものもある。 この場合には、 化学 合成機に添付されたマ二ュァルに従つて操作を行い、 得られた合成産物を逆相ク ロマトグラフィ一等を用いた H PLC法により精製することによつても、 目的の オリゴヌクレオチド誘導体を得ることができる。
ヒ ト C D 1 4をコードする遺伝子の少なくとも一部とハイプリダイズするォリ ゴヌクレオチドは前述の方法で合成したォリゴヌクレオチドをヒト C D 1 4ルシ フェラーゼ融合蛋白発現系を用いた翻訳阻害実験でその効果を確認することがで きる。 またヒト CD 1 4を介して誘導される炎症性因子の発現を抑制する効果を 細胞評価系を用いて確認することができる。 この細胞評価系は、 THP— 1細胞 を PMAおよびビタミン D 3で処理することによりマクロファージ様細胞に分化 誘導し、 LP Sの刺激により TNFひを産生誘導し、 各種のオリゴヌクレオチド を添加して TNF α産生が阻害されるか否かを指標にオリゴヌクレオチドの有効 性を評価する。 本発明のォリゴヌクレオチドは、 またヒト C D 1 4を発現するよ うな組み換え細胞を使用して、 ヒ ト CD 1 4の発現を阻止する活性を指標に 評価、 選択する。 もしくは、 RNaseH切断実験における結合活性値を指標として評 価、 選択する。 '
次に、 本発明のォリゴヌクレオチドの利用方法について説明する。
本発明のオリゴヌクレオチドはヒト CD 1 4とコードする遺伝子に結合するこ とを特徴とするため、 検体中のヒト CD 1 4遺伝子の検出を目的とする診断用プ ローブとして使用できる。 本発明のオリゴヌクレオチドを診断用のプローブとし て使用する場合には、 それらを、 公知の方法に従い、 ラジオアイソトープや、 酵 素、 蛍光物質、 発光物質等で標識する。 次に、 CD 1 4の発現を調べたい患者の 細胞から DNAもしくは mRN Aを公知方法で調製し、 これを被検物質として、 標識プローブを加えて反応させた後、 洗浄して未反応の標識プローブを除去 する。 被検物質中に、 ヒト CD 1 4 DNAもしくは RNAが含まれていれば、 標 識プローブはそれらと結合する。 結合形成の有無は、 標識した酵素、 蛍光物質、 発光物質、 あるいは放射性同位元素等による発光、 蛍光、 放射能等を指標として 知ることができる。
したがって、 本発明のオリゴヌクレオチドは診断用プローブとして、 外界から の刺激に対する各組織や細胞の C D 1 4の発現量の増減を検出したり、 C D 1 4 を介して生じる炎症性因子によって引き起こされる疾患、 具体的には全身性炎症 反応症候群、 敗血症およびショック、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 自己免疫反応 および疾患、 アレルギー疾患、 癌、 移植片対宿主病、 歯周病もしくは骨粗鬆症等 の診断に利用することができる。 また、 炎症の程度や治療方法、 予後を決定する ための診断にも使用することができる。
本発明のォリゴヌクレオチドを医薬用途に使用する場合には、 医薬品として使 用するのに適した純度のものを、 必要に応じて、 薬理学的に許容されうる添加物 とともに、 人体への投与に適した剤型で使用する。 その詳細は、 本発明の医薬組 成物の欄で説明する。
以下に、 本発明の医薬組成物を説明する。 本発明の医薬組成物は、 上述のよう な本発明のォリゴヌクレオチドを有効成分とする。 本発明の医薬組成物は、 また は、 ヒト C D 1 4をコードする遺伝子に結合し、 ヒト C D 1 4の発現を抑制し得 るォリゴヌクレオチドを有効成分とする。 当該医薬組成物は、 医薬品として使用 するのに適した純度のオリゴヌクレチドを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁し て使用してもよいし、 リボソーム中に封入したり、 適当なベクターに組み込んだ 形にして使用してもよい。 また、 必要に応じて、 本発明のオリゴヌクレオチドに 薬学的に許容され得る担体を添加し、 注射剤、 錠剤、 カプセル剤、 点眼剤、 クリーム剤、 座剤、 噴霧剤、 パップ剤等適当な剤型にして使用してもよい。 薬 学的に許容しうる担体には、 溶媒、 基剤、 安定化剤、 防腐剤、 溶解剤、 賦形剤、 緩衝剤等が含まれる。
すでに述べたように C D 1 4は、 マクロファージ、 単球、 クッパー細胞および 好中球膜上に存在する L P S受容体である。 細菌が感染すると C D 1 4を介して マクロファージゃ好中球が活性化され、 炎症性因子を誘発すると考えられて いる。 したがって、 ヒト C D 1 4の発現を抑制するオリゴヌクレオチドを有効成 分とする本発明の医薬組成物は、 C D 1 4を介して生じる炎症性因子によって引 き起こされる疾患、 具体的には全身性炎症反応症候群、 敗血症もしくはエンドト キシン血症、 敗血症性ショックもしくはエンドトキシンショック、 潰瘍性大 腸炎、 クローン病、 自己免疫反応および疾患、 アレルギー疾患、 癌、 腹膜炎、 移 植片対宿主病、 歯周病もしくは骨粗鬆症等の予防もしくは治療薬として使用する ことができる。 本発明の医薬組成物は肝クッパー細胞上の CD 1 4に、 'より選択 的に作用すると考えられるので、 特に、 敗血症および敗血症性ショックまたは、 それらに起因する全身症状や臓器不全の予防/治療薬として高 、効果が期待でき る。
上記の疾患のうち、 全身性炎症反応症候群 （S I RS) は、 菌血症、 外傷、 熱 傷、 脖炎および手術侵襲が引き金となり生じる状態であり、 重篤化すると多臓器 傷害さらに多臓器不全に陥り死に至る。 S I RSで感染が明らかなものが敗血症 であり、 その代表的なものがエンドトキシン血症である。 但し、 外傷、 熱傷、 手 術侵襲でも外因性に L P Sが進入する以外に腸内細菌叢から腸管粘膜の透過 性が亢進して内因性 L P Sが進入する場合もある （R a v i n A. 等、 F e d. P r o c. 2 1巻、 6 5頁、 1 96 2年） 。 例えば感染が認められなく ても外傷後のショックにより腸管膜動脈の血流量が減少し腸管の生理的バリァが 破綻し、 細菌性トランスロケーションが内因性 LPSに起因するェンドトキシン 血症を引き起こすことが報告されている （Surgery 1 1 0巻、 1 5 4頁、 1 9 9 1年） 。 顕著に肝機能が低下している全ての肝炎、 例えばアルコール性肝 炎、 劇症肝炎または肝硬変では、 内因性の LPSカ壩管から門脈に人り肝機能の 低下に伴い肝臓のクッパー細胞に十分処理されないで大循環に入った場合、 D I Cや多臓器不全が生じることが死の原因になることが報告されている （谷川 久一等、 肝胆脖 2 7卷、 3 8 1頁、 1 9 9 3年） 。 熱傷では熱症部位で感染を合 併し、 血中 LP Sが上昇し TNFに代表される炎症性サイ トカインが産生され病 態を形成することが報告されている （遠藤重厚等、 Burns 、 1 9巻、 1 2 4頁、 1 9 9 3年） 。 腹膜炎は、 グラム陰性菌が大部分を占めるが腸管内常在菌に由来 することもある。 移植片対宿主病は、 骨髄移植においては最も高頻度に生じる疾 患である。 移植片対宿主病では、 移植したリンパ球が宿主組織を攻撃しとくに消 化管で顕著に現れ腸管から L P Sが大循環に進入しェンドトキシン血症を生じる ことが報告されている （Mo o r e KH. 等、 Transplantation 4 4巻、 2 4 9頁、 1 9 8 7年） 。 その他のエンドトキシン血症による重篤な疾患として は、 成人性呼吸器窮迫症候群 （ARD S) や、 急性化膿性胆管炎、 汎発性腹 膜炎、 術後腹腔内膿腫などの重症感染症などがある。
本発明のオリゴヌクレオチドは、 上述のような剤型とした場合、 患者の年 齢や、 性別、 疾患の種類、 程度に応じて、 その投与方法、 その投与量を設定して 使用することができる。 すなわち、 CD 1 4の発現を調節し、 病態を改善するの に適した量を、 経口投与または非経口投与する。 例えば、 連続的にあるいは 1日 あたり 1回若しくは数回に分けて、 0. 0 0 1 ~2 0 0 0 mg/k gが投与され る。 静脈注射の場合は 0. 0 1〜1 0 Omg/k gが好ましい。 また、 本発明の ォリゴヌクレオチドは上記投与量においては十分に安全である。 経口投与には舌 下投与を含む。 非経口投与は、 吸入、 経皮投与、 点眼、 膣内投与、 関節内投与、 直腸投与、 動脈内投与、 静脈内投与、 局所投与、 筋肉内投与、 皮下投与、 腹腔内 投与等から適当な方法を選んで投与すればよ 、。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 これらは一例として示 すものであり、 本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。 また、 以 下の記載において用いる略号は、 当該分野における慣用略号に基づく もので ある。 なお、 実施例中の諸操作は、 主に Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Sambrook J. et al. , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 年） を参考にして行った。 これらを引用して本明細書の内容とする。
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例 1 ヒト CD 1 4遺伝子のクローニング
THP- 1細胞を 7. 1 X 1 05 e e l l s/we l lで 2ゥエル、 6ゥエル プレー卜に植え込み一昼夜 3 7°Cでィンキュベーションした。 終濃度 0. 1 M になるように 1 a,25_DihydroxyvitaminD3 (B I OMO Lリーサーチ社製） を加 えさらに一昼夜培養した。 TH P— 1細胞を回収し l m lの I S OG EN
(TE LTE S T社製） を用いてプロ 卜コールに従い RN Aを抽出した。 次 に Superscript Preampl if ication System (G I B CO社製） によりオリゴ dTプライマ一を用いて抽出した RN Aを铸型とし c DNAライブラリーを作製 した。
作製した c DN Aライブラリ一 1. 5 g、 センスプライマー （5， ACGCGTCGA CGAGTTCACAAGTGTGAAGCCTG 3' ；配列番号 5) 、 アンチセンスプライマ一 (5' ACA TGCATGCTTAATAAAGGTGGGGCAAAGGG 3' ；配列番号 6 ) を用い P f u DNA合成酵素 (Stratagene社製） により 9 4°Cで 3 0秒、 5 5 °Cで 3 0秒、 7 2 °Cで 1 8 0秒 のサイクルを 3 0回繰り返し PCR反応を行った。 増幅した DNA断片と pUC 1 1 8プラスミ ドを S a 1 I制限酵素と S h I制限酵素によりそれぞれ処 理し、 1 %ァガロース電気泳動により精製した。 次に pUC l 1 8切断断片と P CR増幅 DN A断片を 2対 1の量比で混合し Ligation kit (Takara社製） を用い てライゲーション反応を行った。 次にこの反応液を JM 1 0 9細胞にトラン スフヱク トし、 ァガ一プレー卜に播種しー晚 37°Cでィンキュベーショ'ンした。 生じたプラークを採取し PCRにより目的の組換え体 （PUCH14P- 4 plasmid)であ ることを確認した。
実施例 2 ヒ ト CD 1 4ルシフェラ一ゼ融合蛋白発現プラスミ ドの構築
in vitro translationに用いる RN Aを合成するために必要な発現べクタ一を 得るために、 pUCH l 4 P— 4プラスミ ドの H i n d I I Iおよび B amH I 部位で切断した遺伝子断片を発現ベクター （PGEMI u cプラスミ ド） に導入 しクローニングし p GEM 1 u cH 1 4一 9を得た。 次に p GEM 1 u c H 1 4 —9プラスミ ドを铸型とし、 センスプライマー （5' CCCAAGCTTAAGTGTGAAGCCTGAA GCCGCCGG 3' ；配列番号 7) 、 アンチセンスプライマ一 （5' ATGGCGCCGGGCCTTTC TTTATGTTTTTGGCGTCTTCCAGTTGC 3；配列番号 8 ) を用いて P C R反応を行つ た。
反応産物をエタノ一ル沈殿し B b e I制限酵素および H i n d I I I制限酵素 でそれぞれ消化した。 あらかじめ両制限酵素で処理した P GEM 1 u cDNA断 片と P CR増幅産物を常法に従いライゲーションし HB 1 0 1細胞を用いて クロ一ニングし p GEM 1 u c (c t g) H 1 4— 3を得た。
実施例 3 オリゴヌクレオチドの合成
以下の実施例で使用するホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびホスホロ チォエイ トオリゴヌクレオチドは、 0 P Cカラムで精製した調製物を （株） サヮ デ一 .テクノロジ一に合成委託し入手した。 また、 実施例 1 0， 1 1で使用した ホスホロチォエイ トオリゴヌクレオチ ドはマイクロボンダスフエア一 C 8
( 3 0 0オングストローム） で精製した調製物を日清紡に合成委託し入手した。 それぞれヒト C D 1 4に対するオリゴヌクレオチドおよびマウス C D Γ 4に対す るオリゴヌクレオチドを表 1、 2、 3、 5、 6に示した。 なお、 表 1、 2、 3、
5、 6において P二 Sとは、 ホスホジエステル結合において 1原子の酸素 （〇） がィォゥ原子 （S ) に置換していることを示し、 P = 0は置換を行っていないこ とを示す。
また、 以下の実施例で用いたコントロールオリゴヌクレオチドには、 配列を指 定せず、 4種類のアミダイ トを混合し、 ランダムな D N A合成を行つて得た無秩 序な配列のホスホジエステルオリゴヌクレオチドの混合物もしくはホスホロチォ ェ一トオリゴヌクレオチドの混合物を用いた。
ヒ ト C D 1 4をコードする遺伝子に対するォリゴヌクレオチド （その 1 ) 表 1の 1
オリゴヌクレオチド 配 列 塩基長 修飾 配列番号 SH0013A CGGCTTCCAGGCTTCACACT 20mer P S 9 SH0023A CGGCACCCGGCGGCTTCCAG 20mer P=S . 1 0 SH0033A TCCTACACAGCGGCACCCGG 20mer P=S 1 1 SH0038A TTCTTTCCTACACAGCGGCA 20mer P=S 1 2 SH0043A TTAGCTTCTTTCCTACACAG 20mer P=S 1 3 SH0048A GTGCTTTAGCTTCTTTCCTA 20mer P=S 1 4 SH0053A TGGAAGTGCTTTAGCTTCTT 20mer P=S 1 5 SH0063A GGACAGGCTCTGGAAGTGCT 20mer P=S 1 6 SH0073A TCTGAGCTCCGGACAGGCTC 20mer P=S 1 7 SH0083A CTTCCGAACCTCTGAGCTCC 20mer P=S 1 8 SH0093A GTCGATAAGTCTTCCGAACC 20mer P=S 1 9 SH0096A ATGGTCGATAAGTCTTCCGA 20mer P=S 2 0 SH0099A TCCATGGTCGATAAGTCTTC 20mer P=S 2 1 SH0102A CGCTCCATGGTCGATAAGTC 20mer P=S 2 2 SH0104A CGCGCTCCATGGTCGATAAG 20mer P=S 2 3 SH0105A GCGCGCTCCATGGTCGATAA 20mer P=S 2 4 SH0106A CGCGCGCTCCATGGTCGATA 20mer P=S 2 5 SH0107A ACGCGCGCTCCATGGTCGAT 20mer P=S 2 6 SH0108A GACGCGCGCTCCATGGTCGA 20mer P=S 2 7 SH0109A GGACGCGCGCTCCATGGTCG 20mer P=S 2 8 SH0112A GCAGGACGCGCGCTCCATGG 20mer P=S 2 9 SH0114A AAGCAGGACGCGCGCTCCAT 20mer P=S 3 0 SH0116A ACAAGCAGGACGCGCGCTCC 20mer P=S 3 1 ヒト C D l 4をコードする遺伝子に対するオリゴヌクレオチド （その 2 ) 表 1の 2
オリゴヌクレオチド 配 列 修飾 配列番号 SH0117A AACAAGCAGGACGCGCGCTC 20mer P=S 3 2 SH0118A CAACAAGCAGGACGCGCGCT 20mer P=S 3 3 . SH0120A AGCAACAAGCAGGACGCGCG 20mer P=S 3 4 SH0122A GCAGCAACAAGCAGGACGCG 20mer P=S 3 5 SH0124A CAGCAGCAACAAGCAGGACG 20mer P=S 3 6 SH0126A AGCAGCAGCAACAAGCAGGA 20mer P=S 3 7 SH1231A TCTTGGATCTTAGGCAAAGC 20mer P=S 3 8 SH1241A CATTATTCTGTCTTGGATCT 20mer P=S 3 9 SH1256A CAGTTTGAGTCCATTCATTA 20mer P S 4 0 SH1259A AGGCAGTTTGAGTCCATTCA 20mer P=S 4 1 SH1261A CAAGGCAGTTTGAGTCCATT 20mer P=S 4 2 SH1262A CCAAGGCAGTTTGAGTCCAT 20mer P=S 4 3 SH1263A GCCAAGGCAGTTTGAGTCCA 20mer P=S 4 4 SH1264A AGCCAAGGCAGTTTGAGTCC 20mer P=S 4 5 SH1265A AAGCCAAGGCAGTTTGAGTC 20mer P=S 4 6 SH1266A GAAGCCAAGGCAGTTTGAGT 20mer P=S 4 7 SH1267A TGAAGCCAAGGCAGTTTGAG 20mer P=S 4 8 SH1268A CTGAAGCCAAGGCAGTTTGA 20mer P=S 4 9 SH1269A CCTGAAGCCAAGGCAGTTTG 20mer P=S 5 0 SH1270A CCCTGAAGCCAAGGCAGTTT 20mer P=S 5 1 SH1271A CCCCTGAAGCCAAGGCAGTT 20mer P=S 5 2 SH1273A CTCCCCTGAAGCCAAGGCAG 20mer P=S 5 3 SH1276A GGACTCCCCTGAAGCCAAGG 20mer P=S 5 4 SH1281A TGACGGGACTCCCCTGAAGC 20mer 5 5 ヒト C D 1 4をコ一ドする遺伝子に対するオリゴヌクレオチド （その 3 ) 表 1の 3
オリゴヌクレオチド 配 列 修飾 配列番号 SH1291A CTCAACGTCCTGACGGGACT 20mer P=S 5 6 SH1301A TCGAAAAGTCCTCAACGTCC 20mer 5 7· SH1311A GTTGAATTGGTCGAAAAGTC 20mer P=S 5 8 SH1331A TAATAAAGGTGGGGCAAAGG 20mer P=S 5 9 0H0013A CGGCTTCCAGGCTTCACACT 20mer P=0 6 0 OH0023A CGGCACCCGGCGGCTTCCAG 20mer P=0 6 1 0H0033A TCCTACACAGCGGCACCCGG 20mer P=0 6 2 0H0043A TTAGCTTCTTTCCTACACAG 20mer P=0 6 3 0H0053A TGGAAGTGCTTTAGCTTCTT 20mer P=0 6 4 0H0063A GGACAGGCTCTGGAAGTGCT 20mer P=0 6 5 OH0073A TCTGAGCTCCGGACAGGCTC 20mer P=0 6 6 0H0083A CTTCCGAACCTCTGAGCTCC 20mer P=0 6 7 0H0092A GTCGATAAGTCTTCCGAACC 20mer P=0 6 8 0H0096A ATGGTCGATAAGTCTTCCGA 20mer P=0 6 9 0H0099A TCCATGGTCGATAAGTCTTC 20mer P=0 7 0 OH0102A CGCTCCATGGTCGATAAGTC 20mer P=0 7 1 0H0103A GCGCTCCATGGTCGATAAGT 20mer P=0 7 2 0H0104A CGCGCTCCATGGTCGATAAG 20mer P 0 7 3 0H0105A GCGCGCTCCATGGTCGATAA 20mer P=0 7 4 OH0106A CGCGCGCTCCATGGTCGATA 20mer P=0 7 5 0H0107A ACGCGCGCTCCATGGTCGAT 20mer P=0 7 6 0H0108A GACGCGCGCTCCATGGTCGA 20mer P=0 7 7 0H0109A GGACGCGCGCTCCATGGTCG 20mer P=0 7 8 0H0110A AGGACGCGCGCTCCATGGTC 20mer P=0 7 9 ヒ ト C D 1 4をコードする遺伝子に対するオリゴヌクレオチド （その 4 ) 表 1の 4
オリゴヌクレオチ卜" 酉己 歹 塩基長 修飾 配列番号 0H0111A CAGGACGCGCGCTCCATGGT 20mer P=0 8 0 0H0112A GCAGGACGCGCGCTCCATGG 20mer P=0 8. 1 0H0113A AGCAGGACGCGCGCTCCATG 20mer P=0 8 2 OH0114A AAGCAGGACGCGCGCTCCAT 20mer P=0 8 3 OH0118A CAACAAGCAGGACGCGCGCT 20mer P=0 8 4 0H0102A-15mer CATGGTCGATAAGTC 15mer P=0 8 5 OH0102A-18mer CTCCATGGTCGATAAGTC 18mer P=0 8 6 0H0102A-19mer GCTCCATGGTCGATAAGTC 19mer P=0 8 7 OH0102A CGCTCCATGGTCGATAAGTC 20mer P=0 7 1 OHO腿 - 21mer GCGCTCCATGGTCGATAAGTC 21mer P=0 8 8 0H0102A-22mer CGCGCTCCATGGTCGATAAGTC 22mer P=0 8 9 OH0102A-25mer ACGCGCGCTCCATGGTCGATAAGTC 25mer P=0 9 0 OH0102A-30mer GCAGGACGCGCGCTCCATGGTCGATAAGTC 30mer P-0 2 2 4
マウス C D 1 4をコードする遺伝子に対するオリゴヌクレオチド 表 2
オリゴヌクレオチド 配 列 塩基長 修飾 配列番号
SM0097A CATGGTCGGTAGATTCTGAA 20mer P=S 9 -1
SM0101-0220A CACACGCTCCATGGTCGGTAGATTC 25mer P=S 9 2
SM0102A-25mer GCACACGCTCCATGGTCGGTAGATT 25mer P=S 9 3
SM0103A-25mer AGCACACGCTCCATGGTCGGTAGAT 25mer P=S 9 4
SM0104A-25mer AAGCACACGCTCCATGGTCGGTAGA 25mer P=S 9 5
SM0105A-25mer CAAGCACACGCTCCATGGTCGGTAG 25mer P=S 9 6
SM0106A-25mer CCAAGCACACGCTCCATGGTCGGTA 25mer P=S 9 7
SM0107-0226A GCCAAGCACACGCTCCATGGTCGGT 25mer P:S 9 8
-25mer
S 0109-25mer AAGCCAAGCACACGCTCCATGGTCG 25mer P=S 9 9 SM0111-25mer ACAAGCCAAGCACACGCTCCATGGT 25mer P:S 1 0 0 SM0105A-21mer CACACGCTCCATGGTCGGTAG 21mer P=S 2 5 8
実施例 4 ヒ ト CD 1 4 RNAの合成
In vitro transcription反応は、 Ribo max system (プロメガ社製） を用いて 添付の方法に準じて行った。 p GEM 1 u c (c t g) H 1 4— 3プラスミ ドを Xh 0 Iで消化し Kl enow fragment で末端を平滑化した。 次にこの 20 gの p GEM 1 u c (c t g) H 1 4— 3をテンプレートとし 7メチルグァ二'ン存在下 SP 6ポリメラ一ゼを用いて、 37 °Cで 4時間インキュベー卜することにより in vitro transcription反応を行った。 DNa s eで反応物を処理しフヱノールで 抽出した。 その反応液をエタノール沈殿し、 生じた RN Aペレツ トを風乾後、 蒸 留水に溶解した。 合成した RNAは、 変性ァガロース電気泳動により 1. 4 k b の単一バンドであること確認した。
実施例 5 ヒト非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドによる CD 1 4翻訳阻 害活性の検出
in vitro translation反応はプロメガ社 Rabbi t Reticulocyte Lysate System を用いて添付の方法に準じて行った。 すなわち、 合成した p G EM 1 u c (c t g) H I 4— 3 RNAと被験未修飾オリゴヌクレオチドを 1対 1 0で混合 し 60°Cで 2分間加熱した。 その後混合液にアミノ酸、 Rabbit Reticulocyte Lysateを加えて、 30 °Cで 2時間ィンキュベー卜した。 1 0 1の反応混合液と 当量の発光基質液 （luciferase assay system ：プロメガ社） を混合し 5秒間室 温で反応させ反応液の発光強度を発光測定器 （LumatLB96P) を用いて測定した。 その結果を図 1に示す。 翻訳阻止活性はコントロールォリゴヌクレオチド （ラン ダムな配列を持つ 20 me rのフォスフォジエステルオリゴヌクレオチド） 処理 時の蛍光量を 1 0 0 %として算出した。 3 0 %以上の阻害活性を示す配列 は、 OH 0 0 1 3 A、 OH 0 0 2 3 A, OH 0 0 3 3 A, OH 0 0 4 3 A, OH 0 053 A, OH 0 099 A, OH 0 1 0 2 A, OH 0 1 0 3 A. OHO 1 04 A、 OH 0 1 05 A、 OH 0 1 06 A、 OH 0 1 0 7 A、 OH 0 1 08 A, OH 0 1 09 A、 OH 0 1 1 0 A、 OH 0 1 1 2 Aおよび〇H 0 1 1 4 Aであつ た。 特に翻訳開始部位の近傍に強い翻訳阻害活性が見出された。 ' 実施例 6 異なる塩基長のォリゴヌクレオチドの C D 1 4翻訳阻害活性
塩基長の異なる 8種類のアンチセンスオリゴヌクレオチド （OHO 1 0 2 A- 1 5me r、 OH0 1 02A— 1 8me r、 OH0 1 02A— 1 9me r、 OH 0 1 02 A、 OH0 1 0 2A— 2 1me r、 0 H 0 1 0 2 A - 2 2 m e r . OH 0 1 02A— 25me r、 OHO 1 0 2 A- 30 me rそれぞれの塩基長は 1 5 m e r , 1 8 m e r , 1 9 m e r , 2 0 m e r , 2 1 m e r , 2 2 m e r , 25 me r， 3 Ome r) およびコントロールオリゴヌクレオチドを用い実施例 5の 方法で翻訳阻止活性を検討した。 その結果、 塩基長によらず用いた全てのオリゴ ヌクレオチドで翻訳阻害活性が検出された （図 2) 。
実施例 7 ヒト T N F α産生阻害活性の測定 （ 5 ' 非翻訳領域および翻訳開始部 位近傍）
ΤΗΡ- 1細胞を 1 0 %非働化牛胎児血清を含む RPMI 1 640培地に浮遊 し、 1 X 1 0 5 e e l I s /we l lで 2 4ゥエルプレ一卜に植え込み 1 0 n g/m 1の Phorbol 12-Myristate 13- Acetate (SIGMA社製） 存在下 24時間 培養した。 培地を交換し、 終濃度 1 0 0 nMになるようにォリゴヌクレオチド溶 液を培養液に加えた。 4時間インキュベーションした後、 培養上清を除去し細胞 を洗浄した。 細胞を再び 4 0 n g/m 1の 1 a, 25-Di hydroxy v ami nD3 (BI0M0L リサーチ社製） 存在下 1 0%非働化牛胎児血清を含む RPMI 1640培地で 2 0時間培 養した。 細胞を洗浄後、 1 ng/m lのリポ多糖 （LPS) (E. coli 055： B5. Difco 社製） を添加した 2 %ヒ ト血清を含む RPMI1640に置換した。 4時間ィ ンキュベ一シヨンし、 培養上清を採取した。 培養上清中の TNF は、 ヒト TN F aELISA SYSTEM (アマシャ厶社製） で測定した。 '
TNF αの測定はヒ ト TNF ELISA SYSTEM添付のプロ トコールに従い 行った。 即ち、 適切に希釈した培養上清 5 0 a 1を反応プレー卜に移し 5 0 ILL 1のビォチン化抗体溶液を加えて室温で 2時間放置した。 反応液を除去し 40 0 zl /we 11の洗浄液で 3回各ゥヱルを洗浄した。 適切に希釈したペルォキシ ダ一ゼを標識したストレプトアビジン溶液を 1 0 0 1加え、 さらに 30分放置 した。 洗浄後、 発色基質 1 0 0 1を添加し 1 5分間反応させた。 停止液 1 00 1を加え反応を停止し、 450 nmの波長の吸光度を測定し、 サンプル中の T NF 値を算出した。 その結果を図 3に示す。
TN F a産生阻害活性は、 SH0023A 、 SH0033A 、 SH0038A 、 SH0043A 、 SH0063A、 SH0093A、 SH0096A、 SH0099A、 SH0102A、 SH0104A、 SH0105A、 SH 0106A、 SH0107A、 SH0108A、 SH0109A、 SH0112A、 SH0117A、 SH0118A、 SH01 20A、 SH0122A、 SH0124Aおよび SH0126Aで検出された。 この結果は実施例 4の 翻訳阻害活性を示したオリゴヌクレオチドの結果と良く相関していた。
また、 活性を示す配列は大きく分けてヒト CD 1 4mRNAの 5' 非翻訳領域 および翻訳開始部位近傍 3つの領域に相補的であることが見出された。 活性領域 1は CUGGAAGCCGCCGGGUGCCGCUGUGUAGGAAAGAAGCUAAAの配列の一部に相補的に結合 するオリゴヌクレオチドにより示された。 活性領域 2は GGUUCGGAAGACUUAUCGACCA UGGAGCGCGCGUCCUGC の配列の一部に相補的に結合するォリゴヌクレオチドにより 示された。 さらに活性領域 3は活性領域 2と重なつて存在し GAGCGCGCGUCCUGCUUG UUGCUGCUGCU の配列の一部に相補的に結合するオリゴヌクレオチドにより示され た。
実施例 8 ヒト T N F 産生阻害活性の測定 （ 3 ' 非翻訳領域） '
実施例 7と同一な方法でヒト C D 1 4 m R N Aの 3 ' 非翻訳領域に対するオリ ゴヌクレオチドの T N F α産生阻害実験の結果を図 4に示す。
T N F ひ産生阻害活性は、 SH1241A 、 SH1256A 、 SH1259A 、 SH1261A 、 SH1264A、 SH1265A 、 SH1266A 、 SH1267A 、 SH1268A、 SH1269A 、 SH1270A 、 SH 1271A 、 SH1273A、 SH1276A 、 SH1281A 、 SH1291A 、 SH1301A 、 SH1311A および SH1331A で検出された。 また、 活性を示す配列は大きく分けて 4つの領域に相補 的であることが見出された。 活性領域 4は AGAUCCAAGACAGAAUAAUGAAUGGACUCAAACU GCCUUGの配列の一部に相補的に結合するオリゴヌクレオチドにより示された。 活 性領域 5は GGACUCAAACUGCCUUGGCUU の配列の一部に相補的に結合するオリゴヌク レオチドにより示された。 さらに活性領域 6は活性領域 5と重なって存在し CUCA AACUGCCUUGGCUUCAGGGGAGUCCCGUCAGGACGUUGAGGACUUUUCGAの配列の一部に相補的に 結合するオリゴヌクレオチドにより示された。 さらに活性領域 7は GGACGUUGAGGA CUUUUCGACCAAUUCAACCCUUUGCCCCACCUUUAUUAの配列の一部に相補的に結合するオリ ゴヌクレオチドにより示された。
実施例 9 マウス T N F 産生阻害活性の測定 （ 5 ' 非翻訳領域および翻訳開始 部位近傍）
J774A. 1 細胞を 1 0 %非働化牛胎児血清を含む D M E M培地に浮遊し、 0 . 5 1 05 eel ls/wellで 2 4ゥヱルプレートに植え込み 2 4時間培養した。 培地交 換し終濃度 1 0 0 nMになるようにオリゴヌクレオチド溶液を培養液に加えた。 4時間インキュベーションした後、 培養上清を除去し細胞を洗浄した。 1 0%非 働化牛胎児血清を含む RPMI 1640培地で 2 0時間培養した。 細胞を洗浄後、 リポ多 糖 （L P S) (E. coli 0111 ： B4、 DIFC0社製） を終濃度 1 0 0 n g/'m 1にな るように添加した。 2 %マウス血清を含む DMEMに置換した。 4時間インキュ ベーシヨンし、 培養上清を採取した。 培養上清中の TN Faは、 マウス TNFa EL I SA SYSTEM (アマシャム社製） で測定した。
TNF αの測定はマウス TNF aELISA SYSTEM添付のプロトコ一ルに従い行つ た。 すなわち、 適切に希釈した培養上清 5 0 n 1を反応プレー 卜に移し 5 0 i 1のピオチン化抗体溶液を加えて室温で 2時間放置した。 反応液を除去し 4 0 0 1 /w e 1 1の洗浄液で 3回各ゥヱルを洗浄した。 適切に希釈したペル ォキシダーゼを標識したストレブトアビジン溶液を 1 0 0 1加えさらに 3 0分 放置した。 洗浄し、 発色基質を 1 0 0 1を添加し 1 5分間反応させた。 停止液 I 0 0 lを加え反応を停止し、 4 5 0 nmの波長の吸光度を測定し、 TNFひ 値を算出した。 その結果を図 5に示した。
マウス T N Fび産生阻害活性は、 マウス CD 1 4mRN Aの翻訳開始領域近傍 に相補的配列を持つアンチセンス化合物、 例えば SM0101-0220A、 SM0102A-25 mer 、 SM0103A-25mer 、 SM0104A-25mer 、 SM0105A-25mer 、 SM0106A-25mer 、 SM 0107- 0226A_25merおよび SM0109- 25merで強い活性が検出された。
実施例 1 0 マウスショックモデルにおける SM0 1 0 5 Aの効果
マウス CD 1 4をコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド SMO 1 0 5 A- 2 1 me rを使用して、 以下の実験を行った。
( 1 ) 致死性ェンドトキシンショックモデルにおける効果
生後 6週齢の B a 1 b/c雄性マウス （日本チャールズリバ一社製） を、 体重 を基に 7群 （各群 1 0匹） に群分けした。 その後 SMO 1 0 5 Aオリゴヌクレオ チドを 3 mgZk gから 0. 3 mgノ k g、 コント口一ルォリゴヌ'クレオチ ド （ランダムな配列を持つ 2 1 m e rのフォスフォロチォェ一 トオリゴヌ クレオチド） を 3mg/kg〜0. 3 mgZk gあるいは生理食塩液 1 0m l/ kg (陰性対照用、 大塚製薬） を尾静脈より単回投与した。
被験薬物投与の 2 4時間後に、 L P S (E. coli 055 :B5, Difco社製） 5 g/k gおよびガラク トサミン （D- Galactosamine hydrochloride，和光純薬社 製） 700 mg/k gを尾静脈より投与し、 ショックを誘発した。 メチルプレド ニゾロン 0. 3 mg/k gは LPS投与直前に投与した。 ショック誘発後 24時 間目まで経時的に生存率を判定した。
結果を図 6に示した。 陰性対照群である生理食塩液投与群ではショック誘発後 9時間目までに全例死亡した。 また、 コントロールオリゴヌクレオチドを投与し た群では何れの投与量においてもショック誘発後 1 0時間目までに全例死亡 した。 一方 SMO 1 0 5 Aオリゴヌクレオチド投与群では、 3 mg/k g投 与群では 2 4時間後でも全例生存し、 1 mg/k g投与群では 9例、 0. 3 mgZk g投与群でも 2例の生存が確認された。 SM0 1 05 Aを 0. 3mg/ k g投与した時の生存率は、 同用量のメチルプレドニゾロンを投与した時の生存 率と同等であった。 この結果より、 SMO 1 05 Aの用量依存的な生存率改善作 用が確認された。 ( 2 ) 致死性ェンドトキシンプレショックモデルにおける S M 0 1 0 5 Aの効 果
Matsumoto, T. 等の方法 (FBMS Immunology and Medical Microbiology 17, 171-178 (1997) ) の方法に準じて行った。 自由摂水 ·摂餌した 6週齢の雄 性 Balb/cマウスに、 サイクロフォスフアミ ド （cyclophosphamide；以下 C PA) を 200 mg/k gの用量で尾静脈投与した。 CPA投与後 7日目に、 生理食塩水 に溶解したィ一タカラゲニン (Iota carrageenan (Sigma 社製) ) ¾· 5 m g 腹腔内投与した。 ィ一タカラゲニンの投与後 1 2時間に L P S (E. coli 127 ： B8 、 Difco 社製） を 3 0 gノ k gの用量で尾静脈より投与し、 LPS投与後 1および 2 4時間に、 へパリン溶液 （1000 IU/mK 持田製薬） で処理しておいた ガラス毛細管 （Dru謹 ond Scientific Company ) を用いて、 5 0 1眼底静脈よ り採取した血液を遠心分離して血漿を採取し、 G P T活性を血中 G P T活性測定 用スライ ド GPT/ALT- P 、 富士フィルム） および富士 DRI-CHEM 5000 (富士フィル ム） を用いて測定した。 溶媒 （生理食塩水） 、 コントロールオリゴヌクレオチド および SM0 1 0 5 Aは、 LPS投与前 2 4時間に 1 0m l /k gの容量で尾静 脈より投与し、 水溶性プレドニゾロン （prednisolone) は LPS投与直前に同様 にして投与した。
その結果、 溶媒投与群で 5 0 %の生存率に比較し SM0 1 0 5 A投与群および プレドニゾロン投与群では 1 0 0 %の生存率を示した。 SM 0 1 0 5 A投与群で は肝臓において G T Pの著しレ、上昇の抑制が見出されたが、 このような効果はプ レドニゾロン投与群では確認できなかった （図 7) 。 実施例 1 1 マウスにおける急性毒性
SM 1 0 5 A- 2 1 me rを使用して以下の実験を行った。
生後 6週齡の B a 1 b/c雄性マウス （日本チャールズリバ—社製） を、 体重 を基に 2群 （各群 4匹） に群分けした。 その後、 SM0 1 0 5A、 コントロール オリゴヌクレオチド （ランダムな配列を持つ 2 1 me rのフォスフォロ 'チォェ一 トオリゴヌクレオチド） をそれぞれ 3 0 mg/k g、 あるいは生理食塩水 1 Om l/kg (陰性対照用、 大塚製薬社製） を尾静脈より単回投与した。 その 後 7日目まで経時的に生存率もしくは血中 G 0 T値を測定した。
生理食塩水投与群およびォリゴヌクレオチド投与群とも全例生存しまた血中 G OT値も正常域内であり、 両群で差がなかった。
実施例 1 2 ヒト CD 1 4ルシフェラーゼ融合蛋白質発現阻害活性の測定
(1) ヒ ト CD 1 4ルシフェラ一ゼ融合蛋白質を発現する He L a組換え細胞 株の樹立
ヒト CD 1 4ルシフヱラ一ゼ融合蛋白発現阻害実験に用いる H e L a組換え細 胞株を樹立するために、 ヒト CD 1 4ルシフヱラーゼ融合蛋白質発現プラスミ ド (pMl 65 1) の構築を行った。 すなわち実施例 2で作製した p GEM 1 u c H 1 4— 9より H i nd i I Iおよび Xh o Iで切断した遺伝子断片を p c DN A3. 1 (+ ) ( I n v i t r o g e n社） の H i n d I I I /Xh o Iサイ ト に常法に従い挿入し、 JM1 09細胞を用いてクローニングし pM 1 6 5 1を得 た。
ヒ ト子宮頸癌由来細胞である He L a細胞に pMl 6 5 1を導入し、 ヒ ト CD 1 4ルシフエラーゼ融合蛋白質を発現する H e L a組換え細胞株の樹立を 行った。 すなわち直径 1 0 0 mmの d i s hに 5 x 1 05 個の H e L a細胞を植 え込み、 一晚培養した後に 1 0〃gの pMl 6 5 1をリン酸カルシウム法で導入 した。 1 0 %牛胎児血清を含む D MEM培地にて一晩培養した。 細胞を 9 6ゥヱ ルプレートに 1 0 0あるいは 5 0 0個/ゥエルずつ播種し、 その翌日から G 一 4 1 8を含む培地で組換え細胞株の選択を行った。 得られた G— 4 Γ8耐性株 のうちルシフェラーゼ活性を示した H e 1 6 5 1 d 3 - 2 0クローンを用いてァ ンチセンスオリゴによる蛋白質発現阻害実験を行つた。
(2) ヒト CD 1 4ルシフェラ一ゼ融合蛋白発現阻害活性の測定 （5' 非翻訳 領域、 翻訳開始部位近傍領域および 5' 翻訳領域）
( 1 ) で準備した H e L a組換え細胞 （H e 1 6 5 1 d 3 - 2 0 ) を 1 0 %牛胎児血清、 0. 6 mg/mLG— 4 1 8を含む DMEM培地に浮遊し、 1 X 1 05 c e 1 1 s/we 1 1で 2 4ゥエルプレー 卜に植え込み一晩培 養した。 大塚生理食塩水で 2度洗浄した後に、 O p t i — MEM培地 (G i b c o BRL社） を 4 5 0 z L/w e 1 1添加した。 引き続き、 G i b c o B R L社のマニュアルに従い、 リボフヱクチンと配列番号 9， 10， 11， 12, 13， 14, 15, 16， 17， 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 37 のオリゴヌクレオチド終濃度 1 00 n Mをになるように添加し、 37 °Cで 6時間 イ ンキュベーショ ンし培養上清を除去し洗浄した。 細胞を再び 1 0 %牛胎児 血清、 0. 6 mg/mLG— 4 1 8を含む DMEM培地でさらにー晚培養した。 細胞を洗浄後、 P a s s i v e L y s i s B u f f e r (P r om e g a 社） に細胞を溶解した。 そのうち 2 0〃 Lを用い、 細胞溶解液中のルシフエ ラ一ゼ活性を測定した。 ルシフヱラーゼ活性測定は P r 0 m e g a社のプ 口 トコールに従い行った。 即ち、 蛍光測定用プレー ト （D YN E X社、 M i c r o l i t e 2 p l a t e) 中で細胞溶解液と L u c i f e r a s e A s s a y R e a g e n t I I (P r om e g a社） を混合し反応を開始 し、 1 0秒間の発光強度を測定した。 測定には b e r t h 0 1 d社のルミノメー 夕一 （LB 9 6 P) を用いた。 各オリゴヌクレオチドの蛋白発現阻害活性はオリ ゴヌクレオチドを添加しないサンプルの発光強度を 1 0 0 %として計算した。 そ の結果を、 図 8に示す。 5'非翻訳領域で 4 0 %以上の阻止活性を示したアンチセ ンスオリゴヌクレオチドは SH0023A 、 SH0033A、 SH0038A および SH0043Aであつ た。 一方、 翻訳開始領域で 4 0 %以上の阻止活性を示したアンチセンスオリゴヌ ク レオチドは、 SH0102A 、 SH0104A 、 SH0105A 、 SH0106A 、 SH0107A 、 SH0108A 、 SH0109A 、 SH0112A 、 SH0114A 、 SH0117A 、 SH0118A 、 SH0122A およ び SH0126Aであった。 これらの細胞を用いた蛋白発現抑制活性の結果は、 実施例 5の in vitro translation反応による C D 1 4翻訳阻害活性の結果によく一致し ていた。
実施例 1 3 RNase H切断実験によるアンチセンスオリゴ結合測定
2 gの実施例 4で得たヒト C D 1 4に対する R N Aと表 3に示した被験未修 飾ォリゴヌクレオチドを 1 ： 1のモル比で混合し、 5倍濃度の RNaseH緩衝液 1 1および適量の蒸留水を加え 4 1の混合液を調整した。 この混合液を 7 5 °Cで加熱した後冷却し、 0. 0 5 Uの RNaseHを加え 3 7 °Cで 1 5分間反 応した。 10〃 1の 2倍濃度の停止溶液 （ 9 5 %ホルムァミ ド、 0.5mMEDTApH8.0、 0.025% SDS、 0.025% Xylene CyanoK 0.025% BPB) を加えて反応を停止し た。 4〃 1の被験物を 6 5 °Cで前処理し、 6 M尿素変性 5 %ポリアクリルァミ ド ゲル （幅 1 6 0 mm、 高さ 3 3 0 mm、 厚さ 0. 3 5 mm) で 1 5 mAZプレー 卜で電気泳動した。 5 0 0 0倍に希釈した SYBER Green Π (和光純薬製） で染色 し生じたバンドを Fluorlmager SI (モリキュラーダイナミックス社製） で測定し た。 結合活性のスコア一は以下の式により算定した。
結果を表 4にまとめた。 ' 結合値二 （被験ォリゴヌクレオチド蛍光値一コントロ一ルォリゴヌクレオチド蛍 光値） Z (SH0102A蛍光値一コントロールオリゴヌクレオチド蛍光値）
スコア- 結合値
0. 5 >X
0. 9 >X≥ 0. 5
2 1. 3 >X≥ 0. 9
3 X≥ 1. 3
表 3の 1
オリゴヌクレオチド 配 列 修飾 配列番号
0H0083A- 15mer GAACCTCTGAGCTCC P=0 15mer 101
0H0102A- 15mer CATGGTCGATAAGTC P=0 15mer 85
0H0104A- 15mer TCCATGGTCGATAAG P=0 15mer 102
0H0114A- 15mer GGACGCGCGCTCCAT P=0 15mer 103 .
0H0134A- 15mer AGCAGCAGCAGCAAC P=0 15mer 104
0H0144A- 15mer CACCAGCGGCAGCAG P=0 15mer 105
0H0154A- 15mer CAGAGACGTGCACCA P=0 15mer 106
0H0164A- 15mer GGCGTGGTCGCAGAG P=0 15mer 107
0H0174A- 15mer ACAAGGTTCTGGCGT P=0 15mer 108
0H0184A- 15mer CGTCCAGCTCACAAG P=0 15mer 109
0H0194A- 15mer AAATCTTCATCGTCC P=0 15mer 110
0H0204A- 15mer GACGCAGCGGAAATC P=0 15mer 111
0H0214A- 15mer AGAAGTTGCAGACGC P=0 15mer 112
0H0224A- 15mer TGAGGTTCGGAGAAG P=0 15mer 113
0H0234A- -15mer CCAGTCGGGCTGAGG P=0 15mer 114
0H0244A- 15mer AGGCTTCGGACCAGT P=0 15mer 115
0H0254A- 15mer ACACACTGGAAGGCT P=0 15mer 116
0H0264A- -15mer TACTGCAGACACACA P=0 15mer 117
0H0274A- -15mer TCTCCACCTCTACTG P=0 15mer 118
0H0284A- -15mer CCGGCATGGATCTCC P=0 15mer 119
0H0294A- 15mer GTTGAGACCGCCGGC P=0 15mer 120
0H0304A- -15mer ACGGCTCTAGGTTGA P=0 15mer 121 6
J3UIQI
Figure imgf000051_0001
(Μ 0=d aiVllOODOO!OOlV jams卜 v 6 OHO 68ΐ J9UIQ J 0=d 130100V11131V11 J3uisi- v 8 OHO
8ei 0 d OV01D30V0310310 1¾卜 w OHO
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π\ 0=d lOOOOOOOVOOOVOV
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LZl J9UIQ1; 0=d 101003V011000V0 Jams卜 νί^εθΗΟ
Figure imgf000051_0003
ζζ\ 0=d 0003VVV0VIXX003 J9uigi-V^T80HO
-^ ^ ^ n n 6dT/X3J 表 3の 3
ォリゴヌクレオチド 配 列 修飾 配列番号
0H0514A- 15mer CTTCCAGAGGCAGCG P=0 15mer 142
0Η0524Α- 15mer AGTCCTGTGGCTTCC P=0 15mer 143
0Η0534Α- 15mer GGAAAGTGCAAGTCC P=0 15mer 144
0Η0544Α- 15mer GGCGCAAGCTGGAAA P=0 15mer 145.
0Η0554Α- 15mer ACGTTGCGTAGGCGC P=0 15mer 146
0Η0564Α- 15mer CGCCCACGACACGTT P=0 15mer 147
0Η0574Α- 15mer AACGCCCTGTCGCCC P=0 15mer 148
0Η0584Α- 15mer GCGAGCCAAGAACGC P=0 15mer 149
0H0594A- 15mer CTGCAGCTCGGCGAG P=0 15mer 150
0H0604A- 15mer TGAGCCACTGCTGCA P 0 15mer 151
0H0614A- 15mer AGGCCTGGCTTGAGC P=0 15mer 152
OH0624A- 15mer CAGTACCTTGAGGCC P 0 15mer 153
ΟΗ0634Α- 15mer GGGCAATGCTCAGTA P=0 15mer 154
ΟΗ0644Α- 15mer GAGTGTGCTTGGGCA P=0 15mer 155
0Η0654Α- 15mer AAAGGCAGGCGAGTG P=0 15mer 156
0Η0664Α- 15mer GTTCGTAGGAAAAGG P=0 15mer 157
0Η0674Α- -15mer GCGCGAACCTGTTCG P=0 15mer 158
0Η0684Α- 15mer GGCCGGGAAGGCGCG P=0 15mer 159
0H0694A-15mer GGCTGGTAAGGGCCG P=0 15mer 160
0Η0704Α- -15mer GACAGGTCTAGGCTG P=0 15mer 161
表 3の 4
オリゴヌクレオチド 配 列 修飾 配列番号
0H0714A- 15mer AGGATTGTCAGACAG P=0 15mer 162 0H0724A-15mer CGCCCAGTCCAGGAT P=0 15mer 163 0H0734A-15mer AGTCCGCGTTCGCCC P=0 15mer 164 0H0744A-15mer AGCCGCCATCAGTCC P=0 15mer 165 · 0H0754A-15mer GGGGACAGAGAGCCG P=0 15mer 166 0H0764A-15mer GGGAACTTGTGGGGA P=0 15mer 167 0H0774A-15mer CTGGATGGCCGGGAA P=0 15mer 168 0H0784A-15mer GCGCTAGATTCTGGA P=0 15mer 169 0H0794A-15mer GTGTTGCGCAGCGCT P=0 15mer 170 OH0804A-15mer CTCCATTCCTGTGTT P=0 15mer 171 0H0814A- 15mer CTGTGGGCGTCTCCA P=0 15mer 172 0H0824A-15mer GCGCACACGCCTGTG P=0 15mer 173 0H0834A- 15mer CGCCAGTGCGGCGCA P=0 15mer 174 0H0844A- 15mer CACCTGCCGCCGCCA P=0 15mer 175 0H0854A-15mer TGGGGCTGCACACCT P=0 15mer 176 0H0864A-15mer GTCTAGGCTGTGGGG P=0 15mer 177 0H0874A-15mer TGTGGCTGAGGTCTA P=0 15mer 178 0H0884A- 15mer CGCAGCGAGTTGTGG P=0 15mer 179 0H0894A-15mer TACGGTGGCGCGCAG P=0 15mer 180 OH0904A-15mer CGCTAGGGTTTACGG P=0 15mer 181 0H0914A- 15mer CATCTCGGAGCGCTA P=0 15mer 182 0H0924A-15mer GGACCACATGCATCT P=0 15mer 183 0H0934A-15mer TCAGGGCGCTGGACC P=0 15mer 184 0H0944A-15mer TTGAGGGAGTTCAGG P=0 15mer 185 0H0954A-15mer GAACGACAGATTGAG P=0 15mer 186 表 3の 5
オリゴヌクレオチド 配 列 修飾 配列番号
0H0964A-15mer CCAGCCCAGCGAACG P=0 15mer 187 OH0974A-15mer GGCACCTGTTCCAGC P=0 15mer 188 0H0984A-15mer CAGTCCTTTAGGCAC P=0 15mer 189 0H0994A-15mer GCTTGGCTGGCAGTC P=0 15mer 190 , 0H1004A-15mer AGCACTCTGAGCTTG P=0 15mer 191 OH1014A-15mer GCTGAGATCGAGCAC P=0 15mer 192 0H1024A-15mer GTCTGTTGCAGCTGA P=0 15mer 193 0H1034A- 15mer GCCCTGTTCAGTCTG P=0 15mer 194 0H1054A- 15mer GCAGCTCGTCAGGCT P=0 15mer 195 0H1064A-15mer TCCACCTCGGGCAGC P 0 15mer 196 0H1074A-15mer TGTCAGGTTATCCAC P=0 15mer 197 0H1084A- 15mer TCCCGTCCAGTGTCA P=0 15mer 198 0H1094A-15mer AGGAAGGGATTCCCG P=0 15mer 199 OH1104A-15mer TCCAGGGACCAGGAA P=0 15mer 200 0H1114A-15mer GGAGGGCAGTTCCAG P=0 15mer 201 0H1124A-15mer CCCTCGTGGGGGAGG P=0 15mer 202 0H1134A-15mer GTTCATTGAGCCCTC P 0 15mer 203 0H1144A- 15mer CCACGCCGGAGTTCA P=0 15mer 204 0H1154A-15mer CAGGCTGGGACCACG P=0 15mer 205 0H1164A-15mer CGAACGTGCACAGGC P=0 15mer 206 0H1174A-15mer CCGACAGGGTCGAAC P=0 15mer 207 0H1184A-15mer GACACCCCCACCGAC P=0 15mer 208 0H1194A-15mer CAGGGTTCCCGACAC P=0 15mer 209 0H1204A-15mer GGAGCAGCACCAGGG P 0 15mer 210 表 3の 6
オリゴヌクレオチド 配列 修飾 配列番号
0H1214A-15mer CGGGCCCCTTGGAGC P=0 15mer 211 0H1224A-15mer GGCAAAGCCCCGGGC P-0 15mer 212 0H1234A-15mer TTGGATCTTAGGCAA P=0 15mer 213 0H1244A- 15mer TTATTCTGTCTTGGA P=0 15mer 214 . 0H1254A- 15mer AGTCCATTCATTATT P=0 15mer 215 0H1264A- 15mer AGGCAGTTTGAGTCC P=0 15mer 216 0H1274A-15mer CCTGAAGCCAAGGCA P=0 15mer 217 0H1284A- 15mer ACGGGACTCCCCTGA P=0 15mer 218 0H1294A-15mer CAACGTCCTGACGGG P 0 15mer 219 0H1304A-15mer GAAAAGTCCTCAACG P-0 15mer 220 0H1314A-15mer TGAATTGGTCGAAAA P=0 15mer 221 0H1324A-15mer GGCAAAGGGTTGAAT P=0 15mer 222 0H1334A- 15mer ATAAAGGTGGGGCAA P=0 15mer 223
表 4の 1
オリゴヌクレオチド 配列番号 結合活性 （スコア）
0H0083A-15mer 101 0
0H0102A-15mer 85 1
0H0104A-15mer 102 2
0H0114A-15mer 103 1
0H0134A-15mer 104 0
0H0144A-15mer 105 0
0H0154A-15mer 106 0
0H0164A-15mer 107 0
0H0174A- 15mer 108 0
0H0184A- 15mer 109 2
0H0194A-15mer 110 0
0H0204A-15mer 111 0
0H0214A- 15mer 112 0
0H0224A-15mer 113 0
0H0234A- 15mer 114 0
0H0244A-15mer 115 0
0H0254A-15mer 116 0
0H0264A- 15mer 117 0
0H0274A-15mer 118 0
0H0284A- 15mer 119 1
0H0294A-15mer 120 0
0H0304A-15mer 121 0 表 4の 2
オリゴヌクレオチド 配列番号 結合活性 （スコア）
0H0314A-15mer 122 0
0H0324A- 15mer 123 1
0H0334A-15mer 124 1
0H0344A-15mer 125 2
0H0354A-15mer 126 0
0H0364A-15mer 127 0
0H0374A-15mer 128 0
0H0384A-15mer 129 0
0H0394A-15mer 130 1
0H0404A- 15mer 131 0
0H0414A-15mer 132 0
0H0424A- 15mer 133 0
0H0434A-15mer 134 0
0H0444A-15mer 135 1
0H0454A-15mer 136 1
OH0464A-15mer 137 2
0H0474A- 15mer 138 2
0H0484A-15mer 139 0
0H0494A-15mer 140 0
OH0504A-15mer 141 0
表 4の 3 オリゴヌクレオチド 配列番号 'ι'π口 a
0H0514A-15mer 142 0
0H0524A-15mer 143 0
0H0534A-15mer 144 1
0H0544A-15mer 145 0
0H0554A-15mer 146 0
0H0564A-15mer 147 0
0H0574A- 15mer 148 0
0H0584A- 15mer 149 0
0H0594A-15mer 150 0
0H0604A-15mer 151 0
0H0614A-15mer 152 0
0H0624A-15mer 153 0
0H0634A-15mer 154 0
0H0644A-15mer 155 1
0H0654A-15mer 156 1
0H0664A-15mer 157 0
0H0674A-15mer 158 0
0H0684A- 15mer 159 1
0H0694A-15mer 160 1
表 4の 4
オリゴヌクレオチド 配列番号 結合活性 （スコア）
0H0704A-15mer 161 2
QH0714A- 15mer 162 2
0H0724A-15mer 163 2
0H0734A-15mer 164 1
OH0744A-15mer 165 1
0H0754A-15mer 166 0
0H0764A-15mer 167 0
OH0774A-15mer 168 0
0H0784A- 15mer 169 0
0H0794A- 15mer 170 1
0H0804A-15mer 171 2
0H0814A-15mer 172 2
0H0824A- 15mer 173 0
0H0834A-15mer 174 0
OH0844A-15mer 175 0
0H0854A-15mer 176 0
0H0864A-15mer 177 2
0H0874A- 15mer 178 2
0H0884A-15mer 179 2
0H0894A-15mer 180 2
0H0904A-15mer 181 2 表 4の 5
オリゴヌクレオチド 配列番号 結合活性 （スコア）
0H0914A- 15mer 182 0
0H0924A-15mer 183 1
0H0934A-15mer 184 0
0H0944A- 15mer 185 1
0H0954A-15mer 186 0
0H0964A-15mer 187 0
0H0974A-15mer 188 1
OH0984A- 15mer 189 0
OH0994A- 15mer 190 1
0H1004A-15mer 191 1
0H1014A-15mer 192 1
0H1024A-15mer 193 2
0H1034A-15mer 194 2
0H1054A-15mer 195 0
0H1064A-15mer 196 2
0H1074A-15mer 197 2
0H1084A- 15mer 198 1
0H1094A-15mer 199 1
0H1104A-15mer 200 0
0H1114A- 15mer 201 0
0H1124A-15mer 202 0
0H1134A-15mer 203 0
0H1144A- 15mer 204 0 表 4の 6
オリゴヌクレオチド 配列番号 結合活性 （スコア）
0H1154A-15mer 205 0
0H1164A- 15mer 206 1
0H1174A-15mer 207 0
0H1184A-15mer 208 0
0H1194A- 15mer 209 2
OH1204A-15mer 210 3
0H1214A-15mer 211 0
0H1224A-15mer 212 0
0H1234A-15mer 213 0
0H1244A- 15mer 214 0
0H1254A-15mer 215 3
0H1264A-15mer 216 3
0H1274A-15mer 217 0
0H1284A-15mer 218 0
0H1294A- 15mer 219 0
0H1304A-15mer 220 2
0H1314A-15mer 221 2
0H1324A-15mer 222 0
0H1334A- 15mer 223 0
切断活性を示したァンチセンスォリゴヌクレオチドのうち翻訳開始領域に対す るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 0H0102A- 15mer 、 0H0104A-15mer 、 0H01 14A-15mer で、 3， 非翻訳領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 OH 1254A- 15mer 、 0H1264A-15mer 、 0H1304A-15mer 、 および 0H1314A- 15mer であつ た。 これらのオリゴヌクレオチドは、 実施例 7および 8のヒト T N F d産生阻害 活性の測定結果から、 T N F α産生阻害に有効であると考えられた活性領域 2、 4、 7の一部に相補的な配列を有するものである。 したがって、 RNaseH切断実験 の結果は T N F α産生阻害活性の結果とよく一致していた。
実施例 1 4 ヒ ト T N F α産生阻害活性の測定 （翻訳領域）
実施例 1 3で明らかになったアンチセンスオリゴヌクレオチド結合領域につい て各領域で代表的なアンチセンスォリゴヌクレオチド （表 5参照） を実施例 3の 方法で合成し実施例 7に記載の方法により評価した。 すなわち、 SH0108A 、 SH0184A、 SH0324A 、 SH0394A、 SH0444A 、 SH0457A 、 SH0470A 、 SH0534A 、 SH 0649Α 、 SH0714A 、 SH0720A、 SH0809A、 SH0864A 、 SH0899A 、 SH1014A 、 SH10 74Α 、 SH1199A 、 SH1204A 、 SH1259A 、 SH1311A およびコントロールオリゴヌク レオチドを終濃度 3 0 η Μで、 Τ Η Ρ— 1細胞に処理した。 4時間インキュベー シヨンし、 培養上清を採取した。 培養上清中の T N F αは、 ヒト T N F EL ISA SYSTEM (アマシャム社製） で測定した。 I 9
8S 遍 02 019VVVV0010011VV0110 VI TSTHS
S=d 02 voiivoaiovoiiiovooov V6S2THS
\n S=d 000V30V30V30V00113a3 V^02THS o z S=d 3331X0D0V03V30V00V00 V66UHS
S=d 3V301V11D0V31010V33X V匿 HS
S=d 02 OVODVDOlVOVOlOOVaOXi 翻 THS
S=d 03001003V111000V1303 V6680HS
S=d -I3UI02 OOOOIOIOOOVIDIOOVOIO W980HS
9CZ S=d 02 丄 33LLV 3:)i)iW L3 V6080HS nz S=d 02 3丄 OUVi)3V:)3丄 丄 観 OHS
S d 02 0V3V0V3101IVD0V3310V V 画 S z S=d 02 iiooioiovoaoovooovw V6^90HS
\iz S=d 02 3310VV3D10VVV00130VV V^CSOHS
0£Z S=d 2 33110V31030V00103109 VO删 S
QZZ S=d 遍 02 IOVOOOOOOVOllOOilOVO V ^ OHS
822 S=d 0Z 03VOVOOV1000V10V0003 W OHS
LZZ S=d •I9UI02 VOIDXOV303I00030101
QZZ S d 遍 OS 1130000VD01VOD031030
^ZZ S=d OVV3V0100V031031V311 V函 HS
LZ 遍 0 V031091V3010030303V0 觀 OHS
霧 ^ ≤]= ίι
s辇
£S600/86dT/X3d 8 6£/86 OAV 結果を図 9に示す。 これにより、 以下に示す 1 2の領域で阻止活性が確認でき た。
活性領域 8は CUUGUGAGCUGGACGAの配列の一部に相補的に結合するオリゴヌクレ ォチド SH0184A によって示された。
活性領域 9は AAGCGCGUCGAUGCGGACGCCGACCCGCGGCAGUA の配列の一部に相補的に 結合するオリゴヌクレオチド SH0324A によって示された。
活性領域 10は UCACAGUGGGAGCCG の配列の一部に相補的に結合するオリゴヌクレ ォチド SH0394A によって示された。
活性領域 11は CGUGUGCUAGCGUACUCCCGCCUCAAGGAACUGACGCUCGAGGAC の配列の一部 に相補的に結合するオリゴヌクレオチド SH0444A 、 SH0457A および SH0470A によって示された。
活性領域 1 2は GGACUUGCACUUUCC の配列の一部に相補的に結合するオリゴヌク レオチド SH0534A によって示された。
活性領域 1 3は UACUGAGCAUUGCCCAAGCACACUCGCCUGCCUUU の配列の一部に相補的 に結合するオリゴヌクレオチド SH0649Aによって示された。
活性領域 1 4は CGCGCCUUCCCGGCCCUUACCAGCCUAGACCUGUCUGACAAUCCUGGACUGGGCGA ACGCGGACUGAUGGCGGCU の配列の一部に相補的に結合するオリゴヌクレオチド SH0714A および SH0720A によって示された。
活性領域 1 5は UCCAGAAUCUAGCGCUGCGCAACACAGGAAUGGAGACGCCCACAG の配列の一 部に相補的に結合するオリゴヌクレオチド SH0809A によって示された。
活性領域 1 6は CCCCACAGCCUAGACCUCAGCCACAACUCGCUGCGCGCCACCGUAAACCCUAGCG の配列の一部に相補的に結合するオリゴヌクレオチド SH0899A によって示さ れた。
活性領域 1 7は GACUGCCAGCCAAGCUCAGAGUGCUCGAUCUCAGCUGCAACAGACUGAACAGGGC の配列の一部に相補的に結合するオリゴヌクレオチド SH1014A によって示さ れた。
活性領域 1 8は GCUGCCCGAGGUGGAUAACCUGACACUGGACGGGAAUCCCUUCCU の配列の一 部に相補的に結合する SH1074A、 活性領域 1 9は GUGUCGGGAACCCUGGUGCUGCUCC の 配列の一部に相補的に結合するオリゴヌクレオチド SH1199A および SH1204A によ り示された。
実施例 1 5 コンセンサスォリゴヌクレオチドの設計と C D 1 4発現阻止活性測 定
( 1 ) コンセンサスオリゴヌクレオチドの設計
ヒト C D 1 4をコードする遺伝子とヒト以外の動物の C D 1 4をコ一ドする遺 伝子の両方に結合するようなオリゴヌクレオチド （以下、 コンセンサスオリゴヌ クレオチドと呼ぶ） を以下の方法で作成した。 まず、 結合領域として有効である と考えられる配列番号 1の 9 3番グァニンから 1 4 5番ゥリジンまでの領域に着 目し、 ヒトとマウスの配列を比較した。 この領域中、 実施例 8および実施例 1 2 で強い活性を示した 1 0 3番のゥリジンから 1 3 7番ゥリジンまでの配列に相補 的な 5種類の 2 1 m e rのアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計したところ、 ヒ卜とマウスで配列が一致しない塩基 （図 1 0中 Xで記載した塩基） はすべて、 シトシンもしくはゥリジンのピリ ミジン置換であつた。 そこで、 Xで記載した塩 基をピリ ミジン塩基と結合する塩基であるイノシンに置換したアンチセンスオリ ゴヌクレオチドを設計し、 実施例 3に記載の方法で合成した。 合成したコンセン サスオリゴヌクレオチドを表 6に示した c
表 6
オリゴヌクレオチド 配 列 塩基長 修飾 配列番号 SU0103A-21mer CICGCTCCATGGTCGITAIIT 21mer P=S 242 SU0104A-21mer ICICGCTCCATGGTCGITAII 21mer P=S 243 SU0105A-21mer CICICGCTCCATGGTCGITAI 21mer P=S 244 SU0106A- 21mer ICICICGCTCCATGGTCGITA 21mer P=S 245 SU0107A-21mer IICICICGCTCCATGGTCGIT 21mer P=S 246 SU0108A-21mer IIICICICGCTCCATGGTCGI 21mer P=S 247 SU0109A-21mer IIIICICICGCTCCATGGTCG 21mer P=S 248 SU0110A-21mer CIIIICICICGCTCCATGGTC 21mer P=S 249 SU0111A-21mer GCIIIICICICGCTCCATGGT 21mer P:S 250 SU0112A-21mer AGCIIIICICICGCTCCATGG 21mer P-S 251 SU0113A-21mer AAGCIIIICICICGCTCCATG 21mer P=S 252 SU0114A-21mer CAAGCIIIICICICGCTCCAT 21mer P=S 253 SU0115A-21mer ACAAGCIIIICICICGCTCCA 21mer P=S 254 SU0116A-21mer AACAAGCIIIICICICGCTCC 21mer P=S 255 SU0117A-21mer CAACAAGCIIIICICICGCTC 21mer P=S 256 SU0118A- 21mer GCAACAAGCIIIICICICGCT 21mer P=S 257
(2) コンセンサスオリゴヌクレオチドによるヒ ト CD 1 4ルシフェラ一ゼ融 合蛋白発現阻害活性およびマウス TNF a産生阻害活性の測定 実施例 1 2記載のヒ卜 CD 1 4ルシフヱラーゼ融合蛋白質を発現する H e L a 組換え細胞による CD 1 4ルンフニラ一ゼ融合蛋白発現阻害活性を、 SU0103A- 21 mer 、 SU0104A-21mer 、 SU0105A-21mer 、 SU0106A-21mer 、 SU0107A-21rner 、 SU 0108A-21mer 、 SU0109A- 21mer 、 SU0110A-21mer 、 SU0111A-21mer 、 SU0112A-21 mer 、 SU0113A-21mer 、 SU0114A-21mer 、 SU0115A-21mer 、 SU0116A- 21mer 、 SU 0117A-21mer および SU0118A-21mer で活性比較した。 その結果を図 1 0に示す。
4 0 %以上の阻止活性を示したコンセンサスォリゴヌクレオチドは、 SU0103A-21 mer 、 SU0104A-21mer 、 SU0105A-21mer 、 SU0106A-21mer 、 SU0107A-21mer 、 SU 0108A-21mer 、 SU0109A-21mer であった。
次に SU0104A- 21mer 、 SU0105A-21mer 、 SU0106A-21mer および SU0108A- 21mer についてマウス TNF α産生阻害活性を測定した。 測定は、 J774A.1 細胞の代わ りに RAW264.7細胞を用い、 実施例 9の方法に準じて行い、 培養上清中の TN F a は、 マゥスTNF EUSA SYSTEM (アマシャム社製） で測定した。 結果を図 1 1 に示す。
SU0104A-21mer 、 SU0105A-21mer 、 SU0106A-21mer および SU0108A_21nier のマ ウス TN F α産生抑制活性はそれぞれ 2 4 %、 3 3 %、 5 4 %、 6 9 %で あった。 またコントロールオリゴヌクレオチドは 3 %の阻害であった。 この結果 より、 SU0104A-21mer 、 SU0105A-21mer 、 SU0106A-21mer 、 SU0108A-21mer は、 マウスにもヒトにも作用を示すオリゴヌクレオチドであることが判った。 産業上の利用可能性
本発明により、 ヒト C D 1 4をコードする遺伝子の一部とハイブリダィズする 配列を含むォリゴヌクレオチドが提供され、 さらに、 該ォリゴヌクレオチドおよ び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物が提供される。 これにより効果的に 炎症性因子を抑制することができる。 すなわち、 ヒト C D 1 4の発現を抑制する オリゴヌクレオチドは、 C D 1 4を介して生じる炎症性因子によって引き起こさ れる疾患、 具体的には全身性炎症反応症候群、 エンドトキシン血症およびショッ ク、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 自己免疫反応、 アレルギー疾患、 癌、 移植片対 宿主病、 歯周病もしくは骨粗鬆症等の予防もしくは治療薬として使用することが できる。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 1 3 5 1
配列の型：核酸 ' 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： mR N A
起源
生物名： h u m a n
配列
GAAGAGUUCA CAAGUGUGAA GCCUGGAAGC CGCCGGGUGC CGCUGUGUAG GAAAGAAGCU 60 AAAGCACUUC CAGAGCCUGU CCGGAGCUCA GAGGUUCGGA AGACUUAUCG ACCAUGGAGC 120 GCGCGUCCUG CUUGUUGCUG CUGCUGCUGC CGCUGGUGCA CGUCUCUGCG ACCACGCCAG 180
AACCUUGUGA GCUGGACGAU GAAGAUUUCC GCUGCGUCUG CAACUUCUCC GAACCUCAGC 240
CCGACUGGUC CGAAGCCUUC CAGUGUGUGU CUGCAGUAGA GGUGGAGAUC CAUGCCGGCG 300
GUCUCAACCU AGAGCCGUUU CUAAAGCGCG UCGAUGCGGA CGCCGACCCG CGGCAGUAUG 360
CUGACACGGU CAAGGCUCUC CGCGUGCGGC GGCUCACAGU GGGAGCCGCA CAGGUUCCUG 420
CUCAGCUACU GGUAGGCGCC CUGCGUGUGC UAGCGUACUC CCGCCUCAAG GAACUGACGC 480
UCGAGGACCU AAAGAUAACC GGCACCAUGC CUCCGCUGCC UCUGGAAGCC ACAGGACUUG 540
CACUUUCCAG CUUGCGCCUA CGCAACGUGU CGUGGGCGAC AGGGCGUUCU UGGCUCGCCG 600
AGCUGCAGCA GUGGCUCAAG CCAGGCCUCA AGGUACUGAG CAUUGCCCAA GCACACUCGC 660 CUGCCUUUUC CUACGAACAG GUUCGCGCCU UCCCGGCCCU UACCAGCCUA GACCUGUCUG 720
ACAAUCCUGG ACUGGGCGAA CGCGGACUGA UGGCGGCUCU CUGUCCCCAC AAGUUCCCGG 780
CCAUCCAGAA UCUAGCGCUG CGCAACACAG GAAUGGAGAC GCCCACAGGC GUGUGCGCCG 840
CACUGGCGGC GGCAGGUGUG CAGCCCCACA GCCUAGACCU CAGCCACAAC UCGCUGCGCG 900
CCACCGUAAA CCCUAGCGCU CCGAGAUGCA UGUGGUCCAG CGCCCUGAAC UCCCUCAAUC 960
UGUCGUUCGC UGGGCUGGAA CAGGUGCCUA AAGGACUGCC AGCCAAGCUC AGAGUGCUCG 1020
AUCUCAGCUG CAACAGACUG AACAGGGCGC CGCAGCCUGA CGAGCUGCCC GAGGUGGAUA 1080
ACCUGACACU GGACGGGAAU CCCUUCCUGG UCCCUGGAAC UGCCCUCCCC CACGAGGGCU 1140
CAAUGAACUC CGGCGUGGUC CCAGCCUGUG CACGUUCGAC CCUGUCGGUG GGGGUGUCGG 1200
GAACCCUGGU GCUGCUCCAA GGGGCCCGGG GCUUUGCCUA AGAUCCAAGA CAGAAUAAUG 1260
AAUGGACUCA AACUGCCUUG GCUUCAGGGG AGUCCCGUCA GGACGUUGAG GACUUUUCGA 1320
CCAAUUCAAC CCUUUGCCCC ACCUUUAUUA A 1351 配列番号： 2
配列の長さ ： 1 5 7 0
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： G e n o m i c D N A
起源
生物名： h u m a n
配列 co
Figure imgf000071_0001
GGGGTGTCGG GAACCCTGGT GCTGCTCCAA GGGGCCCGGG GCTTTGCCTA AGATCCAAGA 1380
CAGAATAATG AATGGACTCA AACTGCCTTG GCTTCAGGGG AGTCCCGTCA GGACGTTGAG 1440
GACTTTTCGA CCAATTCAAC CCTTTGCCCC ACCTTTATTA AAATCTTAAA CAACGGTTCC 1500
GTGTCATTCA TTTAACAGAC CTTTATTGGA TGTCTGCTAT GTGCTGGGCA CAGTACTGGA 1560
TGGGGAATTC ' 1570 配列番号： 3
配列の長さ ： 1 4 4 7
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： mR N A
起源
生物名： m 0 u s 6
配列
CGAACAAGCC CGUGGAACCU GGAAGCCAGA GAACACCACC GCUGUAAAGG AAAGAAACUG 60 AAGCCUUUCU CGGAGCCUAU CUGGGCUGCU CAAACUUUCA GAAUCUACCG ACCAUGGAGC 120 GUGUGCUUGG CUUGUUGCUG UUGCUUCUGG UGCACGCCUC UCCCGCCCCA CCAGAGCCCU 180 GCGAGCUAGA CGAGGAAAGU UGUUCCUGCA ACUUCUCAGA UCCGAAGCCA GAUUGGUCCA 240 GCGCUUUCAA UUGUUUGGGG GCGGCAGAUG UGGAAUUGUA CGGCGGCGGC CGCAGCCUGG 300 AAUACCUUCU AAAGCGUGUG GACACGGAAG CAGAUCUGGG GCAGUUCACU GAUAUUAUCA 360 AGUCUCUGUC CUUAAAGCGG CUUACGGUGC GGGCCGCGCG GAUUCCUAGU CGGAUUCUAU 420 ΐ L
^ ： 銎 mi vvnvvvv ο^ΐ nnnnnnvnvv νηνννοναηα onononvoon onnovvvono onovonovvv voooovvooo 08ei ovaonvoov onooovvnnn nvonoaoovo nnavvvoovo oov vvnooo novonnoonv z£\ ovvonovoDO vvvovvvoov vnonvoovoo nvvnnonvvv vnnvnnnvvv annoononao 092 ΐ nvvoovvono οποοηοοονο ηοηπηοοποα noonvoonnn vovvoovvnn nonnnonooo 0021 onvovoovno onoonnnooo nonovvoovo nonnoooono voovvooonv onvoonoovo 0 ΐ oooooovono vnoooonono vvnanovvov ooonavaoon voaonovoo nnnnnaoonv 080 ΐ vvoovvvnno vononoovvo ooonovvooo oonoovoavo voooDvnooo vvoovnvoon 020 ΐ ooovovvovn novononvoo noonooovon oovvooovoo onoooovvvn oovnoovaov 096 vonoooDnov onnnononon vvonoDonov vvnoovonov ooooonovon onnovooono 006 oooovoonoo nvooooonov onn vovono vnnoavovno voovvoonoo vovnoaovva o^8 ovoooooono oaononoono noooooovoo ooovovoonv ooooooovvn οοοηοοοονη 08丄 nnnovvoono oavooaonno vvonoooono nonoooovon 3nv9novoov OVDVOODDDO OZL nwonoonvv ovonononoo vovnnoovoo nanoooonoo onnonooooo noovovvooo 099 noonnnno v onovonovov oovvoaoonn vnovonavno ovvonovoon aoDvvvnooo 009 novoovoono vvovooonoo onooonvooo vvovvoooon oononoovvo ooonoovvon o^s nonvovvono nvoooovooo ovooovvoon onnoooovoo oooooooovo oooovvnoov 08t oononvvvvo nnanovonov voovoanooo ooonnnvooo onoononooo noooovooon
€S600/86if/X3«I 8£fr6£/86 OAV 鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： G e n o m i c D N A
起源
生物名： m 0 u s e ' 配列
CCTAGCATTT GGGAGGCAGA GGCAGGAGGA AAATCATGCG TTTCAGGCTA GGCTAGATTG 60 GGTTACTAGA CTGAGATATC ATGGGGAGAA TGGAGAGGTA GAGAGTGGGA GAAGAATGAA 120 TTAATAAAGA ACTGAATAAG ATGGGAAGAA GGGAGAATTA TTTTTCATAT TAACTCTCAA 180
CTTTGAGCTT TATTCTCTGC CTGGAATCTA TAGATAAGTT CACAATCTTT CCACAAATGT 240
CCAATTACAT TCAAAGAAAA TCAAGAGCTG GATTTGAACG GTGGGAAATT GCTAGCAACT 300
AAGACTAGGG GAAATGGAGG TGAATCAATG GGACTGAGCA ACAGAATAAT GATCTAAGGC 360
ACTAGGTGTG ATTCACTCTT TTCCTGTACG CACCAGACAA GTCCGGGGCT CATAGGTCAT 420
CCTCCTGGCA CAGAATGCCC TAATGCCACT CTGAATTCTT CCTGTTTTTC GTCCCTCCCT 480
AAAAAACACT TCCTTGCAAT ATTTACTAGA AGTGAGTAGG GCTGTTAGGA GGAAGAGAAG 540
TGGAGACGCA ATTAGAATTC ACAGAGGAAG GGACAGGGTG ACACCCCAGG ATTACATAAA 600
TTTACAGGGG CTGCCGAATT GGTCGAACAA GCCCGTGGAA CCTGGAAGCC AGAGAACACC 660
ATCGCTGTAA AGGAAAGAAA CTGAAGCTTT TCTCGGAGCC TATCTGGGCT GCTCAAACTT 720
TCAGAATCTA CCGACCATGG TGAGTCAGAC AGACTGTCTT GGGGTGGAAC TGGAGCCAAC 780
CTGAGGAATC TCAGGGTCTG GCAGGAGTCT CCCTGACCCC TACTTTCTCC TCAGGAGCGT 840
GTGCTTGGCT TGTTGCTGTT GCTTCTGGTG CACGCCTCTC CCGCCCCACC AGAGCCCTGC 900
GAGCTAGACG AGGAAAGTTG TTCCTGCAAC TTCTCAGATC CGAAGCCAGA TTGGTCCAGC 960 8 I
1V0VVV1V31 OVVVOIOOOO 100011301V X01V130013 I0V3V0V911 1110111101 0222 1110111011 11DD101101 1I100D1110 1111101111 0011011191 OiVVOVVlVV 09 ΐ 2 VVILLLLLVI VVV1VVV3V3 130I0131V3 310110VVV0 13313V313V VVVOOOOVVO 00 ΐ 2 03V0V331V0 0V31333VV1 111V013000 V0113VVV00 VOOOVVVVIO 0010V01100 O OZ IVOVVOlOVO OOVVVOVVVO 0VV101V03V 301VV1131V VVVILV丄丄丄 V VV丄丄丄 33丄 3丄 086 ΐ OOIVVOOVVO 1031331000 V010I11001 331331V301 11V0VVOOVV 1110111013 OZQl 3031V0V00V 1331301113 001310VV00 V310113300 10VD0VV300 IVOlVOOlOO 098 ΐ V0033033VO 10V10300ia 10VVI110VV 0V00310V0D 31VV01DI3V D01111X333 0081 IVVVOOVVVI X3VD10133V V00D010VV3 3330130V01 V0V0D30VX3 33VV00V1V0 0^1 01300V3VV3 VIIOVOIOIV OOXDOIOOOV 0130VV300V 330I0000VV V133V100V3 089 ΐ OVVOiOOOOl OVOIIIOIOI OiVVOXOOOi 3 VV100V0I 0V03000X0V 010110V033 0Ζ9Ϊ I30300V001 301V000301 3V0UVV3V0 10V 33V0V 10V00VV0D1 30V0V1000V 09ST V00V300300 1303013100 I01030030V 33300VOVOO IVOOOOOOOV V103013030 OOSI V11I10VV00 1330V03301 10VV010333 101313330V 3131V013V0 OVOVOVOOOO 0 ΐ OiiVVOlOOl VV0V013101 30V0V1130V 0010103001 ODO DIOOO 331D0V0VV0 08ei 0013311113 VV310V013V 3V0OVV3300 11V10V010V 100VV013V0 01330VVV13 OZ£l OOIOVOOVOO 10VV0V3031 30013001V0 00VV0VV309 010010100V V3003133VV 092Ϊ 01101V0VV3 131V0033V0 OODVOOOVVO OiOilOOOaV 3003003033 V00033VV10 002 ΐ 0V03I31VVV V011313V01 3VV00V0310 OOOOOXIIVO 003X301D10 33100Q0VD0 Ο ΐ 31XV13I1VD 03X0V1331X V000030030 OOOOIOOOVX 100030VVV1 1031010101 080 ΐ 0VV31V1IV1 V013VDU0V 30000131V0 V30VV003V0 V0010I030V VV131X30V1 020 ΐ VV001D00V3 0330030030 DOVIOIIVVO 0101V0V300 3000001110 11VV31U00
£S600/86d /XDd[ 8£^6€/86 OAV CAAGATCGGC CTGCCTCTAC CTCCAAATGC TCTGGTTAAA GGGATGTGCC TCCATGCCCA 2340
GTTGAAGTCA TCCTGAACCA CGAGTCCAGG CCACTCACTC TTTACTAAGA TCTTTACTAA 2400 GTAT 2404
配列番号： 5
配列の長さ ： 3 2
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
ACGCGTCGAC GAGTTCACAA GTGTGAAGCC TG 32 配列番号： 6
配列の長さ ： 3 2
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
ACATGCATGC TTAATAAAGG TGGGGCAAAG GG 32 配列番号： 7
配列の長さ ： 3 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
CCCAAGCTTA AGTGTGAAGC CTGAAGCCGC CGG 33 配列番号： 8
配列の長さ ： 4 4
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
ATGGCGCCGG GCCTTTCTTT ATGTTTTTGG CGTCTTCCAG TTGG 44 配列番号： 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CGGCTTCCAG GCTTCACACT 20 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CGGCACCCGG CGGCTTCCAG 20 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TCCTACACAG CGGCACCCGG 20 配列番号： 1 2 配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
TTCTTTCCTA CACAGCGGCA 20 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
TTAGCTTCTT TCCTACACAG 20 配列番号： 1 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GTGCTTTAGC TTCTTTCCTA 20 ' 配列番号： 1 5
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGGAAGTGCT TTAGCTTCTT 20 配列番号： 1 6
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 GGACAGGCTC TGGAAGTGCT 20 配列番号： 1 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
TCTGAGCTCC GGACAGGCTC 20 配列番号： 1 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CTTCCGAACC TCTGAGCTCC 20 配列番号： 1 9
配列の長さ ： 2 0 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 ' GTCGATAAGT CTTCCGAACC 20 配列番号： 2 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
ATGGTCGATA AGTCTTCCGA 20 配列番号： 2 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
TCCATGGTCG ATAAGTCTTC 20 配列番号： 2 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CGCTCCATGG TCGATAAGTC 20 配列番号： 2 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CGCGCTCCAT GGTCGATAAG 20
8 l 配列番号： 2 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
GCGCGCTCCA TGGTCGATAA 20 配列番号： 2 5
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
CGCGCGCTCC ATGGTCGATA 20 配列番号： 2 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
ACGCGCGCTC CATGGTCGAT 20 配列番号： 2 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
GACGCGCGCT CCATGGTCGA 20 配列番号： 2 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
GGACGCGCGC TCCATGGTCG 20 配列番号： 2 9 配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
GCAGGACGCG CGCTCCATGG 20 配列番号： 3 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
AAGCAGGACG CGCGCTCCAT 20 配列番号： 3 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ACAAGCAGGA CGCGCGCTCC 20 ' 配列番号： 32
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
AACAAGCAGG ACGCGCGCTC 20 配列番号： 3 3
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CAACAAGCAG GACGCGCGCT 20 配列番号： 3 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
AGCAACAAGC AGGACGCGCG 20 配列番号： 3 5
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
GCAGCAACAA GCAGGACGCG 20 配列番号： 3 6 配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A ' 配列
CAGCAGCAAC AAGCAGGACG 20 配列番号： 3 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
AGCAGCAGCA ACAAGCAGGA 20 配列番号： 3 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
TCTTGGATCT TAGGCAAAGC 20 配列番号： 3 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CATTATTCTG TCTTGGATCT 20 配列番号： 4 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CAGTTTGAGT CCATTCATTA 20 配列番号： 4 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
AGGCAGTTTG AGTCCATTCA 20 配列番号： 4 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
CAAGGCAGTT TGAGTCCATT 20 配列番号： 4 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CCAAGGCAGT TTGAGTCCAT 20 配列番号： 4 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
GCCAAGGCAG TTTGAGTCCA 20 配列番号： 4 5
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
AGCCAAGGCA GTTTGAGTCC 20 配列番号： 4 6 配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A AAGCCAAGGC AGTTTGAGTC 20 配列番号： 4 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
GAAGCCAAGG CAGTTTGAGT 20 配列番号： 4 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
TGAAGCCAAG GCAGTTTGAG 20 配列番号： 4 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CTGAAGCCAA GGCAGTTTGA 20 配列番号： 5 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CCTGAAGCCA AGGCAGTTTG 20 配列番号： 5 1 配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CCCTGAAGCC AAGGCAGTTT 20 配列番号： 5 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CCCCTGAAGC CAAGGCAGTT 20
配列番号： 5 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
CTCCCCTGAA GCCAAGGCAG 20 ' 配列番号： 5 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
GGACTCCCCT GAAGCCAAGG 20 配列番号： 5 5
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 TGACGGGACT CCCCTGAAGC 20 配列番号： 5 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CTCAACGTCC TGACGGGACT 20 配列番号： 5 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
TCGAAAAGTC CTCAACGTCC 20 配列番号： 5 8
配列の長さ ： 2 0 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列 ， GTTGAATTGG TCGAAAAGTC 20 配列番号： 5 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
TAATAAAGGT GGGGCAAAGG 20 配列番号： 6 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CGGCTTCCAG GCTTCACACT 20 配列番号： 6 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CGGCACCCGG CGGCTTCCAG 20 配列番号： 6 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
TCCTACACAG CGGCACCCGG 20 配列番号： 6 3 配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A ' 配列
TTAGCTTCTT TCCTACACAG 20 配列番号： 6 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
TGGAAGTGCT TTAGCTTCTT 20 配列番号： 6 5
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
GGACAGGCTC TGGAAGTGCT 20 配列番号： 6 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
TCTGAGCTCC GGACAGGCTC 20 配列番号： 6 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CTTCCGAACC TCTGAGCTCC 20 配列番号： 6 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
GTCGATAAGT CTTCCGAACC 20 配列番号： 6 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
ATGGTCGATA AGTCTTCCGA 20 配列番号： 7 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
TCCATGGTCG ATAAGTCTTC 20 配列番号： 7 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CGCTCCATGG TCGATAAGTC 20 配列番号： 7 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
GCGCTCCATG GTCGATAAGT 20 配列番号： 7 3 配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CGCGCTCCAT GGTCGATAAG 20 配列番号： Ί 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
GCGCGCTCCA TGGTCGATAA 20 配列番号： 7 5
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
CGCGCGCTCC ATGGTCGATA 20 ' 配列番号： 7 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
ACGCGCGCTC CATGGTCGAT 20 配列番号： 7 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
GACGCGCGCT CCATGGTCGA 20 配列番号： 7 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
GGACGCGCGC TCCATGGTCG 20 配列番号： 7 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
AGGACGCGCG CTCCATGGTC 20 配列番号： 8 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
CAGGACGCGC GCTCCATGGT 20 配列番号： 8 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
GCAGGACGCG CGCTCCATGG 20 配列番号： 8 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
AGCAGGACGC GCGCTCCATG 20 配列番号： 8 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
AAGCAGGACG CGCGCTCCAT 20 配列番号： 8 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CAACAAGCAG GACGCGCGCT 20 配列番号： 8 5 配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CATGGTCGAT AAGTC 15 配列番号： 8 6
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CTCCATGGTC GATAAGTC 18 配列番号： 8 7
配列の長さ ： 1 9
配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
GCTCCATGGT CGATAAGTC 19 ' 配列番号： 8 8
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
GCGCTCCATG GTCGATAAGT C 21 配列番号： 8 9
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CGCGCTCCAT GGTCGATAAG TC 22 配列番号： 9 0
配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
ACGCGCGCTC CATGGTCGAT AAGTC 25 配列番号： 9 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CATGGTCGGT AGATTCTGAA 20 配列番号： 9 2 配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A · 配列
CACACGCTCC ATGGTCGGTA GATTC 25 配列番号： 9 3
配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
GCACACGCTC CATGGTCGGT AGATT 25 配列番号： 9 4
配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
AGCACACGCT CCATGGTCGG TAGAT 25 配列番号： 9 5
配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
AAGCACACGC TCCATGGTCG GTAGA 25 配列番号： 9 6
配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
CAAGCACACG CTCCATGGTC GGTAG 25 配列番号： 9 7
配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
CCAAGCACAC GCTCCATGGT CGGTA 25 配列番号： 9 8
配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
GCCAAGCACA CGCTCCATGG TCGGT 25 配列番号： 9 9
配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 D N A 配列
AAGCCAAGCA CACGCTCCAT GGTCG 25 配列番号： 1 00
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
ACAAGCCAAG CACACGCTCC ATGGT 25 配列番号： 1 0 1
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
GAACCTCTGA GCTCC 15 配列番号： 1 0 2 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
TCCATGGTCG ATAAG 15 配列番号： 1 0 3 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGACGCGCGC TCCAT 15 配列番号： 1 0 4 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
AGCAGCAGCA GCAAC 15 ' 配列番号： 1 0 5
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CACCAGCGGC AGCAG 15 配列番号： 1 0 6
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 配列
CAGAGACGTG CACCA 15 配列番号： 1 07
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
GGCGTGGTCG CAGAG 15 配列番号： 1 08
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
ACAAGGTTCT GGCGT 15
l l 6 配列番号： 1 0 9
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸
配列
CGTCCAGCTC ACAAG 15 配列番号： 1 1 0
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
AAATCTTCAT CGTCC 15 配列番号： 1 1 1
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GACGCAGCGG AAATC 15 配列番号： 1 1 2 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
AGAAGTTGCA GACGC 15 配列番号： 1 1 3 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
TGAGGTTCGG AGAAG 15 配列番号： 1 1 4 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CCAGTCGGGC TGAGG 15
配列番号： 1 1 5 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
AGGCTTCGGA CCAGT 15
配列番号： 1 1 6 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
ACACACTGGA AGGCT 15 ' 配列番号： 1 1 7
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TACTGCAGAC ACACA 15 配列番号： 1 1 8
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 配列
TCTCCACCTC TACTG 15 配列番号： 1 1 9 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CCGGCATGGA TCTCC 15 配列番号： 1 20 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GTTGAGACCG CCGGC 15 配列番号： 1 2 1
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸
配列
ACGGCTCTAG GTTGA 15 配列番号： 2 2
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CGCTTTAGAA ACGGC 15 配列番号： 1 2 3
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CGCATCGACG CGCTT 15 配列番号： 1 2 4 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGTCGGCGTC CGCAT 15 配列番号： 1 2 5 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
TACTGCCGCG GGTCG 15 配列番号： 1 2 6 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CGTGTCAGCA TACTG 15 配列番号： 1 27 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GAGCCTTGAC CGTGT 15 配列番号： 1 2 8 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CGCACGCGGA GAGCC 15 ' 配列番号： 1 2 9
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TGTGAGCCGC CGCAC 15 配列番号： 1 3 0
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 配列
CGGCTCCCAC TGTGA 15 配列番号： 1 3 1 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGAACCTGTG CGGCT 15 配列番号： 1 32 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
TAGCTGAGCA GGAAC 15 配列番号： 1 33 配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 ' 配列
CGCCTACCAG TAGCT 15 配列番号： 1 3 4
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
ACACGCAGGG CGCCT 15
配列番号： 1 3 5
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
1 配列の種類：他の核酸 配列
GTACGCTAGC ACACG 15 配列番号： 1 3 6
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
TGAGGCGGGA GTACG 15 配列番号： 1 3 7 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GTCAGTTCCT TGAGG 15 配列番号： 1 38
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸
配列
GTCCTCGAGC GTCAG 15 配列番号： 1 39
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TTATCTTTAG GTCCT 15 配列番号： 1 40
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
ATGGTGCCGG TTATC 15 配列番号： 1 4 1
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CAGCGGAGGC ATGGT 15 配列番号： 1 4 2 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CTTCCAGAGG CAGCG 15 配列番号： 1 43 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
AGTCCTGTGG CTTCC 15 配列番号： 1 44 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGAAAGTGCA AGTCC 15 配列番号： 1 45 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
GGCGCAAGCT GGAAA 15 ' 配列番号： 1 4 6
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
ACGTTGCGTA GGCGC 15 配列番号： 1 4 7
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 配列
CGCCCACGAC ACGTT 15 配列番号： 1 48 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
AACGCCCTGT CGCCC 15 配列番号： 1 49 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GCGAGCCAAG AACGC 15 配列番号： 1 50 配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 ' 配列
CTGCAGCTCG GCGAG 15 配列番号： 1 5 1
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TGAGCCACTG CTGCA 15 配列番号： 1 5 2
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
AGGCCTGGCT TGAGC 15 配列番号： 1 5 3 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CAGTACCTTG AGGCC 15 配列番号： 1 5 4 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGGCAATGCT CAGTA 15 配列番号： 1 55
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸
配列
GAGTGTGCTT GGGCA 15 配列番号： 1 56
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
AAAGGCAGGC GAGTG 15 配列番号： 1 57
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GTTCGTAGGA AAAGG 15 配列番号： 1 5 8 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GCGCGAACCT GTTCG 15 配列番号： 1 5 9 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGCCGGGAAG GCGCG 15 配列番号： 1 6 0 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGCTGGTAAG GGCCG 15 配列番号： 1 6 1 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GACAGGTCTA GGCTG 15 配列番号： 1 6 2 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 〖本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
AGGATTGTCA GACAG 15 ' 配列番号： 1 6 3
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CGCCCAGTCC AGGAT 15 配列番号： 1 6 4
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 配列
AGTCCGCGTT CGCCC 15 配列番号： 1 65 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
AGCCGCCATC AGTCC 15 配列番号： 1 66 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGGGACAGAG AGCCG 15 配列番号： 1 67 配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 ' 配列
GGGAACTTGT GGGGA 15 配列番号： 1 6 8
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CTGGATGGCC GGGAA 15 配列番号： 1 6 9
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GCGCTAGATT CTGGA 15 配列番号： 1 7 0 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GTGTTGCGC AGCGCT 15 配列番号： 1 7 1 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CTCCATTCCT GTGTT 15 配列番号： 1 7 2
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸
配列
CTGTGGGCGT CTCCA 15 配列番号： 1 7 3
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
GCGCACACGC CTGTG 15 配列番号： 1 7 4
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CGCCAGTGCG GCGCA 15 配列番号： 1 7 5 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CACCTGCCGC CGCCA 15 配列番号： 1 7 6 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
TGGGGCTGCA CACCT 15 配列番号： 1 7 7 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GTCTAGGCTG TGGGG 15 配列番号： 1 78 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
TGTGGCTGAG GTCTA 15 配列番号： 1 7 9 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CGCAGCGAGT TGTGG 15 ' 配列番号： 1 8 0
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TACGGTGGCG CGCAG 15 配列番号： 1 8 1
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 配列
CGCTAGGGTT TACGG 15 配列番号： 1 82 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CATCTCGGAG CGCTA 15 配列番号： 1 83 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGACCACATG CATCT 15 配列番号： 1 84 配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 ' 配列
TCAGGGCGCT GGACC 15 配列番号： 1 8 5
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TTGAGGGAGT TCAGG 15 配列番号： 1 8 6
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GAACGACAGA TTGAG 15 配列番号： 1 8 7 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CCAGCCCAGC GAACG 15 配列番号： 1 8 8 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGCACCTGTT CCAGC 15 配列番号： 1 89
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸
配列
CAGTCCTTTA GGCAC 15 配列番号： 1 90
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
GCTTGGCTGG CAGTC 15 配列番号： 1 9 1
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
AGCACTCTGA GCTTG 15 配列番号： 1 9 2 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GCTGAGATCG AGCAC 15 配列番号： 1 9 3 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GTCTGTTGCA GCTGA 15 配列番号： 1 94 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GCCCTGTTCA GTCTG 15 配列番号： 1 9 5 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GCAGCTCGTC AGGCT 15 配列番号： 1 96 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TCCACCTCGG GCAGC 15 ' 配列番号： 1 9 7
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TGTCAGGTTA TCCAC 15 配列番号： 1 9 8
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 配列
TCCCGTCCAG TGTCA 15 配列番号： 1 9 9 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
AGGAAGGGAT TCCCG 15 配列番号： 200 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
TCCAGGGACC AGGAA 15 配列番号： 20 1 配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 ' 配列
GGAGGGCAGT TCCAG 15 配列番号： 202
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CCCTCGTGGG GGAGG 15 配列番号： 203
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GTTCATTGAG CCCTC 15 配列番号： 2 04 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CCACGCCGGA GTTCA 15 配列番号： 205 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CAGGCTGGGA CCACG 15 配列番号： 2 06
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸
配列
CGAACGTGCA CAGGC 15 配列番号： 20 7
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CCGACAGGGT CGAAC 15 配列番号： 2 08
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GACACCCCCA CCGAC 15 配列番号： 209 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CAGGGTTCCC GACAC 15 配列番号： 2 1 0 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGAGCAGCAC CAGGG 15 配列番号： 2 1 1 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CGGGCCCCTT GGAGC 15
配列番号： 2 1 2 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGCAAAGCCC CGGGC 15
配列番号： 2 1 3 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TTGGATCTTA GGCAA 15 ' 配列番号： 2 1 4
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TTATTCTGTC TTGGA 15 配列番号： 2 1 5
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 配列
AGTCCATTCA TTATT 15
配列番号： 2 1 6 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
AGGCAGTTTG AGTCC 15
配列番号： 2 1 7 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
CCTGAAGCCA AGGCA 15
配列番号： 2 1 8 配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 ' 配列
ACGGGACTCC CCTGA 15 配列番号： 2 1 9
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CAACGTCCTG ACGGG 15 配列番号： 220
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GAAAAGTCCT CAACG 15 配列番号： 22 1 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
TGAATTGGTC GAAAA 15 配列番号： 222 配列の長さ ： 1 5 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列
GGCAAAGGGT TGAAT 15 配列番号： 223
配列の長さ ： 1 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 ' 配列の種類：他の核酸
配列
ATAAAGGTGG GGCAA 15 配列番号： 224
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
GCAGGACGCG CGCTCCATGG TCGATAAGTC 30 配列番号： 22 5
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TTCATCGTCC AGCTCACAAG 20 配列番号： 2 2 6
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
GCGTCCGCAT CGACGCGCTT 20 配列番号： 227
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CTGTGCGGCT CCCACTGTGA 20 配列番号： 228 配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CGGGAGTACG CTAGCACACG 20 配列番号： 229
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CAGTTCCTTG AGGCGGGAGT 20
配列番号： 2 30
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
GGTCCTCGAG CGTCAGTTCC 20 配列番号： 23 1
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
AAGCTGGAAA GTGCAAGTCC 20 配列番号： 232
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 配列
AAAGGCAGGC GAGTGTGCTT 20 配列番号： 233
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
AGTCCAGGAT TGTCAGACAG 20 配列番号： 234
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TCGCCCAGTC CAGGATTGTC 20 配列番号： 23 5 配列の長さ ： 20 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CTGTGGGCGT CTCCATTCCT 20 配列番号： 236
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CTGAGGTCTA GGCTGTGGGG 20 配列番号： 237
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸
配列
CGCTAGGGTT TACGGTGGCG 20 配列番号： 23 8
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TTGCAGCTGA GATCGAGCAC 20 配列番号： 239
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TCCAGTGTCA GGTTATCCAC 20 配列番号： 240
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
GGAGCAGCAC CAGGGTTCCC 20 配列番号： 24 1
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CCCTTGGAGC AGCACCAGGG 20 配列番号： 242
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列 ' CiCGCTCCAT GGTCGiTAii T 21 配列番号： 2 4 3
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列
iCiCGCTCCA TGGTCGiTAi i 21 配列番号： 2 4 4
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列 ' CiCiCGCTCC ATGGTCGiTA i 21 配列番号： 2 4 5
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノ シンを表す
配列
iCiCiCGCTC CATGGTCGiT A 21 配列番号： 2 4 6
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列 ' iiCiCiCGCT CCATGGTCGi T 21 配列番号： 2 4 7
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列
iiiCiCiCGC TCCATGGTCG i 21 配列番号： 2 4 8
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列 ' iiiiCiCiCG CTCCATGGTC G 21 配列番号： 249
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列
CiiiiCiCiC GCTCCATGGT C 21 配列番号： 25 0
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列 ' GCiiiiCiCi CGCTCCATGG T 21 配列番号： 25 1
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー '·直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノ シンを表す
配列
AGCiiiiCiC iCGCTCCATG G 21 配列番号： 2 52
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列 ' AAGCiiiiCi CiCGCTCCAT G 21 配列番号： 25 3
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノ シンを表す
配列
CAAGCiiiiC iCiCGCTCCA T 21 配列番号： 254
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列 ' ACAAGCiiii CiCiCGCTCC A 21 配列番号： 255
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノ シンを表す
配列
AACAAGCiii iCiCiCGCTC C 21 配列番号： 256
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列 ' CAACAAGCii iiCiCiCGCT C 21 配列番号： 257
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
他の情報 iはイノシンを表す
配列
GCAACAAGCi iiiCiCiCGC T 21 配列番号： 258
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 配列
CACACGCTCC ATGGTCGGTA G 21

Claims

請求 の 範 囲
1. ヒト CD 1 4をコードする遺伝子の少なくとも一部とハイブリダィズするォ リゴヌクレオチド。
2. ヒト C D 1 4をコードする遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含む請 求項 1に記載のォリゴヌクレオチド。
3. ヒ ト CD 1 4 mRNAの 5' 非翻訳領域、 翻訳開始領域、 翻訳領域また は 3 ' 非翻訳領域のそれぞれまたは少なくともその一部と相補的な配列を少なく とも 1つ含む請求項 1または 2に記載のォリゴヌクレオチド。
4. 配列番号 1の塩基配列の
( 1 ) 塩基位置 2 3番のシトシンから 6 2番のアデニンまでの 4 0塩基の塩基 配列
(2) 塩基位置 9 3番のグァニンから 1 3 1番のシトシンまでの 3 9塩基の塩 基配列
(3) 塩基位置 1 1 7番のグァニンから 1 4 5番のゥリジンまでの 2 9塩基の 塩基配列
(4) 塩基位置 1 2 4 1番のアデニンから 1 2 8 0番のグァニンまでの 4 0塩 基の塩基配列
(5) 塩基位置 1 2 6 4番のグァニンから 1 2 8 5番のシトシンまでの 2 2塩 基の塩基配列
(6) 塩基位置 1 2 6 7番のシトシンカ、ら 1 3 2 0番のアデニンまでの 5 4塩 基の塩基配列
( 7 ) 塩基位置 1 3 0 1番のグァニンから 1 3 5 0番のアデニンまでの 5 0塩 基の塩基配列
( 8 ) 塩基位置 1 8 4番のシ卜シンから 2 0 3番のアデニンまでの 2 0塩基の 塩基配列
( 9 ) 塩基位置 3 2 4番のアデニンから 3 4 3番のシトシンまでの 2 '0塩基の 塩基配列
(10) 塩基位置 3 9 4番のゥリジンから 4 1 3番のグァニンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(11) 塩基位置 4 4 4番のシトシンから 4 8 9番のシトシンまでの 4 6塩基の 塩基配列
(12) 塩基位置 5 3 4番のグァニンから 5 5 3番のゥリジンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(13) 塩基位置 6 4 4番のゥリジンから 6 6 8番のゥリジンまでの 2 5塩基の 塩基配列
(14) 塩基位置 6 8 4番のシトシンから 7 5 8番のゥリジンまでの 7 5塩基の 塩基配列
(15) 塩基位置 7 9 4番のアデニンから 8 2 8番のグァニンまでの 3 5塩基の 塩基配列
(16) 塩基位置 8 6 4番のシトシンから 9 1 8番のグァニンまでの 5 5塩基の 塩基配列
(17) 塩基位置 9 9 4番のグァニンから 1 0 4 8番のシトシンまでの 5 5塩基 の塩基配列
(18)塩基位置 1 0 6 4番のグァニンから 1 1 0 8番のゥリジンまでの 4 5塩基 の塩基配列、 および
(19)塩基位置 1 1 9 4番のグァニンから 1 2 2 3番のグァニンまでの 3 0塩基 の塩基配列塩基
からなる群から選ばれるいずれか 1つの塩基配列とハイプリダイズするオリゴヌ クレオチド、 またはいずれか 1つの塩基配列の少なくとも一部とハイブリダイズ する請求項 1〜 3のいずれかに記載のォリゴヌクレオチド。
5. 配列番号 1の塩基配列の
( 1 ) 塩基位置 2 3番のシトシンから 6 2番のアデニンまでの 4 0塩基の塩基 配列
(2) 塩基位置 9 3番のグァニンから 1 3 1番のシトシンまでの 3 9塩基の塩 基配列
(3) 塩基位置 1 1 7番のグァニンから 1 4 5番のゥリジンまでの 2 9塩基の 塩基配列
(4) 塩基位置 1 2 4 1番のアデニンから 1 2 8 0番のグァニンまでの 4 0塩 基の塩基配列
(5) 塩基位置 1 2 6 4番のグァニンから 1 2 8 5番のシトシンまでの 2 2塩 基の塩基配列
(6) 塩基位置 1 2 6 7番のシトシンカ、ら 1 3 2 0番のアデニンまでの 5 4塩 基の塩基配列
(7) 塩基位置 1 3 0 1番のグァニンから 1 3 5 0番のアデニンまでの 5 0塩 基の塩基配列 ( 8 ) 塩基位置 1 8 4番のシトシンから 2 0 3番のアデニンまでの 2 0塩基の 塩基配列
( 9 ) 塩基位置 3 2 4番のアデニンから 3 4 3番のシトシンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(10) 塩基位置 3 9 4番のゥリジンから 4 1 3番のグァニンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(11) 塩基位置 4 4 4番のシトシンから 4 8 9番のシトシンまでの 4 6塩基の 塩基配列
(12) 塩基位置 5 3 4番のグァニンから 5 5 3番のゥリジンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(13) 塩基位置 6 4 4番のゥリジンから 6 6 8番のゥリジンまでの 2 5塩基の 塩基配列
(14) 塩基位置 6 8 4番のシトシンから 7 5 8番のゥリジンまでの 7 5塩基の 塩基配列
(15) 塩基位置 7 9 4番のアデニンから 8 2 8番のグァニンまでの 3 5塩基の 塩基配列
(16) 塩基位置 8 6 4番のシトシンから 9 1 8番のグァニンまでの 5 5塩基の 塩基配列
(17) 塩基位置 9 9 4番のグァニンから 1 0 4 8番のシトシンまでの 5 5塩基 の塩基配列
(18)塩基位置 1 0 6 4番のグァニンから 1 1 0 8番のゥリジンまでの 4 5塩基 の塩基配列、 および (19)塩基位置 1 1 9 4番のグァニンから 1 2 2 3番のグァニンまでの 3 0塩基 の塩基配列塩基
からなる群から選ばれるいずれか 1つの塩基配列と相補的な塩基配列、 またはい ずれか 1つの塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有する請求項 1〜 4のいずれかに記載のォリゴヌクレオチド。 '
6. 請求項 4に記載の塩基配列のうち、 （ 1 ) ， （ 2 ) ， (4 ) , ( 5 ) ,
(7) ， （8) ， （1 1) ， （1 6) ， （1 9) より選ばれるいずれか 1つの塩 基配列とハイブリダィズするオリゴヌクレオチド、 または （ 1 ) , (2 ) ，
(4) ， （5) ， （7) ， （8) , (1 1) ， （1 6) ， （1 9) より選ばれる いずれか 1つの塩基配列の少なくとも一部とハイブリダイズする請求項 4に記載 のオリゴヌクレオチド。
7. 請求項 5に記載の塩基配列のうち、 （ 1 ) ， （2) ， （4) ， （5 ) ，
(7) , (8) ， (1 1) , (1 6) , (1 9) より選ばれるいずれか 1つの塩 基配列と相補的な塩基配列、 または （ 1 )， （ 2 ) ， (4) , (5) , (7) ,
(8) ， （1 1) ， ( 1 6) , ( 1 9) より選ばれるいずれか 1つの塩基配列の 少なくとも一部に相補的な塩基配列を有する請求項 5に記載のォリゴヌクレオチ ド'。
8. ヒト C D 1 4の発現を抑制しうる請求項 1〜 7のいずれかに記載のォリゴヌ クレオチド。
9. 翻訳阻害実験でヒ ト C D 1 4の発現を 3 0 %以上抑制しうる請求項 8に記載 のオリゴヌクレオチド。
1 0. RNaseH切断実験でヒト CD 1 4の mRN Aとの結合活性がスコア一 1以上 である請求項 8に記載のォリゴヌクレオチド
1 1. 塩基数が 1 0〜5 0のいずれかである請求項 1〜 1 0のいずれかに記載の オリゴヌクレオチド。
1 2. 塩基数が 1 5〜 3 0のいずれかである請求項 1 1に記載のォリゴヌクレオ チド。 '
1 3. ヌクレオチド間の結合基の少なくとも 1つがィォゥ原子を含む請求項 1〜 1 2のいずれかに記載のォリゴヌクレオチド。
1 4. 配列番号 1 0, 1 1， 1 2， 1 3， 1 6， 1 9， 2 0， 2 1， 2 2， 2 3， 24， 25， 2 6， 27， 28， 2 9， 3 2, 33， 34， 3 5， 3 6， 37， 39， 40， 4 1， 42， 45， 46， 4 7， 48， 49， 5 0， 5 1、 5 2， 53， 54， 5 5， 5 6， 57， 58， 59， 6 1， 62， 63， 64， 7 0， 7 1， 72， 7 3， 74， 75， 76， 77， 78, 79， 8 1， 8 3， 8 5， 8 6， 8 7， 8 8， 8 9， 9 0， 1 0 2, 1 0 3, 1 0 9， 1 2 3, 1 24, 1 2 5， 1 3 0， 1 3 5， 1 36, 1 37, 1 38, 1 44, 1 5 5， 1 5 6， 1 5 9， 1 6 0， 1 6 1， 1 62， 1 63， 1 6 4， 1 6 5， 1 7 0， 1 7 1， 1 7 2， 1 77, 1 7 8， 1 79, 1 80, 1 8 1， 1 9 0, 1 9 1，
1 92, 1 9 3， 1 94, 1 9 6, 1 97， 1 9 8， 1 9 9， 20 9, 2 1 0，
2 1 5， 2 1 6， 22 0, 22 1, 224, 2 2 5, 22 6, 22 7, 228, 22 9, 23 0, 2 3 1, 23 2, 2 3 3， 2 3 4, 23 5, 2 3 6, 2 3 7, 2 3 8, 23 9, 24 0, 24 1、 242, 24 3, 244， 24 5, 24 6, 247， 2 48からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を含み、 3 0 塩基以下の塩基からなるオリゴヌクレオチド,
1 5. ヒ ト以外の動物の CD 1 4をコ一ドする遺伝子にもハイプリダイズし 得る、 請求項 1ないし 1 4に記載のォリゴヌクレオチド。
1 6. ヒ ト以外の動物がマウスおよび Zまたはサルである請求項 1 5に記載のォ リゴヌクレオチド。
1 7. 配列番号 1の塩基配列の '
( 1 ) 塩基位置 1 0 3番のアデニンから 1 3 1番のシトシンまでの 2 9塩基の 塩基配列
(2) 塩基位置 1 84番のシトシンから 203番のアデニンまでの 2 0塩基の 塩基配列
(3) 塩基位置 3 24番のアデニンから 3 43番のシトシンまでの 20塩基の 塩基配列
(4) 塩基位置 444番のシトシンから 489番のシトシンまでの 4 6塩基の 塩基配列
(5) 塩基位置 6 84番のシトシンから 7 5 8番のゥリジンまでの 7 5塩基の 塩基配列
(6) 塩基位置 7 94番のアデニンから 828番のグァニンまでの 3 5塩基の 塩基配列
(7) 塩基位置 864番のシトシンから 90 8番のアデニンまでの 4 5塩基の 塩基配列
(8) 塩基位置 994番のグァニンから 1 046番のグァニンまでの 5 3塩基 の塩基配列
(9) 塩基位置 1 0 64番のグァニンから 1 1 0 8番のゥリジンまでの 4 5塩 基の塩基配列
からなる群から選ばれるいずれか 1つの塩基配列と相捕的な塩基配列において、 またはいずれか 1つの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列において、 任意の 1つ以上の塩基がユニバーサルベースに置換された塩基配列を有する請求 項 1 5または 1 6いずれかに記載のォリゴヌクレオチド。 '
1 8 . 請求項 1〜 1 7のいずれかに記載のォリゴヌクレオチドおよび必要に応じ て薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。
1 9 . ヒト C D 1 4を介して生じる炎症性因子によって引き起こされる疾患を治 療するための請求項 1 8に記載の医薬組成物。
2 0 . 前記疾患が敗血症もしくはエンドトキシン血症、 または敗血症性ショック もしくはエンドトキシンショックである請求項 1 9に記載の医薬組成物。
2 1 . ヒト C D 1 4をコードする遺伝子に結合し、 ヒト C D 1 4の発現を抑制し うるオリゴヌクレオチドを有効成分とする、 敗血症またはェンドトキシン血症、 または敗血症性ショックまたはェンドトキシンショックの予防/治療に使用する 医薬組成物。
2 2 . 請求項 1〜 1 7のいずれかに記載のォリゴヌクレオチドおよび必要に応じ て薬学的に許容しうる担体を投与するヒト C D 1 4を介して生じる炎症性因子に よって引き起こされる疾患の予防/治療方法。
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