TWI429910B - 預測食道癌存活及癒後狀態之方法及其套組及微陣列晶片 - Google Patents

預測食道癌存活及癒後狀態之方法及其套組及微陣列晶片 Download PDF

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TWI429910B
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Deng Chyang Wu
Hung Ju Su
Chah Hwa Chou
Jie Len Huang
Yu Kuei Chen
Chun Chieh Wu
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Univ Kaohsiung Medical
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Description

預測食道癌存活及癒後狀態之方法及其套組及微陣列晶片
一種檢測食道癌之方法及檢測組合物，目的在於檢測早期食道癌中特定基因表現量並預測食道癌病患之癒後及存活機率。
食道癌為一高侵略性之癌症，其5年存活率小於15%，現今已成為癌症致死率第六名，且每年全世界之食道癌發病率有漸漸升高的趨勢，食道癌存在許多亞型，食道的腫瘤長會導致吞嚥困難(Dysphagia)，疼痛和不舒服，並需要靠活組織切片檢查做診斷，小的且沒有轉移的腫瘤可靠外科手術治療，但侵犯性強的腫瘤則須靠化學療法、放射線療法或合併使用治療，此病的癒後要看病症不同的程度而定。吞嚥困難是大多數食道癌患者的第一個症狀，吞嚥疼痛也可能會發生。液體和軟性食物通常可接受，而較硬的固體食物(如麵包或肉類)就會困難許多。體重下降可能同時是營養不足合併癌症活動的一個表現。常見症狀為疼痛，特別是灼燒樣痛，可為劇痛、伴隨吞咽加重，或為陣痛，再者，癌腫可能擾亂正常的胃蠕動，導致噁心、嘔吐和食物逆流。由此還會導致咳嗽和發生吸入型肺炎的危險。腫瘤表面可能易破易出血，臨床表現為嘔血。晚期食道癌因癌腫壓迫局部組織，還可能引發上腔靜脈症候群等症狀。另一個併發症是食道和氣管之間發生瘺管。異物經瘺管入肺導致的肺炎常表現為咳嗽、發熱或肺吸入。又，已經遠端轉移的食道癌還會在轉移部位引起其他症狀，例如肝臟轉移導致黃疸、腹水，肺轉移導致呼吸困難、胸膜積液等。
找尋有潛力之基因能夠預測食道癌尤其在早期階段之癒合及存活機率是非常迫切的。現今之預測食道癌為藉由使用抗體或探針去檢測檢體之特定序列或廣泛與食道癌相關之蛋白質，亦或藉由檢測病人之單核苷酸多態性以預測該病人之食道癌細胞是否可被化療之方式治癒。然而先前技術中因對於較不明確之標的物進行檢測以預測食道扁平上皮細胞癌患者癒合存活率，有失其準確性，且程序也較為複雜。另外在美國專利案案號2009/0208514 A1中揭露檢測DKK1來診斷食道癌外，也可預測食道癌之癒後情形。然而若僅以觀測DKK1基因之表現量判斷食道癌癒後情形，不免懷疑其準確性。
然，本發明提供一有別於上述專利之檢測方法，針對檢測食道癌進一步提供二明確檢測標的物，藉由判斷此二檢測標的物之表現量可準確預測食道癌患者之癒後及存活機率，提升以往檢測食道扁平上皮細胞癌以評估病人癒後之準確性。
本發明提供一種用以判斷食道癌患者癒後或存活機率之方法，其包含：
a.　取得一檢體；
b.　檢測該檢體之特定基因在RNA、細胞層次蛋白質或活體組織內蛋白質之表現量；及
c. 將該特定基因之表現量與一對照組進行比對；其中該特定基因為CD14抗原(CD14)或PI3(peptidase inhibitor 3)、該對照組為其他患有食道癌病患之檢體之該特定基因平均表現量；其中該檢體之CD14表現量高於該對照組，則判斷為癒後或存活機率良好；其中，當該檢體之PI3之表現量高於該對照組，則判斷為癒後或存活機率不佳。
本發明所提供之方法可為使用即時PCR、微陣列晶片、免疫組織化學染色法或西方墨點法以檢測該檢體及該對照組之該特定基因之RNA、蛋白質或活體內組織之蛋白質表現量。
為使本發明所提供之方法順利實施，本發明另外提供一種用以檢測食道癌患者癒後及存活機率之檢測套組，其包含：一即時PCR運作裝置，用以檢測一檢體之特定基因之RNA表現量；及一組引子，用以輔助該PCR運作裝置複製特定基因；其中該特定基因為CD14或PI3。同時本發明也提供一種用以判斷食道癌患者癒後或存活機率之微陣列晶片，其包含：一微陣列晶片；及一可辨認特定基因之抗體或核苷酸序列；其中該特定基因為CD14或PI3。
本發明另外提供兩組引子，其分別包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2，與SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4之核苷酸序列，其可應用於本發明提供之檢測套組及微陣列晶片，用以複製或辨認CD14或PI3之核苷酸。
本發明使用一株臺灣食道扁皮上皮細胞癌(ESCC，CE81T/VGH)，利用 Transwell invasion chamber assay，觀察及挑選出侵襲到下層空間之不同侵襲能力之惡性子代細胞。本發明之後使用全基因微陣列晶片比對親代細胞(CE81T1/CE81T1-1)與最有侵襲能力之子代細胞(CE81T2/CE81T2-4)，根據(1)由基因集分析(enrichment analysis)支持參予細胞黏附、細胞骨架重構或細胞外膜重建，或者由文獻支持與腫瘤與癌症的形成和/或進展相關；(2)在原始數據中顯示中至高表現強度；以及(3)基因產物被分泌或位於細胞外、細胞膜或細胞質，最後鑑定出13個潛在的候選基因於表一，其中5個基因表現量為增加，8個基因表現量呈現減少之趨勢，以此對此13個基因進行體外研究，且發現PI3(peptidase inhibitor 3)與CD14抗原(CD14)和食道癌癒後及存活機率有高度相關。本發明所使用細胞株為CE81T2以及CE81T2-4來觀測此二基因之RNA表現量與蛋白質表現量以進行研究，其中CE81T2-4較於CE81T2惡性，實驗結果發現PI3(peptide inhibitor 3)和CD14抗原(CD14)之RNA表現量(由即時PCR或DNA晶片測定)及蛋白質表現量(由西方墨點法或免疫染色測定)結果一致顯示於圖一與圖二。
實施方式一 即時PCR檢測
由圖一所示，PI3此基因在進行全基因微陣列晶片中在CE81T2-4此細胞株中有顯示訊號100但PI3在CE81T2中101則無，而圖二A-1可得知CD14在CE81T2表現200是高於在CE81T2-4的表現量201。在使用即時PCR對此二細胞株檢測其PI3及CD14之RNA表現量，實驗方法為抽取細胞株之全部的RNA，藉由反轉錄成cDNA，再取出300ng的cDNA加入1X SYBR Green Master Mix(Roche Cat；NO.03 531 295 001)以及10mM之引子(引子序列如表二及SEQ ID NO.1~4所示)以放大PI3、CD14及甘油醛-3-磷酸脫氢酶(GADPH)的RNA量藉此觀察細胞株表現PI3和CD14之表現情形。其後進行40個溫度循環：初期變性溫度95℃進行10分鐘，接著變性溫度94℃ 15秒和結合溫度60℃ 1分鐘，其放大之訊號由ABI一步驟即時PCR系統(Applied Biosystems)檢測，藉此觀測CE81T2以及CE81T2-4中PI3及CD14的表現量，檢測結果於圖一B及圖二A-2與B。於圖一B中其CE81T2-4之PI3 RNA表現量111約為在CE81T2的表現量110的兩倍；而由圖二A-2 可以得知CD14的RNA表現在CE81T2細胞株202內高於在CE81T2-4的表現203，且可由圖二B得知CE81T2-4的CD14表現量211為CD14在CE81T2表現量210約0.4倍。
實施方式二 西方墨點法檢測
再者，以進行西方墨點法檢測細胞株中所含有的PI3及CD14蛋白質的表現量，實驗方法為將欲檢測之CD14蛋白質的細胞株中加入溶緩衝溶液中(150mmol/l氯化鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉，10mmol/l乙二胺四乙酸(EDTA)，和1% NP40,1×蛋白脢抑制劑(Roche))和50mmol/l三氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)(pH 7.5)以此取得其全部的蛋白質；而檢測PI3蛋白質之細胞株則是利用TCA沉澱法取其細胞株中全部的蛋白質。細胞株胞溶之緩衝溶液中所含有全部的蛋白質的濃度為使用BCA蛋白質測定法(Pierce)測定，之後加入顯色劑(Invitrogen)到細胞株胞溶之緩衝溶液中加熱到70℃持續十分鐘。再加入40μg的蛋白質進4-12%梯度濃度丙烯醯胺膠(acrylamide gel)(Invitrogen)的每個跑道中進行跑膠。跑完後轉移至PVDF膜(Pall)上，使用5%的牛奶-TBST進行阻塞，然後放入加有一抗包含抗CD14之兔子多源抗體(sc-58954，SantaCruz)及抗PI3之兔子多源抗體(sc-20637，SantaCruz) 進行培養，然後再加入1：5000帶有山葵過氧化氫脢(HRP)之二抗(Pierce)辨認其一抗，再用化學冷光偵測系統(Millipore)進行偵測，最後再將此PVDF膜沖洗後曝露在底片中。另外再使用抗GADPH之多源抗體(Ab Frontier)辨認此內部控制組蛋白，來比對細胞株所含有之PI3及CD14的蛋白含量。實驗結果於圖一C及圖二C，由圖一C發現PI3在CE81T2-4中有高表現量121，反之在CE81T2中120觀測不到PI3蛋白質表現；圖二C則觀測到CD14蛋白質表現量在CE81T2中220較於在CE81T2-4的表現221來的高。
實施方式三 免疫組織染色
本發明也在對於CE81T2及CE81T2-4細胞株進行免疫染色的實驗中也發現相同的實驗結果於圖一D和圖二D。免疫染色實驗所用之抗體與上述西方墨點法相同，皆為抗CD14之兔子多源抗體(sc-58954，SantaCruz)及抗PI3之兔子多源抗體(sc-20637，SantaCruz)，於圖一D所示，PI3在於CE81T2-4有高表現量131；而圖二D顯示CD14蛋白質在CE81T2表現量230較高。總結圖一D及圖二D顯示之實驗結果，在CE81T2-4中，PI3的表現量較高而CD14則較低；反之，在CE81T2中，PI3的表現量則是較低而CD14則較高，而因CE81T2-4較於CE81T2惡性，因此CE81T2-4偏向屬於低癒合存活率而CE81T2則為較高癒合存活率之代表。
本發明之發明人在兩群組之食道扁平上皮細胞癌病人中隨機選擇其福馬林進行固定且用石蠟包埋(FFPE)癌症組織，然後進行切片，而群組分類係根據其存活月數及分期IIA(AJCC,2010)。每群組有3位男性病人，以癒後較好(平均存活約25個月)及癒後較差(平均存活約7個月)來分類。根據圖三 食道癌病患所取之組織免疫組織染色的評分標準，藉以判斷食道扁平上皮細胞癌中PI3及CD14蛋白質的表現情形，群組分類係由同一位病理醫師在不知道病人存活狀態下針對病理切片進行辨別。於圖四A所示一組織陣列400，在每一組織晶片中有10位病人，而每位病人有3個癌症組織且每2位病人位於一排，左上1個黑點401作為標記。免疫組織染色之實驗結果於圖四B，可以看到PI3此蛋白在低存活率之群組表現411較高，而在高存活率之群組412較低；CD14蛋白則是大量表現於高存活率之群組422，而在低存活率之群組421中表現較少。由病理醫師使用圖三免疫染色對照表對於圖四B之結果進行比較，結果顯示於表三，得知在高存活及癒合率之食道癌病患的癌症組織中PI3表現量較少而CD14較高；在低存活及癒合率之食道癌病患的癌症組織表現較大量之PI3而較少的CD14。由上得知，藉此以檢測PI3及CD14在食道癌癌症組織之表現量模式可以推估病患的食道癌癒後狀態及存活率。
表三 食道癌患者抽樣調查表，其中T2為腫瘤已侵犯固有肌肉層(tumor invades muscularis propria)T3為腫瘤已侵犯外膜層(tumor invades adventitia)，M0為無明顯轉移(no distant metastasis)。
100．．．PI3的RNA表現訊號(使用全基因微矩陣晶片檢測CE81T2細胞株)
101．．．PI3的RNA表現訊號(使用全基因微矩陣晶片檢測CE81T2-4細胞株)
110．．．PI3的RNA表現量(使用即時PCR檢測CE81T2細胞株)
111．．．PI3的RNA表現量(使用即時PCR檢測CE81T2-4細胞株)
120．．．PI3蛋白質表現量(使用西方墨點法檢測CE81T2細胞株)
121．．．PI3蛋白質表現量(使用西方墨點法檢測CE81T2-4細胞株)
130．．．PI3的蛋白質表現量(使用免疫組織染色檢測CE81T2細胞株)
131．．．PI3的蛋白質表現量(使用免疫組織染色檢測CE81T2-4細胞株)
200．．．CD14的RNA表現訊號(使用全基因微矩陣晶片檢測CE81T2細胞株)
201．．．CD14的RNA表現訊號(使用全基因微矩陣晶片檢測CE81T2-4細胞株)
202．．．CD14的RNA表現量(使用即時PCR檢測CE81T2細胞株)
203．．．CD14的RNA表現量(使用即時PCR檢測CE81T2-4細胞株)
204．．．GADPH的RNA表現量(使用即時PCR檢測CE81T2細胞株)
205．．．GADPH的RNA表現量(使用即時PCR檢測CE81T2細胞株)
210．．．CD14的RNA表現量(使用即時PCR檢測CE81T2細胞株)
211．．．CD14的RNA表現量(使用即時PCR檢測CE81T2-4細胞株)
220．．．CD14的蛋白質表現量(使用西方墨點法檢測CE81T2細胞株)
221．．．CD14的蛋白質表現量(使用西方墨點法檢測CE81T2-4細胞株)
222．．．GADPH的蛋白質表現量(使用西方墨點法檢測CE81T2細胞株)
223．．．GADPH的蛋白質表現量(使用西方墨點法檢測CE81T2-4細胞株)
230．．．CD14的蛋白質表現量(使用免疫組織染色檢測CE81T2細胞株)
231．．．CD14的蛋白質表現量(使用免疫組織染色檢測CE81T2-4細胞株)
300．．．結果對照表(針對PI3蛋白質使用食道癌患者組織切片進行免疫染色)
301．．．結果對照表(針對CD14蛋白質使用食道癌患者組織切片進行免疫染色)
400．．．癌症組織晶片設計示意圖
401．．．組織晶片之標記(其寬度為2mm)
410．．．針對PI3蛋白質使用免疫組織染色食道癌患者組織之結果
411．．．為低癒合存活率之食道癌患者組織PI3蛋白質表現及分布情形
412．．．為高癒合存活率之食道癌患者組織PI3蛋白質表現及分布情形
420．．．針對CD14蛋白質使用免疫組織染色食道癌患者組織之結果
421．．．為低癒合存活率之食道癌患者組織CD14蛋白質表現及分布情形
422．．．為高癒合存活率之食道癌患者組織CD14蛋白質表現及分布情形
圖一顯示peptidase inhibitor 3(PI3)於細胞株CE81T2與CE81T2-4中之功能性表現。A、PI3在全基因微陣列(Human Whole Genome One Array)中訊號之強度，B、由即時PCR測定PI3之mRNA表現量，其p值小於0.05，C、由Western blotting測定PI3蛋白質表現量，其中加入的蛋白質總量為40μg，D、由IHC染色(箭頭)測定石蠟包埋細胞塊中之PI3蛋白質表現量(4 μm厚)。
圖二顯示CD14抗原(CD14)於細胞株CE81T2與CE81T2-4中之功能性表現。A-1、CD14在全基因微陣列(Human Whole Genome One Array)中之訊號強度，A-2、由即時PCR測定CD14 mRNA表現量，B、由即時PCR測定CD14 mRNA表現量，其p值小於0.05，C、由西方墨點法測定CD14及GADPH蛋白質表現量，進而比較兩種細胞株的CD14表現量差異，D、由免疫組織染色染色(箭頭)測定石蠟包埋細胞塊中之CD14蛋白質表現量(4 μm厚)。
圖三顯示食道癌免疫組織染色中PI3及CD14表現量和分布情形之評分標準，組織來源為食道癌病人。
圖四顯示於同一微陣列晶片中，PI3及CD14於癒後佳之ESCC病人及癒後佳之ESCC病人兩個代表組別中的染色強度表現。A、組織晶片設計。每一晶片有10位病人。每位病人有3個癌症組織與、每排2位病人，左上部份有1個黑點作為「標記」，B、PI3與CD14之功能性表現(放大200倍)。
【附件簡單說明】
附件一為圖一之彩圖，並標上英文標示。
附件二為圖二之彩圖，並標上英文標示。
附件三為圖三之彩圖，並標上英文標示。
附件四為圖四之彩圖，並標上英文標示。
<110> 高雄醫學大學
<120> 預測食道癌存活及癒後狀態之方法及其套組及微陣列晶片
<130> 1582-KMU-TW
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PI3 Forward Primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 1
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PI3 Reverse Primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD14 Forward Primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 3
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD14 Reverse Primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<400> 4
100．．．PI3的RNA表現訊號(使用全基因微矩陣晶片檢測CE81T2細胞株)
101．．．PI3的RNA表現訊號(使用全基因微矩陣晶片檢測CE81T2-4細胞株)
110．．．PI3的RNA表現量(使用即時PCR檢測CE81T2細胞株)
111．．．PI3的RNA表現量(使用即時PCR檢測CE81T2-4細胞株)
120．．．PI3蛋白質表現量(使用西方墨點法檢測CE81T2細胞株)
121．．．PI3蛋白質表現量(使用西方墨點法檢測CE81T2-4細胞株)
130．．．PI3的蛋白質表現量(使用免疫組織染色檢測CE81T2細胞株)
131．．．PI3的蛋白質表現量(使用免疫組織染色檢測CE81T2-4細胞株)

Claims (8)

  1. 一種用以判斷食道癌患者癒後或存活機率之方法，其包含：a. 取得一檢體；b. 檢測該檢體之特定基因在RNA、細胞層次蛋白質或活體組織內蛋白質之表現量；及c. 將該特定基因之表現量與一對照組進行比對；其中該特定基因為PI3(peptidase inhibitor 3)、該對照組為其他患有食道癌病患之檢體之該特定基因平均表現量；其中，當該檢體之PI3之表現量高於該對照組，則判斷為癒後或存活機率不佳，當該檢體之PI3之表現量低於該對照組，則判斷為癒後或存活機率良好。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，該方法為使用即時PCR以檢測該檢體及該對照組之該特定基因之RNA表現量。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，該方法為使用微陣列晶片以檢測該檢體及該對照組之該特定基因之蛋白質表現量。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，該方法為使用西方墨點法檢測該檢體及該對照組之該特定基因之蛋白質表現量。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，該方法為使用免疫組織化學染色法檢測檢體及該對照組之活體內組織該特定基因之蛋白質表現量。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該特定基因進一步包含CD14(CD14抗原)，當該檢體之CD14表現量高於該對照組，則判斷為癒後或存活機率良好，當該檢體之CD14表現量低於該對照組，則判斷為癒後或存活機率不佳。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該PI3基因之一組DNA引子為包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之核苷酸序列。
  8. 請專利範圍第6項之方法，其中該CD14基因之一組DNA引子為包含SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4之核苷酸序列。
TW100137548A 2011-10-17 2011-10-17 預測食道癌存活及癒後狀態之方法及其套組及微陣列晶片 TWI429910B (zh)

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