WO1998025481A1 - Composition d'ail fermente - Google Patents

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WO1998025481A1
WO1998025481A1 PCT/JP1997/004327 JP9704327W WO9825481A1 WO 1998025481 A1 WO1998025481 A1 WO 1998025481A1 JP 9704327 W JP9704327 W JP 9704327W WO 9825481 A1 WO9825481 A1 WO 9825481A1
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garlic
composition
disease
fermenting
enzyme
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PCT/JP1997/004327
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Masanori Kakimoto
Ayumi Suzuki
Isao Nishimoto
Kiyohiro Shiraishi
Youichi Itakura
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Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a garlic fermentation composition, a method for producing the same, and a food or medicine containing the composition.
  • Garlic has been used as a seasoning and spice since ancient times, but in recent years it has become clear that various physiologically active ingredients are contained in it, and it has been widely used as health foods and pharmaceuticals.
  • the present inventor considered that if garlic was fermented with bacteria and / or red bacteria, it would be possible to obtain a composition having no garlic odor and useful as a medicine or food. Since it has an antibacterial action by itself, it was not possible to perform fermentation with Bacillus and z or S. aureus. Also, an example in which a small amount of garlic is added in the wine production process (Japanese Patent Application Laid-Open No. 48-52995) and an example in which a large amount of sugar is added to a small amount of garlic and fermented (Japanese Patent Application Laid-Open No. -No. 26631), but there is no example of fermentation using garlic as a main raw material.
  • an object of the present invention is to eliminate the odor peculiar to garlic by fermenting garlic with bacteria or red bacteria, and to obtain a composition useful as a medicine or food.
  • the present inventors have conducted intensive studies. As a result, if garlic is subjected to enzyme inactivation treatment in advance, garlic alone can be fermented with bacteria and / or red bacteria without adding nutrients such as glucose and starch.
  • the fermented composition obtained has no garlic odor, has about 100 times stronger antioxidant activity than ordinary garlic, and has an anti-diabetic effect, a protective effect against liver damage, an anti-cancer effect, an immune enhancing effect, It has been found that it has a cholesterol lowering effect and is useful for treating or preventing diabetes, liver disease, cancer, immune disease, hyperlipidemia and the like, and has completed the present invention.
  • the present invention provides a composition obtained by fermenting enzyme-inactivated garlic with bacterium and / or Escherichia coli, and foods and medicines containing the same.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a composition obtained by fermenting garlic subjected to an enzyme inactivation treatment with Bacillus and Z or S. aureus, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides a method of fermenting garlic treated with enzyme inactivation with Bacillus and / or S. aureus.
  • the use of the composition as a medicament is provided.
  • the present invention provides a method for administering an effective amount of a composition obtained by fermenting enzyme-inactivated garlic with Bacillus and / or Escherichia coli, which is characterized by diabetes, liver disease, cancer, immune disease and high illness. It is intended to provide a method for treating a disease selected from lipemia.
  • the present invention also provides a method for producing a garlic fermentation composition, which comprises fermenting enzyme-inactivated garlic with Bacillus and Z or S. aureus. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a diagram showing active oxygen scavenging activity.
  • FIG. 2 is a diagram showing active oxygen scavenging activity.
  • 3 to 7 are diagrams showing DPPH radical scavenging activity.
  • FIG. 8 is a view showing the anti-aloxan diabetic action.
  • FIG. 9 is a graph showing glucose tolerance.
  • FIG. 10 shows HMG—C0A reductase inhibitory activity.
  • the garlic refers to Allium sativa ivum L., which belongs to the genus Liliaceae or Allium.
  • the part of garlic used for fermentation is particularly preferably a stalk part.
  • the bulbs treated with enzyme inactivation can be sliced as they are, or sliced to an arbitrary size, or crushed into crushed juice for fermentation. it can. If necessary, beans, such as rice, soybean, wheat, and barley, and Z or grains may be added.
  • garlic is subjected to an enzyme deactivation treatment.
  • the enzyme deactivation treatment can be carried out by treating garlic with heat, microwave, high pressure treatment, enzyme, acid or alcohol, of which heat treatment is simple and preferable.
  • the temperature for the heat treatment is preferably 50 to 200 ° C. for 1 to 60 minutes, and particularly preferably 90 to 121 ° C. and 10 to 30 minutes.
  • Garlic subjected to enzyme inactivation treatment is, for example, Aspergi ll us oryzae, Aspergi ll us Sojae, Aspergillus kawachi, Aspergillus awamori and other bacteria and Monascus pilosus, Monascus anka, Monascus paxii, Monascus pubigerus, Monascus purpures ⁇ Monascus rube Monascus vitreus, Monascus vitreus, Monascus major, etc.
  • the fermented garlic composition can be obtained by fermentation.
  • fermenting bacteria examples include bacterium (Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus kawachi, Aspergillus awamori, etc.) and Rhizobium (Monascus strains: M. pi losus, M. anka, M. paxi M. pubigerus, M. purpures. M. ruber. M. vitreus, M. major) is preferably used.
  • C strain is preferably used in a potato dextrose agar medium supplemented with 2% yeast extract. And pre-cultured at 10 to 50 ° C for 2 to 14 days, preferably at 20 to 40 ° C for 2 to 4 days.
  • Pre-culture medium includes Sabouraud medium (peptone 1%, glucose 4%), potato dextrose medium (potato decoction (200 g / _g) glucose 2, glycerin medium (glycerin 7%, glucose 3%). %, Soybean meal 3%, Nippon 0.8%, Magnesium sulfate 0.1%, Sodium chloride 0.2%) Although a medium for fungi can be used, an edible medium is preferable as a medium composition.
  • 0.1 to 50, preferably 0.5 to 10% of the precultured bacterial solution prepared in Step 2 is added to the garlic medium prepared in Step 1, and the mixture is added at 10 to 50 ° C for 7 days to 6 days.
  • Shake culture or static culture for 0 days, more preferably 20 to 40 days, for 7 to 35 days for bacteria, and 14 to 42 days for S. aureus Thereby, a garlic fermentation composition can be prepared.
  • stationary culture may be performed in the form of solid culture by reducing the water content of the medium to 40 to 60%.
  • the fermented product is heat-sterilized and used directly or separated from the culture filtrate and used separately. It is also possible to extract and use only the active ingredient.
  • composition of the present invention thus obtained can be made into a food by a conventional method, or can be made into various types of drugs together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • an excipient and, if necessary, a binder, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, a flavoring agent, a flavoring agent, etc. are added to the garlic fermentation composition.
  • Tablets, coated tablets, granules, powders, capsules, and the like can be manufactured by a conventional method.Such additives may be those generally used in the art, and examples thereof include excipients. , Lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, silicic acid, etc.
  • the binders are water, ethanol, propanol, simple syrup, dextrose, starch liquid, Gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroquinpropyl starch, methylcellulose, ethylcellulose, shellac, Calcium calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone, etc .; disintegrants are dried starch, carmellose sodium, alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate Glucose, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, lactose, etc., lubricating agents such as refined talc, stearates, borax, polyethylene glycol, etc. Can be illustrated.
  • a flavoring agent, a buffer, a stabilizing agent, a flavoring agent, etc. can be added to the garlic fermentation composition to produce an oral solution, a syrup, an elixir, etc. in a conventional manner.
  • those mentioned above may be used as the flavoring agent, and sodium citrate or the like may be used as the buffer, and tragacanth, arabia gum, gelatin or the like may be used as the stabilizer.
  • the food or medicament of the present invention can be used for the treatment or prevention of diabetes, liver disease, cancer, immune disease, hyperlipidemia and the like.
  • the dose and administration method can be appropriately determined depending on the age, body weight, symptoms, etc., but usually 0.5 to 2 g of the composition of the present invention is administered once or several times a day for an adult. Is preferred.
  • composition of the present invention garlic, bacillus or staphylococcus, which is a main component, is usually used for food and generally has low toxicity. Further, the composition of the present invention was fed to a young rat in a 3% diet for 3 weeks, but no abnormalities were observed in the growth process and general behavior, and it was confirmed that the substance was highly safe. Was.
  • the garlic fermentation composition of the present invention has a strong antioxidant activity, has an anticancer effect, an immunopotentiating effect such as NK activity, a protective effect against acetoaminophen hepatic injury, a protective effect against aroxane sugar and urine disease model, and glucose tolerance. Its anti-diabetic effect and cholesterol lowering effect due to its potentiating effect are recognized, and it is extremely useful for the treatment or prevention of adult diseases prevalent in modern society.
  • composition of the present invention is highly safe and has almost no garlic odor (unlike odorless garlic obtained by inactivating alinase, garlic odor is not generated in the mouth). Examples that can be widely used as health foods and pharmaceuticals Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The present invention is not limited by this.
  • Table 1 shows the bacterium and red bacterium used in this example.
  • the garlic medium showed a weak quenching activity, but the garlic fermented extract increased the quenching activity according to the fermentation period.
  • the activity of the garlic medium was slightly increased by the addition of glucose, but the fermented extract showed almost no difference (Fig. 1) o
  • the garlic fermented extract was diluted and the ability to eliminate superoxide anion was similarly measured.
  • the garlic fermented extract was a 4-week fermented sample, the activity of the garlic medium was equal to that of a 100-fold diluted sample, and the fermentation enhanced the superoxide anion elimination activity by a factor of 100. ( Figure 2) .
  • the DP PH radical scavenging activity was measured using a 100-fold dilution.
  • Rice medium and soy medium showed almost no DPPH radical scavenging activity.
  • A-1 showed some DPPH radical scavenging activity in rice medium and was even weaker in soybean medium, but very strong activity was observed in fermented extract of garlic medium.
  • soybeans are the same as garlic medium as dry solids A soy medium prepared as described above, a medium in which garlic and soy were mixed, and the like were used.
  • the sample was diluted with 0.5 M acetate buffer (pH 5.5), 0.5 mL of ethanol was added to the sample, and 0.5 mM DP PH (1,1—diphenyl-1—2—) was added.
  • Ethanol solution 0.2 was added and mixed well, and the absorbance at 52 Onm was measured with time to find the percentage of the control without the sample. The results are shown in FIGS.
  • the mixed medium of garlic and soybean (2: 2) showed weak scavenging activity, but the fermented garlic extract fermented with S. aureus increased the scavenging activity according to the fermentation period.
  • A-24 and A-26 showed strong activity (Fig. 6).
  • ICR male mice (7 weeks old: CLEA Japan) were subcutaneously implanted with sarcoma-180 10 6 cells / mouse, and the test substance was orally administered 10 times every other day from the next day.
  • the size (3Z4 X minor axis X minor axis X major axis 3 ) was measured. Thereafter, the spleen is aseptically removed, a cell suspension is prepared according to a conventional method, and a Tris buffer for removing erythrocytes (17 mM tris- ⁇ -methyloxymethane 0.77%, NH 4 C £, H 7. 6 5) After processing, is it a shaku? Wash with 1 ⁇ 1 1 6 4 0, RPMI containing 10% FCS
  • Cytotoxicity (%) ((Exp-Tspon) / (Tmax-Tspon)) xlOO
  • NK activity was measured using spleen cells 3 weeks after cancer cell transplantation.
  • the NK activity was 17.8% and 14.1% in the A- and A-6 administration groups, compared to 4.6% in the control group, and a statistically significant increase in NK activity was observed.
  • a significant potentiating effect was observed in the crestine administration group.
  • Killer activity was measured using spleen cells 3 weeks after cancer cell transplantation. Similar to the NK activity, the killer activity showed a remarkable and statistically significant activity enhancing effect in the group administered with A-1, A-6.
  • test substance was orally administered 30 minutes before and twice, and acetaminophen (400 mg / kg) was intraperitoneally administered.
  • blood was collected from the abdominal vena cava using a heparin-treated syringe, and plasma GPT activity was measured and used as an indicator of liver damage.
  • Acetaminophen (Wako Pure Chemical Industries) was dissolved in a saline solution adjusted to pH 11 with an aqueous solution of tribasic phosphate (10 Omg /) in a boiling water bath.
  • GPT activity in plasma was measured using GPT-UV Test Co. (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The results are shown below.
  • the GPT activity of the ⁇ -1, A-6 administration group only increased by 146, 68 I UZ_i, and a remarkable protective action against liver injury was observed.
  • Example 3 Six-week-old male ddY mice (Japan SLC) were fasted overnight. Blood was collected from the orbital venous plexus for 20 pounds using a capillari. Oral administration of 4 gZkg of the test substance, 1 hour later, aloxane (Wako Jun Drug) 5 O mgZkg was intravenously administered, and blood was similarly collected 1 hour and 6 hours later. The fasting was released immediately after the administration of aroxane, the test substance was orally administered once a day from the day before the administration of the aloxane to 3 days after, and blood sampling was similarly performed after 1, 2, and 4 days. Immediately after blood collection, plasma was separated using a hematocrit centrifuge, and blood glucose levels were measured using Glucose CII-Test Pico (Wako Pure Chemical).
  • the blood glucose level of a normal mouse is about 20 mg / dl, but the administration of aloxane increased the blood glucose level of the control group to 540 mg / h after 1 hour. It continued to increase thereafter, reaching 65 O mgZ after 48 hours.
  • the garlic fermentation composition A-6 administration group the blood glucose level at 1 hour after administration of aroxane remained at 38 OmgZdi, and there was a statistically significant reduction in blood glucose elevation between the control group and the control group. Admitted. Subsequently, significant lows were observed. A-1 also showed a significant inhibitory effect on blood glucose elevation.
  • boiled garlic (garlic medium: BG), which was used as a raw material for fermentation, did not inhibit the increase in blood glucose caused by administration of aroxane (FIG. 8).
  • Example 3 An 8-week-old male male d d Y strain (Japan SLC) was fasted overnight, and then blood was collected from the orbital venous plexus using a capillarium to remove 20 / ⁇ blood, and then water was removed until the end of the experiment.
  • the test substance and starch were orally administered at the same time, and blood was similarly collected 30, 60, and 120 minutes later.
  • the plasma was separated by a hematocrit centrifuge, and the blood glucose level was measured using Glucose CII-Test Co. (Wako Pure Chemical).
  • Statistical processing was performed in the same manner as in Example 3.
  • Fig. 9 shows the results.
  • the blood glucose level of the control group to which starch was orally administered increased by 150 mg / d after 30 minutes, but increased only by 100 mg / ci in the A-1 administration group, which was significant compared to the control group. A significant inhibitory effect on blood sugar elevation was observed. Thereafter, the blood glucose level was slightly higher than that of the control group, although there was no significant difference, and a delayed increase in blood glucose level was observed. In the A-6 administration group, almost the same results as in A-1 were obtained. On the other hand, the group to which boiled garlic (garlic medium: BG) was administered showed the same blood glucose transition as the control, and the result was clearly different from the garlic fermentation composition (FIG. 9).
  • Example 7 Cholesterol Synthesis Inhibitory Activity of Garlic Fermented Extract Using Rhizobium Investigation was performed using the same garlic fermented extract as in Example 2.
  • Wistar male rats (6.5-week-old) were bred for 6 days in powdered EC-2 (made by CLEA Japan) under reversed lighting of 17: 0 to 5:00 in the morning. And 2% cholestyramine, 8% corn oil and CE-2 for 5 days. Rats were bled to death at 10: 00, which corresponds to midnight, and the liver was extirpated. The liver was excised, and a 2-fold amount of phosphate buffer was added under ice-cooling, and a homogenate was prepared with a Teflon homogenizer. The microsomal fraction was prepared as follows, adjusted to a protein amount of 1 OnigZ, and stored at 180 ° C.
  • the enzyme reaction mixture 50 was prepared to contain the following reagents, and reacted at 37 ° C for 30 minutes. The reaction was started by adding the enzyme solution, and stopped by adding 20N hydrochloric acid. After the addition of hydrochloric acid, the mixture was further incubated at 37 ° C for 15 minutes. Next, a suspension of cation exchange resin (Bio Rex 5: manufactured by Bio Rad) (1 gZ1450 ⁇ ) was added, and after shaking for 1 hour, the supernatant 400 was added to a liquid scintillator ( ACS I: Amersham) and 14 C separated from CoA were counted in addition to 10.
  • ACS I liquid scintillator
  • test substance (fermented extract obtained by the method described in Example 2) was added at 10 / _ ⁇ in 50 £ of the reaction solution, and 3 points sandwiching 50% inhibition from the enzyme reaction without addition From the above data, IC 5 was determined by the Litchfild-Wilcoxon method. Values were calculated.
  • reaction liquid 50 / medium 30 to 40 ⁇ g microsomal protein (reaction liquid 50 / medium)
  • FIG. 10 shows the HMG-C0A reductase inhibitory activity (indicated by the reciprocal of IC 5 ) of each culture solution.
  • S. aureus A-24 strain
  • soy medium almost no inhibitory activity was observed during the study period, but in the mixed medium of garlic and soy, an inhibitory activity with an IC 50 value of 0.03 to 0.0 was observed. Stronger inhibitory activity depending on the culture period with garlic medium (IC 5. Value 0. 0 2 ⁇ 0. 0 0 ⁇ ⁇ / m was observed (Fig. 1 0).
  • Lactose, corn starch, crystalline cellose, carmellose calcium and magnesium stearate were added to the garlic fermentation composition prepared in Example 3 in the following prescribed amounts, and the mixture was added with a Bohle container mixer (manufactured by Kotopi Giken Kogyo). Mix for 0 minutes.
  • This mixed powder was compression-molded with a tableting machine (Collect 19K, manufactured by Kikusui Seisakusho) to produce tablets with a diameter of 8 countries and a weight of 18 Omg. This tablet was excellent in hardness and disintegration in the stomach.
  • the garlic fermentation composition prepared in Example 3 was mixed with corn starch, crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose and carmellose calcium in the following amounts, and then mixed with water.
  • the kneaded product was extruded into a columnar granule having a depth of 0.8 with an extruder (DOME GRAN. Manufactured by Fuji Baudal), sized, dried and sieved to produce a condyle granule.
  • the granules are excellent in disintegration in the stomach and can be provided in a packaged form such as a sachet.
  • Example 10 Formulation Example z Drink
  • a sweetener, an acidifier, a flavor, and water were added to the garlic fermentation composition obtained in Example 2 according to the following formulation, sterilized, and filled in a glass bottle to prepare a drink.
  • composition of the present invention has no odor and is useful for diabetes, liver disease, cancer, immune disease, hyperlipidemia, etc. Useful as a preventive and therapeutic agent,

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Description

明 細 書 ニンニク発酵組成物
技術分野
本発明は、 ニンニク発酵組成物及びその製造法並びにこれらを含む食品又は医 薬に関する。 背景技術
ニンニクは、 古来より調味料、 香辛料として利用されているが、 近年、 その中 に種々の生理活性成分が含まれていることが明らかとなり、 健康食品及び医薬品 として広く使用されている。
しカヽし、 ニンニクにはァリシン、 ジァリルジスルフィ ド等の臭気成分の前駆物 質が含まれ、 容易にこれらに変換されるため、 嗜好が合わず敬遠する人も多い。 そのため、 熱処理して無臭化する方法 （特開昭 5 9 - 2 1 6 5 6 5号公報、 特開 平 4 一 1 2 6 0 4号公報） 等が開発されたが、 服用後にニンニク臭が発生する等、 依然問題が残されている。
また、 ニンニクは、 加工条件の違いにより、 含有成分や生理活性に差が生じる ため、 ニンニクの加工法を定めることは重要である （望月恵美子： FOODS & FOOD INGREDIENTS JOURNAL OF JAPAN164, 36-45, 1995) 。
一方、 ニンニク以外に、 従来から麴菌及び/又は紅麴菌を用いた発酵法があり、 味噌、 醤油及び酒等の製造に利用されている。 この麴菌及び紅麴菌はいずれも長 年にわたる食経験から安全性については既に実証されており、 種々の生理活性を 有することが報告されている （例えば、 麴菌による抗酸化活性 （山口直彦： 日本 食品工業学会誌 . 71-75, 1979) 、 アンジォテンシン I変換酵素阻害活性 （寺 中毅頼他： 日本農芸化学会誌 ， 1163-1169, 1995) 又は紅麴菌によるコレステ ロール低下活性、 降圧活性等が報告されている） 。
そこで、 本発明者はニンニクを麴菌及び/又は紅麴菌で発酵処理すれば、 ニン ニク臭がなく、 かつ医薬又は食品として有用な組成物が得られると考え、 検討し たが、 ニンニクはそれ自体で抗菌作用を有するため、 麴菌及び z又は紅麴菌で発 酵を行うことはできなかった。 またぶどう酒の製造過程で少量のニンニクを添加 した例 （特開昭 4 8 - 5 2 9 9 5号公報） や少量のニンニクに多量の糖を添加し て発酵させた例 （特開昭 5 3 - 2 6 3 6 1号公報） はあるが、 ニン二クを主原料 とした発酵例はない。
従って、 本発明の目的は、 ニンニクを麴菌又は紅麴菌で発酵させることにより ニンニク特有の臭気をなく し、 医薬又は食品として有用な組成物を得ることにあ る 発明の開示
斯かる実状に鑑み本発明者らは鋭意研究を行った結果、 ニンニクを予め酵素失 活処理すれば、 グルコース、 デンプン等の栄養源を加えずニンニクのみでも麴菌 及び/又は紅麴菌で発酵できることを見出し、 更に得られた発酵組成物はニン二 ク臭がなく、 通常のニンニクに比べ抗酸化活性が約 100倍強く、 抗糖尿病作用、 肝障害防護作用、 抗癌作用、 免疫増強作用、 コレステロール低下作用等があり、 糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患、 高脂血症等の治療又は予防に有用であることも 見出し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、 酵素失活処理したニンニクを麴菌及び/又は紅麴菌で発酵 させた組成物、 並びにこれを含む食品及び医薬を提供するものである。
また本発明は、 酵素失活処理したニンニクを麴菌及び Z又は紅麴菌で発酵させ た組成物及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供するものであ る。
また本発明は、 酵素失活処理したニンニクを麴菌及び/又は紅麴菌で発酵させ た組成物の医薬としての使用を提供するものである。
更に、 本発明は、 酵素失活処理したニンニクを麴菌及び/又は紅麴菌で発酵さ せた組成物の有効量を投与することを特徴とする糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患 及び高脂血症から選ばれる疾患の処置方法を提供するものである。
また本発明は、 酵素失活処理したニンニクを麴菌及び Z又は紅麴菌で発酵させ ることを特徴とするニンニク発酵組成物の製造法を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 活性酸素消去活性を示す図である。 図 2は、 活性酸素消去活性を示す 図である。 図 3〜図 7は、 D P P Hラジカル消去活性を示す図である。 図 8は、 抗ァロキサン糖尿病作用を示す図である。 図 9は、 耐糖能を示す図である。 図 1 0は、 H M G— C 0 Aリダクタ一ゼ阻害活性を示す図である。 発明を実施させるための最良の形態
本発明においてニン二クとはユリ科（Li l iaceae)、 ァリウ厶（Al l ium)属に属す るァリゥ厶 ·サチバム■ リ ンネ（Al l ium sat ivum L. )を示す。
ニンニクのうち発酵に用いる部分は、 とりわけ鳞茎部が好ましく、 酵素失活処 理した鱗茎をそのまま又は任意の大きさにスライスするか、 あるいは破砕して破 砕汁にしたものを発酵に供することができる。 また、 必要に応じて、 米、 大豆、 麦、 ハトムギ等の豆類及び Z又は穀類を添加してもよい。
本発明のニンニク発酵組成物を製造するには、 まずニンニクの酵素失活処理を 行う。 酵素失活処理は、 ニンニクを熱、 マイクロウエーブ、 高圧処理、 酵素、 酸 又はアルコールで処理することにより行うことができ、 このうち熱処理が簡便で あり好ましい。 熱処理のための温度は、 5 0〜 2 0 0 °C、 1〜6 0分が好ましく、 特に 9 0〜 1 2 1 °C、 1 0〜 3 0分が好ましい。
酵素失活処理したニンニクは、 例えば Aspergi l l us oryzae, Aspergi l l us sojae、 Aspergillus kawachi、 Aspergillus awamori等の麴菌及び Monascus pilosus、 Monascus anka、 Monascus paxii、 Monascus pubigerus、 Monascus purpures^ Monascus rube Monascus vitreus、 Monascus major等の紅麴菌から 選ばれる一種又は二種以上の菌により発酵させれば、 目的とするニンニク発酵組 成物を得ることができる。
具体的なニンニク発酵組成物の調製法としては、 例えば次の工程に従って行う 方法が挙げられる。
1 ) ニンニク培地 Zニンニク含有培地の調製
ニンニクを水洗した後、 等量の水を加え、 2 0〜3 0分間煮沸し、 必要に応じ て、 細断、 破砕等の加工を行う （破砕する場合は、 破砕汁のみを使用することも できる） 。 これに必要により、 栄養源として適宜、 米、 大豆、 麦、 ハト厶ギ等の 豆類及び Z又は穀類を加えたり、 補糖を行い、 オートクレープ等で滅菌 （ 1 2 1 て、 2 0分） する。 なお、 豆類及び/又は穀類を加えたり、 補糖を行う場合は、 これらが全体の 9 0重量％ (以下、 単に 「％」 という） を超えないようにする。
2) 発酵菌の前培養
発酵菌と しては、 麴菌 (Aspergillus oryzae、 Aspergillus sojae、 Aspergillus kawachi. Aspergillus awamori等） 及び紅麴菌 (Monascus 属の菌 株 ： M. pi losus、 M. anka、 M. paxi M. pubigerus、 M. purpures. M. ruber. M.vitreus, M.major等） から選ばれる一種又は二種以上を用いることが好ましい c 菌株は 2 %酵母エキス添加ポテトデキストロース寒天培地で継代し、 それを次 の培地に接種し、 1 0〜5 0°Cで 2〜 1 4日、 好ましくは 2 0〜4 0°Cで 2〜4 日間前培養する。
前培養用の培地は、 サブロー培地 （ペプトン 1 %、 グルコース 4 %) 、 ポテト デキストロ一ス培地 （ジャガイモ煎汁 （ 2 0 0 g / _g ) グルコース 2 、 グリ セリ ン培地 （グリセリン 7 %、 グルコース 3 %、 Soybean meal 3 %、 ぺプト ン 0. 8 %、 硫酸マグネシウム 0. 1 %、 塩化ナトリウム 0. 2 %) の他、 任意 の真菌用の培地を利用できるが、 培地構成物としては食用可能な物が好ましい。
3 ) ニンニクの発酵
工程 1で調製したニンニク培地に、 工程 2で調製した前培養菌液を 0 . 1〜 5 0 、 好ましくは 0 . 5〜 1 0 %添加し、 1 0〜 5 0 °Cで 7日〜 6 0日間、 更 に好ましくは、 2 0〜 4 0でで麴菌の場合は 7日〜 3 5 日間、 紅麴菌の場合は 1 4 日〜 4 2日間、 振盪培養若しくは静置培養を行うことにより、 ニンニク発酵 組成物を調製することができる。 また、 培地の水分を 4 0〜6 0 %に減少させ、 個体培養の形式で静置培養を行つてもよい。
4 ) ニンニク発酵組成物の処理
工程 3の発酵が終了した段階で、 発酵物を加熱滅菌した後、 これを直接使用す るか又は培養濾液と分離して別々に使用する。 また、 有効成分のみを抽出して使 用することもできる。
このようにして得られた本発明の組成物は、 常法により食品としたり、 薬学的 に許容される担体とともに種々の剤型の医薬とすることができる。
このうち経口用固形製剤を調製する場合は、 ニンニク発酵組成物に賦形剤、 必 要に応じて結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 着色剤、 矯味剤、 矯臭剤等を加えた後、 常 法により錠剤、 被覆錠剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤等を製造することができる そのような添加剤としては、 当該分野で一般的に使用されるものでよく、 例えば、 賦形剤としては、 乳糖、 白糖、 塩化ナトリウム、 ぶどう糖、 デンプン、 炭酸カル シゥ厶、 カオリ ン、 微結晶セルロース、 珪酸等を、 結合剤としては、 水、 ェタノ —ル、 プロパノール、 単シロップ、 ブドウ糖液、 デンプン液、 ゼラチン液、 カル ボキシメチルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルセルロース、 ヒ ドロキンプロピル スターチ、 メチルセルロース、 ェチルセルロース、 シェラック、 リ ン酸カルシゥ 厶、 ポリ ビニルピロリ ドン等を、 崩壊剤としては乾燥デンプン、 カルメロース力 ルシゥ厶、 アルギン酸ナトリウム、 カンテン末、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸カル シゥム、 ラウリル硫酸ナトリウム、 ステアリン酸モノグリセリ ド、 乳糖等を、 滑 沢剤としては精製タルク、 ステアリン酸塩、 ホウ砂、 ポリエチレングリコール等 を、 矯味剤としては白糖、 橙皮、 クェン酸、 酒石酸等を例示できる。
経口用液体製剤を調製する場合は、 ニンニク発酵組成物に矯味剤、 緩衝剤、 安 定化剤、 矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等を 製造することができる。 この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、 緩衝剤としてはクェン酸ナトリウム等が、 安定化剤としてはトラガント、 ァラビ ァゴム、 ゼラチン等が挙げられる。
本発明の食品又は医薬は糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患、 高脂血症等の治療又 は予防の目的で使用することができる。
投与量及び投与方法は、 年齢、 体重、 症状等により適宜決定することができる が、 通常成人 1 日当たり、 本発明組成物を 0 . 5〜2 gを 1回又は数回に分けて 投与することが好ましい。
なお、 本発明組成物は主成分であるニンニク、 麴菌又は紅麴菌が通常食用に供 されてており、 一般に低毒性である。 また、 本発明組成物を若齢ラッ トに、 3週 間にわたって 3 %混餌で与えたが、 成長過程および、 一般行動に何ら異常は認め られず、 安全性の高い物質であることが確認された。
本発明のニンニク発酵組成物は、 強い抗酸化活性を有し、 抗癌作用、 N K活性 等の免疫増強作用、 ァセトァミノフェン肝障害に対する防護作用、 ァロキサン糖 尿病モデルに対する防護作用、 耐糖能の増強作用による抗糖尿病作用、 コレステ ロール低下作用等が認められ、 現代社会に蔓延する成人病の治療又は予防にきわ めて有用である。
また、 本発明組成物は安全性が高く、 かつニンニク臭が殆どない （ァリナーゼ を失活することによって得られる無臭ニン二クとは異なり、 口の中でニンニク臭 が発生することはない） ので健康食品及び医薬品として広く用いることができる 実施例 次に実施例をあげて本発明を更に詳しく説明する。 なお、 本発明はこれによつ て限定されるものではない。 また、 本実施例で使用した麴菌及び紅麴菌株を表 1 に示す。
表 1
Figure imgf000009_0001
実施例 1 麴菌を用いたニンニク発酵組成物の製造及びその抗酸化活性
(発酵組成物 （エキス） の調製）
ニンニクを水洗した後、 等量の水を加え、 3 0分間煮沸した後、 破砕し、 破砕 汁を得た。 破砕汁に等量の水、 及びグルコース 2%を添加し、 オートクレーブで
1 2 1 °C 2 0分間滅菌した （ニンニク培地） 。 別に、 麴菌 （Aspergillus oryzae) を、 サブロー培地 （ペプトン 1 %、 グルコース 4 %) で 2 7で、 1 6 0 rpm 振盪の条件下で 3日間前培養し、 ニンニク培地にこの培養液を 1 %添加し 2
7 °C 1 6 0 rpm振盪の条件下で 2日〜 5週間培養し、 3 0 0 rpm 1 0分間遠心 分離した上清 （エキス） を以下の試験に用いた。 一方、 米、 大豆は、 乾燥固形物 としてニンニク培地と等しくなるように調製した。
(スーパーォキシドア二オン消去能の測定法）
65mM KH2PO4—ほう酸緩衝液 （pH 8. 2 ) 2 0 0 £、 5 キサンチン水溶液 2 0 0〃 £、 1 0 mMヒ ドロキシルアミ ン水溶液 1 0 0〃 ^、 水 2 0 0〃 の混合 液にサンプル 1 0 0〃 ^及び、 キサンチンォキシダーゼ 2 0 0 £を加え、 3 7 °Cで 1 5分間インキュベートした。 インキュベート終了時に、 反応停止及び発色 の目的で、 3 0 M N—ナフチルエチレ ンジァ ミ ン一 3 mMスルフ ァニル酸 - 2 5 %氷酢酸 2 m を加えて室温で 4 5分間放置し、 5 5 Onmで吸光度を測定し た。 本測定は、 2回行い、 サンプル添加による吸光度の減少から活性酸素消去活 性 （％) を求めた。 なお、 キサンチンォキシダ一ゼ （キサンチンォキシダーゼ懸 濁液：和光純薬） は、 吸光度の変化が 0. 0 2 0〜0. 0 2 5Z分になるように 調製した （ 1 5〜2 0
Figure imgf000010_0001
。
結果を図 1及び 2に示す。
( D Ρ Ρ Ηラジカル消去能の測定法）
サンプルを 0. 5 Μ酢酸緩衝液 （ρΗ5. 5 ) で希釈し、 その 0. 5 にェタノ —ル 0. 5 を加え、 更に 0. 5raM D P PH ( 1 , 1 —ジフエニル— 1 — 2— ピクリルヒ ドラジル ：和光純薬） エタノール溶液 0. 2 5 を加えてよく混合し、 5 2 0 nmにおける吸光度を経時的に測定し、 サンプル無添加の対照に対する％を 求めた。 結果を図 3〜5に示す。
(結果）
( 1 ) ニンニク培地及び、 ニンニク発酵エキスのスーパーォキシドア二オン消去
II
ニンニク培地は、 弱い消去活性を示したが、 ニンニク発酵エキスは、 発酵期間 に応じて消去活性が増加した。 また、 グルコースの添加によって、 ニンニク培地 の活性は僅かに増加したが、 発酵エキスは、 ほとんど差が認められなかった （図 1 ) o
ニンニク発酵エキスを希釈して、 同様にス一パーォキシドア二オン消去能を则 定した。 ニンニク発酵エキスは、 4週間発酵のサンプルで、 1 0 0倍希釈したも のと、 ニンニク培地の活性が等しくなり、 発酵によってスーパーォキシドアニォ ン消去活性は、 1 0 0倍に増強された （図 2) 。
( 2) DP PHラジカル消去活性
1 0 0倍希釈液を用いて DP PHラジカル消去活性を測定した。 ニンニク培地
(BG) は、 殆ど活性は認められなかったが、 ニンニク発酵エキスは、 何れの麴 菌でも、 発酵期間に応じて DP PHラジカル消去活性が増加した。 特に A— 1、 A - 6に強い活性が認められた （図 3 ) 。
( 3 ) A- 1、 A-6 の DP PHラジカル消去活性物質産生に及ぼす培地の影響
米培地、 大豆培地は殆ど DP PHラジカル消去活性を示さなかった。 A— 1は、 米培地で若干の DP PHラジカル消去活性が認められ、 大豆培地では更に弱いも のであつたが、 ニンニク培地の発酵エキスでは、 非常に強い活性が認められた。
(図 4 ) A— 6では、 ニンニク培地での特異性が、 更に顕著に認められた。 （図 5 )
実施例 2 紅麴菌を用いたニンニク発酵エキスの抗酸化活性
(発酵エキスの調製法）
ニンニクを水洗した後、 等量の水を加え、 3 0分間煮沸した後、 破砕し、 鶴 汁を得た。 破砕汁に等量の水、 及びグルコース 2 %を添加し、 オートクレープで
1 2 1 °C. 2 0分間滅菌した （ニンニク培地） 。 別に、 紅麴菌 （Monascus属） 1 白金耳を、 グリセリ ン培地 （グリセリ ン 7 %、 グルコース 3 %、 Soybean meal
3 %、 ペプトン 0. 8 %、 硫酸マグネシウム 0. 1 %、 塩化ナトリウム 0. 2 %) で培養し、 ニンニク培地にこの培養液を 1 %添加し 2 5°C、 1 6 0rpm 振盪の条 件下で 2〜5週間培養し、 3 0 0 rpm 1 0分間遠心分離した上清を以下の試験に 用いた。 ニンニク培地の他、 大豆を乾燥固形物としてニンニク培地と等しくなる ように調製した大豆培地、 ニンニクと大豆を混合した培地などを用いた。
( D P P Hラジカル消去能の測定法）
サンプルを 0. 5 M酢酸緩衝液 （pH5. 5) で希釈し、 その 0. にェ夕ノ ール 0. 5 を加え、 更に 0. 5mM D P PH ( 1 , 1 —ジフエニル— 1 — 2— ピクリルヒ ドラジル：和光純薬） エタノール溶液 0. 2 を加えてよく混合し、 5 2 Onmにおける吸光度を経時的に測定し、 サンプル無添加の対照に対する％を 求めた。 結果を図 6及び 7に示す。
(結果）
( 1 ) 紅麴培溶液の DP PHラジカル消去能
ニンニク ：大豆 （ 2 ： 2) の混合培地は、 弱い消去活性を示したが、 紅麴菌で 発酵した、 ニンニク発酵エキスは、 発酵期間に応じて消去活性が増加した。 特に、 A— 2 4、 A— 2 6に強い活性が認められた （図 6 ) 。
A— 2 4株を用いて、 ニンニクと大豆の混合比を変えて検討した。 大豆のみの 培地 （ 0 ： 4) では、 ラジカル消去活性は、 弱いものであつたが、 ニン二クの配 合比が高くなるにしたがって、 活性の増加が認められた。 特に、 ニンニクを 2倍 の濃度にした培地 （ 8 : 0) で最も強い活性が認められた （図 7) 。
実施例 3 ニンニク発酵組成物の抗腫瘍効果及び免疫増強作用
(ニンニク発酵組成物の調製法）
ニンニクを水洗した後、 等量の水を加え、 3 0分間煮沸した後、 破砕し、 破砕 汁を得た。 破砕汁に、 等量の水及びグルコース 2 %を添加し、 オートクレープで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌した （ニンニク培地） 。 別に、 麴菌 （Aspergillus oryzae) を、 サブ口一培地 （ペプトン 1 %、 グルコース 4 %) で 2 7 °C、 1 6 0 rpm 振盪の条件下で 3 日間前培養し、 ニンニク培地にこの培養液を 1 %添加し 2 7で、 1 6 Orpm 振盪の条件下で 2週間培養した。 得られた発酵物は、 1 0 0 °C 1 0分間加熱した後、 凍結乾燥し、 粉砕した。 各種試験に際しては、 ニンニク 発酵組成物を水に懸濁して経口投与した。 (実験方法）
I CR系雄性マウス （7週合：日本クレア） に、 sarcoma- 180 106 cell/mouse を皮下移植し、 翌日より被験物質を隔日で 1 0回経口投与し、 最終投与の翌日に、 腫瘍の大きさ （3Z4 X短径 X短径 X長径匪3) を測定した。 その後、 無菌的に 脾臓を摘出し、 常法に従って細胞浮遊液を調製し、 赤血球除去用トリス緩衝液 ( 1 7 mMト リスヒ ド αキシメチルァミ ノ メタン 0. 7 4 7 %、 NH4C £ , H 7. 6 5) で処理後、 尺？1^ 1 1 6 4 0で洗浄し、 1 0 % F C Sを含む R P M I
1 6 4 0に懸濁した。
YAC - 1細胞、 Salcoma 1 8 0細胞の標識
1 0 %F C Sを含む R PM I 1 6 4 0で 2 X 1 06 cell/0. に調製し た YAC— 1細胞又は、 salcom— 1 8 0細胞に、 Na2 5'Cr04 1 0 0 (アマシ ャ厶、 1 Ci/ x ^ in sterileO . 9 %NaC_g ) を加え、 C02インキュべ一夕で 2 時間培養した。 その後、 1 0 %FCSを含む RPM I 1 6 4 0で 4回洗浄し、 3 X 1 0 eel 1/ に調製した。
NK活性、 キラー活性
脾臓細胞を 3 X 1 07 cell/^ (YAC - 1紬胞、 Salcoma 一 1 8 0細胞の
2 0 0倍） に調製し、 NUNC 9 6ゥエル U底 multi dishに 1 0 0〃 ^ ( 3 x 1 06 cell) を入れ、 3 X 1 05 cell/ に調製した 5 ]Cr標識 Y A C - 1細胞又 は、 Salcoma— 1 8 0細胞 5 0〃 ^ ( 1. 5 x 1 04 cell) を加えた （Exp) 。 こ れ以外に、 最大遊離用として、 5'Cr標識 YAC— 1細胞又は、 Salcoma - 1 8 0 細胞 5 0 〃 ^ ( 1 . 5 X 1 04 cell) に 1 N HC^ I 0 0 u £を加えたもの
(Traax) 、 自然遊離用として、 5'^標識丫八( ー 1細胞又は、 Salcoma— 1 8 0 細胞 5 0〃 ( 1. 5 X 1 04 cell) に 1 0 %FCSを含む RPM I 1 6 4 0
1 0 0〃 ^を加えたもの （Tspon) を用意した。 この multi dishを C02 ィンキ ュベータ—で 24時間培養後、 遠心分離した上清 1 0 0 ^を R I Aチューブに とり、 ガンマ一カウンターで遊離した51 Crを測定した。 次の式より、 細胞毒性 (%) を算出し NK活性、 キラー活性とした。
細胞毒性 （％) = ((Exp-Tspon)/(Tmax-Tspon)) xlOO
統計処理
F検定の後、 Student's- T test もしくは、 Aspin- Welch法で検定し危険率 5 %未満を有意とし *印で示した。 結果を以下に示す。
(結果）
( 1 ) 抗腫瘍効果
ガン細胞移植 3週間後の腫瘍体積は、 コントロール群の 3 9 3 mm3 に対し、 A 一 1、 A— 6投与群では統計的に有意な増殖抑制作用が認められた。 クレスチン でも同様に有意な作用が認められた。
表 2
Figure imgf000014_0001
( 2) NK活性
ガン細胞移植 3週間後の脾臓細胞を用いて、 NK活性を測定した。 NK活性は、 コントロール群の 4. 6 %に対し、 A— し A— 6投与群では、 1 7. 8 %、 1 4. 1 %となり統計的に有意な、 NK活性の増強作用が認められた。 ク レスチ ン投与群でも同様に有意な増強作用が認められた。 表 3
Figure imgf000015_0001
( 3 ) キラー活性
ガン細胞移植 3週間後の脾臓細胞を用いて、 キラ一活性を測定した。 キラ一活 性は、 N K活性と同様に、 A— l、 A - 6投与群では、 顕著かつ、 統計的に有意 な、 活性の増強作用が認められた。
表 4
Figure imgf000015_0002
実施例 4 ァセトァミノフエン肝障害防護効果
(実験方法）
実施例 3と同じニンニク発酵組成物を用いて検討した。 6週令の d d Y系雄性 マウス （日本 S L C) を一夜絶食した。 ァセ トァ ミ ノ フヱン投与の 2時間前と
3 0分前の 2回被験物質を経口投与し、 ァセトァミノフェン （4 0 0 mg/kg) を 腹腔内投与した。 6時間後に、 腹部大静脈より、 へパリ ン処理したシリ ンジを用 いて採血し、 血漿 GPT活性を測定し、 肝障害の指標とした。 ァセトァミ ノフエ ン （和光純薬） は、 リ ン酸三力リウム水溶液 （ 1 0 Omg/ ) で pHl 1に調製し た生理食塩水に沸騰水浴中で溶解した。 血漿中 GPT活性は、 GPT— UVテス トヮコ一 （和光純薬） を用いて測定した。 結果を以下に示す。
(結果）
ァセトアミ ノフ ンの投与により、 コントロール群の血漿中 G PT活性は、
4 6 8 1 U/^に増加し激しい肝障害が惹起された。 一方、 Α— 1、 A- 6投与 群の GPT活性は、 1 4 6、 6 8 I UZ_iの増加に留まり、 顕著な肝障害防護作 用が認められた。
表 5
Figure imgf000016_0001
(*:p<0.01 by Kruskal-Wallis test) 実施例 5 抗糖尿病作用
(実験方法）
実施例 3と同じニンニク発酵組成物を用いて検討した。 6週令の d d Y系雄性 マウス （日本 SLC) を一夜絶食した。 キヤビラリを用いて眼窩静脈叢より 2 0 £採血した。 被験物質 4 gZkgを経口投与し、 1時間後にァロキサン （和光純 薬） 5 O mgZkgを静脈内投与し、 1時間後及び 6時間後に同様に採血した。 絶食 は、 ァロキサン投与直後に解除し、 被験物質は、 ァロキサン投与の前日から、 3 日後まで 1 日 1回経口投与し、 採血は、 1、 2、 4日後に同様に行った。 採血後、 直ちにへマトクリ ッ ト用遠心機で血漿を分離し、 グルコース C I I—テスト ヮコ 一 （和光純薬） を用いて血糖値を測定した。
統計処理は実施例 3と同様に行った。 結果を図 8に示す。
表 6
Figure imgf000017_0001
(結果）
ノーマルで示した、 正常状態のマウスの血糖値は 2 0 O mg/dl程度であるが、 ァロキサンの投与により、 コン トロール群の血糖値は、 1時間後で 5 4 0 mg/ に激増し、 その後も増加を続け、 4 8時間後では、 6 5 O mgZ に達した。 一 方、 ニンニク発酵組成物 A— 6投与群では、 ァロキサン投与 1時間後の血糖値は、 3 8 O mgZdiに留まり、 コントロール群との間に、 統計的に有意な血糖上昇の抑 制作用が認められた。 その後も、 有意な低値が観察された。 A - 1 も同様に有意 な血糖上昇の抑制作用が認められた。 しかし、 発酵の原料として用いた、 ボイル ニンニク （ニンニク培地： B G ) では、 ァロキサン投与による血糖の上昇の抑制 作用は認められなかった （図 8 ) 。
実施例 6 血糖上昇抑制作用 (実験方法）
実施例 3と同じニンニク発酵組成物を用いて検討した。 8週令の d d Y系雄性 マウス （日本 S L C ) を一夜絶食した後、 キヤビラリを用いて眼窩静脈叢より 2 0 / ^採血し、 以後実験終了時まで絶水とした。 被験物質及びスターチを同時 に経口投与し、 3 0、 6 0、 1 2 0分後に同様に採血した。 採血後、 直ちにへマ トクリ ッ ト用遠心機で血漿を分離し、 グルコース C I I一テスト ヮコ一 （和光純 薬） を用いて血糖値を測定した。 統計処理は実施例 3と同様に行った。 結果を図 9に示す。
Figure imgf000018_0001
(結果）
スターチを経口投与したコントロール群の血糖値は、 3 0分後で 1 5 0 mg/d 上昇したが、 A— 1投与群では、 1 0 O mg/ciの上昇に留まり、 コントロール群 に対し有意な血糖上昇の抑制作用が認められた。 その後の血糖値は、 有意差は無 いがコントロール群よりやや高値を推移し、 血糖上昇の遅延が観察された。 A— 6投与群でも、 A— 1 とほぼ同様の結果が得られた。 一方、 ボイルニンニク （二 ンニク培地： B G ) 投与群は、 コントロールと同様の血糖推移を示し、 ニンニク 発酵組成物とは明らかに異なる結果が得られた （図 9 ) 。
実施例 7 紅麴菌を用いたニンニク発酵エキスのコレステロール合成阻害活性 実施例 2と同じニンニク発酵エキスを用いて検討した。
(酵素標本の調製法）
Wis tar系雄性ラッ ト （ 6. 5週令） を明時 1 7 ： 0 0〜 5 ： 0 0の逆転照明下 で、 粉末の E C— 2 (日本クレア製） で 6日間の馴致飼育の後、 2 %コレスチラ ミ ン 8 %コーン油を配合した CE— 2で 5日間飼育した。 深夜に相当する、 1 0 ： 0 0にラッ トを脱血致死後肝臓を摘出し、 氷冷下で 2倍量のリン酸バッファー を加えて、 テフロンホモジナイザーで、 ホモジネートを作成した。 以下、 次の様 にミ クロゾーム画分を調製しタンパク量 1 OnigZ に調製後、 一 8 0°Cで保存し た。
ラッ ト肝ホモジネート
遠心分離 （700g、 5分）
遠心上清
遠心分離 (12, 000 g, 30分)
遠心上清
遠心分離 （105, 000g、 60分)
沈渣 （洗浄）
遠心分離 （105, 000g、 60分)
沈渣 （ミ クロゾーム画分）
リ ン酸バッファーに懸濁 （タンパク量 lOmg/ )
(HMG-CoA リダクタ一ゼ阻害活性の測定法）
酵素反応液 5 0 中、 次の試薬を含むように調製し、 3 7°C、 3 0分反応さ せた。 反応の開始は酵素液の添加、 反応の停止は 2N塩酸 2 0 の添加により 行い、 塩酸添加後、 更に 3 7°C、 1 5分間インキュベートした。 次に、 陽イオン 交換樹脂 （Bio Rex 5 ： Bio Rad 社製） の懸濁液 （ 1 gZ 1 4 5 0〃 ^を 加え、 1 時間振盪後、 上清 4 0 0 を液体シンチレ一夕一 （ACS I ： Amersham社製） 1 0 に加え C o Aより乖離した14 Cをカウントした。 被験物質 （実施例 2に記載の方法により得た発酵エキス） は、 反応液 5 0 £ 中に 1 0 / _^添加とし、 無添加時の酵素反応に対し、 5 0 %阻害を挟む 3点以上 のデータから Litchfild- Wilcoxon法により I C5。値を算出した。
酵素反応液の組成
0. 1 1 mM d£ [3 -] C] HMG-C oA (2.25Ci/mo )
1 0 OmM リ ン酸カ リウムバッファー （pH 7. 4)
1 OmM E DTA
1 OmM ジチオスレィ トール
5mM NAD PH
3 0〜4 0〃 g ミ クロゾ一厶蛋白 （反応液 5 0 / 中）
(結果）
図 1 0に各培養液の HMG - C 0 Aリダクターゼ阻害活性 （ I C 5。の逆数で表 示） を示した。 紅麴菌 （A - 24株） を大豆培地、 ニンニク ：大豆 （ 1 ： 1 ) の 混合培地、 ニンニク培地を用いて 1 3〜3 4日間培養した。 大豆培地では検討期 間中殆ど阻害活性は認められなかったが、 ニンニク ：大豆の混合培地では I C50 値 0. 0 3〜0. 0 の阻害活性が認められた。 更にニンニク培地では培 養期間に依存した強い阻害活性 （ I C5。値 0. 0 2〜0. 0 0 Ί τηβ/m が認め られた （図 1 0 ) 。
この結果から、 酵素失活処理ニンニクは、 紅麴菌において腿 G- CoA reductase 阻害活性物質を効率よく産生することが確認された。
実施例 8 製剤例 Z錠剤
実施例 3で調製したニンニク発酵組成物に乳糖、 コーンスターチ、 結晶セル口 —ス、 カルメロ一スカルシゥ厶及びステアリ ン酸マグネシウムを下記の処方量で 加え、 ボーレコンテナミキサー （コ トプキ技研工業製） で 1 0分間混合した。 こ の混合末を打錠機 （コレク ト 1 9 K、 菊水製作所製） で圧縮成形し、 径 8國、 重 量 1 8 Omgの錠剤を製した。 本錠剤は硬度及び胃内崩壊性に優れていた。 表 8
錠剤処方
Figure imgf000021_0001
実施例 9 製剤例/顆粒剤
実施例 3で調製したニンニク発酵組成物にコーンスターチ、 結晶セルロース、 ヒ ドロキシプロピルセルロース及びカルメロースカルシウムを下記の処方量で加 え混合した後、 水を加えて練合した。 この練合物を押し出し造粒機 （DOME GRAN. 不二バウダル製） で怪 0 . 8画の柱状造粒物とし、 整粒、 乾燥、 篩過した後、 顆 粒剤を製した。 本顆粒は胃内崩壊性に優れ、 分包等の包装形態で提供することが できる。
表 9
顆粒剤処方
Figure imgf000022_0001
実施例 1 0 製剤例 zドリンク剤
実施例 2で得られたニンニク発酵組成物に下記の処方で甘味剤、 酸味剤、 香料、 水を加えて滅菌した後、 ガラス瓶に充塡してドリンク剤を製した。
表 1 0
ドリンク剤処方
Figure imgf000022_0002
産業上の利用可能性
本発明の組成物は臭気がなく、 糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患、 高脂血症等の 予防 ·治療剤として有用である,

Claims

請 求 の 範 囲 . 酵素失活処理したニンニクを麴菌及び/又は紅麴菌で発酵させた組成物。. 酵素失活処理したニンニクに豆類及び/又は穀類を添加し、 麴菌及び Z又は 紅麴菌で発酵させた組成物。 . 請求項 1又は 2記載の組成物を含む食品。. 請求項 1又は 2記載の組成物を含む医薬。. 糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患及び高脂血症から選ばれる疾患の予防 ·治療 剤である請求項 4記載の医薬。 . 請求項 1又は 2記載の組成物及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組 成物。. 請求項 1又は 2記載の組成物の医薬としての使用。. 医薬が、 糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患及び高脂血症から選ばれる疾患の予 防 ·治療剤である請求項 7記載の使用。. 請求項 1又は 2記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患及び高脂血症から選ばれる疾患の処置方法。 0 . 酵素失活処理したニンニクを麴菌及び Z又は紅麴菌で発酵させることを特 徴とするニンニク発酵組成物の製造法。
1 . 酵素失活処理したニンニクに豆類及び/又は穀類を添加し、 麴菌及び/又 は紅麴菌で発酵させることを特徴とするニンニク発酵組成物の製造法。
補正書の請求の範囲
[ 1 9 9 8年 4月 1 5日 （1 5 . 0 4 . 9 8 ) 国際事務局受理：出願当初の請求の範囲 1， 2 , 1 0及び 1 1は補正された；新しい請求の範囲 1 2— 1 4が加えられた；他の請求の範 囲は変更なし。 （2頁） ]
1 . (補正後） 酵素失活処理したニン二クを紅麴菌で発酵させた組成物。
2 . (補正後） 酵素失活処理したニンニクに豆類及び /又は穀類を添加し、 紅麴 菌で発酵させた組成物。
3 . 請求項 1又は 2記載の組成物を含む食品。
4 . 請求項 1又は 2記載の組成物を含む医薬。
5 . 糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患及び高脂血症から選ばれる疾患の予防 ·治療 剤である請求項 4記載の医薬。
6 . 請求項 1又は 2記載の組成物及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組 成物。
7 . 請求項 1又は 2記載の組成物の医薬としての使用。
8 . 医薬が、 糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患及び高脂血症から選ばれる疾患の予 防 ·治療剤である請求項 7記載の使用。
9 . 請求項 1又は 2記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患及び高脂血症から選ばれる疾患の処置方法。
1 0 . (補正後） 酵素失活処理したニン二クを紅麴菌で発酵させることを特徴と するニンニク発酵組成物の製造法。
1 1 . (補正後） 酵素失活処理したニンニクに豆類及び/又は穀類を添加し、 紅 麴菌で発酵させることを特徴とするニンニク発酵組成物の製造法。
1 2 . (追加） 酵素失活処理したニンニクを翹菌で発酵させた組成物、 あるいは 酵素失活処理したニンニクに豆類及び/又は穀類を添加し、 麴菌で発酵させた 組成物を有効成分とする糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患及び高脂血症から選ば れる疾患の予防 ·治療剤。
1 3 . (追加） 酵素失活処理したニンニクを麴菌で発酵させた組成物、 あるいは 酵素失活処理したニンニクに豆類及び Z又は穀類を添加し、 麴菌で発酵させた
23
修改页 (糸约第 19糸） 組成物の、 糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患及び高脂血症から選ばれる疾患の予 防 ·治療剤の製造のための使用。
4 . (追加） 酵素失活処理したニンニクを麴菌で発酵させた組成物、 あるいは 酵素失活処理したニンニクに豆類及び Z又は穀類を添加し、 麴菌で発酵させた 組成物の有効量を投与することを特徴とする糖尿病、 肝臓病、 癌、 免疫疾患及 び高脂血症から選ばれる疾患の処置方法。
23 / 1 補正された用紙 (条約第 19条)
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