WO1998021196A1 - Antibiotique tkr2648 et son procede de production - Google Patents

Antibiotique tkr2648 et son procede de production Download PDF

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WO1998021196A1
WO1998021196A1 PCT/JP1997/003998 JP9703998W WO9821196A1 WO 1998021196 A1 WO1998021196 A1 WO 1998021196A1 JP 9703998 W JP9703998 W JP 9703998W WO 9821196 A1 WO9821196 A1 WO 9821196A1
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WO
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tkr
antibiotic
strain
tkr2648
culture
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PCT/JP1997/003998
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Kazutoh Takesako
Hideharu Saito
Mitsuhiro Ueno
Naoyuki Awazu
Ikunoshin Kato
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Takara Shuzo Co., Ltd.
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/32—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Definitions

  • the present invention relates to an antibiotic TKR2664 useful as a therapeutic agent for fungal infections, a method for producing the same, and a microorganism producing the same.
  • Fungi are known to infect humans, animals, plants and the like and cause various diseases. For example, it causes superficial mycosis in the skin and oral cavity of humans, systemic mycosis in the internal organs, brain, etc., and similar infections in animals such as pets and livestock. In addition, it causes various diseases on plants such as fruit trees and vegetables.
  • Candida the main fungi that cause systemic mycosis by infecting humans
  • Cryptococcus Aspergillus and others
  • superficial fungi are known. It is thought that the main causes of this disease are force glands that infect the skin, oral cavity, vagina, etc., and ringworm that infects the skin of the limbs.
  • Various other fungi exist in the living environment and are thought to cause animal and plant contamination.
  • the therapeutic agent for systemic infections of animals, especially humans includes amphotericin B, flucytosine, miconazole, fluconazole and the like.
  • amphotericin B flucytosine
  • miconazole fluconazole
  • fluconazole and the like.
  • these compounds had problems in efficacy, toxicity, antibacterial spectrum, etc., and were not sufficient as therapeutic agents.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned state of the art, and an object of the present invention is to provide a novel antibiotic useful as a therapeutic agent for fungal infections.
  • the present inventors aimed at searching for a novel antibiotic useful as a therapeutic agent for such fungal infections, by isolating a large number of microorganisms from nature, isolating the antibiotic produced thereby, When its biological properties are examined, it shows antimicrobial activity against pathogenic fungi such as Candida albicans, Tarcipococcus neoformans and Aspergillus fumigatus in cultures of microorganisms belonging to the genus Penicillium We found that antibiotics were present. Subsequently, the present inventors isolated the antibiotic and examined its physicochemical properties.As a result, it was confirmed that the antibiotic was a novel substance having unique physicochemical properties and not described in the literature. It was named.
  • the first invention of the present invention relates to an antibiotic TKR 2648 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, having the following chemical formula [I].
  • a second invention of the present invention is a strain belonging to the genus Penicillium, wherein a strain producing the antibiotic TKR 2648 is cultured, and thereafter, a target substance is isolated from a culture of the strain. And a method for producing the antibiotic TKR 2648.
  • the third invention of the present invention relates to a microorganism belonging to the genus Penicillium and producing the antibiotic TKR2648.
  • FIG. 1 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of the antibiotic TKR 2648.
  • FIG. 2 is a diagram showing an infrared absorption spectrum of the antibiotic TKR 2648.
  • FIG. 3 is a diagram showing the 1 H—NMR spectrum of the antibiotic TKR 2648.
  • FIG. 4 is a diagram showing a 13 C-NMR spectrum of the antibiotic TKR 2648.
  • FIG. 5 is a diagram showing elution positions of the antibiotic TKR 2648 in HP LC.
  • the antibiotic TKR 2648 is a novel compound having the chemical formula [I], but has the following physicochemical properties (1), (2), (3), (4), (5) and (6). You.
  • Infrared absorption spectrum (KBr method): The main absorption wavelengths (cm- 1 ) are 2960, 1730, 1630, 1390, 1210, and 1010 as shown in Fig. 2. 930.
  • TKR 2648 Solubility: Soluble in black-mouthed form and methanol. Hexane, poorly soluble in water.
  • the above TKR 2648 also has an 'H-NMR spectrum shown in FIG. 3 and a 13 C-NMR spectrum shown in FIG. 4, and is shown in FIG. 5 in reversed-phase partition high performance liquid chromatography. It has the property of being eluted at a location.
  • the horizontal axis represents the wavelength (nm).
  • the horizontal axis represents the wave number (cnf 1 ).
  • the horizontal axis indicates the chemical shift value (ppm).
  • the vertical axis indicates relative ultraviolet absorption intensity, and the horizontal axis indicates retention time (minutes).
  • the TKR2648 belongs to the genus Penicillium, and can be produced by culturing a strain that produces the TKR2648 and then isolating it from a culture of the strain.
  • the above strain used in the present invention is not particularly limited as long as it is a strain that produces the above TKR 2648.
  • Examples of the strain used for producing this substance include Penicillium sp. TKR 2648 (hereinafter simply referred to as TKR 2648).
  • the above-mentioned TKR 2648 strain is a new strain not described in the literature, which was first isolated and identified by the present inventors, and has the property of advantageously producing TKR 2648. Things.
  • the mycological properties of the TKR 2648 strain will be described in detail.
  • the TKR 2648 strain has the color tone of colonies (hereinafter also referred to as “populations”) in various media as shown in Table 1.
  • the color tone in Table 1 is based on the color name according to Japanese Industrial Standard JISZ 8102 (1985). It is.
  • the diameter of the settlement The color of the settlement The color of the back of the settlement The state of the settlement, mm)
  • TKR 2648 strain grows well on a malt extract agar medium, potato dextrose agar medium, quapec agar medium, etc., and the surface of the colony is velvety and the center is slightly raised.
  • Conidia ⁇ of TKR 2648 strain has a smooth surface of 90 to 270 X 1.8 to 3. ⁇ , and forms almost double-ring biosymmetric penicillin.
  • the meteorology is 12.0 ⁇ : 14.0 x 2.8 ⁇ 3.2 ⁇ m and 2 ⁇ 4 trees are clustered, and the phialide is 9.0 ⁇ 10.0 x 1.8 ⁇ 2 ⁇ 2 At 4 im, it becomes a ring shape.
  • Conidia are spherical to subspherical on the smooth surface and their size is 2.2-3.2 X 2.4-4.0 / m.
  • the physiological properties are as shown below.
  • the growing temperature range is from 10 to 25 ° C, and the optimum growing temperature is around 20 ° C.
  • the pH range where growth is possible is pH3 to pH9, and the optimum pH for growth is around pH5.
  • TKR 2648 strain is identified as belonging to the genus Penicillium by searching for strains of the genus Penicillium described in the literature such as the Press (Elsevier Biomedical Press) (1982). be able to.
  • TKR 2648 strain in addition to the above-mentioned TKR 2648 strain, Microorganisms that are capable of producing TKR2648, such as artificial or artificial mutant strains and other strains belonging to the genus Penicillium, can be used.
  • TKR2648 is produced by inoculating a strain producing TKR2648 into a nutrient-containing medium and culturing it.
  • the carbon source include glucose, fructose, saccharose, starch, dextrin, glycerin, molasses, syrup, oils and fats, and organic acids.
  • nitrogen sources include, for example, organic nitrogen compounds such as soybean flour, cottonseed flour, corn chip liquor, casein, peptone, yeast extract, meat extract, germ, urea, amino acids, ammonium salts, and inorganic nitrogen. And the like.
  • examples of the salt include inorganic salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, and phosphate. Each of these may be used alone or in combination as appropriate.
  • the nutrient-containing medium may further contain, if necessary, heavy metals such as iron salts, copper salts, zinc salts, and cobalt salts; vitamins such as piotin and vitamin B; Organic substances, inorganic substances, and the like that promote the production of 648 can be added as appropriate.
  • heavy metals such as iron salts, copper salts, zinc salts, and cobalt salts
  • vitamins such as piotin and vitamin B
  • Organic substances, inorganic substances, and the like that promote the production of 648 can be added as appropriate.
  • an antifoaming agent such as silicone oil or polyalkylene glycol ether, a surfactant, or the like can be added to the nutrient source-containing medium, if necessary.
  • a method generally used for producing an antibiotic by culturing a microorganism can be adopted.
  • the liquid culture method, especially the shaking or deep aeration stirring culture method, can be suitably used.
  • the above culture is preferably carried out at 15 to 25 ° C, and the pH of the medium is usually pH 3 to 8, but is preferably around pH 5. A sufficient production amount can be obtained usually in a culture period of 3 to 8 days.
  • TKR2648 is contained in the culture solution and the cells and cultured. Accumulates in nutrients.
  • the TKR 2648 accumulated in the culture is separated from the culture by utilizing the physicochemical properties of these antifungal substances, and further purified and obtained as necessary. can do.
  • the above separation can be performed by extracting the whole culture with a non-hydrophilic organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, chloroform, butanol, and methyl isobutyl ketone. Further, after the culture is separated into a culture solution and cells by filtration or centrifugation, the culture can be separated from each of the culture solution and cells.
  • a non-hydrophilic organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, chloroform, butanol, and methyl isobutyl ketone.
  • the extraction method using the above-mentioned non-hydrophilic organic solvent can also be adopted.
  • the culture solution is brought into contact with an adsorptive carrier, and the TKR in the culture solution is extracted.
  • a method of eluting with a solvent can also be adopted.
  • the carrier include activated carbon, powdered cellulose, and adsorbent resin.
  • the solvent may be appropriately selected depending on the type and properties of the carrier.
  • One or a combination of two or more of them can be used, and examples thereof include those obtained by appropriately combining aqueous solutions of water-soluble organic solvents such as aqueous acetone and aqueous alcohols.
  • a method of extracting with a hydrophilic organic solvent such as acetone can be adopted.
  • the crude extract of TKR2648 thus separated from the culture can be subjected to a step of further purification, if necessary.
  • the above-mentioned purification can be performed by a method usually used for separation and purification of fat-soluble antibiotics.
  • a method usually used for separation and purification of fat-soluble antibiotics include a column using a carrier such as silica gel, activated alumina, activated carbon, and adsorbent resin.
  • Examples include a chromatography method and a high-performance liquid chromatography method.
  • examples of the eluting solvent include chromatoform, ethyl acetate, methanol, acetone, water, and the like. Can be used together.
  • examples of the carrier include chemically bonded silica gel having octadecyl, octyl, and phenyl groups bonded thereto; polystyrene-based porous polymer gel, and the like.
  • a phase For example, an aqueous solution of a water-soluble organic solvent such as aqueous methanol and aqueous acetonitrile can be used.
  • TKR2664 of the present invention can be used in medicine as it is or as a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the salt is not particularly limited as long as it is pharmacologically acceptable.
  • salts of mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, and hydrobromic acid
  • Salts of organic acids such as acetic acid, tartaric acid, lactic acid, cunic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, camphorsolenoic acid, etc .
  • Examples thereof include salts of alkali metals such as sodium, potassium, and calcium, and salts of alkaline earth metals.
  • the TKR 2648 of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is administered as a medicament
  • the TKR 2648 of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is:
  • a pharmaceutically acceptable non-toxic and inert carrier e.g.
  • the carrier examples include solid, semi-solid or liquid diluents, fillers, and other prescription auxiliaries. One or more of these can be used.
  • the pharmaceutical composition is preferably administered in the form of a dosage unit, and can be administered orally, into a tissue, topically (such as transdermally), or rectally. It goes without saying that the pharmaceutical composition is administered in a dosage form suitable for these administration methods.
  • the dose as an antifungal agent depends on the condition of the patient such as age, body weight, etc., administration route and disease. It is desirable to adjust in consideration of the nature and extent, but usually, for humans, the amount of the active ingredient of the present invention for adults is in the range of 10 to 200 mg per day per day. is there.
  • a dose below the above range may be sufficient, while a dose above the above range may be necessary.
  • it may be divided into several times a day desirable.
  • the above-mentioned oral administration can be carried out in solid, powder or liquid dosage units, for example, powders, powders, tablets, dragees, capsules, drops, sublinguals, other dosage forms, etc. .
  • Parenteral administration can be accomplished, for example, by using liquid dosage unit forms for subcutaneous, intramuscular, or intravenous injection, such as solutions and suspensions. These can be used to suspend a certain amount of the TKR 2648 of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in a non-toxic liquid carrier suitable for injection, such as an aqueous or oily vehicle. It is produced by turbidity or dissolution, and then sterilizing the suspension or solution.
  • a non-toxic liquid carrier suitable for injection such as an aqueous or oily vehicle. It is produced by turbidity or dissolution, and then sterilizing the suspension or solution.
  • the above-mentioned topical administration can be carried out, for example, by using an external preparation such as a liquid, cream, powder, paste, gel, ointment and the like.
  • an external preparation such as a liquid, cream, powder, paste, gel, ointment and the like.
  • These can be used to convert a certain amount of TKR 2648 of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof into fragrances, coloring agents, fillers, surfactants, humectants, It is produced by combining with one or more of emollients, gelling agents, carriers, preservatives, stabilizers and the like.
  • TKR 2648 of the present invention for rectal administration, a fixed amount of TKR 2648 of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is used, for example, higher esters such as myristyl palmitate, polyethylene glycol, cocoa butter, and mixtures thereof. And the like, using a suppository mixed in a low melting point solid such as.
  • the culture thus obtained was centrifuged and separated into a supernatant and bacterial cells.3 L of ethyl acetate was added to the obtained supernatant, mixed well, and an ethyl acetate extraction operation was performed. .
  • the extract was concentrated under reduced pressure to obtain 505 mg of a residue.
  • the residue was dissolved in 0.8 ml of methanol and subjected to high performance liquid chromatography to obtain an active fraction. This fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 84 mg of a crude purified product of TKR 2648.
  • the conditions for high performance liquid chromatography were as follows. Equipment: LC 6 A (manufactured by Shimadzu Corporation)
  • the purified white powder obtained by high-performance liquid chromatography and concentrating the obtained active fraction under reduced pressure was analyzed by FAB-MS using mass spectrometry to find m / z 2229 [M + H] + Turned out to be.
  • the purified white powder obtained by high-performance liquid chromatography and concentrating the obtained active fraction under reduced pressure was analyzed by high-resolution FAB-MS to obtain [M + H] + 229.1090 Gave.
  • 'H-NMR spectrum measurement and 13 C-NMR spectrum measurement of this substance were performed, and the results were examined.
  • the molecular formula of this substance was CH OS (calculated 1 0 7 6).
  • Fig. 3 shows the ' ⁇ -NMR spectrum and Fig. 4 shows the' 3 C-NMR spectrum.
  • the specific rotation measurement in methanol of the purified white powder obtained by subjecting the active fraction obtained by high-performance liquid chromatography to concentration under reduced pressure is as follows.
  • Fig. 1 shows the UV absorption spectrum.
  • Fig. 2 shows the infrared absorption spectrum.
  • the above TKR 2648 was subjected to analysis by reversed-phase partition high performance liquid chromatography (HP LC) using an LC-1 OA type high performance liquid chromatography apparatus (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • HP LC reversed-phase partition high performance liquid chromatography
  • LC-1 OA type high performance liquid chromatography apparatus manufactured by Shimadzu Corporation.
  • the conditions for high performance liquid chromatography were as follows. Column: CAPCE LL PAKC 18 (6mm X 15 Omm) (manufactured by Shiseido) Mobile phase: 40% (v / v) acetonitrile water containing 0.05% trifluoroacetic acid
  • TKR 2648 antibacterial spectrum against various microorganisms was examined.
  • concentration at which the growth of the bacteria was almost completely inhibited was determined as the minimum growth inhibitory concentration (/ gZml) by the liquid medium dilution method.
  • the results are shown in Table 2.
  • YNBG is 0.67% for distro nitrogen base (manufactured by Difco) and 1 for glucose.
  • BHI represents a medium containing 0.5% of Brain Heart Infusion Broth (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the antifungal substance TKR 2648 of the present invention has antibacterial activity against pathogenic fungi such as Candida albicans, Candida 'Kefirinole', Cryptococcus' Neohonoremans, Aspenoregirus fumigatus etc. Was found to have.
  • the cancer cells treated for an appropriate time were returned to the body of the animal, and changes in the properties of the cells were examined using the metastatic ability of the cancer cells as an indicator.
  • fetal calf serum was added to EL4 lymphoma cells or B16 melanoma. After culturing in RPMI 1640 medium, adding various concentrations of TKR 2648 and incubating overnight, the cytotoxicity was measured by the Alama-Blue method (Biosource International) and simultaneously. The cells incubated under the conditions were collected and injected into the tail vein of C57BL / 6 (female) mouse. In the case of EL4, the liver was dissected 10 days later, the liver was excised, and its weight was measured to determine the state of metastasis to the liver. In the case of B16, metastasis to the lung was dissected after 14 days, and the number of nodules was visually counted.
  • Table 3 shows the results. As is evident from the results, metastasis was suppressed at a concentration showing little cytotoxicity to EL4, and metastasis was also suppressed to B16 cells. That is, it was shown that TKR2648 has no effect on the proliferation ability of cancer cells, can suppress only metastatic ability, and is useful as a new anticancer agent.
  • the obtained TKR 2648 was administered intraperitoneally to ICR mice at 50 mg / kg, but no toxicity was observed.
  • the invention's effect was applied intraperitoneally to ICR mice at 50 mg / kg, but no toxicity was observed. The invention's effect
  • the present invention can provide an antibiotic TKR 2648 useful as a clinical drug such as a therapeutic agent for mycosis or an anticancer agent, and a method for producing the same.

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Description

明 細 書
抗生物質 T K R 2 6 4 8及びその製造方法 発明の属する技術分野
本発明は、 真菌感染症の治療剤として有用な抗生物質 T K R 2 6 4 8、 及びそ の製造方法、 並びにこれを産生する微生物に関する。
従来の技術
真菌は、 ヒ ト、 動物、 植物等に感染して種々の疾病を引き起こすことが知られ ている。 例えば、 ヒ トの皮膚、 口腔等に表在性真菌症を起こし、 内臓、 脳等に全 身性真菌症を起こし、 ペッ ト、 家畜等の動物に対しても同様の感染症を起こす。 更に、 果樹、 野菜等の植物に対しても種々の病害を起こす。
このうち、 ヒ トに感染して、 全身性真菌症を起こす原因真菌の主なものとして は、 カンジダ （Candida) , クリプトコッカス （Cryptococcus) 、 ァスペルギルス (Aspergi l lus)等が知られ、 表在性真菌症では、 皮膚、 口腔、 膣等に感染する力 ンジダ、 手足の皮膚に感染する白癬菌等が主なものと考えられている。 生活環境 中にはこれら以外にも多様な真菌が存在し、 動植物の汚染を引き起こす原因と考 えられている。
発明が解決しようとする課題
このような真菌による感染症、 汚染に対する治療、 防御の目的に使用可能であ る抗真菌剤は、 現在のところ、 非常に少数のものが知られているに過ぎない。 こ のうち、 特にヒ トを始めとする動物の全身性感染症に対する治療剤としては、 ァ ンホテリシン B、 フルシトシン、 ミコナゾール、 フルコナゾ一ル等を挙げること ができる。 しカゝし、 これらのものは、 効力、 毒性、 抗菌スペク トル等の点で問題 があり、 治療剤としては充分なものではなかった。
本発明は、 上述の従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、 その目的は真 菌感染症の治療剤として有用な新規抗生物質を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明者らはかかる真菌感染症の治療剤として有用な新規抗生物質の探索を目 的として、 多数の微生物を自然界より分離し、 その産生する抗生物質を単離し、 生物学的性質を調べたところ、 ぺニシリウム （Penicillium)属に属する微生物の 培養物中にカンジダ 'アルビカンス、 タリプトコッカス 'ネオホルマンス、 ァス ペルギルス · フミガタス等の病原性真菌に対して抗菌活性を示す抗生物質が存在 していることを見出した。 その後、 本発明者らは、 この抗生物質を単離し、 その 理化学的性質を調べた結果、 特有の理化学的性質を有する文献未記載の新規物質 であることを確認し、 この抗生物質を TKR 2648と命名した。
即ち、 本発明を概説すれば、 本発明の第 1の発明は、 下記化学式 [ I ] を有す ることを特徴とする抗生物質 TKR 2648又はその薬理学的に許容される塩に 関する。
Figure imgf000004_0001
また、 本発明の第 2の発明は、 ぺニシリウム （Penicillium)属に属する菌株で あって、 抗生物質 TKR 2648を産生する菌株を培養し、 その後、 前記菌株の 培養物から目的物を単離することを特徴とする抗生物質 TKR 2648の製造方 法に関する。
更に、 本発明の第 3の発明は、 ぺニシリウム （Penicillium)属に属し、 抗生物 質 TKR 2648を産生することを特徴とする微生物に関する。
図面の簡単な説明
図 1は、 抗生物質 TKR 2648の紫外線吸収スぺク トルを示す図である。 図 2は、 抗生物質 TKR 2648の赤外線吸収スぺク トルを示す図である。 図 3は、 抗生物質 TKR 2648の 1 H— NM Rスペク トルを示す図である。 図 4は、 抗生物質 TKR 2648の13 C— NMRスぺク トルを示す図である。 図 5は、 抗生物質 TKR 2648の HP LCでの溶出位置を示す図である。 発明の実施の形態
以下、 本発明を具体的に説明する。 上記抗生物質 TKR 2648は、 化学式 [ I ] を有する新規化合物であるが、 下記 （1) 、 （2) 、 （3) 、 （4) 、 （5) 及び （6) の理化学的性質を有す る。
( 1 ) 質量分析： FAB—MSm/z 229 〔M + H〕 +
(2) 分子式： C HH OS . 高分解能 FAB—MS : 229. 1 090 〔M + H〕 + (計算値 229. 1 076)
(3) 比旋光度： 〔α〕 。 2° + 1 26° (c 1. 0、 メタノール）
(4) 紫外線吸収スペク トル （メタノール中） ： 図 1に示す通り、 232である 。 その E lcm 1% は 5 1 0である。
(5) 赤外線吸収スペク トル （KB r法） ：主要な吸収波長 （cm—1) は図 2に示 す通り、 2960、 1 730、 1 630、 1 390、 1 2 1 0、 1 0 1 0、 93 0である。
(6) 溶解性： クロ口ホルム、 メタノールに可溶。 へキサン、 水に難溶である。 上記 TKR 2648は、 また、 図 3に示す 'H— NMRスぺク トル、 図 4に示 す13 C— NMRスぺク トルを有し、 逆相分配高速液体クロマトグラフィ一におい て図 5に示す位置に溶出される特性を有する。
なお、 図 1において横軸は波長 （nm) を示す。 図 2において横軸は波数 （cnf1 ) を示す。 図 3及び図 4において横軸は化学シフ ト値 （ppm)を示す。 図 5におい て縦軸は相対紫外吸収強度を示し、 横軸は保持時間 （分） を示す。
上記 TKR 2648は、 ぺニシリウム （Penicillium)属に属し、 上記 TKR2 648を産生する菌株を培養し、 その後、 上記菌株の培養物から単離することに より製造することができる。
本発明で使用される上記菌株としては、 上記 TKR 2648を産生する菌株で あれば特に限定されるものではない。 本物質の生産に用いられる菌株としては、 例えば、 ぺニシリゥム ·エスピー （Penicillium sp. ) TKR 2648株 （以下単 に TKR 2648株という） 等を挙げることができる。
上記 TKR 2648株は、 文献未記載の新菌株であって、 本発明者らによって 初めて分離同定されたものであり、 TKR 2648を有利に産生する特性を有す るものである。 以下、 上記 TKR 2648株の菌学的性質を詳細に説明する。 上記 TKR 2648株は、 各種培地におけるコロニー （以下 「集落」 ともいう ) の色調が、 表 1に示す通りである。 なお、 表 1中の色調は、 日本工業規格 J I S Z 8 1 02 ( 1 985年） による色名を基準とし、 培地に接種後、 25°Cで 培養し、 7日後に観察した結果によって示したものである。
集落の直径 集落の色調 集落裏面の色調 集落の状態 、mm)
1) 麦芽エキス 19 灰黄緑 草 色 ビロード状 寒天培地 7.5G Y5/2 10Y5/6
2) ポテトデキ 24 灰黄緑 レグホーン色 ビロード状 ス トロース 5 G Y5/2 5 Y8/4
寒天培地
3) ッァペック 20 灰 緑 明るい灰黄緑 綿 状
寒天培地 10G Y5/2 10Y8/2
4) サブロー 29 喑ぃ灰黄緑 明るい灰黄緑 ビロード状 寒天培地 7.5GY4/2 10Y8/2
5) Y p S s 25 灰黄緑 明るい灰黄 綿 状
寒天培地 5 G Y6/2 7.5Y8/2 上記 TKR 2648株は麦芽エキス寒天培地、 ポテトデキス トロース寒天培地 、 ッァペック寒天培地等で良好に生育し、 そのコロニーの表面はビロード状で、 中心部はやや隆起している。 TKR 2648株の分生子抦は 90〜270 X 1. 8〜3. Ο μπιの滑面で、 ほとんど複輪生体対称型のペニシリンを形成する。 メ トレは 1 2. 0〜： 14. 0 X 2. 8〜3. 2 μ mで 2〜 4本が群生し、 フィアラ イ ドは 9. 0〜1 0. 0 X 1 · 8〜2· 4 imで輪生状となる。 分生子は滑面の 球形から亜球形で、 そのサイズは 2. 2〜3. 2 X 2. 4〜4. 0 /mである。 上記 TKR 2648株の菌学的性質のうち生理学的性質は、 下記に示す通りで ある。
生育温度範囲：生育可能温度範囲が、 1 0〜25°Cであり、 生育最適温度が、 2 0°C付近である。
生育 P H範囲：生育可能 p H範囲が、 pH3〜pH9であり、 生育最適 pHが、 p H 5付近である。
上述の菌学的性質を有する菌種を、 カルロス · ラミレツ （Carlos Ramirez) 著 、 マユユアノレ ' アンド ' ア トラス 'ォブ ·ザ ·ぺニシリァ （Manual and atlas o f the Penicillia) 、 エノレセビア ·バイオメディ力ノレ ' プレス （Elsevier Biome dical Press) ( 1 982年） 等の文献に記載されたぺニシリゥム属の菌種につい て検索することにより、 上記 TKR 2648株は、 ぺニシリウム属に属する菌株 であると同定することができる。
しかしながら、 ぺニシリウム属に属する菌株であって、 TKR 2648の産生 能を有するものについては、 これまで報告がなされたことはない。 そこで本発明 者らはこれを新菌株とし、 ぺニシリウム 'エスピー TKR 2648株 （Penici Ilium sp. TKR2648)と命名し、 Penicillium sp. TKR2648 と表示し、 通商産業省 工業技術院生命工学工業技術研究所 [あて名 ； 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 番 3号 （郵便番号 305) ] に、 受託番号 FERM B P— 6093 (原寄託日 ；平成 8年 1 0月 8日、 国際寄託への移管請求日 ；平成 9年 9月 2日） として寄 託した。
本発明においては、 上記 TKR 2648株のほかに、 TKR 2648株の自然 的又は人工的変異株、 その他のぺニシリウム属に属する菌種等であって、 T K R 2 6 4 8の産生能を有する微生物を使用することができる。
本発明においては、 T K R 2 6 4 8は、 上記 T K R 2 6 4 8を産生する菌株を 、 栄養源含有培地に接種し、 培養することによって製造される。 上記栄養源のう ち、 炭素源としては、 例えばグルコース、 フルク トース、 サッカロース、 デンプ ン、 デキストリン、 グリセリン、 糖蜜、 水飴、 油脂類、 有機酸等を挙げることが できる。
上記栄養源のうち、 窒素源としては、 例えば大豆粉、 綿実粉、 コーンスチープ リカ一、 カゼイン、 ペプトン、 酵母エキス、 肉エキス、 胚芽、 尿素、 アミノ酸、 アンモニゥム塩等の有機窒素化合物、 無機窒素化合物等を挙げることができる。 上記栄養源のうち、 塩類としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩、 カルシゥ ム塩、 マグネシウム塩、 りん酸塩等の無機塩類を挙げることができる。 これらは それぞれ単独で使用されてもよく、 適宜組合せて使用されてもよい。
上記栄養源含有培地には、 更に必要に応じて、 鉄塩、 銅塩、 亜鉛塩、 コバルト 塩等の重金属； ピオチン、 ビタミン B , 等のビタミン類；その他、 菌の生育を助 け、 T K R 2 6 4 8の産生を促進する有機物、 無機物等を適宜添加することがで さる。
上記栄養源含有培地には、 上記栄養源のほかに、 更に必要に応じて、 シリコー ンオイル、 ポリアルキレングリコールエーテル等の消泡剤、 界面活性剤等を添加 することができる。
上記 T K R 2 6 4 8を産生する菌株を、 上記栄養源含有培地で培養するに際し ては、 抗生物質の産生を微生物の培養によって行う際に一般的に使用される方法 を採用することができるが、 液体培養法、 中でも振とう又は深部通気かくはん培 養法を好適に使用することができる。
上記培養は、 1 5〜 2 5 °Cで行うことが好ましく、 培地の p Hは、 通常 p H 3 〜 8であるが p H 5付近であることが好ましい。 培養期間は、 通常 3〜8日で充 分な産生量を得ることができる。
上述の培養方法によって、 T K R 2 6 4 8は、 培養液及び菌体に含有されて培 養物中に蓄積される。 本発明においては、 培養物中に蓄積された T K R 2 6 4 8 は、 これら抗真菌性物質の理化学的性質を利用して培養物中から分離した後、 必 要に応じて更に精製し、 取得することができる。
上記分離は、 培養物全体を、 酢酸ェチル、 酢酸プチル、 クロ口ホルム、 ブタノ ール、 メチルイソブチルケトン等の非親水性有機溶媒で抽出することにより行う ことができる。 また、 培養物をろ過又は遠心分離によって培養液と菌体とに分離 した後、 培養液、 菌体のそれぞれから分離することもできる。
上記培養液から T K R 2 6 4 8を分離するには、 上記非親水性有機溶媒で抽出 する方法を採用することもでき、 また、 培養液を吸着性の担体に接触させ、 培養 液中の T K R 2 6 4 8を担体に吸着させた後、 溶媒で溶出する方法を採用するこ ともできる。 上記担体としては、 例えば、 活性炭、 粉末セルロース、 吸着性樹脂 等を挙げることができる。 上記溶媒としては、 担体の種類、 性質等によって適宜
1種又は 2種以上を組合せて使用することができ、 例えば、 含水アセトン、 含水 アルコール類等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を適宜組合せたもの等を挙げるこ とができる。 上記菌体から T K R 2 6 4 8を分離するには、 アセトン等の親水性 有機溶媒で抽出する方法を採用することができる。
本発明においては、 このようにして培養物中から分離された T K R 2 6 4 8の 粗抽出物を、 必要に応じて、 更に精製する工程に付することができる。 上記精製 は、 脂溶性抗生物質の分離、 精製に通常使用される方法によって行うことができ 、 このような方法としては、 例えば、 シリカゲル、 活性アルミナ、 活性炭、 吸着 性榭脂等の担体を用いるカラムクロマトグラフィ一法、 高速液体クロマトグラフ ィ一法等を挙げることができる。 シリカゲルを担体として用いるカラムクロマト グラフィ一法を採用する場合は、 溶出溶媒としては、 例えば、 クロ口ホルム、 酢 酸ェチル、 メタノール、 アセ トン、 水等を挙げることができ、 これらは 2種以上 を併用することができる。
上記高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、 担体としては、 例えば 、 ォクタデシル基、 ォクチル基、 フエニル基等が結合した化学結合型シリカゲル ；ポリスチレン系ポ一ラスポリマーゲル等を挙げることができ、 移動相としては 、 例えば、 含水メタノール、 含水ァセトニトリル等の水溶性有機溶媒の含水溶液 等を使用することができる。
本発明の T K R 2 6 4 8は、 そのまま、 又は、 その薬理学的に許容される塩と して医薬に使用することができる。 上記塩としては薬理学的に許容されるもので あれば特に限定されず、 例えば、 塩酸、 硫酸、 硝酸、 りん酸、 ふつ化水素酸、 臭 化水素酸等の鉱酸の塩； ぎ酸、 酢酸、 酒石酸、 乳酸、 クェン酸、 フマル酸、 マレ イン酸、 こはく酸、 メタンスルホン酸、 エタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸 、 トルエンスルホン酸、 ナフタレンスルホン酸、 カンファースノレホン酸等の有機 酸の塩；ナトリウム、 カリウム、 カルシウム等のアルカリ金属又はアルカリ土類 金属等の塩等を挙げることができる。
本発明の T K R 2 6 4 8、 又は、 その薬理学的に許容される塩を医薬として投 与する場合、 本発明の T K R 2 6 4 8、 又は、 その薬理学的に許容される塩は、 そのまま、 又は、 医薬的に許容される無毒かつ不活性の担体中に、 例えば、 0 .
：!〜 9 9 . 5 °/0、 好ましくは 0 . 5〜9 0 %含有する医薬組成物として、 ヒ トを 含む動物に投与される。
上記担体としては、 例えば、 固形、 半固形若しくは液状の希釈剤、 充てん剤又 はその他の処方用の助剤等を挙げることができ、 これらは、 1種以上を用いるこ とができる。
上記医薬組成物は、 投与単位形態で投与することが好ましく、 経口投与、 組織 内投与、 局所投与 （経皮投与等） 又は経直腸的に投与することができる。 上記医 薬組成物は、 これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。 本発明の T K R 2 6 4 8、 又は、 その薬理学的に許容される塩を医薬として投 与する場合、 抗真菌剤としての用量は、 年齢、 体重等の患者の状態、 投与経路、 病気の性質と程度等を考慮した上で調整することが望ましいが、 通常は、 ヒ トに ついては、 成人に対して本発明の有効成分量として、 一日当り、 1 0〜 2 0 0 0 mgの範囲である。
上記範囲未満の用量で足りる場合もあるが、 逆に上記範囲を超える用量を必要 とする場合もある。 多量に投与するときは、 一日数回に分割して投与することが 望ましい。
上記経口投与は、 固形、 粉末又は液状の用量単位で行うことができ、 例えば、 末剤、 散剤、 錠剤、 糖衣剤、 カプセル剤、 ドロップ剤、 舌下剤、 その他の剤型等 により行うことができる。
上記非経口投与は、 例えば、 溶液や懸濁剤等の皮下、 筋肉内又は静脈内注射用 の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。 これらのものは、 本発明の TKR 2648、 又は、 その薬理学的に許容される塩の一定量を、 例え ば、 水性や油性の媒体等の注射の目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶 解し、 次いで該懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。
上記局所投与 （経皮投与等） は、 例えば、 液、 クリーム、 粉末、 ペース ト、 ゲ ル、 軟こう剤等の外用製剤の形態を用いることによって行うことができる。 これ らのものは、 本発明の TKR 2648、 又は、 その薬理学的に許容される塩の一 定量を、 外用製剤の目的に適合する香料、 着色料、 充てん剤、 界面活性剤、 保湿 剤、 皮膚軟化剤、 ゲル化剤、 担体、 保存剤、 安定剤等のうちの一種以上と組合せ ることにより製造される。
直腸投与は、 本発明の TKR 2648、 又は、 その薬理学的に許容される塩の 一定量を、 例えば、 パルミチン酸ミ リスチルエステル等の高級エステル類、 ポリ エチレングリコール、 カカオ脂、 これらの混合物等の低融点の固体に混入した座 剤等を用いて行うことができる。
実施例
以下、 実施例により本発明を更に具体的に示すが、 本発明は実施例に限定され ない。
実施例 1
TKR 2648株 （F ERM B P— 6093) の斜面培養から一白金耳を、 1 0 Omlの液体培地 〔ディフコポテトデキス トロースブロス 2. 4 % (wZv) 〕 を入れた 50 Oml容の三角フラスコに接種し、 25 °Cで 2日間振とうし、 種培 養液を得た。 この種培養液 1. Omlを上記液体培地 1 25 mlを入れた 50 Oml容 の三角フラスコ 20本に接種し、 25°C、 5日間振とう培養 （振とう 22 Orpm) を行った。 このようにして得た培養液を遠心分離し、 上澄液と菌体とに分離した 得られた上澄液に 3リットルの酢酸ェチルを加え、 充分混合して、 酢酸ェチル 抽出操作を行った。 この抽出液を減圧濃縮することにより、 残渣 505mgを得た これをメタノール 0. 8mlに溶解し、 高速液体クロマトグラフィーに付し、 活 性画分を得た。 この画分を減圧濃縮することにより、 TKR 2648の粗精製物 84mgを得た。 なお、 高速液体クロマトグラフィーの条件は下記に依った。 装置： L C 6 A (島津製作所社製）
カラム ： YMC pack C 1 8 (2. OcmX 25 cm) (ヮイエムシ一社製） 移動相 ： 25〜： L 00% (vZv) メタノール 水
これをメタノール 0. 8mlに溶解し、 メタノールで平衡化したセフアデックス
LH- 20 (フアルマシア社製） カラム （1 50tnl) に付し、 メタノールで溶出 することにより、 活性画分を得た。 この画分を減圧濃縮することにより、 残渣 4
3mgを得た。
これをメタノール 0. 4mlに溶解し、 再度、 高速液体クロマトグラフィーに付 し、 活性画分を得た。 この画分を減圧濃縮することにより、 TKR 2648の粗 精製物 3. 2mgを白色粉末として得た。 なお、 再度の高速液体クロマトグラフィ —の条件は下記に依った。
装置： L C 6 A (島津製作所社製）
カラム ： YMC pack C 1 8 (2. OcmX 25 cm) (ヮイエムシ一社製） 移動相： 36 % ( v/ V) ァセトニトリル/水
(理化学的性質）
質量分析には、 J MS— DX 302型質量分析装置 （日本電子社製） を用いた 。 1H— NMRスぺク トル （重ク口口ホルム中、 標準物質：テトラメチルシラン ) 、 及び13 C— NMRスぺク トル （重クロロホルム中、 標準物質：重クロロホル ム） の測定には、 J NM— A500核磁気共鳴装置 （日本電子社製） を用いた。 比旋光度測定 （メタノール中） には D I P 3 70型旋光度計 （日本分光社製） を 用いた。 紫外線吸収スペク トル分析 （メタノール中） には、 UV— 250型自記 分光光度計 （島津製作所社製） を用いた。 赤外線吸収スペク トル分析 （KB r法 ) には、 2 70— 30型赤外分光光度計 （日立製作所社製） を用いた。 以下に T KR 2648物質の理化学的性質を述べる。
(1) 質量分析
高速液体クロマトグラフィ一に付し、 得られた活性画分を減圧濃縮することに より得られた白色粉末精製物は、 質量分析による FAB— MS測定で、 m/z 22 9 〔M + H〕 + であることが判明した。
(2) 分子式
高速液体ク口マトグラフィ一に付し、 得られた活性画分を減圧濃縮することに より得られた白色粉末精製物は、 高分解能 F A B— MS測定において、 〔M + H 〕 + 229. 1 090を与えた。 更に、 本物質の 'H— NMRスぺク トル測定、 及び13 C— NMRスぺク トル測定を行い、 それらの結果を検討し、 本物質の分子 式が C H OS (計算値 2 2 9. 1 0 7 6 ) であることが判明した。
その 'Η— NMRスペク トルを図 3に、 '3C— NMRスペク トルを図 4に示す
(3) 比旋光度
高速液体クロマトグラフィ一に付し、 得られた活性画分を減圧濃縮することに より得られた白色粉末精製物の、 メタノール中における比旋光度測定結果は、 下 記の通りである。
比旋光度： 〔ひ〕 。 2° + 1 26° (c 1. 0、 メタノール）
(4) 紫外線吸収スぺク トル
高速液体クロマトグラフィ一に付し、 得られた活性画分を減圧濃縮することに より得られた白色粉末精製物の、 メタノール中における紫外線吸収スぺク トル測 定結果は、 下記の通りである。
U V (nm) (E lcm 1%) : 232 (5 1 0) 。
また、 その紫外線吸収スぺク トルを図 1に示す。
(5) 赤外線吸収スぺク トル 高速液体クロマトグラフィ一に付し、 得られた活性画分を減圧濃縮することに より得られた白色粉末精製物の、 KB r法による赤外線吸収スぺク トル測定結果 は、 下記の通りである。
I R (KB r ) (cm"1) : 2960、 1 730、 1 6 30、 1 390、 1 2 1 0 、 1 01 0、 930。
その赤外線吸収スぺク トルを図 2に示す。
(6) 溶解性
また、 本物質の各種溶媒に対する溶解性は、 クロ口ホルム、 メタノールに可溶 、 へキサン、 水には難溶であった。
上記分析結果により、 高速液体クロマトグラフィーに付し、 得られた活性画分 を減圧濃縮することにより得られた白色粉末精製物は、 TKR 2648であるこ とが判明した。
上記 TKR 2648を LC— 1 OA型高速液体クロマトグラフィー装置 （島津 製作所社製） を用いた逆相分配高速液体クロマトグラフィー （HP LC) による 分析に供した。 なお、 高速液体クロマトグラフィーの条件は下記に依った。 カラム ： CAPCE LL PAKC18 (6mmX 1 5 Omm) (資生堂社製） 移動相： 0. 05%トリフルォロ酢酸を含む 40% ( v/v) ァセトニトリルノ 水
カラム温度： 40°C
検出 UV波長： 22 Onm
その結果、 上記 TKR 2648は図 5に示す位置に溶出されることが明らかに なった。
(生物学的性質）
(1) 抗真菌活性
得られた TKR 2648を使用して各種微生物に対する抗菌スぺク トルを調べ た。 測定は、 液体培地希釈法により、 菌の増殖をほぼ完全に阻止した濃度を最小 生育阻害濃度 （/ gZml) として求めた。 結果を表 2に示した。 表中、 YNBG は、 ィ一ス トナイ トロジェンベース （ディフコ社製） 0. 6 7%、 グルコース 1 . 0 %を含有する培地を表す。 BH Iは、 ブレインハートインヒユージョンブイ ヨン （日本製薬社製） 0. 5%を含有する培地を表す。
表 2
Figure imgf000015_0001
表 2の結果から、 本発明の抗真菌性物質 TKR 2648は、 カンジダ ·アルビ カンス、 カンジダ ' ケフィ一ノレ、 クリプトコッカス 'ネオホノレマンス、 ァスぺノレ ギルス · フミガタス等の病原性真菌に対して抗菌活性を有することが判明した。
(2) 癌転移抑制活性
得られた TKR 2648の癌細胞に対して与える影響を調べるために、 適当な 時間処理した癌細胞を動物体内に戻し、 細胞の性質の変化を癌細胞の転移能を指 標に調べた。
すなわち、 E L 4リンパ腫細胞又は B 1 6メラノーマを 1 0%牛胎児血清添加 R PM I 1 640培地で培養し、 これに各種濃度の TKR 2648を添加し一夜 インキュベート後、 細胞障害性をアラマ一ブルー法 〔バイオソース インターナ ショナノレ （Biosource International)社〕 で測定すると共に、 同時に同条件でィ ンキュペートした細胞を回収し、 C 5 7 B L/6 (雌） マウスの尾静脈より注入 した。 E L4の場合、 1 0日後に解剖し肝臓を摘出、 その重量を測定することに より肝臓への転移状態を測定した。 B 1 6の場合、 1 4日後に解剖し肺への転移 結節数を肉眼的に計数した。 その結果を表 3に示した。 この結果から明らかなよ うに、 E L 4に対して細胞障害性をほとんど示さない濃度で転移能の抑制が見ら れると共に、 B 1 6細胞に対しても転移抑制効果を示した。 すなわち、 TKR2 648は癌細胞の増殖能には影響を与えず、 転移能だけを抑制することができ、 新たな制癌剤として有用であることが示された。
3
Figure imgf000017_0001
* ：有意な阻害 （危険率 < 0. 00 1)
(3) 毒性
得られた TKR 2648を、 I CR系マウスに 50 mg/kgを腹腔内投与したが 毒性は認められなかった。 発明の効果
以上詳述したように、 本発明により真菌症の治療剤や制癌剤等の臨床医薬とし て有用である抗生物質 TKR 2648並びにその製造方法を提供することができ る。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記化学式 [ I ] を有することを特徴とする抗生物質 TKR 2648又は その薬理学的に許容される塩。
Figure imgf000019_0001
2. ぺニシリウム （Penicillium)属に属する菌株であって、 抗生物質 TKR2 648を産生する菌株を培養し、 その後、 前記菌株の培養物から目的物を単離す ることを特徴とする抗生物質 TKR 2648の製造方法。
3. ぺニシリウム （Penicillium)属に属し、 抗生物質 T K R 2648を産生す ることを特徴とする微生物。
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