WO1997037034A1 - Ei-2128-1: substance physiologiquement active - Google Patents

Ei-2128-1: substance physiologiquement active Download PDF

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WO1997037034A1
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Takeo Tanaka
Fumito Koizumi
Tsutomu Agatsuma
Hidemasa Kondo
Yutaka Saitoh
Katsuhiko Ando
Yuzuru Matsuda
Original Assignee
Kyowa Hakko Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/12—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D493/20—Spiro-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin

Definitions

  • the present invention is produced by a microorganism belonging to the genus Penicillium, has an antibacterial effect and an inhibitory effect on interleukin-11 production, and has rheumatoid arthritis, gout, osteoarthritis, osteoporosis, periarteritis nodosa, ulcer Useful as a therapeutic agent for inflammatory bowel disease, chronic nephritis, active chronic hepatitis, sepsis, endotoxin shock, atherosclerosis, fever associated with infectious disease, or systemic sclerosis
  • the present invention relates to interleukin-1-1 production inhibitory substances.
  • Interleukin-1 (hereinafter referred to as IL-11) is a variety of cells in the body, including macrophages and monocytes, neutrophils, fibroblasts, skin keratinocytes, liver Kupffer cells, and glomerular mesangium
  • a protein with a molecular weight of 17.5 kDa produced from cells, brain astrocytes, glial cells, vascular endothelial cells, etc., has an isoelectric point (hereinafter referred to as pi) of ⁇ type 5 and PI type 7 is there. At present, it is known that ⁇ -type and type have the same effect.
  • IL-11 is known to have a wide variety of biological activities. In other words, IL-11 is said to act as a factor that enhances the responsiveness of lymphocytes to mitotic proliferation and also acts as a cofactor for cell proliferation and antibody production. Further, 1 1 ⁇ -1 acts on Arakidon acid cascade one de at temperatures central hypothalamic portion is believed to be involved in heat generation by increasing the prostaglandin E 2 synthesis. Furthermore, IL-1 has been shown to have significantly increased activity in the serum of patients with sepsis, Coulomb disease, etc., and in the joint cavity of patients with rheumatoid arthritis, and IL-1 has been shown to develop and progress these diseases. One involvement has been suggested. In order to alleviate the symptoms mediated by IL-11, suppression of IL-1 production may be effective.
  • naphthalene derivatives Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 4-59743
  • 3-arylisothiazole derivatives Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 4-7-1221
  • Synthetic compounds such as gingerol derivatives (JP-A-4-202127) are known.
  • aranorosin J. Antibiot., 41, 1780-1784 (1988)
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-1577386 Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-1577386
  • aranorosinol A aranorosinol A
  • aranorosinol B aranorosinol B
  • the present invention provides a compound of the formula (I)
  • UV absorption spectrum Shimadzu Corporation -2200 type UV photometer
  • Solubility easily soluble in methanol, acetonitrile
  • Test Example 1 Inhibitory effect on IL-1 production
  • the compound E1-2128-1 of the present invention was examined for its activity of inhibiting the production of IL-11 from human monocyte-derived cell line THP-1 (ATCC No. TIB 202).
  • the IL-11 amount was measured by the ELISA method.
  • THP-1 cells were suspended and suspended at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml in RPMI 1640 culture solution (manufactured by Nissi) containing 10% inactivated fetal bovine serum. This was dispensed in a volume of lml / Uweru in 24-well plates, Fuoruboru 12 millimeter start 1 3 Aseta one preparative (PMA; final concentration: 30 nM) was added to, 37 ° C, 5% C0 2 Inkyube one The cells were cultured in the evening for 65 hours to differentiate the cells into macrophages.
  • PMA final concentration: 30 nM
  • lipopolysaccharide (LPS; final concentration: 25 / g / ml) and test sample (final concentration: 0.05 5050 / ig / ml) was added to serum-free RPMI 1640 culture medium (1 ml / well) for 4 hours.
  • IL-1S released into the culture supernatant was measured using an IL-1 measurement kit (manufactured by Amersham).
  • the I L-1 production inhibition rate was calculated by the following formula, and IC 5 . (50% inhibitory concentration) was determined.
  • I L-1 production inhibition rate (%) (A-B) (A-C) x 100
  • Test example 2 Antibacterial activity against various bacteria
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • a medium consisting of 3 gZL of pactotripton (manufactured by Difco), 3 g / L of meat extract, 1 gZL of yeast extract, 1 g / L of glucose, and 16 gZL of agar (pH It was measured by the agar dilution method using 7.0). Table 1 shows the results. Table 1
  • EI-218--1 belongs to the genus Nissanium and cultivates microorganisms capable of producing EI-218-1-1 in a culture medium to produce E-1-2128--1 in the culture It is produced by accumulating and harvesting E 1-2 21 28-1 from the culture.
  • any strain that belongs to the genus Penicillium and has the ability to produce E I —2128-1 can be used.
  • these strains are mutated by artificial mutagenesis methods, for example, ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, treatment with a mutagenic agent, or naturally mutated strains, the ability to produce EI-2128-1 If it has, it can be used in the present invention.
  • a specifically preferred example is Penicillium sp. E-218 strain.
  • the diameter of the colonies reaches 40 to 46 mm on the 7th day of culture. It reaches about 60 mm on the 14th day of culture.
  • the colony is dark greenish blue with a grayish tinge, and its color is white to pale blue at the periphery, and its back surface is pale yellow-white, and its periphery and center are cream-colored.
  • Hyphae have partition walls, exhibit colorless to pale yellowish brown, and are smooth and well-branched.
  • the conidiophores stand up from the mycelium.
  • the conidiophores are smooth, colorless to pale yellow-brown, some reach up to about 160 ⁇ in length, and are 1.8-3.5 m wide.
  • Peninsulas are irregular in shape and size, but many are asymmetrical in multi-wheeled organisms. Metres are wedge-shaped and rectangular in shape.
  • the tip of the meter is 3-6
  • the phialid is in the shape of a stick or a flask, is 5.5 to 9.5 m in length, has a width of 2 to 3 im at the widest part, and a width of about 1.2 im at the tip.
  • the ontogenetic mode of conidia is endogenous budding, and conidia form from the tip of the phialid and become linked.
  • the oral conidia are unicellular, smooth, spherical to subglobular, 2.5 to 4.3 m in diameter, and colorless to light brown when aggregated to give an olive brown color. In this strain, only the anamorph described above is observed, and no teleomorph is observed.
  • a usual culturing method used for culturing filamentous fungi is applied.
  • Any natural or synthetic medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances, and the like that can be used by bacteria.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, sugar beet, starch, dextrin, mannose, maltose, molasses, etc., organic acids such as citric acid, malic acid, acetic acid, fumaric acid, methanol, Alcohols such as ethanol, hydrocarbons such as methane, ethane, propane, and n-paraffin, amino acids such as glutamic acid, and glycerol are used.
  • carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, sugar beet, starch, dextrin, mannose, maltose, molasses, etc.
  • organic acids such as citric acid, malic acid, acetic acid, fumaric acid, methanol, Alcohols such as ethanol, hydrocarbons such as methane, ethane, propane, and n-paraffin, amino acids such as glutamic acid, and glycerol are used.
  • Nitrogen sources include ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium phosphate, etc., ammonium salts, aspartic acid, amino acids such as glutamine, cystine, alanine, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, Corn, starch, soybean flour, cottonseed kashiwa, soybean casein, casamino acid, pharma media, etc. are used.
  • Inorganic substances include potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, cobalt sulfate, zinc sulfate, calcium pantothenate, and molybdate Ammonia, potassium aluminum sulfate, barium carbonate, calcium carbonate, cobalt chloride, salt and the like are used.
  • a substance that promotes the growth of cells such as vitamins, for example, thiamine, or EI-2128-1 to the medium, if necessary. If the microorganism used requires a specific substance, add that substance.
  • the cultivation is carried out by a shaking culture method or an aeration-mixing culture method at a temperature of 20 to 40 ° C and near neutral pH. Normally, cultivation for 3 to 7 days reaches the maximum accumulation of E1-2228-1, and the culture is completed.
  • Extraction of bacterial cell components with solvents such as acetone and methanol, filtration, removal of bacterial cells by centrifugation, etc., adsorption resin, silica gel, silanized silica gel, reverse-phase silica gel, aluminum, cellulose, kieselguhr, gay acid E1-21-228-1 is isolated by adsorption / desorption treatment of the active substance by column chromatography or thin-layer chromatography using magnesium, gel filtration agent, ion exchange resin, etc., distribution by an appropriate solvent system, etc. .
  • E1-21-228-1 in the above purification process can be detected by thin-layer chromatography on silica gel followed by iodine coloring or by ultraviolet irradiation at 253.6 nm. it can.
  • Penicillium sp. E-218 strain was used as the inoculum, glucose 100 g / L, mashed potato (Snow Brand Milk Products) 30 g / L, powdered yeast extract S ( A medium of 5 g / L, pH 6.5 was used. Inoculate 1 platinum loop of the inoculum into 5 Om 1 Om 1 of the first-class medium in a large test tube, and shake 3 test tubes (total medium volume 3 Oml) at 25 ° C for 4 days. Cultured.
  • the composition of the second seed medium was the same as that of the first seed medium.
  • the resulting second-species culture solution 20 Om1, was inoculated into 5 Oml main fermentation medium in 30 Om1 Erlenmeyer flasks, 5 ml each (40 flasks, 2 L in total).
  • the main fermentation medium is glucose 10 g / L, soluble starch (MS # 3
  • E 1 -2 1 2 8-1 in the above process was carried out by thin-layer chromatography on silica gel followed by iodine coloring or by ultraviolet irradiation at 253.6 nm.
  • the physiologically active substance E1-21-2128-11 which has IL-1 production inhibitory action can be provided.

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Description

明 細 書
生理活性物質 E 1 - 2 1 2 8 - 1
技 術 分 野
本発明はぺニシリウム属に属する微生物により生産され、 抗菌作用およびィン ターロイキン一 1産生阻害作用を有し、 かつ慢性関節リウマチ、 痛風、 変形性関 節症、 骨粗鬆症、 結節性動脈周囲炎、 潰瘍性大腸炎、 慢性腎炎、 活動性慢性肝炎、 敗血症、 エン ドトキシン性ショ ック、 ァテロ一厶硬化症、 感染症に関わる発熱等 の症状、 もしくは全身性強皮症などの治療剤として有用な新規ィンターロイキン 一 1 産生抑制物質に関する。
背 景 技 術
イ ンタ一ロイキン— 1 (以下 I L一 1と称する） は体内の多彩な細胞、 例えば マクロファージゃ単球をはじめとし、 好中球、 線維芽細胞、 皮膚ケラチノサイ ト、 肝臓クッパー細胞、 腎糸球体メサンギゥム細胞、 脳の星伏細胞ゃグリア細胞、 血 管内皮細胞などから産生される分子量 17. 5kDaの蛋白質で等電点 （以下 piと称す る） が 5の α型と PIが 7の 型がある。 現在のところ α型と 型は同じ作用をす ることがわかっている。
I L一 1は多種多様の生物活性を有することが知られている。 すなわち、 I L 一 1はリンパ球の分裂増殖に対する反応性の増強因子として働く他、 Β細胞の増 殖や抗体産生增強の補助因子として働くとされている。 また、 1 1^ー 1は視床下 部の温度中枢においてァラキドン酸カスケ一ドに作用し、 プロスタグランジン Ε 2合成を高めることで発熱に関与していると考えられている。 さらに、 I L— 1 は敗血症、 クーロン病などの患者血清や、 関節リウマチ患者の関節腔においてそ の活性が有意に上昇していることが示されており、 これらの疾病の発症、 進展へ の I L一 1の関与が示唆されている。 こうした I L一 1で仲介される症伏の軽減 には I L— 1産生の抑制が有効と考えられる。
I L - 1産生抑制作用を有する物質としては、 従来、 ナフタレン誘導体 （特開 平 4 一 5 9 7 4 3号公報） 、 3 -ァリ一ルイソチアゾ―ル誘導体 （特開平 4― 7 1 2 1号公報） 、 ジンゲロール誘導体 （特開平 4 - 2 0 2 1 2 7号公報） など の合成化合物が知られている。 また、 ァラノロシン （aranorosin) 〔ジャーナル ·ォブ · アンチバイオチック ス （J. Antibiot. ),41, 1780-1784(1988)) 、 （特開平 3 - 1 5 7 3 8 6号公 報） 、 ァラノロシノール A (aranorosinol A) およびァラノロシノール B
(aranorosinol B) 〔ジャーナル ·ォブ 'アンチバイオチックス （J. Antibiot. ), 45, 1592-1598(1992)] が報告されているが、 いずれの化合物の構造も式 （ I ) の化合物とは異なるものであり、 また、 いずれの化合物にも I L一 1産生抑制に 関する報告はない。
発 明 の 開 示
本発明は、 式 （ I )
Figure imgf000004_0001
で表される、 I L一 1産生阻害作用を有'する化合物に関する。
以下、 式 （ I ) で表される化合物を E 1 - 2 1 2 8 - 1と称する,
E I - 2 1 2 8— 1の理化学的性質は、 以下に示すとおりである,
なお、 以下のデータは下記の機器により測定した。
融点：柳本微量融点測定器
質量分析： 日本電子 JMS HX/HX110A質量分析装置
紫外吸収スぺク トル：島津製作所 -2200 型紫外光度計
赤外吸収スぺク トル： 日本電子 JIR-BFX3001 型赤外光度計
核磁気共鳴スぺク トル： 日本電子 《400 核磁気共鳴装置
比旋光度： 日本分光工業 DIP- 370 型デジタル旋光計 E I - 2 1 2 8 - 1の理化学的性質
性状： 白色粉末
融点： 70〜？ IX；
比旋光度： [ ΰ 21= +13.9° (c=0. n,CHCl3)
元素分析：実測値 C， 63.16； H , 8.44； N， 3.29%
理論値 C , 62.85； H,8.48； N, 3.19¾ (C23H35N06 · H20) 質量分析： HRFAB- MS実測値 422.2538 [M+H] +
理論値 422.2542 (C23H36N06)
分子式： C23H35N06
紫外吸収スぺク トル： ax (CHsOH) 220nm (sh)
赤外吸収スぺク トル： υ m3X (KBr) 3390， 1668, 1635, 1539， 984, 930 cm一1 核磁気共鳴スぺク トル： 5 ppm (多重度、 結合定数、 積分値）
Ή-ΝΜΕ (CDCla, 400MHz) 6.74 (dd， 8.3， 15.4Hz, 1H), 6.09 (d， 8.1Hz, 1 H)， 5.77 (d， 15.4Hz, 1H), 5.64 (d， 4.6Hz, 1H)， 4.75 (m, 2H), 3.69 (dd， 3.7， 3.9Hz， 1H), 3.57 (dd， 3.7, 3.9Hz, 1H), 3.46 (dd， 2.7， 3.9Hz, 1H)， 3. 42 (dd, 2.7, 3.9Hz, 1H)， 2.63 (dd, 8.8， 13. lHz， 1H)， 2.40 (m， 1H), 2.05 (dd， 10.5, 13.1Hz, 1H)， 1.39 (m, 1H)， 1.37 (m, 1H)， 1.30 (m, 2H), 1.25 (m， 7H)， 1.12 (m, 1H)， 1.08 (m, 1H), 1.03 (d， 6.8Hz, 3H)， 0.88 (t， 6.8Hz, 3H)， 0.84 (d, 6.6Hz, 3H)
13C -膽 (CDC13, 画 Hz) 198.3(s), 166.2(s), 151.9(d), 121.1(d), 96.6 (d), 79. l(s)， 64.3(d), 62.9(d), 55.9(d), 55.6(d), 52.0(d), 43.9(t), 37.4(ΐ), 36.0(t), 34.2(d), 31.9(t), 30.4(d), 29.7(t), 26.8(t)， 22.7(t), 20.5(q), 19.5(q), 14.1(d)
溶解性： メタノール、 ァセトニトリル、 クロ口ホルムに易溶
呈色反応： ヨウ素、 硫酸に陽性
薄層クロマトグラフィー （R f 値） ： 0.71
展開溶媒： クロ口ホルム一メタノール =85： 15
薄層： HPTLC Fertigplatten kieselgel 60 F254 (メルク社製)
展開方法：室温、 上昇法、 2 0〜 4 0分 検出： ヨウ素発色
次に化合物 E 1 -2 12 8- 1の活性について、 試験例で説明する。
試験例 1 ： I L - 1産生に対する阻害作用
本発明の化合物 E 1 - 2 128- 1についてヒト単球系由来株化細胞 THP - 1細胞 (ATCC No. TIB 202)からの I L一 1 の産生阻害作用を調べた。 I L一 1 量は EL I S A法により測定した。
THP - 1細胞を 1 0 %非働化ゥシ胎児血清含有 RPM I 1640培養液 （二 ッスィ社製） に 1 X105個/ mlの濃度で浮遊懸濁した。 これを 24穴プレートに lml/ゥヱルの容量で分注し、 フオルボール 12—ミ リスタート 1 3—ァセタ一ト (PMA；最終濃度： 30nM) を加えて、 37°C、 5%C02ィンキュベ一夕一で 65時 間培養し、 細胞をマクロファージ様に分化させた。
血清無添加 RPMI 1640で培養プレートを锾やかに洗浄して非付着細胞を 除去した後、 リポポリサッカライ ド （LP S ；最終濃度： 25 /g/ml) と被験試料 (最終濃度： 0.05〜50/ig/ml) を同時に添加した血清無添加 RPM I 164 0培 養液 （1ml/ゥエル） で 4時間培養した。
培養後、 培養上清中に遊離した I L— 1 Sは、 I L— 1 測定キッ ト （アマ シャム社製） を用いて測定した。
I L- 1産生阻害率は次式により算出し、 I C5。 （50%阻害濃度） を求めた。
I L- 1産生阻害率 （％) = (A-B) (A-C) X 100
A： L P Sのみ添加時の I L一 1産生量
B ： LPS +被験試料添加時の I L一 1産生量
C ： L P S未添加時の I L— 1産生量
以上より、 E I—2 128— 1の、 1^?5剌激にょる丁11?ー 1細胞の I L一 1産生の 50%阻害濃度はで 0.1 Μであった。
試験例 2 ：各種細菌に対する抗菌作用
各種細菌に対する最小生育阻止濃度 （M I C) について、 パクトトリプトン (Difco社製） 3 gZL、 肉エキス 3 g/L、 酵母エキス 1 gZL、 グルコース 1 g/L 寒天 16 gZLの組成からなる培地 （pH 7.0) を用いて寒天希釈 法により測定した。 その結果を第 1表に示す。 第 1 表
El-2128-1
Test microorganisms
MIC ( ^ΓηΙ)
Candida albicans ATCC10231 42
Enterococcus hirae ATCC 10541 0.33
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC6538P 0.33
Bacillus subtilis No.10707 0.16
Proteus vulgaris ATCC6897 42
Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae ATCし 10031 21
次に E I - 2 1 2 8— 1の製造法について説明する。
E I - 2 1 2 8 - 1はぺニシリゥム属に属し、 E I— 2 1 2 8 - 1の生産能を 有する微生物を培地に培養し、 培養物中に E 1 - 2 1 2 8 - 1を生成蓄積させ、 該培養物から E 1 - 2 1 2 8 - 1を採取することによって製造される。
E I — 2 1 2 8— 1の生産能を有する微生物としては、 ぺニシリゥム属に属し、 E I - 2 1 2 8 - 1生産能を有する菌株であればいずれの菌株でも用いることが できる。 また、 これらの菌株を人工的変異法、 たとえば紫外線照射、 X線照射、 変異誘起剤処理などによって変異させた変異株あるいは自然的に変異した変異株 でも E I— 2 1 2 8— 1の生産能を有するものであれば本発明に用いることがで きる。 具体的に好適な例として、 ベニシリゥ厶 ·スピ一シ一ズ（Penicillium sp. ) E - 2 1 2 8株があげられる。
ぺニシリウム .スピ一シ一ズ（Penici Ilium sp. ) E - 2 1 2 8株の菌学的性質 は次の通りである。 1.肉眼的観察
麦芽エキス寒天培地を用いて、 2 5 °Cで培養したとき、 集落の直径は培養 7日 目で 4 0〜 4 6 mm. 培養 1 4日目で約 6 0 mmに達する。 培養 1 4日目の集落 は灰色がかった暗緑青色で、 周囲は白色から淡青色を呈し、 その裏面は、 淡黄白 色で周囲並びに中央部はクリ一ム色を呈する。
バレイショ 'ブトウ糖寒天培地を用いて、 2 5 °Cで培養したとき、 集落の直径 は培養 7日目で約 4 5mm, 培養 1 4日目で 7 0〜 7 5 mmに達する。 培養 1 4 日目の集落は灰色がかったォリ一ブ色を呈し、 その裏面は暗赤褐色を呈する。 本菌株の至適生育温度は 6〜 3 8. 5 °Cであり、 2 2 °C前後で最も良好に生育 する。 生育しうる p Hは 3〜 1 2で至適生育 p Hは、 7付近である。
2.麦芽寒天培地上で培養したときの本菌株の光学顕微鏡的観察
菌糸は隔壁を有し、 無色から淡黄褐色を呈し、 平滑でよく分岐する。 分生子柄 は菌糸から単生して立ち上がる。 分生子柄は、 平滑、 無色から淡黄褐色を呈し、 長さ約 1 6 0 μπιに達するものもあり、 幅は 1. 8〜3. 5 mである。 ぺニシ リは形、 大きさともに不規則ではあるが、 多くは複輪生体で非対称である。 メ ト レはくさび形から長方形を呈し、 ベニシリの分枝先端に 3〜 4本群生し、 長さ 6.
5〜1 3. 5 zmで、 幅は 1. 5— 3. 5 mである。 メ トレの先端は 3〜6
個のフィアラィ ドが群生する。 フィアラィ ドはトツクリ形あるいはフラスコ形を 呈し、 長さ 5. 5~ 9. 5 mで、 幅は最も広い部位において 2〜 3 im、 その 先端部は幅約 1. 2 imである。 分生子の個体発生様式は内生出芽型であり、 分 生子はフィアラィ ド先端より形成し、 連鎖伏となる。 フィァ口型分生子は、 単細 胞、 平滑、 球形〜亜球形で、 直径 2. 5〜4. 3 m、 無色〜淡褐色で集合する とオリ一ブ褐色を呈する。 本菌株は、 上述したアナモルフ（anamorph)のみ観察さ れ、 テレオモルフ（teleomorph)は観察されない。
以上の菌学的性質から、 本菌の分類学上の位置を 「ザ · ジュネラ ·ォブ ' ファ ンジャィ · スポルレイティ ング ·イン ' ピュア ·カルチャー第 2版（The Genera of Fungi Sporulating in PureCulture, 2nd ed. Cramer, Vaduz, J. A. von Arx, 1 9 7 4年） 」 に従って検索した結果、 本菌株は、 ぺニシリゥム ·スピ一シ ーズ (Penicillium sp. )に属することが認められた。 本発明者らは、 本菌株を " ぺニシリウム · スピ一シ一ズ E— 2 12 8 (Penici Ilium sp. E- 2128)" と 命名し、 平成 8年 3月 2 7日付で工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨 城県つくば市東 1丁目 1番 3号） FERM BP- 5488として寄託した。
本発明の E 1 -2 1 28 - 1生産菌の培養に際しては、 糸状菌の培養に用いら れる通常の培養方法が適用される。 用いられる培地は菌の資化しうる炭素源、 窒 素源、 無機物などを程よく含有する培地であれば天然培地、 合成培地いずれでも 用い得る。
炭素源としては、 グルコース、 フラク ト一ス、 シユークロース、 ス夕ビロース、 澱粉、 デキストリン、 マンノース、 マルト一ス、 糖蜜等の炭水化物、 クェン酸、 リンゴ酸、 酢酸、 フマール酸などの有機酸、 メタノール、 エタノール等のアルコ ール、 メタン、 ェタン、 プロパン、 n-パラフィ ンなどの炭化水素、 グルタミ ン 酸等のァミノ酸あるいはグリセロール等が用いられる。
窒素源としては、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥ厶、 リン酸アンモニゥム等のアンモニゥム塩、 ァスパラギン酸、 グルタミ ン、 シスチ ン、 ァラニン等のアミノ酸、 尿素、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 乾燥酵母、 コーン ·スチ一プ* リカ一、 大豆粉、 綿実柏、 大豆カゼィン、 カザミノ酸、 ファ ーマメディァ等が用いられる。
無機物としては、 リン酸一水素カリウム、 リン酸二水素カリウム、 リン酸二水 素ナトリウム、 硫酸マグネシウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 硫酸コ バルト、 硫酸亜鉛、 パントテン酸カルシウム、 モリブデン酸アンモニゥ厶、 硫酸 アルミニウムカリウム、 炭酸バリウム、 炭酸カルシウム、 塩化コバルト、 食塩等 が用いられる。
その他必要に応じて培地にビタミン、 たとえばサイアミン等菌体の増殖あるい は E I - 2 128— 1の生産を促進する物質を加える。 また、 用いる微生物が特 定の物質を要求する場合は、 該物質を加える。
培養は振遨培養法、 通気攬拌培養法などにより、 20〜40°Cの温度で中性付 近の p Hで行われる。 通常 3〜 7日の培養によって E 1 - 2 12 8- 1の蓄積が 最大に達し、 培養は完了する。
培養物中に蓄積した E 1 -2 128- 1を培養物から単離精製するに際しては、 通常の微生物代謝産物を培養物から精製する方法に従って行われる。
すなわち、 アセトン、 メタノールなどの溶剤による菌体成分の抽出、 ろ過、 遠 心分離などによる菌体除去、 吸着樹脂、 シリカゲル、 シラナィズドシリカゲル、 逆相シリカゲル、 アルミニウム、 セルロース、 ケィ藻土、 ゲイ酸マグネシウム、 ゲルろ過剤、 イオン交換樹脂等を用いるカラムクロマトグラフィ一もしくは薄層 クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、 適当な溶媒系による分配等に よって E 1 - 2 1 2 8 - 1は単離される。
上記精製工程中の E 1 - 2 1 2 8 - 1の検出は、 シリカゲル薄層クロマトグラ フィ一、ついでヨウ素発色することにより、 または、 2 5 3. 6 nmの紫外線照 射法により行うことができる。
以下に本発明の実施例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1
種菌として、 ぺニシリウム ·スピーシ一ズ E - 2 1 2 8株を用い、 第一種培地 としてグルコース 1 0 0 g/L、 マッシュポテト （雪印乳業社製） 3 0 g/L、 粉末酵母エキス S (日本製薬社製） 5 g/L、 pH 6. 5の培地を用いた。 種菌 1白金耳を、 5 Om 1太型試験管に入れた第一種培地 1 Om 1に植菌し、 試験管 3本 （合計培地量 3 Om l ) を 2 5°Cで 4日間振遨培養した。
この第一種培養液 3 Om 1を 3 0 0 m 1容エルレンマイヤーフラスコに入った
5 0m lの第二種培地に 5 m 1ずつ （合計フラスコ 4本、 2 0 0 m l ) 植菌した ( 第二種培地の組成は第一種培地の組成と同じである。 第二種培養は 2 5°Cで 2日 間振盪培養を行った。
得られた第二種培養液 2 0 Om 1を 3 0 Om 1容エルレンマイヤ一フラスコに 入った 5 Om lの主発酵培地に 5 m 1ずつ （合計フラスコ 4 0本、 2 L) 植菌し た。 主発酵培地としてはグルコース 1 0 g/L、 ソリュブルスターチ （MS # 3
6 0 0、 日本食品化工社製） 1 0 g/L、 コーンスターチ （和光純薬工業社製） 1 0 g/ , コーンスティープリカ一 5 g/L、 ファーマメディア 5 g/Lヽ ェ ビォス 5 g/L、 炭酸カルシウム 2 g/L、 p H 6. 0の培地を用いた。 この主 発酵培養は 2 5でで 6日間振盪培養を行った。 得られた主発酵培養液 2 Lを濾過することにより菌体を得た。 分別した菌体に 2 Lのメタノールを加え撹拌後、 濾過した。 得られた菌体抽出液 2 Lを水 8 Lで 希釈した後、 4 0 0 m lのダイヤイオン HP— 2 0カラム （三菱化学社製） に通 塔し、 5 0 %メタノール 1. 6 Lで洗浄した後、 メタノール 1. 6 Lで溶出した。 E I - 2 1 2 8 - 1を含む画分を集め、 等量の水で希釈した後、 直径 3 c m長さ 5 0 cmの OD Sカラム （ODS— AQ— S 5 0、 YMC社製） に通塔後、 7 5 %メタノールで溶出した。 E I— 2 1 2 8 - 1を含む画分を集め、 減圧乾固後、 メタノール 2 0 m 1に溶解した。 この内、 2 m 1を HP L Cカラム （D-0DS-5-B S-5 120A、 YMC社製） に通塔後、 流速 2 0m l /分の条件で、 8 0 %メタノー ルで溶出し、 E I— 2 1 2 8— 1を含む画分を集めた。 この HP LCを用いた精 製を繰り返し行い、 E I— 2 1 2 8— 1を含む画分を集めて減圧乾固することに より、 E I— 2 1 2 8 - 1を 1 0 7mg得た。
なお上記行程中の E 1 - 2 1 2 8 - 1の検出は、 シリカゲル薄層クロマトグラ フィ一、 ついでヨウ素発色することにより、 または、 2 5 3. 6 nmの紫外線照 射法により行った。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 I L - 1産生阻害作用を有する生理活性物質 E 1 - 2 1 2 8 一 1を提供することができる。

Claims

.請求の範囲 式 (I)
Figure imgf000012_0001
で表される生理活性物質 E 1 -2 128- 1
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