WO1997032035A1 - Procede d'analyse de proteases et membrane fine utilisee dans ce procede - Google Patents

Procede d'analyse de proteases et membrane fine utilisee dans ce procede Download PDF

Info

Publication number
WO1997032035A1
WO1997032035A1 PCT/JP1997/000588 JP9700588W WO9732035A1 WO 1997032035 A1 WO1997032035 A1 WO 1997032035A1 JP 9700588 W JP9700588 W JP 9700588W WO 9732035 A1 WO9732035 A1 WO 9732035A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protease
thin film
layer
digestion
substrate
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/000588
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masashi Ogawa
Tsutomu Hamaoka
Yutaka Tamura
Tetsuhiko Tachikawa
Ikuo Hasegawa
Shusaku Yoshiki
Kohji Hasegawa
Junji Nishigaki
Original Assignee
Fuji Photo Film Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuji Photo Film Co., Ltd. filed Critical Fuji Photo Film Co., Ltd.
Priority to EP97905416A priority Critical patent/EP0884393B1/en
Priority to CA002248272A priority patent/CA2248272C/en
Priority to JP53079997A priority patent/JP3302020B2/ja
Priority to DE69721507T priority patent/DE69721507T2/de
Priority to AT97905416T priority patent/ATE239092T1/de
Publication of WO1997032035A1 publication Critical patent/WO1997032035A1/ja
Priority to US11/050,763 priority patent/US20050136504A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring protease. More specifically, it enables accurate diagnosis of cancer malignancy such as invasive activity and metastatic activity of cancer cells, progression of periodontal disease such as periodontitis, and destructive pathological conditions such as rheumatoid arthritis.
  • the present invention relates to a method for measuring protease.
  • Conventional technology such as invasive activity and metastatic activity of cancer cells, progression of periodontal disease such as periodontitis, and destructive pathological conditions such as rheumatoid arthritis.
  • proteases are involved in tumor cell invasion and metastasis, and it may be possible to control invasion and metastasis of malignant tumor cells by controlling proteases.
  • proteases extracellular matrix-degrading enzymes
  • matrix.meta-oral protease imp
  • Matrix meta-oral protease is an enzyme that degrades extracellular matrix such as collagen, proteoglycan, laminin, fibronectin, and gelatin.
  • MMP-1 The stromal collagenase
  • MMP-2 gelatinase A
  • MMP-9 mainly destroy type IV collagen, laminin, fibronectin, and proteoglycan, which are components of periodontal tissue.
  • EGF cell growth factors
  • TGF-yS cell growth factors
  • proteases involved in tumor cell invasion and metastasis include plasminogen 'activator-1 (PA), which is a serine oral protease.
  • PA plasminogen 'activator-1
  • the plasminogen and activator are enzymes that convert plasminogen to plasmin. Plasmin produced by the action of plasminogen.activator converts prometa-protease into an active form of proteases. Convert to Therefore, it is thought that the cascade formed between the matrix-medium protease and the plasminogen activator accelerates the progression of invasion and metastasis of cancer cells.
  • Protease is involved in the above-mentioned invasion and metastasis of cancer cells, progression of periodontal disease, destructive lesions such as destruction of bone tissue and periodontal ligament due to alveolar abscess, and destruction of periosteum and bone tissue due to rheumatic arthritis.
  • protease in rheumatism, see Japanese clinical study, 50 (3), pp. 463-467, 1992. Therefore, by quantifying the protease in the cell tissue, the degree of malignancy of the cancer cells and the pathological condition of periodontal disease, and the progress of destructive lesions such as rheumatism can be accurately determined from the viewpoint of invasive activity and metastatic activity.
  • a zymography method for measuring enzyme activity from the degree of decomposition of a substrate and an immuno-proteining method using an antibody specific to each protease have been used.
  • the extract is subjected to electrophoresis using SDS-polyacrylamide gel containing gelatin, and the gel after electrophoresis is stained with amide black.
  • a method is known in which a sample that gives a white, transparent band without being stained is determined to be positive for protease.
  • it is necessary to prepare an SDS-polyacrylamide gel for each measurement and there is a problem that it takes about 30 hours to detect.
  • An object of the present invention is to provide a simple and accurate method for measuring protease. More specifically, it can quickly and accurately determine the malignancy of cancer cells such as invasiveness and metastatic activity, the state of disease such as periodontal disease, and the progression of bullous lesions such as rheumatism in a short time. It is an object of the present invention to provide a method for measuring a protease which is useful for accurately predicting the degree of progression of destructive lesions and the like.
  • Another object of the present invention is a method for measuring a protease having the above characteristics, which method accurately measures a protease that is derived from a cancer cell or the like localized in a test tissue. To provide.
  • Still another object of the present invention is to provide a thin film used in the above-described method for measuring protease.
  • the present inventors have made intensive efforts to solve the above-mentioned problems, and as a result, adhered a tissue section such as a cancer tissue to the surface of a thin film containing a protease substrate such as gelatin and a hardening agent, or obtained a disease such as periodontal disease.
  • a tissue section such as a cancer tissue
  • a thin film containing a protease substrate such as gelatin and a hardening agent
  • a disease such as periodontal disease.
  • the exudate collected from the diseased tissue was dropped onto the thin film, it was found that protease contained in the sample digested the thin film and formed a digestion mark on the surface of the thin film.
  • the above method uses a thin film containing agarose.
  • the present invention relates to a method for measuring a protease, comprising: (1) a step of bringing a protease-containing sample into contact with a thin film formed on the surface of a support containing a protease substrate and a hardening agent; And d) detecting a digestion mark formed on the thin film by the action of a protease.
  • a method for measuring a protease comprising the steps of: Contacting one of two successive sections; (2) by the action of a protease; A method for detecting a digestion mark formed on the thin film; and (3) comparing the digestion mark with a tissue specimen prepared from another slice.
  • a method for measuring a protease comprising: (1) a method for measuring a substance of a biological sample with respect to a thin film formed on a surface of a support, which comprises a protease substrate and a hardening agent; Contacting one of the two or more sections in a sequence that is specifically contiguous; (2) leaving the remaining thin film comprising the protease substrate, the hardener, and the protease 'inhibitor, against the thin film formed on the support surface; Contacting the section; (3) detecting digestion marks formed on the thin film by the action of protease; and (4) using the digestion marks of the thin film used in step (1) in step (2).
  • a method is provided that includes the step of comparing with the digestion marks of the thin film.
  • the step (2) includes a step of contacting the remaining two or more sections with thin films containing different types of protease 'inhibitors.
  • a method for measuring a protease comprising: (1) a method for measuring a substance of a biological sample with respect to a thin film formed on a surface of a support, comprising a protease substrate and a hardening agent; Contacting one of the two or more sections that are properly linked; (2) a protease and a hardening agent that are different from the protease contained in the thin film used in step (1).
  • step (2) includes a step of contacting the remaining two or more sections with thin films each containing a different type of protease substrate.
  • a method for measuring a protease comprising: (1) at least the following two layers: a protease substrate, a hardening agent, and a protease. a) contacting a sample containing protease with a thin film containing a layer and a protease substrate and a hardener, and (a) laminated on the layer (b); (2) protease And (3) comparing the digestion traces of the (a) layer and the digestive traces of the (b) layer with each other.
  • the method and the thin film described above wherein the proteases substrate is selected from the group consisting of collagen, gelatin, proteoglycan, fibronectin, laminin, elastin, and zein;
  • the above methods and thin films which are biological samples separated and collected from cancer tissue sections, gingival crevicular exudate, or destructive lesion tissue sections or extracts (for example, rheumatic lesion tissue extract or alveolar pyorrhea)
  • Each of the above methods and thin films that are tissue extracts Each of the above methods and thin films in which the protease is a matrix metalloprotease;
  • Each of the above methods and thin films that detect digestion marks by staining A substance selected from the group consisting of oxides, pigments, and dyes and having a maximum transmission density of 0.01 or more in the wavelength range of 400 nm to 700 nm
  • one of the substances selected from the group consisting of metals, metal oxides, pigments, and dyes and having a maximum transmission density of 0.01 or more in a wavelength region of 400 nm to 700 nm is 0.01 or more.
  • a thin film comprising a seed or two or more species; a thin film having a support selected from slide glass or polyethylene terephthalate film; a thin film having an undercoat layer provided between the support and the thin film; The above-mentioned thin film, which is a photographic film after development and fixing, is also provided.
  • the present invention there is provided a method of diagnosing a disease involving a protease, according to each step defined in each of the above methods.
  • the disease is a disease selected from the group consisting of cancer, rheumatic disease, periodontal disease, and alveolar pyorrhea.
  • the method for measuring a protease in each of the above embodiments basically includes a step of bringing a sample containing a protease into contact with a thin film (first step) and a step of detecting a digestion mark formed on the thin film by the action of the protease. (The second step).
  • the thin film for measuring protease used in this method is basically formed as a single layer or a multilayer on the surface of a support, and contains a protease substrate and a hardener as essential components. It is characterized by: Therefore, according to the method of the present invention, at the beginning of the contacting step between the sample and the thin film, the sample is not in contact with the support.
  • the above thin film contains a hardening agent, and since there is no binder such as agarose, the density of a protease substrate such as gelatin digested by a protease is high in the film, such as gelatin.
  • the cross-linking of the protease substrate prevents the shape of digestion traces from collapsing, and thus has the characteristic of being excellent in protease measurement sensitivity and measurement reproducibility.
  • the term measurement method as used herein should be interpreted in the broadest sense, including qualitative and quantitative.
  • the protease substrate is digested by the protease contained in the sample, and a digestion mark is formed on the thin film. This disappearance mark can be detected under a microscope, for example, after performing appropriate staining as necessary, and the presence of the protease in the sample can be proved.
  • the protease to be measured in the method of the present invention includes, for example, matrix-meta-oral protease (MMP) and matrix'serine protease (MSP). These enzymes are described in detail in Takaru Tsuruo, “Molecular Mechanisms of Cancer Metastasis”, pp. 92-107, published by Medical View, 1993.
  • MMP matrix-meta-oral protease
  • MSP matrix'serine protease
  • Particularly suitable proteases for the method of the present invention include, for example, matrices such as interstitial collagenase (MMP-1), gelatinase A (MP-2). And gelatinase B (MMP-9). And a matrix serine protease such as plasminogen activator (PA).
  • MMP-1 interstitial collagenase
  • MP-2 gelatinase A
  • MMP-9 gelatinase B
  • PA plasminogen activator
  • the subject of the method of the present invention is these proteins
  • the protease substrate is not particularly limited as long as it is a polymer compound that can be degraded as a protease substrate.
  • collagen, gelatin, proteoglycan, fibronectin, laminin, elastin, or casein can be used.
  • collagen, gelatin, fibronectin, elastin, or casein can be used, and more preferably, gelatin, fibronectin, or casein can be used.
  • the protease substrate one of the above substances may be used, or two or more may be used in combination.
  • one of two or more substantially continuous sections of a biological sample is contacted with a thin film containing a protease substrate, and the remaining sections are different from the protease substrate contained in the thin film.
  • a method of comparing digestion marks formed on each thin film can be adopted. With this method, measurements can be made using three or more thin films, each containing a different protease substrate.
  • a single layer containing a first layer containing a protease substrate and a second layer containing a protease substrate different from the protease substrate contained in the first layer A method may be employed in which a thin film is produced, and a sample containing a protease is brought into contact with the sample, and digestion marks formed on each layer are compared. In this method, it is also possible to use a thin film in which three or more layers each containing a different type of protease are laminated.
  • protease inhibitors may facilitate the identification of proteases associated with inhibitors and the determination of the properties of proteases.
  • Proteases and inhibitors include, for example, tissue inhibitor of metaprotease 1 ( ⁇ 1), tissue 'inhibitor' of metabolase 2 ( ⁇ 2), and large inhibitor 'of 'main evening opening Protea Ichize (LIMP), Chikkin. Inhibi evening one. O blanking.
  • meth port protease Chomp
  • Oposutachin Oposutachin
  • platelet IV factor (PF- 4)
  • PF- 4 factor
  • ⁇ 2 Makuroguroburi down EDTA, 1
  • 10-Fannant mouth Lin BB94
  • Minocycline Mtristatin
  • SC-44463 Dithiothreitol
  • DTT Dithiothreitol
  • a single thin film including a first layer containing a protease substrate and a second layer containing a protease substrate and a protease ′ inhibitor is produced, and a sample containing the protease is contacted.
  • a method of comparing digestion marks formed in each layer may be adopted.
  • the above method using a protease / inhibitor and the above method using a combination of two or more different proteases may be further combined.
  • the hardener used in the production of the thin film of the present invention has the function of accelerating the curing of the thin film in the production of the above-mentioned protease substrate thin film and preventing swelling of the thin film after formation.
  • the type of hardening agent is not particularly limited as long as it has the above-mentioned action and does not substantially inhibit the reaction between the protease and the protease substrate, and any of inorganic or organic hardening agents can be used. May be used.
  • chromium salts chromium alum, chromium acetate, etc.
  • aldehydes formaldehyde, glyoxal, glutaraldehyde, etc.
  • N-methyl compounds dimethyl methyl urea, methylol dimethylhydantoin, etc.
  • Dioxane derivatives (2,3-dihydroxydioxane, etc.), and compounds that act by activating carboxyl group (carbedem, 2-naphthalenesulfonate, 1, tribispyrrolidino-1-)
  • Active vinyl compounds (1,3-bisvinylsulfonyl-2-propanol, 1,2-bis (vinylsulfonylacetamide)), chloro-pyridinium, 1-morpholinocarbonyl-3- (sulfonatoaminomethyl)-, etc.
  • Ethane bis (vinylsulfonylmethyl) ether, vinyl with vinylsulfonyl group in side chain Polymers, 1,3,5-triacryloyl-hexahydro-S-triazine, bis (vinylsulfonyl) methane, etc .; Active halogen compounds (2,4-dichloro-6-hydroxy-s-triazine and its sodium salt, etc.) ); Mucohalic acids (mucochloric acid, mucophenoxycyclolic acid, etc.); isoxazoles; dialdehyde starch; or hardening agents such as 2-chloro-6-hydroxytriazinylated gelatin alone. Alternatively, two or more kinds can be used in combination. Of these, vinyl Sulfonic acid hardeners are preferred.
  • the amount of the hardener used is not particularly limited. For example, when gelatin is used as a protease substrate, gelatin is used from the viewpoint of detection performance.
  • tissue or tissue exudate can be used.
  • tissue or tissue exudate can be used.
  • cancer tissues isolated and collected from solid cancer tissues such as lung cancer, stomach cancer, esophagus cancer, breast cancer, and brain tumors by surgery or histological examination, synovium and bone tissue of rheumatoid arthritis, periodontal ligament and bone of alveolar pyorrhea
  • Disruptive lesion tissues such as tissues and exudates, as well as periodontal disease gingival crevicular exudates can be used.
  • a slice having a thickness of 1 to 10 / ⁇ , preferably about 5 / m is prepared from a sample that has been rapidly frozen in liquid nitrogen using a cryosectioning apparatus, and the slice is prepared. By attaching the sample to the thin film, the sample and the thin film can be brought into contact.
  • synovial fluid collected from a patient with rheumatoid arthritis is used as a sample, about 5 to 501, preferably about 20 // 1 of synovial fluid may be dropped on the thin film.
  • gingival crevicular fluid for periodontal disease
  • a method of inserting filter paper into the gingival sulcus, collecting about 5 to 10 1 gingival crevicular fluid, and attaching the filter paper to a thin film is recommended. Can be adopted. After collecting the gingival crevicular fluid, use distilled water or an appropriate buffer (eg, 50 mM Tris-HCl, H7.5, 10 mM CaCl., 0.2 M NaCl, etc.) from the filter paper as needed. The gingival crevicular fluid may be extracted and the extract may be dropped on the thin film.
  • an appropriate buffer eg, 50 mM Tris-HCl, H7.5, 10 mM CaCl., 0.2 M NaCl, etc.
  • the thin film is preferably formed on a transparent or translucent support so that the presence of protease in the tissue can be observed under a microscope.
  • a transparent or translucent support include, for example, glass or a transparent or translucent plastic film made of polyethylene terephthalate, polycarbonate, polyimide, nylon, cellulose, or triacetate. Etc. can be used. It is preferable to use a slide glass for a microscope as the glass, and it is preferable to use a polyethylene terephthalate film as the plastic film.
  • the support is not limited to these, and any support can be used as long as it can produce a uniform thin film and is suitable for microscopy.
  • an opaque support can be used in addition to the above support.
  • paper, synthetic paper, paper laminated with synthetic resin eg, polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene naphthalate, etc.
  • metal plate eg, plate of aluminum, aluminum alloy, zinc, iron, copper, etc.
  • Paper or a plastic film on which the above-mentioned metal is laminated or vapor-deposited can be used.
  • the support may be colored.
  • the thickness of the support is not particularly limited. In the case of glass, a thickness of about slide glass (for example, about 2 to 3 ram) is preferable. In the case of polyethylene terephthalate film, about 100 to 250 um More preferably, about 150 to 200, particularly preferably about 175 / in can be used.
  • the thin film on the support can be formed as a single layer or a multilayer, but the thin film should be prepared so as to give a surface as uniform as possible. For example, it is preferable that the film thickness after drying is adjusted to l to 10 / m, preferably about 4 to 6 im.
  • a protease substrate dispersed in water or an organic solvent such as methylene chloride, acetone, methanol, ethanol, or a mixed solvent thereof is applied to the support surface and dried.
  • the coating method include a die coating method, a mouth coating method, a curtain coating method, and an extrusion coating method.
  • the method for preparing the thin film is not limited to these, and for example, a thin film forming method widely used in the technical field of photographic films and the like can be appropriately adopted.
  • the type of gelatin is not particularly limited, and examples thereof include beef bone alkali-treated gelatin, pork skin alkali-treated gelatin, bovine acid-treated gelatin, bovine bone phthalated gelatin, Pig skin wide acid-treated gelatin can be used.
  • an undercoat layer may be provided between the thin film and the surface of the support to improve the adhesion between the thin film and the support.
  • vinyl chloride, vinylidene chloride, butadiene, methacrylic acid, acrylic acid, itaconic acid, maleic anhydride A polymer or copolymer obtained by polymerizing one or more of monomers selected from acids, etc., polyethyleneimine, epoxy resin, grafted gelatin, and nitrocellulose. It can be formed as an undercoat layer.
  • the surface of the support may be subjected to a corona discharge treatment, an ultraviolet treatment, or a glow discharge treatment instead of the undercoat layer, so that the adhesive strength between the support and the thin film is also reduced. May be improved.
  • a thin film formed on a support surface or a synonym thereof excludes one or more such subbing layers and / or treatment of the support surface.
  • the means for improving the adhesion between the thin film and the support is not limited to the above, and, for example, means commonly used in the technical field of photographic films can be appropriately used. .
  • components such as a dye, a pigment, a preservative, and a stabilizer may be appropriately blended in addition to the above components.
  • Such components can be appropriately selected and used as long as they do not substantially inhibit the reaction between the protease and the protease substrate.
  • the dye for example, dyes described in JP-A-6-102624 (the dyes specifically represented by the chemical structural formulas from page 9, 1-1 to page 47, 63) may be used.
  • a method for adding a dye is described in JP-A-5-313307 (a method specifically described from page 11, paragraph [0037] to page 12, paragraph [0044]). Can be adopted.
  • the detection of digestion marks can be facilitated by adding a dye or a pigment.
  • the thin film after production has a maximum transmission density of 0.01 or more in a wavelength region from 400 nm to 700 nm.
  • a substance such as a metal, a metal oxide, a dye, or a pigment
  • the thin film after production has a maximum transmission density of 0.01 or more in a wavelength region from 400 nm to 700 nm.
  • One or more of these substances can be blended in the thin film, and different layers such as dyes having different colors may be blended in each layer forming the thin film.
  • the use of agarose in the production of the thin film of the present invention is not preferred because the use of agarose in the production of the thin film reduces the reproducibility of protease detection.
  • a tissue section is stuck on a thin film or a liquid sample
  • a tissue section is stuck on a thin film or a liquid sample
  • a tissue section is stuck on a thin film or a liquid sample
  • a tissue section is stuck on a thin film or a liquid sample
  • a humidified box at 37 ° C.
  • a tissue section for 1 to 24 hours, preferably 2 to 12 hours
  • the protease substrate in the thin film is degraded by the protease and a trace of digestion is formed on the thin film.
  • the presence of protease can be proved by observing the digestion marks with the naked eye or under a microscope.
  • the evaluation may be performed using photolysis by a spectrophotometer.
  • Gelatin staining can be performed by a conventional method using, for example, 1% amide black powder or the like.
  • the gelatin thin film is stained dark blue, but when protease produces a gelatin digestion mark on the gelatin thin film, gelatin is present in the digestion mark. As it does not, white areas that are not stained appear.
  • the photographic film for example, Neopan F, manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.
  • the photographic film was exposed and subjected to normal development, fixing, washing, and drying. It may be used as a thin film. In this case, digestion marks can be observed as white portions on the exposed black film.
  • a serial frozen section is prepared from a cancer tissue or the like, and one of two substantially continuous sections is, for example, a hematoxylin-eosin-stained section or the like.
  • protease measurement method it is possible to accurately determine the malignancy (invasive activity and metastatic activity, etc.) of individual cancer cells present in a tissue, and to accurately determine the prognosis of a cancer disease. Judgment becomes possible.
  • a calibration curve is prepared using a standard solution prepared in advance.
  • a bovine bone solution-treated gelatin solution was prepared in the same manner as in Example 1, and this solution was uniformly applied on a slide glass so that the dry film thickness was about 6 // ⁇ 1, and dried to form a gelatin thin film. Manufactured.
  • alkali-treated gelatin from bovine bone alkali-treated gelatin from pork skin, gelatin from bovine acid, gelatin from bovine bone, gelatin from pork skin, gelatin from pork skin (Sigma # G2625), and pork skin from acid
  • Each of the gelatin thin films was similarly manufactured using the treated gelatin (# G2500 manufactured by Sigma).
  • Example 3 Protease activity measurement
  • a proteases liquid sample use a solution containing Matrix-Messenger Protease (J1MP) -1, MMP-2 and MMP-9 (manufactured by Kagai) at a concentration of 2 pg / ml to 200 ng / ml, respectively.
  • J1MP Matrix-Messenger Protease
  • MMP-2 MMP-9
  • the biological samples include gingiva, gingival crevicular fluid (GCF) and periodontal pathogens (P. gingivalis # 381 strain; actinomycetemcomitans Y4 strain; and P. intermedia ATCC) collected from periodontal disease patients. The supernatant obtained by culturing 25611 strain) was used.
  • Example 2 About 10/1 of the liquid sample was dropped on each of the gelatin thin films obtained in Example 2, and the tissue sample was affixed on each gelatin thin film as a frozen section of about 5 m. Place the thin gelatin film in a humid box and incubate at 37 ° C for 4-16 hours. Stained with a gel.
  • Surgical specimens of tongue squamous cell carcinoma, lung cancer, and esophageal cancer were cut out to a size of about 0.5 cm x 2 cm as test tissue samples, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 ° C. .
  • a continuous section of 5 m in thickness was prepared from this specimen using a frozen section preparation device, and one piece was attached to a slide glass and dried, fixed with 10% formalin for 5 minutes, and then processed according to a standard method. Matoxylin'eosin staining was performed.
  • Other serial sections were affixed on each of the gelatin films prepared in Examples 2 and 3 and placed in a wet box and incubated at 37 for 3-6 hours.
  • the gelatin thin film was stained with an amide plaque solution, dried, and then examined under a microscope.
  • the portion where the protease activity was expressed gave a white trace of gelatin digestion, while the other portions were dark blue-black.
  • traces of gelatin digestion were found in individual cancer cells forming cancer nests, but strong traces of gelatin digestion were observed particularly in cells located at the periphery of the cancer nests.
  • weak digestion of gelatin was observed, but as this epithelium grew abnormally, strong digestion of gelatin was observed.
  • Example 5 Case (Oral maxillary gingival cancer)
  • the cancer cells in the specimen were poorly differentiated squamous cell carcinomas, which formed alveolar structures, destructing bone tissue and showing strong invasion.
  • the gelatin thin film corresponding to the cancer cells in the cancer cell nest was digested and gave a white gelatin digestion mark on the gelatin thin film specimen, but it was particularly strong at the site corresponding to the cell located at the periphery of the cancer cell nest. Traces of gelatin digestion were observed. A strong t-granular gelatin digestion mark was formed at the site corresponding to the nested inflammatory cell infiltration site in the specimen.
  • the cancer cells in the specimen were undifferentiated squamous cell carcinomas with large and small cancer nests. Strong traces of gelatin digestion were observed in the area corresponding to the cancer cells at the margin of the cancer cell nest, and traces of gelatin digestion were prominent in the areas corresponding to the cells in the growth area of the cancer. Granular gelatin digestion marks were also found in the area corresponding to the focal inflammatory cell infiltration.
  • Example 7 Case (Severe epithelial dysplasia of the oral mucosa)
  • Hematoxylin and eosin-stained specimens showed severe epithelial dysplasia in the epithelium, with thickening of the spinous cell layer and stratification of basal cells. In particular, pluripotent atypical cell proliferation was observed in basal cells. On the thin gelatin film, strong traces of gelatin digestion were observed in the portions corresponding to the thickened spine cell layer and granular cell layer, but only gelatinous traces of gelatin digestion were observed in the basal cell layer. This result indicates that epithelial cells are actively turning over, while basal cells are invading epithelialized connective tissue.
  • Example 10 Producing a thin film for protease measurement
  • Samples 132 to 160 were prepared in the same manner as Sample 131, using the protease substrates shown in Table 2 in place of collagen I, and changing or adding hardeners, additives, and supports. Created. At the time of coating, a coating aid was used as needed.
  • Samples 161 to 170 were prepared in the same manner as Samples 121 to 130, except that a slide bar was used instead of a wire bar coater at the time of coating.
  • the drying conditions were as follows: once cooled to 10 ° C as needed, and then dried at room temperature and normal humidity.
  • Example 12 Protease activity measurement
  • MMP-2 described in Example 3 was used as a protease liquid sample, and about 10 1 was dropped on each thin film obtained in Example 11.
  • the thin film was incubated in a wet box at 37 ° C for 4 to 16 hours, and then the transparent sample was stained with an amide plaque solution.
  • the activity was evaluated by (1) visual judgment, (2) judgment by measuring the concentration of minute parts by microdensitometry, and (3) judgment by measuring the film thickness using a contact-type film thickness measuring device. .
  • Table 3 shows the results.
  • Table 3 Sample number Digestion mark Optical density Film thickness (juni)
  • Example 11 As a proteases liquid sample, a solution containing 2 pg ml to 200 ng / ml of matrix 'metalloprotease ( ⁇ ) -1 was used, and the sample obtained in Example 11 was used. The measurement was performed in the same manner as in Example 12 to prepare a calibration curve. Table 4 shows the results. Table 4
  • Samples 331 to 360 were prepared in the same manner as Samples 301 to 330, except that a slide coater was used instead of a wire bar coater during coating.
  • the drying conditions were as follows: a method of cooling to 10 ° C as needed and drying at room temperature and normal humidity.
  • Example 16 Protease activity measurement
  • Protease activity was measured in the same manner as in Example 12. Table 7 shows the results. This result indicates that the protease activity can be determined very clearly even in a multilayer thin film. Samples 331 to 360 made by slide coater showed the same results as the samples made by bar coater.
  • Example 17 Preparation of thin film for protease assay and measurement of protease activity
  • Samples 501 to 530 were prepared in the same manner as Samples 331 to 360, except that this solution was applied to the back layer using a slide coater and dried to form a thin film. Further, a polymer latex layer was applied on the back layer of samples 501 to 530 and dried to prepare samples 531 to 560. When the protease activity of these samples was measured in the same manner as in Samples 331 to 360, similar evaluation results were obtained. In addition, these samples did not curl or the like, and were very good in handling of the thin film.
  • Example 18 Protease measurement using photographic film
  • Neopan F black-and-white film for photography: manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.
  • the film was developed, fixed, washed with water and dried in a usual manner.
  • this photographic film as a gelatin thin film for protease measurement, a section of the cancer tissue prepared in Example 4 was stuck on the film, and the protease activity was measured in the same manner as in Example 4. went.
  • digestion marks similar to those on the thin film prepared by staining in Example 4 were observed as white portions.
  • the detection performance was inferior to the thin films manufactured in Example 1, Example 2, Example 10, Example 11, Example 15, and Example 17.
  • Example 19 Measurement of protease using radiographic emulsion and measurement results
  • a biological sample a tissue sample of gingiva, gingival crevicular fluid, and periodontal disease collected from a patient with periodontal disease was subjected to approximately frozen sectioning. It was installed on a slide glass.
  • the method of the present invention is characterized in that a protease, which is derived from a specific site localized in a tissue or an individual cell in a tissue, can be accurately and simply measured, and can be determined in a short time. Therefore, the method of the present invention can be used for accurate diagnosis of cancer cell aggressiveness such as invasiveness and metastatic activity, periodontal disease progression such as periodontitis, and pulmonary disease such as rheumatism and alveolar abscess. Useful. Further, according to the method of the present invention, the protease activity can be measured from an extremely small amount of sample, and the thin film after the determination can be permanently stored as a fixed sample.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書 プロテア—ゼの測定方法及び該方法に用いる薄膜
技術分野
本発明は、 プロテア一ゼの測定方法に関するものである。 より具体的には、 癌 細胞の浸潤活性や転移活性などの癌の悪性度、 歯周炎などの歯周病の進行度、 リ ゥマチ性関節炎などにおける破壊性病態などの正確な診断を可能にするプロテア一 ゼの測定方法に関するものである。 従来の技術
腫瘍の良性、 悪性の相違を規定する因子の一つとして、 間質結合組織への浸潤 の有無を挙げることができる。 この病態を明らかにするためには、 腫瘍細胞自体 の増殖動態の変化を観察すると同時に、 腫瘍細胞と間質結合組織との相互作用に 影響を及ぼす要因を検索することが必要である。 特に、 腫瘍細胞の浸潤や転移に はプロテア一ゼが関与することが明らかにされており、 プロテア一ゼを制御する ことによつて悪性腫瘍細胞の浸潤や転移を抑制できる可能性がある。 このような プロテアーゼ （細胞外マ卜リ ックス分解酵素） のうち、 特にマトリ ックス . メタ 口プロテアーゼ（imp) が癌細胞の増殖、 浸潤、 血管新生に重要な役割をはたすこと が明らかにされている （鶴尾隆編 「癌転移の分子機構」 、 第 8章、 宮崎香著 「マ 卜リックス 'プロテアーゼと癌の浸潤 ·転移」 、 pp. 92-107 、 メジカルビユ一社、 1993年発行を参照） 。
一方、 歯周病では歯肉溝上皮の破壊及びコラーゲンを主体とした結合組織の破 壊が初期病変として進行するが、 この組織の破壊にもマトリ ックス · メタ口プロ テアーゼが関与していることが知られている （歯周組織破壊におけるプロテア一 ゼの関与、 及び病態とプロテアーゼとの相関については、 青野正男監修 「歯周治 療の科学」 、 白川正治著、 第 VI I 章 「歯周組織の病理」 、 pp. 99 〜109 、 医歯薬出 版、 並びに、 長谷川ら、 「歯周病患者における歯肉溝滲出液 (GCF) 中のゲラチナー ゼ活性」 、 演題 A- 44、 日本歯周病学会第 37回秋期学術大会などを参照） 。 マトリ ックス · メタ口プロテアーゼはコラーゲン、 プロテオグリカン、 ラミニ ン、 フイブロネクチン、 及びゼラチンなどの細胞外基質を分解する酵素であり、
MMP-1, 2, 3， 7, 9 及び 10など 8種類の存在が明らかにされている。 間質型コラ一 ゲナ一ゼ（MMP - 1) は最も古くから知られているマトリックス · メ夕口プロテア一ゼ であり、 繊維芽細胞や軟骨などに分布しており、 間質型のコラーゲンを 1,'4 及び 1 '3 に切断する。 歯周病においては、 主として MMP- 2 (ゼラチナ一ゼ A) 及び MMP -9 (ゼラチナーゼ B) が歯周組織の構成成分である IV型コラーゲン、 ラミニン、 フ イブロネクチン、 及びプロテオグリカンなどを破壊する。 なお、 マトリ ックス . メタ口プロテア一ゼの分泌は、 細胞増殖因子である EGF や TGF - ySによって強く促進 されており、 他方、 組織内の内在性インヒビタ—によって分泌や活性発現が制御 されている。 もっとも、 増殖因子が関与した場合にその発現がどのように抑制さ れるのかは必ずしも明らかではない。
また、 腫瘍細胞の浸潤や転移に関与する他のプロテア一ゼとしては、 セリンブ 口テアーゼであるプラスミノ一ゲン 'ァクティベータ一（PA)を挙げることができる。 このプラス ミ ノーゲン ， ァクティべ一ターはプラスミ ノーゲンをプラス ミ ンに変 換する酵素であり、 プラスミノーゲン .ァクティベータ一の作用により生成した プラスミ ンがプロメタ口プロテアーゼを活性型メ夕口プロテア一ゼに変換する。 従って、 マトリ ックス · メ夕口プロテアーゼとプラスミ ノーゲン ·ァクティべ一 ターとの間で形成されるカスケードによって、 癌細胞の浸潤や転移が進行な L、し は加速されると考えられる。
プロテアーゼは、 上記の癌細胞の浸潤及び転移、 並びに歯周病の進行のほか、 歯槽膿漏による骨組織や歯根膜の破壊、 リゥマチ性関節炎による骨膜や骨組織の 破壊などの破壊性病変に関与している可能性がある （リウマチにおけるプロテア一 ゼの関与に関しては、 日本臨床、 50(3), pp. 463-467, 1992 を参照） 。 従って、 細 胞ゃ組織中のプロテア一ゼを定量することによって、 浸潤活性及び転移活性など からみた癌細胞の悪性度や歯周病の病態、 及びリゥマチなどの破壊性病変の進行 程度を正確に診断することが可能である （癌細胞の浸潤度とプロテア一ゼ活性と の相関については、 例えば、 Yamagata, et al. , Cancer Lett. , 59, 51， 1991 ; Azzani, et al. , J. Natl. , Cancer Inst. , 85, 1758, 1993; Brown, et al.， Clin. Exp. Metastasis, 11, 183, 1993 ; Davies, et al. , Br. J. Cancer, 67, 1126, 1993 などを参照） 。
従来、 プロテアーゼの測定方法としては、 基質の分解の程度から酵素活性を測 定するザィモグラフィ一法や各々のプロテアーゼに特異的な抗体を用いたィムノ プロティ ング法などが利用されている。 例えば、 癌細胞や歯周病化細胞を粉砕し た後、 抽出液をゼラチン含有 SDS-ポリアクリルアミ ドゲルを用いた電気泳動に付し、 電気泳動後のゲルをアミ ドブラックで染色して、 染色されずに白く透明なバンド を与える試料をプロテア一ゼ陽性と判定する方法が知られている。 しかしながら、 この方法では測定毎に SDS-ポリアクリルァミ ドゲルを作成する必要があり、 検出ま でに約 30時間を要するという問題がある。
また、 SDS- PAGEによる電気泳動後にゲルをメンブレンに密着させ、 プロッティ ング後の酵素をモノクローナル抗体で検出する方法もあるが、 電気泳動を利用す る点で上記の方法と同様の欠点を有しており、 それに加えて、 操作に熟練を要す ることと高価なモノクローナル抗体を用いることも問題である。 さらに、 これら の方法は個々の細胞のプロテア一ゼを測定したものではなく、 組織全体のプロテ ァーゼ総量を検出するものであり、 個々の癌細胞の浸潤 ·転移活性の情報を得る ことはできないという問題がある。
最近、 血管組織中のプロテア一ゼ活性をザィモグラフィ—の原理により測定す る方法が提案された (The FASEB Journal, Vol. 9, July, pp. 974-980, 1995) 。 こ の方法では、 蛍光性化合物が結合したカゼィン又はゼラチンをプロテア一ゼの基 質として用い、 この基質を含むァガロースの薄膜をスライ ドグラス上に形成させ た後、 その薄膜の表面に固定化されていない組織切片 （6- 10〃m)をのせて 37°Cで培 養し、 基質の消化を蛍光顕微鏡下に観察する工程を含んでいる （第 975 頁、 右欄第 6〜18行のプロ トコ一ルを参照）。 この方法は、 組織中のプロテア一ゼを直接測 定できる点では優れているものの、 プロテア一ゼの基質をスライ ドグラス上に固 定化するためにァガロースを必須成分として用いる必要があり、 プロテア一ゼに よる基質の消化にばらつきが生じてしまい、 再現性に乏しいという問題があつた。 発明の開示
本発明の目的は、 簡便かつ正確なプロテア一ゼの測定方法を提供することにあ る。 より具体的には、 浸潤や転移活性などの癌細胞の悪性度、 歯周病などの病態、 及びリゥマチなどの破壤性病変の進行度を短時間で正確かつ簡便に判定でき、 癌 の予後や破壊性病変の進行程度などを正確に予測するために有用なプロテアーゼ の測定方法を提供することにある。
また、 本発明の別の目的は、 上記の特徴を有するプロテア一ゼの測定方法であ つて、 被検組織内に局在する癌細胞などに由来するプロテア—ゼを正確に測定す る方法を提供することにある。
さらに本発明の別の目的は、 上記のプロテア一ゼの測定方法に用いる薄膜を提 供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、 ゼラチンなどのプロ テアーゼ基質と硬膜剤とを含む薄膜の表面に癌組織などの組織切片を密着させる か、 あるいは歯周病などの病変組織などから採取した滲出液を該薄膜上に滴下す ると、 試料中に含まれるプロテアーゼが薄膜を消化し薄膜表面に消化痕が形成さ れることを見いだした。 また、 上記の方法がァガロースを含む薄膜を用いる方法
(The FASEB Journal, Vol. 9, July, pp. 974-980, 1995) に比べて非常に再現性 に優れており、 試料中のプロテア一ゼ活性を正確に測定できることを見いだした。 さらに、 連続した組織切片を用いてそれぞれ組織標本と上記の薄膜標本を作成し て比較 ·比較することにより、 組織中の個々の細胞内に発現しているプロテア一 ゼを測定することができることを見いだした。 本発明はこれらの知見を基にして 完成されたものである。
すなわち本発明は、 プロテアーゼの測定方法であって、 （1) プロテア一ゼ基質 と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対してプロテアーゼを含む試料 を接触させる工程；及び (2) プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕 を検出する工程を含む方法を提供するものである。
本発明の第二の態様によれば、 プロテアーゼの測定方法であって、 （1) プロテア— ゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体試料の実質的 に連続した二切片のうちの一つを接触させる工程；（2) プロテア一ゼの作用により 該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び（3) 他の一つの切片から調製した 組織標本と上記消化痕とを対比する工程を含む方法が提供される。
本発明の第三の態様によれば、 プロテア—ゼの測定方法であって、 （1) プロテア一 ゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体試料の実質的 に連続した 2以上の切片のうちの一つを接触させる工程；（2) プロテア—ゼ基質、 硬膜剤、 及びプロテアーゼ ' インヒビタ一を含み支持体表面に形成された薄膜に 対して残りの切片を接触させる工程；（3) プロテア—ゼの作用により該薄膜に形成 された消化痕を検出する工程；及び（4) 工程（1 ) で用いた薄膜の消化痕と工程（2) で用いた薄膜の消化痕とを対比する工程を含む方法が提供される。 この方法の好 ましい態様では、 工程 (2) において、 残りの 2以上の各切片をそれぞれ異なる種類 のプロテアーゼ ' イ ンヒビタ一を含む薄膜に接触させる工程を含んでいる。
本発明の第四の態様によれば、 プロテア—ゼの測定方法であって、 （1) プロテア— ゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体試料の実質的 に連繞した 2以上の切片のうちの一つを接触させる工程； （2) 工程（1) で用いた薄 膜に含まれるプロテア—ゼ基質とは異なるプロテア一ゼ基質と硬膜剤とを含み支 持体表面に形成された薄膜に対して残りの切片を接触させる工程；（3) プロテア— ゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び (4) 工程（1) で用 いた薄膜の消化痕と工程 (2) で用いた薄膜の消化痕とを対比する工程を含む方法が 提供される。 この方法の好ましい態様では、 工程 (2) において、 残りの 2以上の各 切片をそれぞれ異なる種類のプロテア一ゼ基質を含む薄膜に接触させる工程を含 んでいる。
本発明の第五の態様によれば、 プロテアーゼの測定方法であって、 （1 ) 少なく とも下記の 2層： プロテアーゼ基質、 硬膜剤、 及びプロテアーゼ . インヒビター を含み支持体表面に形成された（a) 層と、 プロテア一ゼ基質及び硬膜剤を含み（a) 層に積層された（b) 層とを含む薄膜に対してプロテア一ゼを含む試料を接触させ る工程；（2) プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程； 及び (3) (a) 層の消化痕と（b) 層の消化痕とを対比する工程を含む方法が提供され る。
本発明の第六の態様によれば、 （1 ) 少なくとも下記の 2層： プロテア一ゼ某質及 び硬膜剤を含み支持体表面に形成された（a) 層と、 （a) 層に含まれるプロテアーゼ 基質とは異なるプロテア一ゼ基質及び硬膜剤を含み（a) 層に積層された（b) 層とを 含む薄膜に対してプロテア—ゼを含む試料を接触させる工程；（2) プロテア—ゼの 作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び (3) (a) 層の消化痕と (b) 層の消化痕とを対比する工程を含む方法が提供される。
これらの方法では、 プロテアーゼを含む試料や生体試料は、 支持体に接触する ことなく薄膜の表面に接触することを特徴としている。
本発明のさらに別の態様によれば、 上記の各方法において定義されたプロテア一 ゼ測定用の薄膜が提供される。
これらの発明の好ましい態様によれば、 プロテア一ゼ基質が、 コラーゲン、 ゼ ラチン、 プロテオグリカン、 フイブロネクチン、 ラ ミニン、 エラスチン、 及び力 ゼィンからなる群から選ばれる上記の各方法及び薄膜；該試料が患者から分離 · 採取した生体試料である上記の各方法及び薄膜；生体試料が癌組織切片、 歯肉溝 滲出液、 又は破壊性病変組織切片若しくは抽出液 （例えば、 リウマチ性病変組織 抽出液又は歯槽膿漏組織抽出液） である上記の各方法及び薄膜； プロテア—ゼが マ ト リ ックス · メタロプロテアーゼである上記の各方法及び薄膜；消化痕を染色 により検出する上記の各方法及び薄膜；金属、 金属酸化物、 顔料、 及び染料から なる群から選ばれ、 400 nmから 700 nmの波長領域の最大透過濃度が 0. 01 以上の物 質の 1種又は 2種以上を含む薄膜を用いて検出を行う上記の各方法；並びに、 プ 口テア一ゼ基質としてゼラチンを用い、 消化痕をアミ ドブラック又はクマジ一ブ ルーでゼラチン染色する上記の各方法及び薄膜が提供される。
本発明の薄膜の好ましい態様によれば、 金属、 金属酸化物、 顔料、 及び染料か らなる群から選ばれ、 400 nmから 700 nmの波長領域の最大透過濃度が 0. 01 以上の 物質の 1種又は 2種以上を含む上記薄膜；支持体がスライ ドグラス又はポリェチ レンテレフタレー トフイルムから選ばれる上記薄膜；上記支持体と上記薄膜との 間に下塗り層が設けられた上記薄膜；並びに、 上記薄膜が感光 ·現像 ·定着処理 後の写真フィルムである上記薄膜も提供される。
本発明の別の態様により、 上記のそれぞれの方法において定義された各工程に 従ってプロテア一ゼが関与する疾患を診断する方法が提供される。 この発明の好 ましい態様として、 該疾患が、 癌、 リウマチ性疾患、 歯周病、 及び歯槽膿漏から なる群から選ばれる疾患である上記方法が提供される。 発明を実施するための最良の形態
上記の各態様のプロテア—ゼの測定方法は、 基本的には、 プロテアーゼを含む 試料を薄膜と接触させる工程 （第一工程） と、 プロテアーゼの作用により該薄膜 上に形成された消化痕を検出する工程 （第二工程） を含んでいる。 この方法に用 いられるプロテア—ゼ測定用の薄膜は、 基本的には、 支持体表面上に単層又は多 重層として形成されており、 プロテアーゼ基質と硬膜剤とを必須の成分として含 むことを特徴としている。 従って、 本発明の方法に従うと、 試料と薄膜との接触 工程の当初においては、 試料と支持体とが接触しないという特徴がある。 また、 上記の薄膜は硬膜剤を含有しており、 ァガロースのようなバインダ一が存在しな いために、 プロテアーゼにより消化されるゼラチンなどのプロテア一ゼ基質の膜 中密度が高く、 例えばゼラチンなどのプロテア一ゼ基質の架橋により消化痕の形 態の崩れが防止されるので、 プロテアーゼの測定感度や測定の再現性に優れると いう特徴を有している。
本明細書において用いられる測定方法という用語は、 定性及び定量を含めて最 も広義に解釈されるべきである。 本発明の方法では、 試料中に含まれるプロテア一 ゼによってプロテア一ゼ基質が消化され、 薄膜上に消化痕が形成される。 この消 化痕は、 例えば、 必要に応じて適宜の染色などを行った後に顕微鏡下で検出する ことができ、 試料中のプロテアーゼの存在を証明することができる。
本発明の方法の測定対象となるプロテア一ゼとしては、 例えば、 マトリックス - メタ口プロテア一ゼ （MMP)及びマトリックス 'セリンプロテアーゼ （MSP)を挙げる ことができる。 これらの酵素については、 鶴尾隆編 「癌転移の分子機構」 、 pp. 92 -107 、 メジカルビユ ー社、 1993年発行に詳細に説明されている。 本発明の方法に 特に好適なプロテアーゼとして、 例えば、 間質型コラ一ゲナ一ゼ（MMP-1) 、 ゼラチ ナーゼ A ( MP-2). 及びゼラチナーゼ B (MMP- 9)などのマトリックス .メタ口プロ テアーゼ；及びプラスミノ一ゲン 'ァクティべ一ター（PA)などのマトリックスセリ ンプロテアーゼを挙げることができるが、 本発明の方法の対象はこれらのプロテ ァーゼに限定されることはない。
プロテア一ゼ基質は、 プロテア一ゼの基質として分解される高分子化合物であ れば特に限定されない。 例えば、 コラーゲン、 ゼラチン、 プロテオグリカン、 フ ィブロネクチン、 ラミニン、 エラスチン、 又はカゼィンなどを用いることができ る。 好ましくは、 コラーゲン、 ゼラチン、 フイブロネクチン、 エラスチン、 又は カゼインを用いることができ、 より好ましくはゼラチン、 フイブロネクチン、 又 はカゼィンを用いることができる。 プロテア一ゼ基質は上記の物質の 1種を用い てもよいが、 2種以上を組み合わせて用いてもよい。
2種以上の異なるプロテア一ゼ基質を組み合わせて用いることにより、 生体試 料中に含まれるプロテアーゼの種類を正確に特定できる場合がある。 例えば、 生 体試料中の実質的に連続した 2以上の切片のうちの一つをプロテア一ゼ基質を含 む薄膜に接触させ、 残りの切片を上記の薄膜に含まれるプロテアーゼ基質とは異 なるプロテア一ゼ基質を含む他の薄膜に接触させた後、 それぞれの薄膜に形成さ れた消化痕を対比する方法を採用することができる。 この方法では、 異なるプロ テア一ゼ基質をそれぞれ含有する 3以上の薄膜を用いて測定を行なうことが可能 である。 また、 例えば、 プロテア一ゼ基質を含有する第一の層と、 第一の層に含 まれるプロテア一ゼ基質とは異なるプロテア一ゼ基質を含有する第二の層とを含 む単一の薄膜を製造し、 プロテアーゼを含む試料を接触させた後に、 それぞれの 層に形成された消化痕を対比する方法を採用してもよい。 この方法では、 異なる 種類のプロテア一ゼをそれぞれ含有する 3以上の層を積層した薄膜を用いること も可能である。
また、 プロテアーゼ . インヒビ夕一を用いることにより、 インヒビタ一に関連 するプロテアーゼの同定やプロテア一ゼの特性の判定が容易になる場合もある。 プロテア一ゼ ·インヒビ夕一としては、 例えば、 ティ ッシュ ·インヒビター ·ォ ブ · メタプロテアーゼ 1 (ΤΙΜΡ1 )、 ティ ッシュ 'インヒビター 'ォブ 'メタブロテ ァ一ゼ 2 (ΤΙΜΡ2)、 ラージ ·インヒビター 'ォブ ' メ夕口プロテア一ゼ （LIMP) 、 チッキン .インヒビ夕一 .ォブ . メタ口プロテアーゼ （ChIMP)、 ォポスタチン、 血 小板第 IV因子 （PF- 4) 、 α 2 マクログロブリ ン、 EDTA、 1, 10- フヱナン卜口リ ン、 BB94、 ミノサイク リ ン、 マ トリスタチン、 SC- 44463、 又は、 ジチォトレイ トール (DTT)などを挙げることができる。 例えば、 生体試料中の実質的に連続した 2以上 の切片のうちの一つをプロテア一ゼ基質を含む薄膜に接触させ、 残りの切片をプ 口テアーゼ基質とプロテアーゼ ·ィンヒビターとを含む他の薄膜に接触させた後、 それぞれの薄膜に形成された消化痕を対比する方法を採用することができる。 ま た、 例えば、 プロテア—ゼ基質を含有する第一の層と、 プロテアーゼ基質とプロ テアーゼ 'インヒビターとを含有する第二の層を含む単一の薄膜を製造し、 プロ テアーゼを含む試料を接触させた後に、 それぞれの層に形成された消化痕を対比 する方法を採用してもよい。 プロテア一ゼ ·インヒビタ一を用いる上記の方法と、 2種以上の異なるプロテア—ゼを組み合わせて用いる上記の方法とをさらに組み 合わせてもよい。
本発明の薄膜の製造に用いられる硬膜剤は、 上記のプロテアーゼ基質の薄膜の 製造において薄膜の硬化を促進し、 及びノ又は形成後の薄膜の膨潤を防止する作 用を有している。 硬膜剤の種類は、 上記の作用を有し、 かつ、 プロテア一ゼとプ 口テアーゼ基質との反応を実質的に阻害しない限り特に限定されず、 無機又は有 機の硬膜剤のいずれを用いてもよい。 例えば、 クロム塩 （クロム明ばん、 酢酸ク ロムなど） ； アルデヒ ド類 （ホルムアルデヒ ド、 グリオキサール、 グリ タールァ ルデヒ ドなど） ； N -メチ口一ル化合物 （ジメチ口一ル尿素、 メチロールジメチルヒ ダントインなど） ； ジォキサン誘導体 （2, 3-ジヒ ドロキシジォキサンなど） 、 カル ボキシル基を活性化することにより作用する化合物類 （カルべ二ゥム、 2-ナフタレ ンスルホナー ト、 1,卜ビスピロリジノ -1- クロ口- 、 ピリジニゥム、 1-モルホリノ カルボニル- 3- (スルホナトアミ ノメチル） -など） ；活性ビニル化合物 （1, 3-ビスビ ニルスルホニル -2- プロパノール、 1, 2-ビス （ビニルスルホニルァセトアミ ド） ェ タン、 ビス （ビニルスルホニルメチル） エーテル、 ビニルスルホニル基を側鎖に 有するビニル系ポリマー、 1, 3, 5-トリァクリロイル- へキサヒ ドロ- S- トリアジン、 ビス （ビニルスルホニル） メタンなど） ；活性ハロゲン化合物 （2, 4-ジクロル - 6 - ヒ ドロキシ- s- トリアジン及びそのナトリウム塩など） ；ムコハロゲン酸類 （ム コクロル酸、 ムコフエノキシクロル酸など） ； ィソォキサゾール類； ジァルデヒ ド澱粉；又は、 2-クロル - 6- ヒ ドロキシトリアジニル化ゼラチンなどの硬膜剤を単 独でまたは 2種以上を組み合わせて用いることができる。 これらのうち、 ビニル スルホン酸型硬膜剤が好ましい。 硬膜剤の使用量は特に限定されないが、 例えば、 プロテアーゼ基質としてゼラチンを用いる場合には、 検出性能の点からゼラチン
100 gに対して 0. 1〜20 mmol 、 さらに好ましくは 0. 3〜10 mmol 程度を配合す るのがよい。
本発明の方法に用いる試料としては、 例えば、 ヒ トを含む哺乳類動物から分離 . 採取した生体試料を用いることができる。 生体試料としては、 組織又は組織滲出 液などを用いることができる。 例えば、 肺癌、 胃癌、 食道癌、 乳癌、 脳腫瘍など の固形癌組織から手術や組織検査などにより分離 ·採取した癌組織、 リウマチ性 関節炎の滑膜や骨組織、 及び歯槽膿漏の歯根膜や骨組織などの破壊性病変組織や 滲出液、 並びに歯周病の歯肉溝滲出液などを用いることができる。
試料が組織の場合には、 例えば、 液体窒素で急速凍結した試料から凍結切片作 成装置を用いて厚さ 1〜10 /ζ ιη 、 好ましくは 5 / m 程度の切片を調製し、 この切片 を薄膜に貼付することによって試料と薄膜とを接触させることができる。 また、 リウマチ性関節炎の患者から採取した滑膜液を試料として用いる場合には、 滑膜 液約 5〜50 1 、 好ましくは 20 // 1 程度を薄膜上に滴下すればよい。 歯周病の歯肉 溝滲出液を試料として用いる場合には、 歯肉溝内に濾紙を揷入して約 5〜10 1 程度の歯肉溝滲出液を採取し、 該濾紙を薄膜に貼付する方法を採用することがで きる。 歯肉溝滲出液の採取後、 必要に応じて蒸留水や適宜の緩衝液 （例えば、 50 mM Tris-HCl, H 7. 5， 10 mM CaCl。， 0. 2 M NaCl など） を用いて濾紙から歯肉 溝滲出液を抽出し、 抽出液を薄膜上に滴下してもよい。
組織内のプロテア一ゼの存在を顕微鏡下で観察できるように、 薄膜は透明又は 半透明の支持体上に形成されることが好ましい。 このような透明又は半透明の支 持体としては、 例えば、 ガラス、 又はポリエチレンテレフ夕レート、 ポリカーボ ネー ト、 ポリイ ミ ド、 ナイロン、 セルロース、 若しくは ト リアセテー ト等からな る透明又は半透明プラスチックフィルムなどを用いることができる。 ガラスとし ては顕微鏡用のスライ ドグラスを用いることが好ましく、 プラスチックフィルム としてはポリエチレンテレフ夕 レー トフイルムを用いることが好ましい。 もっと も、 支持体はこれらに限定されることはなく、 均一な薄膜を製造することができ、 検鏡に適するものであればいかなるものを用いてもよい。 また、 歯肉溝滲出液などの試料溶液を薄膜表面に滴下すると、 滴下により形成 される円形の塗布面の円周に沿って消化痕が検出される場合がある。 このような 場合には必ずしも顕微鏡下での検出を必要としないので、 上記の支持体に加えて、 不透明な支持体を用いることも可能である。 例えば、 紙、 合成紙、 合成樹脂 （例 えば、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ポリスチレン、 ポリエチレンナフタレ一 ト等） をラ ミネートした紙、 金属板 （例えば、 アルミニウム、 アルミニウム合金、 亜鉛、 鉄、 銅などの板） 、 上記の金属がラミネート又は蒸着された紙やプラスチ ックフィルムなどを用いることができる。 このような態様においては支持体に着 色が施されていてもよい。
支持体の厚さは特に限定されないが、 ガラスの場合にはスライ ドグラス程度の 厚さのもの （例えば 2〜3 ram程度） が好ましく、 ポリエチレンテレフタレ一 トフィ ルムの場合には約 100〜250 u m 、 より好ましくは約 150〜200 、 特に好まし くは 175 / in 程度のものを用いることができる。 該支持体上の薄膜は単層又は重層 で形成することができるが、 薄膜はできる限り均一な表面を与えるように調製す べきである。 例えば、 乾燥後の膜厚が l〜10 / m 、 好ましくは 4〜6 i m 程度にな るように調製することが好ましい。
薄膜の調製には、 例えば、 水、 又はメチレンク口ライ ド、 アセトン、 メタノー ル、 エタノール、 若しくはそれらの混合溶媒などの有機溶媒に分散したプロテア一 ゼ基質を支持体表面に塗布して乾燥すればよい。 塗布方法としては、 例えば、 デ イ ッブ塗布法、 口一ラー塗布法、 カーテン塗布法、 押し出し塗布法などを採用す ることができる。 もっとも、 薄膜の調製方法はこれらに限定されることはなく、 例えば、 写真用フィルムの技術分野などにおいて汎用されている薄膜形成方法な どを適宜採用することが可能である。 なお、 プロテアーゼ基質としてゼラチンを 用いる場合には、 ゼラチンの種類は特に限定されず、 例えば、 牛骨アルカ リ処理 ゼラチン、 豚皮膚アルカリ処理ゼラチン、 牛骨酸処理ゼラチン、 牛骨フタル化処 理ゼラチン、 豚皮廣酸処理ゼラチンなどを用いることができる。
薄膜を支持体上に形成するにあたり、 薄膜と支持体との接着を改善するために、 薄膜と支持体表面との間に下塗り層を設けてもよい。 例えば、 塩化ビニル、 塩化 ビニリデン、 ブタジエン、 メタクリル酸、 ァクリル酸、 ィタコン酸、 無水マレィ ン酸等から選ばれるモノマーの 1種又は 2種以上を重合させて得られる重合体又 は共重合体、 ポリエチレンィ ミ ン、 エポキシ樹脂、 グラフ 卜化ゼラチン、 又は二 トロセルロースなどの重合体を下塗り層として形成することができる。 また、 ポ リエステル系支持体を用いる場合には、 下塗り層に替えて、 支持体表面をコロナ 放電処理、 紫外線処理、 又はグロ—放電処理することによつても、 支持体と薄膜 との接着力を改善できる場合がある。
本明細書において用いられる 「支持体表面上に形成された薄膜」 という用語ま たはその同義語については、 このような 1又は 2以上の下塗り層及び/又は支持 体表面の処理を排除するものと解釈してはならない。 もっとも、 薄膜と支持体と の接着を改善するための手段は上記のものに限定されることはなく、 例えば、 写 真用フィルムの技術分野などにおいて汎用されている手段を適宜採用することが できる。
また、 薄膜を製造する際に、 上記の成分に加えて、 染料、 顔料、 防腐剤、 安定 化剤などの成分を適宜配合してもよい。 このような成分は、 プロテア一ゼとプロ テア一ゼ基質との反応を実質的に阻害しない限り、 適宜のものを選択して用いる ことが可能である。 染料としては、 例えば、 特開平 6- 102624号公報に記載された染 料 （第 9頁 1-1より第 47頁 63までの化学構造式により具体的に示された染料） を用 いることができ、 染料の添加方法は、 例えば、 特開平 5- 313307号公報に記載された 方法 （第 11頁段落番号 [0037]から第 12頁段落番号 [0044]までに具体的に説明された 方法） を採用することができる。 染料や顔料を添加することにより消化痕の検出 が容易になる場合があるが、 このような目的のためには、 染料や顔料のほか、 金 厲ゃ金属酸化物を配合してもよい。 金属、 金属酸化物、 染料、 顔料などの物質を 添加する場合には、 製造後の薄膜が 400 nm から 700 nm までの波長領域の最大透 過濃度が 0. 01 以上であることが好ましい。 これらの物質の 1種又は 2種以上を薄 膜に配合することができ、 薄膜を形成する各層にそれぞれ異なる物質、 例えば色 の異なる染料などを配合してもよい。 なお、 薄膜の製造にあたりァガロースを用 いるとプロテア一ゼ検出の再現性が低下するので、 本発明の薄膜の製造にァガロー スを用いることは好ましくない。
本発明の方法では、 例えば、 組織切片を薄膜に貼付するか、 あるいは液体試料 を薄膜上に滴下することによって薄膜とプロテアーゼを含む試料とを接触させた 後、 好ましくは 37°Cの湿潤箱内で、 組織切片については例えば 1〜24時間、 好まし くは 2〜12時間、 さらに好ましくは 3~6 時間程度、 液状試料については 0. 5~12 時間、 好ましくは 1~6 時間、 さらに好ましくは 1〜3 時間程度ィンキュペートす る。 試料中にプロテア—ゼが含まれる場合には、 薄膜内のプロテアーゼ基質がプ 口テア一ゼによって分解され、 薄膜上に消化痕が形成される。 必要に応じて薄膜 を染色した後、 肉眼や顕微鏡下で消化痕を観察することにより、 プロテアーゼの 存在を証明することができる。 また、 分光光度計による光分解を利用して評価を 行ってもよい。
プロテアーゼ基質としてゼラチンを用いる場合には、 ゼラチン染色後に消化痕 を観察することが好ましい。 ゼラチン染色は、 例えば、 1%アミ ドブラックゃクマジ一 ブル一などを用いて、 常法に従って行うことができる。 例えば、 アミ ドブラック を用いたゼラチン染色では、 ゼラチン薄膜は黒紺色に染色されるが、 プロテア一 ゼによりゼラチン薄膜上にゼラチン消化痕が形成されると、 その消化痕の部分に はゼラチンが存在しないので、 染色されない白抜き部分が現れる。 写真用フィル ムの表面にはゼラチン薄膜が形成されているので、 写真用フィルム （例えばネオ パン F、 富士写真フィルム株式会社製） を感光させて通常の現像、 定着、 水洗、 乾燥処理を行ったものを薄膜として用いてもよい。 この場合には、 感光した黒色 のフィルム上に消化痕が白抜き部分として観察できる。
本発明の方法の別の態様に従えば、 癌組織などから連続凍結切片を作成し、 実 質的に連続した二切片のうちの一方の切片を、 例えば、 へマトキシリ ン .ェオシ ン染色切片などの通常の組織標本として調製し、 他の切片を本発明の測定方法に 従って処理し、 両者の観察結果を比較 ·対比することによって組織中の個々の細 胞に由来するプロテア一ゼの存在を正確に把握することが可能である。 このよう なプロテアーゼの測定方法により、 組織中に存在する個々の癌細胞の悪性度 （浸 潤活性及び転移活性など） を正確に判定することが可能であり、 癌疾患の予後に ついての的確な判定が可能になる。 また、 リウマチ性関節炎の関節液や歯肉溝滲 出液などの試料中のプロテアーゼを定量することにより、 これらの疾患の病態や 進行程度を正確に判定することができるが、 試料中のプロテア—ゼ定量のために は、 予め作成した標準溶液を用いて検量線を作成することが好ましい。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれ らの実施例に限定されることはない。
例 1 ： プロテア—ゼ測定用薄膜の製造
牛骨アルカリ処理ゼラチン 10 g を純水 127 gに溶解し、 硬膜剤として 1, 2 -ビス (ビニルスルホニルァセトアミ ド） ェタン（2¾) 0. 8 ml を添加した。 この溶液を下 塗りを施したポリエチレンテレフタレ一卜フィルム上に乾燥膜厚が約 5 m になる ように均一に塗布し、 乾燥してゼラチン薄膜とした。 ゼラチン薄膜は使用時まで 室温で保存した。 例 2 ： プロテアーゼ測定用薄膜の製造
例 1 と同様にして牛骨アル力リ処理ゼラチン溶液を調製し、 この溶液をスライ ドグラス上に乾燥膜厚が約 6 // Π1 となるように均一に塗布し、 乾燥してゼラチン薄 膜を製造した。 また、 牛骨アルカリ処理ゼラチンに替えて、 豚皮膚アルカリ処理 ゼラチン、 牛骨酸処理ゼラチン、 牛骨フタル化処理ゼラチン、 豚皮庸酸処理ゼラ チン （シグマ社製 #G2625)、 及び豚皮庸酸処理ゼラチン （シグマ社製 #G2500)をそ れぞれ用いて、 同様に各ゼラチン薄膜を製造した。 例 3 ： プロテアーゼ活性測定
プロテア一ゼ液体試料として、 マトリックス ·メ夕口プロテアーゼ （J1MP) - 1、 MMP -2 及び MMP- 9 (ャガイ社製） をそれぞれ 2 pg/mlから 200 ng/mlの濃度で含む溶 液を用いた。 また、 生体試料としては、 歯周病患者から採取した歯肉、 歯肉溝滲 出液（GCF : Gingival Crevicular Fluid) . 及び歯周病原菌 (P. gingivalis #381 株； actinomycetemcomitans Y4 株；及び P. intermedia ATCC 25611 株） を培 養した上清を用いた。 例 2で得たそれぞれのゼラチン薄膜上に液体試料約 10 / 1 を滴下し、 組織試料は約 5 m の凍結切片として各ゼラチン薄膜上に貼付した。 ゼ ラチン薄膜を湿潤箱内に入れて 37°Cで 4〜16時間インキュベートし、 その後、 クマ ジ一ブル一で染色した。
この結果、 いずれのゼラチン薄膜にもプロテアーゼによるゼラチンの消化によ つて染色されない部位 （白抜きの部分：ゼラチン消化痕） が認められた。 特に、 牛骨フタル化処理のゼラチン薄膜は液体試料の場合に顕著なゼラチン消化を与え、 豚皮膚酸処理のゼラチン薄膜も液体試料及び組織切片に対して強いゼラチン消化 痕を与えた。 MMP- 1、 MP-2 及び MMP 9について、 4時間後に 200 ng/mU 8時間 後に 20 ng/ ml. 16時間後に 20-200 pg/ml の濃度範囲でプロテアーゼ活性が認めら れた。 歯肉溝滲出液の多くはプロテアーゼ活性を認めるまでに約 8〜16時間を要し、 プロテアーゼの量が 2 pg/mlから 20 ng/ml の範囲であることが示唆された。 また、 組織切片でのプロテアーゼ活性は、 内縁上皮、 外縁上皮、 及び上皮下結合組織中 の炎症性細胞浸潤が強い部位に認められた。 例 4 ：癌組織のプロテアーゼ活性測定
被検組織試料として舌扁平上皮癌、 肺癌、 及び食道癌の手術標本を厚さ約 0. 5 cm X幅 2 cm の大きさに切り出し、 液体窒素で急速凍結して- 80 °Cで保存した。 この標本から凍結切片作成装置を用いて厚さ 5 m の連続切片を作成し、 一枚をス ライ ドグラスに張り付けて乾燥させた後、 10% ホルマリンで 5分間固定し、 その後、 常法に従ってへマトキシリ ン 'ェオシン染色を行った。 他の連続切片を例 2及び 例 3で製造した各ゼラチン薄膜上に貼付し、 湿潤箱に入れて 37 で 3〜6 時間ィ ンキュベー ト した。
インキュべ一卜終了後にゼラチン薄膜を アミ ドプラック溶液で染色し、 乾 燥した後に検鏡した。 プロテアーゼ活性が発現している部分は白抜きのゼラチン 消化痕を与えており、 一方、 他の部分は濃い青黒色であった。 いずれの癌組織に も癌胞巣を形成する個々の癌細胞にゼラチン消化痕が認められたが、 特に癌胞巣 辺縁に位置する細胞に強いゼラチン消化痕が認められた。 正常扁平細胞ではゼラ チンの消化が弱いながらも認められたが、 この上皮が異型増殖するに従ってゼラ チンの消化が強く認めらた。 例 5 ：症例 （口腔上顎歯肉癌） 標本中の癌細胞は胞巣構造を形成する低分化型扁平上皮癌で、 骨組織を破壊し て強い浸潤を示していた。 癌胞巣中の癌細胞に対応するゼラチン薄膜は消化され てゼラチン薄膜標本上に白抜きのゼラチン消化痕を与えていたが、 特に癌胞巣の 辺緣に位置する細胞に対応する部位に強いゼラチン消化痕が認められた。 標本中 の巣状の炎症性細胞浸潤部位に対応する部分には、 強 t、顆粒状のゼラチン消化痕 が生じていた。 癌胞巣を拡大して観察すると、 癌胞巣辺縁に位置する増殖域の細 胞に強いゼラチン消化痕が認められ、 癌胞巣に隣接する間質の繊維芽細胞にも顆 粒状にゼラチンの消化痕が認められた。 例 6 ：症例 （舌癌）
標本中の癌細胞は未分化型扁平上皮癌で大小の癌胞巣が存在していた。 癌胞巣 の辺縁部の癌細胞に対応する部位にいずれにも強いゼラチン消化痕が認めら、 癌 の増殖域の細胞に相当する部位ではゼラチンの消化痕が顕著であった。 巣状の炎 症性細胞浸潤巣に対応する部分にも顆粒状のゼラチン消化痕が認められた。 例 7 ：症例 （口腔粘膜の高度上皮異形成症）
へマトキシリ ン .ェォシン染色標本では、 上皮に高度上皮異形成症が認められ、 棘細胞層の肥厚と基底細胞の重層化が生じていた。 特に基底細胞には多形成ゃ異 型性の細胞増殖が認められた。 ゼラチン薄膜上では、 肥厚した棘細胞層及び顆粒 細胞層に対応する部分に強いゼラチン消化痕を認めたが、 基底細胞層では点状に ゼラチン消化痕を認めたのみであった。 この結果は、 上皮細胞のターンオーバ一 が盛んに行われており、 一方、 基底細胞では上皮化結合織への浸潤が生じている ことを示している。
棘細胞の肥厚と重層化した基底細胞を拡大して観察すると、 いずれの細胞層に 対応する部分にもゼラチン消化痕が認められたが、 特に、 棘細胞と重層化基底細 胞に対応する部分ではゼラチンが顕著に消化されていた。 一方、 単層又は 2層の 基底細胞ではゼラチンの消化が重層化基底細胞より弱かった。 また、 重層化した 基底細胞は紡錘形となり、 細胞の多形成ゃ異型性が認められたが、 異型性を示す 増殖傾向の細胞に対応する部分はゼラチン薄膜上に強いゼラチン消化痕を形成し ていた, 例 8 ：液状試料のプロテアーゼ活性測定
リウマチ患者の滑膜液約 20 1 をゼラチン薄膜上に滴下し、 37°Cの湿潤箱内で 1〜3 時間インキュベートした。 その後、 ゼラチン薄膜を 1¾ アミ ドブラックで染 色したところ、 滴下によりゼラチン薄膜上に形成された円形の塗布跡の円周に強 いゼラチン消化痕が認められた。 特に、 牛骨フタル化処理のゼラチン薄膜を用い た場合には特に顕著なゼラチン消化痕が観察できた。 例 9 ：歯周病におけるプロテア—ゼ活性測定
歯面の唾液及びブラークを可及的に綿球で除去して簡易防湿した後、 ペリオペ一 パーを歯肉溝に挿入して 90秒間静置し、 歯肉溝滲出液 （約 5〜10 1 程度） をペリ オペ—パ—に吸い取らせた。 このペリオペーパーを 150 1 の緩衝液 （50 mM Tris
-HC1, H 7. 5, 10 mM CaCl2, 0. 2 M NaCl)で抽出して試料溶液とし、 例 3と同様の 方法に従ってプロテアーゼの測定を行った。 この結果、 歯肉溝滲出液の滴下によ りゼラチン薄膜上に形成された円形の塗布跡の円周に沿って強いゼラチン消化痕 が言忍められた。 例 10： プロテア—ゼ測定用薄膜の製造
牛骨アル力リ処理ゼラチン g を純水 123 gに溶解し、 硬膜剤として 1, 2-ビス (ビニルスルホニルァセトアミ ド） ェタン（« 水溶液） 0. 6 mlを添加した。 この溶 液をスライ ドグラス上に乾燥膜厚が約 7 m になるように均一ワイヤ一バーコ一タ一 を使って塗布し、 乾燥して薄膜 （単層薄膜：試料 101)とした。 薄膜は使用時まで室 温で保存した。 また、 牛骨アルカリ処理ゼラチンの代わりに表 1に示したプロテ ァーゼ基質を使用し、 硬膜剤、 添加剤、 支持体を変更又は追加して、 試料 101と同 様にして試料 102〜130 を作成した。 なお、 塗布の際には必要に応じて塗布助剤を 使用した。 なお、 表中の染料 1はアミ ドブラックを示し、 顔料 1は銅フタロシア ニンを示す。 00
Figure imgf000020_0001
例 11 ： プロテアーゼ測定用薄膜の製造
コラーゲン I溶液 （和光純薬株式会社製、 3 mg 'ml)をスライ ドグラス上に乾燥膜 厚が約 Ι /z ra になるように均一ワイヤ一バーコ一ターを使って塗布し、 乾燥して薄 膜 （単層薄膜：試料 131)とした。 薄膜は使用時まで室温で保存した。 また、 コラ一 ゲン Iの代わりに表 2に示したプロテア—ゼ基質を使用し、 硬膜剤、 添加剤、 支 持体を変更又は追加して、 試料 131と同様にして試料 132〜160 を作成した。 なお、 塗布の際には必要に応じて塗布助剤を使用した。
ブ α テ ア 一 ゼ 基 質 硬 膜 剤 添 加 剤 支 持 体 番号
内 容 内 容 塗 ¾ 内 容 ? 7tj ¾ 内 容
1 31 コラーゲン I 7.0 m 1、 2-ビス (ビコ 0.60g/m2 一 スライドグラス
132 コラーゲンお 7.0/zm 7セト了ミ 工タン 0.60g/m2 一 スライドグラス
】 33 コラーゲンiff l.OiltR 0.60g/m2 スライドグラス
1 34 コラーゲン IV 7.0 im 0.60g/m2 一 スライドグラス
135 コラーゲン V 7. 0.60g/m2 スライドグラス
136 コラーゲン VI 7.0 iim 0.60g/m2 一 スライドグラス
137 コラーゲン νπ l.Oum 0.60g/m2 一 スライドグラス
138 コラーゲン w 0.60g/m2 一 スライドグラス
1 39 コラーゲン K 7.0 zm 0.60g/mJ 一 スライドグラス
1 0 コラーゲンお: 7.0 //in 0.60g/m2 一 スライドク'ラス
1 1 牛骨アルカリ処理ゼラチン 7.0 im 0.60g/m2 一 スライドグラス
142 ブロテオグリカン 7.0 ta 一 スライドグラス
143 フイブロネクチン 7.0 um ― スライドグラス
1 4 ラミニン 7.0 At m 0.60g/nis ― スライドグラス
145 カゼイン 7.0 m o. eog/m2 一 スライドグラス t
146 コラーゲン w 7 m 一 PET
147 コラーゲン IV 7.0 win 一 PET
148 コラーゲン IV 7.0/zm 1.20g/mJ 一 PET
149 コラーゲン IV 7.0jum 0.60g/m2 カーボンブラック PET
1 50 コラーゲン IV 7.0 m 0. Wg/m2 謝 1 PET
15 l コラーゲン IV 7.0 m 0. mg/m11 繊 1 PET
152 コラーゲン IV 7.0 m 0.60g/m! バッファー (Tris-HCl) 0.15g/ra2 PET
153 コラーゲン IV 7.0 j m o. eog/m2 インヒビ夕一 1(T【 P1) 0.156/m2 PET
154 コラーゲン IV 7.0 um 0. dOg/a1 インヒビター 2(TIHP2) 0.15g/m2 PET
155 コラーゲン IV 7.0 m 0.60g/raJ っ ノヒヒタ一 d (,ΕϋΙΑヽ 0. i g/m1 PET
1 57 コラーゲン IV 7.0 im 0. Sf Wg/m1 PET
1 58 コラーゲン IV 7. O m 0.60g/ni2 PET
1 59 コラーゲン IV 7.0/zm 0.60g/m2
1 60 コラーゲン IV 0.60g/m2 PEラミネート紙
o o o
^¾Q 塗布の際にワイヤーバーコ一ターの代わりにスライ ドコ一夕一を使用した他は 試料 121〜130 と同様にして試料 161〜170 を作成した。 なお、 乾燥条件は、 必要 に応じて 10°Cにいつたん冷却した後、 常温常湿で乾燥する方法を採用した。 例 12： プロテアーゼ活性測定
プロテア一ゼ液体試料として例 3に記載した MMP- 2を用い、 例 11で得たそれぞれ の薄膜上に約 10 1 を滴下した。 薄膜を湿潤箱内に入れて 37°Cで 4~16時間インキ ュべ一トし、 その後、 透明な試料はァミ ドプラック溶液で染色した。 活性の評価 方法としては、 それぞれの試料に対して、 ①目視による判定、 ②ミクロデンシ ト メ トリーによる微小部分の濃度測定による判定、 及び③接触式膜厚測定機による 膜厚測定による判定を行った。 結果を表 3に示す。 表 3 試料番号 消化痕 光学濃度 膜厚 （juni)
101 有り 0.08 0.4
102 有り 0.08 0.4
103 有り 0.04 0.2
104 有り 0.08 0.4
105 有り 0.02 0.0
106 有り 0.04 0.4
107 有り 0.02 0.0
108 有り 0.02 0.0
109 有り 0.04 0.4
110 有り 0.02 0.0
111 有り 0.04 0.4
112 有り 0.04 0.4
113 有り 0.02 0.2 114 有り 0.02 0.2 115 有り 0.08 0.4 116 有り 0.02 0.0 117 有り 0.02 0.0 118 有り 0.10 0.5 119 有り 0.02 0.0 120 有り 0.02 0.0 121 有り 0.02 0.0 122 有り 0.02 0.0 123 無し 4.50 7.0 124 無し 4.50 7.0 125 無し 4.50 7.0 127 有り 0.02 0.0 128 有り 0.02 0.0 129 有り 0.02 0.0 130 有り 0.02 0.0 131 有り 0.08 0.4 132 有り 0.08 0.4 133 有り 0.04 0.2 134 有り 0.08 0.4 135 有り 0.02 0.0 136 有り 0.04 0.4 137 有り 0.02 0.0 138 有り 0.02 0.0 139 有り 0.04 0.4 140 有り 0.02 0.0 141 有り 0.04 0.4 142 有り 0.04 0.4 143 有り 0.02 0.2 144 Ήり 八
(J. U. L
14ο Ήり Λ Π 0 U.4
14ο Ήり I). υ. U
147 有り 0.02 0.0
148 有り 0.10 八 0.5「 り 0. U2 υ. υ
IDU り 0.02 1). ϋ
lDl Ήり 0.02 0.0
有り 0.02 0.0
lb し 4.50 7. ϋ
mし 4.51) 7.0
lbb 無し 4.50 し 0
157 有り 0.02 0.0
158 有り 0.02 0.0
159 有り 0.02 0.0
160 有り 0.02 0.0
対照 （未処理） 無し 4.50 7.0
プロテアーゼ · ィンヒビタ一を添加しなかった膜膜では、 いずれについてもプ 口テアーゼによりプロテアーゼ基質が消化された白抜きの部分 （消化痕） が認め られ、 この部分の光学濃度及び膜厚は周辺部に比べて減少していた。 一方、 プロ テアーゼ ·ィンヒビターを添加した試料についてはプロテアーゼ活性が抑制され たために消化痕を認めなかった。 また、 スライ ドコーターによって作成した試料
160〜170 はバーコ一ターによって作成した試料と同様の結果を与えた。 例 13： プロテア—ゼ活性測定
プロテア一ゼ液体試料として、 マトリックス ' メタロプロテアーゼ （ΜΜΡ)-1、 をそれぞれ 2 pg mlから 200 ng/mlの濃度で含む溶液を用い、 例 11で得た試料 101 に対して例 12と同様の方法により測定を行って検量線を作成した。 結果を表 4に示 す。 表 4
MMP添加量（g/ml) 消化痕 光学濃度 m)
10-7 有り 0.2 0.1
10一8 有り 0.2 0.1
10— 9 有り 0.2 0.1
10— 10 有り 1.0 0.5
10— 11 微かに有り 4.0 6.0
10— 12 無し 4.5 7.0
無添加 無し 4.5 7.0
表 4の結果をグラフ上にプロッ 卜し、 生体試料を用いた場合の消化痕の光学濃 度 （2.6)を与えるマトリックス ' メタ口プロテア一ゼ （MMP)- 1の濃度を求めた。 こ の結果、 生体試料中のプロテア—ゼの濃度は約 40 pg/ml であった。 例 14： プロテア—ゼ活性測定
生体試料として、 歯周病患者から採取した歯肉、 歯肉溝滲出液、 及び歯周病の 組織試料を約 5//m の凍結切片として薄膜試料 101-160 の上に貼付した。 薄膜を 湿潤箱内に入れて 37°Cで 4〜16時間ィンキュベートし、 その後、 透明な試料はァミ ドブラック溶液で染色した。 活性の評価方法としては、 それぞれの試料に対して はっきりと活性が認められる箇所について、 ①目視による判定、 ②ミクロデンシ トメ トリ一による微小部分の濃度測定による判定、 及び③接触式膜厚測定機によ る膜厚測定による判定を行った。 結果を表 5に示す。 表 5 試料番号 消化痕 光学濃度 膜厚 （ m)
0000002022200221111111111342589244D60703-. -735892- - 6111
有り 0.10 0.6 有り 0.10 0.6 有り 0.06 0.4 有り 0.10 0.6 有り 0.02 0.0 有り 0.04 0.4 有り 0.02 0.0 有り 0.02 0.0 有り 0.04 0.4 有り 0.02 0.0 有り 0.04 0.4 有り 0.04 0.4 有り 0.02 0.2 有り 0.02 0.2 有り 0.08 0.4 有り 0.02 0.0 有り 0.02 0.0 有り 0.16 0.8 有り 0.02 0.0 有り 0.02 0.0 有り 0.02 0.0 有り 0.02 0.0 無し 4.50 7.0 無し 4.50 7.0 無し 4.50 7.0 薪厂
ο οο α ο οο
^ 157 有り 0. 02 0. 0
158 有り 0. 02 0. 0
159 有り 0. 02 0. 0
160 有り 0. 02 0. 0
対照 （未処理） 無し 4. 50 7. 0
生体試料の凍結切片を直接設置する方法においても、 各薄膜にはプロテアーゼ によるプロテアーゼ基質の消化痕 （白抜きの部分） が形成されており、 この部分 の光学濃度と膜厚は周辺部に比べて減少していた。
例 15 ： プロテア一ゼ測定用薄膜の製造
牛骨アルカリ処理ゼラチン 15 g を純水 123 gに溶解し、 硬膜剤として 1, 2-ビ ス （ビニルスルホニルァセトアミ ド） ェタン（4%) 0. 6 ml を添加した。 この溶液を スライ ドグラス上に乾燥膜厚が約 になるように均一ワイヤーバーコ一ターを 使って塗布し、 乾燥して薄膜とした。 牛骨アルカリ処理ゼラチン 15 を純水 123 gに溶解し、 硬膜剤として 1, 2-ビス （ビニルスルホニルァセトアミ ド） ェタン（4 ¾) 0. 6 ml とポリメチルメタク リ レー ト粒子 （平均粒径 2 m ) を添加した。 この 溶液を、 すでに作成した乾燥薄膜の表面に乾燥膜厚が約 7 m になるように均一ヮ ィヤーバーコ—ターを使って塗布し、 乾燥して薄膜とした （多層薄膜：試料 301)。 薄膜は使用時まで室温で保存した。 また、 プロテアーゼ基質、 硬膜剤、 変更又は 追加して、 表 6に示す薄膜を作成した。 なお、 塗布の際には必要に応じて塗布助 剤、 粘度調整剤を使用し、 表中の青色染料 1、 緑色染料 1、 及び赤色染料として は、 それぞれ以下の化合物を用いた。 (靑色染料 I)
Figure imgf000030_0001
(緑色染料 I)
Figure imgf000030_0002
(赤色染料 I)
Figure imgf000030_0003
D CD
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
CO
Figure imgf000033_0001
塗布の際にワイヤーバーコ一ターの代わりにスライ ドコ一ターを使用した他は 試料 301〜330 と同様にして試料 331〜360 を作成した。 なお、 乾燥条件は必要に 応じて 10 °Cにいつたん冷却した後常温常湿にて乾燥する方法を採用した。 例 16： プロテア—ゼ活性測定
例 12と同様の方法でプロテア—ゼの活性測定を行った。 結果を表 7に示す。 この 結果から、 多層の薄膜においてもプロテア—ゼ活性を非常に明確に判定可能であ ることがわかった。 スライ ドコ一タ一によって作成した試料 331〜360 はバーコ一 ターによって作成した試料と同様の結果を示した。
消 化 痕 光 学 濃 度 糗 I
^¾Ρ番号
第一暦 第二 ¾ 第三層 第一圈 第二履 第三層 第一層 第二層 第三層
3 ο 1 有り 有り 0.12 0.02 0.6jum 0.6 ID
302 有り 有り 0.08 0.04 2, οχ^πι 0.5 ζπι
303 有り 有り 0.06 0.02 1. Οχίϊΐ 0. /m
304 有り 有り 0.12 0.02 3. 0.6x/m
305 有り 有り 0.02 0.04 4.0/iin 0. O n
306 有り 有り 02 0.02 2.0/xm 0.4jun
307 有り 有り 3.50 0.04 O.Ojum
308 有り 有り 1.50 0.04 1. Oj m 0. Ojtzm
309 有り 有り 3.50 0.02 0.4um
31 0 有り 有り 2.02 0.02 2. 0.0
3 1 1 有り 有り 3.50 0.04 1.0 ,ίθΐ 0.4j n
3 l 2 有り 有り 1.50 0.02 3. Gjtxffl 0.4 ιπι ω 3 J 3 有り 有り 3.50 0.02 4. Oj m 0.2 win
3 l 有り 有り 2.50 0.04 2 Oi/m 0.2un
3 1 5 有り 有り 0.10 0.02 0. 0.5 m
3 1 6 無し 有り 4.50 0.04 7.0 m 0.0 IB
3 1 7 無し 有り 4.50 0.04 7.0/im O.Oxim
3 1 8 無し 有り 4.50 0.02 7.0 /ni 0.0 urn
322 有り 有り 有り 2.02 0.02 0.04 3. 0.0/zra O.Oum
323 有り 有り 有り 3.50 2.02 0.02 3.0 m 2.0 Mm 0.4wm
324 有り 有り 有り 1.50 3.50 0.04 2.0 0.4/ m
325 有り 有り 有り 3.50 1.50 0.02 .Ouia 3.0un
326 有り 有り 有り 2.50 0.02 3.0 zm 2.0 urn 0.2 m 7 お 右
り 4.0/iin 0.5 am
328 有り 有り 有り 1.23 0.02 0.02 2.0 ID 3. Own O.Oum
329 有り 有り 有り 3.12 0.02 0.04 4.0j m 4.0χ/ΐΒ 0.0 urn
330 有り 有り 有り 2· 02 0.02 0.04 3.0jum ZOun 0.8juni 未艇 無し 無し 無し 4.50 4.50 4.50 7.0um 7.0 染色のみ
例 17： プロテア—ゼ測定用薄膜の製造とプロテアーゼ活性測定
牛骨アル力 リ処理ゼラチン 15 g を純水 123 gに溶解し、 硬膜剤として 1, 2 -ビ ス （ビニルスルホニルァセ トアミ ド） ェタン（4¾) 0. 6 ml を添加した。 この溶液を バック層にスライ ドコーターを使って塗布し、 乾燥して薄膜とした他は試料 331 〜360 と同様にして試料 501〜530 を作成した。 また、 試料 501〜530 のバック層 の上にポリマーラテックス層を塗布、 乾燥した試料 531 ~560 を作成した。 これら の試料について試料 331〜360 と同様にプロテア一ゼ活性測定を行ったところ、 同 様な評価結果が得られた。 また、 これらの試料はカールなどが起きず、 薄膜の取 扱い性において非常に良好であった。 例 18：写真用フィルムを用いたプロテア—ゼの測定
ネオパン F (写真用黒白フィルム ：富士写真フィルム株式会社製） を完全に感 光させた後、 通常の方法に従って現像、 定着、 及び水洗を行った後に乾燥させた。 この写真用フィルムをプロテアーゼ測定用のゼラチン薄膜として用い、 フィルム 上に実施例 4で調製した癌組織の切片を貼付して、 実施例 4と同様の方法に従つ てプロテア一ゼ活性の測定を行った。 この結果、 プロテアーゼの存在しない部分 は黒色のままであつたが、 実施例 4で染色により調製した薄膜上に認められた消 化痕と同様の消化痕が白抜き部分として認められた。 ただし、 例 1、 例 2、 例 10、 例 11、 例 15、 及び例 17で製造した薄膜に比べると検出性能は劣っていた。 例 19： ラジォグラフィ用乳剤を用いたプロテアーゼの測定および測定結果 （比較例） 生体試料として、 歯周病患者から採取した歯肉、 歯肉溝滲出液、 及び歯周病の 組織試料を約 の凍結切片としてスライ ドグラス上設置した。 その上に水で希 釈したラジオグラフィ用乳剤 NRM2 又は NRH2 (コニ力株式会社製） を塗布し、 乾 燥して薄膜を形成した。 薄膜を湿潤箱内に入れて 37°Cで 16時間〜 14日間インキュ ペートし、 その後、 アミ ドブラックで染色するか、 または黒白現像処理をした。 その結果、 プロテア一ゼの活性はほとんど検出できなかった。 14日間インキュべ一 トした後に黒白現像処理した試料においてわずかに活性らしいものを示したが、 活性部の表示が非常に暧昧であり、 本発明の薄膜に比べてプロテア—ゼの検出能 は著しく劣っていた。 産業上の利用可能性
本発明の方法は、 組織中に局在する特定部位や組織中の個々の細胞に由来する プロテア一ゼを正確かつ簡便に測定することができ、 しかも短時間に判定できる という特徴がある。 従って、 本発明の方法は、 浸潤や転移活性などの癌細胞の悪 性度、 歯周炎などの歯周病の進行度、 リウマチや歯槽膿漏などの破壤性病態など の正確な診断に有用である。 また、 本発明の方法に従えば、 極めて微量の試料か らプロテア一ゼ活性を測定することが可能であり、 判定後の薄膜を固定標本とし て永久保存することもできる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . プロテアーゼの測定方法であって、
( 1 ) プロテア一ゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対してプロ テアーゼを含む試料を接触させる工程；及び
(2) プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程 を含む方法。
2 . プロテア—ゼの測定方法であって、
(1 ) プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体 試料の実質的に連続した二切片のうちの一つを接触させる工程；
(2) プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び（3) 他の一つの切片から調製した組織標本と上記消化痕とを対比する工程
を含む方法。
3 . プロテアーゼの測定方法であって、
(1) プロテア一ゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体 試料の実質的に連続した 2以上の切片のうちの一つを接触させる工程；
(2) プロテア一ゼ基質、 硬膜剤、 及びプロテアーゼ ' インヒビターを含み支持体表 面に形成された薄膜に対して残りの切片を接触させる工程；
(3) プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び (4) 工程（1 ) で用いた薄膜の消化痕と工程 (2) で用いた薄膜の消化痕とを対比するェ 程
を含む方法。
4 . プロテアーゼの測定方法であって、
(1) プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体 試料の実質的に連続した 2以上の切片のうちの一つを接触させる工程；
(2) 工程（1 ) で用いた薄膜に含まれるプロテア一ゼ基質とは異なるプロテア一ゼ基 質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して残りの切片を接触させ る工程；
(3) プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び (4) 工程（1 ) で用いた薄膜の消化痕と工程（2) で用いた薄膜の消化痕とを対比するェ 程
を含む方法。
5 . プロテア—ゼの測定方法であって、
(1) 少なくとも下記の 2層： プロテアーゼ基質、 硬膜剤、 及びプロテアーゼ ·ィン ヒビ夕一を含み支持体表面に形成された（a) 層と、 プロテア一ゼ基質及び硬膜剤を 含み (a) 層に積層された（b) 層とを含む薄膜に対してプロテアーゼを含む試料を接 触させる工程；
(2) プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び（3) (a) 層の消化痕と（b) 層の消化痕とを対比する工程
を含む方法。
6 . プロテアーゼの測定方法であって、
(1) 少なくとも下記の 2層： プロテア一ゼ基質及び硬膜剤を含み支持体表面に形成 された（a) 層と、 （a) 層に含まれるプロテア一ゼ基質とは異なるプロテア一ゼ基質 及び硬膜剤を含み (a) 層に積層された（b) 層とを含む薄膜に対してプロテア—ゼを 含む試料を接触させる工程；
(2) プロテア一ゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び (3) (a) 層の消化痕と（b) 層の消化痕とを対比する工程
を含む方法。
7 . プロテア一ゼ基質が、 コラーゲン、 ゼラチン、 プロテオグリカン、 フイブ口 ネクチン、 ラミニン、 エラスチン、 及びカゼィンからなる群から選ばれる請求の 範囲第 1項ないし第 6項のいずれか 1項に記載の方法。
8 . 該試料が患者から分離 ·採取した生体試料である請求の範囲第 1項ないし第 7項のいずれか 1項に記載の方法。
9 . 金属、 金属酸化物、 顔料、 及び染料からなる群から選ばれ、 400 ηπιから 700 nmの波長領域の最大透過濃度が 0. 01 以上の物質の 1種又は 2種以上を含む薄膜を 用いて消化痕の検出を行う請求の範囲第 1項ないし第 8項のいずれか 1項に記載 の方法。
10. プロテア一ゼがマ卜リ ックス . メ夕口プロテアーゼである請求の範囲第 1項な いし第 9項のいずれか 1項に記載の方法。
11. プロテア—ゼの測定用の薄膜であって、 プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支 持体表面に形成された薄膜。
12. 少なくとも下記の 2層：プロテアーゼ基質、 硬膜剤、 及びプロテア—ゼ .ィン ヒビタ—を含み支持体表面に形成された (a) 層と、 プロテア一ゼ基質及び硬膜剤を 含み（a) 層に積層された（b) 層とを含む請求の範囲第 11項に記載の薄膜。
13. 少なくとも下記の 2層：プロテア—ゼ基質及び硬膜剤を含み支持体表面に形成 された（a) 層と、 （a) 層に含まれるプロテア一ゼ基質とは異なるプロテア一ゼ基質 及び硬膜剤を含み (a) 層に積層された（b) 層とを含む請求の範囲第 11項に記載の薄 膜。
14. 金属、 金属酸化物、 顔料、 及び染料からなる群から選ばれ、 400 nmから 700 nmの波長領域の最大透過濃度が 0. 01 以上の物質の 1種又は 2種以上を含む請求の 範囲第 11項ないし第 13項のいずれか 1項に記載の薄膜。
15. 支持体がスライ ドグラス又はポリエチレンテレフ夕レー トフイルムから選ばれ る請求の範囲第 11項ないし第 14項のいずれか 1項に記載の薄膜。
16. 上記支持体と上記薄膜との間に下塗り層が設けられた請求の範囲第 11項ないし 第 15項のいずれか 1項に記載の薄膜。
17. プロテアーゼが関与する疾患の診断方法であって、 下記の工程：
(1 ) 患者から分離 ·採取した生体試料をプ口テア一ゼ基質と硬膜剤とを含み支持体 表面に形成された薄膜に対して接触させる工程；及び、
(2) プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程 を含む方法。
18. 該疾患が、 癌、 リウマチ性疾患、 歯周病、 及び歯槽膿漏からなる群から選ばれ る疾患である請求の範囲第 17項に記載の方法。
PCT/JP1997/000588 1996-02-29 1997-02-27 Procede d'analyse de proteases et membrane fine utilisee dans ce procede WO1997032035A1 (fr)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97905416A EP0884393B1 (en) 1996-02-29 1997-02-27 Method of assaying proteases and thin membrane used in said method
CA002248272A CA2248272C (en) 1996-02-29 1997-02-27 Method of measurement of protease and thin membranes used for said method
JP53079997A JP3302020B2 (ja) 1996-02-29 1997-02-27 プロテアーゼの測定方法及び該方法に用いる薄膜
DE69721507T DE69721507T2 (de) 1996-02-29 1997-02-27 Verfahren zur analyse von proteasen und dünne membran zur verwendung in diesem verfahren
AT97905416T ATE239092T1 (de) 1996-02-29 1997-02-27 Verfahren zur analyse von proteasen und dünne membran zur verwendung im diesem verfahren
US11/050,763 US20050136504A1 (en) 1996-02-29 2005-02-07 Method of measurement of protease and thin membranes used for said method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4264696 1996-02-29
JP8/42646 1996-02-29

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US09/917,897 Continuation US20020086399A1 (en) 1996-02-29 2001-07-31 Method of measurement of protease and thin membranes used for said method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1997032035A1 true WO1997032035A1 (fr) 1997-09-04

Family

ID=12641786

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1997/000588 WO1997032035A1 (fr) 1996-02-29 1997-02-27 Procede d'analyse de proteases et membrane fine utilisee dans ce procede

Country Status (6)

Country Link
EP (2) EP1295948B1 (ja)
JP (1) JP3302020B2 (ja)
AT (2) ATE405672T1 (ja)
CA (1) CA2248272C (ja)
DE (2) DE69721507T2 (ja)
WO (1) WO1997032035A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1085097A1 (en) * 1999-08-18 2001-03-21 Fuji Photo Film Co., Ltd. Method for judging effectiveness of protease inhibitors
WO2001071025A1 (fr) * 2000-03-24 2001-09-27 Fuji Photo Film Co., Ltd. Pellicules de dosage de l'activite protease
EP2107122A1 (en) 2008-03-31 2009-10-07 FUJIFILM Corporation Protease detection material, set of protease detection materials, and method for measuring protease
JP2023176122A (ja) * 2022-05-31 2023-12-13 サンスター株式会社 歯周病菌プロテアーゼ活性を測定する方法及びその利用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6627411B2 (en) 1999-05-24 2003-09-30 Shionogi & Co., Ltd. Method for evaluating matrix metalloprotease inhibitory activity
AUPQ826500A0 (en) 2000-06-21 2000-07-13 Novapharm Research (Australia) Pty Limited Enzyme detection and measurement
US7041787B2 (en) 2000-12-29 2006-05-09 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Design and use of advanced zinc chelating peptides to regulate matrix metalloproteinases
US6600057B2 (en) 2000-12-29 2003-07-29 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Matrix metalloproteinase inhibitors
GB0720030D0 (en) * 2007-10-12 2007-11-21 Cambridge Entpr Ltd Depolymerase assay
IN202021002695A (ja) 2020-01-21 2021-07-23

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1178761A1 (ru) * 1983-10-11 1985-09-15 Всесоюзный Ордена Трудового Красного Знамени Научно-Исследовательский Институт Защиты Растений Способ идентификации ингибиторов протеиназ
JPH022398A (ja) * 1987-12-03 1990-01-08 Block Drug Corp コラーゲナーゼを検定する方法および手段

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5341221A (en) * 1976-09-27 1978-04-14 Fuji Photo Film Co Ltd Photographic light sensitive material
EP0176246A3 (en) * 1984-08-27 1988-08-31 JOHNSON & JOHNSON DENTAL PRODUCTS COMPANY Method and kit for detecting the presence of gum disease
JPH06104077B2 (ja) * 1992-05-15 1994-12-21 コニカ株式会社 分析素子
JP3124858B2 (ja) * 1993-02-23 2001-01-15 富士写真フイルム株式会社 ハロゲン化銀写真感光材料

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1178761A1 (ru) * 1983-10-11 1985-09-15 Всесоюзный Ордена Трудового Красного Знамени Научно-Исследовательский Институт Защиты Растений Способ идентификации ингибиторов протеиназ
JPH022398A (ja) * 1987-12-03 1990-01-08 Block Drug Corp コラーゲナーゼを検定する方法および手段

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, Vol. 104, No. 1, (1980), B. JONSON-WINT, "A Quantitative Collagen Film Collagenase Assay for Large Numbers of Samples", p. 175-181. *
ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, Vol. 76, No. 2, (1976), R. LEVENSON, "A Collagen Film Microassay for Tissue Collagenase", p. 579-588. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1085097A1 (en) * 1999-08-18 2001-03-21 Fuji Photo Film Co., Ltd. Method for judging effectiveness of protease inhibitors
US6413734B1 (en) 1999-08-18 2002-07-02 Fuji Photo Film Co., Ltd Method for judging effectiveness of drug having protease inhibitory activity
WO2001071025A1 (fr) * 2000-03-24 2001-09-27 Fuji Photo Film Co., Ltd. Pellicules de dosage de l'activite protease
EP2107122A1 (en) 2008-03-31 2009-10-07 FUJIFILM Corporation Protease detection material, set of protease detection materials, and method for measuring protease
JP2023176122A (ja) * 2022-05-31 2023-12-13 サンスター株式会社 歯周病菌プロテアーゼ活性を測定する方法及びその利用

Also Published As

Publication number Publication date
JP3302020B2 (ja) 2002-07-15
EP0884393A4 (en) 2000-08-23
EP0884393B1 (en) 2003-05-02
DE69738933D1 (de) 2008-10-02
CA2248272A1 (en) 1997-09-04
DE69721507T2 (de) 2004-03-25
EP1295948A3 (en) 2005-02-02
EP0884393A1 (en) 1998-12-16
CA2248272C (en) 2005-01-04
ATE405672T1 (de) 2008-09-15
DE69721507D1 (de) 2003-06-05
ATE239092T1 (de) 2003-05-15
EP1295948B1 (en) 2008-08-20
EP1295948A2 (en) 2003-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1997032035A1 (fr) Procede d'analyse de proteases et membrane fine utilisee dans ce procede
AbuRahma et al. The correlation of ultrasonic carotid plaque morphology and carotid plaque hemorrhage: clinical implications
Pancione et al. Reduced β-catenin and peroxisome proliferator–activated receptor–γ expression levels are associated with colorectal cancer metastatic progression: correlation with tumor-associated macrophages, cyclooxygenase 2, and patient outcome
Kugler On angiotensin-degrading aminopeptidases in the rat kidney
JP3598292B2 (ja) プロテアーゼの測定方法及び該方法に用いる薄膜
EP1035213A1 (en) Method for enzyme assay
JP2002223796A (ja) プロテアーゼの測定方法及び該方法に用いる薄膜
JP4246799B2 (ja) 酵素の測定方法
US20020086399A1 (en) Method of measurement of protease and thin membranes used for said method
ES2609588T3 (es) Compuestos para detectar proteasas
JP2001000197A (ja) プロテアーゼ活性の測定方法
JPH11103890A (ja) 病理検査方法
JP4070409B2 (ja) マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性の評価方法
US6790609B1 (en) Thin membrane for detecting thiol-containing compounds
WO2001071025A1 (fr) Pellicules de dosage de l'activite protease
US6413734B1 (en) Method for judging effectiveness of drug having protease inhibitory activity
JP2003079395A (ja) プロテアーゼの測定方法
JP2003038172A (ja) プロテアーゼを含む凍結ブロック
JP2001095599A (ja) プロテアーゼの測定方法
JP2000325096A (ja) プロテアーゼの測定方法
Desai et al. Failure of rectal ornithine decarboxylase to identify adenomatous polyp status
JP2003284590A (ja) プロテアーゼ活性の測定方法
Bai et al. Analysis of apoptosis: basic principles and procedures
JP2001211897A (ja) プロテアーゼ活性測定用の薄膜
RU2527338C1 (ru) Способ прогнозирования развития лимфогенных метастазов при плоскоклеточных карциномах головы и шеи после проведения комбинированного лечения

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2248272

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2248272

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1997905416

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1997905416

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1997905416

Country of ref document: EP