JPH022398A - コラーゲナーゼを検定する方法および手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は哺乳動物の生物学的液体中のコラ−ゲナーゼを
検定する方法および手段に関する。より詳細に、本発明
は歯肉溝液体（ｇｌｎｇｌｖａｌ　ｃｒｅｖｌｃｕｆａ
ｒ　　　ｆｌｕｉｄ　）　　（以下、「ＧＣＦ」と称す
る）のコラ−ゲナーゼ活性を定量するためのコラーゲン
の使用を含むこの種の方法および手段に関する。

人間の歯根膜疾病についての基準臨床測定値が、現在の
臨床的歯根膜アタッチメントについて示されるものでは
なく、あるいはアタッチメントの見込喪失について予想
されるものではないことがはっきり理解されるにつれて
［バッファジーニー・デイ−、ツクランスキー、ニス書
ニスおよびグツドサン、ジェー・エム（Ｈａｆｆａｊｅ
ｅ、　Ａ、Ｄ、。

５ｏｃｒａｎｓｋｙ、　Ｓ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｇｏｏｄｓ
ｏｎ、　Ｊ、Ｍ、　）　：　ｒ破壊性Σ根膜疾病作用の
臨床的パラメータまたは予測値（ｃＩｌｎｌｃａｌ　ｐ
ａｒａｍｅ−ｔｅｒｓ　ｏｒ　ｐｒｅｄｌｃｔｏｒｓ　
ｏｆ　ｄｅｓｔｒｕｃｔｌｖｅ　ｐｅｒｌｏｄｏｎｔａ
ｌ　ｄｌｓｅａｓｅ　ａｃｔｌｖｌｔｙ）　　Ｎ。

ＣｌＩｎ、　Ｐｅｒｌｏｄｏｎｔｏｌ、Ｊ　１０：　２
５７．１９８３年コ、活動性歯根膜疾病についての鋭敏
な計測に関するニーズに注目が集まって来た［ボルノン
、ニー・エムおよびグツドサン、ジェー・エム（Ｐｏｌ
ｓｏｎ、　Ａ、Ｍ。

ａｎｄ　Ｇｏｏｄｓｏｎ、　Ｊ、Ｍ、）　：　ｒ歯根膜
病診断（Ｐｅｒｌｄ。

ｎｔａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）　：　ｒ現状および将
来のニーズ（ｃｕｒｒｅｎｔ　５ｔａｔｕｓａｎｄ　ｆ
ｕｔｕｒｅ　ｎｅｅｄｓ）　Ｊ　Ｎ、　Ｐｅｒｌｏｄｏ
ｎｔｏｌ、　Ｊ　５［ｉ：　２５．１９８５年コ。この
種の診断試験の中で、ＧＣＦの生化学的分析に可成りの
注意が払われた［ファイン、デイ−・エッチおよびマン
デル、アイ・デーｔ　−、（Ｆｉｎｅ、　Ｄ、■、　ａ
ｎｄ　Ｍａｎｄｅｌ、　［、Ｄ、　）　：　ｒ歯根膜疾
病作用についてのインジケータ（Ｉｎｄｌｃａｔｏｒｓ
　ｏｆ　Ｐｅｒｌｏｄｏｎｔａｌ　ｄｌｓｅａｓｅ　ａ
ｃｔｌｖｌｔｙ）　：　ｒ評価（ａｎ　ｅｖａｌｕａｔ
ｌｏｎ　）　Ｊ　、ｒＪ、　ＣｌＩｎ。

Ｐｅｒｌｏｄｏｎｔｏｌ、　Ｊ　１３：　５３３．１９
８８年コ。歯根膜の健康および疾病を特徴づける液体の
容量および構成要素についての研究が略３０年に亙り行
われて来た。

蛋白質分解酵素はそれらの診断ポテンシャルについて検
討されて来たＧＣＦ構成要素中に存在する。これらの中
で、コラーゲンは特に関心が持たれている。それはコラ
ーゲンが歯根膜の主要構成蛋白質であり、そしてコラー
ゲンの喪失が歯齦炎および歯根膜炎双方の特徴だからで
ある［ナラヤナン、ニーのニスおよびページ、アール・
シー（Ｎａｒａｙａｎａｎ、　Ａ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｐａ
ｇｅ、　Ｒ，Ｃ，）　：　ｒ歯根膜の結締組織（ｃｏｎ
ｎｅｃｔｌｙｅ　ｔｌｓｓｕｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｒ
ｌｏｄ。

ｎｔｌｕｍ　）　Ｊ　：　ｒ現在の成果の要約（ｓｕｍ
ａ＋ａｒｙ　ｏｆ　ｃｕｒｒｅｎｔ　　ｗｏｒｋ　　）
Ｊ　　、　ｒｅａｌ、Ｒｅ１．Ｒｅｓ、Ｊ　　３　：　
　３３、■９８３年コ。以前の研究はＧＣＦ中の増大す
るコラ−ゲナーゼ活性を増大する歯肉溝炎症と相関させ
て来た［オールノン、ケー、オルノン、アイおよびタイ
ネリウスーブラッタール、ジー（Ｏｈｌｓｓｏｎ。

Ｋ、、　０１ｓｓｏｎ、　１．　ａｎｄ　Ｔｙｎｅｌｌ
ｕｓ−Ｂｒａｔｔｈａｌ、　Ｇ、　）：　「人間の歯根
溝中の好中球コラ−ゲナーゼ、エラスターゼおよび血清
プロテアーゼ・インヒビター　（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｌｌ
　１ｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、　ｅ
ｌａｓｔａｓｅ　ａｎｄ　　ｓｅｒｕｍ　ｐｒｏｔｅａ
ｓｅ　１ｎｈｌｂｌｔｏｒｓ　Ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｇｌ
ｎｇｌｖａｌ　ｃｒｅｖｌｃｅｓ）　　ｒＡｃｔａ　０
ｄｏｎｔ、　５ｃａｎｄ、Ｊ　３１：５１Ｘ１９７３年
；　コーラブ、エル拳エム、シーゲル、エヌ、ラママー
シー、シーおよびマンデル、アイ（Ｇｏｌｕｂ、　Ｌ、
Ｍ、、　Ｓｌｅｇｅｌ、　Ｎ、、　Ｒａｍａｍｕｒｔｈ
ｙ　Ｃ，ａｎｄＭａｎｄｅｌ、　１．）　：　ｒ人間に
おける歯肉溝液体中のコラ−ゲナーゼ作用およびその歯
肉疾病との関係についての若干の特性（Ｓｏｍｅ　ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｌｓｔｌｃｓ　ｏｆｃａｌ−１ａｇｅｎ
ａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｉｎ　ｇｌｎｇｌｖａｌ　
ｃｒｅｖｌｃｕｌａｒｆｌｕｌｄ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　ｒ
ｅｌａｔｌｏｎｓｈｌｐ　ｔｏｇｌｎｌｇｌｖａｌ　ｄ
ｌｓｅａｓｓ　　Ｉｎ　　ｈｕｍａｎｓ　　）　　ｒＪ
、Ｄｅｎｔ、Ｒｅ５Ｊ　　５５：　　１０４９，１９７
６年コ。更に、結紮により誘発させた爾根膜炎罹患ビー
グル犬についての研究はＧＣＦ中のコラーゲン性作用が
アタッチメントの喪失と相関していることを示していた
［クリシュタルキージェ、イー、ソデック、ジェーおよ
びフェリーエ、ジェー・エム（Ｋｒｙｓｈｔａｌｓｋｙ
ｊ、　Ｅ、、　５ｏｄｅｋ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｆｅｒｒ
ｌｅｒ、　Ｊ、Ｍ、　）　：　ｒ犬の実験的歯根膜炎に
おける臨床的および顕微鏡的変化を伴う歯肉溝液体中の
コラーゲン性酵素とインヒビターとの相関関係（ｃｏｒ
ｒｅｌａｔｌｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎｏｌｙｔｌ
ｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎｄ　１ｎｈｌｂｌｔｏｒｓ　
Ｉｎ　ｇｌｎｇｌｖａｌ　ｃｒｅｖｌｃｕｌａｒ　ｆｌ
ｕｉｄ　ｗｉｔｈ　ｃｌｌｎｌｃａｌ　ａｎｄ　ｕ＋１
ｃｒｏ−ｓｃｏｐｌｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　Ｉｎ　ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｅｒｌｏｄｏｎｔｌｔｌｓ　Ｉｎ
　ｔｈｅ　ｄｏｇ　）　　ｒＡｒｃｈｓ、ｏｒａｌ　Ｂ
ｌ。

１、Ｊ　３Ｈ２１，１９８８年コ。それにも拘らず、生
物学的液体中のコラ−ゲナーゼ活性の定量は屡々放射能
標識コラーゲン基質（３■−コラーゲン　１４Ｇ　−コ
ラーゲン）もしくはゲル電気泳動を利用するコラーゲン
分解フラグメントの同定を含んでいる（オールノン他、
同書中；ゴーラブ他、同書中；クリシュタルキージェ他
、同書中）。これらのアプローチは歯科医または歯科衛
生士によって使用されるべき診療所内の試験用キットに
都合良く取り入れることは出来ない。

我々は小容量のｌｌｉ！乳動物の生物学的液体中のコラ
ーゲン性作用（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｏｌｙｔｌｃ　ａｃ
ｔｌｖｌｔｙ　）を測定するためのアプローチを開発し
た。この試験は不活性表面に結合しているタイプＩコラ
ーゲンの分解に基づいており、そしてこれはコラーゲン
・クリヤランスの帯域を評価することによる半定量的な
ものである。この反応の特異性は基質上の異なった酵素
の効果を試験することにより研究された。コラ−ゲナー
ゼはそのフィルムを迅速に分解し、トリプシンは非常に
高い酵素濃度の場所においてのみ該フィルムを分解する
ことになり、またペプシンおよび酵素を分解する各種の
磨砕物質は該フィルムに対し本質的に何らの効果をも有
していないことが確認された。

本発明は、（ａ）Ｉｌｔｌｉ乳動物の生物学的液体の検
体を得る工程と、（ｂ）その液体を、コラーゲンフィル
ムであって、それをガラス・スライドまたはプラスチッ
ク・スライドであって高い表面エネルギーを有する結果
そのものに結合されるようにその表面に密着させたもの
に対し適用する工程と、そのスライドをインキュベート
する工程と、それを洗浄する工程と、それを染料、たと
えばコラーゲンを染色し得る「クーマシー・ブリリアン
トダブル−（ｃｏｏｍａｓｌｅ　Ｂｒ１ｌ−１１ａｎｔ
　Ｂｌｕｅ）　Ｊで染色する工程と、該スライドの非染
色領域からそのコラーゲンフィルムの溶解の範囲を、た
とえば該フィルムを経由する光の透過度から決定する工
程とを含んで構成される哺乳動物の生物学的液体につい
てのコラーゲン性作用を検定するための方法を包含して
いる。前記の決定は視覚的に、あるいは非吸収性波長の
光を使用する分光光度計によって行うことができる。そ
のコラーゲンフィルムは架橋しているのが好ましく、そ
して焼き付けによりスライドの表面に密着されているの
が好ましい。その架橋度ならびに引き続くインキユバ−
２８フ時間はフィルムの焼き付け時間および／または厚
さを変化させることにより制御することができる。

このスライドは、（ａ）不溶性コラーゲンをｌＩＣ１の
溶液とブレンドして分散液を生成し、その分散液をスラ
イド表面に適用し、該スライドを乾燥、すなわち室温で
自然乾燥させることにより乾燥させ、そしてスライドを
焼き付けて該コラーゲンを架橋させ、かつそれをスライ
ド表面に密着させることにより調製するのが好ましい。

スライドに適用される分散液は少なくとも１μ、好まし
くは少なくとも２０μの寸法を有するコラーゲン粒子を
含んでいるのが好ましい。このスライドはマスクによっ
て区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ）に分割されていて
もよい。

この検定法は歯肉溝液体（ＧＣＦ）のコラ−ゲナーゼ活
性の決定に関して特にを用であるが、その場合液状検体
は濾紙ストリップのような吸収性媒質上に得られるもの
とする。しかし、それはまた滑７１１　ｓ洗肺液、漿液
性滲出液等を含む他の組織液についてのコラーゲン検定
に適用してもよい。これらの場合に液状検体は、最初に
吸収性媒質上に吸収させることなく、直接適用してもよ
い。

本発明の一つの特徴は歯科診療所において使用するのに
適したキットを提供することにあり、それは（ａ）吸収
性ストリップ、たとえば濾紙と、その表面に密着させた
コラーゲンを備える１枚以上のスライドと、コラーゲン
を染色することができる染料溶液用の容器とを含んでい
る。そのキットはまた、１枚以上の標定コラ−ゲナーゼ
含浸濾紙ストリップ、基準コラ−ゲナーゼ溶液の容器、
またはその他のコラーゲナーゼ基Ｑ液を包含していても
よい。

本発明は、不活性表面、より具体的にはガラス・スライ
ド表面に結合されている架橋コラーゲン基質の溶解に基
づくコラーゲン性作用を包含するものである。より詳細
に本発明は以下の事項を包含している。

（１）加熱焼き付け工程を利用してガラス・スライドの
表面に対し可溶性または不溶性コラーゲンを密着させる
こと。このコラーゲンフィルムは焼き付け後、中性ｐｌ
水性溶剤では除去することができない。その焼き付け工
程の間にコラーゲンは脱水により架橋されて、合成ペプ
チド結合を生成する。

（２）コラーゲンフィルムの架橋度およびそれに引き続
くコラーゲン性酵素との接触後の溶解時間は焼き付け時
間ならびにフィルムの厚さを変化させることにより制御
される。

（３）このコラーゲン性検定は、ＧＣＦの未知の標本に
ついての溶解を測定することにより、たとえばそれをコ
ラ−ゲナーゼ基準液と比較することにより定量的に説明
することができる。そのインキュベーン８フ時間はイン
キュベーション温度を制御することにより変化させるこ
とができる。

（４）コラーゲンフィルムの溶解の範囲はＧＣＦのコラ
ーゲン性作用に関連している。

ＧＣＦは好ましくは各四分円中の少なくとも４本の最も
離れた画についての遊心溝（ｍｅｓｌｏｂｕｃｃａｌｃ
ｒｅｖｉｃｅ　）から収集される。プラスチックボルダ
−内に収めた端部を備える予め切断したメチルセルロー
ストｚ紙ストリップ［カリフォルニア州、ラスチンのハ
ーフ・エレクトロニックス（Ｈａｒｃｏ　Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｎｌｃｓ　）コをその溝内に４５６の角度をもって、
軽い抵抗を感じるまで挿入し、そしてその場所に３０秒
間保持する。次いで、それらのストリップを調製された
コラーゲン性試験スライド上に配置し、そして以下に説
明するようにして検定する本発明を以下の実施例により
例示する。

ニューシャーシー州、ソマーヴイルのデヴロ・インコー
ホレーテッド（Ｄｅｖｒｏ　Ｉｎｃ、）から得た２０μ
以上の粒子を含む磨砕したウシの真皮を蒸留水およびイ
ソロバノールで洗浄し、次いで凍結乾燥する。この得ら
れた洗浄、凍結乾燥したコラーゲンを「ワイリー」ミル
（Ｗｌｌｅｙ　ｍ１ｌｌ）を用いて粉末に磨砕した。こ
の磨砕粉末を、一連の直径において１μを超える目を有
する篩、たとえば４ｏメツシユ・スクリーンを介して篩
分けする。この分散波調製に際して使用する物質はその
篩の目を通過しない両分である。

このコラーゲン分散液は下記の方法においてガラス・ス
ライドにコーチングするために調製される。

（１）ＩＮのＩＩＯ！溶液を、室温においてそのｐＨが
２．０になるまで蒸留水１２０−にゆっくり添加する。

そのビーカーの内容物を２００ｍ４のメスシリンダー内
に空ける。

（２）上記のようにして得られた粉末不溶性コラーゲン
　１．２ｇを「ワーリング」ブレンダ−（Ｗａｒｌｎｇ
　ｂｌｅｎｄｅｒ）に対し、ｐＨ２，０の■Ｃ１１２０
−と共に添加する。その１％ｖ／ｖ分散液は請速（５０
００ｒ、ｐ、ｍ、　）で３分間ブレンドするが、このブ
レンド工程は粒度を維持するために十分緩やかに行うも
のとする。１ｇ以上の粒度は可成りの機械的安定性を有
するフィルムを生成するために必要である。

（３）この分散液を枝付きフラスコ（ＧＯＯＪ）中に空
ける。　１００μの真空を室温においてこの分散液に対
し、気泡が除去される迄、適用する。この手順は１５分
間に達するまで要する。次に、この真空を排除すると、
分散液はスライド・コーチングのために準備が整った状
態となる。

（１）「ライト−オン・マイクロスライズ（ＲＩＴＥ−
ＯＮ　ＭＩＣＲＯＳＬＩＤＥＳ　）　Ｊ　　［クレイ・
アダムズ（ｃ１ａｙ　Ａｄａｍｓ）　ＣＡＴ　Ｎａ　３
０５０　）を手によりコラーゲン分散液中に浸漬する。

スライドの両面が塗布されるのを妨げるために、テープ
をそのスライドの片百に適用する。スライド上に堆積さ
れるフィルムの厚さはそのコラーゲン濃度に左右される
。薄いフィルムはコラーゲン分散液２０度０．２５％Ｗ
／Ｖを用いることにより調製される。従って、上のよう
に調製された分散液はＩ）Ｈ２，０の１１０１で１乃至
４倍に希釈されることになった。

（２）これらのスライドはフードの下方または無塵雰囲
気中で自然乾燥させる。

（３）これらのスライドをビーカー中に数回浸漬するこ
とにより蒸留水中で洗浄する。

（４）これらのスライドを再び無塵雰囲気中で乾燥する
。

（５）該スライドを空気循環炉内で１１０℃、３０分間
に亙り焼き付ける。

（６）各スライドの非塗布側からテープを剥がし、そし
てスライドの塗布側に標識する。

（７）これらのスライドは試験で必要となるまで室温で
貯蔵される。

これらのスライドはマスクまたは仕切りを備えて調製さ
れ、各試料を区画させることが好ましい。この種のスラ
イドは添付図面の第１図および第２図中に示されている
。これらの図中に示されるように、調製されたスライド
１はその上部表面に密着されたコラーゲンの薄いフィル
ム３を備える長方形の標準ガラス会スライド２から構成
される。このスライドはマスク４によって区画に分割さ
れ、スペース５が一端（ここでは右側）に標識するため
に設けられている。各列に７個の区画が示されている。

これは日中の！／４における各歯ごとに分析すべき一つ
の試料を許容するものである。

プラスチックフィルム、たとえばポリエチレン、ポリプ
ロピレン、ポリウレタン等から適切に成っているマスク
は、水およびアルコール不溶性接着剤、たとえばエポキ
シを用いることによりコラーゲン塗布スライドの上部表
面に適切に適用される。両面テープ６（たとえば、両面
に接着剤を備えたテープ）のストリップをスライドの上
方および下方縁に沿って取り付けて、その端部をプラス
チックケース内に収めた濾紙ストリップを確り固定する
ための手段として機能させてもよい。

ＧＣＦ中のコラーゲン性作用の評価は、上のようにして
得られた試験ストリップを検定スライド上に配置し、か
つそのクリヤランスの帯域を重版されるコラ−ゲナーゼ
の基準量［ミズリー州、セントルイスのシグマ拳ケミカ
ル・ツーボレーション（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のクロストリジラム・ヒス
トリチカム（ｃｌｏｓｔｒｌｄｌｕｍｕ　ｈｌｓｔｏｌ
ｙｔｌｃｕｍ　）　＃　Ｃ−０１３０から誘導されるタ
イプＩのコラ−ゲナーゼ５．０．２．５、■、２５．０
．６３．０．３２ユニツトコにより得られるクリヤラン
スの帯域と比較することにより行われる。全ての濾紙ス
トリップを両面テープを使用してスライド上に配置し、
そして緩衝液（トリスｌ０ｍＭおよびＣａＣｌ□２５ｍ
Ｍを含む食塩水、ｐ）ｌ＝７．４　）　５−７μノをス
トリップに直接添加してその表面の湿潤性を確実にもた
らすようにする。このスライドを室温（２５°Ｃ）にお
いて２時間、相対湿度１００％の下インキュベートする
。

吸７９器は蒸留水により湿潤されたスポンジを収容する
閉塞されたペトリ皿から成っていて、その湿度を提供す
る。２時間後、そのｄ、ｚ紙ス）　ＩＪツブを除去し、
そしてそのスライドを蒸留水で十分に洗浄し、そして「
クーマシー・ブリリアント・ブルー」溶液（２−プロパ
ツール１２５Ｊ、酢酸５０ｔ（１「クーマシー・ブリリ
アント・ブル−」　［タイプ＋＋Ｒ”、＃　Ｂ　−０８
３０；ミズリー州、セントルイスのングマ・ケミカル・
コーポレーシＨンコ　２５０　ｍｇおよび蒸留水５００
＋ｔ／　）で１分間に亙り染色する。これらのスライド
を再び蒸留水中ですすぎ、そして乾燥させる。次いで、
コラーゲンゲルのクリヤランスの評価を行う。濾紙によ
って覆われていなかったスライドの領域は未変化ゲルを
含んでおり、これは中間の青色（陰性対照）を保ってい
る。コラ−ゲナーゼ基準の５．０ユニツトはそのゲルの
完全なりリヤランスを示している。ＧＣＦコラーゲン性
作用のグレード評価はスケール＋５乃至０に関しており
、これらは５種類のコラ−ゲナーゼ基準と陰性の対照と
に対応している。全ての個々のＧＣＦ試料を採点する。

適用を容易にするために、そのスケールを６個（１４乃
至Ｏ）または４個（１３乃至Ｏ）のグレードに減少させ
てもよい。

第３図は、最左端を除く上列中の全ての区画内に標定濾
紙ストリップを配置し、そしてそのスライドを上記のよ
うに処理したときに得られる結果を示している。これら
のストリップは左方から右方へ移動して緩衝液１．０μ
！中の細菌コラ−ゲナーゼ５．０．２．５．１．２５．
０．６３および０．３２ユニツトを含をしていた。上列
の最右方の区画に適用されたストリップは緩衝液のみを
含有していた。この例におけるスライドのインキュベー
ション時間は２５℃で３時間であった。クリヤーされた
領域７は、スライド上のコラーゲンがストリップ上のコ
ラーゲン性作用によって分解されているものであり、従
ってその染料を保っていない。下列にはストリップは全
く配置しなかった。

第４図および第５図は臨床的に使用されたスライドを示
している。これらのスライドはマスクを包含しておらず
、そしてこれらは実施例３の検定手順に従う各患者から
の６個のＧＣＦ検体を検定するために使用された。標識
領域５はここでは左側に示されている。これらのスライ
ドは他の点では第１図および第２図に示したものと同一
である。

第４図は高いコラーゲン性作用を宵する患者についての
試験において使用されたスライドを示し、また第５図は
低コラーゲン性作用を存する患者について使用されたも
のを示している。６片の標定対照濾紙ストリップが上列
に配置され、一方６片の試験用’ｒＭ　Ｋ１．ストリッ
プ（臨床試料）が下列に配置された。これらの対照スト
リップは左方から右方へ向かって表示する、緩衝液１．
０μノ中の細菌コラ−ゲナーゼ５．０．２．５、■、２
５．０．６３，０．３２および０ユニツトを含有してい
た。クリヤーされた領域は、ここでは８と表示されてい
る。

「クーマシー・ブリリアント・ブルー」以外の染料、た
とえばエオシンおよびヘマトキシリンも勿論、染色工程
において代替え可能なものである。

本発明は成る具体的な実施態様および例示的な実施例に
よって本明細書中で説明されたが、それによって如何な
る方法にもせよその範囲の限定を意図するものではなく
、また当業者により容易に理解されるように、本発明を
もって各種の変形および適応が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明において使用されるガラスのスライドの
上部表面図、第２図はこの種のスライドの垂直図、第３
図は試験用検体に関する検定に従って出現する際のこの
皿スライドの上部表面図、第４図は高ＣＣＦコラーゲン
性作用を有する患者の検定に従って出現する際の他のス
ライド実施態様を示す上部表面図、そして第５図は低Ｇ
ＣＦコラーゲン性作用を存する患者の検定に従って出現
する際のこの種の実施態様を示す上部表面図である。 １・・・調製されたスライド、　２・・・長方形の標準
ガラス・スライド、　　３・・・コラーゲンの薄いフィ
ルム、　　４川マスク、　　５・・・スペース、　　６
・・・面テープ、　７，８・・・クリヤーされた領域。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）哺乳動物の生物学的組織液体の検体を得る
   工程と、 （ｂ）前記検体を、その表面に密着させたコラーゲン基
   質フィルムを備えるスライドに対し適用する工程と、 （ｃ）前記スライドをインキュベートする工程と、 （ｄ）前記スライドを洗浄する工程と、 （ｅ）前記スライドを、コラーゲンを染色し得る染料の
   溶液で染色する工程と、 （ｆ）前記スライドの非染色領域の範囲から前記コラー
   ゲン基質の溶解の範囲を決定する工程とを含んで構成さ
   れることを特徴とする哺乳動物の生物学的液体について
   のコラーゲン性作用を検定するための方法。
2. （２）前記密着させたコラーゲンが架橋したコラーゲン
   である請求項１記載の方法。
3. （３）前記コラーゲンが焼き付けにより前記スライドの
   表面に密着されている請求項１記載の方法。
4. （４）前記コラーゲン基質の架橋度および引き続くイン
   キュベーション時間が焼き付け時間および／またはその
   基質フィルムの厚さを変化させることにより制御される
   請求項３記載の方法。
5. （５）前記染料が「クーマシー・ブリリアント・ブルー
   」である請求項１記載の方法。
6. （６）前記哺乳動物の生物学的液体が歯肉溝液体（ＧＣ
   Ｆ）であり、かつ前記検体が吸収性媒質上で得られる請
   求項１記載の方法。
7. （７）前記スライドが透明であり、そして前記コラーゲ
   ン基質の溶解の範囲についての決定が光の透過に基づい
   ている請求項６記載の方法。
8. （８）（ａ）不溶性コラーゲンをＨＣｌの溶液とブレン
   ドして、分散液を生成する工程と、 （ｂ）前記分散液をスライドの表面に適用する工程と、 （ｃ）前記スライドを焼き付け、それによって前記コラ
   ーゲンを架橋させ、かつ前記スライドの表面に対し密着
   させる工程とを含んで構成されることを特徴とするコラ
   ーゲン性作用の検定に際して使用するためのスライドの
   調製方法。
9. （９）請求項８記載の方法により調製されることを特徴
   とするスライド。
10. （１０）スライド表面に適用される分散液が少なくとも
    ２０μの寸法を有するコラーゲン粒子を含んでいる請求
    項８記載の方法。
11. （１１）請求項８記載の方法により調製されることを特
    徴とするスライド。
12. （１２）ＧＣＦの多数試料についての検定用スライドで
    あって、その表面に密着させたコラーゲンを備え、そし
    てマスクによって区画に分割されていることを特徴とす
    る検定用スライド。
13. （１３）（ａ）吸収性ストリップと、 （ｂ）その表面に密着させたコラーゲンを備える１枚以
    上のスライドと、 （ｃ）コラーゲンを染色し得る染料溶液用の容器とを含
    んで構成されることを特徴とするＧＣＦのコラーゲン性
    作用のための検定用キット。
14. （１４）１個以上のコラーゲナーゼ基準をもまた含んで
    成る請求項１３記載の検定用キット。
15. （１５）前記コラーゲナーゼ基準が標定コラーゲナーゼ
    含浸濾紙ストリップである請求項１４記載の検定用キッ
    ト。
16. （１６）前記コラーゲナーゼ基準が標定コラーゲナーゼ
    溶液である請求項１４記載の検定用キット。