ES2609588T3 - Compuestos para detectar proteasas - Google Patents
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Abstract
Un compuesto, para la detección de una proteasa específica en una muestra, en donde el compuesto tiene una de las siguientes estructuras:**Fórmula**
Description
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DESCRIPCION
Compuestos para detectar proteasas Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos y compuestos para detectar biomarcadores, particularmente proteasas activas, por ejemplo serina-proteasas activas. Ademas, la presente invencion se refiere al uso de dichos compuestos en la deteccion y/o inhibicion de biomarcadores, a un metodo para detectar un estado patologico, por ejemplo infla- macion y un a kit que comprende dicho compuesto.
Fundamento de la invencion
Las serina-proteasas son una de las clases de enzimas mas ampliamente estudiadas: esto se debe en gran parte a sus funciones bien caracterizadas, generalizadas y diversas en un hospedante de procesos fisiologicos y patologi- cos. Muchas afecciones son causadas por una disfuncion en la regulacion exquisita normal de la actividad de estas enzimas proteolfticas, dando como resultado la destruccion anormal de tejidos y/o el procesamiento anomalo de otras protemas y peptidos. Por ejemplo, la actividad de la serina-proteasa denominada elastasa de neutrofilos (abre- viadamente en lo sucesivo NE por la expresion inglesa Neutrophil Elastase), normalmente esta estrictamente con- trolada por una variedad de inhibidores naturales, tales como la alfai-antitripsina (AAT), el inhibidor secretorio de proteasa leucocitaria (abreviadamente SLPI por la expresion inglesa Secretory Leukocyte Protease Inhibitor) y la elafina; sin embargo, en la inflamacion cronica tal como la encontrada dentro del pulmon en la fibrosis qmstica (abreviadamente CF por la expresion inglesa Cystic Fibrosis), esta proteasa supera las defensas naturales de los tejidos, y la actividad no controlada resultante esta implicada en la destruccion tisular, una respuesta inmune alterada y fi- nalmente un deterioro pulmonar. De hecho, se ha demostrado que la NE como biomarcador de infeccion e inflamacion esta correlacionada con la gravedad de otras varias enfermedades respiratorias, tales como la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) y la bronquiectasia (Mayer-Hamblett et al., 2007, Fujimoto et al., 2005, Tsang et al., 2000).Tambien se ha encontrado que la NE esta elevada en el fluido de la grieta gingival y por lo tanto tiene valor como biomarcador de la enfermedad periodontal (Loos and Tjoa, 2005).
Las serina-proteasas tambien han estado implicadas como biomarcadores en una variedad de canceres. Por ejemplo, las kalikreinas (KLK) de tejidos humanos que representan el mayor grupo de serina-proteasas y de las cuales el antfgeno espedfico de la prostata (PSA) es la mejor conocida, han atrafdo una atencion particular como biomarcadores para cribado, diagnostico, pronostico y monitorizacion de enfermedades malignas (Paliouras et al., 2007). Otras serina-proteasas implicadas en episodios asociados a tumores, tales como angiogenesis, invasion y metastasis, incluyen uroquinasa y activadores del plasminogeno tisular
Actualmente, las proteasas activas se miden predominantemente utilizando sustratos cromogenicos o fluorogenicos que requieren experiencia tecnica e instrumentacion costosa. Ademas, estos sustratos carecen de selectividad cuando se usan con muestras biologicas en bruto que contienen una batena de enzimas con multiples proteasas proteolfticas e hidrolfticas. Estos ensayos requieren que las muestras sean procesadas, lo que implica el uso de instrumentacion costosa.
Otros metodos de deteccion incluyen inmunoensayos que requieren tiempo y mano de obra intensiva y debido a su costo, requieren que las muestras se distribuidas en lotes para su analisis, dando como resultado la conservacion a largo plazo de muestras y el impacto negativo de los ciclos de congelacion/descongelacion en la integridad de las protemas. Ademas, estos ensayos solo miden las protemas totales y no pueden diferenciar entre enzimas activas y latentes.
Por lo tanto, debido a la falta de un sistema de deteccion rapido y facil para el usuario, las proteasas no se pueden analizar en la clmica y rara vez se analizan en laboratorios de hospitales.
De hecho, aunque se ha establecido la importancia de la NE en la patogenesis de la enfermedad respiratoria neutro- fflica y se entiende que la determinacion habitual de la NE en la clmica proporcionana una informacion bioqmmica importante que ayudana al tratamiento del paciente, la NE solo se mide en muestras de las vfas respiratorias como un punto final en estudios de investigacion y en pruebas clmicas que evaluan la eficacia de las intervenciones tera- peuticas. En estos casos, las muestras se transfieren a laboratorios de investigacion contratados para su procesamiento, conservacion y posterior analisis.
Hasta principios de los anos noventa del siglo XX, las investigaciones sobre la asociacion de la NE a la enfermedad periodontal inclma colocar tiras que conteman un sustrato fluorogenico (Prognostiks, Dentsply) directamente en la grieta gingival (Eley and Cox, 1998). Los sustratos fluorogenicos utilizados incluyen MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-7- amido-trifluoro-metilcumarina (AFC), que fue desarrollado por la comparfta Enzyme System Products (ahora MP Biomedicals) para Dentsply. Este metodo no era suficientemente sensible y tambien era inconveniente para el paciente. Otro sistema de ensayo, basado de nuevo en el sustrato fluorogenico detallado anteriormente e impregnado en discos, no se desarrollo comercialmente (Cox et al., 1990).
Otros metodos actualmente disponibles para medir proteasas, tales como la NE emplean el formato ELISA (Ensayo
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con inmunosorbente unido a enzima). Por ejemplo, para medir la NE, se determina un complejo de NE-alfai- antitripsina (AAT o aiPI) (Bender Medsystems and Biovendor). El AAT es el inhibidor endogeno de la NE, y en con- diciones normales una cantidad de NE-AAT esta correlacionada con una cantidad de NE liberada. Sin embargo, en las enfermedades neutrofflicas, el AAT esta sobrepasado por la carga excesiva de NE, y se puede medir la NE acti- va libre en comparacion con individuos sanos, donde no se puede detectar actividad debido a la inhibicion efectiva. Por lo tanto, la medicion de los complejos NE-AAT solo dana una indicacion de la NE inhibida que, como ya esta secuestrada, no puede causar dano al entorno del tejido circundante, ya sea las endas en la enfermedad dental o ya sean los pulmones en la CF. La medicion importante tiene que ser la de la actividad elastinolftica no controlada. Esto esta bien documentado en la bibliograffa.
La sociedad Calbiochem ofrece actualmente un ensayo ELISA para NE activa que esta en el mercado en la forma de un kit para analisis de actividad denominado Innozyme™ NE Immunocapture. Utilizando un anticuerpo monoclonal de captura para la NE, la falta de especificidad de la etapa posterior que emplea un sustrato es compensada a medi- da que se elimina por lavado el resto de la muestra bruta. El principal inconveniente es que la etapa que emplea sustrato requiere un penodo de incubacion mmimo de 4 horas hasta 24 horas a 37°C, lo que hace que este ensayo consuma tiempo y sea impracticable para su uso, particularmente en los laboratorios de clmicas u hospitales.
Se han descrito previamente sondas de fosfonatos para dirigirlas a la familia de las serina-hidrolasas, y se han desa- rrollado sondas selectivas que se dirigen espedficamente a la serina-proteasa similar a tripsina basada en sondas derivadas de fosfato de difenilo (DPP) (Hawthorne et al., Anal. Biochem. 326 (2004) 273-275, Pan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 2882-2885). Sin embargo, senan utiles sondas alternativas para ayudar a una mejor comprension de la actividad de las enzimas proteasas en las muestras que se han de analizar y los ensayos corres- pondientes.
Sumario de la invencion
Los inventores han desarrollado compuestos espedficos de proteasas y metodos nuevos y rapidos para dirigirlos a proteasas, es decir, detectarlas y/o inhibirlas, en una amplia variedad de muestras que tienen diferentes complejida- des, particularmente serina-proteasas activas. Dichas proteasas son valiosas en diagnostico y pronostico, por ejemplo para detectar un estado patologico, tal como inflamacion.
En particular, el compuesto es capaz de unirse establemente a las especies de proteasas dianas activas, etiquetan- do de este modo las proteasas dianas presentes, por ejemplo en mezclas complejas que comprenden diversas especies de protemas, tales como sol de esputo, lavado broncoalveolar y fluidos de sitios de inflamacion o similares.
De acuerdo con un primer aspecto de la invencion se proporciona un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1.
El compuesto comprende:
un grupo de union capaz de unirse establemente al biomarcador, un grupo de reconocimiento espedfico para el biomarcador, un grupo espaciador, un resto de succinilo, y un grupo indicador.
El resto de succinilo enlaza el grupo de reconocimiento con el grupo espaciador. Aunque los inventores no desean estar limitados por la teona, se cree que el resto de succinilo actua ventajosamente como un segundo grupo de reconocimiento para la proteasa especifica. En particular, se cree que facilita la formacion de interacciones esenciales de enlace por puentes de H entre el compuesto y la proteasa en virtud del enlace airudico formado entre la funciona- lidad ammica del fosfato de difenilo y uno de sus dos grupos carboxilo.
Dicho resto de succinilo tambien puede actuar como unidad espaciadora para facilitar la interaccion entre, por ejemplo, el conjugado estreptavidina-HRP y el resto de biotina para mejorar la " relacion senal a ruido" del ensayo.
Adicionalmente, el resto o grupo de succinilo puede permitir que el compuesto de la presente invencion sea genera- do sobre una fase solida en comparacion con la generacion en solucion. La capacidad de los compuestos de la presente invencion para ser formados sobre una fase solida proporciona una ventaja importante sobre los compuestos usados para analizar biomarcadores que solamente se pueden formar en solucion.
En particular, se cree que es posible la smtesis en fase solida de los compuestos deseados de actividad dirigida al sitio activo, incluyendo la derivatizacion "en resina" con el grupo indicador de biotina y la incorporacion de la unidad espaciadora pegilada. La incorporacion en fase de solucion de biotina en peptidos es frecuentemente lenta y necesi- ta el uso de exceso de biotina para llevar la reaccion a su termino. Esto, a su vez, significa que se necesita una puri- ficacion extensa para obtener el producto deseado libre de biotina contaminante no unida. La omision del resto de succinilo evitana el anclaje del fosfonato de difenilo en el soporte de fase solida, eliminando asf la opcion para la
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smtesis acelerada en fase solida del compuesto.
El resto de succinilo se puede unir al biomarcador espedfico, en particular cuando el biomarcador es una proteasa, preferiblemente la serina-proteasa activa.
Ademas, el succinilo hace que la sonda de actividad sea mas resistente a la degradacion por peptidasas que estan presentes en las matrices biologicas sobre las cuales se realizan los analisis de proteasas, por ejemplo los analisis de elastasa de neutrofilos. Se sabe que las peptidasas son altamente eficaces en la degradacion de peptidos com- puestos totalmente por alfa-aminoacidos. Su accion degradante se reduce grandemente cuando el peptido contiene un aminoacido no proteogenico, tal como homo-beta-aminoacidos. El resto de succinilo difiere de un alfa-aminoacido en dos aspectos importantes no contiene una funcion NH, ni tiene un carbono alfa reconocible, puesto que estructu- ralmente es mas analogo a un homo-beta-aminoacido.
En algunas realizaciones el resto de succinilo puede ser OCCH2CH2CO. Los compuestos de la presente invencion pueden prepararse haciendo reaccionar, por ejemplo anhudrido sucdnico con la porcion ammica del aminoacido del grupo de reconocimiento espedfico para formar derivados de succinilo, de tal modo que cuando se enlaza la porcion de enlace del grupo de union espedfico con el grupo espaciador puede ser representada por:
Como se apreciara, durante la smtesis de los compuestos, el grupo de union succinilado y de reconocimiento se pone en contacto con el grupo espaciador, por ejemplo el grupo PEG, para permitir la reaccion. Esto puede formar la conexion entre el los grupos de reconocimiento y espaciador.
La proteasa puede ser una serina-proteasa activa. Tfpicamente, la serina-proteasa puede ser una proteasa similar a elastasa, por ejemplo elastasa de neutrofilos (NE) o similar, una proteasa similar a tripsina, por ejemplo la mayona de las KLK, o una proteasa similar a quimotripsina, por ejemplo PSA, KLK-7 y KLK-9 o similar. De acuerdo con una realizacion, la serina-proteasa puede ser una proteasa derivada de neutrofilos, tal como elastasa de neutrofilos, catepsina G, proteinasa-3 o similar. Preferiblemente, la serina-proteasa es NE.
Aunque se han descrito previamente derivados de clorometilcetona como inhibidores utiles de serina-proteasas, en contraste con los compuestos de la presente invencion dichos derivados de clorometilcetona exhiben una falta de especificidad y alta inestabilidad.
Ventajosamente, los compuestos de la presente invencion pueden ser altamente espedficos para detectar una proteasa. Ademas, los compuestos de la presente invencion pueden ser potentes a concentraciones micromolares, es- tables en solucion, incluso a temperatura ambiente, y tienen una vida util prolongada. Esto permite realizar ensayos robustos y fiables, produciendo resultados altamente reproducibles. Los compuestos de la presente invencion pueden tener altas especificidad y estabilidad. Ademas, los compuestos de la presente invencion pueden ser capaces de actuar como inhibidores irreversibles, dependientes del tiempo, de biomarcadores, en particular biomarcadores de proteasas.
Un compuesto de la presente invencion comprende un grupo indicador enlazado al resto de succinilo por un grupo espaciador. El resto de succinilo esta enlazado al grupo de reconocimiento espedfico que esta enlazado al grupo de union. Los distintos grupos estan enlazados directamente. Esta disposicion es preferible tanto para la captura eficaz de la proteasa como para la descripcion/deteccion del grupo indicador. Sin pretender estar limitado por la teona, se considera que cualesquiera otras combinaciones/enlaces perjudican la captura y la descripcion del biomarcador proteasa. En la presente memoria descriptiva, los terminos "resto de succinilo" y "grupo succinilo" pueden usarse indis- tintamente.
El resto de succinilo enlaza el grupo de reconocimiento y el grupo espaciador. El resto de succinilo es altamente preferido con el fin de permitir que el compuesto de la presente invencion se genere en una fase solida en compara- cion con la generacion en fase de solucion mas diffcil qmmicamente. El resto de succinilo puede proporcionar un punto de fijacion entre el grupo de reconocimiento espedfico del inhibidor y el grupo enlazador ammico que esta presente en muchas resinas que tfpicamente formanan la fase solida. La capacidad de los compuestos de la presente invencion para ser formados en una fase solida proporciona una ventaja importante sobre los compuestos usados para analizar proteasas que solo se pueden formar en solucion. La provision del grupo succinilo en los compuestos de la presente invencion significa que la smtesis de los compuestos es tfpicamente acelerada.
El grupo de union se une selectivamente a la proteasa. Tfpicamente, el grupo de union puede ser un grupo aminofe- nilfosfinato o un grupo difenilfosfonato. Dicho grupo de union generalmente se une selectivamente a una proteasa activa por la explotacion de su actividad catalftica inherente. Se apreciara que dichos grupos pueden ser capaces de
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unirse covalentemente de forma irreversible al biomarcador proteasa y, de este modo, pueden discriminar claramen- te entre proteasas activas e inactivas.
Ventajosamente, el compuesto de la presente invencion que comprende un grupo de union difenilfosfonato o mono- fenilfosfinato carece de la capacidad de unirse a protemas distintas de la proteasa diana, es decir, protemas colate- rales que residen en la muestra y, en consecuencia, el compuesto de la presente invencion proporciona una activi- dad inhibidora pronunciada con respecto a la proteasa exclusivamente, en particular el biomarcador serina-proteasa activa.
Ventajosamente, en realizaciones el grupo de union puede comprender un grupo monofenilfosfinato.
Si el grupo de union es un grupo monofenilfosfinato, el compuesto de la presente invencion exhibira quiralidad. El compuesto puede ser un epfmero (R) y (S) puesto que hay varias opciones para la localizacion del grupo o grupos indicadores (vease la Figura 4). Anteriormente, se emplearon compuestos racemicos puesto que las metodologfas de smtesis eran incapaces de conseguir la induccion quiral. Esto era un inconveniente puesto que los epfmeros (R) y (S) (con respecto a la configuracion del carbono a) de dichos derivados pueden presentar diferentes actividades inhibidoras. Los inventores han mostrado ahora que cuando el compuesto de la presente invencion comprende un grupo de union monofenilfosfinato, el conformero (R) posee una actividad inhibidora superior. Una parte activa que proporciona dicha actividad fue estudiada por Walker et al., 2000. En las realizaciones, el grupo de union puede ser un conformero R de monofenilfosfinato. Ademas, el analogo de fosfinato exhibe propiedades mejoradas en compa- racion con su correspondiente difenilfosfonato en la activacion de su biomarcador diana. Por lo tanto, un grupo de union monofenilfosfinato sera tambien una entidad util para la incorporacion en la construccion de la sonda.
Como se describe en la presente memoria, el grupo de reconocimiento espedfico puede ser un grupo peptidilo, por ejemplo, aminoacidos colocados en una posicion P1 y/o P2 como se conoce convencionalmente en la tecnica, etc. Preferiblemente, cuando el biomarcador proteasa diana es NE, el grupo peptidilo puede ser un grupo valilo; cuando el biomarcador diana es una proteasa similar a la quimotripsina, el grupo peptidilo puede ser un grupo fenilalanilo; y cuando el biomarcador diana es una protema de tipo tripsina o kalikreina, el grupo peptidilo puede ser un grupo lisilo o arginilo. Como se apreciara, otros grupos peptidilo pueden estar presentes en Pi o P2 (o P1' o P2' en el caso de monofenilfosfinatos) para aumentar la especificidad. Se apreciara que el grupo peptidilo se puede seleccionar ba- sandose en la informacion conocida en relacion con las especificidades de subsitios de proteasas, por ejemplo, Va- lil-prolil-valilo para elastasa.
El grupo de reconocimiento espedfico, que permite la elaboracion de las especificidades P2-P3, se puede conectar al grupo de union a traves de cualquier enlace qmmico adecuado. Cuando el grupo de union es un grupo monofenilfosfinato o un grupo difenilfosfonato, el grupo de reconocimiento espedfico esta tfpicamente conectado al grupo de union a traves de un ester femlico.
Como se ha discutido en la presente memoria, el grupo indicador puede ser cualquier grupo que pueda ser detecta- do directa o indirectamente, por ejemplo ffsica, qrnmica y/o bioqmmicamente. En particular, puede ser cualquier resi- duo qrnmico, grupo, hapteno o antfgeno adecuado. Por ejemplo, el grupo indicador puede comprender biotina, 2,4- dinitrofenol o uno de sus derivados o uno o mas hapteno(s) o antfgeno(s).
En los compuestos reivindicados, el grupo indicador es un resto de biotina. Como se apreciara, el resto de biotina puede ser espedficamente capturado por estreptavidina. Ademas, la estreptavidina puede estar inmovilizada sobre una matriz solida adecuada, que puede estar en forma de una placa, perla, pelmula, membrana, lamina, chip, disco, matriz, nanopartmula, nanotubo de carbono o similar. La matriz se puede formar a partir de un material seleccionado de plasticos, vidrio, metal, agarosa, nitrocelulosa, polfmero, silicio (oblea), carbono o similar
Como se describe en la presente memoria descriptiva, el grupo indicador puede comprender un resto de 2,4- dinitrofenilo, que puede ser detectado por un anticuerpo correspondiente, o el grupo indicador puede comprender un hapteno o antfgeno adecuado, por ejemplo, His-Tag, FLAG-Tag, ferroceno, rodamina, rojo de Texas, protema fluo- rescente verde (abreviadamente GFP por sus iniciales en ingles), glutation-S-transferasa (GST) o similar, que puede ser detectado por un anticuerpo correspondiente. Como se apreciara por un experto en la tecnica, puede usarse cualquier grupo indicador convencional adecuado.
Como se ha discutido en la presente memoria, el grupo espaciador puede comprender al menos un residuo de poli- etilenglicol (PEG), adecuadamente mas de un residuo de PEG.
Cuando el grupo espaciador comprende uno o mas residuos de PEG el grupo espaciador puede tener una estructu- ra como la mostrada en las Figuras 1-5. El uno o mas residuos de PEG pueden tener la estructura:
H2N-(CH2)m-(O-CH2-CH2)n-(CH2)o-NH2
en donde n= 1, 2, 3, 4, 5, 6, y m y o se seleccionan independientemente de 1-6 etc.
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Como se ha discutido en la presente memoria el espaciador puede ser un PEG derivatizado con amino por ejemplo seleccionado o derivado de:
acido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico
acido 12-amino-4,7,10-trioxadodecanoico
acido 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico
acido 18-amino-4,7,10,13,16-pentaoxaoctadecanoico
acido 21-amino-4,7,10,13,16,19-hexaoxaheneoicosanoico
en donde el compuesto de la invencion se forma por una reaccion de condensacion entre el resto de succinilo y la funcion ammica del espaciador
Como se ha discutido en la presente memoria un compuesto tiene la estructura:
en donde R1 puede ser H o cualquier cadena lateral de aminoacido adecuada o uno de sus derivados, y
en donde R2 puede ser cualquier grupo indicador adecuado, por ejemplo. un grupo biotinilo o un grupo 2,4- dinitrofenilo, un resto de aminoacido, un grupo peptfdico o similar
Como se ha discutido en la presente memoria el compuesto tiene la estructura:
donde R1 puede ser H o cualquier cadena lateral de aminoacido adecuado o uno de sus derivados, y
donde R2 puede ser cualquier grupo indicador adecuado, por ejemplo, un grupo biotinilo o un grupo 2,4-dinitrofenilo, un resto de aminoacido, un grupo peptido o similar.
Como se apreciara los derivados adecuados deben ser capaces de proporcionar la union selectiva del compuesto de la invencion con el biomarcador, preferiblemente la proteasa, por ejemplo la serina-proteasa de interes. Sera conoci- do en la tecnica, que derivados se pueden usar en tal posicion en lugar de, o ademas de, los residuos de aminoaci- dos en R1.
El compuesto puede ser un resto de biotina-PEG-succinilo-Phe-difenilfosfonato, un resto de biotina-PEG-succinilo- Val-difenilfosfonato o un resto de biotina-PEG-succinilo-Lys-difenilfosfonato, segun la reivindicacion 1.
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Ventajosamente, el compuesto de la presente invencion tiene la siguiente estructura:
Alternativamente, el compuesto de la presente invencion puede tener la estructura que se ha mostrado anteriormen- te en la que el grupo Valilo esta reemplazado por un grupo fenilalanilo, un grupo lisilo o un grupo arginilo.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo segun la reivindicacion 2,
En particular, la proteasa puede ser una serina-proteasa activa. Tfpicamente, la serina-proteasa puede ser una pro- teasa similar a elastasa, por ejemplo elastasa de neutrofilos (NE) o similar, una proteasa similar a tripsina, por ejem- plo la mayona de las KLK o una proteasa similar a quimotripsina, por ejemplo PSA, KLK-7 y KLK-9 o similar. Segun una realizacion, la serina proteasa puede ser una proteasa derivada de neutrofilos tal como elastasa de neutrofilos, catepsina G, proteinasa-3 o similar. Preferiblemente, la serina-proteasa es NE.
La muestra es una muestra biologica que puede proceder de una celula, tejido, organo, fluido corporal, fluido deriva- do de una cavidad corporal y/o un sitio potencialmente patologico, por ejemplo un sitio de inflamacion potencial, ma- lignidad o similar, un fluido de lavado o similar
Tfpicamente, el fluido corporal es saliva, sangre, fluido linfatico, fluido gingival crevicular, fluido de las vfas respirato- rias, por ejemplo, esputo inducido o expectorado o lavado broncoalveolar, lfquido sobrenadante de un homogeneiza- do de tejido o preparacion celular, fluido fecal, ascitis o fluido de herida o similar. Las celulas o el tejido pueden tra- tarse apropiadamente para obtener un fluido, por ejemplo utilizando un tampon, un tampon de lisis celular o similar y maceracion, homogeneizacion y/o centrifugacion. El fluido de lavado puede ser adecuadamente fluido de lavado broncoalveolar. El fluido de lavado puede proceder, por ejemplo de la broncoscopia de un paciente con FC, EPOC, cancer de pulmon, bronquiectasia u otra enfermedad cronica o aguda de las vfas respiratorias.
El fluido procedente de un sitio potencialmente patologico puede ser adecuadamente fluido crevicular gingival de pacientes con enfermedad periodontal. Es particularmente preferible determinar las serina-proteasas derivadas de neutrofilos en el fluido crevicular de pacientes con enfermedad periodontal, ya que estas proteasas estan asociadas con enfermedad periodontal.
Si un fluido y/o tejido procede de un sitio potencialmente patologico, por ejemplo un sitio que muestra malignidad se detectan preferiblemente kalikreina y/o activador de plasminogeno.
Adicionalmente, la muestra biologica, por ejemplo esputo, puede ser adecuadamente tratada, por ejemplo lavada con tampon y sometida a vortice, lisada, homogeneizada, centrifugada, al menos parcialmente fraccionada, al menos parcialmente purificada o similares. La sangre puede ser fraccionada para obtener plasma o suero.
La cantidad de compuesto que ha de anadirse depende del tipo de muestra biologica y la proteasa que se ha de detectar. Tfpicamente, para la deteccion de una proteasa activa se anaden 1 a 10 pL de una solucion 10 mM del compuesto por mL de muestra biologica acuosa; mas adecuadamente se anaden 5 pL de una solucion 10 mM del compuesto por mL de una muestra biologica acuosa.
El tiempo transcurrido entre el mezclamiento de la muestra y el compuesto y la deteccion del complejo detectable depende de la cantidad de muestra que se ha de determinar y de la proteasa activa que se ha de detectar. Tfpica- mente, el tiempo transcurrido sera de 5 minutos a 1 hora, adecuadamente menos de 30 minutos.
El metodo de la presente invencion proporciona por tanto un metodo de deteccion y/o inhibicion de biomarcadores de proteasas dianas rapido, practico y fiable. Esto permite la deteccion habitual de proteasas, por ejemplo en clmicas y laboratorios de hospitales.
De acuerdo con una realizacion de un metodo de la invencion que utiliza un compuesto de la invencion, el metodo para la deteccion comprende el uso de un ensayo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA). Tfpicamente, el complejo detectable es capturado por contacto con un sustrato que comprende un grupo de captura que se une al complejo detectable inmovilizandolo sobre el sustrato. Tfpicamente, el grupo de captura se puede unir al grupo indicador. Adecuadamente, en una realizacion, el sustrato se puede recubrir con un grupo de captura que comprende estrepta-
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vidina y el grupo indicador es biotina. Se puede usar cualquier sustrato adecuado, tal como placa(s), perlas, disco, partmulas, matrices o similares. El complejo del compuesto de la invencion y la proteasa en donde el complejo esta unido a un sustrato se pueden detectar, por ejemplo, por inmunodeteccion usando un conjugado anticuerpo-enzima espedfico para la proteasa, por ejemplo la proteasa activa.
En realizaciones, el anticuerpo de deteccion por ejemplo, en el caso de un ensayo de elastasa sena anti-elastasa (de especie. por ejemplo de neutrofilos humanos) y podna ser un anticuerpo monoclonal o policlonal que contenga un conjugado enzimatico, tal como peroxidasa de rabano silvestre (HRP), fosfatasa alcalina (AP) o similares. La cuantificacion de la proteasa activa unida se realizana por lo tanto a traves de la conversion de un sustrato complementary en un producto legible, por ejemplo sustratos cromogenos tales como 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), acido 2,2'-azinobis-[3-etilbenzotiazolina-6-sulfonico (ABTS) o dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD) para la conversion por HRP o en el caso de AP, fosfato de p-nitrofenilo (PNPP); o cualquier sustrato quimioluminiscente, qui- miofluorescente o Raman adecuado para el revelado con HRP.
Alternativamente, antes o durante el mezclamiento con el compuesto de la presente invencion se puede anadir a la muestra biologica un conjugado de anticuerpo espedfico no neutralizante (es decir, en donde la union a la proteasa no interfiere con la exposicion del sitio activo de la proteasa al compuesto). De acuerdo con una realizacion, el anticuerpo y el compuesto de la presente invencion se anaden a la muestra biologica en una sola etapa. Por ejemplo, se anaden simultaneamente los reactivos requeridos o se anade una premezcla que comprende los reactivos requeri- dos. La adicion simultanea de los reactivos requeridos reducina el tiempo total de analisis. La adicion simultanea de los reactivos requeridos es particularmente apropiada cuando el anticuerpo no interfiera con el sitio activo de la proteasa. La adicion simultanea de los reactivos requeridos tambien puede ser particularmente apropiada cuando la muestra biologica esta en forma de una mezcla bruta, tal como un lisado celular, una mezcla de protemas parcial- mente purificada o similar.
El complejo del compuesto de la invencion y la proteasa puede ser inmovilizado como se ha indicado anteriormente y ser detectado en consecuencia. En general, pueden usarse los mismos metodos de deteccion independientemente de si el anticuerpo se anade a la mezcla, antes o despues de la adicion del compuesto de la presente invencion. Alternativamente, el soporte/sustrato solido puede ser recubierto con un anticuerpo no neutralizante espedfico que se puede usar para inmovilizar la proteasa sobre el soporte solido. A continuacion, el compuesto se puede anadir al ensayo despues de una etapa de lavado apropiada para unirse irreversiblemente a la proteasa inmovilizada con anticuerpo y el complejo se puede detectar por la adicion de un conjugado apropiado. El grupo indicador en el compuesto es biotina y por lo tanto un conjugado estreptavidina-HRP es capaz de unirse al grupo indicador y el complejo ser cuantificado a traves de la conversion de un sustrato de HRP adecuado como se ha indicado anteriormente.
En realizaciones, el ensayo se puede llevar a cabo a temperatura ambiente. Alternativamente, el ensayo se puede llevar a cabo a temperaturas elevadas adecuadas, por ejemplo de 30°C a 38°C, por ejemplo aproximadamente 37°C. Se apreciara que los resultados se pueden obtener mas rapidamente si la temperatura de reaccion es la temperatura de reaccion optima o un valor proximo, generalmente 30 a 38°C, preferiblemente alrededor 37°C.
Preferiblemente, se lleva a cabo al menos una etapa de lavado adecuada para purificar al menos parcialmente la proteasa. Tfpicamente, la etapa de lavado se realiza despues de la formacion, pero antes de la deteccion del complejo detectable. Puede utilizarse cualquier solucion de lavado adecuada conocida por el experto en la tecnica, tal como un tampon de lavado, por ejemplo una solucion salina tamponada con fosfato o una solucion salina tamponada con Tris, que contiene preferiblemente Tween-20 al 0,05% (v/v).
Dependiendo del sustrato soporte solido y del mecanismo de captura, es decir, bien por el anticuerpo de captura o por el compuesto, el metodo puede incluir la etapa de bloquear los sitios no unidos sobre el soporte solido, tfpica- mente antes de que la muestra se mezcle con el compuesto. Esta etapa puede efectuarse por la adicion de un pep- tido, protema o mezcla de protemas adecuados, tal como seroalbumina bovina, ovoalbumina, casema, gelatina, leche desnatada o similar.
Preferiblemente, la etapa de deteccion del complejo detectable se realiza utilizando al menos un sustrato adecuado, preferiblemente un sustrato acuoso, capaz de convertirse en un producto detectable, en particular un producto de color diferente. Segun una realizacion, el sustrato es 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) o fosfato de p-nitrofenilo. El sustrato se puede convertir por peroxidasa de rabano silvestre o fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina o con un anticuerpo espedfico.
Adicional o alternativamente, se pueden usar sustratos fluorogenicos, luminescentes o Raman adecuados. Como se apreciara, dichos sustratos pueden aumentar la sensibilidad de la deteccion hasta niveles de nanogramos y pico- gramos.
El metodo tiene la ventaja de que es altamente espedfico, puesto que el grupo de reconocimiento espedfico del compuesto es reconocido por una secuencia de reconocimiento espedfica de la proteasa diana. Ademas, el metodo proporciona una buena sensibilidad de deteccion, puesto que el compuesto tiene una alta afinidad para la proteasa diana.
Cuando el metodo de deteccion se realiza sobre una muestra de control, se detecta al menos 90 por ciento de la
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proteasa presente. Adecuadamente se detecta 95 a 100 por cien de la proteasa presente; ventajosamente se detecta alrededor de 99 por ciento de la proteasa presente.
De acuerdo con una realizacion, el metodo se puede usar para detectar mas de una proteasa en una muestra por el uso de mas de un compuesto de la presente invencion, en donde cada compuesto de la presente invencion anadido a la muestra tiene una afinidad diferente. Tfpicamente, en una muestra se detecta mas de una proteasa. Cada compuesto de la presente invencion puede anadirse a la muestra simultanea o secuencialmente.
Tambien se describe un compuesto como se ha descrito anteriormente y a continuacion para su uso en la deteccion y/o inhibicion de proteasas, particularmente serina-proteasas activas.
Tambien se describe un metodo para detectar o monitorizar un estado patologico en un sujeto, que comprende las etapas de:
proporcionar una muestra del sujeto,
Incubar la muestra con un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 para unir la proteasa, en particular una serina-proteasa diana activa, con el fin de formar un complejo detectable y determinar la cantidad de proteasa en la muestra por analisis de la cantidad del complejo detectable presente, comparando la cantidad de proteasa en la muestra con un nivel normal de proteasa en dicha muestra, y en donde un nivel elevado de la proteasa comparado con un nivel normal es indicativo de un estado patologico.
La proteasa puede ser una serina-proteasa activa. Tfpicamente, la serina-proteasa puede ser una proteasa similar a la elastasa, por ejemplo elastasa de neutrofilos (NE) o similar, una proteasa similar a tripsina, por ejemplo la mayona de las KLK, o una proteasa similar a quimotripsina, por ejemplo PSA, KLK-7 y KLK-9 o similar. De acuerdo con una realizacion, la serina-proteasa puede ser una proteasa derivada de neutrofilos, tal como elastasa de neutrofilos, catepsina G, proteinasa-3 o similar. Preferiblemente, la serina-proteasa es NE.
El aumento porcentual de la proteasa depende de la proteasa diana, asf como de la naturaleza del estado patologico. Tfpicamente, la cantidad de proteasa activa esta aumentada en al menos 10 veces en comparacion con el nivel normal y puede exceder de 100 veces dependiendo de la enfermedad y estado de salud del paciente. Tfpicamente, las proteasas activas no se detectan en individuos sanos a niveles tan elevados. Por ejemplo, las proteasas activas generalmente no se detectan en los pulmones de individuos sanos.
El nivel normal de proteasa puede estar en un intervalo, en cuyo caso la cantidad de proteasa en la muestra se compara con el valor superior del intervalo normal.
Un aumento de 5 veces o mas de la proteasa es generalmente indicativo de un estado patologico. Tfpicamente los estados patologicos pueden estar asociados a un aumento de hasta 100 veces o mas.
De acuerdo con una realizacion, el estado patologico es inflamacion, incluyendo enfermedades de las vfas respirato- rias, tales como fibrosis qrnstica (Mayer-Hamblett et al., 2007), enfermedad pulmonar obstructiva cronica (Djekic et al., 2009), bronquiectasia, enfisema, deficiencia congenita de alfa-i-antitripsina y trastornos respiratorios agudos (abreviadamente ARDS por la expresion inglesa Acute Respiratory Distress) (Hayakawa et al., 2010); aterosclerosis (Henriksen and Sallenave, 2008), pancreatitis (Frossard et al., 2001); enfermedad periodontal aguda (Ozgaka et al., 2010); tumores malignos solidos (Sato et al., 2006) y malignidades hematologicas, por ejemplo leucemias; coagula- cion intravascular diseminada, septicemia (Hayakawa et al., 2010), aneurismas (Gaetani et al., 1998), heridas croni- cas no cicatrizantes (Trengove et al., 1996), infeccion bacteriana, viral o fungica o similares. Como se discute en la presente memoria, sena ventajoso proporcionar un metodo rapido para detectar proteasas activas, puesto que la determinacion de proteasas activas puede ser util en pruebas de diagnostico y/o pronostico. Puede ser util detectar un amplio conjunto de proteasas activas o una o mas de una proteasa particular, por ejemplo seleccionada de elastasa, proteasa similar a quimotripsina o similar a tripsina; metaloproteinasas, tales como gelatinasas, matrilisina o colageno intestinal; cistema, por ejemplo catepsina, B, L, S o caspasas.
Utilizando los compuestos de la presente invencion: un grupo indicador enlazado (grupo indicador y espaciador) - una secuencia de reconocimiento espedfica y un grupo de union (ligando de captura (parte activa)) los inventores han desarrollado kits de ensayos para detectar espedfica y selectivamente proteasas de muestras de ensayo.
Los kits de ensayo pueden utilizar el formato ELISA para cuantificar el nivel de proteasa en un dispositivo de flujo lateral con muestra, tal como la tecnologfa de tira reactiva o la tecnologfa de chip de proteasa.
Pueden usarse adecuadamente kits ensayo para realizar el diagnostico o pronostico de enfermedades o afecciones, tales como, por ejemplo, enfermedades respiratorias (fibrosis qrnstica, bronquiectasia y EPOC), cancer, leucemia, enfermedad cardiovascular e infeccion bacteriana.
Adicionalmente, los kits se pueden usar en el descubrimiento de farmacos para cribar quimiotecas para la identifica- cion de inhibidores espedficos, que se podnan usar por ejemplo como terapias antiproteasas en una gama de trastornos patologicos. Por consiguiente, dichos ensayos de cribado de farmacos en donde se proporcionan a una pro-
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teasa un compuesto de ensayo y un compuesto de la presente invencion y la inhibicion de la union del compuesto de la invencion a la proteasa en relacion con la presencia de un compuesto de ensayo pueden ser un aspecto adicional de la presente invencion.
Ventajosamente, el kit mide proteasas activas, no proteasas que ya han sido inactivadas por neutralizacion con un inhibidor endogeno y por lo tanto ya no son capaces de causar dano tisular, propagar inflamacion o activar otras entidades bioqmmicas. Por ejemplo, la NE es inactivada de un modo estequiometrico 1:1 por su inhibidor natural alfai-antitripsina. Una vez unida, se somete a degradacion y ya no es clmicamente relevante. Por lo tanto, la medi- cion de esta protema no sena util ni para el diagnostico ni para el pronostico. La protema biomarcadora total es de- tectada por ELISA solo con anticuerpos estandares que en el caso de la NE abarcana tanto la NE libre activa como la NE/AAT complejada inactiva.
Tambien se discute un sistema o kit de ensayo para la deteccion de una proteasa, que comprende un compuesto como el descrito anteriormente y a continuacion
Particularmente, la proteasa es una serina-proteasa activa, por ejemplo una proteasa similar a la elastasa, similar a la tripsina y similar a la quimotripsina. Como se apreciara, el sistema de ensayo s que comprende dicho compuesto proporciona altas especificidad y sensibilidad, es rapido y sencillo para el usuario. Ademas, el sistema de ensayo es facil de usar y tiene un alto valor predictivo.
En una realizacion, el sistema de ensayo puede estar en forma de un ensayo ELISA, dispositivo de flujo lateral que incluye tiras reactivas, chip o similar
En una realizacion preferida, el metodo para la deteccion es un ensayo ELISA (Ensayo con inmunosorbente unido a enzima). El ensayo ELISA puede incluir la captura selectiva de un complejo formado por la proteasa y el compuesto de la presente invencion usando un sustrato que comprende un grupo de captura, tal como estreptavidina. Adecua- damente, el sustrato puede estar en la forma de placa(s), perla(s) o similares recubiertas con estreptavidina. Tras la captura del complejo por el sustrato, se puede detectar dicho complejo, por ejemplo por inmunodeteccion usando un anticuerpo espedfico para la proteasa o similar. Alternativamente, la inmunocaptura que usa un anticuerpo espedfi- co para la proteasa se puede usar tambien para detectar y/o aislar selectivamente la proteasa en una mezcla bruta, tal como un lisado celular, una mezcla de protemas parcialmente purificada o similar, antes de la adicion del compuesto para la subsiguiente deteccion. En este caso la subsiguiente deteccion se puede realizar por la formacion de un conjugado biotina-estreptavidina-peroxidasa formado a partir del complejo del compuesto y el biomarcador de captura. Esto se puede realizar en una reaccion de una sola etapa. Por ejemplo, el uso de un anticuerpo que no in- terfiera con el sitio activo de la proteasa puede permitir la aportacion simultanea a una muestra del anticuerpo y el compuesto de la presente invencion. Por ejemplo, en un formato particular del sistema de ensayo los reactivos re- queridos se pueden anadir simultaneamente o se anade una premezcla que comprende los reactivos requeridos, reduciendo de este modo el tiempo total de ensayo.
El formato ELISA es ventajoso, puesto que proporciona un formato cuantitativo, que ahorra trabajo y tiempo, que tfpicamente lleva 3,5 horas y normalmente no mas de 4 horas.
En particular, el formato ELISA es ventajoso para analizar la NE activa, que puede ser capturada por un compuesto que es espedfico para la NE. Un conjugado del anticuerpo espedfico subsiguientemente aplicado proporciona una amplificacion adicional de la senal, proporcionando por tanto mucha mayor sensibilidad.
La incubacion con el anticuerpo llevara generalmente 5 minutos a 2 horas, particularmente alrededor de 1 hora. Esta incubacion a corto plazo es particularmente ventajosa, puesto que se pueden obtener rapidamente los resultados.
Como se apreciara el formato de ensayo con dispositivo de flujo lateral o tira reactiva es ventajoso puesto que es robusto, conveniente y facil de usar. Ademas, se puede incorporar facilmente en las determinaciones habituales de pacientes bien sea en el punto de atencion o para la monitorizacion personal como kit de ensayo domestico. Se apreciara que el formato de ensayo con dispositivo de flujo lateral/tira reactiva es particularmente util en la clmica para un resultado cualitativo y posiblemente semicuantitativo que podna ayudar a la monitorizacion del paciente y proporcionar un marcador temprano que podna informar para decisiones clmicas respecto a tratamiento, incluyendo tratamientos profilacticos.
Tambien se discute un kit para detectar una proteasa, particularmente una serina-proteasa activa, que comprende un compuesto como se ha definidos antes y en lo sucesivo en la presente memoria.
El kit puede comprender ademas al menos un agente de deteccion adecuado, que sea capaz de detectar, por ejemplo uniendose a el un grupo indicador del compuesto como se ha descrito antes y en lo sucesivo en la presente memoria.
El kit puede comprender un soporte adecuado, por ejemplo un soporte de matriz solida. El soporte de matriz puede ser una membrana, tal como nitrocelulosa, una resina, tal como resina N-MCA-N1-FMOC-etilendiamina MPB-AM (vendida tfpicamente con el nombre comercial NovaTag™) o similar. Preferiblemente, el al menos un agente de union puede estar unido al menos temporalmente al soporte. Por ejemplo, el agente de union esta unido covalente-
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mente al soporte. Adicionalmente, otros componentes del analisis pueden estar unidos, por ejemplo covalentemente al soporte.
El kit puede comprender un dispositivo de deteccion adecuado, que sea capaz de detectar un grupo indicador ade- cuado del compuesto. Por ejemplo, el dispositivo de deteccion puede comprende runa fuente de luz (UV o visible), fluorescencia, luminiscencia, un laser o similar.
El kit puede comprender al menos un componente de tampon adecuado, por ejemplo una premezcla de tampon, una solucion tampon o similar. Como se apreciara el componente de tampon ayuda a la preparacion de la muestra.
Para el usuario del kit puede ser de ayuda que dicho kit comprenda una referencia, tal como una tarjeta de colores que da el intervalo del ensayo como grna de los niveles clmicos aceptables o inaceptables o similar.
Tambien se describe un producto o dispositivo para detectar espedficamente serina-proteasas activas, que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 y una matriz a la cual esta fijado por ejemplo unido, el compuesto permanentemente o semipermanentemente,.
Particularmente, el producto puede ser un dispositivo de flujo lateral, tal como una tira reactiva, chip, membrana, placa o similar. En realizaciones, el producto puede comprender una almohadilla absorbente, una membrana de ensayo, un anticuerpo inmovilizado y un compuesto de la presente invencion, en donde la almohadilla absorbente esta dispuesta para recibir una muestra de ensayo, de tal modo que la muestra de ensayo se ponga en contacto con un compuesto de la presente invencion, tal que si esta presente una proteasa en la muestra que se ha de detectar, pueda formar un complejo con el compuesto. El complejo puede migrar luego a traves del dispositivo y unirse a un conjugado con un agente de deteccion, por ejemplo estreptavidina-oro coloidal. El complejo expandido puede migrar luego traves del dispositivo, por ejemplo tfpicamente por flujo lateral. El complejo expandido puede ser unido luego por el anticuerpo inmovilizado, por ejemplo el anticuerpo inmovilizado espedfico para la proteasa que se investiga. Preferiblemente, la union del complejo por el anticuerpo inmovilizado puede ser visualizada en una ventana de ensayo. En realizaciones preferidas el producto puede comprender ademas un anticuerpo inmovilizado con especifici- dad de union para el grupo indicador del compuesto o agente de deteccion del conjugado.
En realizaciones se pueden proporcionar al menos dos compuestos en donde al menos los dos compuestos tienen especificidad para diferentes proteasas, por ejemplo un primer compuesto con especificidad para elastasa y un se- gundo compuesto con especificidad para proteasas similares a quimiotripsina o tripsina.
Tambien se discute un metodo de identificar un compuesto capaz de unir espedficamente un biomarcador diana, en particular una serina-proteasa activa, para uso en un sistema de ensayo,, que comprende las etapas de:
proporcionar un compuesto, comprendiendo dicho compuesto
un grupo de union capaz de unirse establemente al biomarcador diana,
un grupo de reconocimiento espedfico, particularmente un grupo peptidilo para el biomarcador diana, un grupo espaciador, y
un grupo indicador, que esta conectado al grupo de reconocimiento por el grupo espaciador, y preferiblemente un resto de succinilo entre el grupo espaciador y el grupo de reconocimiento espedfico,
incubar el compuesto con la proteasa diana y al menos otra proteasa, en particular al menos otra serina- proteasa activa, y
determinar si se ha formado un complejo detectable solamente con el biomarcador diana,
en donde un complejo detectable con solamente la proteasa diana es indicativo de que el compuesto es capaz de unir selectivamente la proteasa diana..
Esto es particularmente ventajoso, puesto que una variedad de compuestos espedficos o familias de compuestos espedficos puede ser conveniente y rapidamente desarrollada para uso en un sistema de ensayo, tal como un for- mato ELISA, un formato de analisis con un dispositivo de flujo lateral/tira reactiva, formato de chip o similar.
Un sistema o kit de ensayo que comprende un compuesto de la invencion puede ser un dispositivo de flujo lateral o tira reactiva. Dichas realizaciones pueden ser formadas adecuadamente para uso en un punto de ensayo de aten- cion para ayudar al tratamiento del paciente o como kit de ensayo domestico para el tratamiento y el control personal de la enfermedad.
La invencion se describira ahora adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitativos con referencia a los dibujos que se acompanan, en los cuales:
un grupo indicador que esta conectado al grupo de reconocimiento por el grupo espaciador, y preferiblemente
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un resto de succinilo entre el grupo espaciador y el grupo de reconocimiento espedfico,
incubar el compuesto con el biomarcador diana y al menos otro biomarcador, en particular al menos otra seri- na-proteasa activa, y
determinar si se ha formado un complejo detectable solamente con el biomarcador diana,
en donde un complejo detectable solamente con el biomarcador diana es indicativo de que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al biomarcador diana.
Adecuadamente en el metodo se proporciona un compuesto de la presente invencion como se ha descrito en la presente memoria.
Esto es particularmente ventajoso, puesto que se puede desarrollar conveniente y rapidamente una variedad de compuestos espedficos o familia de compuestos espedficos para uso en un sistema de ensayo, tal como un formato de ELISA, un formato de dispositivo de flujo lateral/tira reactiva, formato de chip o similar.
En realizaciones de la invencion, un sistema o kit de ensayo que comprende un compuesto de la invencion puede ser un dispositivo de flujo lateral o tira reactiva. Dichas realizaciones pueden ser formadas adecuadamente en un punto de ensayo de atencion para ayudar al tratamiento del paciente o como kit de ensayo domestico para el trata- miento y control personal de la enfermedad.
La invencion se describira ahora en los siguientes ejemplos no limitativos con referencia a los dibujos que se acom- panan, en los cuales:
La Fig. 1 muestra una representacion esquematica de un biotina-PEG-Phe-difenilfosfonato,
La Fig. 2 muestra una representacion esquematica de un biotina-PEG-Val-difenilfosfonato,
La Fig. 3 muestra una representacion esquematica de un biotina-PEG-Lys-difenilfosfonato,
La Fig. 4 muestra una representacion esquematica de la smtesis de biotina-PEG-Succ-ValP(OPh)2,
La Fig. 5 muestra una representacion esquematica de la smtesis de biotina-PEG-Succ-ArgP(OPh)2,
La Fig. 6 muestra una representacion esquematica de la preparacion de sal del acido fosfonoso,
La Fig. 7 muestra una representacion esquematica de la smtesis del analogo racemico de la valina,
La Fig. 8 muestra una representacion esquematica de la smtesis de (R)-Cbz-ValP(OH)H,
La Fig. 9 muestra una representacion esquematica de la smtesis del analogo de (R)-Succ-ValP, y
La Fig. 10 muestra una representacion esquematica del acoplamiento del analogo de (R)-Succ-ValP a biotina-PEG- resina NovaTag™
La Fig. 11 ilustra el ensayo ELISA de NE-Tag frente al de la actividad de la fluorescencia, donde en el eje Y se re- presentan las unidades de fluorescencia relativa/minuto (UFR/min) y en el eje X la elastasa de neutrofilos (ng/mL). ■ muestra el ensayo ELISA de NE-Tag que usa el compuesto de la invencion y ♦ muestra el ensayo de actividad fluo- rogenica, y
La Fig. 12 muestra los resultados de ensayos comparativos en los que los datos se presentan como p (rho) de Spearman (valor p), ** correlacion significativa en el nivel de 0,01 (2 colas), * correlacion significativa en el nivel de 0,05 (2 colas), ND. No se realizo debido a una muestra insuficiente, y
La Fig. 13 muestra las correlaciones de NE con los datos clmicos, en donde los datos estadfsticos se representan como el valor r de Pearson (valor p), f Datos no parametricos se representan como p de Spearman (valor p), ** co- rrelacion significativa en el nivel de 0,01 (2 colas), * correlacion significativa en el nivel de 0,05 (2 colas).
En la Fig. 1 se muestra una representacion esquematica de biotina-PEG-Phe-difenilfosfonato. El biotina-PEG-Phe- difenilfosfonato tiene la formula molecular C44H60N5O10PS y una composicion molecular de 59,92% de C, 6,86% de H, 7,94% de N, 18,14% de O, 3,51% de P y 3,64% de S. Tiene un peso molecular de 882,03 y una masa de 881.
En la Fig. 2 se muestra una representacion esquematica de biotina-PEG-Val-difenilfosfonato. El biotina-PEG-Val- difenilfosfonato tiene la formula molecular C40H60N5O10PS y una composicion molecular de 57,61% de C, 7,25% de H, 8,40% de N, 19,18% de O, 3,71% de P y 3,84% de S. Tiene un peso molecular de 833,99 y una masa de 833.
En la Fig. 3 se muestra una representacion esquematica de biotina-PEG-Lys-difenilfosfonato. El biotina-PEG-Lys- difenilfosfonato tiene la formula molecular C41H63N6O10PS y una composicion molecular de 57,06% de C, 7,36% de H, 9,74% de N, 18,54% de O, 3,59% de P y 3,72% de S. Tiene un peso molecular de 863,03 y una masa de 862.
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Ejemplo I
Smtesis de biotina-PEG-Succ-ValP(OPh)2
Se sintetizo biotina-PEG-Succ-ValP(OPh)2 de acuerdo con el esquema mostrado en la FIG. 4.
Se calentaron isobutiraldehndo (1), trifenilfosfito (2) y carbamato de bencilo (3) en acido acetico proporcionando Cbz- ValP(OPh)2 (4) que se desprotegio utilizando HBr al 33%/AcOH v/v (tfpicamente incubado a temperatura ambiente durante 90 minutos). La sal de HBr resultante (5) se hizo reaccionar con anhndrido succmico y el derivado de succini- lo formado (6) se acoplo a biotina-PEG-resina NovatagR usando HATU/DIPEA obteniendose (7) como se muestra en la Fig. 4
Ejemplo II
Smtesis de biotina-PEG-Succ-ArgP(OPh)2
Se sintetizo biotina-PEG-Succ-ArgP(OPh)2 de acuerdo con el esquema mostrado en la FIG. 5.
Se calento 4-(N-ftaloil)butiraldehndo (10) (preparado a partir de anhndrido ftalico (9) y 4-aminobutiraldehndo- dietilacetal (8)) con fosfito de trifenilo y carbamato de bencilo en AcOH obteniendose N-w-Pth-N-a-Cbz-OrnP(OPh)2 (12). La eliminacion del grupo ftaloilo usando hidrato de hidrazina seguido por reaccion con N,N'-bis-Boc-S- metiltiourea produjo el derivado de arginina (14) que se desprotegio en el a-N por hidrogenolisis catalttica usando H2- Pd al 10%/C. El material desprotegido (15) se hizo reaccionar luego con anhndrido succmico y se acoplo a biotina- PEG-resina Novatag usando HaTU/DIPEA obteniendose (17).
Ejemplo III
Smtesis de biotina-PEG-Succ-(R)-ValP(CH2CH2CO2Et)(OPh)
(a) Preparacion de la sal del acido fosfonoso
La sal del acido fosfonoso se sintetizo de acuerdo con el esquema mostrado en la FIG. 6.
Se hicieron reaccionar acido hipofosforoso anhidro (19) (preparado a partir de una solucion acuosa al 50% p/v por eliminacion de agua a alto vado a temperatura ambiente) y difenilmetilamina (18) en etanol anhidro y el producto precipitado resultante se recogio por filtracion.
(b) Preparacion del analogo racemico de la valina
Se sintetizo el analogo racemico de la valina de acuerdo con el esquema mostrado en la FIG. 7.
Se calentaron la sal del acido hipofosforoso-difenilmetilamina (20) e isobutiraldehndo en etanol a reflujo formando el acido difenilmetilaminofosfonoso (21). Este se desprotegio utilizando acido bromhndrico al 48%. Despues del trata- miento con oxido de propileno se obtuvo el material protegido con Cbz (23) haciendo reaccionar (22) con clorofor- miato de bencilo a pH 9,0 - 9,5.
(c) Preparacion de (R)-Cbz-ValP(OH)H
Se sintetizo (R)-Cbz-ValP(OH)H de acuerdo con el esquema mostrado en la FIG. 8.
Se hizo reaccionar Cbz-ValP(OH)H racemico (23) con (R)-(+)-a-metilbencilamina (24) en etanol anhidro a reflujo. La sal precipitada se recupero y recristalizo en etanol anhidro varias veces hasta que se obtuvo el material opticamente puro [rotacion optica ([a]o = -16,40 c, 1 en etanol)]. La sal resuelta (25) se agito en HBr al 33%/AcOH a 0°C seguido por tratamiento con oxido de propileno obteniendose el acido (R)-aminofosfonoso (26) que se reconvirtio en el material protegido con Cbz (27) por reaccion con cloroformiato de bencilo a pH 9,0 - 9,5.
(d) Preparacion del analogo de (R)-Succ-ValP
Se sintetizo el analogo de (R)-Succ-ValP de acuerdo con el esquema mostrado en la FIG. 9.
Se preparo el analogo de N-Succ-(R)-ValP(CH2CH2CO2Et)(OPh) (31) a partir del acido (R)-N-Cbz-fosfonoso (27) por reaccion con acrilato de etilo obteniendose acido fosfmico (28) seguido de tratamiento con cloruro de oxalilo formando el cloruro de acido y con fenol formando el ester de fenilo (29). La eliminacion del grupo Cbz con HBr al 33%/AcOH y la reaccion con anhndrido succmico dio el producto de succinilo requerido (31)
(e) Acoplamiento del analogo de (R)-Succ-ValP a biotina-PEG-resina Novatag
Se acoplo el analogo de (R)-Succ-ValP a biotina-PEG-resina Novatag de acuerdo con el esquema mostrado en la FIG. 10.
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Esta etapa se realizo bajo las condiciones de acoplamiento utilizadas previamente, es decir, HATU/DIPEA, como se indica en los ejemplos I y II.
Ejemplo IV
Union del compuesto proporcionado por uno de los Ejemplos I a III y una proteasa diana.
El compuesto se une rapidamente a la proteasa diana a temperatura ambiente. Sin embargo, se prefiere una tempe- ratura de 37°C. La union se consigue anadiendo el compuesto a una concentracion adecuada (o a la concentracion optima) obteniendose tipicamente una concentracion final de 10 pM a una muestra que comprende la proteasa diana e incubandola durante aproximadamente 15 minutos u otro tiempo adecuado para formar un complejo. El complejo se puede detectar usando ELISA como se ha descrito anteriormente; por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) seguido por electrotransferencia sobre nitrocelulosa y deteccion utilizando un agente adecuado, por ejemplo estreptavidina o un anticuerpo relevante, conjugado con una enzima, tal como fosfa- tasa alcalina o preferiblemente peroxidasa de rabano silvestre; por transferencia de puntos o por un dispositivo de flujo lateral, tal como un ensayo con tira reactiva.
Ejemplo V
Un kit de ensayo puede comprender un sustrato de estreptavidina previamente recubierto, por ejemplo, una placa de estreptavidina comercialmente disponible, y se proporciona un compuesto de la presente invencion. Opcionalmente, el kit puede incluir ademas un anticuerpo o miembro de union con especificidad de union a la proteasa a la que el compuesto tiene especificidad de union con un indicador conjugado a el.
En una realizacion, un kit de ensayo puede comprender una placa de estreptavidina previamente recubierta, que sea capaz de unirse a un compuesto de la presente invencion con especificidad de union a la elastasa de neutrofilos y un grupo indicador ligado a la biotina.
La muestra de ensayo se puede mezclar con el compuesto de la invencion y aplicarse a la placa de estreptavidina previamente recubierta de manera que el grupo indicador ligado a biotina del compuesto de la invencion se pueda unir a la estreptavidina en la placa. Los tiempos de incubacion de la muestra en la placa se pueden optimizar para que se produzca una union adecuada. La placa se puede lavar entonces con tampon y un anticuerpo conjugado anti- elastasa de neutrofilos-peroxidasa usado para sondar la placa lavada. Puesto que la placa retendra la elastasa de neutrofilos activa que habfa sido unida por el compuesto de la invencion, el anticuerpo conjugado anti-elastasa de neutrofilos-peroxidasa se unira solamente a la elastasa de neutrofilos retenida y la peroxidasa se puede usar para realizar una reaccion ELISA para determinar el nivel de elastasa de neutrofilos presente. Opcionalmente, se pueden incluir en el kit tampones de bloqueo y el metodo puede incluir una etapa de adicion de los tampones de bloqueo para minimizar la probabilidad de union no espedfica del anticuerpo conjugado anti-proteasa a la placa.
La Figura 11 ilustra un ensayo ELISA de NE-Tag y un ensayo de actividad de fluorescencia. El ensayo de NE-Tag terna un intervalo de deteccion de alrededor de 250-3500 ng/mL y era sensible a aproximadamente 125 ng.
Ejemplo VI
Comparacion de tres sistemas de ensayo.
Se recogieron muestras de esputo de sujetos seleccionados aleatoriamente hospitalizados por exacerbacion aguda de fibrosis qrnstica.
Las muestras se dividieron de tal manera que una fraccion de muestras se centrifugo a 30.000 g durante 1 hora a 4°C, mientras que otra fraccion se diluyo en 4 partes de PBS (solucion salina tamponada con fosfato) y se hizo girar mecanicamente durante 1 minuto antes de la centrifugacion a 3000 g durante 30 minutos a 4°C.
A continuacion se detecto la actividad de NE usando un ensayo de actividad de fluorescencia convencional, usando el ensayo de actividad de inmunocaptura convencional de NE Innozyme™ (Calbiochem) y el ensayo ELISA descrito en el Ejemplo V. Los resultados de estos ensayos se proporcionan en las Figuras 11 y 12.
Ventajosamente, el ensayo ELISA de NE-TAG proporciono una captura selectiva acoplada con inmunodeteccion espedfica y se correlaciono apropiadamente con parametros clmicos.
Ejemplo VII
Tambien se puede proporcionar un kit de ensayo para detectar la proteasa utilizando compuestos de la invencion como un dispositivo de flujo lateral/ensayo con tira reactiva.
En dicha realizacion, una tira reactiva puede comprender un compuesto de la invencion que se puede unir espedfi- camente a una proteasa de interes, una parte receptora de muestra, un anticuerpo inmovilizado con especificidad de union a la proteasa de interes, una parte del resultado del ensayo y opcionalmente una parte de control.
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Se proporciona la muestra de ensayo a la parte receptora de la muestra, por ejemplo una almohadilla absorbente en comunicacion con una membrana de ensayo. Se permite que el compuesto de la invencion forme un complejo con proteasa en la muestra de ensayo a la que el compuesto de la invencion tiene especificidad de union, por ejemplo un compuesto de la invencion con especificidad de union a NE puede unirse a NE activa presente en la muestra de ensayo.
La proteasa unida al compuesto de la invencion con un grupo indicador enlazado adecuado puede entonces ser puesto en comunicacion con el anticuerpo inmovilizado, por ejemplo utilizando un recorrido de fluido en una membrana de ensayo sobre la cual se puede inmovilizar un anticuerpo, de manera que el complejo puede ser concentra- do por el anticuerpo inmovilizado en una parte del resultado del ensayo, por ejemplo una ventana de visualizacion en la que se puede detectar la parte indicadora del compuesto de la invencion.
Opcionalmente, la tira reactiva puede comprender ademas una parte de control que, por ejemplo, comprende anti- cuerpos inmovilizados con especificidad de union al indicador del compuesto de interes, situados mas alla de la tra- yectoria de flujo de los anticuerpos inmovilizados con especificidad de union a la proteasa, de tal manera que queda claro cuando la muestra y el compuesto de interes debenan haberse movido mas alla de la parte del resultado del ensayo.
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5
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Un compuesto, para la detection de una proteasa espetifica en una muestra, en donde el compuesto tiene una de las siguientes estructuras:5
imagen1 imagen2 imagen3 imagen4 imagen5 imagen6 imagen7 imagen8 oimagen9 - 2. Un metodo para la detection y/o inhibition de una o mas proteasas, que comprende las etapas de:mezclar una muestra biologica, con al menos un compuesto de acuerdo con la revindication 1,permitir que el compuesto se una establemente a una proteasa diana en la muestra para formar un complejo detectable, ydetectar el complejo detectable.
- 3. Un metodo para detectar un estado patologico en un sujeto, que comprende las etapas de:proporcionar un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 a una muestra del sujeto,incubar la muestra con un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 para unir una proteasa con el fin de for- 5 mar un complejo detectable,determinar la cantidad de proteasa en la muestra por la comparacion de la cantidad del complejo detectable presente con un patron, y comparar la cantidad de proteasa en la muestra con un nivel normal de proteasa en dicha muestra,en donde un nivel elevado de la proteasa en comparacion con un nivel normal es indicativo de un estado patolo- 10 gico.
- 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde un aumento de al menos 5-100 veces es indicativo de un estado patologico.
- 5. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, en donde el estado patologico es una en- fermedad cronica o aguda de las vfas respiratorias, tal como fibrosis qmstica, enfermedad pulmonar obstructiva cro-15 nica, bronquiectasias, deficiencia congenita de alfa-i-antitripsina, enfisema, disfuncion respiratoria aguda (ARDS); aterosclerosis; pancreatitis, enfermedad periodontal aguda, tumores malignos solidos, coagulacion intravascular di- seminada, septicemia, aneurismas o heridas cronicas no cicatrizantes e infeccion bacteriana, viral o fungica.
- 6. Un sistema de ensayo para la deteccion de una proteasa, que comprende un compuesto de acuerdo con la reivin- dicacion 1.20 7. El sistema de ensayo de la reivindicacion 6, en forma de un ensayo ELISA, dispositivo de flujo lateral/tira reactivao chip.
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