WO1997018217A1 - Verbindungen mit bakterizider und/oder antimykotischer aktivität, herstellungsverfahren, mittel und mikroorganismenstamm - Google Patents

Verbindungen mit bakterizider und/oder antimykotischer aktivität, herstellungsverfahren, mittel und mikroorganismenstamm Download PDF

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WO1997018217A1
WO1997018217A1 PCT/EP1996/005072 EP9605072W WO9718217A1 WO 1997018217 A1 WO1997018217 A1 WO 1997018217A1 EP 9605072 W EP9605072 W EP 9605072W WO 9718217 A1 WO9718217 A1 WO 9718217A1
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WO
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methanol
concentrated
compound
extracted
methylene chloride
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PCT/EP1996/005072
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Gerhard Höfle
Hans Reichenbach
Herbert Irschik
Rolf Jansen
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GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D513/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00
    • C07D513/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D513/08—Bridged systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms

Definitions

  • the invention relates to a compound of the formula
  • the invention further relates to a compound of the empirical formula C 35 H 53 NSO 7 , obtainable from a culture of DSM 10320 and having the following features: - FP: 92 to 94 ° C
  • UV (methanol): lambda max (lg epsilon) 224 (4.74), 231, 239
  • the invention further relates to a compound of the formula:
  • the invention further relates to a compound of the empirical formula C 35 H 53 NSO 7 , obtainable from a culture of DSM 10320 and having the following features:
  • UV (methanol): lambda max (lg epsilon 226 (4.70), 231, 240
  • ny 3422 (f), 2923 (s), 1706 (s), 1455 (s), 1224, 1126 (s), 1060 (s) cm -1
  • the invention further relates to a process for the preparation of active compounds with bactericidal and / or antifungal activity, which can be obtained by
  • the microorganism DSM 10320 is aerobically cultivated in a medium containing carbon, nitrogen and sulfur sources and mineral salts,
  • the concentrated phase is dissolved in methylene chloride, applied to silica gel and eluted with methylene chloride, acetone, methanol and mixtures of these solvents,
  • the active compounds of fractions (k) (i) and / or (k) (ii) can be converted into isomers by UV radiation.
  • the invention further relates to a bactericidal or antifungal agent containing an agent according to the invention
  • the invention relates to a microorganism strain DSM 10320.
  • the vegetative cells are cylindrical rods with round ends, usually around 1 ⁇ m thick and 3 to 6 ⁇ m long. in the
  • the fruiting bodies are dark brown to orange cushions and consist of a more or less large number of densely packed sporangioles, spherical or by mutual
  • the sporangioles contain myxospores, rod-shaped permanent cells of a similar shape and size to the vegetative cells, but slightly refractive and
  • the strain shows strong casein breakdown on skim milk agar.
  • the organism grows well on peptone agar, e.g. B. CY agar
  • yeast agar e.g. B. VY / 2 agar (baker's yeast, 5%, based on fresh weight; CaCl 2 .2H 2 O 0.1%; agar 1.5%; pH 7.2).
  • MDl liquid medium (peptone from casein, tryptically digested, Merck, 0.3%; CaCl 2 .2H 2 O 0.05%; MgSO 4 .7H 2 O 0.2%), which is caused by a carbohydrate source is added, e.g. B. glucose,
  • Medium No. 3 starch, soluble (Merck) 0.3%; Glucose. H 2 O 0.5%; Yeast extract (Difco) 0.2%; Peptone from casein, digested tryptically, 0.1%; CaCl 2 .2H 2 O 0.1%; MgSO 4 .7H 2 O 0.15%; KNO 3 0.05%; NH 4 Cl 0.1%; Na-Fe III - EDTA 8 mg / l; HEPES buffer 0.4%; pH 7.4 before autoclaving.
  • Ventilation 1800 1 air per hour.
  • the fermentor is inoculated with 2 ⁇ 10 l pre-fermenters, each with 1.2 1 of a well-grown culture in shake flasks
  • the pH of the 250-1 fermenter was maintained at 6.9 with 5% KOH.
  • the duration of the fermentation was 5 days.
  • Thuggacin A and B were dissolved in dimethyl sulfoxide and on test sheets (6 mm in diameter) in amounts of 10 ⁇ g each
  • test sheets were placed on agar plates in which various test organisms were sown in low cell density. These test plates were incubated at 30 ° C. After the test organisms had grown, the inhibitory zones were read off. The result is shown in the following table:
  • Contained nutrient medium The initial cell density was 10 cells / ml each. The cultures were incubated at 30 ° C for 18 to 40 hours.
  • peptone from casein tryptically digested, Merck, 0.5%
  • Proteose Peptone Difco, 0.5%
  • Meat extract Oxoid, 0.1%
  • pH 7.0 pH 7.0
  • Micrococcus luteus cells are immediately inhibited from incorporating C- or 3 H-labeled precursors of protein, RNA and DNA synthesis after adding thuggacin A (0.02 ⁇ g / ml). Also the Incorporation of 14 C acetate or glucose into perchloric acid-insoluble substances is immediately inhibited.
  • silica gel filtration the extract was dissolved in methylene chloride and onto 200 ml of silica gel 100 (0.063 to 0.200 mm
  • Thuggacin A was crystallized from ether / petroleum ether.
  • UV (methanol): lambda max (lg epsilon) 224 (4.74), 231, 239 (sh), 289 (4, 11) .-
  • ny 3417 (s), 2926 (s), 1707 (s), 1223 (s), 1043 cm -1 .
  • UV (methanol): lambda max (lg epsilon) 226 (4.70), 231, 240 (sh), 287 (4.13) .-
  • ny 3422 (s), 2923 (s), 1706 (s), 1455 (s) 1224, 1126 (s), 1060 (s) cm -1 .

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft Verbindungen der Formeln (I) und (II), sowie ein Herstellungsverfahren, ein Mittel mit den Verbindungen und einen Mikroorganismenstamm zu ihrer Gewinnung.

Description

VERBINDUNGEN MIT BAKTERIZIDER UND/ODER ANTIMYKOTISCHER
AKTIVITAT, HERSTELLUNGSVERFAHREN, MITTEL UND MIKROORGANISMENSTAMM
Verbindungen mit bakterizider und/oder antimykotischer Aktivität, Herstellungsverfahren, Mittel und Mikroorganismenstamm
Die Erfindung betrifft eine Verbindung der Formel
Figure imgf000003_0001
Ferner betrifft die Erfindung eine Verbindung der Summenformel C35H53NSO7, gewinnbar aus einer Kultur von DSM 10320 und mit den folgenden Merkmalen: - FP: 92 bis 94 °C
- [α]D 22 = minus 148,4 (c = 0,4 in Methanol)
- UV (Methanol): lambdamax (lg epsilon) = 224 (4,74), 231, 239
(Schulter), 289 (4,11)
- IR (KBr) : ny = 3417 (s), 1223 (s), 1043 cm-1
- 1H- und 13C-NMR: gemäß Tabelle 1
Ferner betrifft die Erfindung eine Verbindung der Formel:
Figure imgf000004_0001
Ferner betrifft die Erfindung eine Verbindung der Summenformel C35H53NSO7, gewinnbar aus einer Kultur von DSM 10320 und mit den folgenden Merkmalen:
- [α]D 22 = plus 88,3 (c = 1,1 in Methanol)
- UV (Methanol): lambdamax (lg epsilon = 226 (4,70), 231, 240
(Schulter), 287 (4,13)
- IR (KBr): ny = 3422 (f), 2923 (s), 1706 (s), 1455 (s), 1224, 1126 (s), 1060 (s) cm-1
- 1H- und 13C-NMR: gemäß Tabelle 2. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Wirkstoffen mit bakterizider und/oder antimykotischer Aktivität, dadurch gewinnbar, daß man
(a) den Mikroorganismus DSM 10320 in einem Kohlenstoff-, Stick- stoff- und Schwefel-quellen sowie Mineralsalze enthaltenden Medium aerob kultiviert,
(b) zum Fermentationsmedium ein Adsorberharz zugibt und danach das Harz mit den Zellen vom Medium abtrennt,
(c) das mit den Zellen abgetrennte Harz mit Aceton extrahiert,
(d) das Aceton abdampft und den wässerigen Rückstand mit Methylenchlorid extrahiert,
(e) den Methylenchloridextrakt trocknet, einengt und in Methanol aufnimmt,
(f) den methanolischen Extrakt mit Hexan extrahiert und danach einengt,
(g) den eingeengten Rückstand in Essigsäureethylester löst, mit verdünnter Natriumcarbonat-Lösung und danach mit konzentrierter Natriumchlorid-Lösung extrahiert,
(h) die extrahierte Essigsäureethylester-Phase abtrennt, trocknet und einengt,
(i) die eingeengte Phase in Methylenchlorid löst, auf Kieselgel aufträgt und mit Methylenchlorid, Aceton, Methanol und Gemischen dieser Lösungsmittel eluiert,
(j) das Eluat einengt und an einer C18-Umkehrphase mit einem
Wasser/Methanol-Gradienten zu Wirkstoffhaltigen Fraktionen fraktioniert, die man mit Hilfe der UV-Absorption bei 226 nm detektiert, und zwar zu
(k) (i) eine Fraktion mit einem vergleichsweise rasch eluierendem Wirkstoff und
(ii) eine Fraktion mit einem vergleichsweise langsamer eluierendem Wirkstoff, und
(1) die Wirkstoffe der Fraktionen (i) und (ii) getrennt isoliert.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man die Wirkstoffe der Fraktionen (k) (i) und/oder (k) (ii) durch UV-Bestrahlung in Isomere überführen.
Ferner betrifft die Erfindung ein bakterizides oder antimykotisches Mittel mit einem Gehalt an einer erfindungsgemäßen
Verbindung oder mit einem erfindungsgemäß isolierten Wirkstoff neben einem üblichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
Schließlich betrifft die Erfindung einen Mikroorganismenstamm DSM 10320.
A. Beschreibung des Produktionsstammes und der biologischen Aktivität
1. Herkunft, Taxonomie, Morphologie
Der Produktionsorganismus ist Sorangium cellulosum Imshenetski & Solntseva, 1936 (= Polyangium cell ulosum) Stamm So ce895
(Myxobakterien) und wurde 1993 aus einer Bodenprobe von Dougga, Tunesien, isoliert. Der Stamm wurde bei der DSM unter der Nr. 10320 hinterlegt.
Die vegetativen Zellen sind zylindrische Stäbchen mit runden Enden, meist um 1 μm dick und 3 bis 6 μm lang. Im
Phasenkontrastmikroskop erscheinen sie dunkel. Sie bewegen sich gleitend fort. Auf manchen Nährböden bildet der Organismus massenhaft Fruchtkörper, so z.B. auf Filterpapier über
Mineralsalzagar (ST21-Agar).
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Die Fruchtkörper sind dunkelbraune bis orange Polster und bestehen aus einer mehr oder weniger großen Zahl von dicht gepackten Sporangiolen, kugeligen oder durch gegenseitige
Abplattung polyedrische Gebilde mit einer festen Wand von 20 bis 30 μm Durchmesser. In den Sporangiolen befinden sich Myxosporen, stäbchenförmige Dauerzellen von ähnlicher Gestalt und Größe wie die vegetativen Zellen, jedoch leicht lichtbrechend und
trocknungsresistent. Der Stamm zeigt starken Caseinabbau auf Magermilchagar.
2. Kultur
Der Organismus wächst gut auf Peptonagar, z. B. CY-Agar
(Casitone, Difco, 0,3 %; CaCl2.2H2O 0,1 %; Hefeextrakt, Difco, 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,2), dem jedoch ein Kohlenhydrat, z. B. Glucose oder Stärke, zugesetzt werden muß. Das Kohlenhydrat kann in einer Konzentration von z. B. 0,1 % zugegeben werden.
Weiterhin wächst der Stamm auf PM:
Figure imgf000009_0001
Wachstum erfolgt auch auf Hefeagar, z. B. VY/2-Agar (Bäckerhefe, 5 %, bezogen auf Frischgewicht; CaCl2.2H2O 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,2).
In Flüssigmedien wächst So ce895 in überwiegend homogener
Zellsuspension, sowohl in Schüttelkolben (bei z. B. 160 Upm), als auch in Bioreaktoren (bis 300 1 getestet). Die Kultivierung erfolgt bei 30 °C unter aeroben Bedingungen.
Zur Kultur in Flüssigmedium eignet sich z. B.:
Medium Nr. 1 : MDl liquid medium (Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck, 0,3 %; CaCl2.2H2O 0,05 % ; MgSO4.7H2O 0,2 %), das durch eine Kohlenhydratquelle ergänzt ist, z. B. Glucose,
Stärke, Cellulose, jeweils 0,1 %.
Oder Medium Nr. 2 : Glucose. H2O 0,5 %; Pepton aus Casein,
tryptisch verdaut, 0,1 %,- MGSO4.7H2O 0,15 % ; CaCl2.2H2O 0,1 %;
KNO3 0,2 %; Natrium Eisen III - EDTA 8 mg/l; K2HPO4 0,0125 %;
Tris.Hcl 0,2 %; pH vor dem Autoklavieren auf 7,4 eingestellt. Oder Medium Nr. 3 : Stärke, löslich (Merck) 0,3 %; Glucose. H2O 0,5 %; Hefeextrakt (Difco) 0,2 %; Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, 0,1 %; CaCl2.2H2O 0,1 %; MgSO4.7H2O 0,15 %; KNO3 0,05 %; NH4Cl 0,1 %; Na-Fe III - EDTA 8 mg/l; HEPES-Puffer 0,4 %; pH 7,4 vor dem Autoklavieren.
Oder Medium Nr. 4 : Stärke, löslich, 0,5 %; Glucose.H2O 0,3 %; Hefeextrakt (Difco) 0,2 %; Sojamehl, entfettet, 0,1 %;
CaCl2.2H2O 0,1 %; MgSO4.7H2O 0,1 %; Na-Fe III - EDTA 8 mg/l; HEPES-Puffer 1 %; pH 7,4 vor dem Autoklavieren.
3. Fermentation
Beispiel:
Bioreaktor mit 250 1 Inhalt, Fa. Giovanola Freres, Monthey,
Schweiz, Blattrührsystem.
Medium Nr. 3, jedoch ohne HEPES .
pH vor Autoklavieren: 7,8; Terrperatur = 30 °C, Umdrehungen =
100 · min-1.
Belüftung: 1800 1 Luft pro Stunde.
Der Fermentor wird beimpft mit 2 × 10 l Vorfermentoren, die mit je 1,2 1 einer gut gewachsenen Kultur in Schüttelkolben
gestartet wurden und 3 Tage unter Rühren und Belüften bei 30 °C in Medium Nr. 4 gehalten wurden.
Der pH-Wert des 250-1-Fermentors wurde mit 5 % KOH bei 6,9 gehalten.
Die Dauer der Fermentation betrug 5 Tage.
Nach 70 Stunden (pO2 = 20 %) wurde die Umdrehung auf 125 · min-1 erhöht. Der pO2 stieg innerhalb einer Stunde auf 30 % und blieb danach ca. 6 Stunden konstant. Dann stieg der pH kontinuierlich an und gleichzeitig auch der pO2 bis zu 80 % nach 95 Stunden.
Hier wurde die Umdrehung wieder auf 100 · min-1 reduziert, worauf der pO2 auf ca. 70 % fiel. Bis zum Ende der Fermentation stieg er wieder kontinuierlich auf ca. 80 % an. Die Fermentation wurde abgebrochen 1 Tag nachdem die Glucose verbraucht war.
4. Wirkungsspektrum
Thuggacin A und B wurden in Dimethylsulfoxid gelöst und auf Testblättchen (6 mm Durchmesser) in Mengen von je 10 μg
aufgetragen. Diese Testblättchen wurden auf Agarplatten gelegt, in denen verschiedene Testorganismen in niedriger Zelldichte eingesät waren. Diese Testplatten wurden bei 30 °C bebrütet. Nach Wachstum der Testorganismen wurden die Hemmhöfe abgelesen. Das Ergebnis zeigt die folgende Tabelle:
Nährmedium enthielten. Die Anfangs-Zelldichte war jeweils 10 Zellen/ml. Die Kulturen wurden 18 bis 40 Stunden bebrütet bei 30 °C.
Als Medien wurden verwendet:
Für Bakterien: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck, 0,5 %; Proteose Pepton, Difco, 0,5 %; Fleischextrakt, Oxoid, 0,1 % ; pH 7,0.
Für Hefen und Pilze "Mycophil" Medium: Phytone Pepton, BBL
(Becton, Dickinson & Co., USA), 1 %; Glucose. H2O 1 %.
Das Ergebnis zeigt die folgende Tabelle:
Figure imgf000012_0001
5. Wirkungsweise
Die Tests wurden mit Micrococcus luteus durchgeführt. In
Micrococcus l uteus- Zellen wird der Einbau von C- bzw. 3H-markierten Vorstufen der Protein-, RNA- und DNA-Synthese nach Zugabe von Thuggacin A (0,02 μg/ml) sofort gehemmt. Auch der Einbau von 14C-Acetat bzw. Glucose in perchlorsäure-unlösliche Substanzen wird sofort gehemmt.
Isolierung und Charakterisierung
Isolierung
Aus einer 300 l Fermentation von Sorangium cellulosum, Stamm So ce895, wurden 3,0 l Adsorberharz XAD 1180 vermischt mit 1,5 l Zellen durch Sieben getrennt und dreimal mit insgesamt ca. 18 l Aceton extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden im Vakuum zu ca. 3 l Wasserphase eingeengt, die drei Mal mit Methylenchlorid extrahiert wurde. Nach Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat wurden die Methylenchlorid-Extrakte im Vakuum zu 26,6 g
Rohextrakt eingeengt. Dieser wurde in 500 ml 95-proz. Methanol aufgenommen und zweimal mit 500 ml Heptan extrahiert. Es verblieben 15,6 g Rückstand nach Eindampfen der Methanol-Phase im Vakuum. Der Rückstand wurde in 500 ml eiskaltem
Essigsäureethylester gelöst und unter Eiskühlung zweimal mit 1-proz. Natriumkarbonat-Lösung und einmal mit gesättigter
Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Dabei wurde zur Phasentrennung unter Kühlung zentrifugiert. Die Essigsäureethylester-Phase wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zu 5,8 g angereichertem Thuggacin-Extrakt eingedampft.
Der Extrakt wurde zur Kieselgelfiltration in Methylenchlorid gelöst und auf 200 ml Kieselgel 100 (0,063 bis 0,200 mm
Korngröße) aufgetragen, mit 500 ml Methylenchlorid, 400 ml Methylenchlorid/Aceton 95:5, 300 ml Methylenchlorid/Aceton 90:10, 400 ml Methylenchlorid/Aceton/Methanol 90:9:1, 400 ml Methylenchlorid/Aceton/Methanol 90:5:5, und 300 ml Methylenchlorid/Methanol 9:1 eluiert. Die mit
Methylenchlorid/Methanol 9:1 eluierte Fraktion ergab nach dem Einengen im Vakuum 1,5 g Roh-Thuggacin, das durch RP-MPLC [Säule 40*530 mm, Eurosil Bioselect C18 100-20, 15-25 μ, Laufmittel A = Wasser, B = Methanol , Gradient : 65 % B für 76 min . , 65 auf 80 % B in 120 min., 80 % B für 100 min., auf 100 % B in 60 min.;
Flußrate = 17 ml/min.; Detektion UV-Absorption bei 226 nm] in 244 mg Thuggacin A [tR = 242 min.] und 61 mg Thuggacin B [tR = 203 min.] getrennt wurde.
Thuggacin A wurde aus Ether/Fetroleumbenzin kristallisiert.
Charakterisierung
Thuggacin A
Struktur: Abb. 1.-
Schmp. : 92-94 °C.-
[α]D 22 = - 148,4 (c = 0,4 in Methanol).-
UV (Methanol): lambdamax (lg epsilon) = 224 (4,74), 231, 239 (sh), 289 (4, 11).-
IR (KBr): ny = 3417 (s), 2926 (s), 1707 (s), 1223 (s), 1043 cm-1.-
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
C35H53NSO7 Ber. 631,3543 Gef. 631,3553 (EI-MS)
Thuggacin B
Struktur: Abb. 2.-
[α]D 22 = + 88,3 (c = 1,1 in Methanol).-
UV (Methanol): lambdamax (lg epsilon) = 226 (4,70), 231, 240 (sh), 287 (4,13).-
IR (KBr): ny = 3422 (s), 2923 (s), 1706 (s), 1455 (s) 1224, 1126 (s), 1060 (s) cm-1.-
Figure imgf000015_0002
C35H53NSO7 Ber. 631,3543 Gef. 631,3535 (EI-MS)
C35H51NSO6 Ber. 613,3437 Gef. 613,3434 (EI-MS)
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001

Claims

Patentansprüche
1. Verbindung der Formel
Figure imgf000018_0001
2. Verbindung der Summenformel C35H53NSO7, gewinnbar aus einer Kultur von DSM 10320 und mit den folgenden Merkmalen:
- FP: 92 bis 94 °C
- [α]D 22 = minus 148,4 (c = 0,4 in Methanol)
- UV (Methanol): lambdamax (lg epsilon) = 224 (4,74), 231, 239
(Schulter), 289 (4,11)
- IR (KBr): ny = 3417 (s), 1223 (s), 1043 cm-1
- 1H- und 13C-NMR: gemäß Tabelle 1
3. Verbindung der Formel:
Figure imgf000019_0001
4. Verbindung der Summenformel C35H53NSO7, gewinnbar aus einer Kultur von DSM 10320 und mit den folgenden Merkmalen:
- [α]D 22 = Plus 88,3 (c = 1,1 in Methanol)
- UV (Methanol): lambdamax (lg epsilon = 226 (4,70), 231, 240
(Schulter), 287 (4,13)
- IR (KBr): ny = 3422 (f), 2923 (s), 1706 (s), 1455 (s), 1224, 1126 (s), 1060 (s) cm-1
- 1H- und 13C-NMR: gemäß Tabelle 2.
5. Verfahren zur Herstellung von Wirkstoffen mit bakterizider und/oder antimykotischer Aktivität, dadurch gewinnbar, daß man
(a) den Mikroorganismus DSM 10320 in einem Kohlenstoff-,
Stickstoff- und Schwefel -quellen sowie Mineralsalze enthaltenden Medium aerob kultiviert,
(b) zum Fermentationsmedium ein Adsorberharz zugibt und danach das Harz mit den Zellen vom Medium abtrennt,
(c) das mit den Zellen abgetrennte Harz mit Aceton extrahiert,
(d) das Aceton abdampft und den wässerigen Rückstand mit
Methylenchlorid extrahiert,
(e) den Methylenchloridextrakt trocknet, einengt und in
Methanol aufnimmt,
(f) den methanolischen Extrakt mit Hexan extrahiert und danach einengt,
(g) den eingeengten Rückstand in Essigsäureethylester löst, mit verdünnter Natriumcarbonat-Lösung und danach mit konzentrierter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, (h) die extrahierte Essigsäureethylester-Phase abtrennt, trocknet und einengt,
(i) die eingeengte Phase in Kethylenchlorid löst, auf
Kieselgel aufträgt und mit Methylenchlorid, Aceton,
Methanol und Gemischen dieser Lösungsmittel eluiert,
(j) das Eluat einengt und an einer C18-Umkehrphase mit einem Wasser/Methanol-Gradienten zu wirkstoffhaltigen Fraktionen fraktioniert, die man mit Hilfe der UV-Absorption bei 226 nm detektiert, und zwar zu
(k) (i) eine Fraktion mit einem vergleichsweise rasch
eluierendem Wirkstoff und
(ii) eine Fraktion mit einem vergleichsweise langsamer eluierendem Wirkstoff, und
(1) die Wirkstoffe der Fraktionen (i) und (ii) getrennt isoliert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Wirkstoffe der Fraktionen (k) (i) und/oder (k) (ii) durch UV-Bestrahlung in Isomere überführt.
7. Bakterizides oder antimykotisches Mittel mit einem Gehalt an einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder mit einem gemäß einem der Ansprüche 5 bis 6 isolierten Wirkstoff neben einem üblichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
8. Mikroorganismenstamm DSM 10320.
PCT/EP1996/005072 1995-11-16 1996-11-18 Verbindungen mit bakterizider und/oder antimykotischer aktivität, herstellungsverfahren, mittel und mikroorganismenstamm WO1997018217A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

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