DE4244213C2 - Ripostatine, Herstellungsverfahren und Mittel - Google Patents

Ripostatine, Herstellungsverfahren und Mittel

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DE4244213C2
DE4244213C2 DE19924244213 DE4244213A DE4244213C2 DE 4244213 C2 DE4244213 C2 DE 4244213C2 DE 19924244213 DE19924244213 DE 19924244213 DE 4244213 A DE4244213 A DE 4244213A DE 4244213 C2 DE4244213 C2 DE 4244213C2
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ripostatin
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Hermann Augustiniak
Gerhard Hoefle
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/08—Bridged systems

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbin­ dung (Ripostatin) der Formel
und dessen therapeutisch verträgliche Salze.
Es handelt sich um eine Verbindung (Ripostatin), gekennzeichnet durch die folgenden Pa­ rameter: Summenformel C30H38O6 vom Molekulargewicht 494.
Retentionszeit [min] bei HP-Flüssigchromatographie 4,75
HD-Sil-100-C18-Säule (250 mm × 4 mm; Merck)
Flußrate 1,5 ml
Laufmittelgemisch aus Methanol : 0,05 m NaH2PO4 = 70 : 30
Detektion bei 254 nm
RF bei DC-Chromatographie 0,42
DC-Alufolie 60F254 (Merck)
Laufmittelgemisch aus Dichlormethan : Methanol = 9 : 1
Detektion bei 254 nm durch Fluoreszenz-Löschung
NMR (in CD3OD, 600 MHz, delta-Werte in ppm)
und dessen therapeutisch verträgliche Salze.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung (Ripostatin) der Formel
und dessen therapeutisch verträgliche Salze.
Es handelt sich um eine Verbindung (Ripostatin), gekennzeichnet durch die folgenden Pa­ rameter:
Summenformel C30H40O6 vom Molekulargewicht 496
Retentionszeit [min] bei HP-Flüssigchromatographie 4,24
HD-Sil-100-C18-Säule (250 mm × 4 mm; Merck)
Flußrate 1,5 ml
Laufmittelgemisch aus Methanol : 0,05 m NaH2PO4 = 70 : 30
Detektion bei 254 nm
RF bei DC-Chromatographie 0,29
DC-Alufolie 60F254 (Merck)
Laufmittelgemisch aus Dichlormethan : Methanol = 9 : 1
Detektion bei 254 nm durch Fluoreszenz-Löschung
NMR (in CD3OD, 600 MHz, delta-Werte in ppm)
Ripostatin B
13C
1H
164.97 -
120.58 5.74
152.41 -
34.76 2.51, 4.03
124.99 5.25
129.40 5.36
31.00 2.48, 2.60
133.79 -
125.65 5.26
49.81 2.00, 2.21
65.89 3.86
37.10 1.50, 2.20
70.67 5.14
38.89 1.89
69.81 3.80
34.89 1.61
35.87 2.07, 2.18
135.86 -
123.62 5.37
34.26 3.33
141.61 -
129.40 7.15
128.43 7.26
125.80 7.16
44.76 3.15
174.16 -
16.60 1.48
16.19 1.70
und dessen therapeutisch verträgliche Salze.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung einer der vorstehend gekennzeichneten Verbindungen (Ripostatine oder deren therapeutisch verträgliche Salze), wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man
  • a) Sorangium cellulosum DSM 7291 in einem Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltenden Medium (i) in Abwesenheit oder (ii) in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert;
  • b) die gemäß (i) gebildeten Verbindungen an ein Adsorberharz adsorbiert und danach die Verbindungen mit dem Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt oder die gemäß (ii) gebildeten Verbindungen mit dem Adsorberharz abtrennt;
  • c) das Adsorberharz mit einem gepufferten Gradienten Wasser: hydrophiles organisches Lösungsmittel eluiert und
    • 1. von wässerigen Eluaten das hydrophile organische Lösungs­ mittel entfernt, den wässerigen Rückstand mit einem in Was­ ser höchstens begrenzt löslichen organischen Lösungsmittel extrahiert und den Extrakt eindampft und/oder
    • 2. Eluate mit dem reinen hydrophilen organischen Lösungsmittel eindampft,
  • d) die eingedampften Extrakte jeweils einer Umkehrphasen-Chro­ matographie an Kieselgel unterwirft und
  • e) die Eluate gegebenenfalls nach Eindampfen einer Chromato­ graphie an Sephadex unterwirft und
  • f) die Verbindungen in an sich bekannter Weise isoliert.
Eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe (b) als Adsor­ berharz XAD verwendet.
Eine weitere spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe (c) einen gepufferten Gradienten von Wasser : Methanol verwendet.
Eine weitere spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe (c1) als in Wasser höchstens begrenzt lösliches organisches Lö­ sungsmittel Ethylacetat verwendet.
Eine weitere spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß man an Kieselgel RP8 chromatographiert.
Eine weitere spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß man an Sephadex LH20 chromatographiert.
Schließlich betrifft eine Ausführungsform der Erfindung ein the­ rapeutisches Mittel, bestehend aus mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung (Ripostatin) oder umfassend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung ne­ ben üblichen Trägerstoffen und Verdünnungsmitteln.
Nachstehend wird die Erfindung näher erläutert. Es zeigen
Fig. 1 ein UV-Spektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen und
Fig. 2 ein IR-Spektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen.
A. Beschreibung des Produktionsstamms und der biologischen Akti­ vität 1. Herkunft, Taxonomie, Morphologie
Der Produktionsorganismus wurde 1989 aus einer Bodenprobe aus der Umgebung von Nairobi, Kenia, isoliert. Es handelt sich um einen Stamm des Myxobakteriums Sorangium cellulosum (Imshenetski & Solntseva, 1936) (= Polyangium cellulosum). Der Stamm wurde mit So ce377 bezeichnet. Er ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter Nr. DSM 7291 hinterlegt.
Die vegetativen Zellen sind zylindrische Stäbchen mit runden En­ den, meist um 1 µm lang. Im Phasenkontrastmikroskop erscheinen sie dunkel. Sie bewegen sich gleitend fort. Auf manchen Nährbö­ den bildet der Organismus massenhaft Fruchtkörper, so z. B. auf Filterpapier über Mineralsalzagar. Die Fruchtkörper sind orange gefärbte Polster und bestehen aus einer mehr oder weniger großen Zahl von Sporangiolen, kugeligen oder durch gegenseitige Abplat­ tung polyedrischen Gebilden von 20 bis 30 µm Durchmesser mit ei­ ner festen Wand. In den Sporangiolen befinden sich Myxosporen, stäbchenförmige Dauerzellen von ähnlicher Gestalt und Größe wie die vegetativen Zellen, jedoch leicht lichtbrechend.
Der Stamm bildet antibakteriell wirkende Antibiotika, Riposta­ tine genannt.
2. Kultur
Der Organismus wächst gut auf Peptonagar, z. B. CY- Agar (Casitone (Difco) 0,3%; CaCl2.2H2O 0,1%; Hefeextrakt (Difco) 0,1%; Agar 1,5%, pH 7,2), dem jedoch ein Kohlenhydrat, z. B. Glucose oder Stärke, zugesetzt werden muß. Das Kohlenhy­ drat kann in einer Konzentration von z. B. 0,1% zugegeben wer­ den. Gutes Wachstum erfolgt auch auf Hefeagar, z. B. VY/2-Agar (Bäckerhefe 0,5%, bezogen auf Frischgewicht; CaCl2.2H2O 0,1%; Agar 1,5%, pH 7,2). In Flüssigmedien wächst So ce377 in homoge­ ner Zellsuspension sowohl in Schüttelkolben (bei etwa 160 Upm) als auch in Bioreaktoren (bis 300 l getestet). Die Kultivierung erfolgt bei 30°C unter aeroben Bedingungen.
Zur Kultur in Flüssigmedium eignet sich z. B.:
Medium 1 = MD1 l. m. (Pepton aus Casein, tryptisch verdaut (Merck) 0,3%; CaCl2.2H2O 0,5%; MgSO4.7H2 0,2%), das durch ein Kohlenhydrat ergänzt wird, z. B. Glucose, Maltose, Malto­ triose, Stärke oder Cellulose, jeweils 0,1%.
Die Kultivierung kann auch in folgenden Medien erfolgen.
Medium 2 besteht aus:
0,1% Casein
0,15% MgSO4.7H2O
0,1% CaCl2.2H2O
0,2% KNO3
0,0125% K2HPO4
8 mg/l Na-Fe(III)-EDTA
0,5% Glucose.H2O
pH 7,2
Zur pH-Stabilisierung kann 0,2% Tris.HCl (pH 7,2) bzw. 0,1% HEPES (pH 7,2) zugesetzt werden.
In diesem Medium wächst der Stamm weitgehend homogen, die Bil­ dung des Antibiotikums ist aber unterbunden, bedingt durch den Zusatz von Casein und vor allem von KNO3.
Medium 3:
0,3% Glucose.H2O
0,3% Stärke
0,2% Sojamehl, entfettet
0,1% Hefeextrakt
0,1% MgSO4.7H2O
0,05% CaCl2.2H2O
8 mg/l Na-Fe(III)-EDTA
0,1% HEPES
pH 7,4
In diesem Medium wächst der Stamm gut und bildet auch Antibio­ tika, neigt allerdings zur Verklumpung.
Während der Kultivierung sinkt der Anfangs-pH-Wert von 7,4 auf etwa 6,5 ab und steigt dann wieder an bis zu Werten von 6,9 bis 7,1. Die Antibiotikabildung findet in der log-Phase statt, solange noch Glucose im Medium vorhanden ist.
Bei Zusatz des Adsorberharzes XAD 16 zum Medium (1%) werden ebenfalls Antibiotika gebildet. Sie werden an das XAD gebunden.
3. Beispiel für eine Fermentation
Bioreaktoren mit 60 und 300 l Inhalt (Firma Giovanola, Manthey, Schweiz) Umwurfsystem.
Medien
Stärke aus Kartoffelmehl 0,3%
MgSO4.7H2O 0,15%
Hefeextrakt 0,17%
Sojamehl 0,05%
K2HPO4 0,0125%
Na-Fe(III)-EDTA 8 mg/l
CaCl2.2H2O 0,15%
Glucose.H2O 0,3%
AL=L<pH 7,2 nach Autoklavieren.
Der Fermentor mit 300 l-Inhalt (Produktionsfermentor) enthielt außerdem noch
Fructose 0,3%
Brenztraubensäure.Na 0,01%
In beiden Fermentoren wurde der pH-Wert, falls erforderlich, mit 5% KOH bei 6,7 gehalten.
Ein 60 l-Fermentor diente als Vorfermentor für einen 300 l-Fer­ mentor. Der 60 l-Fermentor wurde mit 1,6 l einer Vorkultur (Schüttelkulturen) beimpft. Nach 4 Tagen wurden 30 l aus diesem Fermentor zu 270 l Medium im Produktionsfermentor gegeben.
Startbedingungen:
T = 30°C
Luft = 0,3 Nm3/h
Umdrehungen: 300.min-1
Nach ca. 2 Tagen war der pO2-Wert auf 58% Sättigung abgesunken. Dann wurde die Umdrehungszahl auf 270.min-1 reduziert. Nach weiteren 17 h lag der pO2-Wert bei 30% und sank danach langsam während der weiteren Fermentationsdauer von 3 Tagen auf 15% Sättigung ab.
Verlauf des Glucosegehalts: Nach 2 Tagen bei ca. 0,2%, darauf­ hin Zufüttern von 0,05%; nach weiteren 3 Tagen bei ca. 0,05%
Gesamtlaufzeit: 6 Tage
Ernte durch Absieben des XAD Adsorberharzes
Produktion: ca. 30 mg/l.
4. Wirkungsspektrum
Ripostatin wurde in Methanol gelöst und auf Testblättchen in Mengen von 10 µg aufgetragen. Diese Testblättchen wurden auf Agarplatten gelegt, in denen verschiedene Testorganismen in niedriger Zelldichte eingesät waren. Diese Testplatten wurden bei 30°C bebrütet. Nach Wachstum der Testorganismen wurden die Hemmhöfe abgelesen. Das Ergebnis zeigt Tab. 1.
Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) wurde Ripo­ statin in verschiedenen Konzentrationen in Reagenzgläser gege­ ben, die eine Suspension der Testbakterien in Nährmedium enthielten. Die Anfangs-Zelldichte war 105 Zellen/ml. Die Kul­ turen wurden für 24 Stunden bei 30°C bebrütet. Das Ergebnis zeigt Tab. 1.
Als Medien wurden verwendet:
  • 1. Für Bakterien: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut (Merck) 0,5%; Proteose Pepton (Difco) 0,5%; Fleischextrakt (Oxoid) 0,1%; pH 7,0.
  • 2. Für Pilze und Hefen: Mycophil Phytone Pepton BBL 1%; Glucose 1%
5. Wirkungsweise
Die Versuche wurden mit Ripostatin A durchgeführt. In Staphylo­ coccus aureus-Zellen ist der Einbau von 14C-markierten Vorstufen der RNS 15 min nach Zugabe des Antibiotikums gehemmt, der Einhau von Proteinvorstufen nach 30 min und der Einbau von DNS-Vorstu­ fen unvollständig nach ca. 30 bis 45 min. Isolierte, gereinigte RNS-Polymerase (Boehringer Mannheim) aus Escherichia coli wird ebenfalls gehemmt (ID50 ca. 200 ng/ml). Eine Eukaryoten-RNS-Po­ lymerase (Weizenkeim-RNS-Polymerase) wird bis mindestens 20 µg Ripostatin A/ml nicht beeinflußt. Somit hemmt Ripostatin vermut­ lich die bakterielle RNS-Polymerase.
B. Isolierung der Ripostatine 1. XAD-Elution
Das aus einem 300-l-Fermentor anfallende Gemisch aus XAD und Zellmasse (2,6 l) wurde mehrfach in Wasser aufgeschlämmt und ab­ dekantiert, bis das XAD weitgehend von der Zellmasse befreit war. Die Zellmasse wurde verworfen, das XAD in eine Säule ge­ füllt und mit einem Gradienten eluiert. Angefangen mit einem Ge­ misch von 50% 0.05 m NaH2PO4-Lösung (pH = 5) und 50% Methanol, wurde jeweils ein Bettvolumen Lösungsmittelgemisch über die Säule gegeben, wobei der Methanol-Gehalt stufenweise auf 60, 70, 80, 90 und 100% gesteigert wurde. Die Eluate wurden jeweils analytisch mittels HPLC (siehe weiter unten) überprüft. Die Eluate bis zu einem Methanol-Gehalt von 50%, 60% und 70% wur­ den verworfen, die Eluate mit einem Methanol-Gehalt von 80% und 90% wurden am Rotationsverdampfer eingeengt, bis das Methanol entfernt war. Die zurückbleibende wässrige Suspension wurde mit Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetat-Extrakt ergab nach dem Eindampfen 13,78 g Rohprodukt I.
Die mit dem zweifachen Bettvolumen reinen Methanols eluierte Fraktion ergab nach dem Eindampfen 16,95 g Rohprodukt II.
2. RP8-Chromatographie
Die nach Abschnitt B1 erhaltenen Rohprodukte wurden separat an einer Säule (75 cm × 6.4 cm) von Kieselgel RP8 mit dem Laufmit­ tel 70% Methanol und 30% 0.05 m NaH2PO4-Lösung chromatogra­ phiert. Die eluierten Fraktionen wurden bei 254 nm detektiert und mittels HPLC analytisch überprüft.
Die Fraktionen wurden am Rotationsverdampfer eingeengt, bis das Methanol entfernt war. Der wässrige Rückstand wurde mit Ethyl­ acetat extrahiert, der Ethylacetat-Extrakt ergab nach dem Ein­ dampfen:
aus Rohprodukt I
0,37 g angereichertes Ripostatin B und
2.18 g angereichertes Ripostatin A
aus Rohprodukt II
5.60 g reines Ripostatin A
3. Sephadex LH20 - Chromatographie
Die aus Rohprodukt I angereicherten Ripostatine wurden an Se­ phadex LH20 aus methanolischer Lösung chromatographiert. Dabei erhielt man
aus 0.37 g angereichertem 0.32 g reines Ripostatin B
aus 2.18 g angereichertem 2.04 g reines Ripostatin A
Die Ripostatine sind nahezu farblose, hochviskose Öle. Ihre Iso­ lierung läßt sich folgendermaßen schematisch darstellen:
C. Physikalische Eigenschaften 1. HPLC
Säule 250 mm × 4 mm HD-Sil-100-C 18 (Merck); Flußrate 1.5 ml; detektiert bei 254 nm
Laufmittel: Methanol : 0.05 m NaH2
PO4
= 70 : 30
Retentionszeit für
Ripostatin A 4.75 min;
Ripostatin B 4.24 min
2. DC
DC-Alufolie (60 F254
, Merck) Laufmittel Dichlormethan : Methanol = 9 : 1
Ripostatin A RF
= 0.42; Fluoreszenz-Löschung bei 254 nm und Rot-Violett-Färbung
Ripostatin B RF
= 0.29 nach Ansprühen mit Vanillin/Schwefel­ säure und Erhitzen auf 120°C
3. UV
(gemessen in Methanol; Hitachi U-3200): vgl.
Fig.
1
4. IR
(gemessen als Film; Nicolet 20 DXB-FTIR): vgl.
Fig.
2
5. NMR
600 MHz, gemessen in CD3
OD, δ-Werte in ppm

Claims (9)

1. Verbindung (Ripostatin A) der Formel
und dessen therapeutisch verträgliche Salze.
2. Verbindung (Ripostatin B) der Formel
und dessen therapeutisch verträglichen Salze.
3. Verfahren zur Gewinnung einer Verbindung (Ripostatin oder therapeutisch verträgliches Salz) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) Sorangium cellulosum DSM 7291 in einem Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltenden Medium (i) in Abwesenheit oder (ii) in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert;
  • b) die gemäß (i) gebildeten Verbindungen an ein Adsorberharz adsorbiert und danach die Verbindungen mit dem Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt oder die gemäß (ii) gebildeten Verbindungen mit dem Adsorberharz abtrennt;
  • c) das Adsorberharz mit einem gepufferten Gradienten Wasser:
    hydrophiles organisches Lösungsmittel eluiert und
    • 1. (c1) von wässerigen Eluaten das hydrophile organische Lösungsmit­ tel entfernt, den wässerigen Rückstand mit einem in Wasser höchstens begrenzt löslichen organischen Lösungsmittel ex­ trahiert und den Extrakt eindampft und/oder
    • 2. (c2) Eluate mit dem reinen hydrophilen organischen Lösungsmittel eindampft,
  • d) die eingedampften Extrakte jeweils einer Umkehrphasen-Chro­ matographie an Kieselgel unterwirft und
  • e) gegebenenfalls die Eluate nach Eindampfen einer Chromatogra­ phie an Sephadex unterwirft und
  • f) die Verbindungen in an sich bekannter Weise isoliert.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe (b) als Adsorberharz XAD verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe (c) einen gepufferten Gradienten von Wasser : Methanol verwendet.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe (c1) als in Wasser höch­ stens begrenzt lösliches organisches Lösungsmittel Ethylacetat verwendet.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man an Kieselgel RP8 chromatographiert.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man an Sephadex LH20 chromatographiert.
9. Therapeutisches Mittel, bestehend aus mindestens einer Ver­ bindung (Ripostatin oder therapeutisch verträgliches Salz) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 oder umfassend mindestens eine Ver­ bindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 neben üblichen Träger­ stoffen und Verdünnungsmitteln.
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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DEUTSCHE APOTHEKER Z. 126/27(3.7.1986), S. 1438- 1443 *

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