WO1997016171A1 - Liposome a membrane fusible faisant appel a un virus sendai recombinant - Google Patents

Liposome a membrane fusible faisant appel a un virus sendai recombinant Download PDF

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WO1997016171A1
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sendai virus
virus
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rna
cells
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Yoshiyuki Nagai
Atsushi Kato
Fukashi Murai
Yosuke Suzuki
Katsuo Takeda
Mamoru Hasegawa
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Dnavec Research Inc.
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the present invention relates to a membrane-fused ribosome obtained by fusing a recombinant Sendai virus with a ribosome.
  • DDS Drug Delivery System
  • One is a method using a viral vector. This includes a method of infecting cells with a virus having a desired exogenous gene on the genome, thereby introducing internal nucleic acids into the cells.
  • the other is a method of encapsulating or supporting a desired physiologically active substance in an artificial or semi-artificial transport carrier (carrier 1).
  • carrier 1 an artificial or semi-artificial transport carrier
  • This method depends on the physicochemical properties of the carrier itself to make various processes involved in the behavior and transport of the target substance in the living body, so that the bioactive substance can be converted into desired organs (target organs), cells (target cells). ) Or a method to reach an intracellular organ (target organ) (delivery system).
  • Examples of carriers in this method include proteins (Human Gene Therapy, 5, 29, 1994), peptides (Proceedings of National Acaaemy of Sciences of United States of America, 90, 893, 1993), and macromolecules (The Journal of Biological Chemistry, 269, 12918, 1994) and ribosomes (Proceedings of National Ac ademy of Sciences of United States of America, 92, 1744, 1995).
  • proteins Human Gene Therapy, 5, 29, 1994
  • peptides Proceedings of National Acaaemy of Sciences of United States of America, 90, 893, 1993
  • macromolecules The Journal of Biological Chemistry, 269, 12918, 1994
  • ribosomes Proceedings of National Ac ademy of Sciences of United States of America, 92, 1744, 1995.
  • Examples of this method include the Delino J-I system (Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America, 89, 7934, 1992) using transferrin receptor, which is frequently expressed on the surface of cancer cells, and target cells.
  • a delivery system using a specific antigen expressed on the surface Biochim Biophys Acta, 1152, 231-242, 1993
  • a delivery system using the Asiatic glycoprotein receptor Yuichi located on the surface of hepatocytes The Journal of Biological Chemistry, 266, 14338, 1991
  • the Delipari system utilizing Expansive membrane fusion of Sendai virus (Exp. Cell Res., 159, 399, 1985).
  • Sendai virus used as a material for this system is also called HVJ (Hemagglutinating virus of Japan), and is a paramyxovirus family (P aramyxoviridae), a strain of the parainfluenza virus type 1 belonging to the genus Paramyxovirus.
  • Sendai virions are polymorphic, have an envelope of 150-200 nm in diameter, and contain genomic RNA that does not translate into type II.
  • Sendai virus is historically known as an industrially useful virus, and is widely used for the production of heterokaryons and hybrid cells, in particular, for cell fusion. In addition, as described above, it is suitably used as a material for fusogenic ribosomes.
  • Sendai virus belongs to the group of RNA virus, (-) single-stranded RM virus, and (-) single-stranded RNA virus.
  • RNA viruses are classified into three types: dsRNA virus (double stranded RNA virus), (+) strand RNA virus, and (single) strand RNA virus.
  • the dsRNA virus group includes reovirus, oral virus, plant reovirus, etc., and has multiple segmented linear dsRNA genomes.
  • the (+) chain virus includes poliovirus, Sindbis virus, Semliki Forest virus, Japanese encephalitis virus, etc., and has one (+) chain & NA as its genome.
  • the genomic RNA itself of the (+)-strand RNA virus has a transmitting power.
  • the term “propagation power” refers to “infectious particles or a complex equivalent thereto” after the nucleic acid present in the cell is replicated after the nucleic acid is introduced into the cell by infection or an artificial technique. And the ability to spread one after another to other cells. "
  • Sindbis virus which is classified as (+)-strand RNA virus
  • Sendai virus which is classified as (-) strand RNA virus
  • Sindbis virus-derived (+) strand RNA artificially transcribed in vitro has propagating power, but Sendai artificially transcribed in vitro.
  • Viral RNA has neither (+) nor (1) strand propagation power.
  • DNA virus using DNA as genomic nucleic acid has been performed relatively early.
  • purified genomic DNA itself such as SV40 (J, Exp. Cell Res., 43, 415-425, 1983) has been used. It can be carried out by introducing the cells into monkey cells.
  • RNA viruses using RNA as genomic nucleic acid were preceded by development in (+)-strand RNA viruses.
  • genomic RNA simultaneously functions as mRNA.
  • poliovirus it has been reported in 1959 that purified RNA itself has a transmitting power (Journal of Experimental Medicine, 110, 65-89, 1959).
  • Semliki forest virus SFV
  • SFV Semliki forest virus
  • the Sendai virus has many advantages that can be used as an industrially useful virus.
  • it is a (single-stranded) RNA virus, a reconstitution system has been established. Did not. This is because the virion reconstitution system using viral cDNA was extremely difficult.
  • Influenza virus is a (single-strand) RNA virus composed of an eight-segment genome. According to these reports, exogenous genes were inserted into one of the cDNAs in advance, and RNA transcribed from all eight cDNAs including the exogenous genes was previously associated with the NP protein derived from the virus. And MP. By supplying these RNPs and RNA-dependent RNA polymerase into cells, reconstitution was established.
  • a virus such as a natural virus / recombinant vaccinia virus and a nucleic acid of a virus to be reconstituted are simultaneously used to supply factors necessary for reconstitution into cells. There is a problem that it is not easy to separate the reconstituted desired viruses and their harmful viruses, which are supplied to cells.
  • the object of the present invention is to develop a highly safe delivery system for DDS, ie, a physiologically active substance, utilizing the membrane fusion of Sendai virus.
  • an object of the present invention is to produce a Sendai virus having no transmitting power, and whether or not it can be produced depends on whether or not a technique for reconstituting the Sendai virus can be constructed.
  • the present inventors have intensively studied the establishment of a recombinant Sendai virus reconstitution system. In particular, detailed studies were performed on the conditions for efficient reconstitution, that is, the quantitative ratio of nucleic acids and cofactors to be introduced into cells. Furthermore, studies were conducted to eliminate contamination with recombinant vaccinia virus and the like.
  • the present inventors applied cDNAs for Sendai virus miniparticles or cDNAs derived from Sendai virus DI particles (see Defective interfering particles / EMBO. J., 10, 3079-3085, 1991) in order to apply to the reconstitution test of Sendai virus.
  • Various studies were performed using cDNA. As a result, we found efficient conditions for the ratio of the amount of cDNA, cDNAs involved in transcription and replication, and the recombinant vaccinia virus, which is a T7 RNA polymerase expression unit, to be introduced into cells.
  • the present inventors further obtain both the (+) strand and the (-) strand of full-length Sendai virus cDNA, and biosynthesize (+) or (single) strand Sendai virus RNA in cells.
  • Such a plasmid was constructed and introduced into cells expressing a group of cDNAs for transcription and replication.
  • Sendai virus particles from Sendai virus cDNA for the first time.
  • the present inventors for efficient particle reconstitution, it is more appropriate that the form of cDNA to be introduced into cells be circular than linear, and (1) that the strand RNA is transcribed in cells. It was newly found that the efficiency of particle formation was higher when (+) strand RNA was transcribed in the cell than when it was transferred.
  • the present inventors have found that the Sendai virus can be reconstituted without using a recombinant vaccinia virus which is a T7 RNA polymerase expression unit. That is, when the Sendai virus full-length RNA transcribed in a test tube was introduced into cells, and the cDNA of the initial transcriptase group was transcribed under the control of the T7 promoter, virus particles were reconstituted. This means that by constructing cells that express all of the initial transcription and replication enzymes, it is possible to produce recombinant Sendai virus without using any helper virus such as vaccinia virus. Is shown. In addition, cells expressing all of the initial transcriptase groups are described in “J.
  • the cells described in the document are cells derived from 293 cells having NP, P / C, and L on the chromosome among the Sendai virus genes. These cells are NP, P / C , L express the three proteins.
  • the present invention provides a method for performing genetic manipulation at the DNA level that lacks at least a portion of the Sendai virus structure gene in accordance with a conventional method, and reconstituting Sendai virus particles having no transmitting power from the recombinant DNA. Made it possible.
  • the present invention includes the following.
  • the recombinant Sendai virus is characterized in that at least one of the Sendai virus M ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ gene, F gene or HN gene is deleted or inactivated. Fusogenic ribosomes,
  • a host capable of expressing said gene, a Sendai virus replication enzyme (B) RNA contained in the recombinant Sendai virus contained in the fusogenic liposome according to any of (1) to (3) or RNA containing the cRNA of A Or a unit capable of biosynthesizing these RNAs, (c) a kit containing ribosomes containing the desired nucleic acid or drug,
  • kit according to (4) wherein the host is an animal, an animal-derived cell, an animal tissue, or an animal egg.
  • “Sendai virus j in which one or more functional protein genes have been deleted or inactivated may be derived from a strain classified as parainfluenza type 1; for example, strain Z (Sendai virus Z strain), those derived from the Fushimi strain (Sendai virus Fushimi strain), etc.
  • incomplete viruses such as DI particles and synthesized oligonucleotides are also used as a part of the material.
  • the virus fused to the ribosome may be either a virus that retains autonomous replication ability or a virus that does not retain autonomous replication ability, for example, incomplete virus such as DI particles, Sendai virus, etc.
  • Mini-genomes or synthesized oligonucleotides can also be used, but both ends of genomic RNA can be used It must be recognized and replicated by the NP, P / C, and L proteins that are the factors that make up the protein.
  • the recombinant Sendai virus can insert a desired exogenous gene or delete or modify a desired genomic gene.
  • Recombinant Sendai virus can, for example, inactivate or delete genes involved in immunogenicity, and modified some genes to increase the efficiency of RNA transcription and replication. It may be something. Specifically, for example, at least one of the replication factors NP gene, P / C gene or L gene can be modified to enhance transcription and replication functions.
  • HN protein one of the structural proteins, has both the hemagglutinin (hemagglutinin) activity and the neuraminidase activity, but, for example, it may weaken the former activity. If possible, it would be possible to improve the stability of the virus in the blood, and it would also be possible to modulate infectivity, for example by modifying the activity of the latter.
  • hemagglutinin hemagglutinin
  • neuraminidase activity hemagglutinin
  • it may weaken the former activity.
  • those derived from genomic RNA may be used, or those supplied to trans may be used.
  • the F protein involved in membrane fusion the fusion ability of the membrane fusion liposome can be regulated.
  • a protein source may be derived from genomic RNA or may be supplied in trans.
  • the recombinant Sendai virus used in the present invention does not have autonomous replication ability. If it does not have the autonomous replication ability, there are advantages such as that RNA does not grow in cells after infection and unnecessary protein synthesis does not occur.
  • nucleic acids and drugs to be introduced into the fusogenic ribosome examples include antisense (Drug Delivery System, 10, 91-97, 1995) and decoy (The Journal of Biologica 1 Chemistry, 267, 12403-12406, ⁇ 4 ), Ribozyme (The Drug Del ivery System , 10, 91-97, 1995), triple-stranded DNA (Cell Engineering, Vol. 13, No.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of pUC18 / T7 (+) HVJRz.DM.
  • FIG. 2 shows the structure of pUC18 / T7 ( ⁇ ) HVJRz.DNA. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • T7 Promoter Plasmid pUC18 / T7 (-) HVJRz inserted into pUC18 Plasmid, DNA containing Sendai virus cDNA designed to transcribe (-) strand RNA and lipozyme gene in this order DNA was prepared.
  • T7 Promoter a plasmid containing the Sendai virus cDNA designed to transcribe (+) strand RNA and DM retaining the lipozyme gene in this order, and a plasmid pUC18 / T7 (+) inserted into pUC18 plasmid HVJRz.DNA was prepared.
  • the structures of pUC18 / T7 ( ⁇ ) HVJRz.DNA and pUC18 / T7 (+) HVJRz.DNA are shown in FIGS. 1 and 2.
  • Example 2 Sendai virus reconstitution experiment from cDNA
  • LLC-MK2 cells subjected to normal Toribushin processing brass Chidzu click dish with a diameter of 6 cm 2, 000, 000 or the MEM medium (MEM + FBS 10%) and 2ml was added, C0 2 53 ⁇ 4, 37 °
  • the cells were cultured under the conditions of C for 24 hours. After removing the culture medium and washing with 1 ml of PBS, the recombinant vaccinia virus expressing T7 polymerase VTF7-3, which was prepared so that the moi / multiplicity of infection was 2, was obtained.
  • the turbid matter was added to 0.1 ml of PBS.
  • the petri dish was shaken so that the virus solution spread over the whole body every 15 minutes, and the infection was performed for 1 hour.
  • the virus solution was removed and washed with 1 ml of PBS.
  • a medium containing a cDNA solution was added to the dish.
  • a medium containing a cDNA solution was prepared as follows.
  • the nucleic acids (including plasmids expressing the factors necessary for Sendai virus replication, including pGEM-L, pGEM-P / C, and pGEM-NP) described in the table were placed in a 1.5 ml sampling tube, and HBS (Hepes buffered saline; 20 mM Hepes (pH 7.4, 150 mM NaCl) was added to a total volume of 0.1 ml.
  • HBS Hepes buffered saline; 20 mM Hepes (pH 7.4, 150 mM NaCl) was added to a total volume of 0.1 ml.
  • (+) cDNA in the table indicates brassmid pUC18 / T7 (-) HVJRz.DNA or pUC18 / T7 (+) HVJRz.DNA itself, / C remains circular, and / L indicates This indicates that the cells were linearized with the restriction enzyme Mlul and then introduced into cells.
  • the above petri dishes were cultured for 40 hours under the conditions of C0 25 2 and 37 ° C.
  • the cells in the Petri dish were scraped off using a rubber policeman, transferred to an Eppendorf tube, and centrifuged at 6000 rpm for 5 minutes to precipitate only the cell components, and suspended again in 1 ml of PBS.
  • a part of this cell solution was intact or diluted and inoculated into 10-day-old embryonated chicken eggs.
  • This cell solution was diluted with PBS to the cell number shown in Table 1, and 0.5 ml of the inoculated eggs was used for 35 cells. After culturing for 72 hours, the mixture was transferred to 4 ° C and left overnight.
  • the chorioallantoic fluid of this egg was collected as a virus fluid using a syringe and a needle.
  • the measurement of the brain (hemagglutinin unit) and PFU (plaque forming unit) of the collected oil solution was performed by the following method.
  • HAU The measurement of HAU was performed as follows. Chicken blood was centrifuged at 400 ⁇ g for 10 minutes and the supernatant was discarded. Remaining precipitate with 100 volumes of PBS! ! It became turbid and was further centrifuged at 400 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was discarded. This operation was repeated twice more to prepare a 0.1% blood cell solution.
  • the virus solution was diluted two-fold by a serial dilution method, and 0.05 ml of each was dispensed to a 96-well evening plate. This evening, 0.05 ml of the blood cell solution was further dispensed to the plate, mixed gently by gentle shaking, and allowed to stand at 4 ° C for 40 minutes. Thereafter, red blood cell aggregation was visually observed, and among the aggregated red blood cells, the dilution ratio of the highest dilution of the virus solution was indicated as HAU.
  • the measurement of PFU was performed as follows. CV-1 cells were grown in monolayers on 6-well culture plates. The culture plate was discarded, and 0.1 ml of the virus solution diluted 10-fold by the serial dilution method was dispensed into each culture plate and infected at 37 ° C for 1 hour. Serum-free 2 XMEM and 2% agar 55 during infection. The mixture was mixed with C, and triscine was further added to a final concentration of 0.0075 mg / ml. After infection of 1 hour, the virus solution was removed, added in culture locations 3ml mixed with agar to each culture plate Ueru, 37 in 5% C0 2 conditions. C Insulated for 3 days. 0.2 ml of 0.1% phenol red was added, and the mixture was kept at 37 ° C for 3 hours and then removed. The number of uncolored plaques was counted and the virus titer was evaluated as PFU / ml.
  • Table 1 shows the amounts of type I Sendai virus cDM introduced into LLC-M2 cells, pGEM-L, pGEM-P / C and pGEM-NP, which are cDM factors required for RNA replication, and the incubation volume. The Yong time, the number of cells inoculated into chicken eggs, HAU, and PFU are shown. Table 1 pGEM- pGEM- Type I cDA Total (g) Culture Time (&#) Cell Number HAU PFU
  • the sample showing both HAU and PFU was precipitated by ultracentrifugation, resuspended, purified by sucrose density gradient centrifugation at 20 ° to 60 °, and proteins were separated by 12.5 DS-PAGE.
  • the protein contained was the same size as the Sendai virus protein.
  • This result indicated that the cDNA could be introduced into cells to reconstitute Sendai virus.
  • the virus particles were reconstituted more efficiently than when the cDNA transcribing the (-) strand was introduced.
  • the virus particles were reconstituted more efficiently than when the cDNA was introduced in a linear form.
  • Example 2 An experiment was performed to determine whether all three of them required L, P / C, and NP-expressing brassmids.
  • the method is the same as in Example 2, except that in Example 2, pGEM-L pGEM-P / C and pGEM-NP were introduced into cells together with cDNA, whereas in this experiment, pGEM- L, pGE Any two or only one of MP / C and pGEM-NP was introduced into cells together with cDNA.
  • Table 2 shows the amounts and incubations of Sendai virus cDNA of type III introduced into LLC-MK2 cells, pGEM-L, pGEM-P / C and pGEM-NP, which are cDNAs of factors required for RNA replication. The time, the number of cells inoculated into chicken eggs, HAU, and PFU are shown.
  • Example 2 showed that Sendai virus was reconstituted from cDNA. We examined whether the same could be achieved with cDNA transcribed in vitro, ie, vRNA and cRNA.
  • the Sendai virus transcription unit pUC18 / T7 (-) HVJRz.DNA and pUC18 / T7 (+) HVJRz.DNA are linearized with the restriction enzyme Mlul, and then used as a gun to purify purified T7 polymerase (EPICENTRE).
  • RNA 10 4 2 4 40 I. OOE + 06 5 1 2 2 X 10 l in vilro (-) RNA 10 4 2 4 40 1.00E + 06 5 1 2 ⁇ ° in vi (ro (+) RNA 10 4 2 4 40 1.00E + 06 2 ' 10 3 in vitro (+) RNA 10 4 2 4 40 1.00E + 06 ⁇ 2 ND From these results, it was possible to reconstitute the virus regardless of which type of RNA was introduced into the cells. Above possible use
  • a system for efficiently reconstituting virus particles from Sendai virus cDNA has been established, and gene manipulation in Sendai virus has become possible.
  • one or more functional protein genes have been deleted or inactivated, and a recombinant Sendai virus capable of infecting cells and having no propagating ability has been produced.
  • DDS a highly safe delivery system for DDS, that is, a physiologically active substance, utilizing the membrane fusion properties of Sendai virus.

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Description

明細書 組換え体センダイウィルスを利用した膜融合性リボソーム 技術分野
本発明は、 組換え体センダイウィルスとリボソームとを融合して得られる膜融 合性リボソームに関する。 技術背景
薬物治療、 遺伝子治療、 において薬物 （特に高分子化合物） や核酸等の生理活 性物質を、 目的とする細胞または細胞内組織に到達させるシステム、 すなわちド ラッグデリバリ一システム （Drug Del ivery System；以下単に DDSと言う） は重要 な技術分野である。 DDSは 2つの方法に分類することができる。
ひとつは、 ウィルスベクターを用いる方法である。 これには、 所望の外来性遺 伝子をゲノム上に有するウィルスを細胞に感染させることにより、 内部の核酸を 細胞内に導入するという方法が含まれる。
もうひとつは、 人工的なまたは半人工的な輸送担体 （キャリア一） に、 所望の 生理活性物質を封入または担持させる方法である。 この方法は、 目的物の生体内 挙動および輸送に関与する諸過程を、 キヤリア一自体の物理化学的性質に依存さ せることにより、 生理活性物質を所望の臓器 （標的臓器） 、 細胞 （標的細胞） ま たは細胞内器官 （標的器官） に到達せしめる方法 （デリパリ一システム） である 。 この方法におけるキャリア一としては例えば、 蛋白質 （Human Gene Therapy, 5 ， 29, 1994) 、 ぺプチド (Proceedings of National Acaaemy of Sciences of U nited States of America, 90, 893, 1993) 、 高分子 (The Journal of Biological Chemistry, 269, 12918, 1994) およびリボソーム (Proceedings of National Ac ademy of Sciences of United States of America, 92, 1744, 1995) 等を例示する ことができる。 これらキャリア一は、 分子量、 粒径、 表面電荷、 特異的結合能等 の物理化学的性質により、 生体内においては固有の挙動および標的指向性を呈す る。 そのため、 これらキャリアーに封入または担持された生理活性物質は、 キヤ リア一と同様の生体内挙動および標的指向性を有することが可能となる。 この方 法を用いた例としては、 癌細胞表面に多く発現したトランスフェリンレセプ夕一 を利用したデリノ J一システム (Proceedings of National Academy of Science s of United States of America, 89，7934， 1992) 、 標的細胞表面に発現した特異 的抗原を利用したデリバリーシステム (Biochim Biophys Acta, 1152,231-242, 19 93) 、 肝細胞表面に存在するァシァ口糖蛋白レセブ夕一を利用したデリバリ一シ ステム (The Journal of Biological Chemistry，266， 14338, 1991) 、 センダイゥ ィルスの膜融合性を利用したデリパリ一システム （Exp. Cell Res.，159， 399, 198 5) 等が挙げられる。
特に、 センダイウィルスの膜融合性を利用したデリバリーシステムにおいては 、 エンドサイ トーシス経路を介さず、 生理活性物質を標的細胞質内に直接導入す ることが可能であるため、 従来の方法では困難であつた遺伝子等の高分子量で安 定性の低い生理活性物質の送達において、 高い有効性が示されている （ 「Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Deliveryj Lee, V.H. L. et al . eds. Harwood Academic Publishers, Switzerland, 337, 1995) 。 しか しながら、 このシステムに用いられるセンダイウィルスは野性株を紫外線処理し たものであり、 その安全性は必ずしも高いとは言えない。 紫外線処理によらず完 全に安全性を保つことのできる膜融合性リボソームの開発は、 センダイウイルス の膜融合性を利用したデリパリ一システムにおいて切望されている。 そして、 そ のためには野生型ウィルスとしての活性を有しないセンダイウィルスを実用的な レベルで生産できることが必要であった。
本システムの材料として用いられるセンダイウィルス （Sendai virus) は、 H V J (Hemagglutinating virus of Japan)とも呼ばれ、 パラミクソウィルス科 （P aramyxoviridae) 、 パラミクソウィルス属 (Paramyxovirus) に属するパライン フルェンザウィルス 1型の 1株である。 センダイウィルス粒子は多形性であり、 直径 150〜200nmのエンベロープを有し、 中に翻訳の鎵型とはならないゲノム RNA
(以下、 「 （―） 鎖 RNA」 と称する） を有する。 センダイウィルスは、 歴史的に 見ても産業上有用なウィルスとして知られており、 とくに細胞のへテロカリオン や雑種細胞の作製、 すなわち細胞融合に広く利用されている。 また、 上述したよ うに膜融合性リボソームの材料として好適に用いられている。
ゲノム核酸の形態による分類では、 センダイウィルスは、 RNAウィルスの、 （ 一） 鎖 RMウィルスの、 （―） 1本鎖 RNAウィルスグループに属する。 RNAウィル スは、 dsRNAウィルス（double stranded RNA virus), ( + ) 鎖 RNAウィルスおよ び （一） 鎖 RNAウィルスの 3者に分類される。 dsRNAウィルスグループには、 レオ ウィルス、 口夕ウィルス、 植物レオウィルス等があり、 分節型の複数の線状 dsRN Aゲノムを有している。 （+ ) 鎖ウィルスには、 ポリオウイルス、 シンドビスゥ ィルス、 セムリキ森林ウィルス、 日本脳炎ウィルス等があり、 1本の （+ ) 鎖 &N Aをゲノムとして有しており、 この RNAゲノムは同時に mRNAとしても機能し、 複製 や粒子形成に必要な蛋白質を宿主細胞の翻訳機能に依存して生産することができ る。 言い換えれば、 （+ ) 鎖 RNAウィルスが有するゲノム RNA自体が伝播力を有す る。 なお、 本明細書において 「伝播力」 とは、 「感染や人工的な手法で核酸を細 胞内に導入した後、 細胞内に存在する該核酸が複製後、 感染性粒子またはそれに 準ずる複合体を形成し、 別の細胞に次々と伝播することのできる能力」 を言う。
( + ) 鎖 RNAウィルスに分類されるシンドビスウィルスや （一） 鎖 RNAウィルスに 分類されるセンダイウィルスは、 伝播力を有するが、 パルボウイルス科に分類さ れるアデノ随伴ウィルス （Adeno-associated virus) は、 感染能は有するが、 伝 播カを有しない （ウィルス粒子が形成されるためには、 アデノウイルスの同時感 染が必要である） 。 また、 試験管内で人工的に転写されたシンドビスウィルス由 来の （+ ) 鎖 RNAは伝播力を有するが、 試験管内で人工的に転写されたセンダイ ウィルス RNAは （+ ) 鎖、 （一） 鎖ともに伝播力を有しない。
安全性の高いセンダイウィルス膜融合性リボソームを作製するためには、 伝播 力を有しない組換え体センダイウィルスを作出することが必要となる。 これまで にも、 DI粒子のような不完全ウィルスを利用して、 膜融合リポソ一ムを作ろうと する試みはなされてきたが、 不完全ウィルスの増殖のためにはヘルパーウィルス が必要であったので、 感染性のあるヘルパーウィルスが混入してしまうという問 題があった。 即ち、 安全性の高いセンダイウィルス膜融合性リボソームの原料と なる 「有害なウィルスの混入のない、 伝播力を有しないセンダイウィルス」 を単 離するためには、 センダイウィルスゲノムからのウィルス粒子の再構成のための 手法が確立している必要があつたが、 その方向の研究は精力的に行なわれていな かった。 （ウィルス粒子の再構成とは、 「ウィルスゲノムの核酸を人工的に作製 し、 試験管内または細胞内において、 もとのウィルスまたは組換え体ウィルスを 作製すること」 である。 ）
DNAをゲノム核酸とする DNAウィルスの再構成は比較的早くから行なわれており 、 例えば、 SV40 (J, Exp. Cel l Res. ,43,415-425, 1983) のように、 精製したゲ ノム DNAそのものをサルの細胞に導入することにより行なうことが可能である。
RNAをゲノム核酸とする RNAウィルスの再構成は、 （+ ) 鎖 RNAウィルスにおいて開 発が先行した。 この理由は、 ゲノム RNAが、 同時に mRNAとして機能するからである 。 例えば、 ポリオウイルスでは、 精製した RNA自体が伝播力を有することが、 すで に 1959年に報告されている (Journal of Experimental Medicine, 110,65-89, 195 9) 。 また、 セムリキ森林ウィルス （Semliki forest virus; SFV) では、 宿主細 胞の DNA依存性 RNA転写活性を利用することにより、 cDNAを細胞内に導入すること によってウィルスの再構成が可能であることが報告されている （Journal of Vir ology,65，4107-4113，1991) 。
さらにはこれらの再構成技術を利用して、 遺伝子治療用ベクターの開発も進め られている [Bio/Technology, 11 , 916-920, 1993、 Nucleic Acids Research, 23, 1 495-1501 , 1995、 Human Gene Therapy, 6， 116卜 1167， 1995、 Methods in Cell Biol ogy, 43,43-53, 1994, Methods in Cell Biology,43, 55-78, 1994]。
ところが、 前述したとおり、 センダイウィルスは産業的に有用なウィルスとし て利用しうる長所を多数有しているにもかかわらず、 （一） 鎖 RNAウィルスであ るため、 再構成系が確立していなかった。 そのことは、 ウィルス cDNAを経由した ウィルス粒子再構成系がきわめて困難だったことに起因する。
前述したように （一） 鎖 Aウィルスの RNA(vRNA; viral RNA)またはその相補 鎖 RNA(cRNA;complementary RNA)を単独で細胞内に導入しても ( - ) 鎖舰ウィル スは生成されないことが明らかにされている。 このことは、 （+ ) 鎖 RNAウィル スの場合と決定的に違う点である。 なお、 特開平 4-211377号公報には、 「負鎖 RN Aウィルスのゲノムに対応する cDNAおよび感染性の負鎖 RNAゥィルスの製造方法」 について記載があるが、 該公報の実験内容がそのまま記載されている 「EMB0.J. , 9, 379-384， 1990」 は、 実験の再現性がないことが明らかとなり、 筆者みずから論 文内容を全面的に取り下げている （EMB0.J. , 10, 3558, 1991参照） ことからして、 特開平 4-211377号公報に記載の技術が本発明の先行技術に該当しないのは明らか 乙*あ ®。
(一） 鎖 RNAウィルスの再構成系について、 インフルエンザウイルスに関して は報告がある (Annu.Rev. Microbiol . ,47, 765-790, 1993、 Curr. Opin. Genet. DEV. ,2, 77-81, 1992) 。 インフルエンザウイルスは、 8分節ゲノムより構成され る （一） 鎖 RNAウィルスである。 これらの報告によれば、 あらかじめそのうちの 1つの cDNAに外来性遺伝子を揷入し、 また外来性遺伝子を含む 8本すベての cDNA から転写された RNAをあらかじめウィルス由来の NP蛋白質と会合させて MPとした 。 これらの RNPと、 RNA依存性 RNAポリメラーゼとを細胞内に供給することにより 、 再構成が成立した。 また、 （一） 鎖一本鎖 RNAウィルスについては、 ラブドウ ィルス科に属する狂犬病ウィルスで cDNAからのウィルス再構成についての報告が ある （J. Virol .，68, 713-719, 1994)。 従って、 （―） 鎖 RNAウィルスの再構成系技術は基本的には公知のものとなつ たが、 センダイウィルスの場合は、 この手法をそのまま適用しても、 ウィルスを 再構成することができなかった。 また、 ラブドウィルスにおいてウィルス粒子が 再構成されたという報告については、 マーカ一遗伝子の発現や RT-PCR等で確認を 行なっているだけであり、 生産量の面から十分とはいえなかった。 さらには、 従 来は、 再構成に必要な因子を細胞内で供給する目的で、 天然型のウィルスゃ組換 え型のワクチニァウィルス等のウィルスを、 再構成するべきウィルスの核酸と同 時に細胞に供給しており、 再構成された所望のウィルスとそれらの有害なウィル スの分離が容易でないという問題があった。
発明の開示
本発明は、 センダイウィルスの膜融合性を利用した、 D D S、 即ち生理活性物 質のデリパリ一システムとして、 安全性の高いものを開発することを課題とする ο
もしセンダイウィルスにおいて、 核酸を有しないウィルス粒子を製造すること ができるならば、 安全性の高い膜融合性リボソームを作製することが可能である 。 しかし、 核酸を有しないセンダイウィルス粒子を作製する方法は報告されてい ない。 そこで、 本発明者らはその代りに、 伝播力を有しないセンダイウィルス粒 子を製造し、 安全性の高い膜融合性リポソ一ムを作製することを目指して研究を 進めた。 伝播力を有しない組換え体センダイウィルスを原料として用いた場合、 センダイウィルス由来の不活化された RNAが膜融合性リポソ一ム内に残る可能性 は否定できないものの、 野生型のウィルスを材料として用いる場合よりもはるか に安全であることは明らかである。
本発明は、 より具体的には、 伝播力を有しないセンダイウィルスを製造するこ とを課題とし、 製造できるか否かは、 センダイウィルスの再構成技術を構築でき るか否かに依存している。 本発明者らは、 組換え体センダイウィルス再構成系の確立に関して鋭意検討を 行なった。 特に、 効率的な再構成条件すなわち細胞内に導入する核酸や補助因子 等の量比等の詳細な検討を行なった。 さらには、 組換え型のワクチニァウィルス 等の混入をなくするための検討も行なった。
本発明者らはまず、 センダイウィルスの再構成試験に適用するため、 センダイ ウィルス DI粒子 （defective interfering particle/EMBO. J. , 10, 3079-3085, 1991 参照） 由来の cDNAまたはセンダイウィルスミニゲノムの cDNAを用いて、 種々の検 討を行なった。 その結果、 細胞内に導入する、 cDNA、 転写複製に関する cDNA群、 および T7RNAポリメラーゼ発現ュニッ卜である組換え体ワクチニァウィルスの量 比について、 効率の良い条件を見い出した。 本発明者らは更に、 センダイウィル ス全長の cDNAを （+ ) 鎖と （―） 鎖の両者とも取得し、 細胞内で （+ ) 鎖または (一） 鎖のセンダイウィルス RNAが生合成されるようなプラスミ ドを構築し、 転 写複製に関する cDNA群を発現している細胞内に導入した。 その結果センダイウイ ルス cDNAよりセンダイウィルス粒子を再構成することに初めて成功した。 なお、 本発明者らによって、 効率良い粒子再構成のためには、 細胞内に導入する cDNAの 形態が線状よりも環状のほうが適当であり、 また （一） 鎖 RNAが細胞内で転写さ れるよりも、 （+ ) 鎖 RNAが細胞内で転写されるほうが粒子形成効率が高いこと が新たに見い出された。
さらに、 本発明者らは、 T7RNAポリメラーゼ発現ユニッ トである組換え体ワク チニァウィルスを用いない場合でもセンダイウィルスの再構成を行いうることを 見い出した。 すなわち、 試験管内で転写したセンダイウィルス全長 RNAを細胞内 に導入し、 初期転写複製酵素群の cDNAを T7プロモータ一支配下で転写させた場合 、 ウィルス粒子が再構成された。 このことは、 初期転写複製酵素群をすベて発現 する細胞を構築すれば、 ワクチニァウィルスのようなヘルパーウィルスを全く使 用せずに組換え体センダイウィルスを作出することが可能であることを示してい る。 なお、 初期転写複製酵素群をすベて発現する細胞は、 「J. Virology, 68, 841 3-8417, 1994 j に記載されており、 該記載を参照して当業者が作出することが可 能である。 なお、 該文献記載の細胞は、 センダイウィルス遺伝子のうち、 NP， P/ C, L の 3者を染色体上に有している 293細胞由来の細胞であり、 このものは、 NP ， P/C, L の 3者の蛋白質を発現している。
多くのウィルスベクタ一の例から、 核酸からウイルス粒子の再構成が効率よく できるならば、 所望のウィルス遺伝子を組み換えたり、 外来性遺伝子を挿入した り、 または所望のウィルス遺伝子を不活化させたり、 欠失させることは、 当業者 にとつて容易になしうることであることは明らかである。 即ち、 本発明において 初めてセンダイウィルス粒子の再構成に成功したことは、 本発明によってセンダ ィウイルスの遗伝子操作が可能となったことを意味することは、 当業者には自明 のことである。 例えば、 センダイウィルス構造体遗伝子の少なくとも一部を欠如 させる DNAレベルでの遺伝子操作を常法に従って行い、 該組換え DNAから伝播力を 有しないセンダイウィルス粒子を再構成することが、 本発明によって可能となつ た。
すなわち本発明は以下のものを含む。
( 1 ) 1以上の機能蛋白質遺伝子が欠失または不活化しており、 細胞感染能を 有するが、 伝播力を有しない組換え体センダイウィルスと、 所望の核酸または薬 物を封入したリボソームとを融合して得られる膜融合性リボソーム、
( 2 ) 組換え体センダイウィルスが、 センダイウィルスの M遗伝子、 F遺伝子 または HN遺伝子のうち少なくとも 1以上の遺伝子が欠失または不活化しているこ とを特徴とする （ 1 ) に記載の膜融合性リボソーム、
( 3 ) 組換え体センダイウィルスが外来性遺伝子を有することを特徴とする （ 1 ) または （2 ) のいずれかに記載の膜融合性リボソーム、
( 4 ) ( a) ( 1 )〜 （ 3 ) のいずれかに記載の膜融合性リボソームに含まれる組 換え体センダイウィルスの、 欠失または不活化している遺伝子に相当する遺伝子 を染色体上に有し、 該遺伝子を発現しうる宿主で、 センダイウィルスの複製酵素 群を発現しうるもの、 （b) (1)〜（3) のいずれかに記載の膜融合性リポソ一 ムに含まれる組換え体センダイウィルスに含まれる RNAもしくは該 Aの cRNAを含 む RNA、 またはこれらの RNAを生合成しうるユニッ ト、 （c)所望の核酸または薬物 を封入したリボソームの 3者を含むキット、
(5) 宿主が動物、 動物に由来する細胞、 動物の組織または動物の卵であるこ とを特徴とする （4) に記載のキット、
(6) 動物が哺乳類であることを特徴とする （5) に記載のキッ ト、
(7) 動物が鳥類であることを特徴とする （5) に記載のキット、
(8) 1以上の機能蛋白質遺伝子が欠失または不活化しており、 細胞感染能を 有するが、 伝播力および自律複製能を有しない組換え体センダイウィルス、
(9) センダイウィルスの M遺伝子、 F遺伝子または HN遺伝子のうち少なくとも 1以上の遺伝子が欠失または不活化していることを特徴とする （8) に記載の組 換え体センダイウィルス、 および
(10) 外来性遺伝子を有することを特徴とする （8) または （9)のいずれ かに記載の組換え体センダイウィルス。
本発明において、 「 1以上の機能蛋白質遺伝子が欠失または不活化しているセ ンダイウィルス jは、 パラインフルェンザ 1型に分類される株由来のものであれ ば良く、 例えば Z株 （Sendai virus Z strain) 由来のもの、 フシミ株 （Sendai virus Fushimi strain) 由来のもの等が挙げられる。 また、 DI粒子等の不完全ゥ ィルスや、 合成したオリゴヌクレオチド等も、 材料の一部として使用することが できる。 また、 該ウィルスでリボソームと融合されるものは、 自律複製能を保持 するもの、 または自律複製能を保持しないもののどちらでも構わない。 例えば、 DI粒子等の不完全ウィルス、 センダイウィルスのミニゲノムまたは合成したオリ ゴヌクレオチド等も使用することができるが、 ゲノム RNAの両末端配列が、 細胞 内にトランスに供給された複製因子である NP， P/Cおよび L蛋白質により認識され て複製することが必要である。 組換え体センダイウィルスは、 所望の外来性遺伝子を挿入したり、 所望のゲノ ム遺伝子を欠失または改変することが可能である。 組換え体センダイウィルスは 、 たとえば免疫原性に関与する遺伝子を不活性化したり、 欠失させたりすること もできるし、 RNAの転写効率や複製効率を高めるために、 一部の遺伝子を改変した ものでも良い。 具体的には、 例えば複製因子である NP遗伝子、 P/C遺伝子または L 遗伝子の少なくとも一つを改変し、 転写、 複製機能を高めることもできる。 また 、 構造体蛋白質の 1つである HN蛋白質は、 赤血球凝集素であるへマグルチニン （ hemagglutinin) 活性とノィラミニダ一ゼ (neuraminidase) 活性との両者の活性 を有するが、 例えば前者の活性を弱めることができれば、 血液中でのウィルスの 安定性を向上させることが可能であろうし、 例えば後者の活性を改変することに より、 感染能を調節することも可能である。 むろん、 これらの蛋白質の供給原と してはゲノム RNA由来のものを用いても構わないし、 トランスに供給されたものを 用いてもよい。 また、 膜融合に関わる F蛋白質を改変することにより、 膜融合リポ ソ一ムの融合能を調節することもできる。 また、 例えば、 細胞表面の抗原分子と なりうる F蛋白質や HN蛋白質の抗原提示ェビト一プ等を解析することが 、 再構成 系の確立により可能となったため、 これを利用して抗原提示能を弱めたセンダイ ウィルス、 ひいては抗原提示能の弱まった膜融合性リボソームを作製することも できる。 これらの改良もまた、 蛋白質の供給原としてはゲノム RNA由来のものを用 いても構わないし、 トランスに供給されたものを用いてもよい。
なお、 本発明に用いる組換え体センダイウィルスは、 自立複製能を有しないも のである方が望ましい。 自立複製能を有しなければ、 感染後細胞内で RNAが増殖す ることがなく、 不要な蛋白質の合成が起こることがないなどの利点があるからで ある。
膜融合性リボソーム内に導入する核酸、 薬剤としては、 例えば、 アンチセンス (Drug Del ivery System, 10, 91-97, 1995) 、 デコイ (The Journal of Biologica 1 Chemistry, 267, 12403-12406, Γ 4) 、 リボザィム （The Drug Del ivery System ,10,91-97,1995) 、 三重鎖 DNA (細胞工学、 13巻、 No.4, 277-285、 1994) 、 ブラ スミ ド DM (Methods Enzymology,221, 317-327, 1993) 、 RNAベクタ一、 および、 こ れらとキヤリア一 (Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America, 89, 7934-7938, 1992) または、 蛋白 (Journal of Biological Chemistry, 266 (6), 3361-3364, 1991) との複合体、 さらには、 抗癌剤、 抗ウィル ス剤、 トキシン （ジフテリアトキシン； Biochim Biophys Acta， 1192, 253-262,199 4 リシン； Biochim Biophys Acta, 1070,246-252, 1991) 、 酵素 (Immunology, 81, 280-284,1994) などが挙げられる。 図面の簡単な説明
図 1は pUC18/T7( + )HVJRz.DMの構成を示す図である。
図 2は pUC18/T7(- )HVJRz.DNAの構成を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限 定されるものではない。
[実施例 1 ] センダイウィルス転写ュニッ ト pUC18/T7(-)HVJRz.DNAおよび pU C18/T7( + )HVJRz.DNAの作製
T7 プロモー夕一、 （-)鎖 RNAが転写されるように設計されたセンダイウィルス c DNA、 リポザィム遺伝子をこの順に保持する DNAを、 pUC18プラスミ ドに挿入したプ ラスミ ド pUC18/T7(-)HVJRz.DNAを作製した。 また、 T7 プロモー夕一、 （+ )鎖 RNAが 転写されるように設計されたセンダイウィルス cDNA、 リポザィム遺伝子をこの順 に保持する DMを、 pUC18プラスミ ドに挿入したブラスミ ド pUC18/T7( + )HVJRz.DNA を作製した。 pUC18/T7(-)HVJRz.DNAおよび pUC18/T7( + )HVJRz.DNAの構成を図 1お よび図 2に示した。
[実施例 2] cDNAからのセンダイウィルス再構成実験 直径 6 c mのブラスチヅクシャーレに通常のトリブシン処理を施した LLC-MK2細 胞を 2， 000， 000個と MEM培地 (MEM +FBS 10%) 2mlとを添加し、 C02 5¾， 37°Cの条件 下で 24時間培養した。 培養液を取り除き、 1mlの PBSを用いて洗浄した後、 多重感 染度 （moi/multiplicity of infection) が 2となるように調製した、 T7ポリメ ラーゼを発現する組換えワクチニァウイルス VTF7-3を 0.1mlの PBSに想濁したもの を添加した。 15分毎にゥィルス液が全体にいきわたるようにシャーレを揺らし、 1時間の感染を行った。 ウィルス溶液を除去し、 1mlの PBSを用いて洗浄した。 こ のシャーレに、 cDNA溶液を含む培地を添加した。 cDNA溶液を含む培地の作製は、 以下のように行なった。
表に記した核酸 （センダイウィルスの複製に必要な因子を発現するブラスミ ド 、 pGEM-L, pGEM-P/C, pGEM-NP を含む） を 1.5mlのサンプリングチューブにとり 、 HBS(Hepes buffered saline ; 20mM Hepes pH7.4, 150mM NaCl )を加えて総量を 0.1mlにした。 表中の （- )または（ + )cDNAは、 ブラスミ ド pUC18/T7(- )HVJRz.DNAま たは pUC18/T7( + )HVJRz.DNAそのものを示し、 /Cは環状のまま、 /Lは制限酵素 Mlul により直鎖化した後に細胞に導入していることを示す。
他方、 ポリスチレンチューブの中で、 HBS 0.07ml , D0TAP (ベ一リンガーマンハ ィム社製 )0.03mlを調合し、 核酸溶液をこのポリスチレンチューブに移した。 この 状態で、 10分静置した。 これに、 細胞培養液 （2ml MEM +FBS 10%) を添加した。 さらにこの中にワクチニァウィルスの阻害剤であるリファンビシン （Mfampicin ) とシトシンァラビノシド C (Cytosin arabinoside C/Ara C) を最終濃度がそ れぞれ 0.1mg/ml, 0.04mg/mlとなるように添加した。 これにより、 cDNA溶液を含む 培地が作製された。
前記のシャーレを 40時間 C02 5¾， 37°Cの条件下で培養した。 ラバーポリスマン を用いてシャーレ内の細胞をかき取り、 エツペンドルフチューブに移し 6000rpm、 5分間の遠心を行って細胞成分だけを沈殿し、 再度 lmlの PBSに懸濁した。 この細胞 液の一部をそのままの状態、 あるいは希釈して 1 0日齢の発育鶏卵に接種した。 この細胞液を第 1表に示した細胞数となるように PBSで希釈し、 0.5ml 接種した卵 を 35。C72時間培養後 4 °Cに移して一晩置いた。 この卵の漿尿液をウィルス液とし て注射器と注射針を用いて回収した。
回収したゥイリレス液の腦 (hemagglutinin unit)と、 PFU(plaque forming uni t )の測定を以下に示す方法で行った。
HAUの測定は以下のように行なった。 鶏の血液を、 400x gで 10分間遠心し、 上清 を捨てた。 残る沈殿を、 沈殿の 100倍量の PBSで！！濁し、 これをさらに 400x g，10分 間遠心し、 上清を捨てた。 この操作をさらに 2回、 繰り返し、 0. 1%血球溶液を作 製した。 ウィルス溶液を段階希釈法により 2倍ずつに希釈し、 その 0.05mlずつを、 96穴の夕イタ一プレートに分注した。 この夕イタ一プレートに、 さらに 0.05mlず つの血球溶液を分注し、 軽く振動させてよく混ぜた後、 4°Cで 40分静置した。 その 後、 赤血球の凝集を肉眼で観察し、 凝集したもののうち、 もっともウィルス溶液 の希釈率の高いものの希釈率を、 HAUとして示した。
PFUの測定は以下のように行なった。 CV-1細胞を、 6穴のカルチャープレート上 に単層になるように生育させた。 カルチャープレートの培地を捨て、 段階希釈法 により 10倍づっに希釈したウィルス溶液 0. 1mlずつをそれぞれのカルチヤ一プレー ト内ゥエルに分注し、 37°C、 1時間感染させた。 感染中に血清の含まれていない 2 XMEMと 2%寒天を 55。Cで混ぜ合わせ、 さらに最終濃度 0.0075mg/mlとなるようにト リブシンを加えた。 1時間の感染後、 ウィルス溶液を取り除き、 寒天と混合した培 地 3mlずつをそれぞれのカルチャープレート内ゥエルに加え、 5 %C02条件下で 37 。C3日間保温した。 0.2mlの 0. 1 %フエノールレツ ドを加え、 37°C 3時間保温した後 、 取り除いた。 色の付いていないプラークの数を数え、 ウィルスの力価を PFU/ml として評価した。
表 1には、 LLC-M2細胞に導入した銬型となるセンダイウィルス cDM、 RNA複製 に必要な因子の cDMである pGEM-L、 pGEM-P/Cおよび pGEM-NPの量、 インキュべ一シ ヨン時間、 鶏卵に接種した細胞数、 HAU、 PFU をそれぞれ示した。 表 1 pGEM- pGEM- 铸型 cD A 合計 ( g) 培泰時間 (&#) 細胞数 HAU PFU
L(ug) Nr(ug)
(+) cDNA/C 10 4 2 4 40 1 ππ X i nJ 512
(+) cDNA/C 10 4 2 4 40 00 X 1 fl^ 256 □ j u
10 4 2 4 40 J 256
α.
Figure imgf000016_0001
] U
(+)cDNAし 10 4 2 4 40 1 0ΩΧ 1 <2 <10
(+) cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00 Ϊ06 <2 <I0
(-) cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00 104 <2 <10
(-) cDNAL 10 4 2 4 40 1.00 105 <2 10
(-) cDNAし 10 4 2 4 40 1.00XI06 <2 <10
(-) cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00 104 <2 <I0
(-) cDNA/C to 4 2 4 40 1.00X105 <2 <IO
(-) cDNAC 10 4 2 4 40 1.00X106 4 8X 103
HAU, PFUをともに示したサンプルを超遠心で沈渣とした後、 再浮遊して 20°〜 6 0¾のショ糖密度勾配遠心で精製し、 12.5 DS-PAGEで蛋白質を分離したところ、 こ こに含まれる蛋白質は、 センダイウィルスの蛋白質と同じ大きさのものであった この結果から、 cDNAを細胞に導入してセンダイウイルスを再構成できることが 示された。 また、 （+ )鎖を転写する cDNAを細胞内に導入したときには、 （-)鎖を転 写する cDNAを導入したときに比べてウィルス粒子が効率よく再構成されることが 示された。 さらに、 cDNAを環状のままで導入したときには、 直鎖状にして導入し たときに比べてウィルス粒子が効率よく再構成されることが示された。
[実施例 3 ] センダイウィルス再構成に必要な RNA複製因子の検討
L, P/C, NPを発現するブラスミ ドが三者ともに必要かどうかを調べる実験を行 つた。 方法は実施例 2と同様であるが、 実施例 2では cDNAとともに、 pGEM-L pG EM-P/C, pGEM-NPの 3者を細胞内に導入したのに対し、 本実験では、 pGEM-L, pGE M-P/C, pGEM- NPのうちの任意の 2者または一者のみを cDNAとともに細胞内に導入 した。
表 2は、 LLC- MK2細胞に導入した鎵型となるセンダイウィルス cDNA、 RNA複製に 必要な因子の cDNAである pGEM-L、 pGEM-P/Cおよび pGEM-NPの量、 インキュべ一ショ ン時間、 鶏卵に接種した細胞数、 HAU、 PFU をそれぞれ示した。
表 2
¾型 CDNA 合計 （ β) PGEM-L pGE -P/C pGEM-NP 培 ¾時 fg (時） 細胞数 HAU PFU
(+) cDNA/C 10 40 1.00 105 256 6X 108 (+) cDNAC 10 40 1.00X10° 512 4ΧΪ09
(+)cDNA/C 10 40 1.00 106 <2 <10 (+) cDNA/C 10 40 1.00 106 <2 く 10
(+) cDNAC 10 40 1.00 10° <2 く 10 (+) cDNAC 10 40 1.00X106 2 <10
(+) cDNA/C 10 40 1.00X ΪΟ6 <2 clO (+) cDNA/C 】0 40 Ι.00ΧΪ06 <2 clO
(+) cDNA/C 10 40 .oox 106 <2 clO (+) cDNA/C 10 40 1.00X 10 <2 clO
(+) cDNAC 10 0 40 1.00X106 <2 ;10 (+) cDNA/C 10 0 40 1.00X106 <2 :】0
(+) cDNA/C 10 0 40 1.O0X 106 <2 :10 C+)cDNA/C 10 0 40 1.00X 106 <2 :10 表 2から、 どの組合わせの 2者を導入した場合もウィルスの生産が認められな かった。 この結果、 この 3種の蛋白質すべてが、 再構成には必須であることが確
6'じ、 れ
[実施例 4 ] in V ro-転写 RNAからのセンダイウィルス再構成実験
実施例 2で、 cDNAからセンダイウィルスが再構成されることを示したが、 さら に cDNAを in vitroで転写した産物、 すなわち vRNA および cRNAでも同様のことが できうるかどうかを検討した。
センダイウィルス転写ュニッ ト pUC18/T7( -)HVJRz.DNAおよび pUC18/T7( + )HVJRz .DNAを制限酵素 Mlulで直鎖状にした後、 これを銃型として用い、 精製 T7ポリメラ —ゼ（EPICENTRE TECHNOLOGIES: Ampliscribe T7 Transcription Kit)による in v itro RNA合成を行った。 in vitro RNA合成の方法はキッ トのプロトコルに従った 。 ここで得られた RNA産物を、 実施例 2の cDNAの代わりに用い、 同様の実験を行い 、 ウィルス生産の評価は HA試験により行った。 結果を表 3に示す。
表 3
miMk 合針 ( u g) GE -L(ug) pGE -P/C(ug) pGEM-NF(ug) 培卷時 （時） 細胞数 HAU PFU in vitro(-)RNA 1 0 4 2 4 40 I .OOE+06 5 1 2 2 X 10リ in vilro(-)RNA 1 0 4 2 4 40 1.00E+06 5 1 2 ^° in vi(ro(+)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 2 ' 103 in vitro(+)RNA 1 0 4 2 4 40 1.00E+06 <2 ND この結果より、 どちらのセンスの RNAを細胞内に導入しても、 ウィルスを再構成 することができた。 産業上の利用の可能性
本発明によって、 センダイウィルス cDNAから効率よくウィルス粒子を再構成す る系が確立され、 センダイウィルスにおける遺伝子操作が可能となった。 その結 果、 1以上の機能蛋白質遺伝子が欠失または不活化しており、 細胞感染能を有す る力 伝播力を有しない組換え体センダイウィルスが製造できるようになった。 そして、 センダイウィルスの膜融合性を利用した、 D D S、 即ち生理活性物質の デリバリ一システムとして、 安全性の高いものを提供することが可能となった。

Claims

請求の範囲
1 . 1以上の機能蛋白質遺伝子が欠失または不活化しており、 細胞感染能を有す るが、 伝播力を有しない組換え体センダイウィルスと、 所望の核酸または薬物を 封入したリボソームとを融合して得られる膜融合性リボソーム。
2 . 組換え体センダイウィルスが、 センダイウィルスの M遺伝子
、 F遺伝子または HN遺伝子のうち少なくとも 1以上の遺伝子が欠失または不活化 していることを特徴とする請求の範囲 1に記載の膜融合性リボソーム。
3 . 組換え体センダイウィルスが外来性遺伝子を有することを特徴とする請求の 範囲 1または 2のいずれかに記載の膜融合性リボソーム。
4 . (a)請求の範囲 1〜 3のいずれかに記載の膜融合性リボソームに含 まれる組 換え体センダイウィルスの、 欠失または不活化している遺伝子に相当する遺伝子 を染色体上に有し、 該遺伝子を発現しうる宿主で、 センダイウィルスの複製酵素 群を発現しうるもの、 （b)請求の範囲 1〜 3のいずれかに記載の膜融合性リ ポソ —ムに含まれる組換え体センダイウィルスに含まれる RNAもしくは該 RNAの cRNAを 含む RNA、 またはこれらの RNAを生合成しうるユニッ ト、 （c )所望の核酸また は薬 物を封入したリボソームの 3者を含むキット。
5 . 宿主が動物、 動物に由来する細胞、 動物の組織または動物の卵であることを 特徴とする請求の範囲 4に記載のキット。
6 . 動物が哺乳類であることを特徴とする請求の範囲 5に記載のキッ ト。
7 . 動物が鳥類であることを特徴とする請求の範囲 5に記載のキッ ト。
8 . 1以上の機能蛋白質遺伝子が欠失または不活化しており、 細胞感染能を有す るが、 伝播力および自律複製能を有しない組換え体センダイウィルス。
9 . センダイウィルスの M遺伝子、 F遺伝子または HN遺伝子のうち少なくとも 1以 上の遺伝子が欠失または不活化していることを特徴とする請求の範囲 8に記載の 組換え体センダイウィルス。 18
1 ° · 外来性遺伝子を有することを特徴とする請求の範囲 8または 9のいずれか に記載の組換え体センダイウィルス。
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