WO1997005281A1 - Methode de differentiation genetique des varietes du houblon - Google Patents

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WO1997005281A1
WO1997005281A1 PCT/JP1996/002121 JP9602121W WO9705281A1 WO 1997005281 A1 WO1997005281 A1 WO 1997005281A1 JP 9602121 W JP9602121 W JP 9602121W WO 9705281 A1 WO9705281 A1 WO 9705281A1
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primer
varieties
dna
seq
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PCT/JP1996/002121
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Shigeki Araki
Yohichi Tsuchiya
Original Assignee
Sapporo Breweries Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying varieties of hops, and particularly to a method for identifying varieties using genetic engineering technology.
  • Hops give beer a unique aroma and bitterness, and also have the effect of precipitating and separating excess protein and suppressing the growth of various bacteria.
  • the degree of these effects differs mainly depending on hop varieties, so it is necessary to identify hop varieties before producing beer of a certain quality or developing new beer. is there.
  • the breed identification method of the hop conventionally, fi one with group-containing components of the hops, for example bitterness Ingredient (afe / yS acid cohumulone / humulone, colu ulone / iupulone ) ⁇ essential oil component (farne sene, caryophyl lene) the difference I was
  • the hop variety identification method of the present invention is a method of detecting and identifying this polymorphism by a genetic method based on a DNA sequence difference between varieties, that is, a polymorphism.
  • a region containing polymorphism among varieties of hop DNA is amplified by polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR) using breed identification primer, and varieties are identified by analyzing the amplified DNA. .
  • the polymorphism includes a difference in organization on the sequence derived from insertion, deletion, substitution, etc., and the length of the sequence involved in the polymorphism may be 1 bp, Alternatively, it may be several tens of bp or more, but is preferably several bp to several tens of bp.
  • the sequence of the corresponding portion of chromosomal DNA is determined for each variety, and the sequences determined here are compared and analyzed to detect the polymorphism. It is possible to use the RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) method developed by Wil liams et al. (Nucleic Acids Rese arch. Vol. 18, p. 6531, 1990). it can.
  • RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
  • the RAPD method detects polymorphisms in DNA whose sequence is unknown by using PCR.
  • PCR is performed by mixing a primer with a low specificity composed of a relatively short synthetic oligonucleotide of about 10 bases with a plurality of target DNAs. If there is a sequence that completely or partially complements the mixed primer in the DNA sequence of the hops, it anneals with the complete or partial persimmon sequence and is sandwiched between the primers. The region is amplified. Then, if there is a sequence difference, such as insertion or deletion of DN ⁇ , in the region sandwiched between the primers in different species, PCR amplified fragments of different sizes in different species can get.
  • a PCR-amplified fragment will be obtained in only one variety. By fractionating this by electrophoresis or the like, a polymorphism can be detected.
  • the RAPD method is also used as a method for selecting a primer capable of detecting a polymorphism by PCR, that is, a method for designing primers, in addition to the method for detecting a polymorphism in the present invention as described above. be able to.
  • any polymorphic regions between the varieties of hop DNA detected based on the above R APD method are included in the scope of the present invention.
  • any primer that can amplify a polymorphic region detected based on the above RAPD method can be used as the breed identification primer of the present invention.
  • the variety identification primer of the present invention developed based on the above method may be one kind of synthetic oligonucleotide or two or more kinds of synthetic oligonucleotides.
  • the predetermined length of the synthetic oligonucleotide is 6 to 40, preferably 10 to 21.
  • the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 14 in the sequence listing is Can be suitably used.
  • the second method of designing the variety identification primer of the present invention includes a method comprising the following steps.
  • the base of the amplified fragment obtained by the polymerase chain method using a variety identification primer for example, a primer capable of widening a polymorphic region detected based on the above-mentioned PAPD method, hereinafter referred to as a primary primer
  • a variety identification primer for example, a primer capable of widening a polymorphic region detected based on the above-mentioned PAPD method, hereinafter referred to as a primary primer
  • the sequence is determined and the polymorphic sequence is determined.
  • two types of sequences complementary to the sequences at predetermined intervals in the polymorphic sequence fragment so as to generate an amplified fragment having higher reproducibility and easier identification of the polymorphic sequence than the primary primer Set up a breed identification bramer:]
  • a suitable 11 ⁇ primer can be selected and set based on the polymorphic sequence and its surrounding sequence.
  • the above-mentioned primary primers include the salts shown in SEQ ID NOs: 1 to 14 in the sequence listing. Oligonucleotides containing the base sequence can be used.
  • one or both of the two primers can be designed so as to include all or a part of the polymorphic sequence.
  • varieties with the selected polymorphic sequence have complementary sequences, so that amplification of DNA occurs by PCR and a certain amount of amplified DNA is obtained.
  • Cultivars that do not have the polymorphic sequence do not have the sequence to be complemented, so that PCR does not produce amplified DNA. Therefore, in this case, it is possible to identify the variety based on the presence or absence of the amplified fragment.
  • two types of primers can be designed so as to be located in the upstream region and the Byone catchment region of the polymorphic sequence, respectively.
  • the amplified DNA force of the internal nucleotide sequence between varieties and, in some cases, different sizes is generated by the PCR.
  • the ability to directly fractionate the wide DNA generated by electrophoresis, or, if necessary, digestion with restriction enzymes followed by electrophoresis for fractionation or denaturing gradient gel or temperature gradient gel electrophoresis migration patterns, etc. Varieties can be identified.
  • the sequence of the third variety identification primer can be designed to have a sequence of the primary primer at the 5 'end, followed by 5 to 20 bases linked to the base sequence of the polymorphic region.
  • the type identification is performed using the type identification primer, it is useful, for example, on a platform where a polymorphic sequence exists at a position where the primary primer is complementary. That is, by adding 5 to 20 bases subsequent to the primary primer, the polymorphic sequence can be more specifically detected as compared to the primary primer. .
  • any primer other than the sequence having the ⁇ 2 characteristic can be used favorably as a hop variety primer.
  • a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 15 to 40 in the sequence listing or an oligonucleotide having the nucleotide sequence of a part thereof is appropriately used. Two types can be used in combination.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 15 (17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39) in the sequence listing is also used as a variety identification primer.
  • the site that anneals to DNA and the site where the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 16 (18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40) anneals to genomic DNA Synthetic oligonucleotides having a part of the base sequence of the genomic DNA existing in the above can also be used.
  • the primer is designed based on the determination of the region showing the polymorphism. It is possible.
  • the genetic varieties identification method of the present invention by comparing and analyzing differences in DNA sequences between varieties based on genetic methods, it is possible to ensure that the differences are not affected by the environment and the like collected. Hop varieties can be identified.
  • Figure 1 shows that in the second method for designing cultivar identification primers, a part of Hallertauer tradition (HT) and a part of Shinshu Sayo (SW) DNA was amplified using the primary primer (one type of primer: B72).
  • 4 is a photograph showing a fractionation pattern obtained by fractionating these amplified fragments by electrophoresis.
  • FIG. 2 is a diagram showing the nucleotide sequence of an amplified fragment migrated at about 600 bp indicated by an arrow in FIG. 1, in which the upper row shows the HT sequence and the lower row shows the SW nucleotide sequence. If the base at the position corresponding to the upper HT is the same, it is shown as a black dot ( ⁇ ). If there is a base substitution at the position corresponding to the base, that base is indicated. In addition, there is no corresponding base between the two, that is, the deletion site is indicated by a hyphen (1).
  • Figure 3 shows the results of electrophoresis of the amplified fragment when PCR was performed using the breed identification primer consisting of B72WF2 (SEQ ID NO: 27) and the complementary strand of B72WR2 (SEQ ID NO: 28) shown in Figure 2.
  • 4 is a photograph showing the result of fractionation.
  • FIG. 4 is a diagram showing the nucleotide sequence of another amplified polymorphic fragment (RAPD marker 1).
  • FIG. 5 is a diagram showing the nucleotide sequence of yet another amplified polymorphic fragment (RAPD marker).
  • the hop variety identification method of the present invention is to amplify a region having a different DNA sequence, that is, a polymorphic region between varieties by PCR using a variety identification primer, and to analyze a difference in size or presence or absence of an amplified fragment. This is a method for identifying a variety by using Collect Hop DN A
  • Hop DNA which is a sample, can be collected from a very small amount of hop leaves, cones, hop pellets, and the like.
  • Hop DNA is collected by a general method for recovering DNA from plant individuals, for example, by the usual extraction method described in Nucleic Acids Res., 8, 4321 (1980). Can be. More simply, extraction can be performed using a commercially available BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT (manufactured by QIAGEN). In the case of this KIT, after the cells are lysed, there is an operation of adsorbing and desorbing the DNA on the anion exchange resin column, so that the problem caused by the contamination with the reaction inhibitor can be solved.
  • First breed identification primer-A design method any method can be used as long as it is possible to search for an oligonucleotide capable of detecting the polymorphic region or sequence between varieties by PCR at a hop whose DNA sequence is unknown.
  • the RAPD method is used.
  • Primers used in the ordinary RAPD method can be obtained by, for example, an automatic DNA synthesizer using a phosphoramidite method or the like, and have a randomly designed sequence having a chain length of 6 to 40, preferably 10 to 21. is there.
  • nucleotide sequence disclosed by Williams et al. (Nucleic Acids Research. Vol. 18, p. 6531, 1990) can also be used, or a common primer manufactured by Vex or an Operon 10-mer Kits manufactured by OPER0N.
  • Commercially available synthetic oligonucleotides such as the above can also be used.
  • the primer groups prepared here perform PCR on multiple types of hop DNA under the same conditions as the “PCR reaction” described in detail below.
  • the amplified fragments generated by the PCR are fractionated on an appropriate electrophoresis gel, which will be described later, and the mobility of the amplified fragments among the varieties is compared.
  • a fragment in which the presence or absence or the size of the amplified fragment is different among the varieties is regarded as a polymorphic amplified fragment (RAPD marker), and the one or two kinds of primers that generate this polymorphic amplified fragment are Select from a group of primers to make a variety identification primer.
  • RAPD marker polymorphic amplified fragment
  • the breed identification primer selected in this manner includes synthetic oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 14 in the sequence listing. Naturally, the complementary sequences of these sequences should also be used. Can be. In addition, if any of the polymorphic sequences in the hop DNA can be amplified in the PCR reaction, the varieties of oligonucleotides that partially include the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 14 in the sequence listing are identified. It can also be used as a primer. Furthermore, depending on the PCR reaction conditions, it is also possible to use nucleotides having a base sequence similar to the base sequence of the preceding;] [! Synthetic oligonucleotide].
  • the product type identification primer designed by this method has a sufficient function in product type identification, as will be described in Examples described later.
  • the second breed identification primer design method is based on the first breed identification primer design method, in which the detected amplified polymorphic fragment (RAPD marker 1) is recovered according to a conventional method, the nucleotide sequence is determined, and the polymorphism is determined. Detect the sequence.
  • RAPD marker 1 amplified polymorphic fragment
  • a DNA amplification band showing a change in size when selected as the RAPD marker, the sequence is located on both sides of the insertion and Z or deletion site in the base sequence of the RAPD marker, and
  • an oligonucleotide having a sequence capable of obtaining a DNA having a size that can be easily compared by electrophoresis for changes in size due to insertion and Z or deletion is selected.
  • An example of such a variety identification primer is a combination of oligonucleotides described in SEQ ID NOs: 27 and 28 in the sequence listing.
  • the change in size in RAPD markers is a force ranging from 1 bp to several hundred bp '; more preferably from 10 bp to tens of bp for discrimination.
  • any sequence replacement that can be identified by restriction enzymes or the like without any change in size is sufficient.
  • the size change that is easy to distinguish in electrophoresis depends on the type and concentration of the gel, but as an empirical guide, the size change should be at least 10% of the total length. For example, if the inserted sequence is 20 bp, the total PCR amplification product will be 200 bp or less. Design primers so that Therefore, this variety identification primer was used.
  • the cultivar identification primer spans the sequence inside the insertion site and the Z or deletion site in the base sequence of the RAP marker. Oligonucleotides having a sequence at such positions can be selected. Therefore, PCR using this cultivar identification primer will yield amplified fragments in varieties with insertions and Z or deletions.
  • an oligonucleotide having an optimal sequence for the polymerase chain reaction is selected from the nucleotide sequence inside the RAPD marker as a primer.
  • a primer is the oligonucleotide described in SEQ ID NOs: 35 and 36 in the sequence listing.
  • a sequence consisting of the primary primer sequence at the 5 'end followed by 5 to 20 nucleotides of the base sequence of the RAPD marker is used. May be selected as the primer.
  • specificity can be improved by designing the primers as described above. Can be done.
  • the primers of SEQ ID NOS: 15 and 16 in the sequence listing have the sequence of SEQ ID NO: 12 at the 5 'end, and are sequences in which the subsequent nucleotide sequence (see FIG. 5) is linked.
  • the primer will be annealed in all varieties regardless of the presence or absence of the polymorphism, resulting in a PCR product; and the polymorphism cannot be detected.
  • restriction enzymes that can identify varieties in the base sequence of RAPD marker If there is a recognition site for the restriction enzyme, the PCR amplification product can be treated with a restriction enzyme for identification, so primers should be designed to obtain a PCR amplification product that retains the recognition site for the restriction enzyme.
  • a primer is an oligonucleotide described in SEQ ID NOS: 33 and 34 in the sequence listing.
  • the primer designed in this way can set the annealing temperature when performing PCR so that only the target residue (RAPD marker) is amplified, so that the DNA amplified band can be easily identified, Good reproducibility results ⁇
  • synthetic oligonucleotide is used.
  • the synthetic oligonucleotide used in the present invention can be obtained, for example, by a commercially available automatic DNA synthesizer using the phosphoramidite method or the like.
  • the total length of this total oligonucleotide is 15 to 40, preferably 20 to 30, and those having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 22 in the sequence listing can be suitably used.
  • hop DNA in addition to the above, in hop DNA, two types of base sequences shown in SEQ ID NOs: 15 to 40 in the sequence listing (for example, SEQ ID NOs: 15 and 16, SEQ ID NOs: 17 and 18,... SEQ ID NOs: 35 and 36, etc.) It is also possible to use a synthetic oligonucleotide that represents a part of the base sequence of the hop DNA sandwiched between positions where the synthetic oligonucleotide having the base sequence is complementary.
  • the variety identification primer designed in the second design method amplifies the polymorphic region based on the polymorphic wide fragment, that is, the sequence around the polymorphic sequence so as to enable appropriate variety identification, Since it is composed of a sequence suitable for PCR, it is possible to accurately perform breed identification by using the breed identification primer.
  • the polymorphic region of the hop DN is amplified by the PCR using the variety identification primer designed by the first or second design method.
  • the PCR reaction using the above-mentioned synthetic oligonucleotide as a primer is carried out according to the following method: denaturation step of type I DNA, annealing step of primer with type I DNA And a step of repeatedly carrying out a DNA replication cycle consisting of an extension step with DNA polymerase starting from a primer, as described, for example, in Saiki et al., Science 230, U50-1354, and the like.
  • the conditions for the above PCR reaction are as follows: Separate reaction tubes for each variety, and add one or two synthetic oligonucleotides, DNA polymerase, and four bases (dATP, dTTP, dCTP , dGTP), hop DNA and amplification buffer (approx. 1. OmM to about 4. OmM, preferably from about 1.5 mM to about 3. OmM) for each cultivar to be type I DNA.
  • the reaction solution is prepared by adding dani potassium, gelatin, bovine serum albumin, and a surfactant (containing Teen 20, NP-40, Triton X-100, etc. (all of which are trade names), dimethyl sulfoxide, etc.).
  • reaction tube containing the solution prepared here was placed on an arbitrary thermocycler or the like, and the above-mentioned DNA replication cycle was performed an appropriate number of times, for example, about 20 to about 50 times. Preferably, it is repeated about 25 to about 40 times.
  • the conditions of each reaction step of PCR can be performed, for example, as follows.
  • the denaturation step is usually carried out by heating at 90 ° C. to 95, preferably about 94 ° C. to 95 ° C., for about 1 minute to about 3 minutes, preferably for about 1 minute to about 2 minutes.
  • the primer annealing step is usually performed at 30 ° C to 50 ° C (: preferably at about 35 ° C to about 42 ° C for about 1 minute to about 3 minutes, preferably for about 1 minute to about 2 minutes, incubating with the primer.
  • the variety identification primer can be used singly or in combination of two or more.
  • the elongation step with DNA polymerase is carried out in the presence of a heat-resistant DNA polymerase, usually at about 70 ° C. to about 73 ° C., preferably at about 72 ° C. to about 73 ° C., for about 1 minute to about 4 minutes, preferably Perform for about 2 to 3 minutes.
  • a heat-resistant DNA polymerase usually at about 70 ° C. to about 73 ° C., preferably at about 72 ° C. to about 73 ° C., for about 1 minute to about 4 minutes, preferably Perform for about 2 to 3 minutes.
  • a commercially available thermostable DNA polymerase such as PEM1N ELMER's thermostable DNA polymerase can be used.
  • the desired amplified DNA can be obtained by repeating the above steps.
  • Means for analyzing amplified fragments The amplified DNA generated in the PCR reaction using the above-described cultivar identification primers is fractionated by electrophoresis, which is a method for fractionating normal DNA, and cultivars can be determined based on the fractionation pattern. .
  • polyacrylamide gel In electrophoresis, generally, when fractionating short DNA fragments of 1,000 base pairs or less, about 3% to about 20% polyacrylamide gel is fractionated, and longer DNA fragments are fractionated. For this purpose, about 0.2% to about 2% of agarose gel can be used to obtain a suitable fractionated pattern.
  • the buffers used for electrophoresis include Tris-phosphate (pH 7.5 to 8.0), Tris-acetic acid (pH 7.5 to 8.0), and Tris-borate (pH 7 5 to 8.3) and the like, and preferably a Tris-boric acid system. Also, EDTA and the like can be added as necessary.
  • the electrophoresis conditions include a force that varies depending on the size of the electrophoresis tank, for example, 50 to 300 V, 10 to 120 minutes, preferably 150 V, 30 minutes.
  • a size marker that swims simultaneously as a control for example, 100 Base -A commercially available product such as Pair Ladder (Pharmacia) can be used.
  • the amplified DNA can be visually detected by, for example, a phenanthridine-based dye such as ethidium ore, and a substance that interacts with the nucleic acid by a staining method.
  • a substance such as ethidium orifice having a final concentration of about 0.5 / zg Zm1 is added to the electrophoresis tank in advance, or the gel after the electrophoresis is subjected to about 0.5 ag / m1.
  • the migration pattern can be detected as a red band in which DNA is bound to ethidium.
  • the staining solution is added to the electrophoresis tank, the electrophoresis can be observed even during electrophoresis.
  • the method can be replaced with that method for analysis.
  • Breed identification Type identification is performed by comparative analysis of the fractionation pattern between types based on the fractionation pattern obtained above. This comparative analysis is performed, for example, based on the difference in the presence or absence or the size of the predetermined amplified DNA between the varieties.
  • the difference in the presence or absence of the width DNA indicates whether or not the primer used for PCR has a sequence that anneals (that is, the complementary sequence) in a specific variety, and the difference in the size of the amplified DNA. Indicates that some varieties have a polymorphic sequence such as a deleted or inserted sequence within the region amplified by PCR. In addition, in order to perform more accurate cultivar identification, not only the results of a single PCR but also the fractionation of amplified fragments when one or two different oligonucleotides are used as a varieties identification primer. It is desirable to analyze and collate the information.
  • the hop variety identification method of the present invention by performing the above-described series of operations, the variety can be identified accurately.
  • the variety identification method of the present invention can also be used for the purity test of the variety of hops used in hop products such as hop pellets.
  • the difference between the amplified DNA obtained from the standard hop and the amplified DNA obtained from the hop pellet is examined, and as a result, if the amplified DNA other than the amplified DNA obtained from the standard hop is detected, the hop pellet is included in other varieties. Can be determined to be present.
  • the amount of amplified DNA at that time is measured, for example, by the intensity of color development by the above-mentioned ethidium debut, to determine purity such as the degree of contamination of other varieties. be able to.
  • the accuracy of the purity test can be improved by using two or more of the synthetic oligonucleotides of the present invention in combination.
  • the oligonucleotide of the present invention is expected to be applicable to the identification of varieties of plants other than hops (for example, mulberry, ichiku, cherry, etc.).
  • the location where the base sequence is different is limited because it is the location where mutation in DNA is likely to occur.
  • the location encoding rDNA can be used to identify varieties of bacteria (Escherichia coli, lactic acid bacteria) and plants (rice, orange). Therefore, in the present invention, it is considered that the places where there are differences between closely related species can be applied to cultivar identification also in other plants.
  • the cultivar identification method of the present invention analyzes based on the polymorphism of the sequence between cultivars, and thus can accurately identify hop varieties without being affected by the environment. Further, the variety identification method of the present invention can be used not only for the purpose of identification of the variety but also for the purity of each hop in the product because it can measure the purity of the variety.
  • examples 1 to 12 show hop variety identification using a variety identification pooler designed by the first variety identification primer design method.
  • Hop breeds include Brewer, s Gold (hereinafter referred to as cultivar number 1), Northern Brewer (hereinafter referred to as cultivar number 2), Tettnangef (hereinafter referred to as cultivar number 3), Saazer (hereinafter referred to as cultivar number 4) ), Hersbrucker spaet (hereinafter referred to as cultivar number 5), Spalte ⁇ se! Ect, hereinafter referred to as cultivar number 6), Hallertauer tradition (hereinafter referred to as cultivar number 7), Shinshu early life (hereinafter, cultivar number 8) Furanoace (hereinafter referred to as cultivar number 9) was used.
  • the green leaf tissues (raw weight 1 g) of the above various hop varieties were finely chopped, and the tissue pieces were immersed in liquid nitrogen and frozen.
  • the frozen product was powdered in liquid nitrogen using a polytron, and 5 Omg of the obtained powder was added to a BLOOD AND CELL CULTURE marauder KIT (Q).
  • One unit of heat-resistant DNA polymerase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a primer, using 33 pmol of a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 and 2 (manufactured by Zoditech Inc.). And 20 nmoles of four bases (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) and 0.1 ⁇ g of genomic DNA of various hop varieties prepared in Example 1 were added. 50mM KC 1, 1. 5mM Mg C 1 9, in 0. l% Triton containing X-100 1 OmM Tr i s- HCl buffer (p H 8, 8), was subjected to polymerase chain reaction. The reaction volume was 301, and about 201 mineral oil was added to prevent evaporation of the reaction solution.
  • Each step in the above polymerase chain reaction was performed under the following conditions. First hold at 94 ° C for 3 minutes, then heat the denaturation step at 94 for 1 minute, incubate the primer at 35 ° C for 1 minute, and elongate with DNA polymerase for 2 minutes at 72 ° C. The cycle of treating with a DNA polymerase was performed 35 times, kept at 72 ° C for 10 minutes, and then stored at 4 ° C.
  • the amplified genomic DNA obtained by the above polymerase chain reaction was purified using a 5% polyacrylamide gel in a 10 mM Tris-borate buffer (pH 8.0) containing 2 mM EDTA. Electrophoresis was performed at 150 V for 30 minutes to separate. At this time, a 100 Base-Pair Ladder iPha ⁇ ia company was used as a size marker.
  • Example 2 The procedure was performed in the same manner as in Example 2 except that a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 was used as a primer, and the primer annealing step in the polymerase chain reaction was performed at 40 ° C. .
  • the results are shown in Table 1.
  • Example 2 The procedure was performed in the same manner as in Example 2 except that a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 or 8 was used as a primer. The results are shown in Table 1.
  • a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 was used as a primer, and the primer annealing step in the polymerase chain reaction was performed. The procedure was performed in the same manner as in Example 2 except that the procedure was performed at 40 ° C. The results are shown in Table 1. When a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 was used as a primer, two types of amplified genomic bands of about 9550 bp and about 1200 bp were detected. Varieties of hops were distinguished into three types.
  • Example 2 was carried out in the same manner as in Example 2 except that a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 was used as a primer, and the primer annealing step in the polymerase chain reaction was carried out at 38 ° C.
  • the results are shown in Table 2.
  • a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 was used as a primer
  • three types of primers about 65 bp, about 700 bp, and about 1200 bp, were used. Amplified genomic bands were detected, and hops of 9 varieties could be classified into 4 types based on the presence or absence of the band. (Below)
  • Example 2 The procedure was performed in the same manner as in Example 2 except that a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 was used as a primer, and that the primer annealing step in the polymerase chain reaction was performed at 38 C.
  • the results are shown in Table 2.
  • an amplified genomic band of about 1400 bp is detected, and hops of 9 varieties are classified into two types based on the presence or absence of the band. I was able to.
  • Example 2 was carried out in the same manner as in Example 2, except that a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 was used as a primer, and that the primer annealing step in the polymerase chain reaction was carried out at 38 ° C. Table 3 shows the results.
  • Example 2 was carried out in the same manner as in Example 2 except that a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 was used as a primer, and the primer annealing step in the polymerase chain reaction was performed at 38 ° C. Table 3 shows the results.
  • Hop pellets product of Sapporo Beer Co., Ltd., North Hop Agricultural Cooperative sold as variety 8 are ground in a mortar, and 20 mg of the obtained powder is used to obtain BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT ( About 5 g of genomic DNA was extracted using QIAGEN) according to the protocol.
  • BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT About 5 g of genomic DNA was extracted using QIAGEN
  • a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 was used as the primer 1 according to Example 2.
  • Examples 13 to 30 show hop variety identification using the variety identification pooler designed by the second type identification pooler design method.
  • HT Hallertauer tradition
  • SW Shinshu- ⁇ -raw
  • the green leaf tissue (fresh weight 1) of each of the above hop varieties was finely chopped, and the tissue pieces were immersed in liquid nitrogen and frozen.
  • the frozen product was powdered with a liquid nitrogen width using a polytron, and genomic DNA was extracted from 5 Omg of the obtained powder using BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT (manufactured by QIAGEN) according to the protocol. As a result, 10 to 20 g of genomic DNA of various hop varieties was finally obtained.
  • the primer used was 0.34 mm of primer B 72 (see FIG. 2). Furthermore, 0.25 units of Taq DNA polymerase (manufactured by Futtsubon Gene), four bases of 200 jtzM (dATP, dTTP, dCTP, and dGTP) and 17.5 ng prepared in Example 13 were prepared. It was added genomic DNA of various hop varieties, 5 OmM KC 1, 1. 5mM Mg C 1 2, 1 containing 0. l% Triton X-100 0 mM Tr is- HCl buffer (pH 8. 8) In a polymerase chain reaction was performed. The reaction was 11.
  • Each step in the above-mentioned remelase chain reaction was performed under the following conditions. First hold at 94 ° C for 1 minute, heat for 30 seconds at 94 ° C for denaturation step, incubate for 1 minute at 33 ° C for primer annealing step, and elongation step with DNA polymerase. The cycle of treating at 72 for 30 seconds was performed 35 times and kept at 72 eC for 1 minute.
  • the broad genomic DNA obtained by the above polymerase chain reaction was purified using a 5% polyacrylamide gel in 10 mM Tris-borate buffer (pH 8.0) containing 2 mM EDTA. Electrophoresis was performed at 1 50 V for 30 minutes to separate. At that time, as a size marker, a marker 9 manufactured by Futatsubon Gene was used. After completion of the electrophoresis, the gel was immersed in 0.5 g / m1 aqueous solution of ethidium gel for 10 minutes, and then irradiated with UV light of 254 nm in the dark to remove DNA and ethidium gel. The red band of the conjugate was detected. Figure 1 shows the obtained results.
  • the RAPD marker prepared in Example 14 was excised from the electrophoresis gel and The gel was eluted from the gel by applying a voltage in a tube.
  • each step in the above PCR was performed under the following conditions. After holding at 94 ° C for 1 minute, heat the denaturation step at 94 ° C for 30 seconds, incubate the primer at 60 ° C for 1 minute, and elongate with the thermostable DNA polymerase. The cycle of treating at 72 ° C for 30 seconds was performed 35 times.
  • the amplified genomic DNA obtained by the above PCR is 5% polyacrylamide. Separation was performed by electrophoresis using O gel in 150 OmM Tris-borate buffer (pH 8.0) containing 2 mM EDTA at 150 V for 30 minutes. At that time, as a size marker, a marker 9 manufactured by Nippon Gene Co., Ltd. was used.
  • Example 16 The procedure was carried out under the same conditions as in Example 16 using synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 15 and 16 as primers. Table 4 shows the obtained results.
  • Synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 17 and 18 were used as primers, and the primer annealing step in PCR was performed in 6 The procedure was performed in the same manner as in Example 16 except that the procedure was performed at 2 ° C.
  • synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 17 and 18 were used as the c- primers shown in Table 4, an amplified genomic band of about 260 bp was detected. Hops of 12 varieties could be distinguished into 2 types depending on the presence or absence of hops.
  • Example 19
  • Example 16 except that synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 19 and 20 were used as primers and that the annealing step of the primers in PCR was performed at 65 ° C. Carried out.
  • the synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 19 and 20 were used as the c primers shown in Table 4, the two types of primers, about 500 bp and about 550 bp, were used.
  • the ⁇ genomic band was detected, and hops of 12 varieties could be classified into two types depending on the presence or absence of the band.
  • Example 22 The procedure was performed in the same manner as in Example 16 using synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 23 and 24 as primers. The results are shown in Table 4. When a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 or 24 was used as a primer, an amplified genomic band of about 330 bp was detected. Hops could be classified into two types. Example 22
  • a synthetic primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 or 26 as a primer The same procedure as in Example 16 was carried out, except that the reaction solution 11 was subjected to PCR for 20 cycles under the same conditions as the previous PCR after using the oligonucleotide and performing PCR. The results are shown in Table 4.
  • Example 24 The procedure was performed in the same manner as in Example 16 except that synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 29 and 30 were used as primers, and the annealing step of the primers in PCR was performed at 57 ° C. The results are shown in Table 4. When a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 or 30 is used as a primer, an amplified genomic band of about 350 bp is detected, and the presence or absence of the band distinguishes 12 varieties of hops into two types. I was able to.
  • Example 24 When a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 or 30 is used as a primer, an amplified genomic band of about 350 bp is detected, and the presence or absence of the band distinguishes 12 varieties of hops into two types. I was able to.
  • Example 24 When a synthetic oligonucleotide
  • Example 16 except that synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 35 and 36 were used as primers and that the primer annealing step in PCR was performed at 58 ° C for 30 cycles. Was performed in the same manner as described above. The results are shown in Table 4.
  • a range of about 200 to 2000 bp was obtained. More than a dozen amplified genomic bands were detected, of which the approximately 500 bp band, for which the presence or absence of amplification was observed depending on the variety, was used as the RAPD marker. When the base sequence of this marker was examined, the results shown in FIG. 4 were obtained.
  • Example 14 As a result of performing PCR and electrophoresis in the same manner as in Example 14 using 33 picomoles of Vex common primer (C16; 5'-CGCCCTGCAGTA-3 ') as a primer, a range of about 200 to 2000 bp was obtained. More than a dozen amplified genomic bands were detected, and of these, the approximately 500 bp band that was observed for the presence or absence of amplification by the mouth species was used as the RAPD marker. When the base sequence of this marker was examined, the results shown in FIG. 5 were obtained.
  • Vex common primer C16; 5'-CGCCCTGCAGTA-3 '
  • amplified genomic bands of about 500 bp were observed in all varieties, and it could not be identified.
  • varieties of hops can be accurately and easily identified without being influenced by the environment and the like.
  • the method for identifying a genetic varieties of the present invention can also be effectively used for a purity test of a product using hops as a raw material. Therefore, the genetic variety identification method of the present invention can maintain or improve the quality of products containing hops through hop variety identification and the like.
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Description

明細書 ホップにおける遣伝学的品種識別方法 技術分野
本発明は、 ホップの品種識別方法、 特に遺伝子工学技術を利用した品種識別方 法に関する。 背景技術
ホップは、 ビールに独特な芳香と苦味を与えると共に、 過剰なタンパク質を沈 殿 ·分離きせたり、 雑菌の繁殖を抑える等の作用を有している。 しかし、 これら の作用の程度等は、主にホップの品種によって差異があるため、 一定の品質のビ ールの製造や新たなビールの開発にはホップの品種を識別した上で使用する必要 がある。
このホップの品種識別方法としては、 従来、 ホップの含有成分、 例えば苦味成 分 (afe/yS酸 cohumulone/humulone, colu ulone/iupulone) Λ 精油成分 (farne sene, caryophyl lene) 差異に基ついて fiつていた。
しかしながら、 上記の苦味成分や精油成分の差異による識別方法は、 各種成分 の測定に多大な労力を必要とする上に、 同一品種であっても収穫の地域や年度に より各種成分が大きく変動することから、 上記方法では正確な品種判定が行えな 力、つた。
—方、 近年の遺伝子工学の進歩により、 生物種によっては染色体等の配列の解 明が試みられ、 ここで解明された塩基配列に基づき、 生物種問または同一生物の 品種間での遺伝情報の差異、 すなわち、 DNA配列の多型から種の識別が行われ ようとしていている。 このような多型に基づく品種の識別は、 DNA配列β^が 環境的な影響を受けにくく変化すること力'台どないため、 確実なる識別を行 こ とができる。 そこで、 本発明は、 上記のような遣伝学的な手法を用いて、 正確かつ簡便なホ
、 プの品種識別方法を提供する { 発明の開示
本発明のホップの品種識別方法は、 品種間の D N A配列の違いすなわち多型に 基づき、 この多型を遺伝学的な手法で検出して識別する方法であり、詳細には、 被検体であるホップの DNAのうち品種間で多型を含む領域を品種識別ブラィマ 一を用いたポリメラ一ゼ連鎖反応 （以下、 P CRという） により増幅し、 この増 幅 D N Aを解析することにより品種を識別する。
上記の方法を達成するためには、 ホップにおける品種間の DN A配列上の多型 を知る必要がある。
この多型とは、 具体的には、 挿入、 欠失、 置換などに由来する配列上の編成の 違いを含み、 また、 多型に関与する配列の長さは 1 b pであってもよく、 または 数十 b p以上であってもよいが、 望ましくは数 b pから数十 b pである。
上記のような品種間の配列上の多型を検出する方法としては、 品種毎に染色体 DNAの対応する部分の配列を決定し、 ここで決定した配列を比較解析して、 多 型を検出することもできるが、 より簡便には、 Wil liamsら (Nucleic Acids Rese arch. 第 18巻， 第 6531頁、 1990年） により開発された RAPD (Random ampl if i ed polymorphic DNA) 法を利用することができる。
この R A P D法は、 配列が未知の D N A問の多型を P C Rを利 fflして検出する 方法である。 詳細には、 比較的短い 1 0塩基程度の合成ォリゴヌクレオチドから なる特異性の低 ^、プライマ一を複数種の対象 D N Aとそれぞれ混合して、 P C R を行う。 もしも、 ここで前記ホップの DNAの配列中に混合したプライマーと完 全にまたは部分的に相捕する配列がある場合には、 この完全または部分相柿配列 とァニールし、 プライマー同士に挟まれた領域が増幅される。 そして、 種問でこ のブライマ一同士に挟まれた領域の中に D N Λの挿入や欠失等の配列の差^があ る場台には、 種問で異なるサイズの P CR増幅断片が得られる。 また、 一方の品 種にはプライマーがァニールする配列があり、 他方には無い場合、 一方の品種の みに P C R増幅断片が得られる。 これを電気泳動等で分画することがで多型を検 出することができる。
—方、上記 R A P D法は、上記のように本発明における多型を検出する方法以 外にも、 P C Rにより多型を検出し得るプライマ一を選択する方法、 すなわち、 プライマー設計方法としても利用することができる。
従って、 上記 R A P D法に基づき検出されるホップ D N Aの品種間のいかなる 多型領域も本発明の対象に含まれる。 また、 上記 R A P D法に基づき検出される 多型領域を増幅し得るいかなるブライマ一も本発明の品種識別ブライマ一として 利用することができる。
上記方 ¾に基づき開発される本発明の品種識別プライマーは、 1種類の合成ォ リゴヌクレオチドであっても、 または 2種以上の合成オリゴヌクレオチドであつ てもよい。 また、 この合成オリゴヌクレオチドの所定の鎖長は 6〜4 0、 好まし くは 1 0〜 2 1であり、 具体的には、 配列表の配列番号 1〜 1 4に示した塩基配 列を有するものを好適に用いることができる。
本発明の品種識別プライマーを設計する第二番目の方法としては、 以下の工程 からなる方法が含まれる。
この設計方法は、 先ず、 品種識別プライマー （例えば先の P A P D法に基づき 検出される多型領域を增幅し得るプライマー、 以下一次プライマ一という） を用 いたポリメラーゼ連鎖方法により得られた増幅断片の塩基配列を決定するととも に多型配列を決定する。 最終的に、 この多型配列を一次プライマーより再現性良 くかつ識別し易いような増幅断片を生成し得るように前記多型配列断片内の所定 間隔離れた位置の配列とそれぞれ相補する 2種の品種識別ブラィマーを設：]十して 合成する。
すなわち、 上記方法は、 多型配列及びその周辺の配列に基づき好適な品 11^^ プライマーを選択して設 1-することができる。
また、 上記の一次ブライマ一としては、 配列表の配列番号 1〜 1 4に示した塩 基配列を含むォリゴヌクレオチドを使用することができる。
例えば、 第一の品種識別プライマーの配列としては、 2種のプライマーの一方 または両方を前記多型配列の全部又は一部を含むように設計することができる。 上記品種識别ブライマ一を用いて品種識別を行った場合、 選択された多型配列 を備えた品種では、 相補配列を有することから P C Rにより D N Aの増幅が起き て一定の増幅 D N Aが得られ、 一方当該多型配列を有していない品種では、 相捕 する配列を有していないため、 P C Rを行っても増幅 D N Aは生じないことにな る。 従って、 この場合には、 増幅断片の有無により品種を識別することが可能と なる。
第二の品種識別プライマーの配列として、 2種のプライマーが前記多型配列の 上流域と卞流域のそれぞれに位置するうよに設計することができる。
上記品種識別プライマーを用いて品種識別を行った場合、 P C Rにより品種間 で内部の塩基配列の、 場合によってはサイズの異なる増幅 D N A力〈生成される。 ここで生成された增幅 D N Aを直接電気泳動により分画する力、、 または必要に応 じて制限酵素で消化した後電気泳動により分画あるいは変性勾配ゲルや温度勾配 ゲル電気泳動の泳動パターン等により品種を識別することができる。
第三品種識別プライマーの配列としては、 5 '末端に一次プライマーの配列を 備え、 それに続いた該多型領域の塩基配列を 5〜2 0塩基連結した配列を有する ように設計することができる。
上記品種識別ブライマ一を用いて品種識別を行つた場合、 例えば一次ブラィマ 一が相補する位置に多型配列が存在する場台に有用である。 すなわち、 一次ブラ イマ一にさらにそれに続く塩基配列を 5〜 2 0塩基付加することにより、 一次プ ライマ一に比して、 より特異的に前記多型配列を検出することができるようにな る。
さらに、 上記設計方法により設計された品種識別プライマーであれば、 丄 Π2特 徵を有する配列以外のいかなるものも、 ホップの品種識 ίΐιΐブライマ一として好 に使用することができる。 前記方法により設計された品種識別プライマーとして、 具体的には配列表の配 列番号 15〜 40に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオチドまたはその —部の塩基配列を有するォリゴヌクレオチドを適当に 2種組み合わせて使用する ことができる。
また、上記配列以外にも品種識別プライマーとして、配列表の配列番号 15 (17, 19, 21, 23, 25， 27, 29， 31, 33, 35， 37, 39) に記載の塩基配列がゲノム DN Aにァニールする部位と配列番号 16 (18, 2 0, 22， 24， 26， 28， 30， 32, 34, 36， 38, 40) に記載の 塩基配列がゲノム DNAにァニールする部位の間に存在するゲノム DNAの塩基 配列の一部を有する合成ォリゴヌクレオチドを用いることもできる。
上記の Sり構成された第二の品種識別プライマーの設計方法によれば、 多型を 示す領域の配列決定に基づいて設計されるため、 より確実に品種識別可能なブラ ィマ一を提供すること力可能である。
以上の通り、 本発明の遺伝学的品種識別方法に従い、 品種間の DN A配列の違 いを遺伝学的手法に基づき比較解析することにより、 採取した環境等の影響に左 右されず確実にホップの品種を識別することができる。
以下に、 本発明の好適な実施の形態をより詳しく説明するが、 本発明はこれら により限定されるものではない。 図面の簡単な説明
図 1は、 第二の品種識別プライマー設計方法において、 一次プライマ一 （1種 類のプライマー： B 72) を用いて Hallertauer Tradition (HT) 及び信州早 生 （SW) の DNAの一部をそれぞれ増幅し、 これら増幅断片を電気泳動で分画 した分画パターンを示す写真である。
図 2は、 第 1図において矢印で示す約 600 b p付近に泳動された増幅断片の 塩基配列を示す図であり、 上段には HT、 下段には SWの塩基配列を示す。 なお 上段の HTと対応する位置の塩基が同一の場合には、 黒点 （·） として示し、 両 者の対応する位置に塩基置換がある場合にはその塩基を示す。 また、両者間で対 応する塩基がない、 すなわち、 欠失部位には、 ハイフン （一） として示す。
また、 B 72 WF 2として示す枠内には、 配列表の配列番号 27に示す品種識 別プライマーとして選択した配列を示す。 さらに、 B 72WR2で示す枠内の配 列は、 配列表の配列番号 28に示す品種識別プライマーの相補配列を示す。
図 3は、 図 2に示した B 72WF 2 (配列番号 27) と B 72WR2の相補鎖 (配列番号 28) とからなる品種識別プライ一を用いて PCRを行った際の増幅 断片を電気泳動より分画した結果を示す写真である。
図 4は、 別の多型増幅断片 （RAPDマーカ一） の塩基配列を示す図である。 図 5は、 さらに別の多型増幅断片 （RAPDマーカー） の塩基配列を示す図で あ 発明を実施するための最良な形態
本発明のホップの品種識別方法は、 品種識別ブライマ一を用いた P C Rにより、 品種間で D N A配列の異なる領域すなわち多型領域を増幅し、 増幅断片における サイズの差または有無の差を解析することにより品種を識別する方法である。 ホップ DN Aの採取
検体となるホップ DN Aは、 極少量のホップの葉、 毬果やホップペレツト等か ら、 採取することができる。
ホップ DN Aの採取方法は、 植物個体から DN Aを回収する一般的な方法、 例 えば Nucleic Acids Res. , 8, 4321 (1980)等に記載された通常の D Ν Α抽出方法に より行うことができる。 より簡便には、 市販の BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT (QIAGEN社製） を用いて抽出することもできる。 この KIT の場合、 細胞を溶解し た後、 陰イオン交換樹脂カラムに DNAを吸脱着する操作があるため、 反応阻害 物質等の混入による問題を解消することができる。
次に本発明に使用し得る品種識別プライマーの設計方法について説明する。 第一の品種識別ブライマ一設計方法 この設計方法は、 DN A配列が未知のホップにおいて、 品種間の多型領域また は配列を P C Rにより検出し得るォリゴヌクレオチドを探索できる方法であれば どのような方法を使用してもよいが、 好適には RAP D法を利用することである。 先ず、 RAPD法を行うために、 複数種のプライマーからなるプライマー群を 田竟ォる Λ
通常の RAPD法に用いるプライマーは、 例えばホスホアミダイド法などを用 いる D N A自動合成機によって得ることができ、 ランダムに設計された配列であ り、 その鎖長は 6〜40、 好ましくは 10〜21である。
また、 前記 Williamsらが開示した塩基配列 (Nucleic Acids Research. 第 18巻， 第 6531頁、 1990年） を利用することも、 また、 ベックス社製コモンプライマーや 0PER 0N社製 Operon 10-mer Ki t s等の市販されている合成オリゴヌクレオチドを 利用することもできる。
ここで用意したプライマ一群のうち 1種または 2種以上を用 L、て、 複数種のホ ップ DNAに対して、 後に詳述する 「PCR反応」 と同様の条件で PCRを行う。 次いで、 P C Rにより生成された増幅断片を後述する適当な電気泳動ゲル上で分 画して、 品種間の増幅断片の泳動度を比較する。 比較した結果、 品種間で増幅断 片の有無またはサイズに差異が見られる断片を多型増幅断片 （RAPDマーカー） とし、 この多型増幅断片を生じさせる前記 1種または 2種のプライマーを前記プ ライマ一群から選択して、 品種識別プライマ一とする。
このように選択された品種識別ブライマ一としては、 配列表の配列番号 1〜 1 4に示した塩基配列からなる合成ォリゴヌクレオチドがあり、 当然のことながら、 これら配列の相補配列も使用することができる。 また、 PCR反応において、 ホ ップ D N A中の任意の多型配列を增幅し得るものであれば、 配列表の配列番号 1 〜 14に示した塩基配列を一部に含むォリゴヌクレオチドを品種識別ブライマ一 として使用することもできる。 さらに、 PCRの反応条件によっては、 前；][!合成 ォリゴヌクレオチドの塩基配列と近似の塩基配列からなるヌクレオチドも使 JT]す ることができる。 この第一の設計方法に基づくことにより、 配列力 <未知のホップにおいて多型を 検出できる品種識別プライマーを簡便に設計することができる。 また、 この方法 で設計された品種識別プライマーは、 後述する実施例において示すが品種識別に おいて十分に機能を発揮する。
第二の品種識別ブライマ一設計方法
第二の品種識別ブライマ一設計方法は、 第一の品種識別プライマ一設計方法に おいて、 検出された多型増幅断片 （RAPDマーカ一） を常法に従い回収し塩基 配列を決定するとともに多型配列を検出する。
ここで決定された多型増幅断片内の配列から、 多型配列を含んだ増幅断片を生 成し得るような所定間隔離れた位置の配列を選択して、 ここで選択された配列に 基づき品 識別プライマーを設計する。
Π種識別プライマーの設計にあたっては、 通常 PCRに至適とされる （「PC
Rテクノロジ一」， Henry A. Er!ich 編， 宝酒造株式会社発行など） に記載され るようなプライマーを設計すれば良 L、。
具体的には、 DNA増幅バンドがサイズの変化を示すものを RAPDマーカー として選定した場合は、 R A P Dマーカーの塩基配列中の挿入および Zまたは欠 失部位の両側に位置する配列であり、 かつ遺伝子の挿入および Zまたは欠失によ るサイズの変化を電気泳動にお 、て比較し易いサイズの增幅ノ ンドが得られるよ うな配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして選択する。 このような 品種識別プライマーの 1例として、 配列表の配列番号 27, 28に記載のオリゴ ヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。
RAPDマ一カーにおけるサイズの変化は、 1 b p〜数百 b pに及ぶ力';、 識別 により好適には 10 b p〜数十 b pである。 また、 サイズ変化がなくても制限酵 素等で識別し得る配列置換があればよい。
電気泳動において識別しやすいサイズの変化は、 ゲルの種類や濃度によって異 なるが、 経験的な目安としては、 サイズの変化が全長の 1割以上あればよい。 例 えば、 挿入配列が 20 b pであれば、 P CR増幅産物の全畏は 200 b p以下に なるようにプライマーを設計する。 従って、 この品種識別プライマーを使用した
P C Rにより、 多型に基づくサイズ変ィ匕を見分けやすいような増幅断片が得られ 。
あるいは、 RAP Dマーカーが同様に品種間で増幅断片がサイズの変化を示す 場合、 品種識別プライマーは、 RAP Dマ一カーの塩基配列中の挿入部位の内部 の配列および Zまたは欠失部位をまたぐような位置の配列を有するォリゴヌクレ ォチドを選択することができる。 従って、 この品種識別プライマーを使用した P CRにより、 挿入および Zまたは欠失を持つ品種において増幅断片力く得られる。 また、 RAPDマーカーが品種によって特定の DNA増幅バンドの有無が見ら れる場合は、 RAP Dマーカー内部の塩基配列からポリメラーゼ連鎖反応に最適 な配列を #するオリゴヌクレオチドをプライマ一として選択する。 このようなプ ライマーの 1例として、配列表の配列番号 35， 36に記載のオリゴヌクレオチ ドが挙げられる。
さらに、 一次プライマーのァニールする場所のみに多型があることも予想され るため、 5 '末端に一次プライマーの配列を持ち、 それに続いた RAPDマーカ 一の塩基配列を 5〜20塩基連結した配列を有する合成ォリゴヌクレオチドをプ ライマーとして選択しても良い。 例えば、 RAPDマーカー内部の塩基配列を有 するプライマーを用いた際に、 全ての品種で同じサイズの P CR増幅産物が生じ た場合は、 上記のようにプライマーを設計することにより特異性を高めることが できる。 具体例としては、 配列表の配列番号 15及び 16のプライマ一は 5 '末 端に配列表の配列番号 12の配列を有し、 それに続く塩基配列 （図 5参照） を連 結した配列としている。 ただし、 連結すべき RAPDマーカー内部の塩基配列の 部分が短すぎると P C Rにおいて非特異的な増幅バンドが增えるため多型の検出 が不可能になる。 また、 逆に長過ぎると多型の有無にかかわらず全ての品種にお いてブライマ一がァニールして P C R産物力；生じてしまい、 多型の検出が不可能 になる。
また、 RAPDマーカ一の塩基配列中に品種識別が可能となるような制限酵素 の認識部位が存在する場合は、 P C R増幅産物を制限酵素で処理して識別するこ とも可能であるので、 制限酵素の認識部位を保持した P C R増幅産物が得られる ようにプライマーを設計すればよい。 このようなプライマ一の 1例として、 配列 表の配列番号 33， 34に記載のォリゴヌクレオチドが挙げられる。
このようにして設計されたプライマーは、 目的の遺^ (RAPDマーカー） のみが増幅するように P CRを行う際のァニーリング温度を設定できるため、 D NA増幅バンドの識別が容易で、 力、つ再現性の良い結果力 <得られる。
上記のようにして設計されたブライマ一を簡便に得るには、 合成ォリゴヌクレ ォチドを用いる。 本発明に用いる合成オリゴヌクレオチドは、 例えばホスホアミ ダイ ド法などを用レ、る市販の D N A自動合成機によって得ることができる。 この合 オリゴヌクレオチドの鑌長は 15~40、 好ましくは 20〜30であ り、 配列表の配列番号 1~22に示した塩基配列を有するものを好適に用いるこ とができる。
上記以外にも、 ホップ DNAにおいて、 配列表の配列番号 15〜40に示した 塩基配列のうちの二種類 （例えば配列番号 15と 16、 配列番号 17と 18、 … 配列番号 35と 36など） の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオチドが相補す る位置に挟まれた前記ホップ DN Aの塩基配列の一部を冇する合成オリゴヌクレ ォチドを用いることもできる。
上記の通り第二の設計方法において設計された品種識別プライマーは、 多型增 幅断片すなわち多型配列の周辺の配列に基づき、 適格な品種識別ができるように 多型領域を増幅し、 力、つ PCRに適当な配列から構成されているため、 当該品種 識別ブライマ一を用いることにより正確に品種識別を実行することができる。
P C R反応
次に、 上記第一または第二設計方法により設計された品種識別ブライマ一を用 い P C Rにより、 ホップ D N Λの多型領域の増幅を行う。
上記の合成ォリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた P CR反応は、 法 に従い、 铸型 DNAの変性工程、 プライマーと铸型 DNAとのアニーリング工程 およびプライマーを開始点とした DN Aポリメラーゼによる伸長工程からなる D NA複製サイクルを繰り返して行う工程より構成され、 例えば Saiki ら、 Scienc e,第 230 巻， U50- 1354 頁等に記載されている。
上記の P C R反応の諸条件としては、 各品種毎に反応チューブを別々にして、 この反応チューブに、 1種または 2種の合成オリゴヌクレオチド、 DNAポリメ ラーゼ、 4種類の塩基 (dATP, dTTP, dCTP, dGTP ) 、 铸型 D N Aとなる各品種のホ ップ DNA及び増幅用緩衝液 （約 1. OmMから約 4. OmM、 好ましくは約 1. 5mMから約 3. OmMの塩化マグネシウムや、 塩ィ匕カリウム、 ゼラチン、 牛血 清アルブミン、 界面活性剤 (T een 20, NP-40, Triton X- 100 など （いずれも商品 名） 、 ジメチルスルホキシド等を含有） を加えて、 反応液を調整する。 ここで調 整した反 ίΐΤ、液を含む反応チュ一ブを、 任意のサーモサイキユラ一等に設置して、 上記した DN A複製サイクルを適当な回数、 例えば、 約 20回から約 50回、 好 ましくは約 25回から約 40回、 繰り返して行う。
P C Rの各反応工程の条件としては、 例えば次のように行うことができる。 変性工程は、 通常 90°Cから 95 、 好ましくは約 94°Cから 95°Cで約 1分 間から約 3分間、 好ましくは約 1分間から約 2分間加熱することにより行う。 プライマーのアニーリング工程は、 通常 30°Cから 50° (：、 好ましくは約 35 °Cから約 42 °Cで約 1分間から約 3分間、 好ましくは約 1分間から約 2分間ブラ イマ一とインキュベートすることにより行う。 品種識別プライマーは、 適当に 1 種類で、 もしくは 2種以上組み合わせて用いることができる。
D N Aポリメラーゼによる伸長工程は、 耐熱性 D N Aポリメラーゼ処理存在下 で、 通常約 70°Cから約 73°C、 好ましくは約 72°Cから約 73°Cで、 約 1分間 から約 4分間、 好ましくは約 2分間から約 3分間行う。 この耐熱性 D N Aポリメ ラーゼとしては、 PEM1N ELMER社製の耐熱性 DN Aポリメラーゼ等の市販のもの を使用することができる。
上記の各工程を繰り返すことにより目的の増幅 D N Aを得ることができる。 増幅断片の解析手段 上記の品種識別プライマーを用いた P C R反応において生成された増幅 D N A は、 通常の DNAを分画する方法である電気泳動法によって分画され、 その分画 パターンに基づいて品種を判定することができる。
電気泳動法は、 一般には、 1 000塩基対以下の短い DN A断片を分画する場 合、 約 3%から約 20%のポリアクリルアミ ドゲルを、 それ以上の長い DNA断 片を分画するには、 約 0. 2%から約 2%のァガロースゲルを使用することによ り適当な分画バタ一ンを得ることができる。
また、 電気泳動に用いる緩衝液としては、 Tris- リン酸系 (pH7. 5〜8. 0) 、 Tris- 酢酸系 (p H 7. 5〜8. 0) 、 Tris- ホウ酸系 (pH 7. 5〜8. 3) 等が挙げられ、 好ましくは Tris- ホウ酸系である。 また、 必要に応じて ED T A等を 加することもできる。
泳動条件としては、 泳動槽のサイズにより異なる力 例えば 50~300 V、 1 0〜1 20分間、 好ましくは 1 50 V、 30分間であり、 対照として同時に泳 動するサイズマーカーとしては、 例えば 100 Base-Pair Ladder (Pharmacia社製） 等の市販のものを用いることができる。
増幅 DNAは、 例えばェチジゥムブ口マイ ド等のフエナントリジン系色素で、 かつ核酸と相互作用するような物質を用 L、る染色法によって、 視覚的に検出する ことができる。 該染色法は、 泳動槽に予め、 例えば最終濃度として約 0. 5 /z g Zm 1のェチジゥムブ口マイ ド等の物質を加えるか、 または、 泳動後のゲルを約 0. 5 a g/m 1のェチジゥ厶ブ口マイ ド水溶液に 1 0分から 60分程度漬ける。 ここで染色されたゲルに暗所で 254 nmまたは 366 nmの紫外線を照射する ことによって、 泳動パターンは、 DNAにェチジゥムブ口マイ ドが結合した赤色 バンドとして検出することができる。 もちろん、 泳動槽に前記染色液を添加した 場合、 泳動中でもこの泳動ノ、°タ一ンが観察することができる。
この電気泳動法以外にも、 前記増幅 D N Aの有無またはサイズ等を解析できる 手段があれば、 その方法に置換して解析することもできる。
品種識別 品種識別は、 上記において得られた分画パターンに基づき、 品種間での分画パ ターンの比較解析により実行する。 この比較解析は、 例えば、 品種間での所定の 増幅 D N Aの存在の有無の差またはサイズの差により行う。
增幅 D N Aの存在の有無の差は、 特定の品種において、 P C Rに使用したブラ イマ一がアニーリングする配列 （すなわち相補配列） を備えているか否かを示し ており、 また、 増幅 D N Aのサイズの差は、 品種によっては、 P C Rで増幅され る領域内に欠失または挿入配列等の多型配列力存在することを示している。 また、 より正確な品種識別を行うためには、 一回の P C Rの結果だけでなく、 異なる 1種または 2種のォリゴヌクレオチドを品種識別プライマ一として使用し た場合の増幅断片の分画バタ一ンを解析し照合することが望ましい。
上記以^にも、 P C Rにおけるアニーリング工程の温度、 反応用緩衝液中のマ グネシゥム濃度等の諸条件を変化させた場合の挙動を検討することにより、 品種 同定の精度、 品種間の識別能力を向上させることもできる。
本発明のホップの品種識別方法は、 上記した一連の操作を行うことにより、正 確に品種を識別することができる。
応用
本発明の品種識別方法は、 ホップペレツト等のホップ製品に用いられているホ ップの品種の純度検定にも利用することができる。
例えば、 標準ホップから得られる増幅 D N Aとホップペレツ 卜から得られる増 幅 D N Aとの差異を調べ、 その結果標準ホップから得られる増幅 D N A以外の增 幅 D N Aが検出された場合、 該ホップペレツトには他品種が混入していると判断 できる。
また、 他品種の混入が予想された場合、 その際の増幅 D N Aの量を、 例えば、 前記ェチジゥムブ口マイドによる発色の強度によって測定することにより、 他品 種の混入の程度等の純度を測定することができる。
なお、 この場合も本発明の合成ォリゴヌクレオチドを 2種以上併用することに より、 純度検査の精度を高めることができる。 なお、 本発明のオリゴヌクレオチドは、 ホップ以外の他の植物 （例えば桑、 い ちぢく、 桜等） の品種同定にも適用できること力《期待される。 近縁種において塩 基配列が異なる箇所は、 DNA中の変異の起こり易い箇所であるので、 限定され る。 例えば、 rDN Aをコードする場所は細菌 （大腸菌、 乳酸菌） や植物 （イネ、 オレンジ） の品種識別に利用できること力報告されている。 したがって、 本発明 において、 近縁種で差異のあつた箇所は他の植物においても品種同定にも適用で きるものと思われる。
以上の通り、 本発明の品種識別方法は、 品種間の配列の多型に基づいて解析す るものであるため、 環境的な影響を受けずに正確にホップの品種を識別すること ができる。 また、 本発明の品種識別方法は、 品種識別の目的だけでなく製品中の 各ホップの品種の純度をも測定することができるため、 純度検定にも利用するこ とができる。 実施例
まず、 第一の品種識別ブライマ一設計方法により設計された品種識別ブラィマ 一を用いたホップの品種識別を実施例 1から 12に示す。
実施例 1
ゲノム DNAの抽出
ホップ品種として、 Brewer, s Gold (以下、 品種番号 1と記す） 、 Northern Bre wer (以下、 品種番号 2と記す） 、 Tettnangef (以下、 品種番号 3と記す） 、 Saaz er (以下、 品種番号 4と記す） 、 Hersbrucker spaet ( 以下、 品種番号 5と記す） 、 Spalte〖 se!ect 以下、 品種番号 6と記す） 、 Hallertauer tradition (以下、 品種番号 7と記す） 、 信州早生 （以下、 品種番号 8と記す）、 フラノエース （以 下、 品種番号 9と記す） を用いた。
上記の各種ホップ品種の緑葉組織 （生重量 l g) を細かく切り刻んで、 該組織 片を液体窒素中に浸し、 凍結させた。 該凍結物をポリ トロンを用いて液体窒素中 で粉末状にした後、 得られた粉末 5 Omgを BLOOD AND CELL CULTURE 匪 KIT(Q
4 IAGE 社製） を用いて、 プロトコールに従いゲノム DN Aを抽出した。
その結果、 最終的に、 各種ホップ品種のゲノム DNAを 1 0〜20 ;u g得た。 実施例 2
プライマーとして 33ピコモルの配列番号 1および 2に記載の塩基配列を有す る合成ォリゴヌクレオチド （ザヮディ一 ·テクノロジ一社製委託製造物） を用い て 1ュニッ卜の耐熱性 DNAポリメラーゼ （和光純薬製） 、 20ナノモルの 4種 類の塩基 (dATP, dTTP, dCTP, dGTP ) および実施例 1で調製した 0. 1 μ gの各種 ホップ品種のゲノム DN Aを加えた。 50mM KC 1、 1. 5mM Mg C 1 9、 0. l%Triton X-100を含有する 1 OmM Tr i s-塩酸緩衝液 （p H 8, 8) 中で、 ポリメラーゼ連鎖反応を行った。 反応¾»は 30 1とし、 反応液の蒸発 を防ぐた ¾に約 20 1のミネラルオイルを添加した。
上記のポリメラーゼ連鎖反応における各工程は下記の条件で行った。 はじめに 94 °Cで 3分間保持した後、 変性工程は 94でで 1分問加熱し、 プライマーのァ ニーリングェ程は 35 で 1分間ィンキュペートし、 D N Aポリメラーゼによる 伸長工程は、 72°Cで 2分間耐熱性 DNAポリメラーゼ処理するサイクルを 35 回行い、 72°Cで 1 0分間保持後、 4 °Cで保存した。
上記のポリメラーゼ連鎖反応により得られた増幅ゲノム D N Aは、 5 %のポリ アクリルアミ ドゲルを用いて、 2 mM EDTAを含有する 1 0 OmM Tris- ホウ酸緩衝液 （p H 8. 0) 中で、 1 50V、 30分間電気泳動して分離した。 その際に、 サイズマーカーとしては 100 Base-Pair Ladde r iPha ΓΠΙ i a社製） を用 いた。
電気泳動終了後にゲルを 0. 5 μ g/ 1のェチジゥムプロマイド水溶波に 1 0分間浸漬してから暗所で 254 n mの紫外線をゲルに照射することによって、 DNAとェチジゥムブ口マイドの結合体の赤色バンドを検出した。 得られた^果- を第 1表に示した。
表から明らかなように、 プライマ一として配列番号 1および 2に記載の塩基配 列を有する合成ォリゴヌクレオチドを用いた塡台、 約52013 、 約5301〕 の 2種類の増幅ゲノムバンドが検出され、 そのバンドの有無により 9品種のホッ プを 2タイプに識別することができた。
表 1
Figure imgf000018_0001
実施例 3
プライマーとして配列番号 3および 4に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌ クレオチドを用い、 かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのァニーリン グ工程を 4 0 °Cで行ったこと以外は、 実施例 2と同様に実施した。 結果を第 1表 に示した。
プライマーとして配列番号 3および 4に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌ クレオチドを用いた場合、 約 7 5 0 b p、 約 8 5 0 b pの 2種類の増幅ゲノムバ ンドが検出され、 そのバンドの有無により 9品種のホップを 4タイプに識別する ことができた。
実施例 4
プライ 一として配列番号 5および 6に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌ クレオチドを用い、 かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのァニーリン グ工程を 4 0 °Cで行ったこと以外は、 実施例 2と同様に実施した。 結果を第 1表 に示した。
プライマ一として配列番号 5および 6に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌ クレオチドを用いた場合、 約 2 7 0 b pの増幅ゲノムバンドが検出され、 そのバ ンドの有無により 9品種のホップを 2タイプに識別することができた。
実施例 5
プライマーとして配列番号 7および 8に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌ クレオチドを用いこと以外は、 実施例 2と同様に実施した。 結果を第 1表に示し た。
プライマーとして配列番号 7および 8に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌ クレオチドを用いた場合、 約 3 7 0 b pの増幅ゲノムバンド力く検出され、 そのバ ンドの有無により 9品種のホップを 2タイプに識別することができた。
実施例 6
プライマーとして配列番号 9に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオチ ドを用い、 かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのァニ一リング工程を 4 0 °Cで行ったこと以外は、 実施例 2と同様に実施した。 結果を第 1表に示した。 プライマーとして配列番号 9に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオチ ドを用いた場合、 約 9 5 0 b p、約 1 2 0 0 b pの 2種類のの増幅ゲノムバンド が検出され、 そのバンドの有無により 9品種のホップを 3タイプに識別すること ができた。
実施例 7
プライマーとして配列番号 1 0に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオ チドを用い、 かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのァニーリング工程 を 3 8 °Cで行ったこと以外は、 実施例 2と同様に実施した。 結果を第 2表に示し プライマーとして配列番号 1 0に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオ チドを用いた場合、 約 6 5 0 b p、 約 7 0 0 b p、 約 1 2 0 0 b pの 3種類のの 増幅ゲノムバンドが検出され、 そのバンドの有無により 9品種のホップを 4タイ プに識別することができた。 （以下余白）
表 2
Figure imgf000021_0001
実施例 8
プライマーとして配列番号 1 1に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオ チドを用い、 かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのァニーリング工程 を 3 8 Cで行ったこと以外は、 実施例 2と同様に実施した。 結果を第 2表に示し た。
プライマーとして配列番号 1 1に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオ チドを用いた場合、 約 1 4 0 0 b pの増幅ゲノムバンドが検出され、 そのバンド の有無により 9品種のホップを 2タイプに識別することができた。
実施例 9
プライマーとして配列番号 1 2に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオ チドを用 、 かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのァニ一リング工程 を 3 8 °Cで行ったこと以外は、 実施例 2と同様に実施した。 結果を第 2表に示し た。
プライマーとして配列番号 1 2に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオ チドを用いた場合、 約 5 5 0 b p、 約 8 0 0 b pの 2種類のの增幅ゲノムバンド 力く検出され、 そのバンドの有無により 9品種のホップを 4タイプに識別すること ができた。
実施例 1 0
プライマーとして配列番号 1 3に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオ チドを用い、 かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのァニーリング工程 を 3 8 °Cで行ったこと以外は、 実施例 2と同様に実施した。 結果を第 3表に示し た。
プライマーとして配列番号 1 3に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオ チドを用いた場合、 約 5 0 0 b p、 6 4 0 b p、 6 5 0 b p、 1 4 0 0 b pの 4 種類の増幅ゲノムバンドが検出され、 そのバンドの有無により 9品種のホップを 5タイプに識別することができた。 （以下余白） 表 3
配列 号 13 14
増幅 DNA (bp) 500 R4Q 650 540
ッノ。。 ^'つ
1 o
2 〇 〇 o
〇 o
4 〇
5 〇 〇
6 〇 〇
7 〇 〇 〇
8 〇 〇 〇
9 〇 〇 〇
実施例 11
プライマーとして配列番号 14に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオ チドを用い、 かつポリメラ一ゼ連鎖反応におけるプライマ一のァニーリング工程 を 38°Cで行ったこと以外は、 実施例 2と同様に実施した。 結果を第 3表に示し た。
プライマーとして配列番号 14に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオ チドを用いた場合、 約 540 b pの増幅ゲノムバンドが検出され、 そのバンドの 有無により 9品種のホップを 2タイプに識別することができた。
実施例 12
品種番号 8の品種として販売されているホップペレツト （サッポロビール株式 会社委 f£¾手県北ホップ農業協同組合製） を乳鉢で粉砕し、 得られた粉末 20m gから、 BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT(QIAGEN社製） を用いて、 プロトコ一 ルに従いゲノム DN Aを約 5 g抽出した。 得られた DN Aを用いて、 プライマ 一として配列番号 1, 2に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオチドを用 い、 実施例 2に準じて実施した。
検出される増幅ゲノム D N Aと品種番号 8の標準ホップょり得た増幅ゲノム D N Aとの差異を調べ、 純度を検査した。
次に、 第二の品種識別ブラィマ一設計方法により設計された品種識別ブラィマ —を用いたホップの品種識別を実施例 13から 30に示す。
実施例 13
ゲノム DNAの抽出
ホップ品種として、 Hallertauer tradition (以下、 HTと記す） 、 信州- φ-生 (以下、 SWと記す） を用いた。
上記の各種ホップ品種の緑葉組織 （生重量 1 ) を細かく切り刻んで、 該組織 片を液体窒素中に浸し、 凍結させた。 該凍結物をポリ トロンを用いて液体窒素巾 で粉末状にした後、 得られた粉末 5 Omgを BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT(Q IAGEN社製） を用いて、 プロトコールに従いゲノム DNAを抽出した。 その結果、 最終的に、 各種ホップ品種のゲノム DNAを 1 0〜20 g得た。 実施例 14
RAPDマーカーの選択
プライマーとして 0. 34 ίίΜのプライマー B 72 (図 2参照） を用いた。 さらに、 0. 25ユニッ トの T a qDNAポリメラーゼ （二ツボンジーン社製） 、 200 jtzMの 4種類の各塩基 (dATP, dTTP, dCTP, dGTP ) および実施例 1 3で調 製した 1 7. 5 n gの各種ホップ品種のゲノム DNAを加えた、 5 OmM KC 1, 1. 5mM Mg C 12 , 0. l%Triton X-100 を含有する 1 0 mM Tr is- 塩酸緩衝液 （pH 8. 8) 中で、 ポリメラーゼ連鎖反応を行った。 反応 は 1 1とした。
上記の リメラーゼ連鎖反応における各工程は下記の条件で行った。 はじめに 94 °Cで 1分間保持した後、 変性工程は 94 °Cで 30秒間加熱し、 プライマーの ァニーリング工程は 33 °Cで 1分間インキュべ一トし、 DN Aポリメラーゼによ る伸長工程は、 72 で 30秒間処理するサイクルを 35回行い、 72eCで 1分 間保持した。
上記のポリメラーゼ連鎖反応により得られた增幅ゲノム D N Aは、 5 %のポリ アクリルアミ ドゲルを用いて、 2 mM EDTAを含有する 1 0 OmM Tris- ホウ酸緩衝液 （p H 8. 0) 中で、 1 50V, 30分間電気泳動して分離した。 その際に、 サイズマーカーとしては、 二ツボンジーン社製マーカー 9を用いた。 電気泳動終了後にゲルを 0. 5 g/m 1のェチジゥムブ口マイ ド水溶液に 1 0分間浸漬してから暗所で 2 54 nmの紫外線をゲルに照射することによって、 DNAとェチジゥムブ口マイ ドの結合体の赤色バンドを検出した。 得られた結果 を図 1に示した。
図 1から、 矢印で示した位置のバンドのサイズが H Tと S Wで異なることがわ 力、る。 この矢印で示した位置のバンドを RAP Dマーカーとした。
実施例 1 5
実施例 1 4で調製した RAPDマーカーを電気泳動ゲルから切り出し、 透析チ ユーブに入れて電圧をかけ、 ゲルから溶出させた。
得られた RAPDマーカーを 「PCRテクノロジー」 （Henry A. Erlich編， 宝 酒造株式会社発行） に記載の方法に準じて、 制限酵素 B g 1 Hや P s t Iの認識 配列を付加した。 この制限酵素認識配列を利用して pUCプラスミ ドへサブクロ 一二ングした後、 ダイデォキシ法によって塩基配列を決定し、 図 2に示した。 な お、 図中の ·は上段と同一の塩基を示し、 —は塩基の欠失を示す。 また、 下線部 はプライマ一 B 72の塩基配列であり、 □で囲んだ塩基配列は後記実施例 16で 参照した塩基配列を示す。
こうして各バンドのシーケンスを行った結果、 図 2に示したように、 SWにお いて 32 b pの塩基配列の挿入が観察された。
実施例 16
実施例 15で得られた RAP Dマーカ一のうち、 図 2に示した口で囲んだ塩基 配列 B 72 WF 2を参照して得られた配列表の配列番号 27記載の塩基配列およ び B 72 WR 2の相補的な配列から得られた配列表の配列番号 28記載の塩基配 列を有する合成ォリゴヌクレオチドを設計した （サヮディ一 ·テクノロジ一社に 製造を委託） 。
これら合成オリゴヌクレオチドをプライマーセットとして 0. 34 Mを用い、 0. 25ユニットの T a q DNAポリメラーゼ （二ツボンジーン社製） 、 200 /zMの 4種類の （dATP, dTTP, dCTP, dGTP)および実施例 13で調製した 17. 5 n gの各種ホップ品種のゲノム DNAを加えた 5 OmM KC i、 1. 5mM M gC l 2 、 0. l%Triton X-100を含有する 1 OmM Tr i s—塩酸緩衝液 （p H 8. 8) 中で P CRを行った。 反応液量は 10 Lとした。
上記の P C Rにおける各工程は下記の条件で行つた。 はじめに 94 °Cで 1分問 保持した後、 変性工程は 94 °Cで 30秒間加熱し、 プライマ一のアニーリングェ 程は 60 で 1分間ィンキュベ一トし、 耐熱性 D N Aポリメラーゼによる伸長ェ 程は、 72°Cで 30秒間処理するサイクルを 35回行った。
上記の P CRにより得られた増幅ゲノム DN Aは、 5%のポリアクリルアミ ド O ゲルを用いて、 2 mM EDTAを含有する 1 0 OmM Tris—ホウ酸緩衝液 (pH8. 0) 中で、 1 50V、 30分間電気泳動して分離した。 その際に、 サ ィズマーカーとしては二ツボンジーン社製マーカー 9を用いた。
電気泳動終了後にゲルを 0. 5 g Zm 1のェチジゥムプロマイド水溶液に 1 0分間浸漬してから喑所で 254 n mの紫外線をゲルに照射することによって、 DNAとェチジゥムブ口マイ ドの結合体の赤色バンドを検出した。 得られた結果 を図 3に示した。
また、 他の品種についても、 同様に実施し、 結果を図 3に示した。 他の品種と しては、 Fuggle (FU), Cascade (CC), Brewer' s Gold (BG), Northern Brewer ( D) , Tet tnanger (TE), Saazer (SA), Hersbrucker spaet (HE), Perle (PE), Spal ter select (SS ), フラノエース （FA) を用いた。
図から明らかなように、 挿入部位を含む 329 b pのフラグメント （矢印） の 増幅が、 BG, NB, TE， SW， FAにおいて観察された。 また、 挿入部位を 含まない 299 b pのフラグメントが全ての品種において観察された。 また、 6 00 b p、 700 b p、 7 1 0 b pの品種特異的なフラグメン卜の増幅が観察さ れた。 これらのフラグメントは識別しやすく、 再現性よく観察された。
実施例 1 7
プライマーとして配列番号 1 5および 1 6に記載の塩基配列を有する合成オリ ゴヌクレオチドを用い、 実施例 1 6と同様の条件で実施した。 得られた結果を第 4表に示す。
表から明らかなように、 プライマーとして配列番号 1 5および 1 6に記載の塩 基配列を有する合成ォリゴヌクレオチドを用いた場合は、 約 500 b pの增幅ゲ ノムバンドが検出され、 そのバンドの有無により 1 2品種のホップを 2タイプに 識別することができた。
実施例 1 8
プライマーとして配列番号 1 7および 1 8に記載の塩基配列を有する合成ォリ ゴヌクレオチドを用い、 かつ P CRにおけるプライマーのァニーリング工程を 6 2 °Cで行ったこと以外は、 実施例 1 6と同様に実施した。 結果を第 4表に示した c プライマーとして配列番号 1 7および 1 8に記載の塩基配列を有する合成オリ ゴヌクレオチドを用いた場合は、 約 2 6 0 b pの増幅ゲノムバンドが検出され、 そのバンドの有無により 1 2品種のホップを 2タイプに識別することができた。 実施例 1 9
プライマーとして配列番号 1 9および 2 0に記載の塩基配列を有する合成ォリ ゴヌクレオチドを用い、 かつ P C Rにおけるプライマーのァニーリング工程を 6 5 °Cで行ったこと以外は、 実施例 1 6と同様に実施した。 結果を第 4表に示した c プライマーとして配列番号 1 9および 2 0に記載の塩基配列を有する合成オリ ゴヌクレオチドを用いた場合は、 約 5 0 0 b pと約 5 5 0 b pの 2種類の增蝠ゲ ノムバンドが検出され、 そのバンドの有無により 1 2品種のホップを 2タイプに 識別することができた。
実施例 2 0
プライマーとして配列番号 2 1および 2 2に記載の塩基配列を有する合成オリ ゴヌクレオチドを用いたこと以外は、 実施例 1 6と同様に実施した。 結果を第 4 表に示した。
プライマーとして配列番号 2 1および 2 2に記載の塩基配列を有する合成オリ ゴヌクレオチドを用いた場台、 約 7 1 0 b pの増幅ゲノムバンドが検出され、 そ のバンドの有無により 1 2品種のホップを 2タイプに識別することができた。 実施例 2 1
プライマーとして配列番号 2 3および 2 4に記載の塩基配列を有する合成オリ ゴヌクレオチドを用い、 実施例 1 6と同様に実施した。 結果を第 4表に示した。 プライマ一として配列番号 2 3および 2 4に記載の塩基配列を有する合成ォリ ゴヌクレオチドを用いた場合は、 約 3 3 0 b pの増幅ゲノムバンドが検出され、 そのバンドの有無により 1 2品種のホップを 2タイプに識別することができた。 実施例 2 2
プライマーとして配列番号 2 5および 2 6に記載の塩基配列を有する合成オリ ゴヌクレオチドを用い、 かつ PCRを行った後、 さらに反応液 1 1を铸型 DN Aとして先の PCRと同じ条件で 20サイクル行ったこと以外は、 実施例 16と 同様に実施した。 結果を第 4表に示した。
プライマーとして配列番号 25および 26に記載の塩基配列を有する合成オリ ゴヌクレオチドを用いた場合は、 約 160bpと約 200 b pの 2種類の增幅ゲ ノムバンドが検出され、 そのバンドの有無により 12品種のホップを 2タイプに 識別することができた。
実施例 23
プライマーとして配列番号 29および 30に記載の塩基配列を有する合成オリ ゴヌクレオチドを用い、 かつ PCRにおけるプライマーのァニーリング工程を 5 7°Cで行ったこと以外は、 実施例 16と同様に実施した。 結果を第 4表に示した。 プライマーとして配列番号 29および 30に記載の塩基配列を有する合成オリ ゴヌクレオチドを用いた場合は、 約 350 b pの増幅ゲノムバンドが検出され、 そのバンドの有無により 12品種のホップを 2タイプに識別することができた。 実施例 24
プライマーとして配列番号 31および 32に記載の塩基配列を有する合成ォリ ゴヌクレオチドを用い、 かつ 2度の PC Rを行った後、 さらにこの反応液を制限 酵素 Nl a I I I (第一化学薬品株式会社製） にて処理したこと以外は、 実施例 22と同様に実施した。 結果を第 4表に示した。
プライマーとして配列番号 31および 32に記載の塩基配列を有する合成ォリ ゴヌクレオチドを用いた場合、 約 220bpと約 360 b pの 2種類の増幅ゲノ ムバンドが検出され、 そのバンドの有無により 12品種のホップを 4タイプに識 別することができた。
実施例 25
プライマーとして配列番号 33および 34に記載の塩 配列を有する合成ォリ ゴヌクレオチドを用い、 かつ PC Rにおけるプライマーのァニ一リング工程を 6 7°Cで行い、 さらにこの反応液を制限酵素 Ta Q I (ベーリンガーマンハイム社 製） にて処理したこと以外は、 実施例 1 6と同様に実施した。 結果を第 4表に示 した。
プライマーとして配列番号 3 3および 3 4に記載の塩基配列を有する合成ォリ ゴヌクレオチドを用いた場合、 約 2 2 0 b pと約 2 7 0 b pの 2種類の増幅ゲノ ムバンドが検出され、 そのバンドの有無により 1 2品種のホップを 3タイプに識 別することができた。
実施例 2 6
プライマーとして配列番号 3 5および 3 6に記載の塩基配列を有する合成ォリ ゴヌクレオチドを用い、 かつ P C Rにおけるプライマーのァニーリング工程を 5 8 °Cで 3 0サイクル行ったこと以外は、 実施例 1 6と同様に実施した。 結果を第 4表に示した。
プライマーとして配列番号 3 5および 3 6に記載の塩基配列を有する合成ォリ ゴヌクレオチドを用いた場合、 約 4 0 0 b pの増幅ゲノムバンドが検出され、 そ のバンドの有無により 1 2品種のホップを 2タイプに識別することができた。 実施例 2 7
プライマーとして 3 3ピコモルのベックス社製コモンプライマー （ A25 ; 5' -G GTCAGGCACCA-3' ) を用いて実施例 1 4と同様に P C R及び電気泳動を行った結果、 約 200 から 2000 b p に渡って十数本の増幅ゲノムバンドが検出され、 そのうち、 品種によって増幅の有無が観察された約 500 b pのバンドを R A P Dマーカーとし た。 このマーカ一の塩基配列を調べたところ図 4に示す結果が得られた。
図 4において四角で囲んだ配列 A及び Bで示した配列に基づく配列番号 1 9及 び 2 0、 図 4において下線 C及び Dにて示した配列に基づく 3 7及び 3 8の塩基 配列を有する合成ォリゴヌクレオチドを設計した。 これらプライマーの設計方法 は、 3 7及び 3 8は請求項の範囲 8の方法に相当し、 5及び 6は請求項の範囲 1 2の方法に相当する。
プライマーとして 1 9及び 2 0の場合はァニーリング工程を 65°Cで 35サイクル、 3 7及び 3 8の場合は 60' Cで 30サイクル行った以外は、 実施例 1 6と同様に実施 した結果、 プライマーとして 1 9及び 2 0を用いた場合は第 1表に示したような 5 0 0 b pと 5 5 O b pのバンド力く、 プライマーとして 3 7と 3 8を用いた場合 は 4 5 9 b pの増幅ゲノムバンドが観察され、 そのバンドの有無により 1 2品種 のホップを 2タイプに識別することができた。
実施例 2 8
プライマーとして 3 3ピコモルのベックス社製コモンプライマー （ C 16 ; 5' -C GCCCTGCAGTA-3' ) を用いて実施例 1 4と同様に P C R及び電気泳動を行った結果、 約 200 から 2000 b p に渡って十数本の増幅ゲノムバンドが検出され、 そのうち、 口種によって増幅の有無力観察された約 500 bpのバンドを R A P Dマーカーとし た。 このマーカ一の塩基配列を調べたところ図 5に示す結果が得られた。
図 5に ½いて四角で囲んだ A及び Bで示す配列をもとに配列番号 1 5及び 1 6、 図 5において下線 C及び Bにて示した配列をもとに 3 9及び 4 0の塩基配列を有 する合成ォリゴヌクレオチドを設計した。
プライマ一として、 3 9及び 4 0を用いて 60' Cで 35サイクル行った結果、 全て の品種において約 500 b pの増幅ゲノムバンドが観察され、 品種の識別はできなか
。十:が、 プライマーとして、 1 5及び 1 6を用いて同様に実施した結果、 第 4表 に示したような増幅ゲノムバンドが観察され、 そのバンドの有無により 1 1品種 のホップを 2タイプに識別することができた。
実施例 2 9
実施例 1 6 ~ 2 8において行ったタイプ分けをまとめた第 4表を総合的に評価 することにより、 1 2種類全てのホップ品種を識別することが可能となつた。 なお、 フラグメントサイズを記載したものは品種識別の基準となるもので、 制 限酵素処理したものは （ ） で示した。 （以下余白） 表 4
ブフィマーセッ ト フフグメノ卜サイズ Q
種
列番亏 (bp) FU CC BG N8 ΤΕ HE PE ss HT s FA
15/16 500 〇 〇 〇 〇
Π/18 260 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇
19/20 500 〇 〇 〇 〇 O 〇 〇
19/20 550 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇
21/22 710 〇 〇 -
23/24 330 〇 〇
25/26 200 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇
2D/26 160 〇 υ 〇 〇 〇
27/28 710 〇
27/28 700 〇
27/28 600 CD 〇 〇 〇
Li/ L< U 〇 〇
27/28 299 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇
29/30 350 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇
31/32 360 (NlaIII) 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇
31/32 220 (NlaIII) 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇
33/34 210 (Taql) 〇 〇 〇 〇 〇 〇
33/34 220 (Taql) 〇 〇 〇 〇 0 〇 〇 〇 〇
35/36 400 〇
37/38 459 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇
•39/40 500 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇
実施例 3 0
ホップ品種として信州早生 （ S W) のホップペレット （サッポロビール株式会 社委 f¾g手県北ホップ農業協同組合製） を乳鉢で粉砕し、 得られた粉末 2 0 m g から、 BLOOD AND CELL CULTURE DNA K IT (QIAGE 社製） を用いて、 プロトコール に従いゲノム D N Aを約 5 程度抽出した。 得られた D N Aを用いて、 プライ マーとして配列番号 1 5〜 4 0に記載の塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオチ ドを用い、 実施例 2 9に準じて純度を検査した。
この際に、 非特異的な増幅バンドの出現が少なく、 目的とするマーカーを容葛 に見極めることができた。 また、 再度の純度検定においても、 再現性の高い結果 が得られた。 産業上の利用性
本発明の遺伝学的品種識別方法によれば、 環境等の影響に左右されずにホップ の品種識別を正確かつ簡便に行うことができる。 また、 本発明の遣伝学的品種識 別方法は、 ホップを原料とする製品の純度検定にも有効に利用することができる。 従って、 本発明の遺伝学的品種識別方法は、 ホップの品種識別などを通じて、 ホップを含む製品における一定の品質の維持または品質の向上を図ることができ る。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 19 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
CTATTCTGGCTAGTTCTGC 配列番号'： 2
配列の長さ ： 19 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
CTATTTTGGCCAGTTTTGT 配列番号： 3
配列の長さ ： 20 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
AGCTGAGCAAGCTTCTTTGG 配列番号： 4
配列の長さ ： 2 0 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D NA 配列
CCCTTTATATACACTGCCGA
配列番号'： 5
配列の長さ ： 2 0 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D N A 配列
TAGCATCGGTAATCTCTCGC 配列番号： 6
配列の長さ ： 2 0 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D N A 配列
AACATGCTGGGCAACTCCCA 配列番号： 7
配列の長さ ： 20 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
GGAGACATCATCGAATCAGA
配列番号'： 8
配列の長さ ： 21 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
AACCAGAGCAGCCATGTTAGT 配列番号： 9
配列の長さ ： 10 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
CAATCGCCGT 配列番号： 10 配列の長さ ： 12 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
GCCAGCTGTACG 配列番号'： 11 配列の長さ ： 12 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
AGGTACGCCCGA 配列番号： 12 配列の長さ ： 12 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
CGCCCTGCAGTA 配列番号： 13
配列の長さ： 12 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
CCATCCGCACGA 配列番号'： 1
配列の長さ ： 12 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
GGTCAGGC/CCA 配列番号： 15
配列の長さ ： 24 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
CGCCCTGCAGTACCTTCCTGTAAG 配列番号： 1 6
配列の長さ ： 2 4
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D N A 配列
CGCCCTGCAGTAGAGCACTTCTAT
配列番号'： 1 7
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D N A 配列
CAATCGCCGTCTTGGTAGCGTA 配列番号： 1 8
配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D N A 配列
CAATCGCCGTTGAGAAAGTTAAGTA 配列番号： 19
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
GGTCAGGCACCATGTACTAGCTGGC 配列番号'： 20
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
GGTCAGGCACCAAGGCCACCATCTG 配列番号： 21
配列の長さ ： 26
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
GCCAGCTGTACGATGCCATGACCTTA 配列番号： 2 2
配列の長さ ： 2 4 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D N A 配列
GCCAGCTGTACGCCCCGGAAGGAA
配列番号 '： 2 3
配列の長さ ： 2 3 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D N A 配列
ACTCACCACGCAGAAACCCAGGC 配列番号： 2 4
配列の長さ ： 2 3 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D N A 配列
CCTCGACAAGTGAGATGTTGACC 配列番号： 25
配列の長さ ： 23 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DN A 配列
GCCACATTATCAAGGCAATACAC 配列番号： 26
配列の長さ ： 20 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
GGCATGACTCATGCCAGCTG 配列番号： 27 配列の長さ ： 22 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：台成 DNA 配列
GTCCCTCCTAGACACCTACATA 配列番号： 28 配列の長さ ： 21 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
GCTCCTGACAGCAAGGTAAGC 配列番号'： 29 配列の長さ ： 22 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
GAATACTGAGATTTTTATGAGG 配列番号： 30 配列の長さ ： 20 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
CAGGTCATGACTCATGCTAA 配列番号： 3 1
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A 配列
AAGGTGTTGCGGCCCTTAACAACTTCTT 配列番号 '： 3 2
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A 配列
AAGGTGTTGCGGAGAGTGTTCTAGAACA 配列番号 3 3
配列の長さ ： 2 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A 配列
ATCGAGCGAACGTATCAGCTGCG 配列番号： 34
配列の長さ ： 24 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
CCTTTCCGACGTCACTAATCGTGG 配列番号： 35
配列の長さ ： 24 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
TTAAATGACATGATCACCTCTCCC 配列番号： 36
配列の長さ ： 24 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
TAACACAGAGGTACCTCACTGTCT 配列番号： 3 7 配列の長さ ： 2 1 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D N A 配列
CTCCCACTGCACACCTATTTC
配列番号'： 3 8 配列の長さ ： 2 1 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D N A 配列
CACCATCTGAAGGAGGTCAAG
配列番号： 3 9 配列の長さ ： 2 0 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D M A 配列
CCTTCCTGTAAGGGTTTACA 配列番号： 40 配列の長さ ： 21 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA 配列
GAGCACTTCTATCATTTTTCG

Claims

請求の範囲
1 被検体であるホップの D N Aを、 品種間における塩基配列上の多型を含む 領域を増幅し得るように設計された品種識別ブライマ一を用いてポリメラーゼ連 鎖反応を行うことにより、 前記多型領域を増幅し、 増幅ひ N A断片を解析するこ とにより品種を識別する遺伝学的品種識別方法。
2 品種識別プライマーが、 1種または 2種以上の合成オリゴヌクレオチドか ら構成されることを特徴とする請求の範囲 1に記載の遣伝学的品種識別方法。
3 多型が、 1塩基以上の挿入、 欠失または置換などに由来する配列上の編成 の差によることを特徴とする請求の範囲 1に記載の遺伝学的品種識別方法。
4 解析が、 品種間における増幅 D N Aの有無、 長さ、 所定の制限酵素断片の 長さのうち少なくとも一つの比較に基づくことを特徵とする請求に範囲 1に記載 の遺伝学的品種識別方法。
5 品種識別プライマーが、 任意の合成オリゴヌクレオチドのうち、 ポリメラ ーゼ連鎖反応において品種間の多型を含む領域を増幅するものを選択して設計さ れていることを特徴とする請求の範囲 1に記載の遺伝学的品種識別方法。
6 品種識別プライマーが、配列表の配列番号 1 ~ 1 4のいずれかに記載の塩 基配列またはその相補配列を含むことを特徴とする請求の範囲 5に記載の遺伝学 的品種識別方法。
7 品種識別プライマーが、
( a ) 複数の品種のホップ D N Aを任意の一次プライマーを用いたポリメラー ゼ連鎖方法により増幅させるホップ D N A増幅工程、
(b) 増幅 D N Aのうち品種問で多型性を示す多型増幅断片を選択する多型增 幅断片選択工程、
( c ) 多型増幅断片において多型配列を決定する多型配列決定工程、
( d) 前記多型配列を含みかつ解析可能な長さの増幅断片を生成し^るように、 所定間隔離れた位置のホップ D N A配列のぞれぞれと相補し得る 2稲の品種識別 プライマーを合成する品種識別プライマー合成工程から設計されていることを特 徴とする請求の範囲 1に記載の遗伝学的品種識別方法。
8 2種の品 S ^別ブラィマーカ《前記多形増幅断片の内部の配列から構成され ることを特徴とする請求の範囲 7に記載の遺伝学的品種識別方法。
9 2種の品種識別ブライマ一力前記多形配列をまたぐように構成されること を特徴とする請求の範囲 7に記載の遺伝学的品種識別方法。
1 0 2種の品種識別プライマーのうち少なくとも一方に、 多型配列の一部ま たは全部力含まれていることを特徴とする請求の範囲 7に記載の遺伝学的品種識 別方法。
1 1 品種識別プライマーが P C Rに最適な配列から構成されることを特徴と する請求の範囲 7に記載の遺伝学的品種識別方法。
1 2 品種識別プライマ一のうち少なくとも一方の 5 '末端に一次プライマー の配列を含むことを特徴とする請求の範囲 7に記載の遺伝学的品種識別方法。 1 3 —次プライマーとして、 配列番号 1から 1 4に記載のうちのいずれか一 つまたは二つ以上を用いることを特徴とする請求の範囲 7に言己載の遺伝学的品種 識別方法。
1 4 前記一対の品種識別プライマーが、 配列表の配列番号 1 5 ~ 4 0及びこ れらの相補配列のうち ^、ずれか 2種の組み合わせからなることを特徵とする請求 の範囲 7に記載の遺伝学的品種識別方法。
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