WO1996034004A1 - Composes de sucre - Google Patents

Description

明 細 書

糖 化 合 物

技術分野

本発明は糖質研究の分野において有用な糖化合物、 該糖化合物の生産に有用な 糖分解酵素、 及び該糖化合物の製造に有用なフコイダノバクタ一 （Fucoidanobac ter)属細菌に関する。

背景技術

フコィダンは褐藻類に含まれる硫酸化多糖であり抗血液凝固作用、 脂血清澄作 用、 抗腫瘍作用、 癌転移抑制作用、 抗エイズウイルス感染作用等様々な生物活性 が報告されており、 医薬品として極めて有用な物質である。

しかしながら、 フコィダンは極めて分子量が大きな硫酸化多糖であり、 そのま ま医薬品として用いるには抗原性、 均一性、 抗凝血活性等の問題があるので、 フ コィダンをある程度分解することを必要とされることが多い。

そのため、 フコィダンの構造を解明し、 生物活性との関係を解明することが望 まれていたが、 フコィダンは分岐が多い高分子であり、 構成糖の種類も多く、 硫 酸基も様々な位置に結合しているため、 構造解析は非常に困難であった。 多糖の 構造解析には、 多糖を分解する酵素を作用させ、 生成するオリゴ糖の構造を解析 していく方法があるが、 現在報告されているフコィダン分解酵素の中で分解生成 物の糖鎖構造が判明しているものゃフコィダンォリゴ糖の標準品となるものは市 販品が無い。

上記のような理由で、 構造が判明した糖化合物、 該糖化合物の製造に有用な糖 分解酵素、 及び該糖化合物の製造に有用な微生物が求められていた。

本発明の目的は、 フコィダンの構造解析、 フコィダンの酵素分解物の同定、 及 び生物活性の検索に用いることができる糖化合物、 フコィダンの部分分解、 フコ イダンォリゴ糖の生産などフコィダンに関する研究に有用な新規なェンド（endo) 型のフコィダン分解酵素、 及び糖化合物の製造に有用な新規微生物を提供する とにある。

本発明を概説すれば、 本発明の第 1の発明は、 下記一般式 （ 1 ) 又は （2) ( 1)

(2)

[式中、 Xは H又は下記式 （3) ：

(3)

で表される基を示し、 Yは H又は下記式 （4) 、 若しくは （5)

(4)

(5)

で衣される基を示すが、 Xと Yが共に Hであることはない。 また、 Zは H又は下 記式 （6) ：

で表される基を示す] で表される化合物の少なくとも一つのアルコール性水酸基 が硫酸エステル化している糖化合物又はその塩に関する。

前記一般式 （ 1 ) 又は （2) で表される化合物の例としては、 下記の式 （7) 〜式 （ 1 5) で表される化合物が挙げられる。

(7)

(8)

(9)

0)

( 11 )

L

(ei )

( z\ )

080I0/96df/XDd

刚 OM ( 14)

( 15)

OH 本発明の第 2の発明は、 下記の理化学的性質を有することを特徴とするェンド 型フコィダン分解酵素に関する。

( I ) 作用 ： フコィダンに作用して、 少なくとも前記式 (7) 及び式 （8) で表 される化合物を遊離させる。 (II) 至適 P H ：本酵素の至適 pHは 6から 10である。

(III)至適温度：本酵素の至適温度は 30から 4 CTCである。

また本発明の第 3の発明は、 本発明の第 1の発明である糖化合物の製造に有用 な新規微生物である、 電子伝達鎖にメナキノンを有し、 GC含量が約 60%であ るフコイダノパクター属に属する細菌に関する。

本明細書に記載の式 （ 1 ) 、 （ 2 ) 、 （ 4 ) 〜 （ 15 ) 、 及び （ 17 ) 〜 （ 2 5 ) 中の 「〜」 は、 マンノース、 又はガラク卜一スに αァノマー、 /3ァノマーの 両ァノマーが存在することを意味する。

本発明者らは、 本発明の第 2の発明である酵素又は本発明の第 3の発明である 細菌の菌体抽出物又は培養液上清をフコィダンに作用させると、 本発明の糖化合 物が得られることを見出し、 本発明を完成させた。

図面の簡単な説明

図 1は糖化合物 （a) のビリジルー （2) —アミノ化糖化合物 （PA - a) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。

図 2は糖化合物 （b) のピリジルー （2) —アミノ化糖化合物 （PA— b) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。

図 3は糖化合物 （c) のピリジルー （2) -アミノ化糖化合物 （PA - c) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。

図 4は糖化合物 （d) のピリジルー （2) —アミノ化糖化合物 （PA— d) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。

図 5は糖化合物 （e) のピリジルー （2) —アミノ化糖化合物 （PA— e) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。

図 6は糖化合物 （f ) のピリジルー （2) —アミノ化糖化合物 （PA—: f ) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。

図 7は糖化合物 （g) のピリジルー （2) —アミノ化糖化合物 （PA— g) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。

図 8は糖化合物 （h) のピリジルー （2) -アミノ化糖化合物 (PA-h) を

L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。

図 9は糖化合物 （ i ) のビリジルー （2) —アミノ化糖化合物 （PA— i ) を

L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。

図 10は糖化合物 （a) のマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結果を 示す図である。

図 1 1は糖化合物 （b) のマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結果を 示す図である。

図 12は糖化合物 （c) のマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結果を 示す図である。

図 13は糖化合物 （d) のマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結果を 示す図である。

図 14は糖化合物 （e) のマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結果を 示す図である。

図 1 5は糖化合物 （ί ) のマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結果を 示す図である。

図 16は糖化合物 （g) のマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結果を 示す図である。

図 17は糖化合物 （h) のマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結果を 示す図である。

図 18は糖化合物 （ i ) のマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結果を 示す図である。

図 19は糖化合物 （a) のマスマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結 果を示す図である。 図 20は糖化合物 b) のマスマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結 果を示す図である。

図 2 1は糖化合物 c) のマスマス分析 （ネガティブ測定） により得られた 果を示す図である。

図 22は糖化合物 d) のマスマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結 果を示す図である。

図 23は糖化合物 e) のマスマス分析 （ネガティブ測定） により得られた糸 果を示す図である。

図 24は糖化合物 ) のマスマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結 果を示す図である。

図 25は糖化合物 g) のマスマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結 果を示す図である。

図 26は糖化合物 h) のマスマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結 果を示す図である。

図 27は糖化合物 ) のマスマス分析 （ネガティブ測定） により得られた結 果を示す図である。

図 28は糖化合物 a) の 'Η— NMRスぺクトルを表す図である, 図 29は糖化合物 b) の 'H— NMRスぺクトルを表す図である, 図 30は糖化合物 c) の 'H— NMRスぺクトルを表す図である, 図 3 1は糖化合物 d) の 'Η— NMRスぺクトルを表す図である, 図 32は糖化合物 e ) の 'Η— NMRスぺクトルを表す図である < 図 33は糖化合物 f ) の 'Η— NMRスぺクトルを表す図である < 図 34は糖化合物 g) の 'Η— NMRスぺクトルを表す図である, 図 35は糖化合物 h) の — NMRスぺクトルを表す図である < 図 36は糖化合物 i ) の 'Η— NMRスぺクトルを表す図である, 図 37は本発明の第 2の発明である酵素の pHと相対活性 (%) の関係を表す 図である。 ―

図 38は本発明の第 2の発明である酵素の反応温度 （で） と相対活性 （％) の 関係を表す図である。

図 39は本発明の第 2の発明である酵素を処理した PHと残存活性 （％) の関 係を表す図である。

図 40は本発明の第 2の発明である酵素の処理温度 （°C) と残存活性 （％) の 関係を表す図である。

図 41は糖化合物 （a) 〜 （ i ) を DE A E—セファロース FFにより分離し たときの溶出パターンを示す図である。

図 42は糖化合物 （h) 及び （ i ) を DEAE -セファロース FFにより分離 したときの溶出パターンを示す図である。

以下、 本発明に関して詳細に説明する。

本発明の第 2の発明に使用される菌株としてはフラボバクテリゥム （Flavobac terium) 属に属し、 本発明のエンド型フコィダン分解酵素生産能を有する菌株で あればいかなる菌株でも良い。 また、 該エンド型フコィダン分解酵素生産能を有 する菌株の具体例としては、 例えばフラボパクテリゥム 5.3 ー0082株が 挙げられる。 該菌株由来のェンド型フコィダン分解酵素をフコィダンに作用させ れば、 本発明の第 1の発明である糖化合物を得ることができる。

本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、 その菌 学的性質は次の通りである。

1. フラボパクテリゥム sp. SA-0082株

a. 形態的性質

( 1 ) 本菌は短かん菌である。

幅 0. 8 ~ 1. 0 μ m 長さ 1. 0〜 1. 2

(2) 胞子の有無 なし

(3) グラム染色性 陰性

b. 生理的性質

( 1 ) 生育の温度範囲

37で以下で生育できる。 好適な生育温度は 15〜28でである <

(2) 酸素に対する態度 好気性

(3) カタラーゼ 陽性

(4) ォキシダ一ゼ 陽性

(5) ゥレアーゼ 弱陽性

( 6 ) 酸の生成

D—グルコース 陽性

ラクトース 陽性

マル卜ース 陽性

D—マンニトール 陽性

スクロース 陰性

トレハロース 陰性

( 7 ) 加水分解

デンプン 陰性

ゼラチン 陽性

カゼイン 陰性

エスクリン 陽性

( 8 ) 硝酸塩の還元 陰性

(9) インドールの生成 陰性

( 10) 硫化水素の生成 陰性 ( 1 1 ) ミルクの凝固 陰性

( 1 2) ナ卜リウムの要求性 陽性

( 13) 塩類要求性

0%食塩培地での生育 陰性

1 %食塩培地での生育 P食性

海水培地での生育 陽性

( 14) キノン系 メナキノン 6

( 1 5) 菌体内 DNAの GC含量 32%

( 1 6) 0 F—テス卜 〇

( 1 7) 集落の色調 黄色系

( 18) 運動性 なし

9) 滑走性 なし

本菌株は、 バージ一ズ マニュアル ォブ システィマティック バクテリオ ロジー （Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) 、 第 1巻 （ 1984) 、 及びバージーズ マニュアル ォブ ディターミネイティブ バクテリォロジ ― (Bergey ' s Manual of Determinative Bacteriology)、 第 9巻 ( 1994) に 記載のフラボパクテリゥム アクアタイル （Flavobacterium aquatile)、 及びフ ラボ八'クテリゥム メニンゴセフ 'チカム (Flavobacterium meningosepticum) の 類縁細菌と考えられるが、 前者とはスクロースを資化して酸を形成しない点、 力 ゼインを分解できない点、 エスクリンを分解できる点、 ゼラチンを液化できる点 、 ゥレアーゼが陽性である点が異なり、 後者とはカゼインが分解できない点、 3 7 °Cでの生育が遅い点が異なる。 そこで本菌株をフラボバクテリゥムに属する細 菌と同定し、 フラボパクテリゥム sp. S A— 0◦ 82と命名した。

なお、 上記菌株は Flavobacterium sp. S A— 0082と表示され、 通商産業 省工業技術院生命工学工業技術研究所 [あて名； 曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) 〗 に F E R M B P - 5 4 0 2 (原寄託日：平成 7 年 3月 2 9曰、 国際寄託曰への移管請求曰：平成 8年 2月 1 5曰） として寄託さ れている。

本発明の第 2の発明に使用する菌株の培地に加える栄養源は使用する菌株が利 用し、 本発明の第 2の発明であるェンド型フコィダン分解酵素を生産するもので あればよく、 炭素源としては例えばフコィダン、 海藻粉末、 アルギン酸、 フコー ス、 グルコース、 マンニトール、 グリセロール、 サッカロース、 マルトース、 ラ ク卜ース、 デンプン等が利用でき、 窒素源としては、 酵母エキス、 ペプトン、 力 ザミノ酸、 コーンスティープリカ一、 肉エキス、 脱脂大豆、 硫安、 塩化アンモニ ゥム等が適当である。 その他にナトリウム塩、 リン酸塩、 カリウム塩、 マグネシ ゥム塩、 亜鉛塩等の無機質、 及び金属塩類を加えてもよい。

また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育す る。

本発明の第 2の発明であるェンド型フコィダン分解酵素の生産菌を培養するに 当り、 生産量は培養条件により変動するが、 一般に培養温度は、 1 5。C〜3 0 °C 、 培地の p Hは 5〜9がよく、 5〜7 2時間の通気かくはん培養で本発明のェン ド型フコィダン分解酵素の生産量は最高に達する。 培養条件は使用する菌株、 培 地組成等に応じ、 本発明のェンド型フコィダン分解酵素の生産量が最大になるよ うに設定するのは当然のことである。

本発明の第 2の発明であるエンド型フコィダン分解酵素は菌体中にも培養物上 清中にも存在する。

上記のフラボパクテリゥム sp. S A— 0 0 8 2株を適当な培地で培養し、 その 菌体を集め、 通常用いられる細胞破壊手段、 例えば、 超音波処理などで菌体を破 砕すると無細胞抽出液が得られる。

次いで、 この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得るこ とができる。 例えば、 塩析、 イオン交換カラムクロマ卜、 疎水結合カラムクロマ 卜、 ゲルろ過等により精製を行い、 他のフコィダン分解酵素を含まない純化され た本発明の第 2の発明であるエンド型フコィダン分解酵素を得ることができる。 また、 上述の培養液から菌体を除去した培養液上清中にも本酵素 （菌体外酵素 ) が大量に存在するので、 菌体内酵素と同様の精製手段により精製することがで きる。

本発明の第 2の発明であるェンド型フコィダン分解酵素の化学的及び理化学的 性質は次の通りであり、 菌体内酵素、 菌体外酵素は分子量以外は同一の性質を示 す。

( I ) 作用：フコィダンに作用して、 少なくとも前記式 (7) 及び式 (8) で表 される糖化合物を遊離させる。

(II) 至適 pH ：本酵素の至適 pHは 6から 10である （図 37) 。

すなわち図 37は、 本酵素の pHと相対活性の関係を表すグラフであり、 縦軸 は相対活性 （％) 、 横軸は PHを示す。

(III ) 至適温度：本酵素の至適温度は 30から 40でである （図 38) 。 すなわち図 38は、 本酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、 縱軸 は相対活性 （％) 、 横軸は温度 C) を示す。

(IV) 1安定性：本酵素は ^16〜1 1. 5の間で安定である （図 39) 。 すなわち図 39は、 本酵素を処理した PHと残存活性の関係を表すグラフであ り、 縦軸は残存活性 （％) 、 横軸は PHを示す。

(V) 温度安定性：本酵素は約 30°C以下で安定である （図 40) 。

すなわち図 40は、 本酵素を処理した温度と残存活性の関係を表すグラフであ り、 縦軸は残存活性 （％) 、 横軸は処理温度 (°C) を示す。

(VI) 分子量：本酵素の分子量を、 セフアクリル （Sephacryl) S— 200 (ファ ルマシア製） を用いたゲルろ過法により求めたところフラボパクテリゥム sp. S A - 0082株の菌体外酵素の場合は約 7万であり、 同菌体内酵素の場合は約 4 6万であった。

(VII ) 酵素活性の測定方法：

本発明の第 2の発明であるェンド型フコィダン分解酵素の酵素活性の測定は次 のようにして行った。

すなわち、 2. 5%のガゴメ昆布由来のフコィダン溶液 5 Ο μ 1と、 Ι Ο μ Ι の本発明の第 2の発明であるェンド型フコィダン分解酵素と、 60 μ 1の 667 mM塩化ナトリウムを含む 83 mMリン酸緩衝液 ρΗ 7. 5を混合し、 37で、 3時間反応させた後、 反応液 1 05 μ 1と水 2 m 1を混合かくはんし、 その 23 O nmにおける吸光度 （AT) を測定した。 対照として、 本発明の第 2の発明で あるェンド型フコィダン分解酵素の代りに、 本発明の酵素を溶解している上記緩 衝液のみを用いて同様の条件により反応させたもの及びフコィダン溶液の代りに 水のみを用いて反応を行ったものを用意し、 それぞれ同様に吸光度を測定した （ AB 1及び AB 2) 。

1単位の酵素は、 上記反応系において 1分間に 1 xmo 1のマンノースとゥロ ン酸の間のグリコシド結合を脱離的に切断する酵素量とする。 切断された結合の 定量は、 脱離反応の際に生じた不飽和ゥロン酸のミリモル分子吸光係数を 5. 5 として計算し行った。 なお、 酵素の活性は下記式により求めた。

(AT-AB 1 - A B 2 ) X 2. 1 05 X 1 20/5. 5 1 05 x 0. 0 1 X 1 80 = U/m 1

2. 1 05 :吸光度を測定するサンブルの液量 （m l )

1 20 :酵素反応液の液量 （ μ 1 )

5. 5 ：不飽和ゥロン酸の 230 nmにおけるミリモル分子吸光係数 (/mM) 1 05 :希釈に用いる反応液の液量 （μ 1 )

0. 0 1 :酵素液量 （m 1 ) 180 :反応時間 （分）

タンパク質の定量は、 酵素液の 280 n mの吸光度を測定することにより行つ た。 その際 1 mgZm 1のタンパク質溶液の吸光度を 1. 0として計算した。 本発明者らは、 以下に述べるごとく、 本発明の第 2の発明であるエンド型フコ ィダン分解酵素の作用機作を決定した。

( 1 ) ガゴメ昆布フコィダンの調製

乾燥ガゴメ昆布を自由粉砕機 M- 2型 （奈良機械製作所製） により粉碎し、 1 0倍量の 85%メタノール中で 70°C、 2時間処理後、 ろ過し、 残渣を 10倍量 のメタノ一ル中で 70 °C、 2時間処理し、 ろ過した。 残渣に 20倍量の水を加え 、 100°C、 3時間処理しろ過により抽出液を得た。 抽出液の塩濃度を 40 Om Mの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、 セチルピリジニゥムクロリドをこれ以 上沈殿が生じなくなるまで添加し、 遠心分離した。 その沈殿を、 エタノールで十 分洗浄し、 セチルビリジニゥムクロリドが完全に除去できたら、 限外ろ過器 （ろ 過膜の排除分子量 1 0万） （アミコン社製） により脱塩及び低分子除去を行い、 この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。 この上清を凍結乾燥して精製ガゴ メ昆布フコィダンを得た。 収率は、 乾燥ガゴメ昆布粉末重量に対して約 4%であ つた。

(2) エンド型フコィダン分解酵素によるフコィダンの分解及び分解物の精製 精製したガゴメ昆布由来のフコィダンに本発明の第 2の発明であるェンド型フ コィダン分解酵素を作用させ分解物の大量調製を行つた。

すなわち、 5%のガゴメ昆布由来のフコィダン溶液 60 Om 1と、 l OOmM のリン酸緩衝液 （P H8. 0) 750m lと 4 Mの塩化ナトリウム 150m lと 175 OmU/m 1の本発明のェンド型フコィダン分解酵素溶液 3. 43m 1を 混合し、 25°Cで 144時間反応させた。

反応液をポアサイズ 3500の透析膜を用いて透析し、 分子量 3500以下の 画分を集めた。 この画分をマイクロァシライザ一G 3 (旭化成社製） により脱 塩後、 DEAE—セファロース FFにより 9つの画分 （a) 、 （b) 、 （c) 、

(d) 、 （e) 、 ） 、 （g) 、 （h) 、 及び （ i ) に分画した。 その溶出パ ターンを図 41に示す。 横軸はフラクションナンバーを示し、 左の縦軸及び図中 の黒丸は、 フヱノール硫酸法による糖含量を 480 nmの吸光度で示し、 右の縱 拳由及び図中の白丸は、 不飽和グルクロン酸の含量を 235 nmの吸光度で示し、 最も右の縦軸及び図中の点線は、 溶出液中の酢酸アンモニゥム饞度 （M) を示す 。 各画分のフラクションナンバーは、 それぞれ （a) : 42〜43、 (b) ： 8 4〜91、 ( c ) : 51〜52、 (d) : 79、 (e) : 102〜103、 ( f ) : 62〜63、 (g) : 45、 (h) : 75、 及び （ i ) : 77であった。 画分 （h) 及び （ i ) については上記のフラクションナンバー 64〜78を集 め、 D E AE—セファロース F Fにより、 再精製を行った。 その溶出パターンを 図 42に示す。 横軸はフラクションナンバーを示し、 左の縦軸及び図中の黒丸は 、 フヱノール硫酸法による糖含量を 480 nmの吸光度で示し、 右の縱軸及び図 中の白丸は、 不飽和グルクロン酸の含量を 235 nmの吸 ¾ ^で示し、 最も右の 縱軸及び図中の点線は、 溶出液中の酢酸アンモニゥム濃度 (M) を示す。 各画分 のフラクションナンバーはそれぞれ （h) : 92〜96、 及び （丄） ： 99〜1 03であった。

( 3 ) 酵素反応生成物の構造解析

(ァ） 各画分の均一性の確認

上記の 9つの画分 （a) 、 （b) 、 （c) 、 （d) 、 （e) 、 ） 、 (g) 、 （ h) 、 及び （ i ) をそれぞれ一部だけ G 1 y c oTAG および G 1 y c o TAG Re a ge n t K i t (共に宝酒造社製） を用いて還元性末端を 2 一アミノビリジル化 （P A化） し、 各 PA化糖 （PA— a) 、 （PA— b) 、 ( P A-c) 、 （PA - d) 、 （PA - e) 、 (PA-f ) 、 （PA - g) 、 (P A— h) 、 及び （PA— i ) を得た。 （PA— a) 、 （PA— b) 、 (PA 一 c) 、 （PA - d) 、 （PA - e) 、 （PA— f) 、 （PA - g) 、 （PA - h) 、 及び （PA— i ) は HPLC分析によりそれぞれ均一であることが判明し た。

なお、 H PLCの条件は下記によった。

装置： L一 6200型 （日立製作所製）

カラム ： L一力ラム （4. 6 X 250 mm) ( (財） 化学薬品検査協会

}

溶離液：前記式 （7) 、 （8) 、 及び （9) [ (PA - a) 、 （PA - b) 、 及び （PA-c) 〕 の物質に対しては

5 OmM酢酸一卜リエチルァミン （ρΗ5· 5)

前記式 （ 10) 、 （ 12) 、 （ 13) 、 及び （ 15) ( (PA-d) 、 (PA- f ) , ( PA— g) 、 及び （PA— i ) 〕 の物質に対して は

10 OmM酢酸一卜リエチルァミン （PH5)

前記式 （ 1 1 ) [ (PA— e) 〕 の物質に対しては

0から 1 0分までは 20 OmM酢酸一卜リエチルァミン （ρΗ3· 8 ) 10から 60分までは 20 OmM酢酸一卜リエチルァミン （pH3 . 8) と 0. 5%のテトラヒドロフランを含む 20 OmM酢酸一トリ ェチルァミン （pH3. 8) の比率を 100 ： 0から 20 ： 80に直 線的に変化させた。

前記式 U 4) [ (PA-h) ] の物質に対しては

0から 60分まで 20 OmM酢酸一卜リエチルァミン （PH 3. 8) と 0. 5 %のテ卜ラヒドロフランを含む 20 OmM酢酸一卜リエチル ァミン （pH 3. 8) の比率を 80 ： 20から 50 ： 50に直線的に 変化させた。

検出：蛍光検出器 F - 1 1 50 (日立製作所製） にて励起波長 320nm、 蛍光波長 400 nmで検出。

流速： 1 m 1 Z分

カラム温度： 40°C

(ィ） 酵素反応生成物の還元末端糖及び中性糖組成の分析

また、 各 PA化糖 （PA— a) 、 （PA— b) 、 （PA— c) 、 (PA-d ) 、 （PA - e) 、 (P A- f ) , (PA - g) 、 （PA - h) 、 及び （PA - i ) を 4規定の塩酸、 1 00°C、 3時間処理により加水分解し、 HPLCにより 還元末端糖を調べた。

また、 この加水分解物をグラィコタツグ （宝酒造社製） 及びグラィコタツグ リージユン卜 キット （宝酒造社製） を用いて還元性末端を P A化し H PLCに より中性糖組成を調べた。 なお、 HP LCの条件は下記によった。

装置： L一 6200型 （日立製作所製）

カラム：パルパック夕イブ A (4. 6 mm x 1 5 Omm) (宝酒造社製） 溶離液： 70 OmMほう酸緩衝液 （pH 9. 0) ：ァセトニ卜リル =9 : 1 検出：蛍光検出器 F - 1 1 50 (日立製作所製） にて励起波長 3 1 0 nm、 蛍光波長 380 nmで検出。

流速： 0. 3m lノ分

カラム温度： 65。C

この結果、 （PA— a) 、 （PA-b) 、 （PA— c) 、 (PA-d) , ( PA— e) 、 （ΡΑ- ί ) 、 及び （PA— i ) の還元性末端糖はすべてマンノー スであった。 また中性糖組成としては （PA— a) 、 （PA— b) 、 (PA- c) , (PA— e) 、 （P A— f ) 、 及び （PA— i ) がマンノースとフコース を等モル含んでおり、 （PA— d) はマンノースとフコースの比率が 2 ： 1であ つた。

(PA— g) 及び （PA— h) の還元性末端糖は共にガラク卜ースであり、 そ の中性糖組成としては （PA-g) はガラク卜一スとフコースの比が 1 ： 2であ り、 （PA— h) はガラク卜一スとフコースの比が 2 ： 1であった。

また、 構成糖の一- 3であるマンノースの立体配置を調べるために F—キッ卜 グルコースノフルク卜ース及びホスホマンノースイソメラーゼ （共にベーリンガ 一マンハイムャマノウチ製） を用い、 説明書に従って D—マンノースのみを測定 できる反応系を構築し、 別に （a) 、 （b) 、 （c) 、 （d) 、 （e) 、 (f ) 、 及び （ i ) 各 l O O gを 2 Nの塩酸で 100で、 3時間加水分解後中和した ものをこの反応系で測定した。 この結果 （a) 、 （b) 、 （c) 、 （d) 、 ( e) 、 （f ) 、 及び （ i ) のすベてから D—マンノースが検出されたので、 （a ) 、 （b) 、 （c) 、 （d) 、 （e) 、 （f ) 、 及び （ i ) の構成糖のマンノー スはすべて D型と判明した。

(g) 及び （h) の構成糖の一つであるガラク卜ースの立体配置を調べるため に D型のガラクトースのみを検出できる F—キット 乳糖 Zガラク卜ース （ベー リンガーマンハイムャマノウチ製） を用いた。 すなわち、 （g) 及び （h) 各 1 00 μ gを 2 Nの塩酸で 100 ^eC、 3時間加水分解後中和したものをこのキッ 卜を用いて測定した。 この結果、 （g) 及び （h) からガラク卜ースが検出さ れたので （g) 及び （h) の構成糖のガラクトースはすべて D型と判明した。 さらにもう一種の構成糖であるフコースの立体配置を調べるために、 クリニ力 ルケミストリー （C I i n i c a 1 Chem i s t r y) 第 36巻、 第 474 一 476頁 （ 1990) に記載の方法に従って、 上記の （a) 、 （b) 、 (c) 、 (d) 、 （e) 、 （ί ) 、 （g) 、 （h) 及び （ i ) 各 100 Ltgを 2Nの塩 酸で 100°C、 3時間加水分解後中和したものをこの反応系で測定した。 本反 応系では D—フコースは検出されず L -フコースのみが検出できる。 この結果 (a) 、 （b) 、 （c) 、 （d) 、 （e) 、 （f ) 、 （g) 、 （h) 及び （ i ) から Lーフコースが検出された。

(ゥ） 酵素反応生成物の分子量の分析

次に、 （a) 、 （b) 、 （c) 、 （d) 、 （e) 、 け） 、 （g) 、 （h) 及 び （ i ) を AP I— III 質置分析器 （パーキンエルマ一 ·サイェクス社） を用い た質量分析に供したところ、 それらの分子量は、 それぞれ 564、 724、 1 1 28、 1 062、 1448、 644、 632、 1358、 及び 1288であった 。 （b) および （c) は 2価の陰イオンが主なシグナルを形成した。 （d) は 1 価のイオンとナ卜リウ厶がついた 1価のイオン及び 2価のイオンが検出された。

(e) はナトリウムイオンが 4個ついた 2価のイオン、 ナトリウムイオンが 3個 ついた 3価のイオン、 及びナ卜リゥムイオンが 1個ついた 4価のイオン等が検出 された。 （ f ) はナトリウムイオンが 2個ついた 1価のイオンが検出された。 （ g) は 1価のイオンとナ卜リゥムが結合した 1価のイオン及び 2価のイオンが検 出された。 （h) はナトリウムイオンが 4個、 3個、 2個、 及び 1個ついた、 そ れぞれ 1価、 2価、 3価、 及び 4価のイオン等が検出された。 （ i ) は硫酸基が 2個はずれてナ卜リゥムが 1個ついた 1価のイオン及び硫酸基が 2個取れた 2価 のイオンが検出された。

また、 ネガティブモードのマスマス （MSZMS) 分析により （a) は一価の 硫酸イオン （分子量 97) 、 不飽和へキスロン酸から水分子と水素イオンが取れ た一価イオン （分子量 1 57) 、 不飽和へキスロン酸から水素イオンがとれた一 価イオン （分子量 175) 、 フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素ィ オンが取れた一価イオン （分子量 225) 、 フコースと硫酸が結合したものから 水素イオンが取れた一価イオン （分子量 243) 、 不飽和へキスロン酸とマンノ ースが結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン （分子量 319 ) 、 フコースと硫酸とマンノースが結合したものから水素イオンが取れた一価ィ オン （分子量 405) が検出された。

同様にネガティブモードの MSZMS分析により （b) は一価の硫酸イオン （ 分子量 97) 、 不飽和へキスロン酸から水素イオンが取れた一価イオン （分子量 1 75) 、 フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン （ 分子量 243) 、 不飽和へキスロン酸とフコースとマンノースと硫酸が 2個結合 したものから水素イオンが 2個取れた 2価イオン （分子量 321 ) 、 フコースと 硫酸とマンノースが結合したものから水素ィォンが取れた一価ィォン （分子量 4 05) 、 不飽和へキスロン酸とマンノースと硫酸が結合したものから水素イオン が取れた一価イオン （分子量 417) が検出された。

また、 ネガティブモードの MSZMS分析により （c) は一価の硫酸イオン （ 分子量 97) 、 不飽和へキスロン酸から水素イオンが取れた一価イオン （分子量 1 75 ) 、 フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素ィォンが取れた一価 イオン （分子量 225) 、 フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れ た一価イオン （分子量 243) 、 マンノースとへキスロン酸とマンノースとフコ ースと硫酸が結合したものから水素ィォンが 2個取れた 2価イオン （分子量 37 1 ) 、 フコースと硫酸とマンノースが結合したものから水素イオンが取れた一価 イオン （分子量 405) 、 フコースと不 g包和へキスロン酸とマンノースとへキス ロン酸と硫酸が結合したものから水と水素ィォンが取れたー価ィォン （分子量 7 2 1 ) が検出された。

また、 ネガティブモードの MSZMS分析により （d) の 2価イオンから、 1 価の硫酸イオン （分子量 97) 、 不飽和へキスロン酸から水素イオン力取れた 1 価イオン （分子量 1 75) 、 フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素ィ オンが取れた 1価イオン （分子量 225) 、 フコースと硫酸が結合したものから 水素イオンが取れた 1価イオン （分子量 243) 、 フコースとマンノースと硫酸 基が結合したものから水素イオンが取れた 1価イオン （分子量 405) 、 (d) から硫酸基が 2個取れ、 水素イオンが 2個取れた 2価イオン （分子量 450) 、

(d) から硫酸基が 1個取れ、 水素イオンが 2個取れた 2価イオン （分子量 49 0) が検出された。

また、 ネガティブモードの MSZMS分析により （e) は一価の硫酸イオン （ 分子量 97) 、 フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた —価イオン （分子量 225) 、 フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが 取れた一価イオン （分子量 243) 、 フコースと 2分子の硫酸基とナトリウムィ オンが結合したものから水素イオンが 2個取れた一価イオン （分子量 345)、

(e) から 2個の硫酸基がとれ、 3個のナトリウムイオンがつき、 6個の水素ィ オンがとれた 3価イオン （分子量 450) 、 (e) から 1個の硫酸基と 6個の水 素イオンがとれ、 3個のナトリウムイオンがついた 3価イオン （分子量 476)

、 不飽和へキスロン酸とマンノースとフコースと硫酸が結合したものから水素ィ オンがとれた 1価イオン （分子量 563) 、 及び不飽和へキスロン酸とマンノー スとフコースと 3分子の硫酸が結合したものから水分子と水素ィォンがとれた 1 価イオン （分子量 705) が検出された。

また、 ネガティブモードの MS/MS分析により （f ) は、 一価の硫酸イオン (分子量 97 ) 、 フコースと硫酸が結合したものから水素ィォンが取れた一価ィ オン （分子量 243) 、 不飽和へキスロン酸とマンノースと硫酸とナトリウムが 結合したものから水と水素イオンが取れた一価イオン （分子量 421) が検出さ れた。

また、 ネガティブモードの MSZMS分析により （g) は、 フコースと硫酸と ガラク卜ースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン （分子量 405 ) 及び、 フコース 2分子とガラク卜ース 1分子と硫酸基 1分子が結合したものか ら水素イオンが取れた 1価イオン （分子量 551 ) が検出された。

また、 ネガティブモードの MSZMS分析により （h) に 3分子のナトリウム が結合し、 5分子の水素イオンが取れたものから、 1価の硫酸イオン （分子量 9 7) 、 フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価ィォ ン （分子量 225) 、 フコース 2分子とガラク卜ース 4分子と硫酸基 3分子が結 合したものから水素イオンが 1分子取れた一価イオン （分子量 1 197) が検出 された。

また、 ネガティブモードの MSZMS分析により （ i ) から硫酸基が 2個取れ た 2価イオンから、 1価の硫酸イオン （分子量 97) 、 フコースと 2分子の硫酸 とナトリウムが結合したものから水素ィォンが取れた 1価イオン （分子量 345 ) が検出された。

(ェ） 酵素反応生成物の糖組成の分析

上記質量分析の結果より （a) 、 （b) 、 （c) 、 （d) 、 （ί) 、 及び （i ) は分子内に不飽和へキスロン酸を含む可能性が極めて高いことが示唆された。 酵素反応生成物の分子内に不飽和結合のあるへキスロン酸が存在することを証 明するために以下の実験を行つた。 不飽和結合が分子内に存在すると 230〜 240 nmに強い吸収があることが知られている。 そこで、 精製した （a) 、 ( b) 、 （c) 、 （d) 、 （e) 、 (f ) , (g) 、 （h) 、 及び （ i ) の各オリ ゴ糖の水溶液の 230〜240 nmの吸光度を測定すると （a) 、 （b) 、 (c ) 、 （d) 、 （e) 、 （f ) 、 及び （ i ) の水溶液には強い吸収があり、 分子内 に不飽和結合があることが示唆された。 また、 本酵素によるフコィダンの分解 反応の進行と共に 230〜240 nmの吸光度が增加することも確認されたので 、 本酵素はフコィダン中のマンノースとへキスロン酸の間あるいは、 ガラクトー スとへキスロン酸の間のグリコシド結合を脱離反応により切断することが強く示 唆された。

酵素反応生成物のほとんどが非還元末端に不飽和へキスロン酸を持ち還元末端 がマンノースであることから調製したフコィダンの中にはへキスロン酸とマンノ 一スが交互に並んだ分子種が存在することが示唆された。

フコィダンの構成糖の多くはフコースであるためフコィダンは一般の多糖より 酸により分解され易い。 一方、 へキスロン酸やマンノースの結合は比較的酸に 強いことが知られている。 本発明者らはガゴメ昆布のフコィダンの分子内に存在 するへキスロン酸とマンノースが交互に結合している分子種中のへキスロン酸の 種類を明らかにするためにカーボハイドレー卜 リサーチ （Ca r bo hyd r a t e R e s e a r c h) 第 1 25巻、 第 283 - 290頁、 1 984年の方 法を参考にして、 まずフコィダンを 0. 3Mのシユウ酸に溶解し 1 00°C、 3時 間処理したものを分子量分画し、 分子量が 3000以上の画分を集め、 さらに陰 イオン交換樹脂により吸着分を集めた。 この物質を凍結乾燥後 4 Nの塩酸で酸 加水分解し、 P H8に調整後、 PA化し、 H PLCによりゥロン酸の分析を行つ た。 なお H PLCの条件は下記によった。

装置： L一 6200型 （日立製作所製）

カラム：パルパックタイプ N (4. 6mm x 250mm) (宝酒造社製） 溶離液： 20 OmM酢酸一卜リエチルァミン緩衝液 （pH7. 3) ：ァセ卜二 卜リル = 25 ： 75

検出：蛍光検出器 F - 1 1 50 (日立製作所製） にて励起波長 320 nm、 蛍 光波長 400 nmで検出。

流速： 0. 8 m 1 Z分

カラム温度： 40°C

なお、 P A化へキスロン酸の標準物質はグルクロン酸はシグマ社製、 ガラクッ 口ン酸は和光純薬社製、 ィズロン酸はシグマ社製の 4ーメチルゥンべリフヱリル a一 L—ィズロニドを加水分解したもの、 マンヌロン酸及びグルロン酸はァクタ •ケミカ 'スカンヂナヴイカ （A c t a Chem i c a S c and i na v i c aj 、 第 1 5巻、 第 1 397— 1 398頁、 1 96 1年記載の方法にしたが し、、 和光純薬製のアルギン酸を加水分解後陰イオン交換樹脂で分離したものを P A化することにより得た。 ―

この結果、 上記フコィダンの分子種中に含まれているへキスロン酸はグルクロ ン酸のみであることが判明した。

さらに上記分子種の加水分解物中のグルクロン酸を陰イオン交換樹脂により D 一マンノースと分離し凍結乾燥後その比旋光度を測定したところ右旋性でありグ ルク口ン酸は D—グルク口ン酸であることが判明した。

また、 ガゴメ昆布由来のフコィダンをあらかじめ本発明の第二の発明であるェ ンド型フコィダン分解酵素で処理したものについても上記と同様にシユウ酸で酸 加水分解したが、 D—グルクロン酸と D—マンノースが交互に結合したポリマー は検出されなかった。 このことから、 本発明の酵素が脱離反応により切断するフ コィダンの分子種の骨格構造は D—グルクロン酸と D—マンノースが交互に結合 した構造を持つことが判明した。

さらに、 D—グルクロン酸と D—マンノースのそれぞれの結合位置とグリコシ ド結合のァノメリック配置を調べるため、 シユウ酸分解により得られたポリマー を NMR分析した。

ポリマーの N MRの測定結果を以下に示す。 但し、 ¹ H— NMRでの化学シ フ卜値は卜リエチルァミンのメチル基のィ匕学シフト値を 1. 13ppmに、 ¹³C -NMRでは卜リエチルァミンのメチノレ基の化学シフト値を 9. 32 ppmとし て表した。

'H-NMR (D₂ 0)

δ 5. 25 ( 1 H, br - s, 1 - H) 、 4. 32 ( 1 H. d, J = 7. 6H z, 1 ' 一 H) 、 4. 00 ( 1 H, br-s, 2 - H) 、 3. 71 ( 1 H. m, 5' 一 H) 、 3. 69 ( 1 H. m, 5 - CHの H) 、 3. 68 ( 1 H. m, 3 - H) 、 3. 63 ( 1 H. m, 5— CHの H) 、 3. 63 ( 1 H, m. 4' -H) 、 3. 57 ( 1 H, m. 4一 H) 、 3. 54 ( 1 H, m, 3' — H) 、 3. 53 ( 1 H. m. 5 - H) 、 3. 25 ( 1 H. t, J = 8. 5 H z. 2' 一 H) I³C-NMR (D₂ 0)

5 175. 3 (5' 一 COOHの C) 、 102. 5 ( 1 ' 一 C) 、 99. 6 ( 1一 C) 、 78. 5 (2 - C) 、 77. 9 (4' 一 C) 、 77. 〇 (3' 一 C) 、 76. 7 (5' 一 C) 、 73. 9 (5 - C) 、 73. 7 (2' 一 C) 、 70. 6 (3 - C) 、 67. 4 (4-C) 、 61. 0 (5-CH₂ OHの C)

なお、 ビークの帰属の番号は下記式 （ 16) の通りである ：

( 16)

D—グルクロン酸の 1位の立体配置はそのビシナル結合定数が 7. 6 H zであ ることから 0— D—グルクロン酸であると決定した。

また、 マンノースの 1位の立体配置はその化学シフト値が 5. 25ppmであ ることから α— D—マンノースであると決定した。

構成糖の結合様式は¹ Η検出異種核検出法である HMBC法を用いて行った。

¹ Η— NMRの帰属には D QF— COS Υ法及び HOH AHA法を、 ¹³C— N MRの帰属にはHSQC法を用ぃた。

HMB Cスペクトルにより 1一 Hと 4' 一 Cの間及び 4' 一 Hと 1一 Cの間、 1 ' — Hと 2— Cの間及び 2— Hと 1 '一 Cの間にそれぞれクロスビークが認め られた。 このことから D—グルクロン酸は 3結合で D—マンノースの 2位に、 D -マンノースは α結合で ーグルクロン酸の 4位にそれぞれ結合していることが 明らかとなった。

(ォ） 酵素反応生成物の糖結合様式及び硫酸基の結合位置の分析

構成糖および硫酸基の結合様式を調べるために酵素反応生成物を 50 OMH ζ の核磁気共鳴装置 J ΝΜ— α 500型 （日本電子製） による NMRスぺク卜ル分 折に供した。 この分析結果より （a) は前記式 （7) 、 (b) は前記式 （8) 、 ( c ) は前記式 （ 9 ) 、 （ d ) は前記式 （ 10) 、 （ e ) は前記式 （ 1 1 ) 、 ( f ) は前記式 （ 12) 、 （ g ) は前記式 （ 13) 、 （ h ) は前記式 （ 14 ) 、 及 び （ i ) は前記式 （ 15) で表されるものであることが判明した、 すなわち （a ) は、 還元末端残基である D—マンノースに不飽和 D—グルクロン酸と、 硫酸基 が結合した Lーフコースが結合した構造を持つこと、 （b) は、 硫酸基が結合し た還元末端残基である D—マンノースに不飽和 D—ク'ルクロン酸と 2個の硫酸基 が結合した Lーフコースが結合した構造を持つこと、 （c) は、 還元末端残基で ある D—マンノースに D -グルクロン酸と、 硫酸基が結合した Lーフコ一スが結 合し、 その D—グルクロン酸に D—マンノースが結合し、 さらにその D—マンノ ースに不飽和 D—グルクロン酸と硫酸基が結合したしーフコースが結合した構造 を持つこと、 （d) は、 還元末端残基である D—マンノースに硫酸基と D—グル クロン酸と、 硫酸基が 2分子結合した L-フコースが結合し、 その D—グルクロ ン酸に、 D—マンノースが結合し、 さらにその D—マンノースに不飽和 D—グル クロン酸が結合した構造を持つこと、 （e) は、 還元末端残基である D—マンノ ースに硫酸基と D—グルクロン酸と、 硫酸基が 2分子結合した Lーフコースが結 合し、 その D—グルクロン酸に、 硫酸基が結合した D—マンノースが結合し、 さ らにその D—マンノースに、 硫酸基が 2分子結合した Lーフコースと不飽和 D- グルク口ン酸が結合した構造を持つこと、 （ f ) は、 δ巟酸基が結合した還元末端 残基である D—マンノースに不飽和 D—グルクロン酸と硫酸基が結合した Lーフ コースが結合した構造を持つこと、 （g) は、 還元末端残基である D—ガラク卜 ースに、 硫酸基が結合した L-フコースが結合し、 その L-フコースに、 硫酸基 が結合した Lーフコースが結合した構造を持つこと、 （h) は、 硫酸基が結合し た還元末端残基である D -ガラク卜ースを起点に 2本に分岐した構造を持ち、 一 方の糖鎖は、 D—ガラク卜ースに、 硫酸基が結合した Lーフコースが結合し、 そ の Lーフコースに、 硫酸基が結合した Lーフコースが結合しており、 他方の糖鎖 は、 硫酸基が結合した D—ガラク卜ースに、 硫酸基が結合した D—ガラク卜ース が結合した構造を持つこと、 （ i ) は、 還元末端残基である D—マンノースに硫 酸基と D—グルクロン酸と、 硫酸基が結合した Lーフコースが結合し、 その D— グルクロン酸に、 D—マンノースが結合し、 さらにその D-マンノースに、 硫酸 基が 2個結合した Lーフコースと不飽和 D -グルク口ン酸が結合した構造を持つ ことが判明した。

本発明の第 2の発明であるエンド型フコィダン分解酵素をフコィダンに作用さ せることにより、 本発明の第 1の発明である糖化合物に含まれる化合物を得た。 下記に、 本発明の第 1の発明の糖化合物の例である式 （7) 、 式 （8) 、 式 （ 9) 、 式 （ 10) 、 式 （ 1 1 ) 、 式 （ 12) 、 式 （ 13) 、 式 （ 14) 、 及び式 ( 1 5) で表される化合物、 すなわち （_a) 、 （b) 、 （c) 、 （d) 、 (e) 、 ） 、 （g) 、 （h) 、 及び （ i ) の物性を示す。

図 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 及び 9には各ピリジル （一 2—） ァミノ 化糖化合物 （PA - a) 、 (PA-b) , (PA - c) 、 （PA-d) 、 (PA 一 e) 、 (PA-f ) , (PA— g) 、 （PA— h) 、 及び （PA - i ) 、 の H PLCの溶出パターンを示し、 図において縦軸は相対蛍光強度、 横軸は保持時間 (分） を示す。 さらに図 10に （a) の、 図 1 1に （b) の、 図 12に （c) の、 図 1 3に （ d ) の、 図 14に （ e ) の、 図 15に （ f ) の、 図 16に （ g ) の、 図 1 7に （h) の、 図 18に （ i ) のマススぺクトルを示し、 図 19に （a ) の、 図 20に （ b ) の、 図 2 1に （ c ) の、 図 22に （ d ) の、 図 23に （ e ) の、 図 24に （f ) の、 図 25に （g) の、 図 2— 6に （h) の、 図 27に （ i ) のマスマスのスペクトルを示し、 各図において縦軸は相対強度 （％) 、 横軸は m/zi直を示す。

更に図 28は （a) の、 図 29は （b) の、 図 30は （c) の、 図 3 1は （d ) の、 図 32は （e ) の、 図 33は （f ) の、 図 34は （g) の、 図 35は （h ) の、 図 36は （ i ) の¹ H— NMRスペクトルを示し、 各図において縦軸はシ グナルの強度、 横軸は化学シフト値 （p pm) を示す。

なお、 ' H— NMRでの化竽シフト値は HODの化学シフト値を 4. 65 p p mとして表した。

( a) の物性

分子量 564

MS m/z 563 [M - H+ ] -

MS/MS mZz 97 [H S0₄ ] -、 1 57 [不飽和 D—グルクロン酸一 H₂ 0— H⁺ ] -、 1 75 [不飽和 D—グルクロン酸一 H⁺ ] - , 225 [L一 フコース硫酸一 H₂ 0— H⁺ ] -、 243 [Lーフコース硫酸一 H+ ] ' , 3 1 9 [不飽和 D—グルクロン酸と D—マンノースが結合したもの一 H₂ 0— H+ ] - 、 405 [M—不飽和 D—グルクロン酸一 H⁺ ] -、 483 [M-S0₃ -H

+ ] -

^!H-NMR (D₂ 0)

δ 5. 78 ( 1 H. d. J = 3. 7H z. 4" - H) 、 5. 26 ( 1 H. d, J = 1 . 2 H z. 1一 H) 、 5. 1 2 ( 1 H. d. J = 4. 0H z. 1 ' 一 H) 、 5. 03 ( 1 H. d. J = 6. 1 H z. 1 " 一 H) 、 4. 47 ( 1 H. d-d , J = 3. 4 , 1 0. 4 H z, 3' - H) 、 4. 2 1 ( 1 H. b r - s . 2 - H ) 、 4. 1 2 ( 1 H, m, 5' 一 H) 、 4. 1 0 ( 1 H. d-d. J = 3. 7, 5. 8Hz, 3" - H) 、 4. 03 ( ( 1 H. d, J = 3. 4 H z, 4' -H) 、 3. 86 ( 1 H. m. 3 - H) 、 3. 83 ( 1 H, d-d. J = 4. 0, 10 . 4 H z. 2 ' — H) 、 3. 72 ( 1 H. m. 4-H) 、 3. 72 ( 1 H, m. 5 - H) 、 3. 70 (2 H. m, 5 - CH₂ の H₂ ) 、 3. 65 ( 1 H, d-d . J = 5. 8. 6. 1 H z , 2" - H) 、 1. 08 (3 H. d, J = 6. 7 H z , 5' -CH₃ の H₃ )

糖組成 Lーフコース ：不飽和 D—グルクロン酸： D—マンノース = 1 : 1 : 1

(各 1分子）

硫酸基 1分子 （Lーフコースの 3位）

なお、 'Η— NMRにおけるビークの帰属の番号は下記式 （ 17) の通りであ る。

( 17)

(b) の物性

分子量 724

MS mZz 723 〔Μ— Η+ 〕 - 、 361 [Μ—2Η' MS/MS m/z 97 (HS0₄ ) - , 175 〔不飽和 D—グルクロン酸一 H⁺ 〕 - 、 243 [L一フコース硫酸一 H+ 〕 - 、 32 1 [M-S0₃ -2H + ] 2-、 405 [M—不飽和 D -グルクロン酸一 2 S 0₃ 一 H+ 〕 - 、 417 (M 一 Lーフコース一 2 S〇₃ - H* ) -

Ή-NMR (D₂ 〇）

δ 5. 66 ( 1 H. d. J = 3. 4 H z. 4" 一 H) 、 5. 27 ( 1 H, d. J = 7. 3 H z, ド ー H) 、 5. 25 ( 1 H. d, J = 1. 8Hz. 1 -H) 、 5. 2 1 ( 1 H. d. J = 3. 7 H z. 1 ' 一 H) 、 4. 50 ( 1 H, d, J =3. 1 H z . 4' _H) 、 4. 32 ( 1 H. q, J = 6. 7 H z. 5' -H) 、 4. 27 ( 1 H. d-d, J = 3. 7. 10. 4 H z, 2' 一 H) 、 4. 21

( 1 H. d-d. J = 3. 4. 6. 7 H z. 3" - H) 、 4. 18 ( ( 1 H. d 一 d, J = 1. 8, 1 1. 0 H z. 5— CHの H) 、 4. 15 ( 1 H, b r - s . 2 - H) 、 4. 10 ( 1 H, d-d. J = 5. 8. 1 1. 0Hz、 5 - CHの H) 、 3. 99 ( 1 H. d-d. J = 3. 1 , 10. 4Hz、 3' 一 H) 、 3. 90 ( 1 H. m. 5 - H) 、 3. 82 ( 1 H, m. 3 - H) 、 3. 82 ( 1 H, m. 4 - H) 、 3. 54 ( 1 H. b r - t . J = 7. 3 H z. 2" - H) 、 1.

1 1 ( 3 H. d , J = 6. 7 H z. 5' 一 CH₃ の H₃ )

糖組成 Lーフコース ：不飽和 D—グルクロン酸： D—マンノース = 1 : 1 : 1

(各 1分子）

硫酸基 3分子 （L—フコースの 2位と 4位及び D—マンノースの 6位） なお、 — NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式 ( 18) の通りであ る。 ( 18)

(c) の物性

分子量 1 1 28

MS m/z 1 1 27 [M-H+ 】 -

MS/MS mZz 97 〔HS0₄ ] - 、 175 [不飽和 D—へキスロン酸一 〕 - 、 225 [Lーフコース硫酸一 H₂ 0— H⁺ 〕 - 、 243 [L一フコー ス硫酸一 H+ 〕 ^_ 、 37 1 [M—不飽和 D—グルクロン酸一 Lーフコース一 S〇 ₃ — 2 H+ 〕 、 405 [硫酸化 L一フコースと D-マンノースが結合したもの 一 H+ 〕 - 、 72 1 〔M— D—マンノース一 L一フコース一 S0₃ — H₂ 0— H + ] -

Ή-NMR (D₂ 0)

55. 69 ( 1 H. d. J = 3. 7Hz, (4) " —H) 、 5. 34 ( 1 H. s , ( 1 ) 一 H) 、 5. 1 6 ( 1 H. s, 1一 H) 、 5. 1 0 ( 1 H. d. J = 4. 0Hz. ( 1 ) ' - H) 、 5. 05 ( 1 H. d, J = 3. 7Hz、 1 ' 一 H ) 、 4. 93 ( 1 H, d. J = 6. 4Hz. ( 1 ) " —H) 、 4. 50 ( 1 H. d— d. J = 3. 4， 1 0. 7 Hz、 3' 一 H) 、 4. 47 ( 1 H. d-d. J = 3. 4. 1 0. 4 H z , (3) ' — H) 、 4. 39 ( 1 H, d. J = 7. 9H z. 1 " - H) 、 4. 33 ( 1 H. br-s. (2) — H) 、 4. 14 ( 1 H. m. 2 - H) 、 4. 1 2 ( 1 H. m, (3) " -H) , 4. 12 ( 1 H, m, 5 ' — H) 、 4. 12 ( 1 H. m. (5) ' 一 H) 、 4. 04 ( 1 H. m, 4' - H) 、 4. 03 ( 1 H. m. (4) ' 一 H) 、 3. 85 ( 1 H. m, 2' - H) 、 3. 85 ( l H. m. (2) ' - H) 、 3. 82 ( 1 H. m. 3 - H) 、 3. 82 ( 1 H, m. (3) -H) 、 3. 73 ( 1 H. m. 4 - H) 、 3. 73 ( 1 H. m, 5 - H) 、 3. 73 ( 1 H, m. (4) 一 H) 、 3. 70 (2 H, m. 5 -CH₂ の H₂ ) 、 3. 70 (2 H, m， (5) 一 CH₂ の H₂ ) 、 3. 67 ( 1 H. m. 5" - H) 、 3. 62 ( 1 H, m. 4" - H) 、 3. 62 ( 1 H, m. (2) " -H) , 3. 62 ( 1 H. m. (5) - H) 、 3. 51 ( 1 H. t , J = 8. 9 H z, 3 " - H) 、 3. 28 ( 1 H. t , J = 7. 9 H z . 2" - H) 、 1. 09 ( 3 H, d, J = 6. 7 H z. (5) ' 一 CH₃ の H₃ ) 、 1. 07 ( 1 H. d . J = 6. 7 H z. 5' 一 CH₃ の H₃ )

糖組成 Lーフコース：不飽和 D-グルクロン酸： D—グルクロン酸： D—マン ノース =2 : 1 : 1 : 2 (Lーフコースと D—マンノース各 2分子と不 飽和 D—グルクロン酸と D—グルク口ン酸各 1分子）

硫酸基 2分子 （各 Lーフコースの 3位）

なお、 'Η— NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式 （ 19) の通りであ る。 ( 19)

(d) の物性

分子量 1 062

MS /z 1 06 1 [M - H⁺ ] -

US/US m/z 97 [HS0₄ ] -、 175 [不飽和へキスロン酸一 H ⁺ ] "、 225 [L-フコース硫酸- H₂ 0— H+ ] -、 243 [L一フコース硫 酸- H+ ] — 、 405 [Lーフコースと D—マンノースと硫酸基が結合したもの - H* ] -、 450 [M- 2 S 0₃ -2 H* ] ² 490 [M- S 0₃ 一 2H + 3² -

¹ H-NMR (D₂ 0)

δ 5. 67 ( 1 H. d, J = 3. 7Hz, (4) " —H) 、 5. 32 ( 1 H, b r - s , ( 1 ) 一 H) 、 5. 1 7 ( 1 H, d. J = 3. 5Hz. 1 ' 一 H) 、 5. 1 7 ( 1 H, b r - s . 1一 H) 、 4. 93 ( 1 H. d, J = 6. 4Hz, ( 1 ) " -H) , 4. 7 1 ( 1 H, m. ： T 一 H) 、 4. 53 ( 1 H. d . J = 3. 4 H z. 4' 一 H) 、 4. 33 ( 1 H. q. J = 6. 7Hz. 5' 一 H) 、 4. 28 ( 1 H, d-d. J = 3. 5， 1 1. OH z. 2' 一 H) 、 4. 18 ( 1 H. m. 5 - CH₂ の H) 、 4. 13 ( 1 H, m, (2) 一 H) 、 4. 12 ( 1 H, m, (3) " -H) 、 4. 08 ( 1 H, m. 5 - CH₂ の H) 、 4. 07

( 1 H. m, 2 - H) 、 3. 98 ( 1 H. d-d. J = 3. 4. 1 1. 〇. 3' 一 H) 、 3. 88 ( 1 H. m, 5-H) 、 3. 82 ( 1 H, m. 4" 一 H) 、 3 . 78 ( 1 H, m. 3 - H) 、 3. 78 ( 1 H, m. 4一 H) 、 3. 78 ( 1 H . m. (3) -H) 、 3. 67 (2H. m. (5) — CH₂ の H₂ ) 、 3. 63

( 1 H. m， (2) " -H) 、 3. 60 ( 1 H. m. 3" -H) 、 3. 59 ( 1 H. m. 5" -H) 、 3. 57 ( 1 H. m, (4) -H) 、 3. 57 ( 1 H. m , (5) 一 H) 、 3. 16 ( 1 H, t, J = 7. 9Hz. 2" —H) 、 1. 10

(3 H. d . J = 6. 7 Hz. 5' 一 CH₃ の H₃ )

糖組成 L一フコース：不飽和 D—グルクロン酸： D—グルクロン酸： D—マン ノース = 1 : 1 : 1 : 2 (L—フコースと不飽和 D—グルクロン酸と D-グルク ロン酸各 1分子と D—マンノース 2分子）

硫酸基 3分子 （L-フコースの 2位と 4位及び還元性末端側の D—マンノース の 6位）

なお、 ¹ H— NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式 （20) の通りである

(20)

(e) の物性

分子量 1448

MS m/z 767 [M+4Na-6H⁺ ] ²"

503. 7 [M+3Na-6H⁺ ] ³"

366. 5 [M + Na-5H* ] "

MS/MS m/z 97 [HSCU ] — 、 225 [L-フコース硫酸一 H₂ 0— H+ ] - 、 243 [L- フコース硫酸一 H⁺ ] - 、 345 [L一フコースジ 硫酸 +Na - 2H+ ] - 、 450 [M+3Na-2 S0₃ 一 6H+ ] ³_、 477 [M+ 3 N a - S 0₃ - 6H+ ] ³_、 563 [不飽和 D—グルクロン酸と D—マ ンノースと Lーフコースと硫酸が結合したもの一 H+ ] - 、 705 [不飽和 D— グルクロン酸と D-マンノース硫酸と L-フコースジ硫酸が結合したもの一 H₂ 0-H* ] - ¹ H-NMR (D₂ 〇） S 5. 58 ( 1 H. d. J = 3. 4Hz, (4) " _H) 、 5. 35 ( 1 H, b r - s . ( 1 ) 一 H) 、 5. 22 ( 1 H, d. J = 6. 7Hz, ( 1 ) " - H ) 、 5. 1 9 ( 1 H， d. J = 3. 7Hz. 1 ' — H) 、 5. 19 ( 1 H. d . J = 3. 7 H z . ( 1 ) ' 一 H) 、 5. 16 ( 1 H. d. J= 1. 8Hz. 1 - H) 、 4. 62 ( 1 H, d, J = 7. 6 H z, 一 H) 、 4. 50 ( 1 H, m , 4' 一 H) 、 4. 50 ( 1 H. m, (4) ' 一 H) 、 4. 30 ( 1 H, m. 5 ' -H) , 4. 30 ( 1 H. m. (5) ' — H) 、 4. 30 ( 1 H. m. (5) 一 CH₂ の H) 、 4. 25 ( 1 H, m, 2' - H) 、 4. 25 ( 1 H, m, (2 ) 一 H) 、 4. 25 ( l H. m. (2) ' - H) 、 4. 2〇 （ 1 H. m， (5) 一 CH₂ の H) 、 4. 18 ( 1 H, m. 5-CH₂ の H) 、 4. 16 ( 1 H. m , (3) " —H) 、 4. 08 ( 1 H, m, 5 - CH₂ の H) 、 4. 07 ( 1 H. m， 2 - H) 、 4. 02 ( 1 H. m, 3' 一 H) 、 4. 02 ( 1 H, m. (3) ' 一 H) 、 3. 85 ( 1 H, m, 5 - H) 、 3. 85 ( 1 H. m. (5) 一 H) 、 3. 78 ( 1 H, m. 3-H) 、 3. 78 ( 1 H. m. (3) -H) 、 3. 7 6 ( 1 H, m. 4" — H) 、 3. 76 ( 1 H. m. 5" - H) 、 3. 75 ( 1 H , m, 4 - H) ゝ 3. 75 ( 1 H, m. (4) - H) 、 3. 58 ( 1 H. m, 3 " 一 H) 、 3. 55 ( 1 H. m, (2) " —H) 、 3. 18 ( 1 H, t. J = 8 . 2 H z, 2" - H) 、 1. 10 (3H. d. J = 6. 7Hz. (5) ' -CH ₃ の H₃ ) 、 1. 09 (3 H, d. J = 6. 7Hz. 5' 一 CH₃ の H₃ ) 糖組成 Lーフコース ：不飽和 D-グルクロン酸： D—グルクロン酸： D—マン ノース =2 : 1 : 1 : 2 (Lーフコースと D—マンノース各 2分子と不飽和 D— グルクロン酸と D—グルクロン酸各 1分子）

硫酸基 6分子 （各 Lーフコースの 2位と 4位及び各 D—マンノースの 6位） なお、 ¹ H— NMRにおけるビークの帰属の番号は下記式 (21 ) の通りである (21 )

( f ) の物性

分子量 644

MS m/z 687 [M+ 2Na-3H⁺ ] -

MS/MS m/z 97 [H S0₄ ] -、 243 [L—フコース硫酸一 H⁺ ] " , 42 1 [不飽和 D—グルクロン酸と D—マンノース硫酸 +Na— H₂ 0— 2 H+ ] -

¹ H-NMR (D₂ 0)

55. 60 ( 1 H. d, J = 3. 4Hz, 4* —H) 、 5. 24 ( 1 H. b r 一 s. 1 - H) 、 5. 08 ( 1 H. d. J = 4. OH z. 1 ' 一 H) 、 4. 94 ( 1 H. d. J = 6. 7 H z. 一 H) 、 4. 45 ( 1 H, d-d. J = 3. 1. 1 0. 4Hz. 3' 一 H) 、 4. 20 ( 1 H. b r - s . 2 - H) 、 4. 1 4 (2 H, m. 5-CH₂ の H₂ ) 、 4. 14 ( 1 H. m. 5' 一 H) 、 4. 0 9、 ( 1 H. m. 3" 一 H) 、 4. 01 ( 1 H, d, J = 3. 1 H z, 4' -H ) 、 3. 9 1 ( 1 H, m. 5 -H) 、 3. 85 ( 1 H. m. 3 - H) 、 3. 85 ( 1 H. m. 2' 一 H) 、 3. 75 ( 1 H. t . J = 9. 8Hz, 4一 H) 、 3 • 59 ( 1 H, t , J = 6. 7 H z, 2" - H) 、 1. 06 (3H. d. J = 6 . 4 H z. 5' —CH₃ H₃ )

槠組成 Lーフコース ：不飽和 D—グルクロン酸： D- マンノース =

1 : 1 : 1 (Lーフコースと D—マンノースと不飽和 D—グルクロン酸各 1分 子）

硫酸基 2分子 （Lーフコースの 3位及び D—マンノースの 6位）

なお、 ¹ H— NMRにおけるビークの帰属の番号は下記式 （22) の通りであ る。

(22)

( g) の物性

分子量 632 MS m/z 63 1 [M - H+ ] -

MS/MS m/z 405 [D—ガラクトースと Lーフコース硫酸が結合した もの一 H⁺ ] - 、 551 [L—フコース硫酸と Lーフコースと D—ガラク卜ース が結合したもの一 H+ ] - 1 H - N M R (D₂ 0)

δ 5. 1 5 ( 1 H, d . J = 4. 3Hz, F, 1一 H) 、 4. 93 ( 1 H, d , J = 3. 7 H z. F₂ 1一 H) 、 4. 53 ( 1 H, d-d, J = 2. 4. 10 . 4 H z. F , 3 - H) 、 4. 49 ( 1 H. d. J = 7. 6Hz G, 1 -H) 、 4. 46 ( 1 H, d-d, J = 3. 1 , 10. 7 H z. F₂ 3 - H) 、 4. 3 6 ( 1 H, q, J = 6. 7 H z F₂ 5 - H) 、 4. 14 ( 1 H, q, J = 6. 7Hz F, 5-H) , 4. 09 ( 1 H. d, J = 2. 4Hz F, 4-H) , 4. 03 ( 1 H, d. J = 3. 1 Hz F₂ 4 - H) 、 3. 97 ( 1 H. d-d . J = 4. 3. 1 0. 4H z. F, 2 - H) 、 3. 90 ( 1 H. br-s. G, 4-H) , 3. 81 ( 1 H, d-d. J = 3. 7, 10. 7Hz, F₂ 2 -H) 、 3. 59 ( 1 H, m. G, 3 - H) 、 3. 59 ( 1 H, m. d 5 - H) 、 3 . 59 (2 H. m, G , 5 - CH₂ の H₂ ) 、 3. 56 ( 1 H. m. G, 2 - H ) 、 1. 1 9 (3 H. d. J = 6. 7 H z. F, 5 - CH₃ の H₃ ) 、 1. 14

(3 H. d. J = 6. 7 H z. F₂ 5 - CH₃ の H₃ )

糖組成 Lーフコース： D—ガラク卜一ス= 2 : 1

(Lーフコース 2分子と D—ガラク卜ース 1分子）

硫酸基 2分子 （各 Lーフコースの 3位）

なお、 ¹ H— NMRにおけるビークの帰属の番号は下言己式 （23) の通りである (23)

(h) の物性

分子量 1 358

MS m/z 1 445. [M + 4Na- 5 H⁺ ] -

MS /MS m/z 97 [H S0₄ ] - 、 225 [Lーフコース硫酸一 H₂ 0 一 H* ] - 、 1 1 97 [M- 2 S0₃ -H* ] - ¹ H-NMR (D₂ 0)

δ 5. 1 9 ( 1 H, d. J =4. 3H z, ¥_l 1一 H) 、 4. 93 ( 1 H. d ， J = 3. 7 H z . F₂. l - H) 、 4. 62 ( 1 H. m. G₂ 1一 H) 、 4. 5 9 ( 1 H. m. G i 1一 H) 、 4. 54 ( 1 H. d-d. J = 2. 7, 1 0. 6 H z. F i 3 -H) , 4. 46 ( 1 H. m. F₂ 3-H) , 4. 46 ( 1 H. d , J = 7. 6 H z G₃ 1一 H) 、 4. 4 1 ( 1 H. b r - s . G, 4-H) , 4. 4 1 ( 1 H. d . J = 7. 6H z. G₄ 1一 H) 、 4. 37 ( 1 H. q. J = 6. 4 H z F₂ 5 -H) 、 4. 27 ( 1 H. m. G, 3-H) , 4. 24 ( 1 H. b r - s . G₃ 4-H) , 4. 2 1 ( 1 H. m, G₃ 3-H) , 4. 1 9 ( 1 H. m, G₄ 3 -H) 、 4. 1 5 ( 1 H. b r -s, G₄ 4-H) , 4. 1 3 ( 1 H. q. J = 6. 7 H z. F, 5-H) , 4. 09 ( 1 H, d . J = 2. 7 H z . F i 4一 H) 、 4. 04 ( 1 H. d, J = 2. 8 H z, F₂ 4一 H) 、 3. 98 ( 1 H. m, G. 5 - CH₂ の H) 、 3. 96 ( 1 H, d-d, J = 4 . 3, 1 0. 6 H z , F , 2 - H) 、 3. 88 ( 1 H. b r - s , G₂ 4-H) 、 3. 93 ( 1 H, m, G₃ 5 - CH₂ の H) 、 3. 86 ( 1 H, m. d 5 - H) 、 3. 8 1 ( 1 H, m, F₂ 2 - H) 、 3. 8 1 ( 1 H, m, d 5-CH ₂ の H) 、 3. 80 ( 1 H. m. G₃ 5 - H) 、 3. 80 ( 1 H. m, G₃ 5 - CH₂ の H) 、 3. 66 ( 1 H, m, G₂ 3 - H) 、 3. 65 ( 1 H, m, d 2 - H) 、 3. 64 ( 1 H, m. G₂ 5 - CH₂ の H) 、 3. 64 ( 1 H, m, G₄ 5 - CH₂ の H) 、 3. 6 1 ( 1 H, m. G₄ 5 - H) 、 3. 58 ( 1 H. m, G₂ 2 - H) 、 3. 56 ( 1 H, m. G₂ 5 - CH₂ の H) 、 3. 56 ( 1 H. m, G 4 5- CH2 の 、 3. 55 ( 1 H. m, G₄ 2 - H) 、 3. 54

( 1 H. m, G₂ 5 - H) 、 3. 54 ( 1 H. m, G₃ 2 - H) 、 1. 20 (3 H. d , J = 6. 7 H z, F , 5 - CH₃ の H₃ ) 、 1. 1 4 (3 H. d . J = 6. 4 H z, F₂ 5 - CH₃ の H₃ )

糖組成 Lーフコース ： D—ガラク卜ース = 1 ： 2

(Lーフコース 2分子と D—ガラク卜ース 4分子）

硫酸基 5分子 （各 Lーフコースの 3位、 還元性末端の D—ガラク卜一スの 3位 、 及び還元性末端の D—ガラク卜ースの 6位に結合した D—ガラク卜ースの 3位 、 及びその D-ガラク卜ースの 6位に結合した D—ガラク卜ースの 3位） なお、 ¹ H— NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式 （24) の通りであ る。 (24)

( i ) の物性

分子量 1288

MS m/z 1 149 [M + Na-2 S0₃ - 2H⁺ ] -

MS/MS m/z 97 [H S0₄ ] - 、 345 [ L -フコースジ硫酸 + N a

- 2 H⁺ ] - 、

¹ H- NMR (D₂ 0)

δ 5. 68 ( 1 H, d, J = 3. 4Hz. (4) " 一 H) 、 5. 34 ( 1 H, b r - s , ( 1 ) 一 H) 、 5. 19 ( 1 H. m, 1 - H) 、 5. 19 ( 1 H, m . ( 1 ) ' 一 H) 、 4. 94 ( 1 H. m, 1 ' 一 H) 、 4. 94 ( 1 H. d . J =6. 4H z. ( 1 ) " 一 H) 、 4. 72 ( 1 H. d. J = 7. 9Hz、 ド ー H) 、 4. 54 ( l H, m. (4) ' -H) s 4. 48 ( 1 H. d-d. J = 3 . 3, 10. 6Hz, 3' 一 H) 、 4. 38 ( 1 H, q. J = 6. 4Hz. 5' 一 H) 、 4. 34 ( 1 H. q. J = 6. 7Hz. (5) ' 一 H) 、 4. 29 ( 1 H. m. (2) ' 一 H) 、 4. 20 ( 1 H. m. 5— CH₂ の H) 、 4. 14 ( 1 H, m. (2 ) 一 H) 、 4. 1 3 ( 1 H, m. (3) 〃 一 H) 、 4. 09 ( 1 H. m. 5 - C H₂ の H) 、 4. 08 ( 1 H. m, 2 - H) 、 4. 05 ( 1 H, d, J = 3. 3 H z. 4' 一 H) 、 3. 99 ( 1 H, m. (3) ' 一 H) 、 3. 89 ( 1 H. m, 5 - H) 、 3. 83 ( 1 H. m, 4" 一 H) 、 3. 8 1 ( 1 H , m. 2' - H) 、 3. 80 ( 1 H, m, 4一 H) 、 3. 78 ( 1 H, m, 3 - H) , 3. 78 ( 1 H. m. (3) -H) , 3. 68 (2 H, m, (5) -CH ₂ の H₂ ) 、 3. 62 ( 1 H. m. (2) " -H) 、 3. 60 ( 1 H. m. 3" - H) 、 3. 60 ( 1 H, m, 5" - H) 、 3. 58 ( 1 H. m, (5) -H) 、 3. 56 ( 1 H, m. (4) - H) 、 3. 1 7 ( 1 H, t , J = 7. 9Hz. 2" - H) 、 1 . 1 5 ( 3 H. d, J = 6. 4H z. 5' - CH₃ の H₃ ) 、 1 - 1 1 (3 H, d. J = 6. 7 H z. (5) ' - CH₃ の H₃ )

糖組成 Lーフコース：不飽和 D—グルクロン酸： D—グルクロン酸： D—マ ンノース = 2 : 1 : 1 : 2 (L-フコースと D—マンノース各 2分子と不飽和 D 一グルクロン酸と D—グルクロン酸各 1分子）

硫酸基 4分子 （還元性末端の D—マンノースに結合した Lーフコースの 3位 ともう一方の Lーフコースの 2位と 4位及び還元性末端側の D—マンノ一スの 6 位）

なお、 ¹ H— NMRにおけるビークの帰属の番号は下記式 （25) の通りであ る。

(25)

また、 本発明の第 1の発明である糖化合物は、 本発明の第 3の発明であるフコ イダノバクタ一厲に厲する細菌から得られる菌体抽出物又は培養液上清をフコィ ダンに作用させた場合にも製造することができる。

本発明の第 3の発明である菌株としては、 フコイダノバクター属に属する本発 明の菌株であればいかなる菌株でも良く、 該菌株の具体例としては、 例えば、 フ コイダノパクター ·マリナス （Fucoidanobacter marinus) S I— 0098株が挙 げられる。

本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、 その菌 学的性質は次の通りである。

2. フコイダノバクタ一 マリナス S 1—0098

a. 形態的性質

( 1 ) 本菌は球〜短桿菌であり、 時に双球菌の形態をとることがある。

幅 0. 5〜0. 7/Ltm

長さ 0. 5〜0. 7 /um (2) 胞子の有無 なし

(3) グラム染色性 陰性

b. 生理的性質

( 1 ) 生育の温度範囲

37°Cで生育できる。 好適な生育温度は 15〜28でである,

(2) 酸素に対する態度 好気性

(3) カタラーゼ 陽性

(4) ォキシダーゼ 陰性

(5) ゥレアーゼ 陰性

(6) 加水分解

デンプン 陽性

ゼラチン 陰性

カゼイン 陰性

エスクリン 陽性

( 7 ) 硝酸塩の還元 P貪性

(8) インドールの生成 陰性

( 9 ) 硫化水素の生成 陽性

( 10) ミルクの凝固 陰性

( 1 1 ) ナトリウムの要求性 陽性

( 12) 塩類要求性

0%食塩培地での生育 陰性

1 %食塩培地での生育 陰性

海水培地での生育 陽性

( 1 3) キノン系 メナキノン 7

( 14) 菌体内 DNAの GC含量 61% ( 1 5) 細胞壁のジアミノピメリン酸 陰性

( 16) ク'リコリノレ言式験 陰性

( 17) ヒドロキシ脂肪酸の存在 陽性

( 18) 0 F—テス卜 0

( 19) 集落の色調 特徴的な集落色素を生成せず

(20) 運動性 あり

(2 1 ) 滑走性 なし

( 22 ) 鞭毛 極単毛

本菌株は、 バージーズ マニュアル ォブ ディターミネイティブ パクテリ ォロジ一、 第 9巻 （ 1994) 記載の基本分類によればグループ 4 (グラム陰性 好気性かん菌及び球菌） に分類される。 しかしながら本菌株は、 電子伝達鎖にメ ナキノン 7を有し、 GC含量が 61 %の点でグループ 4に属する菌と大いに異な る。 基本的にグラム陰性細菌は電子伝達鎖にュビキノンを有し、 グラム陽性細菌 はメナキノンを有している。

グラム陰性細菌であるフラボパクテリゥム属及びシ卜ファーガ （Cytophaga)厲 は例外的に電子伝達鎖にメナキノンを有しているが、 これらの属に属する細菌の GC含量は、 土壌細菌であるシ卜ファーガ ァーベンシコラ （Cytophaga arvens icoia)が 43〜46%、 海洋細菌であるシ卜ファーガ ジフルエンス （Cytophag a diffluens), シ卜ファーガ フアーメンタンス （Cytophaga fermentans) 、 シ 卜ファーガ マリーナ （Cytophaga marina) 、 及びシ卜ファーガ ゥリギノーサ (Cytophaga uUginosa)が 42 %であり、 本菌株の性質とは全く異なる。 更に、 本菌株と既同定株の 16 S r DNA配列の相同性を比較したところ、 最も相同性 の高い既同定株べルコミクロビゥム スビノサム （Verrucomicrobium spinosum) においてもその相同性は、 76. 6%であった。 16 S r DNA配列の相同性が 90%以下の場合、 両細菌の属が異なることは一般に広く知られていることから 、 本発明者らは、 本菌株は既存の属に属さない新属の細菌であると断定し、 よつ て本菌株をフコイダノバクタ一 マリナス S I — 0 0 9 8と命名した。

なお、 上 §己 ¾株 (ま Fuco idanobacter marinus S I — 0 0 9 8と表不され、 通 商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 [あて名：曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) 〕 に F E R M B P - 5 4 0 3 (原寄託曰； 平成 7年 3月 2 9日、 国際寄託日への移管請求日：平成 8年 2月 1 5日） として 寄託されている。

本発明の第 3の発明であるフコイダノパクター属細菌を培養し、 その菌体抽出 物、 又は培養液上清をフコィダンに作用させることにより、 本発明の第 1の発明 の糖化合物を遊離させることができる。 培養する菌株としては、 フコイダノバク ター属に属し、 その菌体抽出物又は培養液上清をフコィダンに作用させた場合、 本発明の第 1の発明である糖化合物が得られる菌株であればいかなる菌株でも良 く、 該菌株の具体例としては、 例えば、 Fucoidanobacter mar i nus S I - 0 0 9 8株が挙げられる。

フコイダノパクター属細菌株の培地に加える栄養源は該菌株が利用し、 該菌株 がフコィダンから本発明の第 1の発明である糖化合物の生成が可能な菌体内抽出 物及び培養上清を生産するものであればよく、 炭素源としては例えばフコィダン 、 海藻粉末、 アルギン酸、 フコース、 グルコース、 マンニトール、 グリセロール 、 サッカロース、 マルトース、 ラク卜ース、 デンプン等が利用でき、 窒素源とし ては、 酵母エキス、 ペプトン、 カザミノ酸、 コーンスティーブリカー、 肉エキス 、 脱脂大豆、 硫安、 塩化アンモニゥム等が適当である。 その他にナトリウム塩、 リン酸塩、 カリウム塩、 マグネシウム塩、 亜鉛塩等の無機質、 及び金属塩類を加 えてもよい。

また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育す る。 本発明の第 3の発明であるフコイダノバクター属細菌を培養するに当り、 一般 に培養温度は、 15。C~ 30 °C、 培地の pHは 5~9がよく、 5〜72時間の通 気かくはん培養で、 該菌株の菌体内抽出物及び培養上清のェンド型フコィダン分 解酵素活性は最大に達する。 培養条件は使用する菌株、 培地組成に応じ、 該菌株 が生産する菌体内抽出物及び培養上清のェンド型フコィダン分解活性が最大にな るように設定することは当然のことである。

フコイダノバクター属 S I— 0098株を適当な培地で培養し、 培養終了後 、 遠心分離すれば菌体及び培養液上清が得られる。 更に得られた菌体を通常用い られる細胞破壊手段、 例えば、 超音波破砕後、 遠心分離すれば菌体抽出液が得ら れる。

限外ろ過により濃縮した培養液上清又は菌体抽出液を塩化ナ卜リゥムを含むリ ン酸緩衝液と混合し、 これにフコィダンを加え、 反応させる。

反応終了後、 反応液を分子量分画用のカラムを用いて分画することにより本発 明の第 1の発明である糖化合物を得ることができる。

本発明の第 1の発明である糖化合物は糖鎖工学用試薬として有用であり、 特公 平 5— 651 08号記載の方法により P A化を行い、 P A化物を調製すれば、 糖 鎖工学用試薬として極めて有用な物質が提供される。 更に本発明の糖化合物は抗 ガン剤、 癌転移抑制剤、 抗ウィルス剤としての生理活性の適用が期待される。 本発明を実施するための最良の形態

以下に、 本発明の第 1の発明である糖化合物の例の製造方法を実施例をもって 示すが本発明が以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。

実施例 1

フラボパクテリゥム sp. SA— 0082 (F ERM BP— 5402) を、 グ ルコース 0. 1 %、 ペプトン 1. 0%、 酵母エキス 0. 05%を含む人工海水 （ ジャマリンラボラトリー製） ΡΗ7· 5からなる培地 60 Om 1を分注して殺菌 した （ 1 20°C、 20分） 2リットルの三角フラスコに接種し、 24°Cで 20時 間培養して種培養液とした。 ガゴメ昆布由来のフコィダン 0. 3%、 ペプトン 0 . 5%、 酵母エキス 0. ◦ 1 %、 及び消泡剤 （信越化学工業製 KM70) 0. 0 1 %を含む人工海水 （ジャマリンラボラトリー製） pH7. 5からなる培地 20 リットルを 30リ 卜ル容のジャーフアーメンターに入れ 120。Cで 20分殺菌 した。 冷却後、 上記の種培養液 60 Om 1を接種し、 24でで 20時間、 毎分 1 0リットルの通気量と毎分 125回転のかくはん速度の条件で培養した。 培養終 了後、 培養液を遠心分離して菌体及び培養液上清を得た。

この培養液上清を限外ろ過 （ろ過膜の排除分子量 1万） （アミコン社製） によ り攘縮し、 本発明のェンド型フコィダン分解酵素を測定したところ培養液 1 m 1 当り 6ミリユニットの活性が検出された。

—方、 本培養で得られた菌体を、 20 OmMの食塩を含む 2 Οτ Μの酢酸ーリ ン酸緩衝液 （ΡΗ7. 5) に懸濁し、 超音波破碎後、 遠心分離して菌体抽出液を 得た。 この菌体抽出液中の本発明のェンド型フコィダン分解酵素の活性を測定し たところ、 培地 1 m 1中に 2 OmUの活性が検出された。

上記の培養液上清の濂縮液に、 終濃度が 90%飽和となるように硫酸アンモニ ゥムを加え、 かくはん溶解後遠心分離し、 沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に 懸濁して、 5 OmMの食塩を含む 2 OmMの酢酸一リン酸緩衝液 （pH7. 5) で+分透析した。 透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、 あらかじめ 5 OmMの食塩を含む 2 OmMの酢酸一リン酸緩衝液 （pH7. 5) で平衡化した DEAE—セファロース FFのカラムに吸着させ、 吸着物を同緩衝液にて +分洗 碰、 5 OmMから 60 OmMの食塩のグラジェン卜により溶出させ、 活性画分 を集めた。 次にこの活性画分に終溏度が 4 Mとなるように食塩を加え、 あらかじ め 4 Mの食塩を含む 2 OmMのリン酸緩衝液 （pH8. 0) で平衡化したフエ二 ルセファロース CL一 4Bのカラムに吸着させ、 吸着物を同緩衝液で十分洗浄 後、 4Mから 1 Mの食塩のグラジェン卜により溶出させ、 活性画分を集めた。 次 にこの活性画分を限外ろ過器 （アミコン社製） で澳縮後、 あらかじめ 50mM食 塩を含む 10 mMリン酸緩衝液で平衡ィヒしたセフアクリル S— 200でゲルろ 過を行い活性画分を集めた。 次にこの活性画分に終濃度が 3. 5 Mとなるように 食塩を加え、 あらかじめ 3. 5Mの食塩を含む 1 OmMリン酸緩衝液 （pH8) で平衡化したフヱニルセファロース HPのカラムに吸着させ、 吸着物を同緩衝 液で洗浄後、 3. 5Mから 1. 5Mの食塩のグラジェン卜により溶出させ、 活性 画分を集めて精製酵素を得た。 この酵素の分子量をセフアクリル S - 200の 保持時間から求めたところ約 7万であった。 以上の精製工程を表 1に示す。

表 1

総タンパク量 総活性 比活性 収率 ェ 程 （mg) (ミリ単位） （ミリ単位/ mg) (%) 培養液上清 980 114.000 116 100 硫安塩析 473 108, 000 228 94.7

DEAE—セファロース FF 216 86.400 400 75.8 フエ二ルセファロース CL-4B 21.9 57.300 2,620 50.3 セフアクリル S-200 3.70 46,200 12.500 40.5 フエ二ルセファロース HP 1.53 41,200 27.000 36.1 実施例 2

フラボパクテリゥム sp. SA— 0082 (F ERM BP— 5402) をグル コース 0. 25%、 ペプトン 1. 0%、 酵母エキス 0. 05%を含む人工海水 ( ジャマリンラボラトリー製） pH7. 5からなる培地 6 OOm lを分注して殺菌 した （ 120°C、 20分） 2リットルの三角フラスコに接種し、 24°〇で24時 間培養して種培養液とした。 グルコース 0. 25%、 ペプトン 1. 0%、 酵母ェ キス 0. 05%、 及び消泡剤 （信越化学工業製 KM70) 0. 01 %を含む人工 海水 （ジャマリンラボラトリ一製） P H 7. 5からなる i咅地 20リツ卜ルを 30 リッ卜ル容のジャーフアーメンターに入れ 120°Cで 20分殺菌した。 冷却後、 上記の種培養液 600m lを接種し、 24でで 24時間、 毎分 10リットルの通 気量と毎分 1 25回転のかくはん速度の条件で培養した。 培養終了後、 培養液を 遠心分離して菌体及び培養液上清を得た。

この培養液上清を限外ろ過 （ろ過膜の排除分子量 1万） （アミコン社製） によ り鑲縮し、 本発明のェンド型フコィダン分解酵素を測定したところ培養液 1 m 1 当り 1 mUの活性が検出された。

—方、 本培養で得られた菌体を、 20 OmMの食塩を含む 2 OmMの酢酸ーリ ン酸緩衝液 （PH7. 5) に懸濁し、 超音波破砕後、 遠心分離して菌体抽出液を 得た。 この菌体抽出液中の本発明のェンド型フコィダン分解酵素の活性を測定し たところ、 培地 1 m 1中に 5 m Uの活性が検出された。

本抽出液に、 終濂度が 90%飽和となるように硫酸アンモニゥムを加え、 かく はん溶解後遠心分離し、 沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、 50m Mの食塩を含む 2 OmMの酢酸一リン酸緩衝液 （pH7. 5) で十分透析した。 透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、 あらかじめ 50mMの食塩を含 む 2 OmMの酢酸一リン酸緩衝液 （pH7. 5) で平衡化した D E A E-セファ ロース FFのカラムに吸着させ、 吸着物を同緩衝液にて+分洗净後、 5 OmMか ら 60 OmMの食塩のグラジェン卜により溶出させ、 活性画分を集めた。 次にこ の活性画分に終濃度が 4 Mとなるように食塩を加え、 あらかじめ 4 Mの食塩を含 む 2 OmMのリン酸緩衝液 （pH8. 0) で平衡化したフエ二ルセファロース CL一 4 Bのカラムに吸着させ、 吸着物を同緩衝液で +分洗浄後、 4Mから 1M の食塩のグラジェン卜により溶出させ、 活性画分を集めた。 次にこの活性画分を 限外ろ過器で澳縮後、 あらかじめ 5 OmM食塩を含む 1 OmMリン酸緩衝液で平 衡化したセフアクリル S - 300でゲルろ過を行い活性画分を集めた。 この酵 素の分子量をセファクリル S— 300の保持時間から求めたところ約 46万で あった。 次にこの活性画分に 25 mMの食塩を含む 1 OmMのリン酸緩衝液 （p H7) で透析した。 この酵素液を、 あらかじめ 25 OmMの食塩を含む 1 OmM のリン酸緩衝液 （pH7) で平衡化したモノ （Mono) Q HR5Z5のカラムに 吸着させ、 吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、 25 OmMから 45 OmMの食塩の グラジェン卜により溶出させ、 活性画分を集め、 精製酵素を得た。 以上の精製ェ 程を表 2に示す。

表 2

総タンパク量 総活性 比活性 収率 ェ 程 （mg) (ミリ単位） （ミリ単位/ mg) (%) 菌体抽出液 61.900 101.000 1.63 100 硫安塩析 33,800 88,600 2.62 87.7

DEAE—セファロース FF 2, 190 40, 400 18.4 40.0 フエ二ルセファロース CL-4B 48.2 29.000 601 28.7 セフアクリル S-300 7.24 19.600 2.710 19.4 モノ Q 0.824 15, 000 18.200 14.9 実施例 3

精製したガゴメ昆布由来のフコィダンに本発明の実施例 1で得られたェンド型 フコィダン分解酵素 （菌体内酵素） を作用させ分解物の調製を行った。

すなわち、 2. 5%のフコィダン溶液 16m 1と、 5 OmMのリン酸緩衝液 （ p H 7. 5) 12 m 1と 4Mの塩化ナトリウム 4m 1と 3 SmUZm 1の本発明 のェンド型フコィダン分解酵素溶液 8 m 1を混合し、 25°Cで 48時間反応させ た。

反応液をセル口ファイン GCL— 300 (生化学工業社製） のカラムにより分 子量分画し、 分子量 2000以下の画分を集めた。 この画分をマイクロァシライ ザ一 G3 (旭化成社製） により脱塩後、 DEAE—セファロース FFによ.り 3つ の画分に分離した。 この結果前記した物質 （a) 、 (b) 、 (c) をそれぞれ 4 l mg、 69mg、 及び 9. 6mg得た。

実施例 4

精製したガゴメ昆布由来のフコィダンに本発明の実施例 2で得られたェンド型 フコィダン分解酵素 （菌体外酵素） を作用させ分解物の調製を行った。

すなわち、 2. 5%のフコィダン溶液 16m 1と、 50mMのリン酸緩衝液 （ PH7. 5) 12m 1と 4Mの塩化ナトリウム 4m 1と 32mUZm 1の本発明 のェンド型フコィダン分解酵素溶液 8 m 1を混合し、 25。Cで 48時間反応させ た。

反応液をセル口ファイン GCL— 300 (生化学工業社製） のカラムにより分 子量分画し、 分子量 2000以下の画分を集めた。 この画分をマイクロァシライ ザ一 G3 (旭化成社製） により脱塩後、 DEAE-セファロース FFにより 3つ の画分を分離し、 凍結乾燥した。 この結果前記した物質 （a) 、 （b) 、 (c) をそれぞれ 40mg、 65mg、 及び 9. 2mg得た。

実施例 5

フコイダノバクタ一 マリナス 51—0098株 （ £1¾1^ BP-540 3) を、 ガゴメ昆布由来のフコィダン 0. 3%、 ペプトン 0. 5%、 酵母エキス 0. 05%、 及び消泡剤 （信越化学工業製 KM70) 0. 01 %を含む人工海水 (ジャマリンラボラトリー製） pH7. 5からなる培地 60 Om 1を 2リットル 容の三角フラスコに入れ 1 20°Cで 20分殺菌した培地に接種し、 25°〇で48 時間、 毎分 1 20回転のかくはん速度の条件で培養した。 培養終了後、 培養液を 遠心分離して菌体及び培養液上清を得た。

この培養液上清を限外ろ過 （ろ過膜の排除分子量 1万） （アミコン社製） によ り鑲縮し、 本発明のェンド型フコィダン分解酵素を測定したところ培養液 1 m 1 当り 0. 2 mU活性が検出された。

—方、 本培養で得られた菌体を、 20 OmMの食塩を含む 2 OmMの酢酸ーリ ン酸緩衝液 （PH7. 5) に懸濁し、 超音波破砕後、 遠心分離して菌体抽出液を 得た。 この菌体抽出液中の本発明のェンド型フコィダン分解酵素の活性を測定し たところ、 培地 1 m 1中に 20 m Uの活性が検出された。

実施例 6

精製したガゴメ昆布由来のフコィダンに本発明の実施例 5で得られたフコイダ ノバクタ一 マリナス S I— 0098株の菌体内酵素を作用させ分解物の調製 を行った。

すなわち、 2. 5%のフコィダン溶液 16m 1と、 80 OmMの塩化ナ卜リウ ムを含む 1 0 OmMのリン酸緩衝液 （pH8. 0) 20m 1と 2 OmUZm 1の 本発明の実施例 5で得られたフコイダノバクタ一 マリナス S 1 -0098株 の菌体内酵素溶液 4 m 1を混合し、 25 で 48時間反応させた。

反応液をセル口ファイン GCL- 300のカラムにより分子量分画し、 分子量 2000以下の画分を集めた。 この画分をマイクロァシライザ一 G 3により脱塩 後、 D E AE-セファロ一ス F Fにより 3つの画分を分離し、 凍結乾燥した。 こ の結果前記した物質 （a) 、 (b) 、 （c) をそれぞれ 38mg、 60mg、 及 び 8. 2mg得た。

本発明により、 フコィダンの構造解析、 フコィダンの酵素分解物の同定、 及び 生物活性の検索に用いることができる糖化合物、 フコィダンの部分分解及びフコ ィダンオリゴ糖の生産などフコィダンに関する研究に有用な新規なェンド型のフ コィダン分解酵素及び糖化合物の製造に有用な新規微生物が提供された _c

Claims

96/34004 請 求 の 範 囲

1. 下記一般式 （ 1 ) 又は （2) ：

( 1)

(2)

〔式中、 Xは H又は下記式 （3)

(3)

で表される基を示し、 Yは H又は下記式 （4) 、 若しくは （5)

(4)

(5)

で表される基を示すが、 Xと Yが共に Hであることはない。 また、 Zは H又は下 記式 （ 6 ) ：

(6)

で表される基を示す] で表される化合物の少なくとも一つのアルコール性水酸基 が硫酸ェステル化している糖化合物又はその塩。

2. 下記式 （7) で表される糖化合物又はその塩。

(7)

3. 下記式 （8) で表される糖化合物又はその塩 c

(8)

4. 下記式 （9) で表される糖化合物又はその塩。

(9)

96/34004

5. 下記式 （ 1 0) で表される糖化合物又はその塩'

( 10)

6. 下記式 （ 1 1 ) で表される糖化合物又はその塩。

(Π)

7. 下記式 （ 1 2) で表される糖化合物又はその塩。

( 12)

⁸· 下記式 （ ^{1 3}) で表される糖化合物又はその塩。

( 13)

9. 下記式 （ 1 4) で表される糖化合物又はその塩, 96/34004

( 14)

10. 下記式 （ 1 5) で表される糖化合物又はその塩。

( 15)

11. 下記の理化学的性質を有することを特徴とするェンド型フコィダン分解酵 素。 ( I ) 作用： フコィダンに作用して、 少なくとも前記式 （7 ) 及び式 (8) で表 される化合物を遊離させる。

(II) 至適 P H ：本酵素の至適 pHは 6から 1 0である。

(ΠΙ)至適温度：本酵素の至適温度は 30から 40°Cである。

12. 電子伝達鎖にメナキノンを有し、 G C含量が約 60%である、 フコイダノ パクター属に属する細菌。

要 約 書

新規なェンド型のフコィダン分解酵素、 及び糖化合物の製造に有用な新規微生 物を提供する。

下記一般式 （ 1 ) ：

( 1)

[式中、 Yは H又は下記式 （2)

(2)

で表される基を示す〕 で表される化合物中の少なくとも—つのアルコール性水酸 基が硫酸ェステル化している糖化合物又はその塩。