KR19990008099A - 당 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 엔도형 퓨코이단 하이드롤라제 및 당 화합물의 생산에 유용한 신규 미생물을 제공한다. 당 화합물이란 적어도 하나의 알콜 하이드록실 그룹이 설페이트화되고 Y가 수소 또는 화학식 2의 그룹인 화학식 1로 표현되는 화합물, 및 이의 염을 말한다.
화학식 1
화학식 2

Description

당 화합물
갈조류(Phaeophyta)에 함유되어 있는 설페이트화 폴리사카라이드인 퓨코이단이 항응고, 지질혈증-퇴치, 항암, 암 전이-억제 및 항-AIDS 바이러스 감염 효과를 포함한 다양한 생물학적 활성을 지니고 있음이 보고되어 왔다. 즉, 퓨코이단은 약제로서 매우 유용하다.
퓨코이단 자체를 약제로 사용하고자 하는 경우, 그러나 퓨코이단이 지극히 거대한 분자량을 지닌 설페이트화 폴리사카라이드이기 때문에 항원성, 균일성, 항응고 활성 등에 있어서 문제점이 발생한다. 따라서, 퓨코이단을 특정 범위까지 분해하는 것이 종종 필요하다.
따라서, 퓨코이단의 구조를 규명하고 이의 생물학적 활성과의 관계를 밝히고자 열망하여 왔다. 그러나, 퓨코이단은 다수의 측쇄 및 각종 구성성분을 이루는 당이 달린 고분자 화합물이다. 더욱이, 이의 설페이트 그룹은 다양한 위치에 결합되어 있다. 이러한 특징으로 말미암아 퓨코이단의 구조 분석이 매우 곤란하게 된다. 폴리사카라이드의 구조를 분석하기 위하여, 폴리사카라이드를 분해할 수 있는 효소로 처리하고 이렇게 하여 형성된 올리고사카라이드의 구조를 분석하는 단계를 포함하는 방법이 공지되어 있다. 그러나, 알려져 있는 당쇄 구조를 지닌 산물을 생성하는 여타의 퓨코이단 분해 효소 또는 이제까지 보고된 이들 가운데서 퓨코이단 올리고사카라이드의 표준으로서 역할을 하는 어떠한 것도 상업적으로 이용가능하지 않다.
이러한 이유로 해서, 확인된 구조를 지닌 당 화합물, 이러한 당 화합물의 생산에 유용한 폴리사카라이드 분해 효소 및 당 화합물의 생산에 유용한 미생물이 요구되어 왔다.
본 발명의 목적은 퓨코이단의 구조 분석, 퓨코이단의 효소 분해 산물의 동정 및 이의 생물학적 활성 검출에 사용할 수 있는 당 화합물, 퓨코이단 올리고사카라이드의 생산과 같은 퓨코이단 연구에 유용한 신규 엔도-퓨코이단-리아제 및 당 화합물의 생산에 유용한 신규 미생물을 제공하는 것이다.
간단히 말해서, 본 발명의 제 1 목적은 적어도 하나의 알콜 하이드록실 그룹이 설페이트화된 화학식 1 또는 2로 표현되는 당 화합물, 또는 이들의 염에 관한 것이다.
상기식에서,
X는 수소 또는 화학식 3의 그룹이고,
Y는 수소 또는 화학식 4 또는 5의 그룹이며, 단 X 및 Y는 동시에 수소일 수 없으며,
Z는 수소 또는 화학식 6의 그룹이다.
화학식 1 또는 2로 표현되는 화합물의 예는 화학식 7 내지 15로 표현되는 것들이다:
본 발명의 제 2 발명은 다음과 같은 물리화학적 특성을 지님을 특징으로 하는 엔도-퓨코이단-리아제에 관한 것이다.
(I) 기능: 퓨코이단에 작용 및 이에 따라 적어도 화학식 7 또는 8로 표현되는 화합물 방출.
(II) 최적 pH 값: pH 6 내지 10.
(III) 최적 온도: 30 내지 40℃.
본 발명의 제 3 발명은 전자 전달쇄에 메나퀴논을 갖고 60%의 GC를 갖는, 본 발명의 제 1 발명의 당 화합물 생산에 유용한 미생물인 퓨코이다노박터속에 속하는 세균에 관한 것이다.
화학식 1, 2, 4 내지 15 및 17 내지 25에 있어서, ∼은 만노스 또는 갈락토스가 α- 및 β-아노머 모두 생성됨을 의미한다.
본 발명에 의하여 본 발명의 당 화합물이 퓨코이단을 본 발명의 제 2 발명의 효소 또는 본 발명의 제 3 발명의 세균의 세포 추출물 또는 배양 상등액으로 처리함으로써 수득될 수 있음이 밝혀졌으며 이에 따라 본 발명이 완성된다.
본 발명은 탄수화물 연구분야에 유용한 당 화합물, 이러한 당 화합물의 생산에 유용한 폴리사카라이드 리아제 및 당 화합물의 생산에 유용한 퓨코이다노박터(Fucoidanobacter)속에 속하는 미생물에 관한 것이다.
도 1은 L 컬럼으로부터 용출되는 피리딜-(2)-아민화(PA-a) 당 화합물 (a)의 용출 패턴도.
도 2는 L 컬럼으로부터 용출되는 피리딜-(2)-아민화(PA-b) 당 화합물 (b)의 용출 패턴도.
도 3은 L 컬럼으로부터 용출되는 피리딜-(2)-아민화(PA-c) 당 화합물 (c)의 용출 패턴도.
도 4는 L 컬럼으로부터 용출되는 피리딜-(2)-아민화(PA-d) 당 화합물 (d)의 용출 패턴도.
도 5는 L 컬럼으로부터 용출되는 피리딜-(2)-아민화(PA-e) 당 화합물 (e)의 용출 패턴도.
도 6은 L 컬럼으로부터 용출되는 피리딜-(2)-아민화(PA-f) 당 화합물(f)의 용출 패턴도.
도 7은 L 컬럼으로부터 용출되는 피리딜-(2)-아민화(PA-g) 당 화합물 (g)의 용출 패턴도.
도 8은 L 컬럼으로부터 용출되는 피리딜-(2)-아민화(PA-h) 당 화합물 (h)의 용출 패턴도.
도 9는 L 컬럼으로부터 용출되는 피리딜-(2)-아민화(PA-i) 당 화합물 (i)의 용출 패턴도.
도 10은 당 화합물(a)의 질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 11은 당 화합물(b)의 질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 12는 당 화합물(c)의 질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 13은 당 화합물(d)의 질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 14는 당 화합물(e)의 질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 15는 당 화합물(f)의 질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 16은 당 화합물(g)의 질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 17은 당 화합물(h)의 질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 18은 당 화합물(i)의 질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 19는 당 화합물(a)의 질량-질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 20은 당 화합물(b)의 질량-질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 21은 당 화합물(c)의 질량-질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 22는 당 화합물(d)의 질량-질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 23은 당 화합물(e)의 질량-질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 24는 당 화합물(f)의 질량-질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 25는 당 화합물(g)의 질량-질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 26은 당 화합물(h)의 질량-질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 27은 당 화합물(i)의 질량-질량 스펙트로그램도(네가티브 측정).
도 28은 당 화합물(a)의1H-NMR 스펙트럼도.
도 29는 당 화합물(b)의1H-NMR 스펙트럼도.
도 30은 당 화합물(c)의1H-NMR 스펙트럼도.
도 31은 당 화합물(d)의1H-NMR 스펙트럼도.
도 32는 당 화합물(e)의1H-NMR 스펙트럼도.
도 33은 당 화합물(f)의1H-NMR 스펙트럼도.
도 34는 당 화합물(g)의1H-NMR 스펙트럼도.
도 35는 당 화합물(h)의1H-NMR 스펙트럼도.
도 36은 당 화합물(i)의1H-NMR 스펙트럼도.
도 37은 본 발명의 제 2 발명에 따른 효소의 상대 활성(%)과 pH값간의 관계 예시 그래프도.
도 38은 본 발명의 제 2 발명에 따른 효소의 상대 활성(%)과 온도(℃)간의 관계 예시 그래프도.
도 39는 처리시의 본 발명의 제 2 발명에 따른 효소의 잔류 활성(%)과 pH값간의 관계 예시 그래프도.
도 40은 처리시의 본 발명의 제 2 발명에 따른 효소의 잔류 활성(%)과 온도(℃)간의 관계 예시 그래프도.
도 41은 DEAE-세파로스 FF에 의하여 분리한 당 화합물(a) 내지 (i)의 용출 패턴도.
도 42는 DEAE-세파로스 FF에 의하여 분리한 당 화합물(h) 및 (i)의 용출 패턴도.
이하에서, 본 발명은 더욱 상세히 기술된다.
본 발명의 제 2 발명에 사용되는 균주는 플라보박테리움(Flabobacterium)속에 속하고 본 발명의 엔도-퓨코이단-리아제를 생성할 수 있는 한은 여타의 것일 수 있다. 엔도-퓨코이단-리아제를 생성할 수 있는 균주의 특정 예로서, 플라보박테리움종 SA-0082 균주가 언급될 수 있다. 본 발명의 제 1 발명의 당 화합물은 퓨코이단을 이러한 균주 기원의 엔도-퓨코이단-리아제로 처리함으로써 수득될 수 있다.
일본 아오모리의 해수로부터 본 발명자에 의하여 최초로 발견된 상기 균주는 다음과 같은 균학 특성을 지니고 있다.
1. 플라보박테리움종 SA-0082 균주
a. 형태학적 특성
(1) 단간상;
폭: 0.8 내지 1.0μm
길이: 1.0 내지 1.2μm
(2) 포자 : 없음
(3)그람 염색: -
b. 생리학적 특성
(1) 생장 온도 범위: 37℃ 이하에서 생장 가능, 적정 생장 온도 15 내지 28℃
(2) 산소에 대한 행태: 호기성
(3)카탈라제: +
(4)옥시다제: +
(5)우레아제: 약 +
(6) 산 형성 D-글루코스 : +
락토스 : +
말토스 : +
D-만니톨 : +
슈크로스 : -
트레할로스 : -
(7) 가수분해 전분: -
젤라틴: +
카제인: -
에스쿨린: +
(8) 질산염의 환원: -
(9) 인돌 형성 : -
)10) 황화수소 형성: -
(11) 우유의 고형화: -
(12) 나트륨 요구성: +
(13) 염류 요구성
NaCl-비함유 배지내 생장: -
1% NaCl 배지내 생장: -
해수 배지내 생장 :+
(14) 퀴논 :메나퀴논 6
(15) 세포내 DNA의 GC 함량: 32%
(16) OF-시험: O
(17)콜로니 색채: 황색
(18) 운동성: 없음
(19)활주성: 없음
본 균주는 문헌[참조: Bergeys's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1(1984)] 및 문헌[참조: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 9 (1994)]에 기술되어 있는 플라보박테리움 아쿠아타일(F. aquatile) 및 플라보박테리움 메닌고셉티컴(F. meningosepticum)과 유사한 세균인 것으로 평가될 수 있다. 그러나, 본 균주는 슈크로스 대사를 경유한 어떠한 산도 형성할 수 없고, 카제인을 분해할 수 없으며, 에스쿨린을 분해할 수 있으며, 젤라틴을 액화할 수 있으며, 우레아제 양성이라는 점에서 전자와 상이하고, 카제인을 분해할 수 없으며 37℃에서 서서히 생장한다는 점에서 후자와 상이하다. 따라서, 본 균주는 플라보박테리움속에 속하는 세균으로 동정되었으며 플라보박테리움종 SA-0082라 명명되었다.
상기 균주는 플라보박테리움종 SA-0082라 명명되며 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (주소: 일본 이바라키겐 305 츠쿠바시 히가시 1 초메 1반 3고)에 1995년 3월 29일자로 수탁번호 FERM P-14872로 및 전술한 바와 같이 National Institute of Bioscience and Human-Technology에 수탁번호 FERM BP-5402로 기탁되었다(1996년 2월 15일자로 국제기탁기관으로의 이관 청구되었다)
본 발명의 제 2 발명에 사용될 균주 배양용 배지에 첨가될 영양분은 사용된 균주가 이러한 영양분을 이용하여 본 발명의 제 2 발명의 엔도-퓨코이단-리아제를 생성할 수 있는 한 제약이 없다. 탄소원의 적절한 예에는 퓨코이단, 해조류 분말, 알긴산, 퓨코스, 글루코스, 만니톨, 글리세롤, 사카로스, 말토스, 락토스 및 전분이 포함되는 반면에, 질소원의 적절한 예에는 효모 추출물, 펩톤, 카사미노산, 옥수수 침출액, 육류 추출액, 탈지 대두, 황산암모늄 및 염화암모늄이 포함된다. 배지는 무기물질과 나트륨 염, 인산염, 칼륨염, 마그네슘염 및 아연염과 같은 금속염을 추가로 함유할 수 있다.
본 균주는 또한 해수 또는 전술한 영양소를 함유하는 인공 해수에서도 잘 성장한다.
본 발명의 제 2 발명의 엔도-퓨코이단-리아제를 생성하는 균주의 배양시, 효소의 수율은 배양 조건에 따라 다양하다. 일반적으로, 배양온도는 15 내지 30℃ 범위이고 배지의 pH는 5 내지 9 범위인 것이 바람직하다. 엔도-퓨코이단-리아제의 수율은 균주를 호기조건 및 교반하에 5 내지 72 시간 동안 배양함으로써 최대가 달성된다. 당연한 일로서, 배양조건은 최대 수율이 달성되도록 사용된 균주, 배지 조성 등에 따라 적절히 선택된다.
본 발명의 제 2 발명의 엔도-퓨코이단-리아제는 세포 및 세포 상등액 모두에 함유되어 있다.
전술한 플라보박테리움종 SA-0082를 적절한 배지중에 배양하고 세포를 수거하여 초음파처리와 같은 세포 파괴에 통상적으로 사용되는 수단에 의하여 붕괴시킨다. 이에 따라, 무세포 추출물이 수득될 수 있다.
계속해서, 추출물을 당해 분야에 통상적으로 사용되는 정제수단으로 정제하며 이에 따라 정제된 효소 제제가 생성된다. 예를 들면, 정제는 염석, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 결합 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 등에 의하여 수행될 수 있으며 이에 따라 어떠한 퓨코이단 분해 효소도 함유하지 않는 본 발명의 제 2 발명의 정제된 엔도-퓨코이단-리아제가 수득된다.
전술한 배양 배지로부터 세포를 제거함으로써 수득된 배양 상등액도 다량의 이러한 효소(외세포 효소)를 함유하며 이는 내세포 효소 정제에 사용된 동일한 수단에 의하여 정제시킬 수 있다.
본 발명의 제 2 발명의 엔도-퓨코이단-리아제는 다음과 같은 화학적 및 물리적 특성을 띤다. 외세포 효소는 분자량을 제외하고는 특성에 있어서 내세포 효소와 동일하다.
(I) 퓨코이단에 작용하여 적어도 화학식 7 및 8로 표현되는 당 화합물의 방출 유도.
(II) 최적 pH값: pH 6 내지 10 (도 37).
즉, 도 37은 상기 효소의 상대 활성과 pH값간의 관계 예시 그래프도이며 종좌표는 상대 활성(%)을 나타내고 횡좌표는 pH값을 나타낸다.
(III) 최적 온도: 30 내지 40℃(도 38).
즉, 도 38은 상기 효소의 상대 활성과 온도간의 관계 예시 그래프도이며 종좌표는 상대 활성(%)을 나타내고 횡좌표는 온도를 나타낸다.
(IV) pH 안정성: pH 6 내지 11.5 범위내에서 안정(도 39).
즉, 도 39는 처리시 상기 효소의 잔류 활성과 pH값간의 관계 예시 그래프도이며 종좌표는 잔류 활성(%)을 나타내고 횡좌표는 pH값을 나타낸다.
(V) 온도 안정성: 약 30℃ 이하의 온도에서 안정(도 40).
즉, 도 40은 처리시의 상기 효소의 잔류 활성과 온도간의 관계 예시 그래프도이며 종좌표는 잔류 활성(%)을 나타내고 횡좌표는 온도를 나타낸다.
(VI) 분자량: 세파크릴 S-200(Pharmacia 제조)을 사용하여 겔 여과로 측정한 상기 효소의 분자량은 균주 플라보박테리움종 SA-0082의 외세포 효소의 경우 약 70,000 또는 상기 균주의 내세포 효소의 경우 약 460,000이다.
(VII) 효소 활성 측정 방법
본 발명의 제 2 발명의 엔도-퓨코이단-리아제의 활성은 다음과 같이 측정한다.
젤마니엘라 크래시폴리아(Kjellmaniella crassifolia) 기원의 퓨코이단 2.5% 용액 50㎕, 본 발명의 제 2 발명의 엔도-퓨코이단-리아제 10㎕ 및 667mM의 염화나트륨 함유 83mM 포스페이트 완충액(pH 7.5) 60㎕를 함께 혼합하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킨다. 이어서, 105㎕의 반응 혼합물을 2ml의 물과 교반하에 혼합하고 흡광도(AT)를 230nm에서 측정한다. 대조군으로서, 본 발명의 제 2 발명의 엔도-퓨코이단-리아제를 효소를 용해시키는데 단독으로 사용된 전술한 완충액으로 대체하는 것을 제외하고는 동일 방법에 의하여 제조된 반응 혼합물 및 퓨코이단 용액을 물만으로 대체한 것을 제외하고는 동일 방법에 의하여 제조된 다른 하나의 반응 혼합물을 사용하여 이들의 흡광도(AB1 및 AB2)를 측정한다.
만노스와 우론산간의 글리코사이드 결합 1μmol이 1분안에 배타적으로 절단될 수 있는 효소의 양을 1U로 언급한다. 이렇게 절단된 결합은 제거 반응에서 형성되는 불포화 우론산의 mmol 분자 흡광계수를 5.5로서 취함으로써 측정된다. 효소의 활성은 하기 공식에 따라 측정된다:
활성(U/ml) =
(AT - AB1 - AB2) x 2.105 x 120/(5.5 x 105 x 0.01 x 180) ;
2.105 : 흡광도를 측정하고자 하는 샘플의 용적(ml).
120 : 효소 반응 혼합물의 용적(㎕),
5.5 : 불포화 우론산의 230 nm에서의 mmol 분자 흡광계수(/mM),
105 : 희석에 사용된 반응 혼합물의 용적(㎕),
0.01 : 효소의 용적(㎖), 및
180 : 반응 시간(분).
단백질은 280nm에서 효소 용액의 흡광도를 측정하고 1mg/ml 단백질 용액의 흡광도를 1.0으로서 취함으로써 계산된다.
본 발명자들은 본 발명의 제 2 발명의 엔도-퓨코이단-리아제의 작용 메커니즘을 다음과 같이 측정하였다:
(1) 젤마니엘라 크래시폴리아 퓨코이단의 제조
건조 젤마니엘라 크래시폴리아를 프리밀 모델 M-2 (Nara Kikai Seisakusho 제조)로 분쇄하여 10배량의 85% 메탄올로 70℃에서 2 시간 동안 처리한다. 이어서, 이를 여과하고 잔사를 추가로 10배 분량의 메탄올로 70℃에서 2 시간 동안 처리한다. 여과한 후, 20배 분량의 물을 잔사에 가한다. 이어서, 혼합물을 100℃에서 3 시간 동안 처리하고 여과하여 추출물을 수득한다. 추출물의 염 농도는 염화나트륨의 400mM 용액의 것과 동일 수준으로 조정된다. 이어서, 세틸피리디늄 클로라이드를 침전물이 더 이상 형성되지 않을 때까지 가한다. 원심분리 후, 침전물을 에탄올로 철저히 세척하여 세틸피리디늄 클로라이드를 완전히 제거시킨다. 차후에, 이를 탈염시키고 한외여과기(한외여과막의 배제 분자량: 100,000, Amicon 제조)를 사용함으로써 저분자량 물질을 제거한다. 이렇게 하여 형성된 침전물을 원심분리로 제거한다. 상등액을 동결건조하여 정제된 젤마니엘라 크래시폴리아 퓨코이단을 수득한다. 산물의 수율은 건조 젤마니엘라 크래시폴리아 분말의 중량을 기준으로 약 4%이다.
(2) 엔도-퓨코이단-리아제에 의한 퓨코이단의 분해 및 분해 산물의 정제
젤마니엘라 크래시폴리아 기원의 정제된 퓨코이단을 본 발명의 제 2 발명의 엔도-퓨코이단-리아제로 처리하여 다량의 분해 산물을 수득한다.
즉, 젤마니엘라 크래시폴리아 기원의 퓨코이단 5% 용액 600㎖, 100mM 포스페이트 완충액(pH 8.0) 750㎖, 4M 염화나트륨 150㎖ 및 본 발명의 엔도-퓨코이단-리아제 1750 mU/㎖ 용액 3.43㎖를 함께 혼합하여 25℃에서 144 시간 동안 반응시킨다.
이어서, 반응 혼합물을 세공 크기가 3500인 투석막을 사용하여 투석하고 분자량이 3500 이하인 분획을 취한다. Micro Acilyzer G3 (Asahi Chemical Industry Co., Ltd. 제조)로 탈염한 후, 이러한 분획을 DEAE-세파로스 FF로 9개의 분획 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)로 분배한다. 도 41은 이의 용출 패턴을 도시하며, 여기에서 횡좌표는 분획 번호를 나타내고, 좌측 종좌표 및 폐쇄원은 페놀-황산법으로 측정하고 480nm에서의 흡광도로 표현한 샘플의 당 함량을 나타내며, 우측 종좌표 및 개방원은 235nm에서의 흡광도로 표현한 샘플의 불포화 글루쿠론산 함량을 나타내며, 최우측 종좌표 및 점선은 용출물중의 암모늄 아세테이트 농도(M)를 나타낸다. 분획의 분획 번호는 각각 다음과 같다: (a) : 42 내지 43, (b) : 84 내지 91, (c) : 51 내지 52, (d) : 79, (e) : 102 내지 103, (f) : 62 내지 63, (g): 45, (h) : 75, 및 (i) : 77.
분획 (h) 및 (i)와 관련하여, 전술한 분획 64번 내지 78번을 합하여 DEAE-세파로스 FF로 재정제한다. 도 42는 이의 용출 패턴을 도시하며, 여기에서 횡좌표는 분획 번호를 나타내고, 좌측 종좌표 및 폐쇄원은 페놀-황산법으로 측정하고 480nm에서의 흡광도로 표현한 샘플의 당 함량을 나타내며, 우측 종좌표 및 개방원은 235nm에서의 흡광도로 표현한 샘플의 불포화 글루쿠론산 함량을 나타내며, 최우측 종좌표 및 점선은 용출물중의 암모늄 아세테이트 농도(M)를 나타낸다. 분획의 분획 번호는 각각 다음과 같다: (h): 92 내지 96, 및 (i): 99 내지 103.
(3) 효소 반응 산물의 구조 분석
각 분획의 균일성 확인
전술한 9개의 분획 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i) 각각의 부분은 GlycoTAG 및 GlycoTAG 시약 키트(각각 Takara Shuzo Co., Ltd. 제조)를 사용하여 환원성 말단에서 피리딜-(2)-아민화(PA)되어 PA 사카라이드 (PA-a), (PA-b), (PA-c), (PA-d), (PA-e), (PA-f), (PA-g), (PA-h) 및 (PA-i)를 수득하며 이어서 이들을 HPLC로 분석한다. 따라서, (PA-a), (PA-b), (PA-c), (PA-d), (PA-e), (PA-f), (PA-g), (PA-h) 및 (PA-i) 각각은 균일한 물질이다.
HPLC는 하기 조건하에서 수행된다.
장비: 모델 L-6200 (Hitachi, Ltd. 제작).
컬럼: L-컬럼(4.6 x 250 mm) [Kagaku Yakuhin Kensa Kyokai (Foundation)]
용출제: 화학식 (7), (8) 및 (9)의 물질[즉, (PA-a), (PA-b) 및 (PA-c)]에 대해 50mM 아세트산-트리에틸아민 (pH 5.5);
화학식 (10), (12), (13) 및 (15)의 물질[즉, (PA-d), (PA-f), (PA-g) 및 (PA-i)]에 대해서 100mM 아세트산-트리에틸아민(pH 5) ;
상기 화학식(11)의 물질[즉, (PA-e)]에 대하여 0 내지 10분까지는 200 mM 아세트산-트리에틸아민(pH 3.8) 및 10분 내지 60분까지는 200mM 아세트산-트리에틸아민(pH 3.8) 및 0.5% 테트라하이드로퓨란을 함유하는 200 mM 아세트산-트리에틸아민((pH 3.8)(전자 : 후자는 100 : 0 내지 20 : 80 직선비로 변화); 및 화학식(14)의 물질[즉, (PA-e)]에 대해 0 내지 60분까지는 200mM 아세트산-트리에틸아민 (pH 3.8) 및 0.5%의 테트라하이드로퓨란을 함유하는 200 mM 아세트산-트리에틸아민 (pH 3.8)(전자 : 후자는 80 : 20 내지 50 : 50 직선비로 변화).
검출: 형광측정 검출기 F-1150 (Hitachi, Ltd. 제작), 흡광 파장: 320nm, 형광 파장: 400nm.
유속: 1ml/분
컬럼 온도: 40℃.
효소반응 산물의 환원성 말단 당 및 중성 당 조성물의 분석
PA-당 (PA-a), (PA-b), (PA-c), (PA-d), (PA-e), (PA-f), (PA-g), (PA-h) 및 (PA-i) 각각을 4N 염산으로 100℃에서 3 시간 동안 처리하여 가수분해하고 환원성 말단 당을 HPLC로 검사한다.
뒤 이어서, 이들 가수분해물의 환원성 말단을 GlycoTAG 및 GlycoTAG 시약 키트(각각 Takara Shuzo Co., Ltd. 제조)를 사용하여 피리딜-(2)-아민화(PA)시키고 중성 당 조성물을 HPLC로 분석한다. HPLC는 하기 조건하에서 수행된다.
장비: 모델 L-6200 (Hitachi, Ltd. 제작).
컬럼: PALPAK Type A(4.6 mm x 150 mm, Takara Shuzo, Co., Ltd. 제작).
용출제: 700 mM 보레이트 완충액 (pH 9.0); 아세토니트릴 = 9 : 1.
검출: 형광측정 검출기 F-1150 (Hitachi, Ltd. 제작), 흡광 파장: 310nm, 형광 파장: 380nm.
유속: 0.3ml/분, 및
컬럼 온도: 65℃.
결과적으로, (PA-a), (PA-b), (PA-c), (PA-d), (PA-e), (PA-f), (PA-g), (PA-h) 및 (PA-i) 모두는 환원성 말단 당으로서 만노스를 운반한다. 중성 당 조성물과 관련하여, (PA-a), (PA-b), (PA-c), (PA-e), (PA-f) 및 (PA-i)는 만노스와 퓨코스를 동몰량으로 함유하는 반면에 (PA-d)는 만노스와 퓨코스를 2 : 1 비로 함유한다.
(PA-g) 및 (PA-h) 각각은 환원성 말단 당으로서 갈락토스를 운반한다. 중성 당 조성물과 관련하여, (PA-g)는 갈락토스와 퓨코스를 1 : 2로 함유하는 반면에 (PA-h)는 갈락토스와 퓨코스를 2 : 1로 함유한다.
더욱이, 구성당의 하나인 만노스의 형태를 하기의 방식으로 검사한다. F-키트 글루코스/프럭토스 및 포스포만노스 이소머라제 (각각 Boehringer Mannheim-Yamanouchi 제조)를 사용함으로써, D-만노스만이 측정될 수 있는 반응 시스템은 제조업자의 설명에 따라 제작한다. 이와는 별도로, 당 화합물(a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (i) 100μ 분량을 각각 2N 염산으로 100℃에서 3 시간 동안 가수분해하고, 중화한 후 이 반응 시스템내에서 측정한다. 결과적으로, D-만노스는 당 화합물 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (i) 모두로부터 검출된다. 따라서, 당 화합물 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (i) 모두 구성당으로서 D-만노스를 함유하는 것으로 밝혀졌다.
또한, (g) 및 (h)의 구성당의 하나인 갈락토스의 형태를 D-갈락토스만이 검출될 수 있는 F-키트 락토스/갈락토스(Boehringer Mannheim-Yamanouchi 제조)를 사용하여 검사한다. 즉, (g) 및 (h) 100㎍ 분량을 각각 2N 염산으로 100℃에서 3 시간 동안 가수분해하고, 중화한 후 이 반응 시스템안에서 측정을 수행한다. 결과적으로, 갈락토스는 (g) 및 (h)로부터 검출된다. 따라서, (g) 및 (h) 모두 구성당으로서 D-갈락토스를 함유하고 있음이 증명된다.
더욱이, 또 다른 하나의 구성당인 퓨코스의 형태를 하기 방식으로 검사한다. 문헌[참조: Clinical Chemistry, 36, 474-476 (1990)]에 기술된 방법에 따라, 전술한 화합물(a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i) 100㎍ 분량을 2N 염산으로 100℃에서 3 시간 동안 가수분해하고, 중화한 후, D-퓨코스가 아니라 L-퓨코스만이 검출될 수 있는 본 반응 시스템내에서 측정을 수행한다. 결과적으로, L-퓨코스가 당 화합물 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)로부터 검출된다.
효소반응 산물의 분자량 분석
이어서, 당 화합물 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)를 API-III 질량 스펙트로그래피(Perkin-Elmer Science 제조)를 사용하여 질량 분광분석한다. 이에 따라, 이들 물질은 각각 분자량이 564, 724, 1128, 1062, 1448, 644, 632, 1358 및 1288인 것으로 밝혀졌다. (b) 및 (c)에 있어서, 2가 음이온은 주요 시그널을 형성한다. 1가 이온, 나트륨이 결합된 1가 이온 및 2가 이온이 (d)로부터 검출된다. 나트륨 이온이 결합되어 있는 2가 이온, 3개의 나트륨 이온이 결합되어 있는 3가 이온, 나트륨 이온이 결합되어 있는 4가 이온 등이 (e)에서 검출된다. 2개의 나트륨 이온이 결합되어 있는 1가 이온이 (f)로부터 검출된다. 1가 이온, 나트륨이 결합되어 있는 1가 이온 및 2가 이온이 (g)로부터 검출된다. 각각 4개, 3개, 2개 및 1개의 나트륨 이온 등을 갖는 1가, 2가, 3가 및 4가 이온은 (h)에서 검출된다. 2개의 설페이트 그룹이 제거되고 나트륨 이온이 결합되어 있는 1가 이온 및 2개의 설페이트 그룹이 제거된 2가 이온이 (i)에서 검출된다.
네가티브 방식의 질량-질량 (MS/MS) 분광측정술에 의하여, 1가 설페이트 이온(분자량 97), 물 분자 및 수소 이온이 불포화 헥슈론산으로부터 제거된 1가 이온(분자량 157), 수소 이온이 불포화 헥슈론산으로부터 제거된 1가 이온(분자량 175), 물 분자 및 수소 이온이 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 225), 수소 이온이 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 243), 물 분자 및 수소 이온이 만노스와 결합된 불포화 헥슈론산으로부터 제거된 1가 이온(분자량 319), 및 수소 이온이 만노스와 결합된 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 405)이 (a)에서 검출된다.
네가티브 방식의 MS/MS 분광측정술에 의하여, 1가 설페이트 이온(분자량 97), 수소 이온이 불포화 헥슈론산으로부터 제거된 1가 이온(분자량 175), 수소 이온이 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 243), 2개의 수소 이온이 설페이트화 만노스와 결합된 불포화 헥슈론산 및 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 2가 이온(분자량 321), 수소 이온이 만노스와 결합된 설페이트화 퓨코스 또는 설페이트화 만노스와 결합된 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 405), 및 수소 이온이 설페이트화 만노스와 결합된 불포화 헥슈론산으로부터 제거된 1가 이온(분자량 417)이 (b)에서 상기와 유사하게 검출된다.
네가티브 방식의 MS/MS 분광측정술에 의하여, 1가 설페이트 이온(분자량 97), 수소 이온이 불포화 헥슈론산으로부터 제거된 1가 이온(분자량 175), 물 분자 및 수소 이온이 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 225), 수소 이온이 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 243), 2개의 수소 이온이 만노스와 결합한 헥슈론산에 결합된 만노스와 결합되어 있는 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 2가 이온(분자량 371), 수소 이온이 만노스와 결합한 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 405), 및 물 및 수소 이온이 설페이트화 퓨코스 및 헥슈론산과 결합한 만노스에 결합된 불포화 헥슈론산으로부터 제거된 1가 이온(분자량 721)이 (c)에서 검출된다.
네가티브 방식의 MS/MS 분광측정술에 의하여, 1가 설페이트 이온(분자량 97), 수소 이온이 불포화 헥슈론산으로부터 제거된 1가 이온(분자량 175), 물 분자 및 수소 이온이 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 225), 수소 이온이 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 243), 수소 이온이 만노스와 결합한 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 405), 및 2개의 설페이트 그룹 및 2개의 수소 이온이 (d)로부터 제거된 2가 이온(분자량 450), 및 설페이트 그룹 및 2개의 수소 이온이 (d)로부터 제거된 2가 이온(분자량 490)이 (d)의 2가 이온에서 검출된다.
네가티브 방식의 MS/MS 분광측정술에 의하여, 1가 설페이트 이온(분자량 97), 물 분자 및 수소 이온이 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 225), 수소 이온이 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 243), 2개의 수소 이온이 디설페이트화 퓨코스로부터 제거되고 여기에 나트륨 이온이 결합된 1가 이온(분자량 345), (e)로부터 2개의 설페이트 그룹이 제거되고, 3개의 나트륨 이온이 결합되었으며 6개의 수소 이온이 제거된 3가 이온(분자량 450), 설페이트 그룹 및 6개의 수소 이온이 (e)로부터 제거되고 여기에 3개의 나트륨 이온이 결합된 3가 이온(분자량 476), 수소 이온이 만노스와 결합된 불포화 헥슈론산 및 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 563), 및 물 분자 및 수소 이온이 설페이트화 만노스와 결합된 불포화 헥슈론산 및 디설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 705)이 (e)에서 검출된다.
네가티브 방식의 MS/MS 분광측정술에 의하여, 1가 설페이트 이온(분자량 97), 수소 이온이 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 243), 및 설페이트화 만노스와 결합한 불포화 헥슈론산으로부터 물 및 2개의 수소 이온이 제거되고 여기에 나트륨 이온이 결합되어 있는 1가 이온(분자량 421)이 (f)에서 검출된다.
네가티브 방식의 MS/MS 분광측정술에 의하여, 수소 이온이 갈락토스와 결합한 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 405) 및 수소 이온이 갈락토스와 결합한 퓨코스에 결합된 설페이트화 퓨코스 또는 갈락토스와 결합한 설페이트화 퓨코스에 결합된 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 551)이 (g)에서 검출된다.
네가티브 방식의 MS/MS 분광측정술에 의하여, 3개의 나트륨 이온이 (h)에 결합되고 5개의 수소 이온이 이로부터 제거된 물질로부터, 1가 설페이트 이온(분자량 97), 물 분자 및 수소 이온이 설페이트화 퓨코스로부터 제거된 1가 이온(분자량 225), 및 수소 이온 및 2개의 설페이트 그룹이 (h)로부터 제거된 1가 이온(분자량 1197)이 검출된다.
네가티브 방식의 MS/MS 분광측정술에 의하여, 2개의 설페이트 그룹및 2개의 수소 이온이 (i)로부터 제거된 2가 이온으로부터, 1가 설페이트 이온(분자량 97) 및 디설페이트화 퓨코스로부터 2개의 수소 이온이 제거되고 여기에 나트륨 이온이 결합된 1가 이온(분자량 345)이 검출된다.
효소반응 산물의 당 조성 분석
질량 분광측정 결과가 지시하는 바와 같이, 당 성분(a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (i)가 자체 분자에 각각 불포화 헥슈론산을 함유할 수 있을 가능성이 높다.
따라서, 하기 실험을 수행하여 이들 효소 반응 산물 각각이 자체 분자안에 불포화 결합을 함유하는 헥슈론산을 함유함을 입증한다. 230 내지 240nm에서의 강력한 흡수는 분자내 불포화 결합에 기인하는 것으로 알려졌다. 따라서, 정제된 올리고사카라이드 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)의 수용액의 흡광도를 230 내지 240 nm에서 측정한다. 결과적으로, (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (i) 각각의 수용액은 강력한 흡수를 보이는 데, 이는 분자내에 불포화 결합이 존재함을 암시한다. 230 내지 240 nm에서의 흡광도는 상기 효소에 의한 큐코이단의 분해가 진행함에 따라 증가한다. 이러한 사실은 상기 효소가 제거반응을 통해서 퓨코이단내 만노스와 헥슈론산 또는 갈락토스와 헥슈론산간의 글리코사이드 결합을 절단함을 강력하게 암시한다.
대부분의 효소 반응산물이 비환원성 말단에 불포화 헥슈론산을 갖고 환원성 말단에 만노스를 함유하는 데, 이는 제조된 퓨코이단이 헥슈론산과 만노스가 교대로 상호 결합되어 이루어진 분자종을 수반함을 암시한다.
주 구성 사카라이드로서 퓨코스를 함유하기 때문에, 퓨코이단은 통상의 폴리사카라이드보다 산에 의해 더 분해되기 쉽다. 한편, 헥슈론산과 만노스의 결합은 산에 비교적 매우 내성인 것으로 알려져 있다. 본 발명자는 문헌[참조: Carbohydrate Research, 125, 283-290 (1984)]에 기술된 방법을 참조로 하여 하기 방식으로, 상호 교대로 결합된 헥슈론산과 만노스로 이루어지고 젤마니엘라 크래시폴리아 기원의 퓨코이단에 함유되어 있는 당 쇄안의 헥슈론산을 동정하고자 시도하였다. 우선, 퓨코이단을 0.3M 옥살산중에 용해시키고 100℃에서 3 시간 동안 처리한다. 이어서, 분자량 분별을 수행하고 분자량이 3,000 이상인 분획을 합한다. 이어서, 음이온 교환 수지로 추가 처리하고 흡착 물질을 수집한다. 이렇게 하여 수득된 물질을 동결건조하고 4N 염산으로 가수분해한다. pH값을 8로 조정한 후, 피리딜-(2)-아민화하고 우론산을 HPLC 분석한다. HPLC는 하기 조건하에서 수행된다.
장비: 모델 L-6200 (Hitachi, Ltd. 제작),
컬럼: PALPAK Type N (4.6 mm x 250 mm, Takara Shuzo, Co., Ltd. 제조),
용출제 : 200 mM 아세트산-트리에틸아민 완충액 (pH 7.3): 아세토니트릴 = 25 : 75;
검출: 형광측정 검출기 F-1150 (Hitachi, Ltd. 제작), 여기 파장: 320 nm, 형광 파장: 400nm,
유속: 0.8㎖/분
컬럼 온도: 40℃.
PA 헥슈론산에 대한 표준으로서, Sigma Chemical Co.에 의하여 제조된 글루쿠론산, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에 의하여 제조된 갈락투론산, Sigma Chemical Co.에 의하여 제조된 4-메틸움벨리페릴-α-L-이듀로니드를 가수분해하여 수득된 이듀론산, 및 알긴산의 가수분해로 수득된 만뉴론산 및 굴루론산(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)을 문헌[참조: Acta Chemica Scandinavicaj, 15, 1397-1398 (1961)]에 기술되어 있는 방법에 따라 피리딜-(2)-아민화하고 이어서, 음이온 교환 수지로 분리함으로써 제조된 것들을 사용한다.
결과적으로, 글루쿠론산만이 퓨코이단의 전술한 분자종내 헥슈론산으로서 함유되어 있음이 밝혀졌다.
더욱이, 상기 분자종의 가수분해물안에 있는 글루쿠론산은 음이온 교환 수지를 사용하여 D-만노스로부터 분리되며 동결건조한다. 이어서, 이의 특이적 회전을 측정한다. 이에 따라, 글루쿠론산이 우선형, 즉 D-글루쿠론산임이 명백해진다.
또한, 젤마니엘라 크래시폴리아 기원의 퓨코이단을 본 발명의 제 2 발명의 엔도-퓨코이단 하이드롤라제로 처리하고 이어서 상기에서와 유사하게 옥살산을 사용하여 가수분해한다. 그러나, D-글루쿠론산과 D-만노스가 상호 교대로 결합된 어떠한 중합체도 발견되지 않았다. 이러한 결과를 토대로하여, 본 발명의 효소가 제거반응을 통해서, D-글루쿠론산과 D-만노스가 상호 교대로 결합되어 이루어진 골격구조를 지닌 분자종을 절단함이 명백해진다.
추가로, 옥살산으로 가수분해하여 수득된 중합체를 NMR 분광측정하여 D-글루쿠론산과 D-만노스의 결합부위 및 글리코사이드 결합의 아노머 배치를 검사한다.
중합체의 수득된 NMR 스펙트럼은 다음과 같다.1H-NMR 스펙트럼에서의 화학적 쉬프트는 트리에틸아민내 메틸 그룹의 화학적 쉬프트를 취함으로써 1.13 ppm으로 표현되는 반면에,13C-NMR 스펙트럼에서의 것들은 트리에틸아민내 메틸 그룹의 화학적 쉬프트를 취함으로써 9.32ppm으로서 표현된다.
1H-NMR(D2O)
δ5.25(1H, br-s, 1-H), 4.32(1H, d, J=7.6Hz, 1′-H), 4.00(1H, br-s, 2-H), 3.71(1H, m, 5′-H), 3.69(1H, m, 5-CH의 H), 3.68(1H, m, 3-H), 3.63(1H, m, 5-CH의 H), 3.63(1H, m, 4′-H), 3.57(1H, m, 4-H), 3.54(1H, m, 3′-H), 3.53(1H, m, 5-H), 3.25(1H, t, J=8.5Hz, 2′-H)
13C-NMR(D2O)
δ175.3(5′-COOH의 C), 102.5(1′-C), 99.6(1-C), 78.5(2-C), 77.9(4′-C), 77.0(3′-C), 76.7(5′-C), 73.9(5-C), 73.7(2′-C), 70.6(3-C), 67.4(4-C), 61.0(5-CH2OH의 C)
피크는 화학식 16에서의 수치값으로 나타낸 위치에 각각 할당될 수 있다.
D-글루쿠론산의 1 위치에서의 배치와 관련하여, 이는 7.6Hz의 근접 결합 상수로 인하여 β-D-글루쿠론산으로서 확인된다.
D-만노스의 1 위치에서의 배치와 관련하여, 이는 5.25 ppm의 화학적 쉬프트로 해서 α-D-만노스로서 확인된다.
구성 당의 결합 방식은 HMBC 방법, 즉,1H-검출 다중 결합 이핵성 다중 양자 간섭 스펙트럼에 의하여 분석된다.
DQF-COSY 및 HOHAHA 방법은1H-NMR 스펙트럼에서의 할당에 사용되는 반면에, HSQC 방법은13C-NMR 스펙트럼에서의 할당에 사용된다.
HMBC 스펙트럼에 있어서, 크로스 피크는 4′-H와 1-C사이와 함께 1-H와 4′-C 사이에서, 및 2-H와 1′-C사이와 함께 1′-H와 2-C 사이에서 관찰된다. 이러한 사실은 D-글루쿠론산이 β 결합을 통하여 D-만노스의 2 위치에 결합되는 반면에 D-만노스는 α 결합을 통하여 D-글루쿠론산의 4 위치에 결합됨을 표시한다.
효소 반응산물내 설페이트 그룹의 결합부위 및 당 결합 방식에 대한 분석
구성당 및 설페이트 그룹의 결합 방식을 검사하기 위하여, 효소 반응 산물은 핵자기 공명 분광측정기 모델 JNM-α500(500Mz; JEOL Ltd. 제작)을 사용하여 NMR 분광측정분석한다. 이렇게 하여 수득된 분석 데이터는 당 화합물 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)이 각각 화학식 (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14) 및 (15)로 표현됨을 나타낸다. 즉, 이렇게 명확해진 사실은 다음과 같다. 당 화합물(a)는 설페이트 그룹이 결합되어 있는 불포화 d-글루쿠론산 및 l-퓨코스가 환원성 말단 잔기인 D-만노스에 결합되는 구조를 취한다. 당 화합물(b)는 2개의 설페이트 그룹이 결합되어 있는 불포화 D-글루쿠론산 및 L-퓨코스가 설페이트 그룹이 결합된 환원성 말단 잔기인 D-만노스에 결합되는 구조를 취한다. 당 화합물 (c)는 설페이트 그룹이 결합된 D-글루쿠론산 및 L-퓨코스가 환원성 말단 잔기인 D-만노스에 결합되고, D-만노스가 D-글루쿠론산 및 불포화 D-글루쿠론산에 추가로 결합되고, 설페이트 그룹이 결합된 L-퓨코스가 D-만노스에 추가로 결합되는 구조를 취한다. 당 화합물(d)는 설페이트 그룹, D-글루쿠론산 및 2개의 설페이트 그룹이 결합된 L-퓨코스가 환원성 말단 잔기인 D-만노스에 결합되고, D-만노스가 D-글루쿠론산에 추가 결합되며, 불포화 D-글루쿠론산이 또한 D-만노스에 결합되는 구조를 취한다. 당 화합물(e)는 설페이트 그룹, D-글루쿠론산 및 2개의 설페이트 그룹이 결합된 L-퓨코스가 환원성 말단 잔기인 D-만노스에 결합되고, 설페이트 그룹이 결합된 D-만노스가 D-글루쿠론산에 추가 결합되며, 2개의 설페이트 그룹이 결합된 L-퓨코스 및 불포화 D-글루쿠론산이 D-만노스에 결합되는 구조를 취한다. 당 화합물(f)는 불포화 D-글루쿠론산 및 설페이트 그룹이 결합된 L-퓨코스가 설페이트 그룹이 결합된 환원성 말단 잔기인 D-만노스에 결합되는 구조를 취한다. 당 화합물(g)는 설페이트 그룹이 결합된 L-퓨코스가 환원성 말단 잔기인 D-갈락토스에 결합되고 설페이트 그룹이 달린 L-퓨코스가 L-퓨코스에 추가로 결합되는 구조를 취한다. 당 화합물(h)는 당쇄 중 하나에서는 설페이트 그룹이 결합된 L-퓨코스가 D-갈락토스에 결합되고 설페이트 그룹이 달린 L-퓨코스가 L-퓨코스에 추가로 결합되고, 반면에 다른 당쇄에서는 설페이트 그룹이 결합된 D-갈락토스가 설페이트 그룹이 결합된 D-갈락토스에 결합되는, 설페이트 그룹이 결합된 환원성 말단 잔기인 D-갈락토스로 개시되는 2개의 측쇄로 이루어진 구조를 취한다. 당 화합물(i)는 설페이트 그룹, D-글루쿠론산 및 설페이트 그룹이 결합된 L-퓨코스가 환원성 말단 잔기인 D-만노스에 결합되고, D-만노스가 D-글루쿠론산에 추가 결합되며, 2개의 설페이트 그룹이 결합된 L-퓨코스 및 불포화 D-글루쿠론산이 D-만노스에 추가로 결합되는 구조를 취한다.
본 발명의 제 1 발명에 포함된 화합물은 퓨코이단을 본 발명의 제 2 발명의 엔도-퓨코이단-리아제로 처리하여 수득된다.
이어서, 화학식 (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14) 및 (15)로 표현된 화합물, 즉, 본 발명의 당 화합물의 예인 당 화합물 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)의 물리적 특성이 기술된다.
도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9는 피리딜-(2)-아민화 당 화합물 (PA-a), (PA-b), (PA-c), (PA-d), (PA-e), (PA-f), (PA-g), (PA-h) 및 (PA-i) 각각의 HPLC 용출 유형을 나타낸다. 각각의 도에서, 종좌표는 상대적인 형광 강도를 나타내고 반면에 횡좌표는 보유 시간(분)을 나타낸다. 또한 도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18은 당 화합물 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), 및 (i) 각각의 질량 스펙트럼을 나타내고, 도 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27은 당 화합물 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), 및 (i) 각각의 질량-질량 스펙트럼을 나타낸다. 각각의 도에서, 종좌표는 상대적인 강도(%)를 나타내고 반면에 횡좌표는 m/z를 나타낸다.
또한, 도 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 및 36은 당 화합물 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), 및 (i) 각각의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 각각의 도에서, 종좌표는 신호 강도를 나타내고 횡좌표는 화학적인 쉬프트(ppm)를 나타낸다.
1H-NMR 스펙트럼의 화학적 쉬프트는 HOD의 화학적 쉬프트를 4.65 ppm으로서 취함으로써 표현한다.
화합물 (a)의 물리적인 성질 :
분자량 : 564
MS m/z : 563 [M-H+]-.
MS/MS m/z : 97 (HSO4]-, 157 [불포화 D-글루쿠론산-H2O-H+]-, 175 [불포화 D-글루쿠론산-H+]-, 225 [설페이트화 L-퓨코스-H2O-H+]-, 243 [설페이트화 L-퓨코스-H+]-, 319 [D-만노스-H2O-H+에 결합한 불포화 D-글루쿠론산]-, 405 [M-불포화 D-글루쿠론산-H+]-, 483 [M-SO3-H+]-.
1H-NMR(D2O)
δ5.78(1H, d, J=3.7Hz, 4-H), 5.26(1H, d, J=1.2Hz, 1-H), 5.12(1H, d, J=4.0Hz, 1'-H), 5.03(1H, d, J=6.1Hz, 1-H), 4.47(1H, d-d, J=3.4, 10.4Hz, 3'-H), 4.21(1H, br-s, 2-H), 4.12(1H, m, 5'-H), 4.10(1H, d-d, J=3.7, 5.8Hz, 3-H), 4.03(1H, d, J=3.4Hz, 4'-H), 3.86(1H, m, 3-H), 3.83(1H, d-d, J=4.0, 10.4Hz, 2'-H), 3.72(1H, m, 4-H), 3.72(1H, m, 5-H), 3.70(2H, m, 5-CH2의 H2), 3.65(1H, d-d, J=5.8, 6.1Hz, 2-H), 1.08(3H, d, J=6.7, 5'-CH3의 H3)
당 조성 :
L-퓨코스 : 불포화 D-글루쿠론산 : D-만노스 = 1 : 1 : 1 (각각 1 분자).
설페이트 그룹 :
1 분자 (L-퓨코스의 3 위치에서).
1H-NMR 스펙트럼에서 피크는 각각 하기 화학식 17의 수치에 의해 나타낸 위치로 지정할 수 있다:
화합물(b)의 물리적인 성질 :
분자량 : 724
MS m/z : 723 [M-H+]-, 361 [M-2H+]2-.
MS/MS m/z : 97 [HSO4]-, 175 [불포화 D-글루쿠론산-H+]-, 321 [M-SO3-2H+]2-, 405 [M-불포화 D-글루쿠론산-2SO3-H+]-, 417 (M-L-퓨코스-2SO3-H+]-.
1H-NMR(D2O)
δ5.66(1H, d, J=3.4Hz, 4-H), 5.27(1H, d, J=7.3Hz, 1-H), 5.25(1H, d, J=1.8Hz, 1-H), 5.21(1H, d, J=3.7Hz, 1'-H), 4.50(1H, d, J=3.1Hz, 4'-H), 4.32(1H, q, J=6.7Hz, 5'-H), 4.27(1H, d-d, J=3.7, 10.4Hz, 2'-H), 4.21(1H, d-d, J=3.4, 6.7Hz, 3-H), 4.18(1H, d-d, J=1.8, 11.0Hz, 5-CH의 H), 4.15(1H, br-s, 2-H), 4.10(1H, d-d, J=5.8, 11.0Hz, 5-CH의 H), 3.99(1H, d-d, J=3.1, 10.4Hz, 3'-H), 3.90(1H, m, 5-H), 3.82(1H, m, 3-H), 3.82(1H, m, 4-H), 3.54(1H, br-t, J=7.3Hz, 2-H), 1.11(3H, d, J=6.7Hz, 5'-CH3의 H3)
당 조성 :
L-퓨코스: 불포화 D-글루쿠론산 : D-만노스 = 1 : 1 : 1 (각각 1 분자).
설페이트 그룹 :
3 분자(L-퓨코스의 2- 및 4- 위치에서 및 D-만노스의 6-위치에서).
1H-NMR 스펙트럼에서 피크는 하기의 화학식 18의 수치에 의해 나타낸 위치로 각각 지정할 수 있다.
화합물(c)의 물리적 성질 :
분자량 : 1128.
MS m/z : 1127 [M-H+]-.
MS/MS m/z : 97 [HSO4]-, 175 [불포화 D-헥슈론산-H+]-, 225 [설페이트화 L-퓨코스-H2O-H+]-, 243 [설페이트화 L-퓨코스-H+]-, 371 [M-불포화 D-글루쿠론산-L-퓨코스-SO3-2H+]2-, 405 (D-만노스-H+에 결합한 설페이트화 L-퓨코스]-, 721[M-D-만노스-L-퓨코스-SO3-H2O-H+]-.
1H-NMR(D2O)
δ5.69(1H, d, J=3.7Hz, (4)-H), 5.34(1H, s, (1)-H), 5.16(1H, s, 1-H), 5.10(1H, d, J=4.0Hz, (1)'-H), 5.05(1H, d, J=3.7Hz, 1'-H), 4.93(1H, d, J=6.4Hz, (1)-H), 4.50(1H, d-d, J=3.4, 10.7Hz, 3'-H), 4.47(1H, d-d, J=3.4, 10.4Hz, (3)'-H), 4.39(1H, d, J=7.9Hz, 1-H), 4.33(1H, br-s, (2)-H), 4.14(1H, m, 2-H), 4.12(1H, m, (3)-H), 4.12(1H, m, 5'-H), 4.12(1H, m, (5)'-H), 4.04(1H, m, 4'-H), 4.03(1H, m, (4)'-H), 3.85(1H, m, 2'-H), 3.85(1H, m, (2)'-H), 3.82(1H, m, 3-H), 3.82(1H, m, (3)-H), 3.73(1H, m, 4-H), 3.73(1H, m, 5-H), 3.73(1H, m, (4)-H), 3.70(2H, m, 5-CH2의 H2), 3.70(2H, m, (5)-CH2의 H2), 3.67(1H, m, 5-H), 3.62(1H, m, 4-H), 3.62(1H, m, (2)-H), 3.62(1H, m, (5)-H), 3.51(1H, t, J=8.9Hz, 3-H), 3.28(1H, t, J=7.9HZ, 2-H), 1.09(3H, d, J=6.7Hz, (5)'-CH3의 H3), 1.07(1H, d, J=6.7Hz, 5'-CH3의 H3)
당 조성 :
L-퓨코스 : 불포화 D-글루쿠론산 : D-글루쿠론산 : D-만노스 = 2 : 1 : 1 : 2 (L-퓨코스 및 D-만노스: 각각 2 분자, 불포화 D-글루쿠론산 및 D-글루쿠론산: 각각 1 분자).
설페이트 그룹:
2 분자(L-퓨코스의 3- 위치에서).
1H-NMR 스펙트럼에서 피크는 하기의 화학식 19의 수치에 의해 나타낸 위치로 각각 지정할 수 있다.
화합물(d)의 물리적 성질 :
분자량 : 1062.
MS m/z : 1061 [M-H+]-.
MS/MS m/z : 97 [HSO4]-, 175 [불포화 헥슈론산-H+]-, 225 [설페이트화 L-퓨코스-H2O-H+]-, 243 [설페이트화 L-퓨코스-H+]-, 405 [D-만노스-H+에 결합한 설페이트화 L-퓨코스]-또는 [설페이트화 D-만노스-H+에 결합한 L-퓨코스]-, 450 [M-2SO3-2H+]2-, 490 [M-SO3-2H+]2-.
1H-NMR(D2O)
δ5.67(1H, d, J=3.7Hz, (4)-H), 5.32(1H, br-s, (1)-H), 5.17(1H, d, J=3.5Hz, 1'-H), 5.17(1H, br-s, 1-H), 4.93(1H, d, J=6.4Hz, (1)-H), 4.71(1H, m, 1-H), 4.53(1H, d, J=3.4Hz, 4'-H), 4.33(1H, q, J=6.7Hz, 5'-H), 4.28(1H, d-d, J=3.5, 11.0Hz, 2'-H), 4.18(1H, m, 5-CH2의 H), 4.13(1H, m, (2)-H), 4.12(1H, m, (3)-H), 4.08(1H, m, 5-CH2의 H), 4.07(1H, m, 2-H), 3.98(1H, d-d, J=3.4, 11.0, 3'-H), 3.88(1H, m, 5-H), 3.82(1H, m, 4-H), 3.78(1H, m, 3-H), 3.78(1H, m, 4-H), 3.78(1H, m, (3)-H), 3.67(2H, m, (5)-CH2의 H2), 3.63(1H, m, (2)-H), 3.60(1H, m, 3-H), 3.59(1H, m, 5-H), 3.57(1H, m, (4)-H), 3.57(1H, m, (5)-H), 3.16(1H, t, J=7.9Hz, 2-H), 1.10(3H, d, J=6.7Hz, 5'-CH3의 H3)
당 조성 :
L-퓨코스 : 불포화 D-글루쿠론산 : D-글루쿠론산 : D-만노스 = 1 : 1 : 1 : 2 (L-퓨코스, 불포화 D-글루쿠론산 및 D-글루쿠론산: 각각 1 분자, D-만노스: 2 분자).
설페이트 그룹:
3 분자(L-퓨코스의 2- 및 4- 위치와 D-만노스의 환원성 말단 부위의 6-위치에서).
1H-NMR 스펙트럼에서 피크는 하기의 화학식 20의 수치에 의해 나타낸 위치로 각각 지정할 수 있다.
화합물(e)의 물리적 성질 :
분자량 : 1448.
MS m/z : 767 [M+4Na+-6H+]2-, 503.7 [M+3Na+-6H+]3-및 366.5 [M+Na+-5H+]4-.
MS/MS m/z : 97 [HSO4]-, 225 [설페이트화 L-퓨코스-H2O-H+]-, 243 [설페이트화 L-퓨코스-H+]-, 345 [디설페이트화 L-퓨코스+Na+-2H+]-, 450 [M+3Na+-2SO3-6H+]3-, 477 [M+3Na+-SO3-6H+]3-, 563 [D-만노스-H+에 결합한 불포화 D-글루쿠론산 및 설페이트화 L-퓨코스]-또는 [설페이트화 D-만노스-H+에 결합한 불포화 D-글루쿠론산 및 L-퓨코스]-, 705 [설페이트화 D-만노스-H2O-H+에 결합한 불포화 D-글루쿠론산 및 디설페이트화 L-퓨코스]-.
1H-NMR(D2O)
δ5.58(1H, d, J=3.4Hz, (4)-H), 5.35(1H, br-s, (1)-H), 5.22(1H, d, J=6.7Hz, (1)-H), 5.19(1H, d, J=3.7Hz, 1'-H), 5.19(1H, d, J=3.7Hz, (1)'-H), 5.16(1H, d, J=1.8Hz, 1-H), 4.62(1H, d, J=7.6Hz, 1-H), 4.50(1H, m, 4'-H), 4.50(1H, m, (4)'-H), 4.30(1H, m, 5'-H), 4.30(1H, m, (5)'-H), 4.30(1H, m, (5)-CH2의 H), 4.25(1H, m, 2'-H), 4.25(1H, m, (2)-H), 4.25(1H, m, (2)'-H), 4.20(1H, m, (5)-CH2의 H), 4.18(1H, m, 5-CH2의 H), 4.16(1H, m, (3)-H), 4.08(1H, m, 5-CH2의 H), 4.07(1H, m, 2-H), 4.02(1H, m, 3'-H), 4.02(1H, m, (3)'-H), 3.85(1H, m, 5-H), 3.85(1H, m, (5)-H), 3.78(1H, m, 3-H), 3.78(1H, m, (3)-H), 3.76(1H, m, 4-H), 3.76(1H, m, 5-H), 3.75(1H, m, 4-H), 3.75(1H, m, (4)-H), 3.58(1H, m, 3-H), 3.55(1H, m, (2)-H), 3.18(1H, t, J=8.2Hz, 2-H), 1.10(3H, d, J=6.7Hz, (5)'-CH3의 H3), 1.09(3H, d, J=6.7Hz, 5'-CH3의 H3)
당 조성 :
L-퓨코스 : 불포화 D-글루쿠론산 : D-글루쿠론산 : D-만노스 = 2 : 1 : 1 : 2 (L-퓨코스와 D-만노스산: 각각 2 분자, 불포화 D-글루쿠론산 및 D-글루쿠론산: 각각 1 분자).
설페이트 그룹:
6 분자(각각의 L-퓨코스의 2- 및 4- 위치와 각각의 D-만노스의 6-위치에서).
1H-NMR 스펙트럼에서 피크는 하기의 화학식 21의 수치에 의해 나타낸 위치로 각각 지정할 수 있다.
화합물(f)의 물리적 성질 :
분자량 : 644.
MS m/z : 687 [M+2Na+-3H+]-.
MS/MS m/z : 97 [HSO4]-, 243 [설페이트화 L-퓨코스-H+]-, 421 [설페이트화 D-만노스+Na+-H2O-2H+에 결합한 불포화 D-글루쿠론산]-.
1H-NMR(D2O)
δ5.60(1H, d, J=3.4Hz, 4-H), 5.24(1H, br-s, 1-H), 5.08(1H, d, J=4.0Hz, 1'-H), 4.94(1H, d, J=6.7Hz, 1-H), 4.45(1H, d-d, J=3.1, 10.4Hz, 3'-H), 4.20(1H, br-s, 2-H), 4.14(2H, m, 5-CH2의 H2), 4.14(1H, m, 5'-H), 4.09(1H, m, 3-H), 4.01(1H, d, J=3.1Hz, 4'-H), 3.91(1H, m, 5-H), 3.85(1H, m, 3-H), 3.85(1H, m, 2'-H), 3.75(1H, t, J=9.8Hz, 4-H), 3.59(1H, t, J=6.7Hz, 2-H), 1.06(3H, d, J=6.4Hz, 5'-CH3의 H3)
당 조성 :
L-퓨코스 : 불포화 D-글루쿠론산 : D-만노스 = 1 : 1 : 1 (L-퓨코스, D-만노스 및 불포화 D-글루쿠론산: 각각 1 분자).
설페이트 그룹:
2 분자(L-퓨코스의 3- 위치와 D-만노스의 6-위치에서).
1H-NMR 스펙트럼에서 피크는 하기의 화학식 22의 수치에 의해 나타낸 위치로 각각 지정할 수 있다.
화합물(g)의 물리적 성질 :
분자량 : 632.
MS m/z : 631 [M-H+]-.
MS/MS m/z : 405 [D-갈락토스-H+에 결합한 설페이트화 L-퓨코스]-, 551 [D-갈락토스-H+에 결합한 설페이트화 L-퓨코스에 결합한 L-퓨코스]-또는 [D-갈락토스-H+에 결합한 L-퓨코스에 결합한 설페이트화 L-퓨코스]-또는 [M-SO3-H+]-.
1H-NMR(D2O)
δ5.15(1H, d, J=4.3Hz, F11-H), 4.93(1H, d, J=3.7Hz, F21-H), 4.53(1H, d-d, J=2.4, 10.4Hz, F13-H), 4.49(1H, d, J=7.6Hz, G11-H), 4.46(1H, d-d, J=3.1, 10.7Hz, F23-H), 4.36(1H, q, J=6.7Hz F25-H), 4.14(1H, q, J=6.7Hz F15-H), 4.09(1H, d, J=2.4Hz F14-H), 4.03(1H, d, J=3.1Hz F24-H), 3.97(1H, d-d, J=4.3, 10.4Hz, F12-H), 3.90(1H, br-s, G14-H), 3.81(1H, d-d, J=3.7, 10.7Hz, F22-H), 3.59(1H, m, G13-H), 3.59(1H, m, G15-H), 3.59(2H, m, G15-CH2의 H2), 3.56(1H, m, G12-H), 1.19(3H, d, J=6.7Hz, F15-CH3의 H3), 1.14(3H, d, J=6.7Hz, F25-CH3의 H3)
당 조성 :
L-퓨코스 : D-갈락토스 = 2 : 1 (2개의 L-퓨코스 분자와 1개의 D-갈락토스 분자).
설페이트 그룹:
2 분자(각각의 L-퓨코스의 3- 위치에서).
1H-NMR 스펙트럼에서 피크는 하기의 화학식 23의 수치에 의해 나타낸 위치로 각각 지정할 수 있다.
화합물(h)의 물리적 성질 :
분자량 : 1358.
MS m/z : 1445 [M+4Na+-5H+]-.
MS/MS m/z : 97 [HSO4]-, 225 [설페이트화 L-퓨코스-H2O-H+]-, 1197 [M-2SO3-H+]-.
1H-NMR(D2O)
δ5.19(1H, d, J=4.3Hz, F11-H), 4.93(1H, d, J=3.7Hz, F21-H), 4.62(1H, m, G21-H), 4.59(1H, m, G11-H), 4.54(1H, d-d, J=2.7, 10.6Hz, F13-H), 4.46(1H, m, F23-H), 4.46(1H, d, J=7.6Hz G31-H), 4.41(1H, br-s, G14-H), 4.41(1H, d, J=7.6Hz G41-H), 4.37(1H, q, J=6.4Hz F25-H), 4.27(1H, m, G13-H), 4.24(1H, br-s, G34-H), 4.21(1H, m, G33-H), 4.19(1H, m, G43-H), 4.15(1H, br-s, G44-H), 4.13(1H, q, J=6.7Hz, F15-H), 4.09(1H, d, J=2.7Hz, F14-H), 4.04(1H, d, J=2.8Hz, F24-H), 3.98(1H, m, G15-CH2의 H), 3.96(1H, d-d, J=4.3, 10.6Hz, F12-H), 3.88(1H, br-s, G24-H), 3.93(1H, m, G35-CH2의 H), 3.86(1H, m, G15-H), 3.81(1H, m, F22-H), 3.81(1H, m, G15-CH2의 H), 3.80(1H, m, G35-H), 3.80(1H, m, G35-CH2의 H), 3.66(1H, m, G23-H), 3.65(1H, m, G12-H), 3.64(1H, m, G25-CH2의 H), 3.64(1H, m, G45-CH2의 H), 3.61(1H, m, G45-H), 3.58(1H, m, G22-H), 3.56(1H, m, G25-CH2의 H), 3.56(1H, m, G45-CH2의 H), 3.55(1H, m, G42-H), 3.54(1H, m, G25-H), 3.54(1H, m, G32-H), 1.20(3H, d, J=6.7Hz, F15-CH3의 H3), 1.14(3H, d, J=6.4Hz, F25-CH3의 H3)
당 조성 :
L-퓨코스 : D-갈락토스 = 1 : 2 (2개의 L-퓨코스 분자와 4개의 D-갈락토스 분자).
설페이트 그룹:
5 분자(각각의 L-퓨코스의 3- 위치, 환원성 말단의 D-갈락토스의 3- 위치 및 환원성 말단의 D-갈락토스의 6- 위치에 결합한 D-갈락토스의 3- 위치, 및 상기에 언급된 D-갈락토스의 6- 위치에 결합한 D-갈락토스의 3- 위치에서).
1H-NMR 스펙트럼에서 피크는 하기의 화학식 24의 수치에 의해 나타낸 위치로 각각 지정할 수 있다.
화합물(i)의 물리적 성질 :
분자량 : 1288.
MS m/z : 1149 [M+Na+-2SO3-2H+]-.
MS/MS m/z : 97 [HSO4]-, 345 [디설페이트화 L-퓨코스+Na+-2H+]-.
1H-NMR(D2O)
δ5.68(1H, d, J=3.4Hz, (4)-H), 5.34(1H, br-s, (1)-H), 5.19(1H, m, 1-H), 5.19(1H, m, (1)'-H), 4.94(1H, m, 1'-H), 4.94(1H, d, J=6.4Hz, (1)-H), 4.72(1H, d, J=7.9Hz, 1-H), 4.54(1H, m, (4)'-H), 4.48(1H, d-d, J=3.3, 10.6Hz, 3'-H), 4.38(1H, q, J=6.4Hz, 5'-H), 4.34(1H, q, J=6.7Hz, (5)'-H), 4.29(1H, m, (2)'-H), 4.20(1H, m, 5-CH2의 H), 4.14(1H, m, (2)-H), 4.13(1H, m, (3)-H), 4.09(1H, m, 5-CH2의 H), 4.08(1H, m, 2-H), 4.05(1H, d, J=3.3Hz, 4'-H), 3.99(1H, m, (3)'-H), 3.89(1H, m, 5-H), 3.83(1H, m, 4-H), 3.81(1H, m, 2'-H), 3.80(1H, m, 4-H), 3.78(1H, m, 3-H), 3.78(1H, m, (3)-H), 3.68(2H, m, (5)-CH2의 H2), 3.62(1H, m, (2)-H), 3.60(1H, m, 3-H), 3.60(1H, m, 5-H), 3.58(1H, m, (5)-H), 3.56(1H, m, (4)-H), 3.17(1H, t, J=7.9Hz, 2-H), 1.15(3H, d, J=6.4Hz, 5'-CH3의 H3), 1.11(3H, d, J=6.7Hz, (5)'-CH3의 H3)
당 조성 :
L-퓨코스 : 불포화 D-글루쿠론산 : D-글루쿠론산 : D-만노스 = 2 : 1 : 1 : 2 (L-퓨코스와 D-만노스: 각각 2 분자, 불포화 D-글루쿠론산 및 D-글루쿠론산: 각각 1 분자).
설페이트 그룹:
4 분자(환원성 말단의 D-만노스에 결합한 L-퓨코스의 3-위치, 다른 L-퓨코스의 2- 및 4- 위치 및 환원성 말단 부위의 D-만노스의 6-위치에서).
1H-NMR 스펙트럼에서 피크는 하기의 화학식 25의 수치에 의해 나타낸 위치로 각각 지정할 수 있다.
또한, 본 발명의 제 1 발명의 당 화합물은 퓨코이단을 퓨코이다노박터 속에 속하는 본 발명의 제 3 발명의 세포 추출물 또는 배양 상등액으로 처리함으로써 생성할 수 있다.
본 발명의 제 3 발명의 균주는 퓨코이다노박터 속에 속하는 본 발명의 균주일 경우 임의의 것일 수 있다. 이의 특정 예로서, 퓨코이다노박터 마리너스(F. marinus) SI-0098 균주를 언급할 수 있다.
본 발명자에 의해 아오모리의 해수로부터 최초로 발견된 이 균주 퓨코이다노박터 마리너스 SI-0098은 하기의 균학적 특성을 지닌다.
2. 퓨코이다노박터 마리너스 SI-0098 균주
a. 형태적 특성
(1) 단간상 (종종 쌍구균상);
폭 : 0.5 - 0.7 ㎛
길이 : 0.5 - 0.7 ㎛
(2) 포자 : 없음
(3) 그람-염색 : -
b. 생리학적 성질
(1) 생장 온도 범위 : 37℃에서 생장 가능, 적정 생장 온도 15 내지 28℃.
(2) 산소에 대한 행태 : 호기성
(3) 카탈라제 : +
(4) 옥시다제 : -
(5) 우레아제 : -
(6) 가수분해 전분 : +
젤라틴 : -
카제인 : -
에스큘린 : +
(7) 질산염의 환원 : -
(8) 인돌 형성 : -
(9) 황화수소 형성 : +
(10) 우유의 고형화 : -
(11) 나트륨 요구성 : +
(12) 염류 요구성
NaCl-비함유 배지에서의 생장 : -
1% NaCl 배지에서의 생장 : -
해수 배지내 생장 : +
(13) 퀴논 : 메나퀴논 7
(14) 세포내 DNA의 GC 함량 : 61%
(15) 세포벽의 디아미노피멜산 : -
(16) 글리콜릴 시험 : -
(17) 하이드록시 지방산의 존재 : +
(18) OF-시험 : O
(19) 콜로니 색채 : 특징적인 색을 형성하지 않음.
(20) 운동성 : 있음
(21) 활주성 : 없음
(22) 편모 : 극성 단모
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9 (1994)에 기재된 분류에 따라서, 이 균주는 그룹 4(그람-음성 호기성 간균과 구균)로 분류한다. 하지만, 이 균주는 대체로 전자 전달 쇄에 메나퀴논을 갖고 61%의 GC를 함유하는 그룹 4에 속하는 세균과는 다르다. 기본적으로, 그람-음성 세균은 전자 전달쇄에 유비퀴논을 갖고, 그람-양성 세균은 메나퀴논을 갖는다.
플라보박테리움 속과 시토파가(Cytophaga) 속에 속하는 그람-음성 세균은 예외적으로 전자 전달쇄에 메나퀴논을 갖지만, 이들은 대체로 GC 함량에 있어서 상기에 언급된 균주와 달라서, 토양 세균인 시토파가 아르벤시콜라(C. arvensicola)는 43 내지 46%의 GC를 함유하고 해양 세균인 시토파가 디플루엔스(C. diffluens), 시토파가 퍼멘탄스(C. fermentans), 시토파가 마리나(C. marina) 및 시토파가 얼리기노사(C. uliginosa)는 각각 42%의 GC를 함유한다. 이 균주를 16SrDNA 서열의 상동성에 대해 동정된 균주와 비교할 경우, 심지어 가장 상동인 것(베루코마이크로븀 스피노섬(Verrucomicrobium spinosum))은 이와 76.6%의 상동성을 나타낸다. 90% 또는 그 이하의 상동성을 갖는 두 세균은 서로 속이 다르다는 것이 널리 공지되어 있다. 따라서, 본 발명자는 이 균주가 존재하는 어떠한 속에도 속하지 않는 신규한 세균이라고 결정했고 이것을 퓨코이다노박터 마리너스 SI-0098이라고 명명하였다.
상기의 균주는 퓨코이다노박터 마리너스 SI-0098라 명명되고 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology(주소: 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 수탁 번호FERM BP-5403로 기탁되었다 (원 기탁은 1995년 3월 29자로 시행되었고 1996년 2월 15일자로 국제 기탁으로의 이관 청구되었다).
퓨코이다노박터 속에 속하는 본 발명의 제 3 발명의 미생물은 배지에서 배양하고 퓨코이단은 세포 추출물 또는 배양 상등액으로 처리하여 이로 인해 본 발명의 제 1 발명의 당 화합물을 유리하는 것이 가능하다. 퓨코이다노박터 속에 속하고 퓨코이단을 세포 추출물 또는 이의 배양 상등액으로 처리시 본 발명의 제 1 발명의 당 화합물을 생성할 수 있는 경우, 사용될 미생물은 임의의 것일 수 있다. 균주의 특정 예로서, 퓨코이다노박터 마리너스 SI-0098 균주를 언급할 수 있다.
사용된 균주가 제 1 발명의 당 화합물을 생성할 수 있는 세포 추출물 또는 배양 상등액을 생성하기 위해서 이들을 사용할 수 있는 경우, 퓨코이다노박터 속에 속하는 세균 균주의 배지에 첨가될 영양분은 임의의 것일 수 있다. 탄소원의 적합한 예에는 퓨코이단, 해조류 분말, 알긴산, 퓨코스, 글루코스, 만니톨, 글리세롤, 사카로스, 말토스, 락토스 및 전분이 포함되고, 질소원의 적합한 예에는 이스트 추출물, 펩톤, 카사미노산, 옥수수 침출액, 육류 추출물, 탈지 대두, 황산암모늄, 및 염화암모늄이 포함된다. 배지는 또한 무기 물질과 나트륨염, 인산염, 칼륨염, 마그네슘염 및 아연염과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
이러한 균주는 또한 상기에 언급된 영양원을 함유하는 해수 또는 인공 해수에서 잘 자란다.
본 발명의 제 3 발명에 따라서 퓨코이다노박터 속에 속하는 세균을 배양하기 위해서, 일반적으로 배양 온도는 15 내지 30℃의 범위이고 배지의 pH 값은 5 내지 9의 범위인 것이 바람직하다. 세포 추출물과 배양 상등액에서의 엔도퓨코이단-리아제 활성은 5 내지 72시간 동안 통기 및 교반하에 균주를 배양함으로써 최대한에 도달한다. 당연한 일로서, 배양 조건은 세포내 추출물과 배양 상등액의 엔도-퓨코이단-리아제의 최대 활성을 이루기 위해서 사용된 균주, 배지 조성물 등에 따라서 적절히 선택된다.
퓨코이다노박터 마리너스 SI-0098 균주를 적합한 배지에서 배양하고, 배양이 완료된 후, 배양 배지를 원심분리하여 이로 인해 세포와 배양 상등액을 생성한다. 또한 거두어들인 세포를 초음파처리와 같이 세포를 분쇄하기 위해 통상적으로 사용되는 방법에 의해 분쇄한다. 분쇄된 세포를 원심분리함으로써, 세포 추출물을 수득할 수 있다.
순차적으로, 세포 상등액 또는 세포 추출물을 한외여과에 의해 농축하고 염화나트륨을 함유하는 포스페이트 완충액으로 혼합한다. 이어서 퓨코이단을 이에 첨가하고 함께 반응시킨다.
반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 분자량 분획화용 컬럼을 사용함으로써 분획화한다. 따라서, 본 발명의 제 1 발명의 당 화합물을 수득할 수 있다.
본 발명의 제 1 발명의 당 화합물은 당 쇄 기술용 시약으로서 유용하다. 일본 특허 공고 제 65108/1993에 기재된 방법에 따른 피리딜-(2)-아민화 (PA) 이들 화합물에 의해서, 당 쇄 기술용 시약으로서 매우 유용한 PA 화합물을 생성하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 당 화합물의 생리학적 활성은 이들을 항암, 암 전이 억제 및 항바이러스 약제에 적용할 수 있다고 예상된다.
본 발명을 수행하는 최상의 양식:
하기의 실시예는 본 발명의 제 1 발명의 당 화합물을 생성하기 위한 방법의 예를 설명하기 위해서 제공될 것이지만, 본 발명이 이에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1
플라보박테리움 종 SA-0082 (FERM BP-5402)를 2-1 삼각 플라스크에 피펫팅하고 120℃에서 20분 동안 멸균한 0.1%의 글루코스, 1.0%의 펩톤 및 0.05%의 이스트 추출물을 함유하는 인공 해수(pH 7.5, Jamarin Laboratary 제조)를 포함하는 600㎖의 배지에서 배양한다. 이어서 균주를 24℃에서 20시간 동안 배양하고 이로 인해 시드 배양물을 생성한다. 30-1 jar 발효기에 젤마니엘라 크래시폴리아에서 생성된 0.3%의 퓨코이단, 0.5%의 펩톤, 0.01%의 이스트 추출물 및 0.01%의 소포제(Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. 제조)를 함유하는 인공 해수를 포함하는 배지 20ℓ를 공급하고 120℃에서 20분 동안 멸균한다. 냉각 후, 배지를 상기 언급된 시드 배양물 600 ㎖로 접종하고, 이어서 10 1/분의 비율로 통기하고 125 rpm으로 교반하면서 24℃에서 20시간 동안 배양한다. 배양을 완료한 후, 배양 배지를 원심분리하여 이로 인해 세포와 배양 상등액을 수득한다.
배양 상등액을 한외 여과(막의 배제 분자량: 10,000, Amicon 제조)에 의해 농축하고 본 발명의 엔도-퓨코이단-리아제를 분석한다. 따라서, 배양 배지의 6 mU/㎖ 활성이 검출된다.
이와는 달리, 주배양에 의해 수득된 세포를 200 mM의 염화나트륨을 함유하는 20 mM 아세테이트-포스페이트 완충액(pH 7.5)에 현탁하고 초음파 처리에 의해 분쇄하고 원심분리하여 이로 인해 세포 추출물을 생성한다. 이 세포 추출물의 본 발명의 엔도-퓨코이단-리아제를 분석시, 배양 배지의 20 mU/㎖ 활성이 검출된다.
최종적으로 90% 포화를 이루기 위해서 배양 상등액의 상기 언급된 농축물에 황산암모늄을 첨가한다. 교반에 의해 용해시킨 후, 혼합물을 원심분리하고 침전물을 세포가 현탁된 상기 언급된 것과 동일한 완충제에 현탁한다. 이어서 현탁액을 50 mM의 염화나트륨을 함유하는 20 mM 아세테이트-포스페이트 완충액(pH 7.5)에 대해 완전히 투석한다. 투석에 의해 형성된 침전물을 원심분리에 의해 제거한 후, 50 mM의 염화나트륨을 함유하는 20 mM 아세테이트-포스페이트 완충액(pH 7.5)으로 평형시킨 DEAE-세파로스 FF 컬럼에 흡착시킨다. 흡착된 물질을 동일한 완충액으로 잘 세척하고 50 mM 내지 600 mM의 염화나트륨으로의 선형 농도 구배 용출에 의해 진전시킨다. 활성 분획을 합하고 4M의 최종 농도를 생성하기 위해서 염화나트륨을 여기에 첨가한다. 이어서 4M의 염화나트륨을 함유하는 20 mM 포스페이트 완충액(pH 8.0)으로 평형시킨 페닐 세파로스 CL-4B 컬럼에 흡착시킨다. 이어서 흡착된 물질을 동일한 완충액으로 잘 세척하고 4M 내지 1M의 염화나트륨으로의 선형 농도 구배 용출에 의해 진전시킨다. 활성 분획을 합하고 한외 여과기(Amicon 제조)로 농축한다. 이어서, 50 mM의 염화나트륨을 함유하는 10 mM 포스페이트 완충액으로 평형시킨 세파크릴 S-200 겔을 사용하여 겔 여과하도록 한다. 활성 분획을 합하고 최종 농도 3.5 M을 생성하기 위해서 염화나트륨을 이에 첨가한다. 이어서, 3.5 M의 염화나트륨을 함유하는 10 mM 포스페이트 완충액(pH 8)으로 평형시킨 페닐 세파로스 HP 컬럼에 흡착시킨다. 이어서 흡착된 물질을 동일한 완충액으로 세척하고 3.5 M 내지 1.5 M의 염화나트륨으로의 선형 농도 구배 용출에 의해 진전시킨다. 활성 분획을 합하고 이로 인해 정제된 효소를 생성한다. 세파크릴 S-200의 보유 시간으로부터 측정된 효소의 분자량은 약 70,000이다. 표 1은 상기 언급된 정제 단계를 요약한다.
단계 총 단백질(mg) 총 활성(mU) 특이 활성(mU/mg) 수율(%)
세포 추출물 980 114,000 116 100
황산 암모늄-염석 473 108,000 228 94.7
DEAE-세파로스 FF 216 86,400 400 75.8
페닐 세파로스 CL-4B 21.9 57,300 2,620 50.3
세파크릴 S-200 3.70 46,200 12,500 40.5
페닐 세파로스 HP 1.53 41,200 27,000 36.1
실시예 2
플라보박테리움 종 SA-0082 (FERM BP-5402)를 2-1 삼각 플라스크로 피펫팅하고 120℃에서 20분 동안 멸균한 0.25%의 글루코스, 1.0%의 펩톤 및 0.05%의 이스트 추출물을 함유하는 인공 해수(pH 7.5, Jamarin Laboratary 제조)를 포함하는 600㎖의 배지에서 배양한다. 이어서 균주를 24℃에서 24시간 동안 배양하여 이로 인해 시드 배양물을 생성한다. 30-1 jar 발효기에 0.25% 글루코스, 1.0%의 펩톤, 0.05%의 이스트 추출물 및 0.01%의 소포제(KM 70 Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. 제조)를 함유하고 120℃에서 20분 동안 살균된 인공 해수(pH 7.5, Jamarin Laboratory 제조)를 포함하는 20ℓ의 배지를 공급한다. 냉각 후, 배지를 상기 언급된 시드 배양물 600 ㎖로 접종하고, 이어서 10 1/분의 비율로 통기하고 125 rpm으로 교반하면서 24℃에서 24시간 동안 배양한다. 배양을 완료한 후, 배양 배지를 원심분리하여 이로 인해 세포와 배양 현탁액을 생성한다.
배양 상등액을 한외 여과(막의 배제 분자량: 10,000, Amicon 제조)에 의해 농축하고 본 발명의 엔도-퓨코이단-리아제를 분석한다. 따라서, 배양 배지의 1 mU/㎖ 활성이 검출된다.
이와는 달리, 주배양에 의해서 수득된 세포를 200 mM의 염화나트륨을 함유하는 20 mM 아세테이트-포스페이트 완충액(pH 7.5)에 현탁하고, 초음파처리에 의해 분쇄하고 원심분리하여 이로 인해 세포 추출물을 생성한다. 이 세포 추출물의 엔도-퓨코이단-리아제 분석시, 배양 배지의 5 mU/㎖ 활성이 검출된다.
최종적으로 90% 포화를 이루기 위해서 이 추출물에 황산암모늄을 첨가한다. 교반에 의해 용해시킨 후, 혼합물을 원심분리하고 침전물을 세포가 현탁된 상기 언급된 것과 동일한 완충액에 현탁한다. 이어서 현탁액을 50 mM의 염화나트륨을 함유하는 20 mM 아세테이트-포스페이트 완충액(pH 7.5)에 대해 완전히 투석한다. 투석에 의해 형성된 침전물을 원심분리에 의해 제거한 후, 50 mM의 염화나트륨을 함유하는 20 mM 아세테이트-포스페이트 완충액(pH 7.5)으로 평형시킨 DEAE-세파로스 FF 컬럼에 흡착시킨다. 이어서 흡착된 물질을 동일한 완충액으로 잘 세척하고 50 mM 내지 600 mM의 염화나트륨으로 선형 농도 구배 용출에 의해 진전시킨다. 활성 분획을 합하고 4M의 최종 농도를 생성하기 위해서 염화나트륨을 여기에 첨가한다. 이어서 4M의 염화나트륨을 함유하는 20 mM 포스페이트 완충액(pH 8.0)으로 평형시킨 페닐 세파로스 CL-4B 컬럼에 흡착시킨다. 이어서 흡착된 물질을 동일한 완충액으로 잘 세척하고 4M 내지 1M의 염화나트륨으로의 선형 농도 구배 용출에 의해 진전시킨다. 활성 분획을 합하고 한외 여과기로 농축한다. 이어서 50 mM의 염화나트륨을 함유하는 10 mM 포스페이트 완충액으로 평형시킨 세파크릴 S-300을 사용하여 겔 여과하도록 한다. 활성 분획을 합한다. 세파크릴 S-300의 보유 시간으로부터 측정된 효소의 분자량은 약 460,000이다. 이어서 활성 분획을 250 mM의 염화나트륨을 함유하는 10 mM 포스페이트 완충액(pH 7)에 대해 투석한다. 효소 용액을 250 mM의 염화나트륨을 함유하는 10 mM 포스페이트 완충액(pH 7)으로 평형시킨 Mono Q HR5/5 컬럼에 흡착시킨다. 흡착된 물질을 동일한 완충액으로 잘 세척하고 250 mM 내지 450 mM의 염화나트륨으로 선형 농도 구배 용출에 의해 진전시킨다. 활성 분획을 합하여 정제된 효소를 생성한다. 표 2는 상기 언급된 정제 단계를 요약한다.
단계 총 단백질(mg) 총 활성(mU) 특이 활성(mU/mg) 수율(%)
세포 추출물 61,900 101,000 1.63 100
황산 암모늄-염석 33,800 88,600 2.62 87.7
DEAE-세파로스 FF 2,190 40,400 18.4 40.0
페닐 세파로스 CL-4B 48.2 29,000 601 28.7
세파크릴 S-300 7.24 19,600 2,710 19.4
모노 Q 0.824 15,000 18,200 14.9
실시예 3
젤마니엘라 크래시폴리아에서 생성된 정제된 퓨코이단을 실시예 1에서 수득된 본 발명의 엔도-퓨코이단-리아제(세포내 효소)로 처리하여 이로 인해 이의 분해 생성물을 제조한다.
즉, 16 ㎖의 2.5% 퓨코이단 용액, 12 ㎖의 50mM 포스페이트 완충액(pH 7.5), 4 ㎖의 4M 염화나트륨 용액 및 본 발명의 8 ㎖의 32 mU/㎖ 엔도-퓨코이단-리아제 용액을 함께 혼합하고 25℃에서 48시간 동안 반응시킨다.
이어서 반응 혼합물을 셀룰로핀(Cellulofin) GCL-300 컬럼(Seikagaku Kogyo 제조)을 사용함으로써 분자량 분획화하도록 하고 2,000 이하의 분자량의 분획을 모은다. Micro Acilyzer G3 (Asahi Chemical Industry Co., Ltd. 제조)로 탈염한 후, 이 분획을 DEAE-세파로스 FF에 의해 3개의 분획으로 분리하여 이로 인해 상기 언급된 화합물 (a), (b), 및 (c)를 각각 41 mg, 69 mg 및 9.6 mg 생성한다.
실시예 4
젤마니엘라 크래시폴리아에서 생성된 정제된 퓨코이단을 실시예 2에서 수득된 본 발명의 엔도-퓨코이단-리아제(외세포 효소)로 처리하여 이로 인해 이의 분해 생성물을 제조한다.
즉, 16 ㎖의 2.5% 퓨코이단 용액, 12 ㎖의 50 mM 포스페이트 완충액(pH 7.5), 4 ㎖의 4M 염화나트륨 용액 및 본 발명의 8 ㎖의 32 mU/㎖ 엔도-퓨코이단-리아제 용액을 함께 혼합하고 25℃에서 48시간 동안 반응시킨다.
이어서 반응 혼합물을 셀룰로핀 GCL-300 컬럼(Seikagaku Kogyo 제조)을 사용함으로써 분자량 분획화하고 2,000 이하의 분자량의 분획을 모은다. Micro Acilyzer G3 (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)로 탈염한 후, 이 분획을 DEAE-세파로스 FF에 의해 3개의 분획으로 분리하고 동결-건조하여 이로 인해 상기 언급된 화합물 (a), (b), 및 (c)를 각각 40 mg, 65 mg 및 9.2 mg 생성한다.
실시예 5
퓨코이다노박터 마리너스 SI-0098 균주(FERM BP-5403)를 젤마니엘라 크래시폴리아에서 생성된 0.3% 퓨코이단, 0.5%의 펩톤, 0.05%의 이스트 추출물 및 0.01%의 소포제(KM70, Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. 제조)를 함유하는 인공 해수(pH 7.5, Jamarin Laboratory 제조)제조를 포함하는 600㎖의 배지에 접종하고 멸균한다(120℃, 20분). 균주를 2-1 삼각 플라스크 중으로 피펫팅하고 120℃에서 20분 동안 멸균한다. 이어서 균주를 120 rpm으로 교반하면서 25℃에서 48시간 동안 배양한다. 배양을 완료한 후, 배양 배지를 원심분리하여 이로 인해 세포와 배양 상등액을 생성한다.
배양 상등액을 한외 여과(막의 배제 분자량: 10,000, Amicon 제조)에 의해 농축하고 본 발명의 엔도-퓨코이단-리아제를 분석한다. 따라서, 배양 배지의 0.2 mU/㎖ 활성이 검출된다.
이와는 달리, 주배양에 의해서 수득된 세포를 200 mM의 염화나트륨을 함유하는 20 mM 아세테이트-포스페이트 완충액(pH 7.5)에 현탁하고, 초음파처리에 의해 분쇄하고 원심분리하여 이로 인해 세포 추출물을 생성한다. 이 세포 추출물의 본 발명의 엔도-퓨코이단-리아제 분석시, 배양 배지의 20 mU/㎖ 활성이 검출된다.
실시예 6
젤마니엘라 크래시폴리아에서 생성된 정제된 퓨코이단을 실시예 5에서 수득된 본 발명의 퓨코이다노박터 마리너스 SI-0098 균주의 세포내 효소로 처리하여 이로 인해 이의 분해 생성물을 제조한다.
즉, 16 ㎖의 2.5% 퓨코이단 용액, 800 mM의 염화나트륨을 함유하는 20 ㎖의 100 mM 포스페이트 완충액(pH 8.0), 및 실시예 5에서 수득된 본 발명의 4 ㎖의 20 mU/㎖ 퓨코이다노박터 마리너스 SI-0098 균주 세포내 효소 용액을 함께 혼합하고 25℃에서 48시간 동안 반응시킨다.
이어서 반응 혼합물을 셀룰로핀 GCL-300 컬럼을 사용함으로써 분자량 분획화하도록 하고 2,000 이하의 분자량의 분획을 모은다. Micro Acilyzer G3로 탈염한 후, 이 분획을 DEAE-세파로스 FF에 의해 3개의 분획으로 분리하고 동결-건조하여 이로 인해 상기 언급된 화합물 (a), (b), 및 (c)를 각각 38 mg, 60 mg 및 8.2 mg 생성한다.
따라서, 본 발명은 퓨코이단의 구조 분석, 퓨코이단의 효소 분해 산물의 동정 및 퓨코이단의 생물학적 활성 검출에 사용할 수 있는 당 화합물, 퓨코이단의 부분 분해 및 퓨코이단 올리고사카라이드의 생산과 같은 퓨코이단에 관한 연구에 유용한 신규한 엔도-퓨코이단-리아제를 제공한다.

Claims (12)

  1. 적어도 하나의 알콜 하이드록실 그룹이 설페이트화된 화학식 1 또는 2의 당 화합물 또는 이들의 염.
    화학식 1
    화학식 2
    화학식 3
    화학식 4
    화학식 5
    화학식 6
    상기식에서,
    X는 수소 원자 또는 화학식 3의 그룹이고,
    Y는 수소 또는 화학식 4 또는 5의 그룹이며, 단 X와 Y는 동시에 수소일 수 없으며,
    Z는 수소 또는 화학식 6의 그룹이다.
  2. 화학식 7의 당 화합물 또는 이의 염.
    화학식 7
  3. 화학식 8의 당 화합물 또는 이의 염.
    화학식 8
  4. 화학식 9의 당 화합물 또는 이의 염.
    화학식 9
  5. 화학식 10의 당 화합물 또는 이의 염.
    화학식 10
  6. 화학식 11의 당 화합물 또는 이의 염.
    화학식 11
  7. 화학식 12의 당 화합물 또는 이의 염.
    화학식 12
  8. 화학식 13의 당 화합물 또는 이의 염.
    화학식 13
  9. 화학식 14의 당 화합물 또는 이의 염.
    화학식 14
  10. 화학식 15의 당 화합물 또는 이의 염.
    화학식 15
  11. 하기의 생리화학적 성질을 지니는 엔도-퓨코이단-리아제:
    (1) 기능 : 퓨코이단에 작용하여 적어도 화학식 7과 8의 당 화합물 유리;
    (2) 최적 pH 값 : pH 6 내지 10의 범위;
    (3) 최적 온도 : 30 내지 40℃의 범위.
  12. 전자 전달 쇄에 메나퀴논을 갖고 약 60%의 GC를 함유하는 퓨코이다노박터 속에 속하는 세균.
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