WO1996000296A1 - Procede de production de d-amino acide au moyen d'une preparation a base d'une enzyme composite immobilisee - Google Patents

Procede de production de d-amino acide au moyen d'une preparation a base d'une enzyme composite immobilisee Download PDF

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WO1996000296A1
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coli
ferm
enzyme
producing
amino acid
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PCT/JP1995/001257
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French (fr)
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Hirokazu Nanba
Yukio Tamada
Kazuyoshi Yajima
Masayuki Takano
Yasuhiro Ikenaka
Satomi Takahashi
Takehisa Ohashi
Original Assignee
Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha
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    • C12P41/009—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving hydantoins or carbamoylamino compounds
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    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture

Definitions

  • the present invention relates to a composite immobilized enzyme preparation and a method for producing D-amino acid using the same.
  • the composite immobilized enzyme preparation of the present invention is particularly useful for producing D-amino acids which are intermediate materials for antibiotics such as D- (p-hydroxyphenyl) glycine used for producing the antibiotic amoxicillin.
  • Optically active D-amino acids which are important compounds as pharmaceutical intermediates, are not capable of converting 5-substituted hydantoins to the corresponding D-N-potassium monoamino acid by the action of the enzyme hydantoinase (hereinafter abbreviated as Hase).
  • Hase the enzyme hydantoinase
  • the present invention provides a method for simultaneously immobilizing two enzymes, hydantoinase and decarbamylase, on the same immobilized resin carrier in the presence of two enzymes (hereinafter, referred to as a complex enzyme), and efficiently using this immobilized enzyme resin. It relates to the technology for producing one amino acid.
  • the hydantoinase reaction is generally optimal ⁇ ka ⁇ ⁇ 8-9, with increasing solubility of the substrate as ⁇ increases, and hydantoin. It is desirable that the ⁇ during the reaction be in the range of 7 to 10 and more preferably in the alkaline range, because the racemization reaction of the ring is promoted in the alkaline state.
  • the optimal ⁇ is generally ⁇ 6.5 to 9.0.However, as ⁇ increases, the inhibition of the reaction of the product by ammonia increases rapidly. It is preferable to carry out near neutrality.
  • the present inventors have conducted intensive studies on preparing a composite immobilized enzyme preparation in which both enzymes are simultaneously immobilized on the same immobilized carrier. Both these enzymes When immobilization is carried out simultaneously, two enzymatic reactions occur consecutively in the space inside the small resin, and the substrate for decarbamylase, D-N-force rubamyl-amino acid, diffuses from the immobilized Hase and is immobilized. In addition, the need to transfer to activated DCase is eliminated, and the pH fluctuation in the micro space can be reduced, increasing the reactivity of each enzyme, reducing product inhibition by ammonia, and reducing the possibility of repeated reactions. It was thought that the stability of the enzyme was also improved.
  • the present invention relates to a hydantoinase (hereinafter, abbreviated as Hase) having an optimum pH in an alkaline region and a D-N-caprolactam having an optimum pH near neutrality on an immobilization carrier comprising an anion exchange resin. It is characterized in that a complex immobilized enzyme, which is simultaneously immobilized in the presence of amino acid amide hydrolase (hereinafter abbreviated as D Case) (hereafter referred to as a complex enzyme), is used at a pH around neutrality.
  • D Case amino acid amide hydrolase
  • the present invention provides a method for efficiently producing the corresponding D-amino acid from a DL-5-substituted hydantoin in a one-step reaction.
  • hydantoinase used in the present invention those derived from animals, plants and microorganisms can be used, but microorganisms are suitable for industrial production.
  • microorganisms include, for example, those disclosed in Japanese Patent Publication No. Sho 62-30758.
  • Streptomyces S treptomyces
  • Akuchinopuranesu genus a ctinoplanes
  • Asuperugirusu genus as belonging to fungi (Asper gillus)
  • Nono 0 Eshiromisesu genus Paecilomyces
  • Bae Nishiriumu genus P enic illium
  • Candida the genus Pichia
  • Rhodotorula the genus Torulopsis and so on.
  • strains having relatively high hydantoinase activity and excellent practicality include Aerobacter cloacae I AM 1221, Agrobacterium rhizogenes. rhizogenes) I FO 13259, Brevibacterium incertum IF 0 12145, Corynebacterium seperonicum.
  • Sedonicum (C orynebacterium sepedonicum) F 3306, Microbacterium flavum (Microbacterium flavum A) TCC 10340, Micrococcus roseus (Micrococcus roseus) IF 0 3764, Pseudomonas striata (IF 0 12996), Mycobacterium (Mycobacterium smegmatis) ATCC 607, Nocardia cor 3338 I The Streptomyces' Flaveolas (Streptomyces flaveolus) IFO 3241, Bee Vinegar species (Bacillus sp.) KNK 108 (FERM P-6056), Bacillus sp. KNK 245 (FERM BP-4863), etc.
  • Microorganisms given hydantoinase-producing ability by genetic recombination For example, E. coli HB10 lpTH104 (FERM BP-4864), or an enzyme produced by an enhanced artificial microorganism, or JP-A-53-136583, which has equivalent activity
  • E. coli HB10 lpTH104 (FERM BP-4864)
  • an enzyme produced by an enhanced artificial microorganism or JP-A-53-136583, which has equivalent activity
  • JP-A-53-136583 JP-A-53-136583
  • the origin of the decarbamylase used in the present invention is not particularly limited, such as animals, plants, and microorganisms, but microorganisms are suitable for industrial production.
  • microorganisms include Agrobacterium, Pseudomonas, Arthrobacter, Alkaligenes, and A. disclosed in JP-B-57-18793, JP-B-63-20520, and JP-B-1-48758.
  • Natural microorganisms such as the genus Chromobacter, the genus Moraxella, the genus Paracoccus, the genus Aerobacter, the genus Aeromonas, the genus Brevibacterium, the genus Bacillus, the genus Flavobacterium, and the genus Serratia, and gene sets as described in WO 91/01696
  • An artificial microorganism that has been given or enhanced the ability to produce a weakened rubamil enzyme by replacement is mentioned.
  • Representative examples of these microorganisms include Aggropacterium 'species (Agrobacterium sp.) KNK 712 (FERM BP-1900) and Pseudomonas sp.
  • J Ml 09 pAD 406 (FERM BP-3914), E. coli J Ml 09 pAD 416 (FERM BP-3915, CCTCC NO: M 93040), E. coli JM109 pAD428, E-Joli JM1 09 pAD429 (FERM BP) -4035), — J JM109 pAD431, — '109 JM109 pAD434, ⁇ J JM1 09 pAD435,' ⁇ ⁇ J JM109 pA D 439, ⁇ J JMl 09 pAD441, ⁇ ' ⁇ ⁇ Koli JM109 pAD 445. E. coli JM109 pAD447, E.
  • the enzymes used in the present invention can be produced simultaneously using microorganisms that can produce both enzymes simultaneously, or they can be produced separately or simultaneously using microorganisms that produce each enzyme alone.
  • Bacteria capable of producing both enzymes include strains isolated from the natural world, for example, JP-B-63-2052
  • both enzyme genes can be isolated from the same or different microorganisms and inserted into the same vector so that both genes can be expressed, or different vectors with different replication modes, such as pUC19 and pACYC184 And transforming it into a host into which E. coli or the like can be introduced so that one type of recombinant microorganism can produce and use both enzymes.
  • the cultivation can be performed by aerobic cultivation, for example, by shaking cultivation using a flask or the like, or by aeration and stirring cultivation using a stirring type culturing tank or the like.
  • a medium to be used in this case generally used natural nutrients, for example, a nutrient medium containing a meat extract or polypeptone can be used, but hydantoinase alone or simultaneously can be used.
  • good results can be obtained by adding manganese ions, for example, as manganese chloride in an amount of about 1 to 10 Omg / liter, preferably about 2 Omg / liter.
  • the enzyme to be used may be present as a purified enzyme, a partially purified enzyme, or a crude enzyme in the immobilized enzyme preparation in some cases as it is in the form of cells, and it may be in a state where each enzyme activity can be exhibited. For example, it does not matter whether it exists or coexists.
  • antioxidants include dithiothreitol and 2-mercapto. Tetanol, L-cysteine hydrochloride, cysteamine hydrochloride, dithioerythritol, a mixture of dithiothreitol and dithioerythritol, reduced glutathione and the like can be used.
  • the immobilization support to be used depends on the mode of immobilization of the enzyme to be used.However, when a crude enzyme solution such as a cell-free extract or a partially purified enzyme solution subjected to ammonium sulfate fractionation is used for immobilization, Polymer supports having ion exchange groups or covalent bonding groups can be used.
  • polymer support having an ion-exchange group examples include an anion-exchange resin, for example, Duolite (registered trademark) A having an exchange group of a primary, secondary, tertiary or quaternary amine, or Amberlite IRA ( (Registered trademark) series or polystyrene resin having a functional group of a diethanol type, such as Diaion EX. Can be used.
  • anion-exchange resin for example, Duolite (registered trademark) A having an exchange group of a primary, secondary, tertiary or quaternary amine, or Amberlite IRA (Registered trademark) series or polystyrene resin having a functional group of a diethanol type, such as Diaion EX. Can be used.
  • Examples of the polymer having a covalent bonding group include a substituted polymethacrylic acid polymer having an aldehyde as a bonding group, and a high-density alumina coated with a polyethyleneiminoglutaraldehyde conjugate.
  • polymers such as polyacrylamide, polyurethane or calcium alginate, and porous materials such as pumice and alumina can be used.
  • the composite immobilized enzyme preparation of the present invention is produced as follows.
  • a complex crude enzyme solution in which the enzyme titer of each of Hase and D Case is appropriately adjusted, is brought into contact with the support, and each enzyme is adsorbed and treated with a crosslinking agent to stabilize.
  • the cells are cultured to produce each enzyme.
  • the cells can be collected and a cell-free extract can be prepared by sonication, mechanical crushing (such as a homogenizer), or enzyme treatment.
  • Both enzymes can be prepared by, for example, mixing and culturing the respective producing bacteria, and simultaneously disrupting the cells to prepare a cell-free extract in which the two enzymes are mixed.
  • the productivity varies greatly depending on the type of bacteria and the cultivation method.
  • hydantoinase is usually 0.1 to 10 units / ml (here One unit of the enzyme converts the substrate 5- (p-hydroxyphenyl) hydantoin to D-N-force rubamyl-p-hydroxyfujylglycine in 1 minute at 40 ° C and pH 8.7.
  • the amount of enzyme needed to produce the recombinant artificial microorganism is about 5 to 150 units Zml, and the amount of decarbamylase is about 0.01 to 2 units for normal bacteria. Unit: 40 ° C, pH 7.0 Is the amount of enzyme required to convert the substrate D—N—force rubamil-p-hydroxyphenylglycine to D—p—hydroxyphenylglycine in 1 minute.) 1 to 20 units About Zml. Hase and DC in complex crude yeast solution
  • the ratio of enzyme titer of ase is adjusted so that the reaction to produce D-amino acid from 5-substituted hydantoin proceeds most effectively.
  • this reaction since this reaction is performed near neutral pH close to the optimal pH of the D Case, the activity of both enzymes is regulated due to factors such as the condition that the activity of Hase is not maximized. Therefore, it is desirable that the same enzyme activity be exhibited at the reaction pH.
  • the immobilization reaction is performed using an enzyme solution containing approximately 5 times the amount of hydantoinase in approximately the same amount of protein and activity ratio to achieve the desired composite immobilization. Enzyme preparation can be prepared.
  • the ratio of the enzyme titer in the complex crude enzyme solution be in the range of Hase: D Case of 1 to 10: 1. Therefore, the enzyme titer of the complex crude enzyme solution is adjusted in this way after disruption of the cells and before adsorption.
  • the concentration of the amount of decarbamylase in the complex crude enzyme solution is preferably set to 10 to 300 units / ml.
  • the titer of the enzyme to be adsorbed is about 20 to 90% of the added enzyme, and there is no great difference between both enzymes.
  • the support used is such that the exchange group is activated with a saline solution or the like and then equilibrated in a buffer or the like.
  • the ratio of the composite crude enzyme solution to the support is preferably such that the total protein content of the crude enzyme solution is the same as the maximum amount of adsorption on the support. If necessary, add an antioxidant of 1 to 1 ⁇ ⁇ and 0.5 to 2 OmM of manganese ion, and stir at 4 to 30 ° C, preferably 15 ° C to adsorb the enzyme.
  • the desired amount After the desired amount has been reached (usually for 8 to 48 hours, preferably in an atmosphere of an inert gas such as nitrogen), it is collected by filtration, washed, treated with a cross-linking agent, insolubilized and stabilized .
  • a cross-linking agent for example, a known one such as 1% or less (preferably 0.1 to 0.2%) of glutaraldehyde can be used.
  • Wash the cross-linked complex immobilized enzyme preparation with distilled water or a buffer solution (containing 0.1 to 20 mM of the above-described antioxidant, usually containing 1 to 5 mM). (About 4 DC ) and store in a closed container in a wet state.
  • the enzymatic activity of the complex immobilized enzyme preparation thus obtained is generally about 1 to 10 times that of decarbamylase, depending on the conditions of the support and of hydantoinase, depending on the conditions at the time of adsorption. There is activity per support.
  • the complex-immobilized enzyme preparation is allowed to act on the reaction substrate, 5-substituted hydantoin, if necessary, in the presence of an antioxidant and / or manganese ion.
  • the reaction is preferably performed in the presence of 0.1 to 2 O mM of an antioxidant and manganese ion.
  • R represents a phenyl group, a phenyl group substituted with a hydroxyl group, an alkyl group, a substituted alkyl group, an aralkyl group or a phenyl group).
  • the concentration of the reaction substrate, 5-substituted hydantoin, is 0.1 to 30 wZv%, preferably 1 to 5 wZv%.
  • the amount of the complex immobilized enzyme preparation to be used is preferably about 10 to 20 units / g substrate based on decarbamylase activity per substrate.
  • the reaction temperature varies depending on the enzyme, but generally 30 ° C. to 60 ° C., and particularly higher temperature can be used for a thermostable enzyme.
  • the reaction pH is appropriately selected from the range of 6.5 to 8.0. In this pH range, DCase is almost near the optimal pH, but Hase is far from the optimal pH, and its activity is reduced by a factor. Racemization of DL-5-substituted hydantoins is also slowing. However, since the production of D- ⁇ -amino acids is ultimately governed by D Case, which is the enzyme in the last step, the amount of enzyme and reaction conditions (that is, the optimal conditions for D Case) are set based on this. It is preferable to combine the Hase activity with the Hase activity. Depending on the reaction conditions, the ratio of the adsorbed enzyme is generally adjusted so that the same activity can be expressed.
  • the same level of activity means that the activity of hydantoinase (expressed in units (PH7.5)) measured at a reaction pH, for example, pH 7.5, and the above-mentioned decarbamylase activity are approximately 0.5 to 1.5: 1. Is the state that is. The reaction is performed while controlling at the pH range selected in this way, usually pH 7.5. These tasks overcome the disadvantageous conditions of Hase, and shift the equilibrium reaction toward the direction of DN-force rubamilaminoic acid, allowing the reaction to proceed more efficiently than expected, and the substrate, 5-substituted hydantoin. The conversion yield can be improved.
  • the reaction is When the reaction is performed in the near-alkaline region, it is good until the production of DN-galvanamic acid, but the activity of decarbamylase is reduced to 1Z2 or less, and furthermore, the amount of ammonia generated by the reaction is large. It has been found that the overall reaction efficiency is reduced and the stability of decarbamylase itself is also reduced due to reaction inhibition. For these reasons, the reaction using the composite immobilized enzyme preparation is not suitable for the decarbamylase reaction under the optimal reaction conditions and near the reaction substrate concentration. The use of the combined immobilized enzyme preparation can be carried out efficiently. In addition, conditions such as high productivity of Has e and irreversible reaction of D Case make it advantageous to regulate the overall enzyme activity of the complex immobilized enzyme preparation.
  • the reaction is carried out by a column method or suspension in a reactor. In the latter case, a batch reaction is usually carried out, and the reaction time is usually about 6 to 48 hours per batch.
  • the composite immobilized enzyme preparation of the present invention was used, it was possible to efficiently produce the corresponding D-amino acid with high optical purity and high yield from 5-substituted hydantoin in a one-step reaction.
  • the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • Bacillus sp. KNK108 (FERM P-6056) was added to a 25 mlml seed mother medium (1.0% meat extract, 1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract (pH 7.0) to prepare the hydantoinase enzyme solution. 0)) and cultured at 33 ° C for about 25 hours. This is inoculated into 2.5 liters of main culture medium (1.0% meat extract, 1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.1% peracil, 2 Opm MnCl 2 (H7.5)), and cultured at 33 ° C for about 16 hours. did.
  • the cells cells were collected by centrifugation, 20 mM of 50ml MnS0 4 After suspending in an aqueous solution and adjusting the pH to 8.5, the cells were disrupted by ultrasonication, and the residue was removed by centrifugation to obtain a crude hydantoinase enzyme solution (107 units / ml).
  • E. coli HB101P T4553 (FERM BP-4368) to 20 ml of 2YT medium (1.6% pak tryptone, 1.0% bacto yeast extract, 0.5% Na CD in 50%).
  • 2YT medium (1.6% pak tryptone, 1.0% bacto yeast extract, 0.5% Na CD in 50%.
  • Preculture was performed at 37 ° C for about 16 hours in a medium supplemented with zg / ml ampicillin, and this was inoculated with 1% in 1.4 liters of 2YT medium, and cultured at 37 ° C for about 28 hours.
  • the cells are collected by centrifugation, suspended in 140 ml of a 5 mM dithiothreitol solution, adjusted to pH 7.0, disrupted by ultrasonication, and the residue is removed by centrifugation. (36 units / ml).
  • Example 2 Using the crude enzyme solution obtained in Example 1, the enzyme was immobilized.
  • Duolite A-568 (Rohm & Haas) was first used as a carrier for immobilization, and the pH was adjusted to 7.5 in ion-exchanged water after washing with 1M NaCl and ion-exchanged water.
  • To 8.4 g of this resin were added 20 ml and 11.5 ml of a crude enzyme solution of hydantoinase and decarbamylase adjusted to pH 7.5, respectively, and the mixture was stirred at 15 ° C. for about 20 hours under a nitrogen atmosphere. After the resin washed twice with 0.5mM MnS_ ⁇ 4 solution, and suspended in 5 volumes of deionized water, pH 7.
  • Example 2 Using the composite immobilized enzyme preparation obtained in Example 2 and the immobilized enzyme of each enzyme alone, a reaction was performed to generate the corresponding D-a-mamino acid from the 5-substituted hydantoin in a one-step reaction. .
  • Bacillus ⁇ species having the hydantoinase gene of 245 (FERM BP-4863) was used.
  • the HB101pTH104 (FERM BP-4864) was added to 20 ml of 2YT medium at 37 ° C. Precultured for 16 hours. In 2 YT medium this 1.2 rate Torr, 50 ⁇ gZml ampicillin, and were 26 hours of culture at 40 Oppm of MnCl 2. 4H 2 0 in a medium supplemented with 37 ° C.
  • the cells were centrifuged and harvested, suspended in 11111 ⁇ MnS_ ⁇ 4 aqueous solution 801 111, was adjusted to 8.5 pH with aqueous ammonia, and disrupted by ultrasonic to remove the residue by centrifugation . After adjusting the supernatant to pH 8.5, it is heat-treated at 60 ° C for 20 minutes to remove the denatured protein by centrifugation.
  • Example 2 Using this crude enzyme solution and the crude decarbamylase enzyme solution (240 units / ml) prepared in the same manner as in Example 1, a composite immobilized enzyme preparation was prepared by the method shown in Example 2. 30 ml of crude enzyme solution of decarbamylase and Hydantoina 13 ml of the crude enzyme solution was immobilized on 29 g of the resin by the method shown in Example 2 (45 units of decarbamylase, 119 units of hydantoinase, 44 units (pH 7.5) per gram of resin).
  • decarbamylase immobilized enzyme 43 units / resin lg
  • a hydantoinase immobilized enzyme was used as a resin in which two enzymes to be used as controls were separately immobilized.
  • 21.8 g of the resin for immobilization was mixed with 60 ml of the crude enzyme solution and immobilized by the method shown in Example 2 (117 units, Z resin lg, ⁇ 1 unit / g (pH 7.5)).
  • Example 5 Of the immobilized enzymes obtained in Example 5, 5 g of the complex immobilized enzyme and 5.6 g of the hydantoinase immobilized enzyme and 5.2 g of the dexamerubamylase immobilized enzyme as separately immobilized enzymes were mixed. Using the same enzyme (having the same decarbamylase activity (pH 7.5) and hydantoinase activity (PH 8.7) twice as high as the complex immobilized enzyme) in the method of Example 3 Reactions were performed with a concentration of substrate.
  • the reaction of the complex immobilized enzyme shows almost the same reactivity despite the 1H2 hydantoinase activity, and the complex immobilized enzyme can perform the reaction more efficiently.
  • expensive immobilization resin can be significantly reduced.
  • Example 5 Using 5 g of each of the composite immobilized enzymes obtained in Example 5, the effect of pH during the reaction was examined. Reaction was carried out at 3 levels of pH 7.0, 7.25 and 7.5 by the method shown in Example 3 with a 3% concentration of the substrate. The reaction times required to convert 99% of the substrates were determined to be 5.5 hours, 5.4 hours, and 6.7 hours, respectively. 5 hours, pH 7.0 and 7.25 were found to be more favorable for the reaction.
  • a composite immobilized enzyme preparation in which hydantoinase and decarbamylase are simultaneously immobilized on the same resin is used.
  • a one-step reaction can be performed with a much simpler operation than a two-step reaction, and with higher reaction efficiency than a mixture of two kinds of immobilized enzymes in which these enzymes are immobilized on separate resins. It became possible.
  • FIG. 1 shows the results of 5_ (p-hydroxyphenyl) hydantoin using the complex immobilized enzyme preparation and the mixture of immobilized enzymes obtained by immobilizing hydantoinase and decarbamylase in different resins in Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing the generation of D—p-hydroxyphenylglycine corresponding to the time course.
  • FIG. 2 is a graph showing the stability of the enzyme during the repeated reaction of the composite immobilized enzyme preparation in Example 4.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of a comparison of the enzyme activities of the composite immobilized enzyme preparation and a mixture of separate immobilized enzyme preparations (hydantoinase activity twice as high) in Example 6.

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Description

明 細 書 複合固定化酵素調製物を用いた D—ァミノ酸の製造方法 発明の分野
本発明は、 複合固定化酵素調製物およびそれを使用する D— ーァミノ 酸の製造方法に関する。 本発明の複合固定化酵素調製物は、 特に、 抗生物 質ァモキシシリンの製造に用いる D—（p—ヒドロキシフエニル）グリシン などの抗生物質の中間原料となる D— —アミノ酸の製造に役立つ。
発明の背景
医薬中間体などとして重要な化合物である光学活性 D—ァミノ酸類は、 5—置換ヒダントイン類を酵素ヒダントイナーゼ （以下、 Haseと略する） の作用で対応する D— N—力ルバミル一 一アミノ酸に不斉的に加水分解 する反応 （特公昭 62— 30785号） と、 生成した D— N—力ルバミル 一 α—アミノ酸を酵素 D— N—力ルバミル一 α—ァミノ酸ァミ ドヒ ドロラ ーゼ （以下、 デカルバミラーゼ： D Caseと略する） の作用で、 対応する D—ひ一アミノ酸に変換する反応 （PCTZJ P91Z01696) を組 合せることによって効率よく生産できることが既に知られている。
また、 これらの酵素は、 イオン交換樹脂等の担体に固定化した、 いわゆ る固定化酵素として用いると、 それぞれの反応がさらに効率よく行えるこ とが、 特開昭 63- 185382号や WO 92/00739等に開示さ れている。
し力、し、 これらの反応では、 両酵素の至適 pH、 安定 pHが大きく異なつ ているため、 2段階の反応で行う必要があり、 固定化酵素の調製も別々に 行う必要があり、 反応操作も煩雑であった。 発明の目的
本発明は、 ヒダントイナーゼおよびデカルバミラーゼの 2つの酵素が共 存する状態で （以下、 複合酵素という） 、 同一の固定化樹脂担体に同時固 定化し、 この固定化酵素樹脂を使用して、 効率よく D— 一アミノ酸を製 造する技術に関するものである。
5—置換ヒダントインを D— α—ァミノ酸へ変換する 2つの酵素反応の うち、 ヒダントイナーゼ反応は、 一般に、 至適 ρΗカ^ Η 8〜9で、 ρΗが 増すにつれて基質の溶解度が増し、 ならびにヒダントイン環のラセミ化反 応がアル力リ性において促進されることなどによって、 反応中の ρΗが 7 〜1 0の範囲で、 好ましくは、 アル力リ域で行うことが望ましい。 一方、 デカルバミラーゼ反応は、 至適 ρΗが、 一般に、 ρΗ 6 . 5〜9. 0であるが、 ρΗが増すにつれて、 生成物のアンモニアによる反応の阻害が急激に増大 するため、 反応中の ρΗは中性付近で行うことが好ましい。
これら 2つの酵素反応を 1つの反応槽で同時に行う、 いわゆる 1段反応 で行えれば、 2つの酵素を別々に反応させる、 いわゆる 2段反応と比較し て操作が簡略になるとともに、 全体の反応時間が短縮できること、 また、 可逆反応のヒダントイナ一ゼ反応と、 不可逆反応のデカルバミラーゼ反応 とを組み合わせることによってヒダントインの転換収率を向上させること ができるとともに、 その後の D—ァミノ酸の精製も簡略化できるなど、 大 きなコストダウンが可能になると考えられる。 しカヽし、 それぞれの酵素を 別々の固定化担体に固定化し、 これを混合して使用した場合、 両酵素反応 の至適 ρΗが大きく違うため、 反応性が劣り、 また、 固定化した酵素の安 定性の点でも問題があった。
そこで、 本発明者らは、 両酵素を同一の固定化担体に同時に固定化した 複合固定化酵素調製物を作製せんとして鋭意研究を重ねた。 これら両酵素 を同時固定化した場合には、 微小な樹脂内の空間で 2つの酵素反応が連続 して起こるため、 デカルバミラーゼの基質、 D— N—力ルバミル一 ーァ ミノ酸が固定 Haseより拡散して固定化 D C aseまで移行する必要がなくな ることや、 微小空間内の pH変動が小さくできることから、 それぞれの酵 素の反応性が増し、 アンモニアによる生成物阻害も緩和されるとともに、 繰返し反応の際の酵素の安定性も向上すると考えられた。
発明の概略
本発明は、 陰イオン交換樹脂よりなる固定化担体に、 アルカリ域に至適 pHを持つヒダントイナーゼ （以下、 Haseと略する） および中性付近に至 適 pHを持つ D— N—力ルバミル一 なーァミノ酸ァミ ドヒ ドロラーゼ （以 下、 D Caseと略する） を共存する状態で （以下、 複合酵素という） 同時 に固定化した複合固定化酵素を、 中性付近の pHで用いることを特徴とす る D L— 5—置換ヒダントインから 1段反応で対応する D—ァミノ酸を効 率よく製造する方法を提供するものである。
発明の詳細な説明
本発明で用いるヒダントイナーゼとしては、 動物、 植物、 微生物由来の ものが使用できるが、 工業生産のためには微生物が適している。 かかる微 生物としては、 例えば、 特公昭 6 2— 3 0 7 5 8号に開示されたものが挙 げられ、 細菌に属するものとして、ァクロモパクター属 （Achromobacter：)、 ァェロバクター属 （Aerobacter) 、 ァエロモナス属 （ Aeroraonas)、 ァグ ロノ s'クテリウム属 （ Agrobacterium)、ァノレカリゲネス属 (A lcaligenes) 、 ァルスロバクター属 （Arthrobacter) 、 バチルス属 （B acillus) 、 ブレ ビバクテリゥム属 （ B revibacterium) 、 コリネバクテリゥム属 （C oryne bacterium) ヽ 工ンテ ciノ ク夕ー属 ( E nterobacter) ヽ エルウイニ了属 ( E rwinia) 、 ェシエリヒア属 （E scherichia) 、 クレブシーラ属 （K le bsiella) 、 Sクロノく'クテ1リウム属 (Microbacterium) ヽ ミクロコッカス 属 (Micrococcus; ヽ プ o夕ミノノくク夕ー属 ( P rotaminobacter ヽ °o テウス属 （Proteus) 、 シユードモナス属 （ P seudomonas) 、 サルチナ属 ( Sartina). セラチア属 （Serratia) 、 キサントモナス属 （Xanthom onas) など、 放線菌に属するものとしてはァクチノ ミセス属 （Actinomyc es) 、 ミコノくクテリゥム属 (Mycobacterium) 、 ノカノレディア属 (Nocar dia) 、 ストレプトミセス属 （ S treptomyces) 、 ァクチノプラネス属 （A ctinoplanes) など、 かびに属するものとしてはァスペルギルス属（Asper gillus)、 ノヽ0ェシロミセス属 (Paecilomyces) ぺニシリウム属 ( P enic illium) など、 酵母に属するものとしてはキャンディダ属 （Candida) 、 ピヒア属 （Pichia) 、 ロードトルラ属 （Rhodotorula) 、 トルロプシス 属 （Torulopsis) などがある。
また、 上記の微生物の中で、 ヒダントイナーゼ活性が比較的高く実用性 の優れた菌株を具体的に例示すれば、 ァエロパクター · クロァカェ （Aer obacter cloacae) I AM 1221、 ァグロバクテリウム · リゾゲネス (A robacterium rhizogenes) I FO 13259、 ブレビパクテリゥム ' ィンサータム （ B revibacterium incertum) I F 0 12145、 コリネ ノくクテリゥム .セぺドニカム ( C orynebacterium sepedonicum) 丄 F〇 3306、 ミクロバクテリゥム 'フラバム （Microbacterium flavum) A TCC 10340、 ミクロコッカス ' ロゼゥス （Micrococcus roseus) I F 0 3764、 シユードモナス 'ストリアタ （ P seudomonas striata) I F 0 12996、 ミコバクテリゥム 'スメグマティス（Mycobacterium smegmatis) ATCC 607、 ノカルディア · コラリナ （Nocardia cor allina) I FO 3338、 ストレプトミセス ' フラベオラス （Streptom yces flaveolus) I FO 3241、 バチルス ·スピーシーズ （Bacillus sp.) KNK 108 (FERM P— 6056) 、 バチルス · スピーシ一 ズ （Bacillus sp.) KNK 245 (FERM BP— 4863) などがあ また、 遺伝子組換えによってヒダントイナーゼ産生能を付与された微生 物、 例えば、 ィー ' コリ （E. coli) HB 10 lpTHl 04 (FERM BP— 4864) など、 あるいは増強された人工微生物の生産する酵素や、 同等の活性を有する、 特開昭 53— 136583号等に開示されたジヒ ド 口ピリミジナーゼも使用可能である。
また、 本発明で用いるデカルバミラーゼとしては、 その由来については 動物、 植物、 微生物など特に制限はないが、 工業生産のためには微生物が 適している。 かかる微生物としては、 例えば、 特公昭 57— 18793号、 特公昭 63— 20520号および特公平 1一 48758号に開示されたァ グロバクテリウム属、 シユードモナス属、 アースロバクター属、 アルカリ ゲネス属、 ァクロモバクター属、 モラキセラ属、 パラコッカス属、 ァエロ パクター属、 ァエロモナス属、 ブレビバクテリウム属、 バチルス属、 フラ ボバクテリウム属、 セラチア属などの天然の微生物や、 WO 91/01 696に記載されるごとき遺伝子組換えによって脱力ルバミル酵素産生能 を付与された、 あるいは増強された人工微生物が挙げられる。 これらの微 生物の代表的な例としては、 ァグロパクテリゥム 'スピーシーズ （Agrob acterium sp. ) KNK 712 (FERM BP— 1900) 、 シユードモ ナス · スピ一シーズ （Pseudomonas sp. ) KNK 003 A (FERM B P - 3181) 、 シュー ドモナス · スピーシ—ズ (Pseudomonas species) KNK 505 (FERM BP— 3182) 、 ィー ' コリ （Escherichia coli) JM109 pAD 108 (FERM BP - 3184、 CCTCC N〇 ：M91095) 、 ィー♦ コリ JM109 pPD 304 (FERM BP_3183、 CCTCC NO： M91096) などが挙げられる。 また、 デカルバミラーゼの耐熱性に関与するアミノ酸を他のァミノ酸に 置換して、 安定化させたデカルバミラーゼを使用する場合は、 W〇 94 /03613に開示された以下の形質転換株が使用できる。 例えば、 ィー · コリ （E.coli) JM109 pAD402 (FERM BP— 3912、 C CTCC N〇 ： M93038) 、 ィー · コリ JM109 pAD 404 (F ERM BP - 3913、 CCTCC NO :M93038) 、 ィ— ' コリ
J Ml 09 pAD 406 (FERM BP - 3914) 、 ィ—— コリ J Ml 09 pAD 416 (FERM BP - 3915、 CCTCC NO： M 93040) 、 ィ一 コリ JM109 pAD428、 ィ—— コリ JM1 09 pAD429 (FERM BP - 4035) 、 ィ—— コリ JM109 pAD431、 ィ— ' コリ JM109 pAD434、 ィ一 コリ JM1 09 pAD435、 ィー ' コリ J M 109 pA D 439、 ィー · コリ J Ml 09 pAD441、 ィー ' コリ JM109 pAD 445. ィー ' コ リ JM109 pAD447、 ィ一 コリ JM109 pAD448、 ィ一' コリ J M109 PAD450、 ィー · コリ JM109 pAD421、 ィ — · コリ JM109 pAD422、 ィー 'コリ JM109 pAD423、 ィ—— コリ JM109 pAD424 (FERM BP— 4034、 CCT CC N〇 ： M93041) 、 ィ一 コリ JM109 pAD425、 ィー · コリ JM109 pAD426、 ィー · コリ JM109 pAD427、 ィ — コリ JM109 pAD451、 ィー 'コリ JM109 pAD452、 ィ—— コリ JM109 pAD453、 ィー ' コリ JM109 pAD46 1、 ィ一 コリ JM109 pAD454、 ィ— · コリ JM109 pAD 455 (FERM BP - 4036) 、 ィー · コリ JM109 pAD45 6、 ィ一 . コリ JM109 pAD468、 ィー · コリ JM109 pAD 469、 ィー 'コリ JM109 PAD470またはィー ' コリ HB10 1 pNT4553 (FERM BP - 4368、 CCTCC NO： M93 042) などの形質転換微生物が挙げられる。 この様な安定な酵素を用い ると、 本複合固定化酵素調製物の繰り返し使用に、 さらに良い結果が得ら れる
本発明で用いる酵素の生産は、 両酵素を共に生産できる微生物を用いて 同時に生産可能であり、 また、 それぞれの酵素を単独で生産する微生物を 用いて別々にまたは同時に生産することもできる。 両酵素の生産能を有す る菌としては、 天然界より分離した菌株、 例えば、 特公昭 63— 2052
0号に開示されたァグロパクテリゥム属の菌株などを用いる方法があり、 また、 これらの菌から両酵素の遺伝子を分離して、 宿主に導入した組換え 微生物、 例えば、 WO 94/00577に開示された菌などが使用でき る。 また、 両酵素遺伝子を同一または別々の微生物から分離し、 いずれの 遺伝子も発現できる形で同一ベクターに挿入したり、 複製様式の異なる別 々のべクタ一、 例えば、 pUC 19と pAC YC 184などに挿入して、 大 腸菌等の導入可能な宿主に形質転換して、 1種類の組換え微生物に両酵素 を生産させ、 使用することもできる。 これらの場合、 種々の能力を持つプ 口モーターの種類やコピー数の異なるプラスミ ドを選択することによって、 目的により両酵素の生成比率を変えることが可能であるが、 本発明におい て、 通常は、 ほぼ等量の酵素蛋白を生成する様に設定することが望ましい。 それぞれの酵素を単独に生産する微生物を用いる場合も、 天然界より分離 した菌株や、 遺伝子組換え技術を用いて作成した組換え微生物が使用可能 であるが、 その生産の際には、 それぞれの酵素生産菌を別々に培養する場 合と、 これらを種々の比率、 好ましくは、 ほぼ同量の酵素蛋白を生産する 比率で混合培養することができる場合がある。 培養は、 好気的な培養、 例えば、 フラスコ等を用いた振盪培養や攪拌式 培養槽などによる通気攪拌培養によって行うことができる。 その際に用い る培地としては、 通常、 一般的に用いられている天然栄養源、 例えば、 肉 エキスやポリぺプトンを含む栄養培地等が使用可能であるが、 ヒダントイ ナ一ゼを単独または同時に生産する場合は、 マンガンイオンを、 例えば、 塩化マンガンとして 1〜1 0 O mgノリッ トル好ましくは 2 O mgノリ ッ トル 程度添加して培養するとよい結果を得ることができる。
本発明において、 使用する酵素は精製酵素、 部分精製酵素または粗酵素 として、 場合によっては菌体のままで固定化酵素調製物中に存在していて よく、 それぞれの酵素活性を発揮できる状態にあれば、 存在型態や共存物 を問わない。
また、 本複合固定化酵素調製物の調製および使用に際しては、 酸化防止 剤を添加することにより繰返し使用にさらに良い結果が得られるが、 その 様な酸化防止剤としては、 ジチオスレィ トール、 2—メルカプ卜ェタノ一 ル、 L—システィン塩酸塩、 システアミ ン塩酸塩、 ジチォエリスリ トール、 ジチオスレィ トールとジチォエリスリ トールの混合物、 還元型グルタチォ ンなどが使用できる。
用いる固定化支持体は、 使用する酵素の固定化時の態様によって異なる が、 無細胞抽出液のような粗酵素液や硫安分画等を行つた部分精製酵素液 を固定化に供する場合は、 ィォン交換基や共有結合基をもったポリマー支 持体が使用できる。
イオン交換基を持ったポリマー支持体としては、 陰イオン交換樹脂、 例 えば、 第 1、 2、 3、 4級ァミ ンを交換基とするデュオライ ト （登録商標） Aやアンバーライ 卜 I R A (登録商標） のシリーズ、 あるいはジエタノー ル型の官能基を持つポリスチレン樹脂、 例えば、 ダイアイオン E Xなどが 使用できる。
共有結合基を持つものとしては、 アルデヒ ドを結合基として持つ置換ポ リメタクリル酸ポリマー、 ポリエチレンイミ ンノグルタルアルデヒ ド複合 体で被覆された高密度アルミナなどが使用できる。
また、 生菌体ゃ乾燥菌体のような全細胞を固定化するには、 ポリアクリ ルアミ ド、 ポリウレタンまたはアルギン酸カルシウムなどのポリマーや軽 石、 アルミナのような多孔質材料を使用することができる。
本発明の複合固定化酵素調製物は以下の様にして製造される。 Hase、 D Case各々の酵素力価を適切に調整した複合粗酵素液を支持体と接触さ せて、 各々の酵素を吸着させ、 架橋剤で処理して安定化させる。 複合粗酵 素液の調製には、 まず、 菌体を培養することによって、 それぞれの酵素を 生産させる。 その際に、 両酵素を共に生産できる菌を用いた場合には、 菌 体を採取して、 超音波破砕、 機械的破砕 （ホモジナイザーなど） 、 酵素処 理などによって無細胞抽出液を調製できる。 別々の菌によって作成する場 合は、 それぞれの菌を別々に培養し、 菌体を採取し、 無細胞抽出液を調製 してから混合する方法、 培養液または採取した菌体を混合したり、 両酵素 それぞれの生産菌を混合培養した後、 菌体を同時に破砕して 2酵素の混合 された無細胞抽出液を作成する方法等で調製できる。 両酵素を別々の菌で 生産する場合、 その生産性は菌の種類や培養方法の違いによって大きく異 なる力、 一般に、 ヒダントイナーゼは、 通常の菌で' 0 . 1〜1 0単位/ ml (ここで、 酵素 1単位は、 4 0 °C、 pH 8. 7で基質の 5— （p—ヒドロキ シフエ二ル） ヒダントインを 1分間で D— N—力ルバミル一p—ヒ ドロキ シフユ二ルグリシンに転換するのに必要な酵素量である） 、 組換え人工微 生物では 5〜1 5 0単位 Zml程度生産され、 デカルバミラーゼでは、 通常 の菌で 0. 0 1〜2単位ノ1111 (ここで、 酵素 1単位は、 4 0 °C、 pH 7. 0 で基質の D— N—力ルバミル一 p—ヒ ドロキシフヱ二ルグリシンを 1分間 で D— p—ヒ ドロキシフヱニルグリシンに転換するのに必要な酵素量であ る） 、 組換え人工微生物では 0. 1〜2 0単位 Zml程度である。 複合粗酵 素液中の Haseと D C
aseの酵素力価の割合は、 5—置換ヒダントインから D— 一アミノ酸を 製造する反応が最も効果的に進行するように調節する。 後にも記載するよ うに、 この反応は D Caseの至適 pHに近い中性付近で行われるため、 Has eの活性が最大に発揮される条件ではないなどの要因から、 両酵素活性を 調節して、 反応 pH下で同程度の酵素活性を示すようにすることが望まし い。 例えば、 PH 7. 5で反応させる場合、 ほぼ同程度の蛋白量、 活性比に してヒダントイナーゼが 5倍単位程度多く存在する酵素液を用いて固定化 反応を行うことによって、 目的とする複合固定化酵素調製物を作製するこ とができる。 固定化後にこのような活性を保っためには、 複合粗酵素液中 の酵素力価の割合が、 Hase : D Caseの比率が 1〜1 0 ： 1の範囲であ ることが望ましい。 したがって、 菌体の破砕後、 吸着させる前に、 複合粗 酵素液の酵素力価をこのように調節する。
また、 適切な酵素量を吸着させるためには、 複合粗酵素液中のデカルバ ミラーゼの酵素量の濃度を 1 0 ~ 3 0 0単位 /mlにしておくのが好ましい。 吸着される酵素の力価は添加した酵素の 2 0 ~ 9 0 %程度であり、 両酵素 とも大差ない。 '
支持体は、 交換基を食塩水などで活性化した後、 緩衝液等の中で平衡化 させたものを使用する。 上記複合粗酵素液と支持体の割合は粗酵素液の総 蛋白量を支持体の最大吸着量と同じ位にするのが好ましい。 必要に応じて 1〜 1 Ο πιΜの酸化防止剤およびノまたは 0. 5〜2 O mMのマンガンィォ ンを存在せしめ、 4 ~ 3 0 °C、 好ましくは 1 5 °Cで攪拌し、 酵素の吸着量 が所期の量に達した後 （通常 8〜4 8時間、 できれば窒素等の不活性ガス の雰囲気下で行う） 、 濾集し、 洗浄後、 架橋剤で処理して不溶化し、 安定 化させる。 架橋剤としては、 例えば 1 %以下 （好ましくは 0. 1〜0. 2 %) のグルタールアルデヒド等の公知のものが使用できる。 架橋された複合固 定化酵素調製物は、 蒸留水や緩衝液 （先に記載した酸化防止剤 0. 1〜2 0 mM、 通常、 l ~ 5 mMを含むのが好ましい） で洗浄し、 低温 （約 4 DC) にて、 密閉容器中に湿潤状態で保存する。 こうして得られた複合固定化酵 素調製物の酵素活性は、 一般に、 デカルバミラーゼについては、 5〜8 0 単位 支持体、 ヒダン卜イナーゼについては、 吸着時の条件によって、 その 1〜1 0倍程度の支持体あたりの活性がある。
つぎに、 本複合固定化酵素調製物を使用した 5—置換ヒダントインから D—ひ一アミノ酸を製造する工程について説明する。
反応は、 反応基質である 5—置換ヒダン卜インに複合固定化酵素調製物 を、 必要により抗酸化剤および またはマンガンイオンの存在下に作用さ せる。 通常、 反応は 0. 1〜2 O mMの酸化防止剤およびマンガンイオンの 存在下で行うことが好ましく、 反応式：
Figure imgf000014_0001
(式中、 Rはフユ二ル基、 水酸基で置換されたフヱニル基、 アルキル基、 置換アルキル基、 ァラルキル基またはチェ二ル基を示す） に従って進行す る。
反応基質である 5—置換ヒダントインの濃度は、 0.1〜30wZv%、 好ましくは l〜5wZv%で使用される。 複合固定化酵素調製物の使用量 は、 対基質当たり、 デカルバミラーゼ活性で、 10〜20単位/ g基質程 度で用いるのが好ましい。 反応温度は、 酵素によって異なるが、 一般には、 30°C〜60°C、 特に耐熱性の酵素ではさらに高い温度で使用することも できる。
反応 pHは 6.5〜8.0の間から適宜選ばれる。 この pH域では、 DC aseは、 ほぼ至適 pH近くであるが、 Haseは至適 pHからかなりはずれてい るため、 活性が数分の 1に低下している。 また、 DL— 5—置換ヒダント インのラセミ化速度も遅くなつている。 しかし、 D— α—アミノ酸の生成 は、 結局、 最後の工程の酵素である D Caseによって支配されるので、 こ れを基準として酵素量や反応条件 （すなわち、 D Caseの至適条件） を設 定し、 これに均合った Hase活性を組み合わせるのが好ましい。 反応条件 で異なるが、 一般には、 同程度の活性を発現できるように、 吸着される酵 素の比率を調整する。 同程度の活性とは、 反応 pH、 例えば、 pH7.5で 測定したヒダントイナーゼ活性 （単位 （PH7.5) で表される） と、 先に 記載したデカルバミラーゼ活性が、 ほぼ 0.5〜 1.5 ： 1の割合である状 態をいう。 こうして選ばれた pH域、 通常 pH7.5で制御しつつ反応をお こなう。 これらの作業により、 Haseにとつて不利な条件を克服し、 平衡 反応を D— N—力ルバミルァミノ酸の生成方向に傾け、 予想以上に効率よ く反応を行えるとともに、 基質である 5—置換ヒダントインの転換収率を 向上させることができる。 もし、 反応をヒダントイナーゼの反応至適 pH 付近のアル力リ域で行った場合には、 D— N—力ルバミルァミノ酸の生成 までは良好であるが、 デカルバミラーゼの活性が 1 Z 2以下まで低下し、 さらに、 反応によって生成したアンモニアにより大幅は反応阻害を受ける ことにより、 全体の反応効率が低下し、 デカルバミラーゼ自体の安定性も 低下することがわかっている。 これらの理由により、 複合固定化酵素調製 物を用いた反応は、 デカルバミラ一ゼの反応至適条件、 反応基質濃度付近 で、 デカルバミラ一ゼ反応がやや律速傾向となる両酵素の固定化比率の複 合固定化酵素調製物を用いれば、 効率良く行うことができる。 また、 Has eの生産性が高いこと、 D Caseが不可逆反応を接触するなどの条件がある ので、 複合固定化酵素調製物の全体の酵素活性を調節しゃすいことも有利
7よ点で ¾)る。
反応は、 カラム法や反応器中に懸濁するなどして行うが、 後者ではバッ チ反応が普通に行われ、 通常 1バッチ当たり、 6〜48時間程度の反応時 間である。 本発明の複合固定化酵素調製物を用いると、 1段反応で 5—置 換ヒダントインから対応する D—ァミノ酸を高い光学純度で効率よく高収 率で生産することが可能であった。 以下に実施例を示して本発明をさら に詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例 1
まず、 ヒダントイナーゼの酵素液を作製するため、 バチルス ·スピーシ ーズ KNK108 (FERM P— 6056) を 25◦ mlの種母培地 （1. 0%肉エキス、 1.0%ポリペプトン、 0.5%イーストエキス （pH7.0)) に植菌し、 33 °Cで約 25時間培養した。 これを 2.5リッ トルの本培養 培地 （1.0%肉エキス、 1.0%ポリペプトン、 0.5%ィーストエキス、 0.1%ゥラシル、 2 O pm MnCl2 ( H 7.5) ) に植菌し、 33°Cで約 16時間培養した。 菌体を遠心分離で集菌し、 50mlの 20mM MnS04 水溶液に懸濁し、 pHを 8.5に調整後、 超音波によって菌体を破砕し、 遠 心分離によって残渣を除き、 これをヒダントイナーゼ粗酵素液 （107単 位/ ml) とした。
また、 デカルバミラーゼの酵素液を作製するため、 ィー♦ コリ HB1 01 P T4553 (FERM BP— 4368) を 20mlの 2YT培地 (1.6%パク ト トリプトン、 1.0%バク トイーストエキス、 0.5%Na CD に 50 zg/mlのアンピシリンを添加した培地で、 37 °Cで約 16時 間前培養を行い、 これを 1.4リッ トルの 2 YT培地に 1%植菌し、 37 °Cで約 28時間培養した。 菌体を遠心分離で集菌し、 5mMジチオスレィ トール溶液 140mlに懸濁し、 pHを 7.0に調整後、 超音波で菌体を破碎 し、 遠心分離で残渣を除き、 その上清をデカルバミラーゼ粗酵素液 （36 単位/ ml) とした。
実施例 2
実施例 1で得られた粗酵素液を用いて、 酵素の固定化を行った。 固定化 用担体としてデュオライ ト A— 568 (ローム ·アンド ·ハース） をま ず 1M NaCl つぎに、 イオン交換水で洗浄後、 イオン交換水中で pHを 7.5に調整した。 この樹脂 8.4 gに、 pHを 7.5に調整したヒダントイ ナーゼおよびデカルバミラーゼの粗酵素液をそれぞれ 20ml、 11.5ml 加え、 窒素雰囲気下、 15°Cで約 20時間攪拌した。 この樹脂を 0.5mM MnS〇4溶液で 2回洗浄後、 5倍量のイオン交換水に懸濁して、 pH7. 5に調整後、 2.5%グルタールアルデヒ ド 544 / lを少しずつ添加して 35分間攪拌した。 これを 5 OmM Tris · HC1 (pH7.5) 、 δπιΜ D TT、 ImM 1^^304で1晚処理し、 濾集して複合固定化酵素調製物 （樹 脂 lg当たりヒダントイナーゼ活性 8.2単位 （pH7.5) 、 デカルバミラ ーゼ活性 9.9単位） とした。 つぎに、 対照として用いる 2つの酵素を別々に固定化した樹脂を作製し た。 ■
ヒダントイナーゼ粗酵素液 20mlまたはデカルバミラーゼ粗酵素液 60 mlを上記の固定化用担体それぞれ 4. 2 g、 22. 0 gと混合し、 上記と同 様の操作を行って、 それぞれの酵素が別々に固定化された固定化酵素樹脂 (ヒダントイナーゼ固定化酵素 24単位 樹脂 lg (2. 7単位 樹脂 lg (pH 7. 5) ) 、 デカルバミラーゼ固定化酵素 3 7単位 Z樹脂 lg) を作 製した。
実施例 3
実施例 2で得られた複合固定化酵素調製物およびそれぞれの酵素単独の 固定化酵素を用いて、 5—置換ヒダントインから 1段反応で対応する D— a—マミノ酸を生成させる反応を行った。
1 0 (^1の0. 11^ ？8 ^117. 5) 、 lmM MnS 04, 5mM DT Tに基質として 5— （ρ—ヒドロキシフヱニル） ヒダントイン l gを添加 し、 窒素ガスを十分通気後、 40°C、 pH 7. 5に調整した。 両方の酵素活 性が同じになる様に複合固定化酵素調製物 0. 9 7 gまたはヒダントイナ —ゼ固定化酵素 3. 0 gおよびデカルバミラ一ゼ固定化酵素 0. 26 gを添 加し、 窒素ガスを通気しながら 2N H2S 04または 6 N NaOHで pH 7. 5にスタツ 卜して反応を行った。 経時的にサンプリングし、 2 9時間目ま で反応を行い、 各経時での生成した P—ヒ ドロキンフエ二ルグリシンの量 を高速液体クロマトグラフィー （日本分光、 ファインパック S I L C— 1 8カラム） で分析定量した。
結果を図 1に示す。
図 1から明らかなごとく、 同一樹脂に 2つの酵素を同時固定した方が効 率よく反応が行えることがわかった。 実施例 4
複合固定化酵素調製物の繰り返し反応を行つた際の酵素活性の安定性を 調べた。 l OOml01mM MnS〇4、 5mM D TTに 5— （P—ヒ ドロキ シフユニル） ヒダントイン 2 gを添加し、 pHを 7.5に調製したものに実 施例 2で得られた複合固定化酵素調製物 8.9 gを添加し、 40°Cで窒素 ガス通気下、 pH 7.5にスタツ 卜して、 23時間反応させた。 反応液を吸 引濾過した後、 同様に反応液を加え、 反応を行う操作を 5回繰り返し、 そ れそれの反応終了時の両酵素活性を測定した。
第 1回目の反応に対する相対活性を図 2に示す。
δ回の反応で活性の低下はほとんどみられなかった。
実施例 5
ヒダントイナ一ゼの酵素液を作製するため、 バチルス♦スピーシーズ ΚΝΚ245 (FERM BP— 4863) のヒダントイナーゼ遺伝子を 持つィ一 . コリ HB101pTH104 (FERM BP— 4864) を 20mlの 2 YT培地で、 37°Cにて 16時間前培養した。 これを 1.2リツ トルの 2 YT培地に、 50 ^gZmlのアンピシリ ン、 40 Oppmの MnCl2. 4H20を添加した培地で 37 °Cにて 26時間培養した。 菌体を遠心分離 して集菌し、 801111の11111^ MnS〇4水溶液に懸濁し、 pHをアンモニア 水で 8.5に調整後、 超音波によって菌体を破砕し、 遠心分離によって残 渣を除いた。 この上清を pH 8.5に調整後、 60°C、 20分間の熱処理を 行い、 変性蛋白を遠心分離して除き、 これをヒダントイナ一ゼ粗酵素液
(1， 100単位/ ml) とした。
この粗酵素液と、 実施例 1と同様の方法で調製したデカルバミラーゼ粗 酵素液 （240単位/ ml) を用い、 実施例 2に示す方法で複合固定化酵素 調製物を作成した。 デカルバミラ一ゼ粗酵素液を 30mlと、 ヒダントイナ ーゼ粗酵素液を 13 mlを 29 gの樹脂に実施例 2に示す方法で固定化した (樹脂 lg当たりデカルバミラ一ゼ 45単位、 ヒダントイナーゼ 119単 位、 44単位 （pH7.5) )。
対照として用いる 2つの酵素を別々に固定化した樹脂として、 デカルバ ミラ一ゼ固定化酵素 （43単位/樹脂 lg) は実施例 2と同様にして作製 したものを用い、 ヒダントイナーゼ固定化酵素としては、 60mlの粗酵素 液に固定化用樹脂 21.8 gを混合して実施例 2で示す方法で固定化して 作製した （1 Ί 7単位 Z樹脂 lg、 δ 1単位/ g (pH7. 5) ) 。
実施例 6
実施例 5で得られた固定化酵素のうち、 複合固定化酵素 5 gおよび、 別 々に固定化した酵素として、 ヒダントイナーゼ固定化酵素 5.6 gと、 デ 力ルバミラーゼ固定化酵素 5.2 gとを混合したもの （複合固定化酵素と 比較して、 デカルバミラーゼ活性 （pH 7.5) が同じで、 ヒダントイナー ゼ活性 （PH 8. 7) が 2倍の活性を有する） を用いて、 実施例 3の方法で 3%濃度の基質による反応を行った。
その結果を図 3に示す。
図 3から明らかなごとく、 複合固定化酵素の反応は、 ヒダントイナーゼ 活性が 1Z2にもかかわらず、 ほぼ同程度の反応性を示しており、 複合固 定化酵素の方が効率よく反応が行え、 また、 高価な固定化用樹脂も大幅に 削減できることがわかった。
実施例 7
実施例 5で得られた複合固定化酵素各 5 gを用いて反応時の pHの影響 を調べた。 pH7.0、 7.25および 7.5の 3水準で、 実施例 3に示した 方法で 3%濃度の基質による反応を行った。 99%の基質が転換するのに 要する反応時間を調べたところ、 それぞれ 5.5時間、 5.4時間、 6.7 5時間であり、 pH 7 . 0および 7. 2 5の方が、 反応に有利であることが わかった。
以上記載したごとく、 本発明によれば、 5—置換ヒダントインから対応 する D— ーァミノ酸を製造するプロセスにおいて、 ヒダントイナーゼお よびデカルバミラ一ゼを同一樹脂に同時固定化した複合固定化酵素調製物 を用いることにより、 2段反応よりは、 はるかに簡便な操作で、 また別々 の樹脂にこれらの酵素を固定化した 2種類の固定化酵素を混合したものよ りは、 反応効率よく 1段反応を行うことが可能になった。
図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 3における、 複合固定化酵素調製物およびヒダントイナ ーゼおよびデカルバミラーゼをそれぞれ別の樹脂に固定化した固定化酵素 を混合したものを用いて、 5 _ ( p—ヒ ドロキシフヱニル） ヒダントイン から対応する D— p—ヒ ドロキシフェニルグリシンの生成を経時的に示す グラフである。
図 2は、 実施例 4における、 複合固定化酵素調製物の繰返し反応時の酵 素の安定性を示すグラフである。
図 3は、 実施例 6における、 複合固定化酵素調製物と別々の固定化酵素 調製物の混合物 （ヒダントイナ一ゼ活性 2倍） との酵素活性を対比した結 果を示すグラフである。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 固定化担体に、 アルカリ域に至適 pHを持つヒダントイナーゼ （以 下、 Haseと略する） および中性付近に至適 pHを持つ D— N—力ルバミル 一 一アミノ酸アミ ドヒ ドロラーゼ （以下、 DCaseと略する） を共存す る状態で （以下、 複合酵素という） 同時に固定化した複合固定化酵素を、 中性付近の pHで用いることを特徴とする DL— 5—置換ヒダントインか ら 1段反応で対応する D—ァミノ酸を製造する方法。
2. 固定化に用いる複合酵素を、 Haseと DCaseを別々に調製して混合 することによつて調製する請求項 1記載の D—ァミノ酸の製造方法。
3. 使用する Haseがバチルス属 （Bacillus) の細菌由来の酵素である 請求項 1または 2記載の D—ァミノ酸の製造方法。
4. 使用する Haseがバチルス 'スピーシーズ （Bacillus sp. ) KN K 108 (FERM Ρ-6056) またはバチルス ·スピーシーズ （Ba cillus sp. ) K N K 245 (FERM Ρ— 4863) 由来の酵素である 請求項 1または 2記載の D—ァミノ酸の製造方法。
5. 使用する Haseが組替えィー ' コリ （E. coli) 、 特にィー ' コリ HB 10 lpTHl 04 (FERM BP— 4864) 由来の酵素である請 求項 1または 2記載の D—ァミノ酸の製造方法。
6. 使用する D Caseがァグロバクテリゥム ' スピーシーズ （Agrobact erium sp. ) KNK 712 (FERM BP— 1900) 、 シュ— ドモナ ス . スピーシ一ズ （Pseudomonas sp. ) K N K 003 A (FERM BP -3181) 、 シユードモナス ' スピ一シ一ズ KNK 505 (FERM BP - 3182) 、 ィー ' コリ （E. coli) JM109 pAD 108 (F ERM BP— 3184) またはィー · コリ JM109 pPD 304 (F ERM BP— 3183) 由来である請求項 1または 2記載の D—ァミノ 酸の製造方法。
7. 使用する D Caseがァグロバクテリゥム 'ラジオパクター （Agroba cterium radiobacter) KNK 712 ( F E RM B P— 1900 )由来 のものをアミノ酸置換によって安定性を向上させた、 ィー · コリ （E. co li) JM109 pAD402 (FERM BP - 3912)、 ィー♦コリ JM109 pAD404 (FERM BP - 3913) 、 ィ一. コリ JM 109 pAD 406 (FERM BP - 3914) 、 ィー · コリ JM10
9 pAD 416 (FERM B P- 3915) 、 ィー · コリ JM109 p AD428、 ィ一 コリ J Ml 09 pAD 429 (FERM BP - 40 35) 、 ィー ' コリ JM109 PAD431、 ィー ' コリ JM109 P AD434、 ィ一 コリ J Ml 09 pAD435、 ィー · コリ JM10 9 pAD439、 ィー ' コリ JM109 pAD441、 ィー · コリ JM
109 PAD445、 ィ一 コリ JM109 pAD447、 ィ一 コリ JM109 pAD448、 ィ一 コリ JM109 pAD450、 ィ一 コリ JM109 pAD421、 ィ一 コリ JM109 pAD422、 ィ 一. コリ JM109 pAD423、 ィー · コリ JM109 pAD424
(FERM BP— 4034) 、 ィ一 コリ JM109 pAD425、 ィ 一 · コリ JM109 pAD426、 ィー · コリ JM109 pAD427、 ィー · コリ JM109 PAD451、 ィ— · コリ JM109 pAD45 2、 ィー ' コリ JM109 pAD453、 ィ— ' コリ JM109 pAD 461、 ィ一 コリ JM109 PAD 454、 ィー ' コリ JM109 P AD455 (FERM BP— 4036) 、 ィ— 'コリ JM109 pAD 456、 ィー ' コリ JM109 PAD468、 ィー ' コリ JM109 p AD469、 ィー ' コリ J M109 PAD470またはィ一 · コリ HB 101 p T4553 (FERM BP— 4368) である形質転換微生 物由来である請求項 1〜4のいずれか 1項記載の D—ァミノ酸の製造方法 c
8. 固定化に用いる複合酵素を、 Haseと D Caseとを同時に生産して調 製する請求項 1記載の D—アミノ酸の製造方法。
9. Haseと D Caseを同時に生産する細菌が、 ァグロバクテリウム . ス ピーシーズ （Agrobacterium sp. ) KNK- 712 (FERM BP— 1 900) 、 リゾビゥム 'スピーシーズ （Rhizobium sp. ) KNK 1415 (FERM B P- 4419) またはシユードモナス ·スピーシーズ （Ps eudomonas sp. ) KNK 003 A (FERM BP— 3181) である請求 項 8記載の D—ァミノ酸の製造方法。
10. 複合酵素を、 Haseおよび D Caseの遺伝子を同一のベクターにつ ないだプラスミ ドを揷入した宿主を培養することにより生産する請求項 8 記載の D—アミノ酸の製造方法。
11. Haseおよび D Caseの遺伝子を同一のベクターにつないだプラス ミ ドを挿入した宿主がィー ·コリ HB101pPHD301 (FERM BP— 4866) およびィー ' コリ JM109pAHD101である請求 項 10記載の D—ァミノ酸の製造方法。
12. 複合酵素を、 Haseおよび D Caseの遺伝子を複製様式の違う別々 のべクタ一につなぎ、 これらを同一の宿主に導入し、 培養することにより 生産する請求項 8記載の D—ァミノ酸の製造方法。
13. 複合酵素を Hase生産菌と DCase生産菌とを混合培養して生産す る請求項 8記載の D—アミノ酸の製造方法。
14. 各々異なる、 もしくは同じ菌株に由来するヒダントイナーゼとデ 力ルバミラーゼ、 抗酸化剤、 マンガンイオンと、 これらを担持した支持体 よりなり、 当該担持されたヒダントイナーゼとデカルバミラーゼの pH 6. 5〜 8 . 0内の反応 PHにおける酵素活性が同程度である複合固定化酵素調 製物。
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