WO1995020599A1 - Epitope a lymphocytes b d'allergene d'acariens - Google Patents

Epitope a lymphocytes b d'allergene d'acariens Download PDF

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WO1995020599A1
WO1995020599A1 PCT/JP1995/000082 JP9500082W WO9520599A1 WO 1995020599 A1 WO1995020599 A1 WO 1995020599A1 JP 9500082 W JP9500082 W JP 9500082W WO 9520599 A1 WO9520599 A1 WO 9520599A1
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lys
gly
peptide
asp
pro
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PCT/JP1995/000082
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English (en)
French (fr)
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Shigeru Ikeda
Tohru Ando
Yoshiji Hantani
Goro Ito
Original Assignee
Torii Pharmaceutical Co., Ltd.
Asahi Breweries, Ltd.
The Nikka Whisky Distilling Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43531—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from mites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Der f II which is a major allergen of Dermatophagoides farinae
  • Der f II is a peptide derivative which can be a B cell epitope and which binds to an antibody of an allergic patient sensitized to mite allergen.
  • Such peptides are used in the diagnosis and treatment of human or animal mite allergy.
  • diagnostic methods for In Vivo include a method of injecting an allergen intradermally or a method of searching for an allergen by observing a skin reaction caused by dripping onto a slightly injured skin, or a diagnosis of In V itro.
  • a method there is a method for detecting allergen-specific IgE in serum, such as the RAST method.
  • As a treatment there is a specific desensitization treatment that relieves allergic symptoms while gradually increasing the allergen in the skin subcutaneously.
  • allergens extracted from natural products have been used in these diagnostic and therapeutic methods. That is, crude allergens extracted with various buffers from substances containing allergens such as pollen, house dust, and mites are used. In addition, there is a problem in the effectiveness of treatment and the accuracy of diagnosis due to the difference between lots of raw materials. Recently, attempts have been made to produce major allergens of pollen and mites by genetic recombination in order to obtain pure allergens (R. V a1 en a., Eta 1., Int. Arc h A ller gy A p 1.
  • allergens of type I allergens It is a powerful tick belonging to De rma topha go ides.
  • mite allergens there are two major allergens: group I allergens (Derp l. Derfl) and group I allergens (Der ⁇ ⁇ ,
  • D erf ⁇ is the most important, and more than 80% of mite sensitized patients have IgE antibodies against these allergens (Ya suedaeta 1., Int. Arc h. 1. Immu no 1., 88, 402, (1 989)). Patients who also have IgE antibodies to these major allergens also have IgG antibodies (Nakanisshieta., Ann.
  • mite allergen As a method for producing mite allergen, as described above, a method of extracting from mite bodies or a culture thereof or producing the mite allergen by genetic recombination is known. It is difficult to produce major and major allergens in large quantities and purely by the method of extraction from mite bodies or cultures. On the other hand, in the production of mite allergen by genetic recombination, as in the present invention, it is not possible to produce only a low molecular weight portion which binds to an antibody in a major mite allergen protein.
  • Garman Richard D. et al. International Patent Application WO 93 08279) describe variously encoded various forms of De rfl, De rfl De rpl, and Der ⁇ go, which are major allergens of the genus De rma to phagoides. Synthesize epitopes. Ando et al. (Japanese Patent Application No. 4-2-16955)
  • these peptides are T cell epitopes that do not react with or have very weak responses to antibodies in serum and react with T cells sensitized to antigen. That is, it does not react with the antibody in the serum of mite allergic patients.
  • T cells sensitized to antigen that is, it does not react with the antibody in the serum of mite allergic patients.
  • I-type allele In the hyposensitization therapy, treatment is performed by administering a small amount of the same antigen as the sensitized antigen. Therefore, the so-called B cell epitope that reacts with the antibody in the patient's serum as well as the sensitizing antigen is important. For B-cell epitopes, see Wim
  • the present inventors have studied peptide derivatives having B cell epitope activity, and have reached the present invention.
  • the inventors of the present invention provide easily and purely a substance capable of binding to an antibody by chemically synthesizing only a portion of a major mite allergen protein that binds to an antibody. Tried. That is, a part of the amino acid sequence of Derf ⁇ , which is one of the major allergens of Dermatophagoidesfrae, was synthesized in various ways, and a peptide having antibody binding ability was found. The solubility in water was improved by introducing a 3-carboxypropionyl group at the ⁇ -terminal of the peptide or Lys-Gly-OH at the C-terminal.
  • Derf ⁇ was mixed with aluminum hydroxide gel and intraperitoneally administered to mice.
  • Antiserum against Derf was prepared. Using this serum, an ELISA experiment using the peptide of the present invention was performed. As a result, the peptide of the present invention was found to have a strong reaction activity with mouse anti-Derf ⁇ IgG. On the other hand, serum from normal mice did not react with any of the peptides.
  • peptides exhibiting strong binding ability inhibit the binding of Derf ⁇ to mouse anti-Derf ⁇ IgG, and the concentration of the peptide required for its 50 ° 0 ′ inhibition is about 1% of Derf ⁇ . It was 0000 times. Furthermore, using the human pool serum sensitized to mites, the peptide of the present invention
  • the peptide of the present invention clearly binds to mouse-human antibodies sensitized to mites.
  • the use of the peptide of the present invention makes it possible to diagnose allergies by binding to antibodies in the blood of a patient sensitized to mites.
  • IgE and IgG of humans sensitized to mites both recognize peptides derived from Der r hydrolyzed by lysylendopeptidase (Oshikaeetal., Pediatlica)
  • the peptides of the present invention also bind to human IgE antibodies.
  • the antigen-binding site of the antibody bound to human mast cells or basophils is blocked, and even if the cells are exposed again to mite allergen, the chemical mediators from these cells can be obtained. Release is inhibited and mite allergy can be treated.
  • a peptide which binds to an antibody of an allergy patient sensitized to mite allergen that is, a B cell epitope of mite allergen.
  • the present invention relates to the following peptides.
  • Suc represents a 3_carboquinpropionyl group. Furthermore, Cys 9 and Cys 15 form a disulfide bond at the side chain thiol group. ] Heptade force peptide shown by.
  • Suc represents a 3-carboxypropionyl group. Furthermore, the first Cys and the seventh Cys form a disulfide bond at the side chain thiol group.
  • Nonabeptide represented by:
  • H-Me t -Va l -A s pG 3 y-Cy s -H is -G l yS e r- A sp—Pro—C ys— I 1 e-I 1 e— ⁇ H (3)
  • Suc represents a 3-carboxypropionyl group. Furthermore, the fourth Cys and the tenth Cys form a disulfide bond at the side chain thiol group. ] The heptadecapeptide shown by these.
  • Suc represents a 3-carboxypropionyl group. Furthermore, Cys 1 and Cys 7 form a disulfide bond at the side chain thiol group. ] The heptadecapeptide shown by these.
  • Suc represents a 3-carboxypropionyl group
  • Abu represents an L- ⁇ -aminobutyric acid residue.
  • Suc represents a 3-carboxypropionyl group. Heptade force peptide c
  • Suc represents a 3-carboquinpropionyl group. Heptade Peptides.
  • Suc represents a 3-carboxypropionyl group.
  • Suc represents a 3-carboxypropionyl group. Dode force peptide shown by].
  • Suc represents a 3_carboxypropionyl group. Dode force peptide shown by].
  • the peptide of the present invention is not limited to these.
  • the peptides (1 to 11) of the present invention are generally represented by R. B. Merrifi e 1 d,
  • the obtained peptide was bound to a resin by an appropriate method and used for activity measurement.
  • a resin for example, hexamethylene diamine and then the F moc group of a polyethylene resin (pin) covered with polyacrylic acid derivatized with Fmoc-yS-alanine are removed, and succinic anhydride is reacted.
  • the peptide was condensed on the pin into which the 3-carboquinpropionyl group had been introduced.
  • Fmo c—G 1 y—0—Wang—resin content: 0.1 millimol
  • PIP piperidine
  • DIPC dimethylformamide
  • Condensation was performed by the azo (HOB t) method.
  • Fmo c—amino acid, DI PC and HOB t were added and reacted as follows: Fmo c—Lys (B oc) -OH (281 mg, 0.6 mimol), HOB T (9 2 mg, 0.6 mmol, DIPC (94 zl, 0.6 mmol) and N-methylpyrrolidinone (NMP) (3 ml) were placed in a reaction vessel and shaken twice at room temperature for 30 minutes. Finally, it was condensed.
  • Fmo c_Cy s (T rt) — OH (357 mg, 0.6 mmol), HOBT (92 mg, 0.6 mmol), DI PC (94 1, 0.6 mmol) and NMP (3 ml) was placed in a reaction vessel and shaken twice at room temperature for 30 minutes to condense.
  • Fmo c—Pro—OH (204 mg, 0.6 mmol), HOBt (92 mg, 0.6 mmol), DI PC (941, 0.6 mmol) and NMP (3 ml) was placed in a reaction vessel and condensed by shaking twice at room temperature for 30 minutes.
  • Fmo c -C ys (T rt) —OH 35 1 mg, 0.6 mimol
  • HOB t 92 mg, 0.6 mimol
  • DIPC 941, 0.6 mimol
  • NMP 3 ml
  • Fmo c—A sp (OB ut) —OH (246 mg, 0.6 mmol), HO B t (92 mg, 0.6 mmol), DIPC (94-0.6 mmol), and NMP (3 ml) was placed in a reaction vessel and condensed by shaking twice at room temperature for 30 minutes.
  • Fmo c-Va 1 -OH 203 mg, 0.6 mimol
  • HOBt 92 mg, 0.6 mimol
  • DI PC 941, 0.6 mimol
  • NMP (3 ml) was placed in a reaction vessel and shaken twice at room temperature for 30 minutes for condensation.
  • Fmo c -Ly s (B oc) -OH (281 mg, 0.6 mimol), HOBt (92 mg, 0.6 mimol), DIPC (941, 0.6 mimol) NMP (2 ml) was placed in a reaction vessel and shaken twice at room temperature for 30 minutes to effect condensation.
  • Fmo c—L ys (B oc) — OH (28 1 mg, 0.6 mimol), HOBt (92 mg, 0.6 mimol), DIPC (941, 0.6 mimol) and NMP (3 ml) was placed in a reaction vessel and shaken at room temperature for 30 minutes twice to condense.
  • This peptide resin was suspended and shaken at room temperature for 1 hour in a mixed solution of TFA (5 ml) -phenol (0.3 g) -ethanedithiol (0.5 ml), and the resin was filtered. (lml) three times. The combined filtrate and washings were evaporated to dryness, precipitated with ethyl ether, filtered and dried to give 14 Omg of the crude peptide.
  • H is 1.03 (1); G 1 y 1.98 (2); Ser 0.85 (1); As 1.05 (1) Pro 1.02 (1); Lys1.07 (1)
  • This peptide resin was suspended and shaken at room temperature for 1 hour in a mixed solution of TFA (10 ml) -phenol (0.6 g) -ethanedithiol (0.5 ml), and the resin was filtered. Then, the plate was washed three times with TFA (1 ml). The combined filtrate and washings were evaporated to dryness, precipitated with getyl ether, filtered and dried to yield 120 mg of crude peptide.
  • This crude peptide (12 Omg) was dissolved in potassium hydrogen carbonate aqueous solution (pH 8) (120 ml) and stirred for 1 day. After adjusting to pH 4 with acetic acid, the solution was purified by preparative HP LC using a Microbonders C18 reverse phase column (1.9 ⁇ 15 cm). The crude peptide is dissolved in a minimum amount of acetic acid and injected directly into the column, and the concentration of 20-28% (8 minutes) of acetonitrile / 0.01 N-HC1 is measured in a linear gradient of 10 ml / min. Eluted at the flow rate. Inspect each fraction on an analytical HP LC, collect the high-purity fractions and dry in a single run.
  • 150 mg of crude peptide synthesized in solid phase according to Example 1 was dissolved in 150 ml of an aqueous solution of potassium hydrogen carbonate (pH 8) and stirred for 1 day. After adjusting the pH to 4 with acetic acid, the mixture was purified by preparative HPLC using a micro-column Bondasphere-C18 reverse-phase column (1.9 x 15 cm). The crude peptide is dissolved in a minimum amount of acetic acid and injected directly into the column. The solution is 15-'23% (8 minutes) of acetonitrile, 0.1 ⁇ ⁇ 1 X—HC 1 min. Eluted at the flow rate.
  • Example 1 155 mg of the crude peptide synthesized in a solid phase according to Example 1 was purified by preparative HPLC using a Microbondersphere C 18 reverse phase column (1.9 ⁇ 15 cm). The crude peptide is dissolved in the minimum amount of acetic acid and injected directly onto the column, and eluted at a flow rate of 10 ml / with a linear gradient of 22-30% (8 min) acetonitrile /. did.
  • Example 1 148 mg of the crude peptide synthesized in solid phase according to Example 1 was purified by preparative HPLC using a Microbonders C18 reverse phase column (1.9 ⁇ 15 cm). The crude peptide was dissolved in a minimum amount of acetic acid, injected directly into the column, and eluted with a linear gradient of 22-30% (8 min) acetonitrile Z0.01 N-HC1 at a flow rate of 10 m1 min.
  • Example 2 140 mg of the crude peptide synthesized in a solid phase according to Example 1 was purified by preparative HPLC using a Microbonderssphere-C18 reverse phase column (1.9 ⁇ 15 cm). The crude peptide was dissolved in a minimum amount of acetic acid and injected directly onto the column, and eluted at a flow rate of 1 OmlZ with a linear gradient of 17-25% (8 min) acetonitrile / 0.01 N-HC1 . Each fraction is analyzed by HPLC for analysis, and high-purity fractions are collected and frozen.
  • Example 1 125 mg of the crude peptide synthesized in a solid phase according to Example 1 was purified by preparative HPLC using a microbonder C18 reverse phase column (1.9 ⁇ 15 cm). The crude peptide was dissolved in a minimum amount of acetic acid and injected directly onto the column, and eluted at a flow rate of 1 OmlZ with a linear gradient of 17-25% (8 min) of acetonitrile 0.01 N-HC1. . Each fraction was analyzed by HPLC for analysis, and high-purity fractions were collected and freeze-dried.
  • Crude peptide 13 Omg synthesized in solid phase according to Example 1 was purified by preparative HPLC using a Microbonders-Phase C18 reverse-phase column (1.9 ⁇ 15 cm). The crude peptide was dissolved in a small amount of acetic acid, injected directly into the column, and eluted at a flow rate of 10 ml / min with a linear gradient of 15-23% (8 min) acetonitrile 0.01 N-HC1 .
  • Example 12 ELISA using mouse anti-Derf serum using the peptide of the present invention Derf ⁇ was mixed with aluminum hydroxide gel, and intraperitoneally administered (10 g / anima 1) to AJ mice at a two-week interval for a total of four times, and then whole blood was collected to prepare antiserum against Derf ⁇ . 0.15 ml of this serum (40,000 dilution) was added to a 96-well microplate well, and a pin with Derf or the peptide of the present invention was placed in the well. Shake for 2 hours.
  • Table 1 also shows the absorbances of the results of similar experiments using normal mouse serum.
  • AZJ mouse serum (diluted 1: 1000) immunized with DerfII with peptide solutions or DerfIII solutions at various concentrations (0.2, 2, 20 mg / m1) in a test tube. I combined. Thereafter, 0.15 ml of the mixed solution was added to a 96-well microplate well, a pin having Derf bound thereto was added to the well, and the mixture was shaken at 37 ° C. for 2 hours. After the pins were washed four times with 10 mM phosphate buffer (pH 7.2), peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG (500-fold, Kappel) was added.
  • the peptide of the present invention inhibits the binding of Derf ⁇ to mouse anti-Derf g IgG, and its concentration for 50% inhibition is about 100,000 times that of Derf ⁇ . Was.
  • Example 14 ELISA experiments with human pooled sera sensitized by mites with peptides of the invention.
  • Table 3 shows the resulting absorbance values.
  • the peptide of the present invention showed a strong reaction activity with human pool serum sensitized with mites.

Description

明 細 書 ダニアレルゲンの B 細胞ェピトープ 技術分野
Dermatophagoides farinaeの主要アレルゲンである Der f IIを構成するペプチド の内、 B細胞ェピトープと成り得るペプチド誘導体で、 ダニアレルゲンに感作さ れたァレルギ一患者の抗体と結合するべプチド誘導体に関する。 このようなぺプ チドはヒトあるいは動物のダニアレルギーの診断および治療に使用される。
背景技術
アレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎の様な、 いわゆる I型アレルギー の診断および治療方法として、 原因抗原 （アレルゲン） を用いる方法が従来から 行われている。
すなわち、 I n V i v oの診断方法としてはアレルゲンを皮内に注射したり、 軽く傷つけた皮膚上に滴下して生じる皮膚反応を観察してァレルゲンを検索する 方法、 あるいは、 I n V i t r oの診断法としては、 RAST法などの様に血 清中のアレルゲン特異的 I gEを検出する方法がある。 また治療法としては、 原 因アレルゲンを皮下に漸増しながらアレルギー症状を緩和させる特異的減感作療 法がある。
これらの診断および治療方法においては従来、 天然物から抽出されたアレルゲ ンが用いられてきた。 すなわち、 花粉、 室内塵あるいはダニなどのアレルゲンを 含む物質から、 種々の緩衝液で抽出した粗アレルゲンを用いている。 また原料の ロッ ト間による差などから、 治療の有効性や診断の正確性などに問題がある。 最近、 純粋なアレルゲンを得る目的で、 花粉やダニの主要アレルゲンを遺伝子 組換えにより作製しょうという試みがなされている （R. V a 1 e n a. ， e t a 1. , I n t. A r c h. A l l e r gy A p 1.
I mmu no l. . 9 7， 287 ( 1 992 ) , 特願平 3— 262538， 特願 平 3 - 3 1 006 9 ) :
I型ァレルギ一の最も重要なアレルゲンの一つに De rma t o p h a go i d e s (ヒヨウヒダニ） に属するダニ力くある。 これ らダニアレルゲンのなかで 2種類の主要アレルゲン、 すなわちグループ Iアレル ゲン （D e r p l. D e r f l) とグループ Πアレルゲン （D e r ρ Π,
D e r f Π) は最も重要であり、 ダニに感作された患者の 80%以上がこれらァ レルゲンに対する I gE抗体を有する （Ya s u e d a e t a 1. , I n t. A r c h. A l l e r gy A p 1. I mmu n o 1. , 88， 402， (1 989 ) ) 。 またこれらの主要アレルゲンに対する I gE抗体を有する患者は I gG抗体をも有する （Na k an i s h i e t a . ， Ann.
A l l e r gy, 64， 2 1 9 (1 990) ) 。
さらに、 グループ Πアレルゲン間では 88%のアミノ酸配列の相同性を有する (C h u a e t a 1. , I n t. Ar c h. A l l e r gy A p 1. I mmu no l. , 9 1, 1 1 8 (1 990) , Yuuk i e t a 1.
J p n. J. A 1 1 e r o 1 , 39， 557, ( 1 990 ) ) 0
ところでダニアレルゲンの製造方法としては、 前述した如く、 ダニ虫体あるい はその培養物から抽出するか、 あるいは遺伝子組換えにより作製する方法が知ら れている。 し力、し、 ダニ虫体あるいは培養物から抽出する方法は、 主要アレルゲ ンを大量に、 かつ、 純粋に製造することは困難である。 一方、 遺伝子組換えによ るダニアレルゲンの製造では、 本発明の如く、 ダニの主要アレルゲンの蛋白質の なかの抗体と結合する低分子部分のみを製造することはできない。
そこで、 ダニアレルゲンのェピトープ部分を化学的に合成し、 減感作療法等に 供しょうという試みがなされている。
例えば、 Ga rman R i c h a r d D. ら （国際特許出願 WO 93 08279) は De rma t o ph a go i d e s属の主要アレルゲンである De r f l、 De r f l De r p l、 D e r ρ Πの種々にコードされる種々の ェピトープを合成している。 また、 安藤ら （特願平 4 - 2 1 6955 ) は
D e r f Πの C末あるいは N末から 1 5残基のぺプチドを合成している。
しかし、 これらのぺプチドは血清中の抗体とは反応しないかまたは非常に弱い 反応しか示さず、 抗原に感作された T細胞と反応する T細胞ェピトープである。 すなわち、 ダニアレルギー患者の血清中抗体とは反応しない。 一般に I型アレル ギ一の減感作療法では感作された抗原と同一の抗原を少量ずつ投与することによ り治療する。 そこで、 感作抗原と同様に患者の血清中抗体と反応するいわゆる B 細胞ェピトープが重要である。 B細胞ェピトープについては、 Wi m
v an' t Ho f ら （Mo l. I mmuno l. , 28， 1 225 ( 1 99 1) ) 力く D e r p Πの B細胞ェピトープを化学的に合成し、 報告している。 しか し、 彼らの報告によると D e r p Πの 65番目から 78番目のアミノ酸配列の部 分、 すなわち Ac— Va 1— P r o— G l y - I 1 e—As p— P r o— As n -A 1 a— Cy s— H i s -Ty r -Me t -Ly s-Cy s-Ly s -OH (但し、 Acは酢酸残基を示す） にのみ弱い B細胞ェピトープ活性を認めている。 しかしこのェピト一プはダニアレルギー患者のうちの一部の患者の抗体としか反 応しないことがわかっている。
発明の記載
そこで、 本発明者らは B細胞ェピトープ活性を有するぺプチド誘導体について 検討し、 本発明に至った。
本発明者らは、 ダニの主要アレルゲンの蛋白質の中の抗体と結合する部分のみ を化学的に合成することにより、 抗体との結合能をもった物質を容易に且つ、 純 粋に提供することを試みた。 すなわち、 De rma t oph a go i d e s f a r i na eの主要アレルゲンの一つである D e r f Πのアミノ酸配列の一部 を種々合成し、 抗体結合能を有するペプチドを見いだした。 また、 ペプチドの Ν 末端に 3—カルボキシプロピオニル基あるいは C末端に Ly s— G 1 y— OHを 導入することで、 水への溶解性を向上させた。
D e r f Πを水酸化アルミニウムゲルと混合してマウスに腹腔内投与し、
De r f Πに対する抗血清を作製した。 この血清を用いて、 本発明のペプチドに よる EL I S Α実験を行った。 その結果、 本発明ペプチドはマウス抗 D e r f Π I gGとの強い反応活性が認められた。 一方、 正常マウスの血清は、 いずれのぺ プチドとも反応が認められなかった。
また、 強い結合能を示したぺプチドは D e r f Πとマウス抗 D e r f Π I gG との結合を阻害し、 その 5 0 °0'阻害に必要とするベプチドの濃度は D e r f Πの 約 1 0000倍であつた。 さらに、 ダニに感作されたヒトプール血清を用いて、 本発明のペプチドによる
EL I S A実験を行った。 その結果、 本発明ペプチドはヒト抗 De r f Π I gG との強い反応活性が認められた。
このことは、 本発明のペプチドは明らかにダニに感作されたマウスゃヒトの抗 体に結合することを意味している。 言い換えると、 本発明のペプチドを用いるこ とにより、 ダニに感作されている患者の流血中の抗体と結合することによりァレ ルギ一の診断が可能となる。 またダニに感作されたヒ卜の I gEおよび I gGは リジルェンドぺプチダーゼによって加水分解された D e r Π由来のぺプチドを ともに認識する （Os h i k a e t a l. , P e d i a t r i c
Re s e a r c h, 33， 209 (1 993) ) ことより、 本発明のぺプチドは ヒ卜の I gE抗体とも結合することがわかる。 本発明のぺプチドを用いることに より、 ヒト肥満細胞や好塩基球上に結合している抗体の抗原結合部位は塞がれ、 再度ダニアレルゲンに暴露されてもこれらの細胞からの化学伝達物質の遊離は阻 害され、 ダニアレルギーの治療が可能となる。
本発明により、 ダニアレルゲンに感作されたアレルギー患者の抗体と結合する ぺプチド即ちダニアレルゲンの B細胞ェピトープが提供される。
より詳細には、 本発明は以下のペプチドに関する。
Su e— I 1 e— Ly s-Ly s— Va 1— Me t— V a 1— As p— G l y―
Cy s— H i s— G 1 y— S e r— As p— P r o— Cy s— Ly s-G l y OH ( 1 )
[式中、 S u cは 3 _カルボキンプロピオ二ル基を示す。 さらにに 9番目の Cy sと 1 5番目の Cy sは側鎖チオール基でジスルフィ ド結合を形成している。 ] で示されるヘプタデ力べプチド。
S u c-Cy s— H i s-G l y-S e r-As p— P r o-Cy s-Ly s- G 1 y-OH (2)
[式中、 S u cは 3—カルボキシプロピオ二ル基を示す。 さらに 1番目の Cy s と 7番目の Cy sは側鎖チオール基でジスルフィ ド結合を形成している。 ] で示 されるノナベプチド,：
H-Me t -Va l -A s p-G 3 y-Cy s -H i s -G l y-S e r- A s p— P r o— C y s— I 1 e - I 1 e—〇H (3)
[式中、 5番目の Cy sと 1 1番目の C y sは側鑌チオール基でジスルフィ ド結 合を形成している。 ] で示されるトリデカペプチド。
S u c - V a 1 - A s p -G 1 y— Cy s— H i s -G 1 y— S e r— As p— P r o-Cy s- I 1 e— I 1 e— H i s-Ar g-G l y-Ly s -G l y- OH (4)
[式中、 S u cは 3—カルボキシプロピオ二ル基を示す。 さらに、 4番目の Cy sと 1 0番目の Cy sは側鎖チオール基でジスルフィ ド結合を形成している。 ] で示されるヘプタデカペプチド。
Su e— Cy s— H i s— G l y— S e r— As p— P r o— Cy s— I 1 e— I 1 e— H i s— Ar — G l y— Ly s-P r o-Ph e— Ly s-G l y— OH (5)
[式中、 S u cは 3—カルボキシプロピオ二ル基を示す。 さらに、 1番目の Cy sと 7番目の C y sは側鎖チオール基でジスルフィ ド結合を形成している。 ] で 示されるヘプタデカペプチド。
S u e— G l y— S e r— As p— P r o— Abu— I 1 e— I 1 e— H i s— A r g— G l y-Ly s-P r o-Ph e-Th r-L e u-Ly s-G l y - OH (6)
[式中、 S u cは 3—カルボキシプロピオ二ル基を示し、 Abuは、 L— α—ァ ミノ酪酸残基を示す。 ] で示されるヘプタデカペプチド。
Su e— I 1 e— I 1 e— H i s— A r g-G l y-Ly s -P r o-Ph e— Th r— Le u— G l u— A 1 a— L e u— Ph e— As p— L"y s— G 1 y— OH (7)
[式中、 S u cは 3—カルボキシプロピオ二ル基を示す。 ] で示されるヘプタデ 力ペプチド c
S u c— Ly s— P r o— Ph e— Th r— L e u— G 1 u— A 1 a— L e u— Ph e— As p— A 1 a - A s n -G 1 n-As n-Th r-Ly s -G 1 y -
OH 8 )
[式中、 S u cは 3—カルボキンプロピオ二ル基を示す。 ] で示されるヘプタデ カぺプチド。
S u e— G l u - A 1 a-L e u-Ph e-As p-A l a - A s n -G 1 n - A s n-Th r-Ly s -Th r-A l a-Ly s -Th r-Ly s -G l y- OH (9)
[式中、 S u cは 3—カルボキシプロピオ二ル基を示す。 ] で示されるヘプ夕デ 力べプチド。
S u e— A l a-L e u-Ph e-As p-A l a— As n— G i n— As n— Th r-Ly s -Ly s -G l y-OH (1 0)
[式中、 S u cは 3—カルボキシプロピオ二ル基を示す。 ] で示されるドデ力べ プチド。
Su e— Ph e— As p— A l — A s n— G 1 n— As n— Th r— Ly s— Th r-A l a-Ly s-G l y-OH (1 1)
[式中、 S u cは 3 _カルボキシプロピオ二ル基を示す。 ] で示されるドデ力べ プチド。
なお、 本発明のペプチドはこれらに限定されるものではない。
本発明のぺプチド （ 1〜 1 1 ) は、 一般に、 R. B. Me r r i f i e 1 d、
J. Am. C h em. S o c. 85、 2 1 49 ( 1 963 ) に記載されているよ うな方法を使用して調製することが出来る力 <、 他の同等の既知の化学的合成方法 を用いることもできる。
個々のべプチドの純度は分析用 H P L Cで検査を行った。 ァミノ酸分析、 質量 分析の結果は理論値と良く一致していた。
得られたペプチドを適当な方法で樹脂に結合させて、 活性測定に使用した。 例 えば、 へキサメチレンジァミン、 ついで、 Fmo c— yS—ァラニンで誘導体化し たポリアクリル酸で表面を覆ったポリェチレン製樹脂 （ピン） の F m o c基を除 去し、 無水コハク酸を反応させることで、 3—カルボキンプロピオ二ル基を導入 したピンに、 ペプチドを縮合させた。
本発明によりダニァレルゲンに感作されたァレルギ一患者の抗体と結合するべ 千ドを^、 こ へフ :チドを ¾いてダニ丁しルギ一 診断および治療を f亍ぅこと ができた。 以下の例は、 本発明を例示するものであり、 これを限定するものではない。
例 1 化合物 1のヘプ夕デカぺプチドの製造
0. 2 gの Fmo c— G 1 y— 0— Wa n g—樹脂 （含量； 0. 1 ミ リモル） を固相合成用反応容器に入れて、 2 0%ピぺリジン （P I P) ZN， N_ジメチ ルホルムアミ ド （DMF) で Fmo c基を除去してアミノ基をプロトン化した後、 遂次 Fmo c _アミノ酸誘導体を N， N' —ジイソプロピルカルポジイミ ド （D I P C) — 1—ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル （HOB t ) 法で縮合を行った。 Fmo c—アミノ酸、 D I PCおよび HOB tは次のように添加し反応を行った； Fmo c— Ly s (B o c) -OH (2 8 1 mg, 0. 6 ミ リモル） 、 HOB T (9 2mg、 0. 6 ミ リモル） 、 D I PC (9 4 z l、 0. 6 ミ リモル） およ び N—メチルピロリジノン （NMP) (3m l ) を反応容器に入れて室温で 3 0 分 2回振とうして縮合した。 Fmo c_Cy s (T r t) — OH (3 5 7mg、 0. 6 ミ リモル） 、 HOBT (9 2mg、 0. 6 ミ リモル） 、 D I PC (94 1、 0. 6 ミリモル） および NMP (3m l) を反応容器に入れて室温で 3 0 分 2回振とうして縮合した。 Fmo c— P r o— OH (2 0 4 mg、 0. 6 ミリ モル） 、 HOB t (92m g、 0. 6 ミ リモル） 、 D I PC (9 4 1、 0. 6 ミリモル） および NMP (3ml ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とう して縮合した。 Fmo c— As p (OBu t) — OH (2 47mg、 0. 6 ミリ モル） 、 HOB t (9 2mg、 0. . 6リモル） 、 D I PC (9 4〃 1、 0. 6 ミ リモル） および NMP (3m l) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とう して縮合した。
Fmo c— S e r (Bu t) -OH (2 3 Omg. 0. 6 ミ'リモル） 、 HO B t (9 2mg、 0. 6 ミ リモル） 、 D I PC (9 4 1、 0. 6 ミ リモル） お よび NMP (3m l ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とうして縮合した c Fmo c-G 1 y-OH (1 7 8mg, 0. 6 ミ リモル） 、 HOB t (9 2mg、 0. 6 ミ リモル） 、 D I PC (9 4〃 1、 0. 6 ミ リモル） および NMP (3 m l ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とうして縮合した。 Fmo c— H i s (T r t J -OH (3 7 1 mg, 0. G ミ リモル） 、 H O B t (9 2 m g , 0. 6 ミリモル） 、 D I PC (9 4 1、 0. 6 ミリモル） および NMP (3 m 1 ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とうして縮合した。
Fmo c -C y s (T r t ) —OH (3 5 1 mg、 0. 6 ミ リモル） 、 HOB t (9 2 mg、 0. 6 ミ リモル） 、 D I P C (9 4 1、 0. 6 ミ リモル） およ び NMP (3 m l ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とうして縮合した。 Fmo c -G l y-OH ( 1 7 8mg. 0. 6 ミ リモル） 、 HOB t (9 2mg、 0. 6 ミリモル） 、 D I P C (9 4〃 1、 0. 6 ミリモル） および NMP (3 m l ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とうして縮合した。
Fmo c— A s p (OB u t) — OH (2 4 6 mg、 0. 6 ミ リモル） 、 HO B t (9 2mg、 0. 6 ミ リモル） 、 D I P C (9 4 し 0. 6 ミリモル） お よび NMP (3 m l ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とうして縮合した。 Fmo c-Va 1 -OH (2 0 3m g、 0. 6 ミ リモル） 、 HOB t (9 2mg、 0. 6 ミ リモル） 、 D I PC (9 4 1、 0. 6 ミ リモル） および NMP (3 m l ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とうして縮合した。 Fmo c— Me t -OH (2 2 2mg、 0. 6 ミ リモル） 、 HOB t (9 2mg、 0. 6 ミ リモル） 、 D I PC (9 4 K 0. 6 ミリモル） および NMP (3 m l ) を反 応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とうして縮合した。
Fmo c— V a l — OH (2 0 3 mg、 0. 6 ミ リモル） 、 HOB t (9 2 mg、 0. 6 ミリモル） 、 D I PC (9 4 // K 0. 6 ミリモル） および ΝΜΡ (3m l ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とうして縮合した。
Fmo c -Ly s (B o c) -OH (2 8 1 mg、 0. 6 ミ リモル） 、 HOB t (9 2mg、 0. 6 ミ リモル） 、 D I P C (9 4 1、 0. 6 ミ リモル） およ び NMP (2m l ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とう'して縮合した。 Fmo c—L y s (B o c) — OH (2 8 1 mg、 0. 6 ミ リモル） 、 HOB t (9 2mg、 0. 6 ミ リモル） 、 D I P C (9 4 1、 0. 6 ミ リモル） および NMP (3m l ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 2回振とうして縮合した。 Fmo c— I 1 e -OH (2 1 l mg、 0. 6 ミ リモル） 、 HOB t (9 2 mg、 0. 6 ミ リモル） 、 D I P C (9 4 〃 1、 0. 6 ミ リモル） および NMP (2 m 1 ) を反応容器に入れて室温で 3 0分 回振とうして ¾|合した。 了ミノ末端の Fmo c基を 2 0 %P I PZDMFで除去した後、 トリェチルァミ ン （ 1 4 0 1 1 ミリモル） 、 無水コハク酸 （1 0 Omg、 1 ミリモル） および NMP (3m l ) を反応容器に入れて室温で 1 0分 2回振とうして 3—カルボキシプロ ピオ二ル基を導入した。
乾燥すると、 S u c _ I 1 e -L y s (B o c) —Ly s (Bo c) -V a 1 -Me t -Va l -A s p (OB u t ) — G l y_Cy s (T r t) - H i s (T r t) — G l y - S e r (Bu t) —A s p (OBu t) — P r o— Cy s 、 (T r t) -Ly s (Bo c) — G l y— O— Wa n g—樹脂が得られた。 この ペプチド樹脂を TFA (5m l ) 一フエノール （0. 3 g) —エタンジチオール ( 0. 5m l ) の混合溶液中、 室温で 1時間懸濁および振とうした後、 樹脂を濾 過し、 TFA (l m l ) で 3回洗浄した。 濾液と洗液を集め蒸発乾固し、 ジェチ ルエーテルで沈澱させ、 濾過し、 乾燥すると、 1 4 Omgの粗ペプチドが得られ た。
1 4 0 mgのこの粗ペプチドを炭酸水素カリウム水溶液 （pH8) 1 4 0ml に溶解させ、 1日間撹拌した。 酢酸で pH 4に調整後、 マイクロボンダスフエア — C 1 8逆相カラム （1. 9 X 1 5 cm) を用いる調製用 H PLCで精製した。 粗ペプチドは最小量の酢酸に溶解させカラムに直接注入し、 1 0〜1 8% (8分） ァセトニトリル Z 0. 0 1 N-HC 1の直線グラジヱントの条件で 1 0m l Z分 の流速で溶離した。 各分画を分析用 H PLCで検査し、 高純度の分画を集め凍結 乾燥すると、 6 8mgの S u e— I l e— Ly s— Ly s—Va l—Me t— V a 1一 As p— G l y— Cy s— H i s -G 1 y— S e r— A s p— P r o— C y s -Ly s -G 1 y-OH (S— S結合； Cy s 9— Cy s l 5) が得られた。 酸加水分解後のァミノ酸分析値： I l e 0. 9 9 (1) ； Ly s 2. 87 (3 ) ； V a 1 1. 9 2 (2) ； Me t 0. 96 (1 ) ； As p 2. 1 0 (2) ； G 1 y 3. 2 1 (3) ； H i s 1. 0 0 ( 1 ) ； S e r 0. 9 3 ( 1 ) ; P r o 1. 0 3 (1)
FAB質量分析値： mz'z = 1 7 7 2. 0 ( (M+H) · )
例 2 化合物 2のノナぺプチドの製造
冽 1に準じて固相台成した粗べブチド 8 2 m gを炭酸水素力リゥム水溶液 (pH 8 ) 8 0m lに溶解させ、 1 日間撹拌した。 酢酸で P H 4に調整後、 マィ クロボンダスフエア一 C 1 8逆相カラム （ 1. 9 X 1 5 c m) を用いる調製用 HPL Cで精製した。 粗べプチドは最小量の酢酸に溶解させ力ラムに直接注入し、 1 0- 1 8 % (8分） ァセトニトリル / 0. 0 1 - H C 1の直線グラジェント の条件で 1 0m 1 Z分の流速で溶離した。 各分画を分析用 H P L Cで検査し、 高 純度の分画を集め凍結乾燥すると、 3 5111 の3110 _。 5—1"1 1 3—0 1 7 - S e r -A s p -P r o -C y s -L y s -G l y-OH (S— S結合； C y s 1 -C y s 7) が得られた。
酸加水分解後のァミノ酸分析値： H i s 1. 0 3 ( 1 ) ； G 1 y 1. 9 8 (2) ； S e r 0. 8 5 ( 1 ) ； A s 1. 0 5 ( 1 ) ； P r o 1. 0 2 ( 1 ) ； L y s 1. 0 7 ( 1 )
FAB質量分析値： m/z = 9 0 0. 9 ( (M+H) + )
例 3 化合物 3のトリデカぺプチドの製造
例 1に準じて固相合成を行い、 ァミノ末端の Fmo c -Me t—OHを縮合し た後、 2 0 %P I PZDMFで Fmo c基を除去し、 乾燥すると、 H_Me t - V a 1 -A s p (OB u t) — G l y— C y s (T r t) —H i s (T r t) - G 1 y - S e r (B u t) 一 A s p (OB u t ) 一 P r o— C y s (T r t) - I 1 e - I 1 e— O—Wa n g—樹脂が得られた。 このペプチド樹脂を T FA ( 1 0m 1 ) —フヱノール （0. 6 g) —エタンジチオール （0. 5 m l ) の混 合溶液中、 室温で 1時間懸濁および振とうした後、 樹脂を濾過し、 TFA ( 1 m l ) で 3回洗浄した。 濾液と洗液を集め蒸発乾固し、 ジェチルエーテルで沈 澱させ、 濾過し、 乾燥すると、 1 2 0 mgの粗ペプチドが得られた。
この粗ぺプチド 1 2 Omgを炭酸水素カリウム水溶液 （pH 8) 1 2 0 m 1に 溶解させ、 1日間撹拌した。 酢酸で pH 4に調整後、 マイクロボンダスフヱァー C 1 8逆相カラム （ 1. 9 X 1 5 cm) を用いる調製用 HP L Cで精製した。 粗ペプチドは最小量の酢酸に溶解させカラムに直接注入し、 2 0〜2 8 % (8 分） ァセトニトリル /0. 0 1 N-HC 1の直線グラジヱン卜の条件で 1 0 m 1 Z分の流速で溶離した。 各分画を分析用 HP L Cで検査し、 高純度の分画を集め し1結乾燥するこ、 υ m gの H― M e t - " a i 一 A s p— G 1 y— C y s一 H i s— G l y— S e r— A s p— P r o— C y s— I 1 e - I 1 e -OH (S 一 S結合； C y s 5— C y s 1 1 ) が得られた。
酸加水分解後のァミノ酸分析値： Me t 1. 1 7 ( 1 ) ； V a 1 0. 9 8 ( 1 ) ： A s p 2. 0 5 ( 2 ) ； G 1 y 2. 0 0 (2) ； H i s 1. 1 3
( 1 ) ； S e r 0. 9 3 ( 1 ) ； P r o 1. 0 3 ( 1 ) ； I 1 e 1. 6 8 (2)
FAB質量分析値： m/z = 1 3 4 3. 7 ( (M+H) ')
例 4 化合物 4のヘプタデカペプチドの製造
例 1に準じて固相合成した粗べプチド 1 4 4 m gを炭酸水素力リゥム水溶液 (PH8) 1 4 0m lに溶解させ、 1日間撹拌した。 酢酸で p H 4に調整後、 マ イク口ボンダスフヱァー C 1 8逆相カラム （し 9 X 1 5 cm) を用いる調製用 HPLCで精製した。 粗べプチドは最小量の酢酸に溶解させカラムに直接注入し、 1 0〜1 8% (8分） ァセトニトリルノ 0. 0 1 N-HC 1の直線グラジェント の条件で 1 Om lZ分の流速で溶離した。 各分画を分析用 HP LCで検査し、 高 純度の分画を集め凍結乾燥すると、 7 3mgの S u e— Va 1 -A s p-G 1 y — Cy s— H i s -G l y-S e r-A s p-P r o-Cy s - I 1 e— I 1 e — H i s -A r g-G 1 y -L y s -G 1 y-OH (S— S結合； Cy s 4— C y s 1 0 ) が得られた。
酸加水分解後のァミノ酸分析値： V a 1 0. 9 8 ( 1 ) ； A s p 2. 0 5
(2) ； G 1 y 4. 1 5 (4) ； H i s 1. 9 3 (2) ； S e r 0. 8 8 ( 1 ) ； P r o 1. 0 2 ( 1 ) ； I 1 e 0. 9 3 (2) ； A r g 0. 9 6
( 1 ) ； L y s 1. 0 8 (1 )
FAB質量分析値： m/z= 1 74 8. 9 ( (M + H) * )
例 5 化合物 5のヘプダデカペプチドの製造
例 1に準じて固相合成した粗べプチド 1 5 0 mgを炭酸水素力リウム水溶液 (pH 8) 1 5 0m lに溶解させ、 1日間撹拌した。 酢酸で P H 4に調整後、 マ イク口ボンダスフエア一 C 1 8逆相カラム （ 1. 9 X 1 5 cm) を用いる調製用 HPLCで精製した。 粗ペプチドは最小量の酢酸に溶解させカラムに直接注入し、 1 5〜 '2 3 % ( 8分） ァセトニトリル， 0. ϋ 1 X— H C 1の直線グラジェン ト の条件で 1 0m 1 Z分の流速で溶離した。 各分画を分析用 HPLCで検査し、 高 純度の分画を集め凍結乾燥すると、 7 7111 の31_1 じ—じ 5—1^ 1 s— G l y 一 S e r— A s p— P r o— Cy s— I 1 e - I 1 e— H i s— A r g— G l y -Ly s-P r o-Ph e-Ly s -G l y-OH (S - S結合； Cy s 1 - C y s 7) が得られた。
酸加水分解後のアミノ酸分析値： H i s 2. 0 1 (2) ： G l y 3. 24 (3) ； S e r 1. 02 (1) ; As p 1. 1 9 ( 1 ) ； P r o 2. 1 6 (2) ; I 1 e 1. 75 (2) ； A r g 0. 96 ( 1 ) ； Ly s 2. 27 (2) ； Ph e 1. 1 1 (1)
FAB質量分析値： m z = 1 850. 1 ( (M + H) " )
例 6 化合物 6のヘプタデカペプチドの製造
例 1に準じて固相合成した粗べプチド 1 5 Omgをマイクロボンダスフヱァー C 1 8逆相カラム （1. 9 X 1 5 cm) を用いる調製用 H P L Cで精製した。 粗 ペプチドは最小量の酢酸に溶解させカラムに直接注入し、 1 5〜23% (8分） ァセトニトリル Z 0. 0 1 N-HC 1の直線グラジヱントの条件で 1 0ml /分 の流速で溶離した。 各分画を分析用 H PLCで検査し、 高純度の分画を集め凍結 乾燥すると、 1 1 5mgの S u c_G l y— S e r— As p— P r o— Abu— I 1 e— I 1 e— H i s— A r g— G l y— Ly s— P r o— Ph e— Th r— L e u-Ly s-G l y—OHが得られた。
酸加水分解後のアミノ酸分析値： G l y 3. 1 2 (3) ； S e r 0. 9 1 ( 1 ) ； A s p 1. 05 ( 1 ) ； P r o 2 0 1 (2) ； Ab u 1 2 ( 1 ) ； I 1 e 1. 82 (2 ) ； H i s 0 88 ( 1 ) ； A r g 93 ( 1 ) ； L y s 2. 03 (2) ； P h e 1 03 ( 1 ) ； Th r 00 ( 1 ) ； L e u 0. 9 1 (1)
例 7 化合物 7のヘプタデカペプチドの製造
例 1に準じて固相合成した粗ペプチド 1 55 mgをマイクロボンダスフエアー C 1 8逆相カラム （ 1. 9 X 1 5 cm) を用いる調製用 H P L Cで精製した。 粗 ペプチドは最小量の酢酸に溶解させカラムに直接注入し、 22~30% (8分） ァセトニトリル/. 0. ϋ 1 X - H C 1の直線グラジェン 卜の条件で 1 0m l / の流速で溶離した。 各分画を分析用 H PLCで検査し、 高純度の分画を集め凍結 乾燥すると、 1 23mgの S u e— I 1 e - I 1 e -H i s— A r g— G l y— Ly s-P r o-Ph e-Th r-L e u-G l u— A l a— L e u— Ph e— As p-Ly s -G l y-0 Hが得られた。
酸加水分解後のァミノ酸分析値： I l e 1. 56 (2) ； H i s 1. 04 ( 1 ) ； A r g 0. 9 5 ( 1 ) ； G 1 y 2. 04 (2) ； L y s 2. 05
(2) ； P r o 1. 0 3 (1) ； P h e 2. 1 6 (2) ； Th r 1. 00 ( 1 ) ； L e u 2. 09 (2) ； G 1 u 1. 1 0 ( 1 ) ； A 1 a 1. 07 (1) ； As p 0. 94 (1)
例 8 化合物 8のヘプタデカペプチドの製造
例 1に準じて固相合成した粗ぺプチド 1 48 mgをマイクロボンダスフヱァー C 1 8逆相カラム （1. 9 X 1 5 cm) を用いる調製用 H P L Cで精製した。 粗 ペプチドは最小量の酢酸に溶解させカラムに直接注入し、 22〜30% (8分） ァセトニトリル Z0. 0 1 N-HC 1の直線グラジヱン卜の条件で 1 0m 1 分 の流速で溶離した。 各分画を分析用 H PLCで検査し、 高純度の分画を集め凍結 乾燥すると、 1 20mgの Su e— Ly s— P r o— Ph e— Th r— Le u— G 1 u - A 1 a— L e u— Phe— As p— A l a— A s n— G 1 n— As n— Th r-Ly s-G l y— OHが得られた。
酸加水分解後のアミノ酸分析値： Ly s 1. 94 (2) ； P r o 1. 03 ( 1 ) ； P h e 2. 04 (2) ； Th r 1. 88 (2) ； L e u 1. 98 (2) ； G 1 u 2. 07 (2) ； A 1 a 2. 04 (2) ； A s p 3. 1 0
(3) ： G 1 y 0. 9 1 (1)
例 9 化合物 9のヘプタデカぺプチドの製造
例 1に準じて固相合成した粗ぺプチド 1 40 mgをマイクロボンダスフエア一 C 1 8逆相カラム （1. 9 X 1 5 cm) を用いる調製用 H P L Cで精製した。 粗 ペプチドは最小量の酢酸に溶解させカラムに直接注入し、 1 7〜25% (8分） ァセトニトリル /0. 0 1 N-HC 1の直線グラジヱントの条件で 1 Om lZ分 の流速で溶離した。 各分画を分析用 H PLCで検査し、 高純度の分画を集め凍結 •乙'燥すると、 1 1 5mgの S u e— G l u— A l a— L e u— Ph e— As p— A 1 a— As n— G l n— As n— Th r— Ly s— Th r— A l a— Ly s— u
Th r-Ly s-G l y— OHが得られた。
酸加水分解後のアミノ酸分析値： G 1 u 2. 02 (2) ； A 1 a 3. 02 (3) ； L e u 0. 98 ( 1 ) ： P h e 1. 00 ( 1 ) ； A s p 3. 03 (3) ； Th r 2. 96 (3 ) ; L y s 3. 06 (3) ； G 1 y 0. 93 (1)
例 1 0 化合物 1 0のドデ力べプチドの製造
例 1に準じて固相合成した粗ぺプチド 1 25 mgをマイクロボンダスフヱァー C 1 8逆相カラム （1. 9 X 1 5 cm) を用いる調製用 H P L Cで精製した。 粗 ペプチドは最小量の酢酸に溶解させカラムに直接注入し、 1 7〜25% (8分） ァセトニ卜リル 0. 0 1 N— HC 1の直線グラジヱントの条件で 1 OmlZ分 の流速で溶離した。 各分画を分析用 H PLCで検査し、 高純度の分画を集め凍結 乾燥すると、 92mgの Su c—A l a— L e u— Ph e— As p—A l a— A s n— G l n-As n-Th r-Ly s-Ly s-G l y— OHが得られた。 酸加水分解後のァミノ酸分析値： A l a 1. 95 (2) ； L e u 0. 92 ( 1 ) ； P h e 0. 99 ( 1 ) ； A s p 3. 1 0 (3) ； G 1 u 1. 05 ( 1 ) ； Th r 0. 96 (1 ) ； L y s 2. 03 (2) ； G 1 y 1. 00 (1)
例 1 1 化合物 1 1のドデカぺプチドの製造
例 1に準じて固相合成した粗ぺプチド 1 3 Omgをマイクロボンダスフヱァー C 1 8逆相カラム （1. 9 X 1 5 cm) を用いる調製用 H PLCで精製した。 粗 ペプチドは «小量の酢酸に溶解させカラムに直接注入し、 1 5〜23% (8分） ァセトニトリル 0. 0 1 N-HC 1の直線グラジヱントの条件で 1 0ml /分 の流速で溶離した。 各分画を分析用 H PLCで検査し、 高純度の分画を集め凍結 乾燥すると、 98mgの S u c— Ph e—As p—A l a— As n— G l n - A s n-Th r-Ly s-Th r-A l a-Ly s-G l y— OHが得られた。 酸加水分解後のァミノ酸分析値： Ph e 0. 97 ( 1 ) ； A s p 3. 06 (3) ； A 1 a 1. 97 (2) ； G 1 u 1. 02 ( 1 ) ； Th r 1. 95 ( 2 ) ： L y s 2. 0 2 ( 2 ) ： G 1 y 1. 00 ( 1 )
例 1 2 本発明のぺプチドによる、 マウス抗 D e r f Π血清を用いた EL I S A D e r f Πを水酸化アルミニウムゲルと混合して A Jマウスに 2週間隔で計 4回腹腔内投与 （1 0 g/a n i ma 1 ) 後、 全採血し、 De r f Πに対する 抗血清を作製した。 この血清 ( 40000倍希釈） を 9 6穴マイクロプレートウ エルに 0. 1 5 m 1ずつ添加し、 このゥエルに、 D e r f Πあるいは本発明ぺプ チドを結合させたピンを入れ、 37°C、 2時間振とうした。 ピンを 1 0 mMのリ ン酸緩衝液 （PH7. 2) で 4回洗浄後、 ペルォキシダーゼ標識ャギ抗マウス I gG ( 5000倍、 カッペル社） の入った 96穴マイクロプレートウエル （0. 1 5ml//ゥエル） に入れ、 37°C、 2時間振とうした。 ピンを 1 0 mMのリン 酸緩衝液 （pH2. 7) で 4回洗浄後、 オルトフヱ二レンジァミン溶液を新たな 96穴マイクロプレートウエルに 0. 1 5ml添加し、 これにピンを入れて室温 で 30分間反応した。 マイクロプレートリーダーで各ゥエルの 45 O nmにおけ る吸光度を測定した。
正常マウスの血清を用いた同様の実験の結果の吸光度を併せて表 1に示す。
表 1
マウス I gGとの結合能 （4 5 0 nmにおける吸光度） ィ匕合物番"^ マウス抗 D e r r Π血? W 正常マウス血清
1 0. 1 3 1 0. 0 0 4
2 0. 0 8 0 0. 0 0 5
3 0. 2 8 1 0. 0 0 5
4 0. 5 3 1 0. 0 0 6
5 0. 3 8 8 0. 0 0 5
6 0. 1 8 6 0. 0 0 6
7 0. 5 3 6 0. 0 0 8
8 0. 5 5 6 , 0. 0 0 5
9 0. 0 1 9 0. 0 0 4
1 0 0. 0 1 8 0. 0 0 5 ·
1 1 0. 0 1 7 0. 0 0 5
D e r f Π 0. 9 3 5 0. 0 0 9
表 1から明らかのように、 本発明のぺプチドは正常マウスの血清とは反応力認 められなかったのに対し、 マウス抗 D e r f Π I g Gとの強い反応活性が認めら れた。
例 1 3 本発明化合物の抗体中和実験。
De r f Πで免疫した AZ Jマウス血清 ( 1 0 0 0 0倍希釈） と各種濃度 （0. 2、 2、 20 mg/m 1 ) のペプチド溶液あるいは D e r f Π溶液を試験管の中 で混ぜ合わせた。 その後、 これら混合溶液を 9 6穴マイクロプレートウヱルに 0. 1 5m l添加し、 このゥヱルに D e r f Πを結合させたピンを入れ、 3 7度 、 2時間振とうした。 ピンを 1 0 mMのリン酸緩衝液 （ p H 7. 2 ) で 4回洗浄後、 ペルォキシダーゼ標識ャギ抗マウス I gG ( 5 0 0 0倍、 カッペル社） の入った 96穴マイクロプレートウエル （0. 1 5 m 1 Zゥエル） に入れ、 37 °C、 2時 間振とうした。 ピンを 1 0 mMのリン酸緩衝液で 4回洗浄後、 オルトフヱ二レン ジァミン溶液を新たな 96穴マイクロプレートウエルに 0. 1 5m l添加し、 こ れにピンを入れて室温で 30分間反応した。 マイクロプレートリーダーで各ゥェ ルの 450 nmにおける吸光度を測定した。 D e r f Π (l OmgZm l) を血 清と同量混合した時の値を 1 00 %阻害とし、 1 %B S Aリン酸食塩緩衝液 (pH7. 4) と血清を同量混合した時の値を 0%とし、 各濃度での阻害率を求 めた。 これより 50 %阻害を示す濃度を表 2に示した。 表 2
マウス抗 D e r f Π I gGとの結合中和能
Figure imgf000019_0001
表 2から明らかなように、 本発明のペプチドは De r f Πとマウス抗 De r f Π I gGとの結合を阻害し、 その 50 %阻害に有する濃度は D e r f Πの約 1 0 000倍であつた。
例 1 4 本発明のぺプチドによる、 ダニで感作されたヒトプール血清を用いた EL I S A実験。
ダニで感作されたヒトプール血清 （50倍希釈） を 96穴マイクロプレートウ エルに 0. 1 5 m 1ずつ添加しこのゥエルに、 D e r f Π由来ペプチドを結合さ せたピンを入れ、 37 °C、 2時間振とうした。 ピンを 1 0 mMのリン酸緩衝液 ( H 7. 2 ) で 4回洗浄後、 ペルォキシダ一ゼ標識ャギ抗ヒ ト I gG (50 0 0倍、 カッペル社） の入った 96穴マイクロプレートウエル （0. 1 5m 1 ゥ エル） に入れ、 3 7°C、 2時間振とうした。 ピンを 1 0 mMのリン酸緩衝液 (pH 7. 2) で 4回洗浄後、 オルトフヱ二レンジアミン溶液を新たな 9 6穴マ イク口プレートウヱルに 0. 1 5m l添加し、 これにピンを入れて室温で 3 0分 間反応した。 マイクロプレートリーダーで各ゥエルの 4 5 0 nmにおける吸光度 を測定した。
結果の吸光度の値を表 3に示す。 表 3
ヒト I gGとの結合能 （4 5 0 nmにおける吸光度） 化合物番号 ヒト抗 D e r f Π血清
1 0. 0 9 9
4 0. 0 8 5
6 0. 5 37
7 0. 2 7 7
8 0. 5 1 1
9 0. 6 5 2
D e r f Π 0. 9 6 6
表 3から明らかのように、 本発明のペプチドはダニで感作されたヒトプール血 清との強い反応活性が認められた。

Claims

請求 の 範 囲
1. ダニアレルゲンの Der f Πを構成するペプチドの誘導体で式 （I ) 、 式
(Π) あるいは式 （m) のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド誘導体 Cy s -H i s -G l y-S e r -A s p-P r o-C y s (I )
I 1 e - I 1 e— H i s— A r g— G l y— Ly s— P r o— Ph e— Th r— L e u (Π)
P h e - A s p -A 1 a - A s n -G 1 n-A s n-Th r -Ly s (I)
2. X-Cy s -H i s - G l y - S e r— A s p - P r o_Cy s— Y
[式中、 Xは N 一 3—カルボキシプロピオニル基、 N«— 3—カルボキシプロ ピオニル一 V a 1— A s p— G l y、 H— Me t— V a l— A s p— G l y、 ま たは Να— 3—カルボキシプロピオ二ルー I 1 e— L y s— Ly s— Va 1— M e t— Va l— A s p— G l yを、 Yは L y s— G l y— OH、 l i e— l i e -OH. I 1 e - I 1 e— H i s -A r g-G 1 y-Ly s -G 1 y— OHまた は I 1 e— I 1 e— H i s -A r g-G l y-Ly s -P r o-Ph e -Ly s -G 1 y— OHを示す。 さらに 1番目の C y sと 7番目の Cy sは側鎖チォ一 ル基でジスルフィ ド結合を形成している。 ] で示されるペプチドである請求項 1 に記載のぺプチド。
3. a - I 1 e - I 1 e -H i s -A r g-G l y-Ly s -P r o-Ph e -Th r-L e u-b
[式中、 aは Nな一 3—カルボキシプロピオニル基または Να— 3—カルボキシ プロピオ二ルー G l y— S e r— A s p— P r o— Ab uを、 bは Ly s— G l y— OHまたは G 1 u - A 1 a— L e u— Ph e— A s p— L y s— G l y- OHを示し、 そして Ab uは、 L—な一アミノ酪酸残基を示す。 ] で示されるぺ プチドである請求項 1に記載のぺプチド。
4. C— P h e— A s p— A 1 a— A s n— G l n— A s n— Th r— Ly s 一 d
[式中、 cは — 3—カルボキンプロピオニル、 — 3—カルボキンプロピ ォニル一 A 1 a— L e u、 Na- 3一カルボキシプロピオ二ルー G 1 u— A 1 a 一 L e uまたは Να— 3一カルボキシプロピオニル _ L y s— P r o— Ph e— Th r— L e u— G 1 u_A 1 a_L e uを、 dは G l y— OH、 Ly s_G l y— OH、 Th r-A l a-Ly s-G l y— OHまたは Th r— A 1 a— Ly s -Th r-Ly s— G 1 y— OHを示す。 ] で示されるペプチドである請求項 1に記載のぺプチド。
5. N末端に 3—カルボキシプロピオ二ノレ基あるいは C末端に Ly s— G 1 y— OHを導入した、 請求の範囲 1〜 4のいずれか一つに記載のぺプチド。
6. 請求の範囲 1〜4のいずれか一つに記載のぺプチドからなるダニアレル ギー診断薬および治療薬。
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