WO1995018220A1 - Chaine d'adn utilisee pour la synthese de xanthophylles, synthese et procede de preparation de xanthophylles - Google Patents

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WO1995018220A1
WO1995018220A1 PCT/JP1994/002220 JP9402220W WO9518220A1 WO 1995018220 A1 WO1995018220 A1 WO 1995018220A1 JP 9402220 W JP9402220 W JP 9402220W WO 9518220 A1 WO9518220 A1 WO 9518220A1
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dna strand
polypeptide
enzymatic activity
acid sequence
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PCT/JP1994/002220
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Norihiko Misawa
Keiji Kondo
Susumu Kajiwara
Akihiro Yokoyama
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Marine Biotechnology Institute Co., Ltd.
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0093—Oxidoreductases (1.) acting on CH or CH2 groups (1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the present invention is useful for deepening cultured seafood such as tai, salmon, and shrimp, and is used in foods as a coloring agent and an antioxidant.
  • the present invention relates to a method for producing a xanthofinolate (ketocarotide) containing a keto group such as obtained ataxanthin.
  • Xanthophyll ( ⁇ anth Q phy 11) is a general term for carotenoid pigments containing oxygen, such as hydroxyl, keto, and epoxy groups.
  • Carotinide is derived from mevalonic acid as a starting material and isoprenoid biosynthetic pathway that is common to steroid pentanoids. And synthesized.
  • C15 fullnesylpyrrolinic acid (FPP) produced by the isoprene basic biosynthesis system is C5 isopenteninolepyrrolinic acid (F5).
  • FPP fullnesylpyrrolinic acid
  • GGPP geranylgeranylpyrrolic acid
  • the phytoene is synthesized.
  • the phytoene is made up of a series of unsaturated reactions, phytoiluene, ⁇ -carotene, and neurosporene. 0 sp 0 rene) and lycopene (1 ycopene), and this lycopene is converted to -carotene (S-car 0 tene) by a cyclization reaction. It is done.
  • the red cinnamon finaxole, astaxanthin is especially red fish such as marine creatures such as tai and salmon, and crustaceans such as ryuji and shrimp. It is a representative animal carotenoid widely existing in Japan. In general, animals are unable to biosynthesize carotenoids, so they ingest carotenoids synthesized by microorganisms and plants from the outside world. There is a need . For this reason, astaxanthin has been widely used for the purpose of deep-coloring cultured fish and shellfish such as tai, salmon and shrimp. In addition, astaxanthin is not only used as a coloring agent in foods, it also removes active oxygen generated in the living body that causes cancer.
  • Sources of astaxanthin are known to include crustaceans such as Antarctic krill, cultures of the yeast Pha ffia, cultures of the green alga Ha ema tococcus, and organic synthesis methods. It is. However, Antarctica
  • the present invention relates to a ketone necessary for producing a xanthan file (keto carotenoid) containing a keto group including ataxanthin.
  • a xanthan file keto carotenoid
  • the microorganisms are able to obtain a xanthofinolate containing a keto group such as ataxanthin.
  • DNA strands containing a group of genes necessary for producing tokalotinoid) and astaxanthin using a microorganism into which the DNA strands have been introduced.
  • a xant file containing a starting keto group (keto The purpose is to provide a manufacturing method for
  • marine bacteria can produce astaxanthin ('Yokoyama, A., Izumida, H., Miki, W., 'Ma rinebacteriapro du cedastax an thin'. L Otii Internati ona ls ym osi um on carotenoids, abstract, CL 11-3, 1993) and, in the case of bacteria, a series of related genes. May or may not constitute a cluster, and, in the case of bacteria, the genes may or may not be functionally expressed in Escherichia coli. Attention was paid to this, and this marine bacterium was selected as a genetic source.
  • a group of ataxanthin-synthesizing genes constitutes a cluster, which is functionally expressed in Escherichia coli, and these gene products are: The ability to use 5-carotene or lycopene as a substrate has been demonstrated for the first time in the present invention.
  • the DNA chain according to the present invention is as shown below.
  • It has a nucleotide sequence that hybridizes to the DNA strand described in (4) above and encodes a polypeptide having the enzymatic activity described in (4) above. DNA strand.
  • (11) 3rd hydroxy- ⁇ -ionon ring It has an enzymatic activity to convert a len group into a keto group, and the amino acid sequence substantially corresponds to the amino acid number from 1 to 211 shown in SEQ ID NO: 1.
  • the enzyme has an enzymatic activity to convert the methylene group at the 4-position of the 3-hydroxy- ⁇ -ionon ring to a keto group, and the amino acid sequence is substantially Specifically, a D-chain having a base sequence encoding the polypeptide of the amino acid sequence from amino acid number 1 to amino acid number 24 shown in SEQ ID NO: 5. .
  • An amino acid sequence having an enzymatic activity to convert zeaxanthin to astaxanthin via 4-keto zeaxanthin Has a nucleotide sequence that substantially encodes the polypeptide of the amino acid sequence from amino acid number 1 to amino acid number 2 to 21 shown in SEQ ID NO: 1. .
  • the enzyme has an enzymatic activity to convert it to astaxanthin, and the amino acid sequence is substantially from amino acids 1 to 242 shown in SEQ ID NO: 5.
  • the enzyme has the enzymatic activity of adding one hydroxyl group to the 3-position carbon of the 4-keto- ⁇ -ionon ring, and the amino acid sequence substantially corresponds to SEQ ID NO: 2.
  • (21) A nucleotide sequence that hybridizes to the DNA strand described in (20) above and encodes a polypeptide having the enzyme activity described in (20) above. The DNA strand that you have.
  • the enzyme has the enzymatic activity of adding one hydroxyl group to the carbon at position 3 of the 4-keto- ⁇ -ionone ring, and the amino acid sequence substantially corresponds to SEQ ID NO: 6.
  • a D-chain having a nucleotide sequence encoding the polypeptide of the amino acid sequence from amino acid number 1 to 162 as shown.
  • (23) A nucleotide sequence that hybridizes to the DNA strand described in (22) above and encodes a polypeptide having the enzyme activity described in ( ⁇ ) above. The DNA strand that you have.
  • the present invention also relates to a method for producing a xanthophyll, that is, the method for producing xanthophyll according to the present invention is described below. .
  • the DNA strand according to any one of (1) to (9) above is converted into a microorganism having the ability to produce ⁇ -carotin. Introducing the transformed microorganism in a culture medium, and collecting cantaxanthin or echinenone from the culture. Manufacturing method of finale.
  • Figure 1 shows the nucleotide sequence of the ketotransferase gene (crtW gene) of the marine bacterium Ag robacterium aurantiacuss. No v. MK1 and the amino acid sequence of the encoded polypeptide. This is an explanatory diagram.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the hydroxyltransferase gene (crtZ gene) of the marine bacterium Ag r obacteri um aurantia cu s_s p. No v. MK1 and the polypeptide encoded by it.
  • FIG. 2 is an explanatory view showing an amino acid sequence of the present invention.
  • Fig. 3 shows the nucleotide sequence of the lycopene cyclase gene (mi gene) of the marine bacterium Ag robacteri um aura-nti-acu ss. N0 v.
  • FIG. 3 is an explanatory view showing the amino acid sequence of a peptide.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram showing an array following FIG.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram showing the nucleotide sequence of the xanthophyll-synthesizing gene group of the marine bacterium Agrobaccteriumumaurantiacu_ssp.n0v.MK1.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram showing the sequence :. 'following FIG.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram showing an array following FIG.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram showing an array following FIG.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram showing an array following FIG.
  • FIG. 10 is an explanatory diagram showing the mechanism of the power mouth tinoide biosynthesis pathway of the non-photosynthetic bacterium Erwiniaua redovora and the function of the carotenoid synthesis gene.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram showing functions of a virus synthesis gene.
  • Fig. 12 contains genes for the xanthophyll synthesis of the marine bacterium Agrobaccterium auran acu s-sp. N0 v. MK1
  • FIG. 13 shows marine bacteria A 1 ca 1 igeness p.
  • PC- FIG. 13 shows marine bacteria A 1 ca 1 igeness p.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram showing the nucleotide sequence of the ket group transfer enzyme gene (crtW gene) 1 and the amino acid sequence of the encoded polypeptide.
  • Fig. 15 is an explanatory diagram showing the sequence following the figure.
  • Fig. 15 shows the nucleotide sequence and code of the hydroxylase gene (crtZ gene) of the marine bacterium A1ca1igeness p.
  • PC-1 Fig. 16 is an explanatory diagram showing the amino acid sequence of the polypeptide shown in Fig. 16.
  • the xanthophyll synthesis gene of the marine bacterium A1ca1igeness p. PC-1 A to D in the illustrations showing the base sequences of the groups correspond to A to D in FIGS. 13 to 15.
  • FIG. 17 is an explanatory diagram showing the array following Fig. 16
  • Fig. 18 is an explanatory diagram showing the array following Fig. 17
  • Fig. 19 is an oceanographic diagram BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing various Delane a plasmids containing a xanthophyll synthesis gene (group) of the bacterium A1ca1igeness p. PC-1.
  • the outlined P indicates the promoter of lac of the vector pBluescripip11SK +.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing functions of a santofil synthesis gene.
  • the minor raw total path is indicated by the dotted arrow.
  • the present invention relates to a marine bacterium, a bacterium, Agr 0 ba _ c te _ rium _ aur _ antiacussp. lcaligen—e _s p.
  • xanthofinol ketocarotide
  • a keto group such as astaxanthin derived from PC-1
  • a xanthan file containing a keto group such as ataxanthin (ketocarotenoid) using a microorganism into which the DNA strand has been introduced. That is, ataxanthin, phenicoxanthin, 4-ketozeaxanthin, cantaxanthin, and jaxanthin.
  • a method for producing quinenone is provided.
  • the DNA strand according to the present invention has a principle, in principle, from the viewpoint of the fine chemical generation reaction, and in principle, the above (1), (10) and
  • polypeptides encoded by the D-chain according to the present invention have substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NOS: 1-2 and 5-6 (Figs. 1-2 and 1--2). In the specific range (for example, SEQ ID NO: 1 (FIG. 1)) as described above in FIGS. 3 to 15), the sequence is amino acid number 1 to 212. It has an amino acid sequence (A to B in Fig. 1).
  • the four types of polypeptides encoded by these DNA chains ie, involved in the xanthophyll-forming reaction
  • the four enzymes may have deletions, substitutions, additions, etc. in some of the amino acids as long as they have the enzymatic activity as described above. See Example 13).
  • DNA strands (1) to () are genes encoding ket group transfer enzymes (designated crtW).
  • crtW ket group transfer enzymes
  • a typical example is the crt cloned from the marine bacterium Agro obacterium aurantiacus sp. Nov. MK1 or A1ca1 igenes—sp. It is a W gene and can be expressed by A to B in Fig. 1 (amino acid numbers 1 to 21 2 in SEQ ID NO: 1) or A to B in Fig. 13 to 14
  • the crt W gene product (hereinafter also referred to as CrtW) is a keto (methylene) group at position 4 of the ⁇ -ionon ring (yS-icnonerin).
  • yS-carotene ⁇ -carotene
  • It is an enzyme activity that synthesizes cantaxanthin (cantxanthin) through e) (see Fig. 11).
  • the crtW gene product contains a 3-hydroxy-ionion ring.
  • zeaxanthin zea X anthin
  • 4-keto zeaxanthin 4-ke
  • ⁇ -carotin zeaxanthin can be produced in microorganisms such as Escherichia coli.
  • the crtE, crtB, crtI, and crtY genes of Erwinia confer ⁇ -carotin-producing ability to microorganisms such as E. coli.
  • the crtE, crtB, crtI, crtY, and crtZ genes of Erwinia confer zeaxanthin-producing ability to microorganisms such as E. coli (FIG. 10 and the aforementioned W091 / (See 13 G Publication).
  • the substrate for CrtW is supplied from these Erwinia ert gene groups, it can be used for microorganisms such as Escherichia coli that contain the above-mentioned Etwinia crt gene group.
  • crt W jg gene When we introduce the crt W jg gene to them, for ⁇ -carotin-producing microorganisms, cantaxanthin is passed through echinenon, and for zeaxanthin-producing microorganisms, it is passed through 4-ketozeaxanthin. It will produce astaxanthin.
  • the DNA strands (19) to (II) are genes (designated crt Z) that code for a hydroxylase.
  • a typical example is the marine bacterium—Ag 0 bacteri um aurantiacuss. Nov. MK1; r is the crt Z gene cloned from AI ca 1 igeness p. PC-1. 2 (amino acid numbers 1 to 162 in SEQ ID NO: 2) or C to D in FIG. 15 (amino acid numbers in SEQ ID NO: 6).
  • It is a DNA strand consisting of a nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid sequence up to 1 to 16 2).
  • the crt Z gene product (hereinafter also referred to as Crt Z) has an enzymatic activity that adds one hydroxyl group to the 3rd carbon of the ⁇ -ionon ring () S-i'onerin).
  • Crt Z has an enzymatic activity that adds one hydroxyl group to the 3rd carbon of the ⁇ -ionon ring () S-i'onerin).
  • One of the specific examples is the use of ⁇ -carotene (/ S-carotene) as a substrate and ⁇ -cryptoxanthin (yS-cryptp). It is an enzyme activity that synthesizes zeaxanthin (zeaxantliin) via toxan thin) (see Fig. 11).
  • the ni gene product also has an enzymatic activity that adds one hydroxyl group to the 3-position carbon of the 4-keto-ionion ring (4-keto- ⁇ -ionone ring).
  • an enzymatic activity that adds one hydroxyl group to the 3-position carbon of the 4-keto-ionion ring (4-keto- ⁇ -ionone ring).
  • cantha X antin as a substrate for phoenixanthine. It is an enzymatic activity that synthesizes astaxanthin (asta ⁇ anthin) via coxant li ⁇ n) (see Fig. 11).
  • the latter polypeptide having enzymatic activity and the DNA strand that encodes it are not known in the past.
  • a gr 0 bacterium and Alcaligenes OC rt Z are amino acid sequence levels, each of which is equivalent to the C rt Z of Er ⁇ iniau r_e dovora, and W% and It had a high hologram of 58% identity.
  • Ao er 0 bacterium and Alcaligenes OC rt Z are amino acid sequence levels, each of which is equivalent to the C rt Z of Er ⁇ iniau r_e dovora, and W% and It had a high hologram of 58% identity.
  • the homologue of CrtZ between A1ca1iRenes is the amino acid sequence level and has a high homology of 90% identity. Mouth jie showed.
  • Substrates for C rt Z include the Erinia ⁇ tE, c_rt ⁇ ⁇ crt U crt Y gene (producing S-carotin), and
  • crtits are supplied from Agrobacterium or Alcaligenes with the addition of the crtW gene (cantaxanthin production).
  • the crtZ gene of Agrobacterium or Alcaligenes is introduced into microorganisms such as Escherichia coli containing genes, the ⁇ -carotin-producing microorganisms become Zeaxanthin is produced via santin, and astaxanthin is produced by cantanxanthine-producing microorganisms via panicoxanthin. To become savvy.
  • the amino acid sequence is substantially changed from E to F in Figs. 3 and 4.
  • the DNA strand encoding the amino acid sequence up to is a gene encoding the lycopine cyclase (crt Named Y).
  • crt Named Y is a gene encoding the lycopine cyclase (crt Named Y).
  • It is a DNA strand consisting of a nucleotide sequence that encodes a polypeptide having an amino acid sequence.
  • the crt Y gene product (hereinafter also referred to as Crt Y) is an enzyme that synthesizes yS-carotin (S-carotene) using lycopene (1 ye Q pene) as a substrate. (See Fig. 11).
  • yS-carotin S-carotene
  • lycopene (1 ye Q pene
  • lycopene can be produced by microorganisms such as Escherichia coli, that is, Erwiin.
  • the nia crtE, crtB, and crtI genes confer lycopene-producing ability on microorganisms such as E. coli (see FIG. 10 and the aforementioned W091 / 13 (see ⁇ 8 publication)). Therefore, the substrate for CrtY of Arobacterium is supplied by the group of crt genes of Erwinia, and thus includes the _rt group of ErV inia described above.
  • Introduction of Agrotacterium crt Y into microorganisms such as Escherichia coli could produce carotene.
  • the C rt Y of Agr 0 bacterium is significant at the amino acid sequence level, with the C rt Y of Erwiniauredovora being 44.3% of the identity. It has homology and the functions of the enzymes are the same for both (see Fig. 10 and Fig. 11). Mycological properties of marine bacteria
  • Mk1 and A1ca1igeness p.PC-1 of the marine bacterium from which the xanthophyll synthesis gene was obtained were as follows: It shows various mycological properties.
  • Bacterial shape, size rod-like, 0.9 ⁇ m ⁇ 1.2 m
  • Flagella with perihair
  • Gravy agar slant culture grows in a non-diffusible, glossy, orange band.
  • Broth liquid culture grows uniformly throughout the medium and shows orange color.
  • Gravy gelatin Puncture culture Grows on the surface, mainly at the puncture hole
  • Pigment formation fat-soluble red-orange pigment
  • Negative citrate, phosphate, dalconate, carboxylate, succinate, adipicate
  • Flagella with perihair
  • Gravy agar slant culture grows in a non-diffusive, glossy, orange band.
  • Broth liquid culture grows uniformly throughout the medium and shows orange color.
  • Broth gelatin puncture culture Growing on the surface centering on the puncture hole c (3) Physiological properties Pigment formation: fat-soluble red-orange pigment
  • ketocarotenoids such as astaxanthin (Yokoyama, A .; , 1 zumida, H., Mi ki, W., 'Ma rinebacteriapr odu cedast axan t li in'. 10 th I nte rn ata ona ls ymp os
  • MK1 as a probe to obtain a strong DNA fragment from the chromosomal DNA of A1ca1 igenes PC-1.
  • the crtW and crtZ genes were used as DNA fragments to be pre-hybridized. (See Examples for details).
  • the inventors have determined that the remaining 14 types of oceans capable of synthesizing astaxanthin can be obtained.
  • A1 terom on a_s_SD-402 was selected from the bacteria, chromosomal DNA was prepared therefrom, and a DNA fragment containing crt W and crt Z of Ag, aurantiacus p. No v. MK1 was prepared.
  • the DNA 'strand according to the present invention comprises the DNA strand (2), (4), (6), (8), (11), (13), (15), (17), (17) 20), (22), (24), and (26), including DNA strands to be hybridized.
  • One means for obtaining a DNA strand having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of each of the above enzymes is to reduce the length of the strand according to the method of nucleic acid synthesis.
  • Agr 0 nov. MK1 or Alcaligen ess.PC- 1Oh A DNA digested with appropriate restriction enzymes and used as a library in E. coli.
  • the library is used to create methods that are commonly used in the field of gene engineering, for example, by a suitable probe. It may be preferable to obtain this (due to other marine bacteria). See xanthophyll synthesis genes).
  • the DNA strand of the present invention as described above may be converted into an appropriate bacterium (for example, Escherichia coli, Zym0m0_n asmobi1 ⁇ s, Agrobacterium um tumefaciens), a yeast (for example, Saccharomyces cescerevisiae), or the like. By introducing it into microbes, various kinds of xantho fizelles can be produced.
  • an appropriate bacterium for example, Escherichia coli, Zym0m0_n asmobi1 ⁇ s, Agrobacterium um tumefaciens
  • yeast for example, Saccharomyces cescerevisiae
  • the following is an outline of the method for introducing a foreign gene into a preferred microorganism.
  • Procedures or methods for introducing and expressing a foreign gene into a microorganism such as Escherichia coli are not limited to those described below in the present invention. Including those that are more commonly used in different fields, the methods or methods (for example, 'Vectorsforcl on inggenes', Methodsin Enzymologgy, 216, p. 469-631, 1992, Ac ad emic Press, and '0 therbacterialsyst ems', Me t ho dsin En z ymo logy, 20 4, p. 305-636, 1991, Ac ad emic Press).
  • a vector for Escherichia coli having a lac promoter such as a pUC system or a pBluescript system.
  • the present inventors have proposed that a lac-promoter can be obtained by using a colon bacterium vector pBliiiscript II SK or KS having a 1 ac promoter or the like. Those who will receive the transfer transcript of the key l. nov.MK1's crtW, crtZ, and crtY genes and Alcaligenessp.PC-1's crtW and crtZ genes were inserted into j, and these genes were transformed with E. coli. Was expressed.
  • yeast S accharomy cescerevisiae such as the lithium method, which can be performed using it
  • expression of a foreign gene in yeast is carried out by using a promoter and a terminator such as PGK and GPD to transfer the foreign gene to the promoter and the terminator.
  • PGK and GPD a terminator
  • the YRp system (a yeast multimers that uses the ARS sequence of the yeast chromosome as an origin of replication) Copy vector), YEp system (multi-copy vector for yeast having an origin of replication of yeast 2 ⁇ m DNA), ⁇ ⁇ ⁇ system (no origin of yeast replication) By inserting it into a vector such as a yeast chromosome integration vector).
  • the introduction of foreign genes into the ethanol-producing bacterium Zymomon asmobi 1is can be performed by a conjugative transfer method common to Gram-negative bacteria. Expression of the foreign gene can be carried out, for example, using the vector pZA22 for Zymomon as mobilis (Katsumi Nakamura, ⁇ Molecular breeding of ZymoMonas bacteria), Japan Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry, p. 1016-1
  • Plant pathogenic bacteria The introduction of foreign genes into A grobacteri um tumefaciens can be achieved by conjugation transfer that is common to Gram-negative bacteria. Expression of the foreign gene can be performed, for example, using the vector for A grobacteri um tumefaciens ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ awa (Misawa, N., Y amano, S., I kenaga, H., 'Productionof ⁇ -carotenein Zymomonasmobilisand—Ag—rocte rj_um tumefaciensbyintroductionofthebiosynthesis genesfromErwiniauredoyora'.Ap 1.Environ n. See).
  • Farnesylpyrrolinic acid is not only carotenoid, but also sesquiterpen, tritenolene, sterol, hono. It is a substrate that is common to wild-type nodes such as knoles. In general, all microorganisms are essentially intermediate metabolites, even if they cannot synthesize carotenoids, but because they do, they do. Should have an FPP. On the other hand, carotenoid synthesis of non-photosynthetic bacterium Erwinia The gene group uses FPP as a substrate, and is a substrate of the crt gene product of Agrobacterium aurantlacusspno v.
  • K1 or Aca1 lenessp PC-1 that is, lycopene, ⁇ - It is possible to synthesize up to rotin and zeaxanthin (see Fig. 10).
  • the present inventors have found that not only Escherichia coli but also the above-mentioned microorganisms, that is, yeast, accharomascescerevisiae, an ethanol-producing bacterium Zym0m0nasmobiI is a plant pathogenic bacterium Ag robacterium tume ⁇ aciens was introduced with Erwinia's crt gene group, and these microorganisms can produce carotenoids such as yS-carotin as expected.
  • the carotenoid synthesis genes derived from Erwinia and the DNA strand of the present invention are combined and introduced simultaneously into the same microorganism.
  • Agrobacterium aurant nov. iacu_s_s.nov.MK1 or Alcaligeness.PC-1 a group of carotenoid synthesis genes derived from PC-1 are combined and introduced simultaneously into the same microorganism.
  • all microorganisms for which a gene transfer expression system has been established can produce ketocarotides such as astaxanthin xanthine. It should be.
  • methods for producing various ketocarotinoides by microorganisms will be described.
  • One of the DNA strands typically Ag roba cteri um aurantiacuss.nov.
  • MK1 or A ⁇ ca1 igenes PC-1 (_ ⁇ _ rtW gene) is introduced into microorganisms such as Escherichia coli and expressed, and as a final product, Xenanthin can produce echinenone as an intermediate metabolite.
  • Xenanthin can produce echinenone as an intermediate metabolite.
  • the plasmid pAK916 inserted into pBluescript IIS K- was introduced into Escherichia coli IM1Q1, which was cultured until the stationary phase, and the cells were collected.
  • the rotoride dye was extracted. 94% of the extracted pigment was cantaxanthin and 6% was echinenone. In addition, the yield of cantaxanthin was 3 mg from 2 liters of the culture broth.
  • _Erwiniauredovora A plasmid containing the crt E, crt B, crtl, and crt Y genes inserted into the E. coli vector PACYC184, a plasmid pACCAR16 um crtX, and Alcaligenes PC- Insert the fragment containing the crt W gene in step 1 into the E. coli vector pBluescript IIS K + and introduce both plasmids, pPCn-3, into E. coli IM1U, and place them in the stationary phase. The cells were then cultured, the cells were collected, and the carotenoid pigment was extracted. Forty percent of the extracted pigment was hydraxanthin and 50% was echinenone. The remaining 10% was unreacted ⁇ -carotene.
  • the crt W gene of Alcali genes PC-1 is introduced into a microorganism such as Escherichia coli and expressed, and as a final product, astaxanthin, medium Metabolites and To control the expression level of the above-mentioned DNA strand (crtW gene), which can produce 4-ketozeaxanthin, and to examine the culture conditions of microorganisms having the same.
  • crtW gene DNA strand
  • the plasmid containing the crt W gene of A1ca1 igene j_P Cl was inserted into Escherichia coli vector pBluescript IIS K +, and both plasmids, pPC17-3, were added to E. coli M1. After introduction, the cells were cultured until the stationary phase, the cells were collected, and the carotenoid pigment was extracted. Lottery Of the dyes produced, the yields of astaxanthin and 4-ketozexanthin were approximately 1 mg from 2 liters of culture, respectively. there were.
  • crtE, 1111, 1111, crtY gene of Erwiniaured ovora required for ⁇ -carotin synthesis and the DNA strand of the present invention which is a gene for a ketotransferase enzyme (1) to (9) Any one of the DNA strands (typically Ag R ob acteri um aurantiacussp.
  • the DNA strand according to any one of the DNA strands () to (27) of the present invention which is the hydroxylase-transferring enzyme gene, and the e ⁇ tW gene of MK1 or A1ca1igenes PC-1.
  • the e ⁇ tW gene of MK1 or A1ca1igenes PC-1 is introduced and expressed in microorganisms such as colonic teeth.
  • a plasmid pACCAR16 that contains a fragment containing the crt E, crt B, crtl, and crtY genes of E rwin i_a _ u r edovo ra in E. coli vector PACYC184, and A g. aurantiacuss p. no v.
  • Both plasmids of pAK96K were introduced into Escherichia coli QM1Q1 and cultured until stationary phase. The body was collected and the carotenoid pigment was extracted. Among the extracted pigments, the yields of astaxanthin and phanikoxanthin were 3 mg and 2 mg, respectively, from 4 lit. Met.
  • microorganism which has become the gene source of the DNA strand of the present invention and Escherichia coli harboring the isolated gene have been deposited with the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as follows.
  • the chromosomal DNA is derived from three marine bacteria, namely, Agr0bacteri_um_au_rantiacussp.nov.MKl, Alcaligenes_sp.PC-1 and Alteromonas _SD-402 strain (Y okoyama, A., Izumida, H., Miki, W., 'Marine bacteriapro du ced asta ⁇ an thin'. 10 th Inte rna tio na ls ymp osi um on carotenoids, abstract, CL 11- 3, 1993).
  • Plasmid p CAR having a carotenoid synthesis gene group other than crt Z of Erwiniauredovora (Misa? A, N., Nakagawa, M., Kobayas Iii, K., Y amano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., Harashima K., 'E lucidati on of the_Er w_i nia_u redo 7 oracarotenoidbi os yn theticat hwa ybyfuncti on ala na lysisofg en epro du cts ex ressedin Escherichiaco I i '. J.
  • Gigapack Gold (Stratagene, sold by Funakoshi Co., Ltd.) was used for the invitro pack using the DNA that had undergone the above ligation reaction. Caging was performed to obtain a sufficient amount of phage particles to make a cosmid library.
  • the phage particles were transformed into Escherichia coli (E-scheriehiac_o1i) DH1 (ATCC 33849) and Escherichia coli having each of the three types of plasmids prepared in Example 2. After infecting with DH1, dilute to 100-300 colonies per plate, and add LB (1% tryptone, 0,5 The plate was plated on 1% NaCl (1% NaCl) and incubated at ° C or room temperature overnight to several days.
  • Lycopine-producing Escherichia coli DH1 (light red) having P ACCRT-E IB and S-carotin-producing Escherichia coli DH1 (yellow) having pACCAR16 AccrtX were used as hosts. Dozens of colonies were selected from among the orange colonies obtained by the Cosmid Library, and the plasmids were analyzed. At that time, except for one strain, ⁇ 8 contained a plasmid in which a partially degraded Sau3AI fragment from 33 k to kb was inserted.
  • the remaining strain (mainly containing lycopene-producing Escherichia coli, mainly) had a plasmid in which the 3.9 kb Sau3AI partially digested fragment was inserted into p ⁇ B8. Mid (named pAK9). This was thought to have been formed by in vivo deletion of the insert after infection with E. coli. Lycopene-producing E. coli harboring pAK9 can be used for other cosmidophiles. The same dye (identified as ataxanthin in Example 6) was able to be synthesized with the orange colony obtained from the slurry. This pAK9 was used as a material in subsequent analyses.
  • FIG. 12 shows a restriction map of the plasmid pAK92.
  • the direction of the dye-synthesizing gene group in the plasmid ⁇ ⁇ is the same as the direction of the vector 1 ac promoter.
  • the 9 kb BamHI fragment and the 2.3 'kb and 1.6 kb Sa1I fragments obtained by digestion with Sa1I were vectorized, respectively. Cloned to pBluescript II SK-. Fig.
  • Plasmid pAK94, pAK96, pAK98, pAK910, pAK93, and pAK95 indicates that the direction of the dye synthesis gene group is the same as the direction of the 1 ac port motor of the vector, and the opposite is the case for pAK93 and pAK95.
  • the DNA sequence was determined by constructing deletion mutants of the 2.9 BamHI fragment in both forward and reverse directions, and obtained clones having deletions of various lengths. I went to. Deletion mutants were prepared for the four plasmids pAK96, pAK98, pAK93, and pAK95 by the following procedure. After decomposing 10 g of each of the plasmids with SacI and XbaI, a phenolic Z-hole mouth extraction was performed, and ethanol precipitation was performed. The DNA was recovered by PCR. Each DNA was transferred to a 100 I Exoll buffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaC1, 5 mM MgC12, 10 mM
  • FIGS. 5 to 9 The resulting DNA sequence of ⁇ 86 base pairs (bp) is shown in FIGS. 5 to 9 (SEQ ID NO: 4).
  • An open reading frame with a ribosome binding site before the start codon results in a search for three different xanthophylls. gene er tW, crt Z, there was expected position of crt Y (example 8) in each of the data N'no, 0 click quality of Ru bovine code three O over blanking down rie Ding frame (Fig. 5 to 9 in Fig. 5 to ⁇ to ⁇ (base position of SEQ ID NO: 4 to 864), C to! (Base positions 864 to 1349), ⁇ to F (base position) Positions 1349 to 25 Q 6)) were found.
  • B to E and F to F the start code is GTG. And A to G for C to D.
  • Example 6 Identification of orange pigment
  • E. coli pACCRT-E IB, pAK92 or pAK96 introduced into lycopene-producing E. coli] M101 (E. coli (pACCRT-E IB, pAK92 or pAK96))
  • Fig. 12 was introduced into ⁇ -carotin-producing Escherichia coli M101 (Escherichia coli (pACCARl6 ⁇ crtX, pAK9 or pAK96K)) (showing orange).
  • 2YT medium 1.6 ⁇ m
  • containing 150 / g Z inl ampicillin Ap, Meiji Seika
  • 30 ⁇ IZ ml of chloramphenicol Cm, Sankyo
  • Incubation was carried out at 37 ° C for 18 hours in a 1% ripple, 1% east extract, 0.5% NaC1) liter.
  • the cells collected from the culture solution were extracted with 600 ml of acetone.
  • the dye of R f 0.1 and the next thicker dye of Ri 0.82 were cut from the TLC plate, and then a small amount of Chlorozozolem Z methanol ( 9/1) or dissolved in methanol, and separated with Sephadex LH-20 column chromatograph (15 x 300 mm) In addition, by developing and eluting with mouth-opening hologram / methanol (9/1) or methanol, 3 mg (: Rf 0.12) and 2 mg (: Rf 0.82) were obtained.
  • the dye of R ⁇ 0.72 was found to be astaxanthin and astaxanthin. It became clear that they had the same planar structure. So, the jet ether: 2-prono. After dissolving in ethanol 5: 5: 2 and measuring the CD spectrum, it was found that it had a 3S, 3'S steric structure. Therefore, this substance was identified as astaxanthin (astaxanthin, structural formula: see Fig. 11).
  • the dye of R f 0.82 is an ultraviolet-visible spectrum, 1H-NMR, FD-MS spectrum.
  • Zeaxanthin-producing Escherichia coli was prepared as follows. That is, a plasmid P CAR25 (Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi), which has a full-blown oral chinoid synthesis gene group of Er.ured0 ⁇ 0ra.
  • pAK910 or pAK916 (Fig. 12) introduced into this zeaxanthin-producing Escherichia coli ⁇ M1 (Escherichia coli (pACCAR25 ⁇ crt X p AK910 or pAK916)) ( ) was cultured at 37 ° C for 18 hours in 2 liters of a 2YT medium containing 150 ug Zml of Ap and 30 ⁇ g / ml Cm. The cells collected from the culture solution were extracted with 300 ml of acetate. After concentration, this was extracted twice with 200 ml of chloroform / methanol (9/1) and concentrated to dryness.
  • pA ⁇ 0 or pAK916 was introduced into ⁇ -carotin-producing Escherichia coli ⁇ M101 (Escherichia coli (pACCARl 6 m crtX, pAK910 or pA ⁇ 10 ⁇ 6)) (orange) was cultured in two liters of 2YT medium containing 150 ⁇ g Zml of ⁇ and 30 ⁇ % Zml of Cm at 37 ° C for 18 hours. The cells collected from the culture solution are Extracted by ml of acetone. After concentrating this, it was extracted twice with 200 ml of black-mouthed holmethanol (9/1) and concentrated to dryness.
  • the 1.4 kb fragment (p AKNK) between this Nc0I and ⁇ I site has a hydroxyl group It can be seen from the results of Example 7 (3) that the enzyme activity was present and the keto group-introducing enzyme activity was absent.
  • the Sa1I site which is present at one site in the 2.9 kb BamHI fragment and is located between the Ncol and KpnI sites described above, and this Sa1I site In the fragment ( ⁇ ⁇ and P AK 916) obtained by removing the right-hand fragment of the 2.9 kb BamHl fragment from the left H inci I site, ⁇ -carotin ⁇ Although cantansyn can be synthesized from the 2.9 kb Bam HI fragment of ⁇ 96 (see Example 7 (2)), the left co In the fragment obtained by removing the right fragment from the I site, the activity of synthesizing cantaxanthin from yS-carotin was lost.
  • crtW gene As a result of sequencing, one open reading buffer having a ribosome binding site immediately before the start codon corresponding to this gene was obtained. Since a frame could be detected, it was named crtW gene.
  • the nucleotide sequence of this crtW gene and the amino acid sequence of the encoded polypeptide are shown in Figure 1 (SEQ ID NO: 1). It is shown .
  • Nov.MK1's crtW gene product is a methylene at the fourth position of the ⁇ -ionon ring (yS-iononerin). e) It has an enzymatic activity to convert a group to a keto group.
  • One specific example is the use of ⁇ -carotene (S-carotene) as a substrate.
  • S-carotene The enzyme activity of synthesizing canthaxanthin (canthaxin thin) via echinone none (Example 7 (2), Fig. 11) See).
  • the crtWjg gene product is a 4-hydroxy- ⁇ -ionon ring (3-hydroxy-yS-ionoii ering) with a methylene at position 4 (met).
  • zeaxanthin is synthesized in the Ncol — KpnI fragment of 1.4 using yS-carotin as a substrate. It is considered that there is a gene encoding a hydroxyl group-introducing enzyme having enzymatic activity, and that the above-mentioned Sa1I site is present in this gene.
  • the nucleotide sequence of the crtZ gene and the amino acid sequence of the encoded polypeptide are shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2).
  • the ⁇ _ gene product (C rt Z) has an enzymatic activity to add one hydroxyl group to the carbon at position 3 of the ⁇ -ionon ring (yS-ion on ering).
  • ⁇ -carotene 3-carotene
  • ⁇ -cryptoxan an 3-cryptoxanthin
  • the m gene product is an enzyme that adds one hydroxyl group to the 3rd carbon of the 4-keto- ⁇ -ionone ring (-keto0- ⁇ -io-eta-erin). It also has activity, and one of the specific examples is the use of pantixiatin (canopiiaxanthin) as a substrate for piconicotin (plio eii). It is an enzymatic activity that synthesizes astaxanthin (asia ⁇ antliin) via icoxanthin) (see Example 6, FIG. 11). The latter polypeptide having the enzymatic activity and the DNA strand encoding it are not known in the past.
  • C rt Z of A gr Q b _a cterium is the amino acid sequence level, meaning that C rt 2 of Erwiniauredo ⁇ ora and 57% of identity are significant. It showed a good horology.
  • pAK96 a fragment (pAKK) obtained by removing the right fragment from the Kpnl site on the right side of the 2.9 kb BamHI fragment in the AK96 fragment, and further to the right from this Kpnl site
  • the fragment (pAK94) obtained by removing the fragment on the right from the PstI site in (pAK94) it is possible to synthesize astaxanthin from ⁇ -carotin.
  • Example 6 It is no longer possible to synthesize astaxanthin from benzene.
  • a 1.6 kb Sa1I fragment exists at one site in the 2.9 kb BamHI fragment and includes a fragment to the right of the Sa1I site located to the left of the KpnI site.
  • CY1 is the amino acid sequence level, and the C rt Y of Erwiniaure d_o_v ora and 44.3. It has a significant hologram of% identity, and the functions of the enzymes are the same for both.
  • Example 9 Southern analysis with chromosomal DNA of other marine bacteria Whether or not a region showing homology to crtW and crtZ isolated on the chromosome of other marine microorganisms was examined.
  • Example 1 Chromosome 0? Of PC-1 and Alte romona s sp. SD-402 prepared by the above procedure was digested with restriction enzymes BamH1 and PstI, and agarose was digested. Separated by gel electrophoresis. All the separated DNA fragments were denatured with an alkaline solution of 0.5 N NaOH and 1.5 M NaCl, and then transferred to the nylon plate. I was sent out.
  • the DNA-adsorbed nylon membrane is immersed in a hybridization solution (6 ⁇ Denhardt, 51 SSC, 100 ⁇ g / m 1 ss DNA) for 2 hours. Pre-hybridization at 60 ° C. Next, a 1.5 kb DNA fragment containing crtW and crtZ, which had been cut with Ba1I from pAK96K, was purified using Mega primeTM DNA laell in systems (Amersham). And [a-32P] dCTP ( ⁇ 110 TBq / mmol), and added to the above pre-hybridization solution for 16 hours at 6 Q ° C. A hybridization was held.
  • Example 10 Obtaining xanthophyll synthetic genes from other marine bacteria
  • a region that hybridizes with the DNA fragment containing the crtW and crtZ genes of Agrobacterium aurantiac uss p. No v. MK1 at around 2.35 kb.
  • PstI After digestion of the chromosomal DNA of A1ca1 igenes with PstI, a 2-3.5 kb size DNA fragment was Recovered by gel electrophoresis. The recovered DNA fragment was inserted into the PstI site of the vector -pB1uescript II SK + using T4 DNA ligase, introduced into Escherichia coli DH5, and transformed into A1ca1igenes.
  • a partial library was made.
  • This partial library was cloned into a colony hybridizer using a 1.5 kb DNA fragment containing the crt W and rt Z genes of Agr0 bacterium. As a result, one positive colony was isolated from about 50 QQ colonies.
  • the condition of the colony hybridization was the same as that of the Southern analysis method described in Example 9.
  • plasmid DNA was isolated from the obtained colony, digested with PstI, and the size of the integrated DNA fragment was examined. It was found that the plasmid contained three different fragments. Therefore, one of the 2.35 kb fragments that was hybridized from the three different DNA fragments by the Southern analysis method described in Example 9 was identified, and the agaro fragment was identified.
  • the plasmid (named PPC17, Fig. 19) from which the 0.1 kb Bst EII-Eco RV fragment on the right side of the inserted fragment of pPC11 was inserted into ⁇ - It was found that, even when introduced into E. coli-producing Escherichia coli, the E. coli transformant synthesizes stachysanthin and the like in the same manner as when pPCll was introduced.
  • Example 12 2 The base sequence of 1. 1.kb Pst—Bs ⁇ Ell fragment in this pPC17 was determined.
  • Deletion mutants were prepared using ⁇ 7 and pPC by the following procedure. After decomposing 10 g of pPC17 or pPC12 with _pnI and Hind1I1 or Kpn1 and EcoR1, respectively, Perform roro-horizon extraction and ethanol precipitation The DNA was recovered by PCR. Add each DNA to 100; zol Exolll buffer (50 mM Tris-HC1, 100 mM NaC1, 5 mM MgC12, 10 mM2-methanol captoe) It was dissolved in ethanol (pH 8.0), added with Q-unit ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ nuclease, and incubated at 37 ° C.
  • zol Exolll buffer 50 mM Tris-HC1, 100 mM NaC1, 5 mM MgC12, 10 mM2-methanol captoe
  • the recovered DNA was blunt-ended with Klenow frame, subjected to 1 C, single-ligation reaction, and then transformed into Escherichia coli JM109.
  • helper phage M13K07 single-strand DNA was prepared from the various clones obtained, and the system was purchased from Applied System, Inc.
  • the fluorescence reaction kit is used to perform the sequencing reaction, and the DNA sequence is sequenced using an automatic sequencer. It was determined.
  • FIGS. 16 to 18 The resulting DNA sequence of 1631 base pairs (bp) is shown in FIGS. 16 to 18 (SEQ ID NO: 7).
  • a search for an open reading frame with a ribosome binding site before the start codon resulted in two types of xanthodium binding.
  • Two open reading frames that encode each protein at the position where the presence of synthetic gene 11 and crt Z were expected (Example 13).
  • Figures A to B base positions 99 to ⁇ 4 in SEQ ID NO: 7
  • C to D base positions 824 to 13Q9
  • Example 12 Identification of a pigment produced by Escherichia coli having a xanthophyll synthesizing gene group A1ca1igenes
  • This pPCn-3 ' was introduced into zeaxanthin-producing Escherichia coli IM101 (Example 7 (1)) (Escherichia coli (pACCAR25AertX pPCn-3)) (shows orange color) was cultured in 2 liters of 2YT medium containing 150 ⁇ IZ ml of ⁇ and 3G ⁇ gmI Cm for ⁇ ° C for ⁇ ° C. The cells collected from the culture solution were extracted with 300 ml of acetate. After concentrating this, it was extracted twice with 20 ⁇ ml of black mouth Holm Z methanol (9/1) and concentrated to dryness.
  • E. coli IM1Q1 E. coli (pACCARl6 ⁇ crtX, pPCH-3)) (showing orange) was transformed into 150 ⁇ g Z ml Ap And 2 liters of 2YT medium containing 30 ⁇ gZm1 and Cm were cultured at ⁇ ° C for 1 hour.
  • the cells collected from the culture solution were extracted with 3DQ ml of acetone. After concentrating this, it was extracted twice with 200 ml of black mouth-holmethanol (9/1) and concentrated to dryness.
  • This pPCU was introduced into ⁇ -carotin-producing E. coli M101 (E. coli (pACCAR nA "tX, pPCl3)) (yellow) was transformed into 150 g Z ml Ap
  • E. coli pACCAR nA "tX, pPCl3
  • the cells were cultured in 2 liters of 2YT medium containing 30 ⁇ gml of Cm at ⁇ ° C for 18 hours.
  • the cells collected from the culture solution were collected in 300 ml of acetonitrile. After concentration, the extract was extracted twice with 200 ml of chlorophonolem Z methanol (9/1), concentrated to dryness, and concentrated to dryness.
  • Example 13 Identification of a group of synthetic genes for xanthofinolates
  • crtW gene The nucleotide sequence of the crtW gene and the amino acid sequence of the encoded polypeptide are shown in FIGS. 13 to 14 (SEQ ID NO: 5).
  • the crtW gene product (CftW) of Alcaligenessp.PC-1 is a methylene (methhylenej) at position 4 of the ⁇ -ionon ring (/ S-i0n0 nering). It has an enzyme activity that converts it into a keto (ketc) group.
  • One specific example is the ⁇ -carotene (yS-carotene) Enzyme activity for synthesizing cantaxantan, cantl ⁇ a ii tli i ii) via non (echinen 0 ne) (see Example 12 (2), FIG. 11) ).
  • the crtW3 ⁇ 4 gene product is a 3-hydroxy- ⁇ -cy-non-ring (3-hydroxy-S-iononerin, the 4th-position methylene (methy).
  • l en e It also has an enzyme activity that converts it to a keto group.
  • One specific example is the quality of zeax an thin.
  • the polypeptide having such an enzyme activity and the DNA strand encoding the same are conventionally used.
  • the cr gene product (CrtW) between AgR obacteri ui aurantiacus_s.no v. MK1 and A1ca1igeness.PC-1 is expressed at the amino acid sequence level. It has a high homology of 1% identity and the functions of the enzymes are the same for both. Of these amino acid sequences, 17% of the amino acid sequences that do not have identity are of crucial importance to the function of the enzyme. Not considered. Thus, particularly in this region, there may be a small amount of substitution, deletion, or other amino acid substitution with another amino acid. It seems that the addition does not affect the enzyme activity.
  • the ket group transfer enzyme gene crtW of the marine bacterium regardless of whether a hydroxyl group is added at position 3 or not, directly converts the methylene group at position 4 to the keto group. / 8-ionon or 3-hydroxy- ⁇ -ionon ring ketotransferase
  • the product of the ert Z gene (C ft Z) of Alcaligeness ⁇ .PC-1 has one hydroxyl group at the 3rd carbon of the ⁇ -ionon ring (/ S-i0n0nering). It has an enzymatic activity to be added, and one of its concrete examples is based on ⁇ -carotene (yS-carotene). Enzyme activity to synthesize zeaxanthin (zea-antitin) via the enzyme (yS-cryptto-antli-in) (see Example 12 (3), Figure 11) .
  • one gene product has one hydroxyl group added to the carbon at the 4-position of the 4-keto- ⁇ -ionon ring (4-keto- ⁇ -i0 ⁇ 0ne rinng).
  • canthaxanthin as a substrate for phenicoxanthine. It is an enzymatic activity that synthesizes astaxanthin (astaian thin) via phoenic Qxan thin (Example 12 (1), see FIG. 11). Incidentally, the latter polypeptide having the enzyme activity and the DNA strand encoding the same are not known before. In addition, C rt Z of A 1 ca 1 igeness p. PC-1 is equivalent to C rt Z of Erwiniaure dov ora. At the amino acid sequence level and has an identity of 58%. One significant homology was shown.
  • the crt Z gene product (Cr) between A grobacter i_um_a u_r antiacussp. Nov. MK1 and Alcaligen ess. PCl is 90% of the amino acid sequence level at the amino acid sequence level. It has a high homology mouth, and the function of the enzyme is the same for both. Of these amino acid sequences, the amino acid sequence in the 1 Q% region without identity is of paramount importance to the function of the enzyme. It is thought that there is not. Therefore, particularly in this region, there is little substitution, deletion, or other amino acid substitution with other amino acids. It is considered that the addition of DNA does not affect the enzyme activity.
  • carotenoid biosynthetic enzymes are generally used as substrates. Lotino It has become clear that half of the molecule is recognized and acts. For example, crtY, a lycopene cyclase gene of Erv inia, recognizes and cyclizes half of the lycopene molecule.
  • a xanthofinolate (astaxanthin, fenikoniki) containing astaxanthin or other keto groups from marine bacteria is used.
  • Santin, 4-ketozeaxanthin counter We succeeded in obtaining the genes required for the biosynthesis of xanthine and echinenon), and clarified the structure or nucleotide sequence of those genes and their functions.
  • the DNA strands according to the present invention can be used as a foreign gene by transforming and expressing a microorganism such as Escherichia coli by a genetic engineering technique using the gene as a foreign gene.
  • This gene is useful as a gene capable of imparting the biosynthesis ability of xanthophylls containing astaxanthin or other keto groups to microorganisms of the present invention.
  • Sequence type number of strands: double strand
  • Organism name Agrobacterium aurant lacus
  • ATC GCA AAT TTC CTG GGG CTG ACC TGG CTG TCG GTC GGA TTG TTC ATC 96 He Ala Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe He
  • ATC GCG CAT GAC GCG ATG CAC GGG TCG GTG GTG CCG GGG CGT CCG CGC 144 lie Ala His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg
  • GCC AAT GCG GCG ATG GGC CAG CTT GTC CTG TGG CTG TAT GCC GGA TTT 192 Ala Asn Ala Ala Met Gly Gin Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe
  • Sequence type number of strands: double strand
  • Genomic DNA Organism Agrobacterium aurantiacus
  • Sequence type number of strands: double strand
  • Organism name Agrobacterium aurant i acus
  • ATC GCC CTG GCG CTG CGC GCG GCG CGG CCC GAC CTG CGC GTG CTG CTG 96 lie Ala Leu Ala Leu Arg A Ala Arg Pro Asp Leu Arg Val Leu Leu
  • Sequence type number of strands: double strand
  • Organism name Agrobact e rium aurant i a cus
  • GCCGGTCCGG GGGACAAGAT GAGCGCACAT GCCCTGCCCA AGGCAGATCT GACCGCCACC 180 CGGCCAGGCC CCCTGTTCTA CTCGCGTGTA CGGGACGGGT TCCGTCTAGA CTGGCGGTGG
  • Sequence type number of strands: double strand
  • Genomic DNA Organism Alcal igenes
  • GGT CTG ACC GCC GCG ATC CTG CTG TGC TGG CTG GTC CTG CAC GCC TTT 96 Gly Leu Thr Ala Ala lie Leu Leu Cys Trp Leu Val Leu His Ala Phe
  • 061 081 oid m isy dsy SIR il9 OI, J Sjy SIH OJJ naq ⁇ jqi i
  • Genomic DNA Organism name Alcal igenes
  • Sequence type number of strands: double strand
  • CTGCAGGCCG GGCCCGGTGG CCAATGGTCG CAACCGGCAG GACTGGAACA GGACGGCGGG 60 GACGTCCGGC CCGGGCCACC GGTTACCAGC GTTGGCCGTC CTGACCTTGT CCTGCCGCCC
  • CAACTGGCGA CACGATCGTC AATCTCGGTC TGACCGCCGC GATCCTGCTG TGCTGGCTGG 180 GTTGACCGCT GTGCTAGCAG TTAGAGCCAG ACTGGCGGCG CTAGGACGAC ACGACCGACC
  • TCCTGCACGC CTTTACGCTA TGGTTGCTAG ATGCGGCCGC GCATCCGCTG CTTGCCGTGC 240 AGGACGTGCG GAAATGCGAT ACCAACGATC TACGCCGGCG CGTAGGCGAC GAACGGCACG

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Description

明 細 書 キ サ ン ト フ ィ ルの 合成 に 有用 な D N A 鎖お よ び キ サ ン ト フ ィ ル の製造法 技術分野
本発明 は、 タ イ 、 サ ケ 、 ェ ビ等の 養殖魚介類の'色揚 げ に有用 で あ り 、 ま た、 着色料ゃ抗酸化剤 と し て食品 に利 用 さ れ る ァ ス タ キ サ ン チ ン 等の ケ ト 基を含む キ サ ン ト フ ィ ル （ ヶ ト カ ロ チ ノ ィ ド） の 合成 に有用 な D N A 鎖、 及び、 こ の DNA 鎖を導入 し た微生物を利用 し た ァ ス タ キ サ ン チ ン 等の ケ ト 基を含む キ サ ン ト フ イ ノレ （ ケ ト カ ロ チ ノ ィ ド） の製造法 に 関す る も の で あ る 。
背景技術
キ サ ン ト フ ィ ル （ ϊ a n t h Q p h y 1 1 ) と は、 水酸基、 ケ ト 基、 エ ポ キ シ基な どの酸素を 含む カ ロ チ ノ ィ ド （ c a r 0 t e n o i d) 色素の総称で あ る 。 カ ロ チ ノ ィ ド は、 メ バ ロ ン 酸 を 出発物質 と し て、 ス テ ロ イ ドゃ テ ルぺ ノ ィ ド と 途中 ま で共通な イ ソ プ レ ノ ィ ド生合成経路 に よ っ て合成 さ れ る 。 イ ソ プ レ ン基本生合成系 に よ っ て生 じ た C15 の フ ア ル ネ シ ル ピ ロ リ ン 酸 （ F P P ) は 、 C 5の イ ソ ペ ン テ 二 ノレ ピ ロ リ ン酸 （ 1 PP ) と 縮合す る こ と に よ り 、 0 の ゲ ラ ニ ルゲ ラ ニ ル ピ ロ リ ン酸 （ G G P P ) が作 ら れ る 。 次 に、 2 分子の GGPPが縮合 し て、 最初の カ ロ チ ノ ィ ドで あ る 無色の フ ィ ト ェ ン （ phy t o e ne) が合成 さ れ る 。 フ ィ ト ェ ン は、 一連 の 不飽 和 反 応 に よ り 、 フ ィ ト フ ノレ ェ ン （ phy t o i l u e n e ) 、 ζ - カ ロ チ ン ( Γ — c a r o t e n e ) 、 ノ ィ ロ ス ポ レ ン n e u r 0 s p 0 r e n e ) 、 リ コ ピ ン （ 1 y c o p e n e ) に変換 さ れ、 さ ら に、 こ の リ コ ピ ン は環化反応 に よ り - カ ロ チ ン （ S - c a r 0 t e n e ) に変換 さ れ る 。 そ し て、 β - カ ロ チ ン に水酸基や ケ ト 基な どが導入 さ れ、 種 々 の キ サ ン ト フ ィ ルが合成 さ れ る と 考え ら れて い る （ B r i t t on, G. , ' B i o s yn t h e s i s o f c a r o t e n o o i d s . P l an t P i gme n t s. Lo ndon, Ac a d emi c
P r e s s, 1988, p. 133 - 182. (Go o dwi n, T. W. e d. ) 参照） 最近、 発明者 ら は、 植物常在非光合成細菌 E rwi n i a u r e d o v o r a の カ ロ チ ノ ィ ド生合成遺伝子群を、 そ の黄色の 色調を指標 に大腸菌 に ク ロ ー ニ ン グ し 、 こ れ ら の遺伝子 の い ろ い ろ な 組み合わせ を大腸菌等の 微生物で発現 さ せ る こ と に よ り 、 大腸菌等の 微生物 に、 フ ィ ト ェ ン 、 リ コ ピ ン 、 β - カ ロ チ ン 、 お よ び 、 β - カ ロ チ ン に水酸基力く 導入 さ れた黄色の キ サ ン ト フ ィ ノレで あ る ゼア キ サ ン チ ン を生産 さ せ る こ と を可能 に し た （図 1 0 参照） （ Mi s awa ， . , N a k a g a w a , M. , K o b a y a s ii i , K. , Y a m a n o , S . , I z a w a , Y. , N a k a m u r a , K. , H a r a s h i m a K. , ' E l u c i d a t i on o f t he E r i _n i a u r e d o v o r a c a r o t e n o i d b i o s yn t he t i c a t hwa y b y f un c t i o na l a n a l ys i s o f g e ne p r o du c t s e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o 1 i ' . J. B a c t e r i o 1. , 172 , p. 6104 - 6712, 1990、 及 びヽ Mi s awa, N. , Yama no, S. , 1 k e n a g a , H. , P r o du c t i o n o f β -c a r o t e n e i n Z y m
0 m o n a s m o b i 1 i s and Ag r ob a c t e r i um t umej a c i en s _by i n t r o du c t i o n o f t he b i o s yn t h e s i s g e n e s f r o m _ E r w_i n
1 a u r e d o V o r a ' . A p p 1. Env i r on. Mi c r o b i o l. , 57, p. 1847- 1849, 1991 、 及び、 本発明者 ら に よ る 特許出願特 願平 号公報 （特願平 2- 5 Π 55 号明細書） ： 「 力 口 チ ノ ィ ド の 合成 に 有用 な D N A 鎖」 参照） 。
—方、 赤色の キ サ ン ト フ ィ ノレで あ る ァ ス タ キ サ ン チ ン は、 特 に 海洋生物の タ イ 、 サ ケ 等の 赤色魚類や、 力 二、 ェ ビ等の 甲殻類 に 広 く 存在す る 代表的動物 カ ロ チ ノ ィ ド で あ る 。 一般 に、 動物 は カ ロ チ ノ ィ ド を生合成す る こ と がで き な い の で、 微生物や植物 に よ っ て合成 さ れた カ ロ チ ノ ィ ド を外界 よ り 摂取す る 必要があ る 。 そ の た め、 従 来よ り 、 タ イ 、 サ ケ 、 ェ ビ等の 養殖魚介類の色揚げの 目 的 に ァ ス タ キ サ ン チ ン は広 く 用 い ら れて き た。 ま た、 ァ ス タ キ サ ン チ ン は、 食品 に お い て も 、 着色料 と し て だ け で は な く 、 癌の原因 と な る 生体内で発生す る 活性酸素を 除去す る 抗酸化剤 と し て も 注 目 を集め て い る （松野隆男 - 幹渉、 「動物 に お け る カ ロ テ ノ イ ド の生理機能 と 生物活 性」 化学 と 生物、 Π , p. 219-227, 1990 参照） 。 ァ ス タ キ サ ン チ ン の供給源 と し て は、 南極ォ キ ア ミ 等の 甲殻 類、 酵母 Pha f f i aの 培養物、 緑藻 Ha ema t o c o c c u sの 培養 物、 及 び、 有機合成法が知 ら れて い る 。 し か し 、 南極ォ
― s ― キ ア ミ 等の 甲殻類を用 い る 場合、 そ の 採取、 抽 出 に お い て、 脂質を始め と す る 夾雑物 と の 分離等 に お い て多大な 労力 と コ ス ト を有す る 。 ま た、 酵母 P h a H i aの 培養物 に お い て は、 そ の細胞壁が強固で し か も 生産量が低 い た め ァ ス タ キ サ ン チ ン の採取、 抽 出 に多大な コ ス ト を有す る 緑藻 H a e m a t 0 c 0 c c u sの 培養物 に お い て は、 そ の 培養時 に は、 ァ ス タ キ サ ン チ ン 合成 に欠 く こ と の で き な い光を供 給 し な け ればな ら ず、 太陽光採取の た め の立地条件や人 ェ光供給の た め の培養装置等の設備が必要で あ る だ け で な く 、 混在す る 副生産物の 脂肪酸エ ス テ ルや混在す る ク ロ ロ フ ィ ル と の分離が困難で あ る 。 以上の こ と か ら 上記 の生物起源の ァ ス タ キ サ ン チ ン は、 コ ス ト 的 に 、 有機合 成法 に勝て な い のが現状であ っ た。 し か し な 力く ら 、 有機 合成法 に お い て は、 ァ ス タ キ サ ン チ ン が魚介類の 飼料や 食品添加剤 と し て用 い ら れ る こ と を考慮す る と 、 反応時 に生ず る 副生成物等の面で問題が残 り 、 ま た、 消費者の 天然物嗜好 に も 反 し て い る 。 以上の こ と よ り 、 安全で消 費者イ メ ー ジ の よ い生物起源の安価な ァ ス タ キ サ ン チ ン の 供給、 製造法の 開発が望 ま れて い る 。
発明 の 開示
も し 、 ァ ス タ キ サ ン チ ン の生合成を担 う 遺伝子群があ れば非常 に有用 であ る と 考え ら れ る 。 な ぜな ら 、 ァ ス タ キ サ ン チ ン の産生能の 有無 に かかわ り な く 、 食品 と し て の安全性ゃ ァ ス タ キ サ ン チ ン の 潜在的生産能の面で最適 な 微生物 に、 ァ ス タ キ サ ン チ ン 合成遺伝子群を導入す る こ と に よ り 、 そ の生産能を与え る こ と がで き る か ら で あ る 。 こ の場合、 混在す る 副生産物の 問題 も な く 、 今 日 の 進ん だ遺伝子操作の手法を も つ て、 有機合成法を凌駕す る レ ベ ル ま で ァ ス タ キ サ ン チ ン の生産量を上 げ る こ と も 難 し く な い と 思わ れ る 。 し か し な が ら 、 キ サ ン ト フ ィ ル の 1 種で あ る ゼア キ サ ン チ ン ま で を 合成す る 遺伝子群 は 前述 し た様 にすで に本発明者等 に よ っ て取得 さ れて い る が、 ァ ス タ キ サ ン チ ン を 合成す る の に必要な ケ ト 基導入 酵素を コ ー ドす る 遺伝子等の 取得 は未だ誰 も 成功 に 至 つ て は い な い。 こ の 原因 と し て は、 ケ ト 基導入酵素 は膜 タ ン パ ク 質で あ り 、 膜か ら 分離す る と 活性を失 う た め、 そ の酵素精製、 活性測定が不可能で あ り 、 酵素の知見が皆 無で あ っ た こ と が挙 げ ら れ る 。 し たが っ て、 今 日 ま で、 ァ ス タ キ サ ン チ ン を遺伝子操作 に よ り 微生物等 に生産 さ せ る こ と は不可能で あ っ た。
本発明 は、 ァ ス タ キ サ ン チ ン を始め と す る ケ ト 基を含 む キ サ ン ト フ ィ ル （ケ ト カ ロ チ ノ イ ド） を生産す る の に 必要な ケ ト 基導入酵素を コ ー ドす る 遺伝子等を取得す る こ と に よ り 、 微生物 に ァ ス タ キ サ ン チ ン を始め と す る ケ ト 基を含むキ サ ン ト フ ィ ノレ （ケ ト カ ロ チ ノ イ ド） を生産 さ せ る の に必要な遺伝子群を含む D N A 鎖、 お よ び、 こ の D N A 鎖を導入 し た微生物を利用 した、 ァ ス タ キ サ ン チ ン を始め と す る ケ ト 基を含むキ サ ン ト フ ィ ル （ケ ト カ ロ チ ノ ィ ド） の 製造法を提供す る こ と を 目 的 と す る も の で あ る
通常よ く 使わ れ る 遺伝子 ク ロ ー ニ ン グ法で あ る 、 目 的 と す る タ ンパ ク 質の精製、 ア ミ ノ 酸配列 の一部決定、 お よ び、 合成 プ ロ ー ブ に よ る 遺伝子の取得法 は、 ァ ス タ キ サ ン チ ン 合成酵素の精製が不可能で あ る こ と よ り 採用 で き な い こ と は前述 し た と お り で あ る 。 そ こ で、 本発明者 等 は、 非光合成細菌エ ル ビニ ァ （ E r w i n i a ) の カ ロ チ ノ ィ ド合成遺伝子群が大腸菌で機能す る こ と に 注 目 し 、 そ の遺伝子群 の組み合わせ に よ っ て 、 ァ ス タ キ サ ン チ ン の 生合成中間体で あ る と 考え ら れ る リ コ ピ ン や ； S - カ ロ チ ン を大腸菌で作 ら せ、 こ れ ら の大腸菌を ァ ス タ キ サ ン チ ン 合成遺伝子の ク ロ ー ニ ン グの た め の 宿主 と し た。 本発 明者等 は、 ま た、 い く つ かの海洋細菌がァ ス タ キ サ ン チ ン を生産 で き る こ と '（ Yo koyama, A. , I z u m i d a , H. , M i k i, W. , ' Ma r i n e b a c t e r i a p r o du c e d a s t a x an t h i n' . l O t ii I n t e r n a t i ona l s ym o s i um on c a r o t e n o i d s, a b s t r a c t , CL 11 - 3, 1993 ) 、 お よ び、 細菌の 場合 は一連の 関連遺 伝子が ク ラ ス タ ー （群） を構成 し て い る か も し れな い こ と 、 お よ び、 細菌の場合 は大腸菌でそ の遺伝子群が機能 発現す る か も し れな い こ と に 注 目 し 、 こ の海洋細菌を遺 伝子源 と し て選ん だ。 こ れ ら 2 つ の手段を組み 合わせ て 研究を行 う こ と に よ り 、 海洋細菌 よ り ァ ス タ キ サ ン チ ン や そ の他の ケ ト 基を含む キ サ ン ト フ ィ ルの生合成 に必要 な遺伝子群の取得 に成功 し 、 本発明 を完成 さ せ る に 至 つ た。 な お、 海洋細菌で ァ ス タ キ サ ン チ ン 合成遺伝子群が ク ラ ス タ ー を構成 し てお り 、 大腸菌で機能発現す る こ と お よ び、 こ れ ら の遺伝子産物が ；5 - カ ロ チ ン ま た は リ コ ピ ン を基質 と し て利用 で き る こ と は、 本発明 に お い て始 め て明か に さ れた の であ る 。
本発明 に よ る D N A 鎖 は下記 に 示す も の で あ る 。
( 1 ) β - ィ オ ノ ン環 （ /S -i onone r i n ) の 4 位の メ チ レ ン （ me thy l ene)基を ケ ト （ ke to) 基 に変換す る 酵素 活性を有す る ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列を有す る D N A 鎖。
( 2 ) β - ィ オ ノ ン環の 4 位の メ チ レ ン基を ケ ト 基 に 変換す る 酵素活性を有 し て い て ア ミ ノ 酸配列が実質的 に 配列番号 1 に示 し た ア ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 1 2 ま で の ァ ミ ノ 酸配列の ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列を有す る D Ν Α 鎖。
( 3 ) 上記 （ 2 ) に記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダィ ズ し かつ上記 （ 2 ) に記載の酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
( ) β - ィ オ ノ ン環の 4 位の メ チ レ ン基を ケ ト 基 に 変換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実質的 に 配列番号 5 に 示 し た ア ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 4 2 ま での ァ ミ ノ 酸配列の ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る D Ν Α 鎖。 ( 5 ) 上記 （ 4 ) に記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダ ィ ズ し かつ上記 （ 4 ) に記載の 酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
( 6 ) β - カ ロ チ ン を ェ キ ネ ノ ン を経 て カ ン タ キ サ ン チ ン に変換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実 質的 に配列番号 1 に示 し た ア ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 1 2 ま で の ア ミ ノ 酸配列の ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
( 7 ) 上記 （ 6 ) に記載の D Ν Α 鎖 に ハ イ プ リ ダ イ ズ し かつ上記 （ 6 ) に記載の酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
( 8 ) β - カ ロ チ ン を ェ キ ネ ノ ン を経 て カ ン タ キ サ ン チ ン に変換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実 質的 に配列番号 5 に示 し た ア ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 4 2 ま での ァ ミ ノ 酸配列の ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る D Ν Α 鎖。
( 9 ) 上記 （ 8 ) に記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダィ ズ し かつ上記 （ 8 ) に記載の酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
( 10) 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ オ ノ ン環 （ 3- hydroiy- β - i o n o n e r i n ) の 4 位の メ チ レ ン （ me thy l ene ) 基を ケ ト （ ke to) 基 に変換す る 酵素活性を有す る ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
( 11) 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ オ ノ ン 環の 4 位 の メ チ レ ン基を ケ ト 基 に変換す る 酵素活性を有 し て い て ア ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 1 に 示 し た ア ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 1 2 ま で の ア ミ ノ 酸配列の ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
( 12) 上記 （ 11) 記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダ ィ ズ し 、 かつ上記 （ 11) に記載の 酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鑌。
( 13) 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ オ ノ ン 環 の 4 位 の メ チ レ ン基を ケ ト 基 に変換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 5 に 示 し た ァ ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 4 2 ま での ア ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列を有す る D Ν Α 鎖。
( 14) 上記 （ U ) に記載の D N A 鎖 にノヽ イ ブ リ ダィ ズ し かつ上記 （ 13) に記載の酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列を有す る D N A 鎖。
( 15) ゼ ア キ サ ン チ ン を 4 - ケ ト ゼ ア キ サ ン チ ン を経 て ァ ス タ キ サ ン チ ン に変換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 1 に示 し た ァ ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 1 2 ま で の ア ミ ノ 酸配列の ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
( 16) 上記 （ 15) に記載の D N A 鎖にハ イ ブ リ ダィ ズ し かつ上記 （ 15) に記載の酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
( 17) ゼ ア キ サ ン チ ン を 4 - ケ ト ゼ ア キ サ ン チ ン を 経 て ァ ス タ キ サ ン チ ン に変換す る 酵素活性を 有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 5 に 示 し た ァ ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 4 2 ま での ア ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る D N A 鎖。
( 18 ) 上記 （ Π ) に記載の D N A 鎖 にハ イ ブ リ ダィ ズ し かつ上記 （ 17) に記載の酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列を有す る DNA 鎖。
( 19) 4 - ケ ト - β - ィ オ ノ ン 環 （ 4— k e t o - β - ί ο η ο η e r i n g) の 3 位の炭素 に 1 つ の水酸基を付加す る 酵素活 性を有す る ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る
DN A 鎖。
( 20) 4 - ケ ト - β - ィ オ ノ ン環の 3 位の炭素 に 1 つ の 水酸基を付加す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列 が実質的 に配列番号 2 に 示 し た ア ミ ノ 酸番号 1 か ら 1 6 2 ま での ア ミ ノ 酸配列の ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基 配列を有す る D Ν Α 鎖。
( 21 ) 上記 （ 20) に記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダィ ズ し ， かつ 上記 （ 20) に記載の酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
( 22 ) 4 - ケ ト - β - ィ オ ノ ン 環 の 3 位 の 炭素 に 1 つ の 水酸基を付加す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列 が実質的 に配列番号 6 に示 し た ア ミ ノ 酸番号 1 か ら 1 6 2 ま での ア ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基 配列を有す る D Ν Α 鎖。 ( 23) 上記 （ 22) に記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダィ ズ し かつ上記 （ Π ) に記載の酵素活性を有す る ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ドす る 塩基配列を有す る DNA 鎖。
( 24) カ ン タ キ サ ン チ ン を フ エ ニ コ キ サ ン チ ン を 経 て ァ ス タ キ サ ン チ ン に転換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 2 に示 し た ァ ミ ノ 酸番号 1 か ら 1 6 2 ま での ア ミ ノ 酸配列 の ポ リ ぺ プチ ドを コ 一 ド す る 塩基配列を有す る D N A 鎖。
( 25) 上記 （ 24) に記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダィ ズ し かつ上記 （ 24) に記載の酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列を有す る DNA 鎖。
( 26) カ ン タ キ サ ン チ ン を フ ヱ ニ コ キ サ ン チ ン を 経 て ァ ス タ キ サ ン チ ン に転換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 6 に 示 し た ァ ミ ノ 酸番号 1 か ら 1 6 2 ま での ァ ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プ チ ドを コ 一 ド す る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
( 27) 上記 （ 26) に記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダィ ズ し かつ上記 （ ) に記載の酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
本発明 は、 ま た、 キ サ ン ト フ ィ ルの製造法 に も 関す る すな わ ち 、 本発明 に よ る キ サ ン ト フ ィ ル の製造法 は下 記 に 示す も の であ る 。
( 1 ) 上記 （ 1 ) 〜 （ 9 ) の いずれか 1 項 に記載の D N A 鎖を、 β - カ ロ チ ン を産生す る 能力 を有す る 微生物 に 導入 し て該形質転換微生物を培地で培養 し 、 培養物か ら カ ン タ キ サ ン チ ン ま た は ェキ ネ ノ ン を採取す る こ と を特 徴 と す る 、 キ サ ン ト フ ィ ノレ の 製造法。
( 2 ) 上記 （ 1 β) 〜 （ 18) の い ずれか 1 項 に記載の DN Α 鎖を、 ゼア キ サ ン チ ン を産生す る 能力を有す る 微生物 に導入 し て該形質転換微生物を培地で培養 し 、 培養物か ら ァ ス タ キ サ ン チ ン ま た は 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン を採 取す る こ と を特徴 と す る 、 キ サ ン ト フ ィ ル の 製造法。
( 3 ) 上記 （ 19) 〜 （ Π) の いずれか 1 項 に記載の DN A 鎖を、 カ ン タ キ サ ン チ ン を産生す る 能力を有す る 微生 物 に導入 し て該形質転換微生物を培地で培養 し 、 培養物 力、 ら ァ ス タ キ サ ン チ ン ま た は フ エ ニ コ キ サ ン チ ン を採取 す る こ と を特徴 と す る 、 キ サ ン ト フ ィ ルの製造法。
( 4 ) 微生物が細菌 ま た は酵母で あ る 、 上記 （ 1 ) 〜 ( 3 ) の い ずれか 1 項 に記載の製造法。
図面の簡単な説明
第 1 図 は、 海洋細菌 Ag r o b a c t e r i um a u r a n t i a c u s s . no v. MK1 の ケ ト 基導入酵素遺伝子 ( c r tW 遺伝子） の 塩基配列 と コ ー ド さ れ る ポ リ べ プチ ドの ア ミ ノ 酸配列 示す説明図で あ る 。
第 2 図 は、 海洋細菌 Ag r ob a c t e r i um au r ant i a cu s _s p. no v. MK1 の水酸基導入酵素遺伝子 ( c r t Z 遺伝子） の 塩基配列 と コ ー ド さ れ る ポ リ べ プチ ド の ア ミ ノ 酸配列を 示す説明図で あ る 。 第 3 図 は、 海洋細菌 Ag r o b a c t e r i um a u r a— n t i— a cu s s . n 0 v. MK 1 の リ コ ピ ン環化酵素遺伝子 （ mi 遺伝子） の塩基配列 と コ ー ド さ れ る ポ リ べ プチ ド の ア ミ ノ 酸配列 を示す説明図であ る o
第 4 図 は、 第 3 図 に続 く 配列 を示す説明図で あ る 。 第 5 図 は、 海洋細菌 Ag r o b a c t e r i um a u r a n t i a c u_s s p . n 0 v. MK1 の キ サ ン ト フ ィ ル合成遺伝子群の塩基配列 を 示す説明図で あ る
図中 の A 力、 ら F は、 第 1 図か ら 第 4 図の A か ら F に対 応 し て い る 。
第 6 図 は、 第 5 図 に続 く 配列 ：.'示す説明図で あ る 。 第 7 図 は、 第 6 図 に続 く 配列 を示す説明図で あ る 。 第 8 図 は、 第 7 図 に続 く 配列を示す説明図で あ る 。 第 9 図 は、 第 8 図 に続 く 配列を示す説明図で あ る 。 第 1 0 図 は、 非光合成細菌 E r w i n i a u r e d o v o r a の 力 口 チ ノ イ ド生合成経路 と カ ロ チ ノ ィ ド合成遺伝子の 機能 を示す説明図で あ る 。
第 1 1 図 は、 海洋細菌— A g r 0 b a c t e r i u m a u r a n t i a c u s s p . n 0 V . M K 1 お よ び A 1 c a 1 i e n e s s p . -1 の主要な キ サ ン ト フ ィ ル生合成経路 キ サ ン ト フ ィ ル合成遺伝子の 機能を示す説明図で あ る
た だ し 、 c r t Y遺伝子の機能 は前者 に お い て の み確認。 第 1 2 図 は、 海洋細菌 Ag r o ba c t e r i um au r anリ a cu s— s p . n 0 v. MK 1 の キ サ ン ト フ ィ ル合成遣伝子 （群） を含む
3 一 い ろ い ろ な デ レ ー シ ョ ン プ ラ ス ミ ド を示す説明図で あ る 白抜 き の P は、 ベ ク タ ー p B l u e s c r i p t I I SK の l a c の プ ロ モ ー タ ー を示 し て い る 。 制限酵素切断部位 は次の よ う に省略 し て示 さ れて い る 。 S a, S a c I； X, X b a 1； B, B amH I； P, P s t I ; E, E c o R I ; S , S a 1 I ; A , A p a 1 ; K , K p n I ; S t, S t u I ; N , N r u I ; B g, B g 1 I I ; N c , N_c_o I； H e, H i n c I I 第 1 3 図 は、 海洋細菌 A 1 c a 1 i g e n e s s p. PC-1 の ケ ト 基導入酵素遺伝子 （ c r tW 遺伝子） の塩基配列 と コ ー ド さ れ る ポ リ べ プチ ド の ァ ミ ノ 酸配列 を示す説明図で あ る 第 1 4 図 は、 第 1 3 図 に続 く 配列 を示す説明図で あ る 第 1 5 図 は、 海洋細菌 A 1 c a 1 i g e n e s s p. PC-1 の水酸 基導入酵素遺伝子 （ c r t Z 遺伝子） の塩基配列 と コ ー ド さ れ る ポ リ べ プチ ドの ア ミ ノ 酸配列 を示す説明図で あ る 第 1 6 図 は、 海洋細菌 A 1 c a 1 i g e n e s s p. PC-1 の キ サ ン ト フ ィ ル合成遣伝子群の塩基配列 を示す説明図で あ る 図中 の A か ら D は、 図 1 3 〜図 1 5 の A か ら D に対応 し て い る 。
第 1 7 図 は、 第 1 6 図 に続 く 配列 を示す説明図で あ る 第 1 8 図 は 、 第 1 7 図 に続 く 配列を示す.説明図で あ る 第 1 9 図 は、 海洋細菌 A 1 c a 1 i g e n e s s p. PC-1 の キ サ ン ト フ ィ ル合成遺伝子 （群） を含む い ろ い ろ な デ レ ー ン a ン プ ラ ス ミ ド を示す説明図で あ る 。
白抜 き の P は、 ベ ク タ ー pB l u e s c r i p t 11 S K+ の l a c の プ ロ モ ー タ ー を示 し て い る 。
— \ 4 — 第 2 0 図 は、 海洋細菌 Ag r o b a c t e r i um a u r a n t i a c u s s p. n o v . MK 1 お よ び A l c a l i g e n e s s . P C - 1 の マ イ ナ ー な生合成経路を含むキ サ ン ト フ ィ ル生合成経路 と キ サ ン ト フ ィ ル合成遺伝子の機能を 示す説明図で あ る 。
マ イ ナ ー な生合計経路 は点線の 矢印で示 さ れて い る 。
発明 を実施す る た め の最良の形態 本発明 は、 海洋細菌であ る ァ グ ロ パ ク テ リ ゥ ム A g r 0 b a _c t e _r i u m _ a u r _a n t i a c u s s p . n o v . M K 1 お よ ひ A l c a l i g e n—e _s p. PC- 1 に 由来す る ァ ス タ キ サ ン チ ン 等の ケ ト 基を 含むキ サ ン ト フ イ ノレ （ ケ ト カ ロ チ ノ ィ ド） の 合成 に 有用 な D N A 鎖、 及び、 こ の D N A 鎖を導入 し た微生物を利用 し た ァ ス タ キ サ ン チ ン 等 の ケ ト 基 を 含む キ サ ン ト フ ィ ル （ ケ ト カ ロ チ ノ イ ド） 、 す な わ ち 、 ァ ス タ キ サ ン チ ン 、 フ ェ ニ コ キ サ ン チ ン 、 4 - ケ ト ゼ ア キ サ ン チ ン 、 カ ン タ キ サ ン チ ン 、 及 び、 ェ キ ネ ノ ン の 製造法を提供す る も の で め る 。
本発明 に よ る DNA 鎖 は、 フ ァ イ ン ケ ミ カ ル生成反応の 点か ら 原理、 原則的 に は、 前記 （ 1 ) , ( 10) お よ び
( 19 ) に よ り 示 さ れ、 基本的 に は、 前記 （ 2 ) , ( 4 )' ( 11) , ( 13) , ( 20 ) お よ び （ 22 ) に よ り 定義 さ れ る も の で あ る 。 D N A 鎖 （ 2 ) お よ び （ 4 ) の 具体例が前記 ( 6 ) お よ び （ 8 ) で あ り 、 D N A 鎖 （ 11) お よ び （ 13) の 具体例が前記 （ 15) お よ び （ 17) で あ り 、 さ ら に、 D N A 鎖 （ 20) お よ び （ Π ) の 具体例が前記 （ 24) お よ び ( 26 ) で あ る 。 な お、 D N A 鎖 （ 3 ) , ( 5 ) , ( ？ ) ,
( 9 ) ， ( 12) , ( 14) , ( 16) , ( 18) ， ( 21) ,
( 23 ) , ( 25 ) お よ び （ 27) は、 そ れぞれ、 D Ν Α 鎖 （ 2 )
， ( 4 ) , ( 6 ) , ( 8 ) , ( 11) , ( 13) , ( 15) , ( Π ) ， （ 20 ) , ( 22 ) ， （ 2 Ο お よ び （ 26 ) に対 し て、 ス ト リ ン ジ ェ ン ト な条件下でハ イ ブ リ ダィ ズす る も の で め る 。
本発明 に よ る D Ν Α 鎖が コ ー ドす る ポ リ ペ プチ ド は、 ァ ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 1 〜 2 及び 5 〜 6 (第 1 〜 2 図及 び第 1 3 〜 1 5 図） に お け る 前記 し た よ う な特 定範囲 （た と え ば配列番号 1 ( 第 1 図） で は ア ミ ノ 酸番 号 1 〜 2 1 2 の配列で あ る ア ミ ノ 酸配列 （ 第 1 図で は A 〜 B) ) を有す る も の で あ る 。 本発明 に お い て、 こ れ ら の DN A 鎖 に よ っ て コ ー ド さ れ る 4 種の ポ リ ペ プチ ド （すな わ ち キ サ ン ト フ ィ ル生成反応に 関与す る 4 種の 酵素） は、 前述の よ う な酵素活性を有す る 限 り ア ミ ノ 酸の い く つ か に つ い て欠失、 置換、 付加等の変化があ っ て も よ い （実 施例 1 3 参照） 。 こ の こ と は、 「ア ミ ノ 酸配列が実質的 に --- 」 と い う こ と と 対応 し て い る 。 た と え ば、 こ の酵 素の 第 1 番 目 の ア ミ ノ 酸 （ Me t ) が欠失 し て い る も の な ど も こ の ア ミ ノ 酸配列 の変化 に よ る ポ リ べ プチ ド な い し は酵素 に包含 さ れ る 。 な お、 各ポ リ ペ プチ ドを コ ー ドす る 本発明 DNA 鎖 は、 配列番号 1 〜 2 及び 5 〜 6 (第 1 〜 2 図及 び第 1 3 〜 1 5 図） に示 し た特定範囲の塩基配列 を も つ も の の 他 に、 縮重 コ ド ン に お い て の み異 な る 同一 の ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 縮重異性体を も 包含す る も の で あ る こ と は い う ま で も な い。
ケ ト 基導入酵素遺伝子 （ e f tW)
DNA 鎖 （ 1 ) 〜 （ ) は ケ ト 基導入酵素を コ ー ドす る 遺伝子 （ c r t W と 命名） で あ る 。 こ の典型的 な例 は、 海 洋細菌— Ag r ob a c t e r i um a u r a n t i a c u s s p . n o v . M K 1 ま た は A 1 c a 1 i g e n e s— s p. P C- 1 よ り ク ロ ー ニ ン グ し た c r t W 遣伝子で あ り 、 第 1. 図の A か ら B (配列番号 1 の ァ ミ ノ 酸番号 1 〜 2 1 2 ) ま た は第 1 3 〜 1 4 図の A か ら B
(配列番号 5 の ア ミ ノ 酸番号 1 〜 2 4 2 ) ま で の ァ ミ ノ 酸配列 を有す る ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列 か ら な る D N A 鎖で あ る 。 c r t W 遺伝子産物 （以下 C r tW と も 呼ぶ） は、 β - ィ オ ノ ン環 （ yS - i cnon e r i n ) の 4 位の メ チ レ ン （ me t hy l e n e ) 基を ケ ト （ ke t o) 基 に転換す る 酵素活性を有 し て お り 、 そ の 具体的 な例 の 1 つ が、 ^ - カ ロ チ ン （ yS -c a r o t e n e ) を基質 と し てェ キ ネ ノ ン （ e c h i n e non e) を経て カ ン タ キ サ ン チ ン （ c a n t ha xa n t n ) を 合成す る 酵素活性であ る （第 1 1 図参照） 。 さ ら に、 c r tW遺伝子産物 は、 3 - ヒ ド ロ キ シ - - ィ オ ノ ン環
( 3-hy d r oxy- S -i onon e r i ng) の 4 位 の メ チ レ ン ( me t h y l en e ) 基を ケ ト （ k e t o) 基 に転換す る 酵素活性 も 有 し てお り 、 そ の具体的 な例 の 1 つ が、 ゼア キ サ ン チ ン （ z e a X a n t h i n) を基質 と し て 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン （ 4-k e
7 一 t o z e ax an t h i n) を 経て ァ ス タ キ サ ン チ ン ( a s t a xa n t h i n ) を 合成す る 酵素活性で あ る （第 1 1 図参照） 。 な お、 こ の よ う な酵素活性を有す る ポ リ べ プチ ド お よ び こ れを コ 一 ドす る D N A 鎖 は、 従来知 ら れて い な か つ た も の で あ り 、 こ の ポ リ ペ プチ ド ま た は こ れを コ ー ドす る D N A 鎖 は、 現 在ま で に知 ら れて い る どの よ う な ポ リ べ プチ ド ま た は D N A 鎖 と も 全体的 な ホ モ ロ ジ 一 は有 し て い な い。 ま た、 β - ィ オ ノ ン環や 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ オ ノ ン環 に 限 ら ず、 1 つ の酵素が ジハ イ ド 口 カ ル ボ二 ル基を 直接ケ ト 基 に変換す る と い う 知見 は今 ま で無か っ た も の で あ る 。 な お、 Ag r o " c t e r i um _と A l c a l i g e n e s 間の C r t W の ホ モ ロ ジ 一 は、 ア ミ ノ 酸配列 レ ベ ルで、 83 % の ア イ デ ン テ ィ テ ィ 一 と い う 高 い ホ モ ロ ジ一を示 し た。
—方、 非光合成細菌 E r w i n i a の カ ロ チ ノ ィ ド合成遺 伝子を用 い る こ と に よ り 、 大腸菌等の微生物 に ^ - カ ロ チ ン ゃ ゼア キ サ ン チ ン を作 ら せ る こ と がで き る 、 す な わ ち 、 E rwi n i a の c r t E、 c r t B、 c r t I、 c r t Y 遺伝子 は、 大 腸菌等の微生物 に ） δ - カ ロ チ ン生産能を与え、 E rwi n i a の c r t E、 c r t B、 c r t I、 c r t Y、 c r t Z 遺伝子 は、 大腸菌等 の微生物 に ゼア キサ ン チ ン生産能を与え る （第 1 0 図お よ び前記の W 091 / 13 G 号公開公報参照） 。 し たが っ て、 C r t W の基質 は、 こ れ ら E rwi n i a の e r t 遺伝子群 に よ り 供給 さ れ る の で、 上記の E twi n i a の c r t 遺伝子群を含む 大腸菌等の 微生物 に さ ら に c r t W jg伝子を導入す る と 、 β - カ ロ チ ン 産生微生物で は、 ェ キ ネ ノ ン を経て カ ン タ キサ ン チ ン を、 ゼア キ サ ン チ ン 産生微生物で は、 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン を経て ァ ス タ キ サ ン チ ン を生産す る よ う に な る 。
水酸基導入酵素遺伝子 （ e f t Z)
DNA 鎖 （ 19) 〜 （ Π) は水酸基導入酵素を コ ー ドす る 遺伝子 （ c r t Zと 命名） で あ る 。 こ の典型的 な 例 は、 海洋 細菌— A g 0 b a c t e r i um a u r a n t i a c u s s . n o v . M K 1 ま ； rこ は A I c a 1 i g e n e s s p. P C - 1 よ り ク ロ ー ニ ン グ し た c r t Z遺伝 子で あ り 、 第 2 図の じ か ら （配列番号 2 の ア ミ ノ 酸番 号 1 〜 1 6 2 ) ま た は第 1 5 図の C か ら D (配列番号 6 の ア ミ ノ 酸番号 1 〜 1 6 2 ) ま での ア ミ ノ 酸配列 を有す る ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列か ら な る D N A 鎖で あ る 。 c r t Z 遣伝子産物 （以下 C r t Z と も 呼ぶ） は、 β - ィ オ ノ ン 環 （ ）S - i'onon e r i n ) の 3 位の炭素 に 1 つ の 水酸基を付加す る 酵素活性を有 し て お り 、 そ の具体的な 例 の 1 つ が、 β - カ ロ チ ン （ /S - c a r o t e n e ) を基質 と し て β - ク リ プ ト キ サ ン チ ン （ yS -c ryp t oxan t h i n) を経て ゼア キ サ ン チ ン （ z e ax an t li i n) を 合成す る 酵素活性で あ る （第 1 1 図参照） 。 さ ら に、 ni 遺伝子産物 は、 4 - ケ ト - - ィ オ ノ ン環 （ 4-k e t o- β - i o n o n e r i ng) の 3 位の炭素 に 1 つ の水酸基を付加す る 酵素活性 も 有 し て お り 、 そ の 具体的な例の 1 つ が、 カ ン タ キ サ ン チ ン （ c a n t h a X a n t i n ) を基質 と し て フ エ ニ コ キ サ ン チ ン （ pho e n i c o x a n t li ί n ) を経て ァ ス タ キ サ ン チ ン （ a s t a∑a n t h i n ) を 合成す る 酵素活性であ る （第 1 1 図参照） 。 な お、 後 者の酵素活性を有す る ポ リ べ プチ ド お よ び こ れを コ ー ド す る DNA 鎖 は、 従来知 ら れて い な か っ た も の で あ る 。 ま た、 A g r 0 b a c t e r i u m お よ び A l c a l i g en e s O C r t Z は、 ァ ミ ノ 酸配列 レ べ ノレで、 E r ¥ i n i a u r_e d o v o r a の C r t Z と そ れぞれ、 W% お よ び 58 % の ア イ デ ン テ ィ テ ィ ー と い う 高 い ホ モ ロ ジ一を有 し た。 な お、 A e r 0 b a c t e r i u m と
A 1 c a 1 i R e n e s 間の C r t Z の ホ モ ロ ジ 一 は、 ア ミ ノ 酸配 列 レ ベ ル で、 90% の ア イ デ ン テ ィ テ ィ 一 と い う 高 い ホ モ 口 ジ ー を示 し た。
非光合成細菌 E r i n i a の カ ロ チ ノ ィ ド合成遺伝子を 用 い る こ と に よ り 、 大腸菌等の 微生物 に S - カ ロ チ ン を 作 ら せ る こ と がで き る の は前述の と お り であ る 。 さ ら に こ れ に c r t W を加え る と 、 大腸菌等の微生物 に カ ン タ キ サ ン チ ン を作 ら せ る こ と がで き る の も 前述の と お り で あ る 。 し た力く つ て、 A? r o b a c t e r i um ま た は A 1 c a 1 _i g e n e sの
C r t Z の基質 は 、 E r i n i a の ^ t E、 c _r t Β Λ c r t U c r t Y 遺伝子 （ S - カ ロ チ ン の生産） 、 お よ び、 こ れ ら に
Ag r o ba c t e r i um ま た は A l c a l i g en e sの c r t W 遺伝子を加 え た も の （カ ン タ キ サ ン チ ン の 生産） に よ り 供給 さ れ る の で、 こ れ ら の c r tit伝子群を含む大腸菌等の 微生物 に Ag r o ba c t e r i um ま た は A l c a l i g en e sの c r tZ遺伝子を導入 す る と 、 β - カ ロ チ ン産生微生物で は、 β - ク リ プ ト キ サ ン チ ン を経てゼ ア キ サ ン チ ン を、 カ ン タ キ サ ン チ ン 産 生微生物で は、 フ ヱ ニ コ キ サ ン チ ン を経て ァ ス タ キ サ ン チ ン を生産す る よ う に な る 。
リ コ ピ ン環化酵素遺伝子 （ e r t Y )
ア ミ ノ 酸配列が実質的 に 第 3 お よ び 4 図の E か ら F
(配列番号 3 の ア ミ ノ 酸番号 1 〜 3 8 6 ) ま で の ァ ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る D N A 鎖 は、 リ コ ピ ン環化酵素を コ ー ドす る 遺伝子 （ c r t Yと 命名） で あ る 。 こ の 典型的な例 は、 海洋細菌 Ag r o b a c t e r i um a u r a n t i a c u s s . n o v . M K 1 よ り ク ロ ー ニ ン グ し た c r t Y遺伝子で あ り 、 第 3 お よ び 4 図 の E か ら F ま での ア ミ ノ 酸配列 を有す る ポ リ べ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列 か ら な る D N A 鎖で あ る 。 c r t Y遺伝子 産物 （以下 C r t Y と も 呼ぶ） は、 リ コ ピ ン （ 1 y e Q p e n e ) を基質 と し て yS - カ ロ チ ン （ ；S - c a r o t en e ) を 合成す る 酵素活性を有 し て い る （第 1 1 図参照） 。 非光合成細菌
E rw i n i aの カ ロ チ ノ ィ ド合成遺伝子を用 い る こ と に よ り 、 大腸菌等の 微生物 に リ コ ピ ン を作 ら せ る こ と がで き る 、 す な わ ち 、 E rwi n i a の c r t E、 c r t B、 c r t I 遺伝子 は、 大 腸菌等の 微生物 に リ コ ピ ン生産能を与え る （第 1 0 図お よ び前記の W091/13 (Π 8号公開公報参照） 。 し たが っ て、 A r o b a c t e r i um の C r tY の基質 は 、 E rwi n i a の c r t 遺伝 子群に よ り 供給 さ れ る の で、 上記の E r V i n i a の _r t 遺伝 子群を含む大腸菌等の微生物 に Ag r ob a c t e r i umの c r t Y を導入す る と 、 カ ロ チ ン を生産 さ せ る こ と が可能 と
2 な る 。
な お、 A g r 0 b a c t e r i u m の C r t Y は、 ア ミ ノ 酸配列 レ べ ルで、 E r w i n i a u r e d o v o r a の C r t Y と 44. 3% の ア イ デ ン テ ィ テ ィ ー と い う 意義深 い ホ モ ロ ジ一を有 し て お り 、 酵 素の機能 も両者で同一で あ る （第 1 0 図、 第 1 1 図参照） 海洋細菌の菌学的性質
キ サ ン ト フ ィ ル合成遺伝子の取得源 と な っ た海洋細菌 で め る Ag r o b a c t e r i um a u r a n t i a c u s s . n o v . M K 1 お よ び A 1 c a 1 i g e n e s s p. P C- 1 は、 下記の よ う な 菌学的性質 を示す。
< A g r 0 b a c t j r i _u m _a u r a n t i a c u _s_ s . n o v . M K 1 >
( 1 ) 形態
菌の形 ， 大 き さ ： 桿状、 0. 9 β m ∑ 1. 2 m
動性 ： あ り
鞭毛 ： 周毛あ り
細胞の 多形成 ： な し
胞子の形成 ： な し
グ ラ ム染色 ： 陰性
( 2 ) 各培地 に お け る 生育状況
肉汁寒天平板培養 ： 非拡散性で光沢を有す る 、 橙色の 円 形 コ ロ ニ ー を形成す る 。
肉汁寒天斜面培養 ： 非拡散性で光沢を有す る 、 橙色の帯 状 に生育す る 。 肉汁液体培養 ： 培地全体 に均一 に生育 し 、 橙色を示す。 肉汁ゼ ラ チ ン 穿刺培養 ： 穿刺孔を 中心 に表面 に生育す る
( 3 ) 生理学的性質
硝酸塩の還元 ： 陽性
脱窒反応 ： 陰性
イ ン ド ー ル の生成 ： 陰性
ク ェ ン酸の 利用 ： 陰性
色素の生成 ： 脂溶性の赤橙色色素
ゥ レ ア ー ゼ活性 ： 陰性
ォ キ シ ダ ー ゼ活性 ： 陽性
カ タ ラ ー ゼ活性 ： 陽性
；8 - ダル コ シ ダー ゼ活性 （エ ス ク リ ン分解性） ： 陽性 β - ガ ラ ク ト シ ダー ゼ活性 ： 陽性
生育の 範囲 ： Ρ Η 5 〜 9 、 温度 1 0 〜 4 0 °C
酸素 に対す る 態度 ： 好気性
海水耐性 ： 陽性
0 — F テ ス ト ： 酸化
糖類の 同化能 ：
陽性 ： D -グル コ ー ス 、 D -マ ン ノ ー ス 、 D -ガ ラ ク ト ー ス 、 D -フ ノレ ク ト ー ス 、 乳糖、 麦芽糖、 シ ョ 糖、 グ リ コ ー ゲ ン 、 N -ァ セ チ ノレ - D - ダ ル コ サ ミ ン
陰性 ： L -ァ ラ ビ ノ ー ス 、 D -マ ン ニ ト ー ノレ 、 イ ノ シ ロ 一ノレ 、 L -ラ ム ノ ー ス 、 D -ソ ル ビ ト ー ル
有機酸の 同化能 ： 陽性 ： 乳酸塩
陰性 ： ク ェ ン 酸塩、 リ ン ゴ酸塩、 ダル コ ン酸塩、 カ ブ リ ン酸塩、 コ ハ ク 酸塩、 ア ジ ピ ン酸塩
他の 有機物の 資化能 ：
陽性 ： イ ノ シ ン 、 ゥ リ ジ ン 、 グ ル コ ー ス - 1 - リ ン 酸、 グ ル コ ー ス - 6 - リ ン 酸
陰性 ： ゼ ラ チ ン 、 L -ァ ノレ ギニ ン 、 DNA 、 カ ゼ イ ン
< A l c a l i ge n e s s p . P C - 1 >
( 1 ) 形態
菌 の 形 ， 大 き さ ： 短捍状、 1. 4 β m
¾ ¾ ： あ り
鞭毛 ： 周毛あ り
細胞の多形成 ： な し
胞子の形成 ： な し '
グ ラ ム 染色 ： 陰性
( 2 ) 各培地 に お け る 生育状況
肉汁寒天平板培養 ： 非拡散性で光沢を有す る 、 橙色の 円 形 コ ロ ニ ー を形成す る 。
肉汁寒天斜面培養 ： 非拡散性で光沢を有す る 、 橙色の 帯 状 に生育す る 。
肉汁液体培養 ： 培地全体 に均一に生育 し 、 橙色を示す。 肉汁ゼ ラ チ ン 穿刺培養 ： 穿刺孔を 中心 に表面 に生育す る c ( 3 ) 生理学的性質 色素の生成 ： 脂溶性の 赤橙色色素
ォ キ シ ダ ー ゼ活性 ： 陽性
カ タ ラ ー ゼ活性 ： 陽性
生育の範囲 ： PH5 〜 9 、 温度 10 〜 40°C
酸素に対す る 態度 ： 好気性
海水耐性 ： 陽性
0 — F テ ス ト ： 酸ィ匕
ゼ ラ チ ン 分解性 ： 陰性
他の海洋細菌の キ サ ン ト フ ィ ル合成遺伝子群
現在 ま で に 1 6 種の海洋細菌が ァ ス タ キ サ ン チ ン等の ケ ト カ ロ チ ノ イ ドを 合成す る こ と が報告 さ れて い る （ Yo k 0 y a m a , A. , 1 z u m i d a , H. , Mi k i, W. , ' Ma r i n e b a c t e r i a p r odu c e d a s t axan t li i n' . 10 t h I n t e rn a t i ona l s ymp o s
1 u m -on c a r o t e n o i d s , ab s t r a c t, C L 11 - 3 , 1993 ) 。 前述 し た海洋細菌 Ag r ob a-c t e r i um a u r a n t i a c u s s . n o v . M K 1 ま た は A 1 c a 1 i g e n e s s p. P C - 1 の e r t 遺伝子の 内 の いずれかを プ ロ ー ブ と し て用 い れ ば、 そ の ホ モ ロ ジ 一 を 利用す る こ と に よ っ て、 他 の ァ ス タ キ サ ン チ ン 産生海洋 細菌か ら 、 ァ ス タ キ サ ン チ ン を始め と す る ケ ト カ ロ チ ノ ィ ドの生合成を担 う 遺伝子群を取得す る こ と がで き る は すで あ る 。 事実、 発明者等 は、 A . a u r a n t i a c u s s . no v. MK 1 の c r t W と c r t Z を含む DNA 断片を プ ロ ー ブ と し て、 A 1 c a 1 i g e n e s P C - 1 の染色体 DNA か ら 、 強 く ノヽ ィ プ リ ダイ ズす る D N A 断片 と し て、 c r t W と c r t Z 遺伝子 を取得 し た の で あ っ た （詳細 は実施例 を参照 さ れ た い） さ ら に、 発明者等 は、 ァ ス タ キサ ン チ ン を 合成で き る 残 り の 1 4 種の海洋細菌の 中か ら A 1 t e r om o n a_s_ S D- 402 を 選んで、 こ れか ら 染色体 DNA を調製 し 、 Ag, a u r a n t i a c u s s p. n o v. MK 1 の c r t W と c r t Z を含む DNA 断片を プ ロ ー ブ と し て、 サザ ン法を行 っ た と こ ろ 、 予想 ど お り 、 こ の プ ロ ー ブ は こ の海洋細菌の染色体 D N A に 由来す る バ' ン ド と も ノヽ イ ブ リ ダィ ズ し た。 本発明 に よ る D N A' 鎖 は、 こ の よ う な 前記 D N A 鎖 （ 2 ) , ( 4 ) , ( 6 ) , ( 8 ) ( 11 ) , ( 13 ) , ( 15 ) , ( 17 ) , ( 20 ) , ( 22 ) , ( 24) お よ び （ 26) と ノ、 イ ブ リ ダィ ズす る D N A 鎖を包含 す る も の で あ る 。
DN A 鎖の取得
上記の各酵素の ア ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る 塩基配列を 有す る DNA 鎖を取得す る 一つ の手段 は、 核酸合成の方法 に従 っ て、 そ の鎖長の少な く と も 一部を化学合成す る こ と で あ る が、 結合ア ミ ノ 酸が多数で あ る と い う こ と を考 え れば、 こ の ィ匕学合成法 よ り も A g r 0 b a c t e r i u ni a u r a n t i a c u s s . n o v . M K 1 ま た は A l c a l i g en e s s . P C - 1 O h 一タ ル D N A を適当 な制限酵素で消化 し た も の を用 い て大 腸菌で ラ イ ブ ラ リ ー を作製 し 、 こ の ラ イ ブ ラ リ ー か ら 遺 伝子工学の分野で慣用 さ れて い る 方法、 た と え ば適当 な プ ロ ー ブ に よ る ノヽ ィ プ リ ダイ ゼー シ ヨ ン 法、 に よ り 、 こ れを取得す る ほ う が好ま し い と 言え る （他の 海洋細菌の キサ ン ト フ ィ ル合成遺伝子群参照） 。
大腸菌等の 微生物の形質転換お よ び遺伝子発現
上述の よ う な本発明 D N A 鎖を適当 な細菌 （例え ば、 大 腸菌、 Z y m 0 m 0 _n a s m o b i 1 ι s 、 Ag r o b a c t e r i um t u m e f a c i e n s ) や酵母 （例え ば S a c cha r omy c e s c e r e v i s i a e ) 等の微 生物 に導入す る こ と に よ り 、 種 々 の キ サ ン ト フ ィ ゾレを製 造す る こ と がで き る 。
以下 は、 好 ま し い微生物への 外来遺伝子の導入法の概 要 につ い て記載 し た も の で あ る 。
大腸菌等の 微生物への外来遺伝子の導入お よ び発現 の た め の 手順な い し方法 は、 本発明 に お い て下記 し た と こ ろ 以外の も の に お い て も 、 遺伝子工学の分野 に よ り 慣用 さ れて い る も の を含み、 そ の手法な い し 方法 （た と え ば ' Ve c t o r s f o r c l on i ng g en e s' , Me t ho d s i n En z ymo l o gy , 216, p . 469 - 631, 1992, Ac a d em i c P r e s s、 お よ び、 ' 0 t h e r b a c t e r i a l s y s t ems' , Me t ho d s i n En z ymo l o gy, 20 4, p. 305 - 636, 1991, Ac ad em i c P r e s s ) に準 じ て 実施すれば よ い。
< 大腸菌 〉
大腸菌への外来遺伝子の導入法 は、 ハ ナハ ン の方法、 ル ビ ジ ウ ム 法な どすで に確立 さ れた い く つ かの効率的方 法があ り 、 そ れを用 い て行え ば よ い （た と え ば、 S a m b r 0 ok, J. , F r i t s ch, E . F . , a n i a t i s , T. , " Mo l e cu l a r c l on i n - A l abo r a t o r y i a n u a 1. ' Co l d S r i ng Ha r bo r L a b o r a t o r y P r e s s, 1989 参照） 。 大腸菌での 外来遺伝 子の発現 は常法 に従 っ て行え ば よ い 力く （た と え ば、 前述 の ' Mo l e cu l a r c l on i n g - A l a b o r a t o r y ma nu a l. ' 参照 ) 、 た と え ば、 pUC 系や p B l u e s c r i p t 系等の l a c の プ ロ モ 一 タ ー等を有す る 大腸菌用 ベ ク タ ー を用 い て行 う こ と 力《 で き る 。 発明者等 は、 1 a c の プ ロ モ ー タ ー等を有す る 大 腸菌用ベ ク タ ー pB l ii e s c r i p t I I SK ま た は KS を用 い て、 l a c—の プ ロ モ ー タ ー の 転写の リ 一 ド ス ノレ一を受 け る 方 l。j に、 Ag r o b a c t e r i um a u r a n t i a c u s s . n o v . M K 1 の c r tW、 c r t Z、 c r t Y遺伝子お よ び A l c a l i g e n e s s p . P C - 1 の c r t W、 c r t Z遺伝子を挿入 し 、 こ れ ら の遺伝子を大腸菌 で発現 さ せ た。
< 酵母 〉
酵母 S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e への外来遺伝子の導 入法 は、 リ チ ウ ム法な どすで に確立 さ れた方法があ り 、 そ れを用 い て行え ば よ い （ た と え ば、 秋山裕一監修バ イ ォ イ ン ダス ト リ 一協会編集、 「酵母の ニ ュ ーバ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー」 医学出版セ ン タ ー 刊参照） 。 酵母で の外来 遺伝子の発現 は、 PGK や GPD 等の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一を用 い て、 外来遺伝子を こ の プ ロ モ ー タ 一 と タ ー ミ ネ ー タ ー の 間 に転写の リ 一 ド ス ルー を受 け る よ う に挿入 し た発現 カ セ ッ ト を構築 し 、 こ の発現 カ セ ッ ト を、 S. c e r e V i s i_a_e_ の ベ ク タ ー、 た と え ば、 YRp 系 (酵母染色体の ARS 配列 を複製起点 と す る 酵母用 マ ルチ コ ピ ー ベ ク タ ー） 、 YEp 系 （酵母の 2 β m DNA の複製 起点を持つ酵母用 マ ルチ コ ピ ー ベ ク タ ー） 、 Υ ί ρ 系 （酵 母の複製起点を持た な い酵母染色体組込み用 べ ク タ ー） 等の ベ ク タ ー に挿入す る こ と に よ り 行 う こ と がで き る
(前述の 「酵母の ニ ュ ーバ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー」 医学出版 セ ン タ ー刊、 日 本農芸化学会 A B C シ リ ー ズ 「物質生産の た め の遺伝子工学」 朝倉書店刊、 お よ び、 Yama no, S. , I s h i i , T . , Ν a k a g a 7 a , M. , I k e n a g a , H. , Mi s a w a , N. ， ' Me t ab o l i c e n i n e e r i ng f o r p r o du c t i o n o f β - c a r o t e n e an d 1 y c o p e n e i n S a c c ha r omy c e s c e r e v i s i a e ' . B i o s c i . B i o t e ch. B i o c h em. , 58, P. 1112 - 1114, 199 参 照） 。
< Zymomo n a s m o b i 1 i s >
エ タ ノ ー ノレ生産細菌 Zymomon a s m o b i 1 i s へ の外来遺 伝子の導入法 は、 グ ラ ム 陰性菌 に共通な 接合伝達法 に よ り 行 う こ と 力くで き 、 Zymomona s mo b i l i s で の 外来遺伝子 の 発現 は、 た と え ば Zymomon a s mob i l i s 用 ベ ク タ ー p Z A22 を用 い て行 う こ と がで き る （中村克己、 Γ ZymoMo n a s 細菌の分子育種」 、 日 本農芸化学会誌， p. 1016-1
018, 1989 、 お よ ひ、 M i s a a , N. , Y a m a n o , S. , I k e n a g a, H. ， ' P r odu c t i on o f β -c a r o t en e i n Zymomona s_ mob Π i s a nd_Ag r ob a c t e r i iim t u m e f a c i e n s by i n t r o du c t i on o f t h e b i o s yn t h e s i s g en e s f r om E rwi n i a u r e d o v o r a ' A p p I . Env i r on. i c r ob i o l. , 57, p. 1847 - 1849, 199 1 参照） 。
く A g r o b a _c t e _r i u m _ t u i e { a c i e n s >
植物病原細菌— A g r o b a c t e r i um t u m e f a c i e n s への外来 遣伝子の導入法 は、 グ ラ ム 陰性菌 に共通な接合伝達法 に よ り 行 う こ と か'で さ 、 A g r o b a c t e r i um t u ID e f a c i e n s で の 外来遺伝子の 発現 は、 た と え ば A g r o b a c t e r i um t u m e f a c i e n s 用 べ ク タ ー ρ Β Ι Π Ιを用 い て行 う こ と 力くで き る （ M i s a w a , N. , Y a m a n o , S. , I k e n a g a , H. , ' P r o d u c t i o n o f β - c a r o t e n e i n Z y m o m o n a s m o b i l i s a n d— A g— r o c t e rj_um t u m e f a c i e n s b y i n t r o d u c t i o n o f t h e b i o s y n t h e s i s g e n e s f r om E r w i n i a u r e d o y o r a ' . A p 1. E n v i r o n. M i c r o b i o 1. , 51, p. 1847 - 1849, 1991 参照） 。
微生物 に よ る キ サ ン ト フ ィ ル生産
前述 し た、 微生物への外来遣伝子の導入お よ び発現の た め の手法な い し 方法に よ っ て、 海洋細菌由来の ァ ス タ キ サ ン チ ン を始め と す る ケ ト カ ロ チ ノ ィ ド合成遺伝子群 を導入 し 、 発現 さ せ る こ と が可能で あ る 。
フ ア ル ネ シ ル ピ ロ リ ン 酸 （ F P P ) は カ ロ チ ノ ィ ド だ け で な く 、 セ ス キ テ ルペ ン 、 ト リ テ ノレペ ン 、 ス テ ロ ー ル、 ホ ノ、。 ノ ー ル等の テ ルぺ ノ ィ ド と 共通な基質で あ る 。 一般 に、 微生物 は、 カ ロ チ ノ ィ ドを合成で き な い も の で も 、 テ ルぺ ノ ィ ド は 合成 し て い る の で、 すべて の 微生物 は、 基本的 に、 中間代謝産物 と し て F P Pを有 し て い る はずで あ る 。 一方、 非光合成細菌 E r w i n i aの カ ロ チ ノ ィ ド合成 遺伝子群 は、 FPP を基質 と し て、 Ag r o ba c t e r i um a u r a n t l a c u s s p n o v. K1 ま た は A c a 1 l e n e s s p P C- 1 の c r t 遺伝子産物の基質、 す な わ ち 、 リ コ ピ ン、 β - 力 ロ チ ン、 ゼア キ サ ン チ ン ま で合成 さ せ る こ と が可能で あ る （第 1 0 図参照） 。 発明者等 は、 大腸菌だ けで な く 前 記 し た微生物、 すな わ ち 、 酵母」 a c ch a r omy c e s c e r e v i s i a e 、 エ タ ノ ー ノレ生産細菌 Z y m 0 m 0 n a s m o b i I i s 植物病 原細菌 Ag r o b a c t e r i um t u m e { a c i e n s に E rwi n i aの c r t 遺伝子群を導入 し 、 .こ れ ら の 微生物が、 予想 ど お り 、 yS - カ ロ チ ン 等の カ ロ チ ノ ィ ド を生産で き る よ う に な る こ と を、 すで に確認 し て い る （ Yama no, S. , 1 s h i i , T. , N a k a g a a , M. , I k e n a g a , H. , Mi s a w a , N. , ' Me t abo l i c e n g i n e e r i n g f o r p r o du c t i on o ί β -c a r o t e n e and 1 y c o p e n e i n S a c c ha r omy c e s c e r e v i s i a e ' . B i o s c i . B i o t e c h. B i o ch em. , 58, P . 1112 - 1114 , 199" M i s a w a , N. , Y a m a n o , S. , I k e n a g a , H. ， ' P r o du c t i on o f β -c a r o t e n e i n_Zymomon a s mob i l i s and Ag r o b a c t e r i um _t ume f a c i e_n s by i n t r o du c t i on o { t h e D i o s yn t h e s i s g e n e s f r om E r w i n i a _u r_e d o 7 o r a '·. A p 1. Env i r on. i c r o i o l. , 57, p. 1841- 1849, 1991 、 お よ び、 本発明者 ら に よ る 特許 出 願特願平 号公報 （特願平 号明細書） ： 「カ ロ チ ノ ィ ドの 合成 に有用 な DNA 鎖」 ） 。
し たが っ て、 E rwi n i a 由来の カ ロ チ ノ ィ ド合成遺伝子 群 と 本発明 D N A 鎖 （典型的 に は、 Ag r o ba c t e r i um a u r a n t i a c u _s_ s . n o v . M K 1 ま た は A l c a l i g e n e s s . P C - 1 由 来の カ ロ チ ノ ィ ド合成遺伝子群） を組み 合わせ て 同一の 微生物 に 同時 に導入す る こ と に よ り 、 原理的 に は、 遺伝 子導入発現系が確立 し て い る すべて の 微生物に、 ァ ス 夕 キサ ン チ ン等の ケ ト カ ロ チ ノ ィ ドを生産 さ せ る こ と が可 能 と な る はずであ る 。 以下 に、 各種ケ ト カ ロ チ ノ ィ ド の 微生物 に よ る 生産法 につ い て説明す る 。
く カ ン タ キ サ ン チ ン 、 ェ キ ネ ノ ン の生産 〉
β - カ ロ チ ン 合成 に必要な E rwi n i a u r e d o v o r a の c r t E c r t B、 c r t 1、 c r t Y 遺伝子お よ びケ ト 基導入酵素遺伝子 で あ る 本発明 D N A 鎖 （ 1 ) 〜 （ 9 ) の い ずれか 1 項の D N A 鎖 (典型的 に は Ag roba c t e r i um a u r a n t i a c u s s . n o v .
MK 1 ま た は A ί c a 1 i g e n e s P C- 1 の _^_r tW 遺伝子） を大 腸菌等の微生物 に導入 し 発現 さ せ る こ と に よ り 、 最終産 物 と し て カ ン タ キ サ ン チ ン 、 中間代謝産物 と し てェ キ ネ ノ ン を生産 さ せ る こ と がで き る 。 上記 D N A 鎖 （ _c M W 遺 伝子） の 発現 レ ベ ル の調節や こ れを有す る 微生物の 培養 条件の検討等 に よ り 、 カ ン タ キ サ ン チ ン ゃ ェ キ ネ ノ ン の 収量や量比を変え る こ と がで き る 。 以下 に大腸菌 に お け る 2 つ の例 を述べ る が、 詳細 は実施例 を参照 さ れた い。
E r w i n i a u r e d o v o r a の c r t E、 c r tB、 c r t l、 c r t Y 遺伝 子を 含む断片を大腸菌べ ク タ ー PACYC1 に挿入 し た プ ラ ス ミ ド pACCAR16 Δ c r t お よ び、 _ A g. a u r a n t i a c u s s p. no v. MK1 の e MW 遺伝子を含む断片を大腸菌べ ク タ ー pB l u e s c r i p t I I S K- に 挿入 し た プ ラ ス ミ ド pAK91 6 の両 プ ラ ス ミ ドを大腸菌 IM1 Q 1に導入 し 、 そ れを定常 期 ま で培養 し 、 菌体を集め、 カ ロ チ ノ ィ ド色素を抽 出 し た。 抽 出 さ れた色素の 94% は カ ン タ キ サ ン チ ン で あ り 、 6 % はェキ ネ ノ ン で あ っ た。 ま た、 カ ン タ キ サ ン チ ン の 収量 は、 培養液 2 リ ッ ト ノレか ら 3 m g で あ っ た。
_E r w i n i a u r e d o v o r a の c r t E、 c r t B、 c r t l、 c r t Y 遺 伝子を含む断片を大腸菌べ ク タ ー PACYC184 に 挿入 し た プ ラ ス ミ ド pACCAR16 厶 c r tX、 お よ び、 A l c a l i ge n e s PC - 1の c r t W 遺伝子を含む断片を大腸菌べ ク タ ー pB l u e s c r i p t I I S K+ に挿入 し た プ ラ ス ミ ド pPCn-3 の両 プ ラ ス ミ ドを大腸菌 IM1 Uに導入 し 、 そ れを定常期 ま で培養 し 、 菌体を集め、 カ ロ チ ノ ィ ド色素を抽出 し た。 抽出 さ れた色素の 40% は 力 ン タ キ サ ン チ ン であ り 、 50% は ェ キ ネ ノ ン で あ っ た。 残 り の 10% は未反応の ^ - カ ロ チ ン で あ っ た。
く ァ ス タ キ サ ン チ ン 、 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン の生産 〉 ゼア キ サ ン チ ン 合成 ίこ必要な E rwi n i a u r e d ov o r a の c r t E c r t B. c r t I c r t Y. c r t Z 遺伝子お よ び ケ ト 基導入 酵素遺伝子であ る 本発明 DNA 鎖 （ 10) 〜 （ 18) の い ずれ カヽ 1 項 0 DNA 鎖 （典型的 に は A g r 0 b a c t e r i c m a u r a n t i a c u s s . n o v. MK 1 ま た は A l c a l i gen e s P C - 1 の c r t W 遺 伝子） を大腸菌等の 微生物 に導入 し 発現 さ せ る こ と に よ り 、 最終産物 と し て ァ ス タ キ サ ン チ ン、 中 間代謝産物 と し て 4 - ケ ト ゼア キサ ン チ ン を生産 さ せ る こ と がで き る 上記 D N A 鎖 （ c r tW 遺伝子） の発現 レ ベルの調節や こ れ を有す る 微生物の培養条件の検討等 に よ り 、 ァ ス タ キサ ン チ ン や 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン の収量や量比を変え る こ と がで き る 。 た だ し、
以下に大腸菌 に お け る 2 つ の例 を述べ る が、 詳細 は実施 例を参照 さ れた い。
E r w i n i a u r e d ovo r a 0 c r t E c r t B、 c r t l、 c r tY、 c—r t Z 遣伝子を含む断片を大腸菌べ ク タ ー pACYU に挿入 し た プ ラ ス ミ ド pACCAR25 Δ c r t X お よ び、 Ag. a u r a n t i a c u s s p. n o v. MK 1 の e r tW 遺伝子を含む断片を大腸 菌ベ ク タ ー pB l u e s c r i p t I I S K- に挿入 し た プ ラ ス ミ ド PAK916 の両 プ ラ ス ミ ド を大腸菌 〗M101に導入 し 、 そ れ を定常期 ま で培養 し、 菌体を集め、 カ ロ チ ノ ィ ド色素を 抽 出 し た。 抽 出 さ れた色素の う ち 、 ァ ス タ キ サ ン チ ン と 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン の 収量 は、 そ れぞれ、 培養液 2 リ ッ ト ノレか ら 1. 7 m g 、 1. 5 m gであ っ た。
E r w i n i a u r e d ovo r a の c r t E、 c r tB、 c r t丄、 c—r t Y、 c r_t Z 遺伝子を含む断片を大腸菌べ ク タ ー PACYC 4 に 挿入 し た プ ラ ス ミ ド pACCAR25 A c r tX、 お よ び、 A 1 c a 1 i g e n e j_P C-lの c r t W 遺伝子を含む断片を大腸菌べ ク 夕 一 pB l u e s c r i p t I I S K+ に挿入 し た プ ラ ス ミ ド pPC17-3 の両 プ ラ ス ミ ドを大腸菌 】M1 に導入 し 、 そ れを定常期 ま で 培養 し 、 菌体を集め、 カ ロ チ ノ ィ ド色素を抽 出 し た。 抽 出 さ れた色素の う ち 、 ァ ス タ キ サ ン チ ン と 4 - ケ ト ゼ ァ キサ ン チ ン の収量 は、 そ れぞれ、 培養液 2 リ ッ ト ルか ら 約 1 m g で あ っ た。
く ァ ス タ キ サ ン チ ン 、 フ エ ニ コ キ サ ン チ ン の生産 〉
β - カ ロ チ ン 合成 に必要な E rwi n i a u r e d ov o r a の c r t E、 1111、 1111、 c r t Y 遺伝子お よ び ケ ト 基導入酵素遺伝 子であ る 本発明 DNA 鎖 （ 1 ) 〜 （ 9 ) の いずれか 1 項の DNA 鎖 (典型的 に は Ag r ob a c t e r i um a u r a n t i a c u s s p .
n o y. M K 1ま た は A 1 c a 1 i g e n e s P C - 1 の e τ t W 遺伝子） と 水酸基導入酵素遺伝子で あ る 本発明 DNA 鎖 （ ) 〜 （ 27) の いずれか 1 項の D N A 鎖 （典型的 に は A g. au r a n t i a c u s s p. n o v. M K 1ま た は A 1 c a 1 i g e n e s P C- 1 の c r t Z 遺伝子） を大腸齒等の微生物 に導入 し発現 さ せ る こ と に よ り 、 最 終産物 と し て ァ ス タ キ サ ン チ ン 、 中間代謝産物 と し て フ ヱ ニ コ キ サ ン チ ン を生産 さ せ る こ と がで き る 。 上記 DNA 鎖 （ c r t W 遺伝子お よ び c r t Z 遺伝子） の発現 レ ベ ル の 調節や こ れを有す る 微生物の培養条件の検討等 に よ り 、 ァ ス タ キ サ ン チ ン 、 フ ヱ ニ コ キ サ ン チ ン の収量や量比を 変え る こ と がで き る 。 以下 に大腸菌 に お け る 1 例を述べ る が、 詳細 は実施例 を参照 さ れた い。
E rwi n i_a _u r edovo r a の c r t E、 c r t B、 c r t l、 c r tY 遺伝 子を含む断片を大腸菌ベ ク タ ー PACYC184 に挿入 し た プ ラ ス ミ ド pACCAR16 厶 c r tX、 お よ び、 A g. a u r a n t i a c u s s p. n o v. K 1 の— c r tW 、 c r t Z 遺伝子を含む断片を大 腸菌ベ ク タ ー pB l u e s c r i p t I I S K- に挿入 し た ^ プ ラ ス ミ ド pAK96K の両 プ ラ ス ミ ドを大腸菌 〗M1 Q 1に導入 し 、 そ れを定常期 ま で培養 し 、 菌体を集め、 カ ロ チ ノ ィ ド色素 を抽出 し た。 抽出 さ れた色素の う ち 、 ァ ス タ キ サ ン チ ン と フ ヱ ニ コ キ サ ン チ ン の 収量 は、 そ れぞれ、 培養液 4 リ ッ ト ゾレカヽ ら 3 m g 、 2 m gであ っ た。
微生物の寄託
本発明 DNA 鎖の遺伝子源 と な っ た微生物お よ び単離 さ れた遺伝子を組み込ん だ大腸菌 は、 工業技術院生命工学 工業技術研究所 に下記の通 り に寄託 さ れて い る 。
i ) -Ji r o ba c t e r i um a u r a n t i a c u s s . n o v . M K 1
寄託番号 ： FERM BP- 4506
受託年月 日 ： 平成 5 年 12月 20日
( i i ) Es ch e r i ch i a c o 1 i J M 101 (p A c c r t -E I B, p AK 92)
寄託番号 ： FER BP - 4505
受託年月 日 ： 平成 5 年 12月 20日
( i i i ) A 1 c a 1 i g e n e s s , P C - 1
寄託番号 ： FERM B P- 4760
受託年月 日 ： 平成 6 年 7 月 2 7 日
( i V ) E s ch e r i c h i a c o 1 i . β ： p P C Π
寄託番号 ： FERM BP-4761
受託年月 日 ： 平成 6 年 7 月 2 7 曰 以下の実施例 は、 本発明を さ ら に具体的 に説明す る た め の も の で あ り 、 本発明 を 限定す る も の で は な い。 な お こ こ で用 い ら れた通常の遺伝子組換え実験 は、 特 に言及 さ れて い な い場合 は、 標準的 な方法 （ S aml o o k, 】.， F r i t s c h, E . F . , M a n i a t i s , T . , ' Mo l e cu l r c l on i n - A l abo r a t o r y manu a l. ' Co l d Sp r i ng Ha r bo r L a bo r a t o ry
P r e s s, 1989 ) に基づ い て い る 。
実施例 1 ： 染色体 DNA の調製
染色体 DNA は、 3 種の海洋細菌、 すな わ ち 、 Ag r 0 b a c t e r i _u m _a u _r a n t i a c u s s p . n o v . MKl、 A l c a l i g e n e s _s p. PC - 1、 及び A l t e r omona s _SD-402 株 ( Y o k o y a m a , A. , I z u m i d a , H . , M i k i , W. , ' Ma r i ne b a c t e r i a p r o du c ed a s t a∑ an t h i n' . 10 t h I n t e rna t i o na l s ymp o s i um on c a r o t e n o i d s , a b s t r a c t, CL 11 - 3, 1993 ) か ら 調製 し た。 こ れ ら の 海洋細菌を 2 Q 0 ミ リ リ ッ ト ル （ m l ) の培地 （ D I F C 0 社 製 " Ma r i ne B r o t h"' を説明書記載の方法 に よ り 調製 し た培地） で、 25 C、 定常期 ま で 4 日 間増殖 さ せ た菌体を 集菌後、 TE S 緩衝液 （ 20 mM ト リ ス 、 10 mM EDTA、 0. 1 M N a C 1、 pH8 ) で洗浄 し 、 68 °C で 15分間熱処理 し た後、 5 nig/ m l リ ゾチ ー ム （生化学工業製） と 100 β g / m l RNa s e A ( シ グマ社製） を含む I 液 （ 50 mM ダル コ 一 ス 、 25 mM ト リ ス 、 10 mM EDTA, pH8 ) に懸濁 し た。 37 °C で 1 時間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た後、 250 β g Z m 1 に な る よ う に プ ロ テ ィ ί ゼ {( ( P r o t e i na s e K、 ベ ー リ ン ガ 一 · マ ン ハ イ ム製） を加え、 37°C で 10分間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た。 さ ら に、 最終濃度力く 1 % に な る よ う に ザル コ シ 一ノレ （ N-L a u r。y l s a r c。 s i n e N a 、. シ グマ社製） を加え、 よ く 混合 し た後、 n°cで数時間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た。 さ ら に、 フ エ ノ ー ル Zク ロ 口 ホ ル ム抽 出 を数回行 っ た後、
2倍量の エ タ ノ ー ルを ゆ つ く り 加え な が ら 、 析出 し て き た染色体 DNA を ガ ラ ス棒 に巻 き 付 け、 70%エ タ ノ ー ルで リ ン ス し た後、 2 m l の TE 緩衝液 （ 10 mM ト リ ス 、 1 mM EDTA 、 pH8 ) に溶解 し て、 染色体 DNA 調製液 と し た 実施例 2 ： コ ス ミ ド ラ イ ブ ラ リ ー の た め の宿主の作製
( 1 ) フ ィ ト ェ ン産生大腸菌の作製
E r w i n i a u r e d o v o r a の c r t Z 以外の カ ロ チ ノ ィ ド合成 遺伝子群を有す る プ ラ ス ミ ド p CAR ( M i s a?a, N. , Na k a g a w a , M. , K o b a y a s Ii i , K. , Y a m a n o , S . , I z a w a , Y.， N a k a m u r a , K. , H a r a s h i m a K. , ' E l u c i d a t i on o f t h e _ E r w_i n i a _u r e d o 7 o r a c a r o t e n o i d b i os yn t h e t i c a t hwa y b y f u n c t i on a l a na l y s i s o f g en e p r o du c t s ex r e s s e d i n E s ch e r i c h i a c o I i ' . J . B a c t e r i o 1. , 112, . 670 - 6712, 1990. お よ び、 本発明者 ら に よ る 特許出願特願平 3-58786 号公報 （特願平 号明細書） ： 「 カ ロ チ ノ ィ ド の 合成 に有用 な D N A 鎖」 ） か ら B s t E I I ( 1235 ) - E c 0 521 ( 4926 ) 断片を除 い た後、 フ ィ ト ェ ン産生 に必要 な c r t E と e f t B 遺伝子を含む 2. 3 キ ロ 塩基対 （ kb) の A s p 718 ( Kp n 1 ) - E c oR I 断片を切 り だ し た。 そ し て 、 こ の 断片を大腸菌ベ ク タ ー PACYC 184 の E c oRV 部 位 に挿入 し 、 目 的 と す る プ ラ ス ミ ド （ pACCRT-EB ) を得 た。 こ の pACCRT- EBを有す る 大腸菌 は、 抗生物質 ク ロ ラ ム フ ヱ 二 コ ー ル耐性 （ CmT ) を示 し 、 フ ィ ト ェ ン を生産 す る ( L i nd en, H. , Mi s a w a , N.， C h a m o v i t z , D . , P e c k e r, I . , H i r s c h b e r g , J. , S a n d i a n n , G . , ' Fun c t i ona l c omp l emen t a t i oii i n E s ch e r i c i a c o l i o f d i f f e r en t p h y t o e n e d e s a t u r a s e g e n e s and an a l y s i s o f a c cumu l a t e d c a ro t e ne s' . Z. N a t u r i o r s c h. , 46 c, 1045 - 1051, 19 91) 。
( 2 ) リ コ ピ ン産生大腸菌の作製
E r. u r_e d 0 v o r a の c r t Z 以外の カ ロ チ ノ ィ ド合成遺伝 子群を有す る プ ラ ス ミ ド p CAR16 か ら B s t E l l ( 1235 ) -
Sna B I ( 3497 ) 断片を 除 い た後、 リ コ ピ ン 産生 に 要 な c r t E、 c r t U c r t B 遺伝子を含む 3. 75 k b A s p Π 8 ( Kp n I )一 E c oR I 断片を切 り だ し た。 そ し て、 こ の 断片 を大腸菌ベ ク タ ー PACYC 184 の E c cRV部位 に挿入 し 、 目 的 と す る プ ラ ス ミ ド （ pACCRT-E l B) を得た。 こ の pACCR T-E！ B を有す る 大腸菌 は、 Cm1 を示 し 、 リ コ ピ ン を生産 す る Cunn i ngliani J r , F . X. , C h a m ο ν i t ζ , D. , M i s a w a ,
N. , G a t t , E. , H i r s c h b e r f , J. , ' C l on i n g a" { u n c t i o n a 1 ex r e s s i o n i n E s che r i ch i a c o l i o f a c y a n o b a c t e r i a 1 ge ne f o r 1 y c o p e n e cy c l a s e, t h e e nz yme t ha t c a t a 1 y z e s t e b i o synt he s i s o f β - c a r o t en e' . FEBS L e t t. , 328, 130 - 138, 1993 ) 。 ( 3 ) β - カ ロ チ ン産生大腸菌の 作製
E r . u r e d 0 τ o r a の c r t Z 以外の カ ロ チ ノ ィ ド合成遺伝 子群を有す る プ ラ ス ミ ド pCAR の制限酵素 B s t E 11 消 ィ匕、 Kl enow f ragment 処理、 ラ イ ゲ ー シ ヨ ン反応を行 う こ と に よ り 、 c r tX 遺伝子を フ レ ー ム シ フ ト に よ り 失活 さ せ た後、 β - カ ロ チ ン産生 に必要な e r t E、 ertY、 c r t I c r t B 遣伝子を含む 6. Q k b A s p 718 ( Kp n I ) - _E c o R I 断片を切 り だ し た。 そ し て、 こ の 断片を大腸菌ベ ク タ ー p AC YC 18 の EcoRV部位 に 挿入 し 、 目 的 と す る プ ラ ス ミ ド （ pACCAR A cr tXと 命名） を得た。 こ の pACCAR Δ cr tXを有す る 大腸菌 は、 Cm1 を示 し 、 β - カ ロ チ ン を生 産す る 。 な お、 制限酵素お よ び遺伝子操作 に用 い る 酵素 類 は、 宝酒造 （株） ま た は べ一 リ ン ガ ー · マ ン ハ イ ム社 か ら 購入 し た。
実施例 3 ： コ ス ミ ド ラ イ ブ ラ リ ー の作製お よ び橙色を呈 す る 大腸菌の 取得
A_g r 0 b a c t e r i u m a u r a n t i a c u s s p . n o v . M K 1 の染色体 DNA 25 β i に対 し て、 1 ュニ ッ ト の制限酵素 S a u 3 A I を用 い、 Πて、 15分間イ ン キ ュ ベ ー ト し た後、 68 °C、 10 分間の処理で制限酵素を失活 さ せ た。 こ の条件で、 40 k b 付近 に多 く の Sau3Al 部分分解断片が得 ら れた。 こ の —部を用 い て、 コ ス ミ ドベ ク タ ー ρΠ8 ( ア ン ピ シ リ ン 耐性 （ A ρ【 ） ：） を BamH I 消化後ァ ノレ カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ処理 し た も の 、 お よ び、 ρΠ8 を Sa i l / B amH I 消化後右ア ー ム （小 さ い方の 断片） を ゲルか ら 回収 し た も の を混ぜ、 irc、 一晚 ラ イ ゲ ー シ ヨ ン反応を行 っ た。 な お、 p J B 8 は以前 に ア マ一 シ ャ ム社か ら 購入 し た も の で め る 。
上記の ラ イ ゲー シ ヨ ン反応を行 っ た D N A を用 い、 ギガ パ ッ ク . ゴ ー ル ド （ ス ト ラ タ ジ ー ン 社製、 フ ナ コ シ販売） に よ り i n v i t r o パ ッ ケ ー ジ ン グを行い、 コ ス ミ ド ラ イ ブ ラ リ 一を作 る の に十分量の フ ァ ー ジ粒子を得た。
こ の フ ァ ー ジ粒子を大腸菌 （ E— s c h e r i e h i a c _o 1 i ) DH 1 ( ATCC 33849 ) 、 お よ び、 実施例 2 で作製 し た 3 種の プ ラ ス ミ ド の各々 を有す る 大腸菌 DH1 に感染 さ せ た後、 1 プ レ ー ト あ た り 100 - 300 コ ロ ニ ー に な る よ う に希釈 し 、 適当 な薬剤を含む LB ( 1 % ト リ プ ト ン、 0, 5 % ィ 一 ス ト エ キ ス、 1 % NaC 1 ) に プ レ ー テ ィ ン グ し 、 °C ま た は室温で、 一晩か ら 数 日 間培養 し た。
そ の結果、 た だの大腸菌 （ベ ー ジ ュ 色） お よ び p A C C R T-EB を有す る フ ィ ト ェ ン 産生大腸菌 （ベ ー ジ ュ 色） を 宿主 と し た コ ス ミ ド ラ イ ブ ラ リ ー で は、 各々 、 1 万 コ ロ ニ ー以上 ス ク リ ー ニ ン グ し たが、 色調が変化 し た も の は 得 ら れな か っ た。 一方、 pACCRT-Ε Ι Β を有す る リ コ ピ ン 産生大腸菌 （ う す い赤色） お よ び pACCAR A c r tXを有 す る /3 - カ ロ チ ン産生大腸菌 （黄色） を宿主 と し た コ ス ミ ド ラ イ ブ ラ リ ー で は、 各々 、 数百 コ ロ ニ ー に 1 株の割 合で、 橙色を呈す る コ ロ ニ ー が 出現 し た。 こ れ ら の 橙色 を呈す る 大腸菌形質転換株の ほ と ん ど は、 に 40 k b 前後の S au 3 A I 部分分解断片が挿入 さ れた プ ラ ス ミ ド を含ん で い た。 な お、 た だ の大腸菌お よ び p A C C R T - E B を有す る フ ィ ト ェ ン産生大腸菌を宿主 と し た コ ス ミ ド ラ ィ ブ ラ リ ー で は色調が変化 し た も の は得 ら れな か っ た こ と か ら 、 Ag r o ba c t e r i um au r a n t i a cu s s p. n o y . MK1染色 体 DNA か ら キ サ ン ト フ ィ ル合成遺伝子群を発現 ク ロ ー 二 ン グす る た め に は、 少な く と も フ ィ ト ェ ン よ り 後の カ ロ チ ノ ィ ド合成中間体を作 る 大腸菌を宿主 と し て用 い な け ればな ら な い こ と がわ か る 。
実施例 4 ： 橙色色素合成遺伝子群を含む断片の 縮小化
P ACCRT-E I B を有す る リ コ ピ ン産生大腸菌 DH1 ( う す い赤色） お よ び pACCAR16 A c r tXを有す る S - カ ロ チ ン 産生大腸菌 DH1 (黄色） を宿主 と し た コ ス ミ ド ラ イ ブ ラ リ ー で得 ら れた橙色の コ ロ ニ ー の 中か ら 、 各々 、 数十 コ ロ ニ ー を選んで、 そ の プ ラ ス ミ ドを分析 し た と こ ろ 、 1 株を 除 い てすベて、 ρ Π8 に 33 k か ら k b の S au 3 A I 部分分解断片が挿入 さ れた プ ラ ス ミ ドが含 ま れて い た。 残 り の 1 株 （ リ コ ピ ン 産生大腸菌を宿.主 と し た も の） に は、 p〗 B 8 に 3. 9 k b の S au 3 A I 部分分解断片が挿入 さ れた プ ラ ス ミ ド （ pAK9 と 命名） が含 ま れて い た。 こ れ は、 大腸菌 に感染後、 挿入断片の i n v i vo デ レ ー シ ヨ ン に よ り 形成 さ れた も の で あ る と 考え ら れた。 pAK9 を有す る リ コ ピ ン産生大腸菌 は、 そ の他の コ ス ミ ド ラ イ ブ ラ リ ー か ら 得 ら れた橙色 コ ロ ニ ー と 同一の 色素 （実施 例 6 に お い て ァ ス タ キ サ ン チ ン と 同定） を 合成す る こ と がで き た の で、 以後の解析 に は、 こ の p A K 9 を材料 と し て用 い た。
実施例 5 ： 橙色色素合成遺伝子群の塩基配列決定
PAK9か ら 調製 し た 3. b の E c oR I 挿入断片を大腸菌 ベ ク タ ー pB l u e s c r i p t 11 SK +の E c oR I 部位 に挿入 し て、 断片の方向性がべ ク タ 一 に対 し て互 い に逆の 2 種の ブ ラ ス ミ ド （ pAK91 お よ び pAK92 と 命名） を得た。 こ の う ち プ ラ ス ミ ド pAK92 の制限酵素地図を第 1 2 図 に示す。 pA K92 を リ コ ピ ン産生大腸菌 に導入 し た と こ ろ 、 ァ ス タ キ サ ン チ ン 合成 （実施例 6 ) に よ り 橙色 コ ロ ニ ー に な っ た が、 p A K 91 を リ コ ピ ン産生大腸菌 に導入 し て も 、 新た な 色素の 合成能 は与え ら れな か っ た。 し た力く つ て、 プ ラ ス ミ ド ρΑΚΠ に お け る 色素合成遣伝子群の方向性 は べ ク タ 一の 1 a c プ ロ モ ー タ ー の 向 き と 同 じ で あ る と 考え ら れた つ ぎに ρΑΚΠ の Ρ 8 t I 分解 に よ り 得 ら れ る 2. 7 k bの P s t I 断片 と 、 p A K 92 か ら B am H I 分解 に よ り 得 ら れ る 2. 9 k bの B amH I 断片お よ び S a 1 I 分解 に よ り 得 ら れ る 2. 3 ' k bと 1. 6 k bと の S a 1 I 断片 と を、 そ れぞれベ ク タ ー pB l u e s c r i p t I I SK -に ク ロ ー ニ ン グ し た。 こ れ に よ り 得 ら れ た プラ ス ミ ドの う ち 、 pAK94 、 p AK96 、 p AK98 、 pAK910 pAK93 、 p AK95 と 名付 け た プ ラ ス ミ ド の制限酵素地図を 第 1 2 図 に示す。 プ ラ ス ミ ド pAK94 、 p AK96 、 p AK98 、 ρΑΚΠ ϋは色素合成遣伝子群の 方向性がべ ク タ 一 の 1 a c プ 口 モ ー タ ー の 向 き と 同 じ で あ り 、 pAK93 、 p AK95 で は逆
^ め る
2. 9 kbの B amH I 断片を有す る プ ラ ス ミ ド pAK96 を リ コ ピ ン産生大腸菌 に導入 し て も 、 3. 9 k b E c oR I 断片を 有す る pAK92を導入 し た場合 と 同様 に、 そ の大腸菌形質 転換株 は ァ ス タ キ サ ン チ ン を 合成す る こ と がわ か つ た た め （実施例 6 ) 、 こ の 2. 9 k b B amH I断片の DNA 配列の 決 定を行 つ た。
DNA 配列の決定 は 2. 9 の B amH I 断片 に つ い て正逆 両方向 か ら の欠失変異体を作成 し 、 得 ら れた種々 の 長 さ の欠失を有す る ク ロ ー ン に つ い て行 っ た。 欠失変異体作 製 は 4 種の プ ラ ス ミ ド pAK96 、 p AK98 、 p AK 93 、 p AK 95 につ い て以下の手順で行 っ た。 そ れぞれの プラ ス ミ ド、 10 g を S a c I と Xb a I と で分解 し た後、 フ ヱ ノ ー ノレ Z ク ロ 口 ホ ル ム抽 出 を行い、 エ タ ノ ー ル沈殿に よ り DNA を 回収 し た。 そ れぞれの DNA を 100 I の Exo l l lバ ッ フ ァ 一 （ 50 mM T r i s -H C 1 , 100 mM N a C 1 , 5 mM Mg C 12, 10 mM
2 - メ ノレ カ プ ト エ タ ノ ー ル ， PH8. 0 ) に溶解 し 、 180 ュ ニ ッ ト の Ε Σ Ο Ι Ι Ιヌ ク レ ア ー ゼを加え て 37°C で保温 し た。
1 分 ご と に を サ ン プ リ ン グ し て、 2 サ ン プル分ず つ 、 U β I の MBノ 、 ッ フ ァ ー （ 40 iM Na一 A c e t a t e, 100 mM
Na , 2 m M Z n C 12 , 10 % グ リ セ ロ ー ノレ ， p H 4. 5 ) の 入 つ た氷上の チ ュ ー ブ に移 し た。 サ ン プ リ ン グ終了後、 得 ら れた 5 本の チ ュ ー ブを 65 °C、 10分間保温 し て酵素を失 活 さ せ た後、 5 ュニ ッ ト の マ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ア ー ゼを 加えて 37°Cで 30分間保温 し た。 反応後、 ァ ガ ロ ー ス ゲル 電気泳動 に よ り 、 1 つ の プ ラ ス ミ ド につ い て 5 種の そ れ ぞれ欠失の 程度が異な る DNA 断片を 回収 し た。 回収 し た DNA は K 1 e n G w f ra ment に よ り 末端を平滑化 し 、 16 °C、 —晚 ラ イ ゲ ー シ ヨ ン反応 し た後、 大腸菌 】Μ1(Η を形質転 換 し た。 得 ら れた種々 の ク ロ ー ン につ い てヘ ルパ ー フ ァ ー ジ Ml 3K07を用 い て.1 本鎖 DNA を調製 し 、 ア プ ラ イ ドバ ィ ォ シ ス テ ム （株） の 蛍光 プ ラ イ マ ー サ イ ク ノレ シ ー ク ェ ン ス キ ッ ト を用 い て シ ー ク ェ ン ス 反応を行 い 、 自 動 シ ー ク ェ ン サ ー を用 い て D N A 配列 を決定 し た。
そ の結果得 ら れた Π 86塩基対 （ bp) か ら な る D N A 配列 を第 5 〜 9 図 （配列番号 4 ) に示す。 開始 コ ド ン の前 に リ ボ ソ ー ム 結合部位が存在す る オ ー プ ン · リ ー デ ィ ン グ • フ レ ー ム の検索の結果、 3 種の キ サ ン ト フ ィ ル合成遺 伝子 e r tW、 c r t Z、 c r t Y の存在が予想 さ れた位置 （実施 例 8 ) に各 々 の タ ンノ、0 ク 質を コ ー ド し う る 3 つ の オ ー ブ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム （第 5 〜 9 図中 Α .か ら Β ( 配列 番号 4 の 塩基位置 〜 864) 、 C か ら ！） （ 塩基位置 864 〜 1349) 、 Ε か ら F ( 塩基位置 1349〜 25 Q 6) ) が見い だ さ れた。 こ の う ち Α か ら B 、 E か ら F の 2 つ の オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム に つ い て は そ れぞれ開始 コ ド ン は GT G で あ り 、 C か ら D につ い て は AT G で あ る 。 実施例 6 ： 橙色色素の 同定
p AK92 ま た は p A K 96 を リ コ ピ ン産生大腸菌 】 M 101 に導 入 し た も の （大腸菌 （pACCRT-E IB、 p AK92 ま た は pAK96) )
(橙色を呈 し て い る ） 、 ま た は、 PAK94 ま た は pAK96K
(第 1 2 図） を β - カ ロ チ ン 産生大腸菌 〗 M101 に導入 し た も の （大腸菌 （pACCARl 6 Δ c r tX, p AK9 ま た は pAK96K ) ) (橙色を呈 し て い る ） を 150 / g Z in lの ア ン ピ シ リ ン （ Ap、 明治製菓製） と 30 β I Z m lの ク ロ ラ ム フ ヱ 二 コ ー ル （ Cm、 三共製） を含む 2YT 培地 （ 1. 6 % ト リ プ ト ン 、 1 % イ ー ス ト エ キ ス 、 0. 5 % N a C 1 ) リ ッ ト ル で、 37 °C、 18時間培養 し た。 培養液か ら 集菌 し た菌体を、 600 ml の ア セ ト ン に よ り 抽 出 し た。 こ れを濃縮後、 40 0 m l の ク ロ 口 ホ ル ム / メ タ ノ ー ノレ （ 9 Z 1 ) で 2 回抽 出 し 、 濃縮乾固 し た。 さ ら に、 こ れを小量の ク ロ 口 ホ ル ム Z メ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) に 溶解後、 メ ル ク 社製の分取 用 シ リ カ ゲル T L C プ レ ー ト を用 い て、 ク ロ 口 ホ ル ム メ タ ノ 一ノレ （ 15Z 1 ) で展開す る こ と に よ り 、 薄層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ TLC ) を行 っ た。 元の橙色色素 は、 こ の TL C に よ り 、 R ί 値 0. 72 、 0. 82、 0. 91 の 3 ス ポ ッ ト に分かれた。 橙色色素全体の 50%に相当す る 、 最 も 濃い
R f 0. 1 の色素 と 、 次 に濃 い Ri 0. 82 の色素を、 TLC プ レ ー ト か ら 、 か き と り 後、 小量の ク ロ ロ ホ ゾレム Z メ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) ま た は メ タ ノ ー ルに溶解 し 、 セ フ ア デ ク ス LH-20 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ 15 X 300 mm ) に か け、 ク ロ 口 ホ ル ム / メ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) ま た は メ タ ノ ー ルで展開溶出す る こ と に よ り 、 各々 の 純品を、 3 mg ( ： R f 0. 12 ) 、 2 mg ( ： Rf 0. 82 ) 得 た。
R { 0. 72 の色素 は、 紫外 一可視 ス ぺ ク ト ノレ 、 1H- NMR、 FD-MS ス ぺ ク ト ノレ （ m / e 596 ) の 結果 よ り 、 ァ ス タ キ サ ン チ ン と 同一の平面構造を持つ も の で あ る こ と が明か に な っ た。 そ こ で、 ジ ェ チ ルエ ー テ ル ： 2 -プロ ノ、。 ノ ー ル エ タ ノ ー ル 5 ： 5 ： 2 に溶解 し 、 C Dス ぺ ク ト ノレを測定 し た と こ ろ 、 3S, 3' S の立体構造を と る こ と がわ か っ た た め、 本物質を ァ ス タ キ サ ン チ ン （ a s t axa n t h i n 、 構造 式 は第 1 1 図参照） と 同定 し た。 ま た、 R f 0. 82 の色素 は、 紫外 一 可視ス ぺ ク ト ノレ 、 1H-NMR、 FD-MS ス ぺ ク ト ル
( m / e 580 ) の結果 よ り 、 フ エ ニ コ キ サ ン チ ン （ pho e n i c 0 X a n t h i n 、 構造式 は第 1 1 図参照） と 同定 さ れた。 な お、 Ri 0. 91 の色素 は カ ン タ キ サ ン チ ン で あ っ た
(実施例 7 (2) ) 。
実施例 7 ： キ サ ン ト フ ィ ル中間代謝産物の 同定
( 1 ) 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン の 同定
ゼア キ サ ン チ ン産生大腸菌 は次の よ う に し て作製 さ れ た。 すな わ ち 、 E r . u r e d 0 γ 0 r a の 全力 口 チ ノ イ ド合成 遺伝子群を有す る プ ラ ス ミ ド P CAR25 ( Mi s awa, N. , Na k a g a w a , M. , K o b a y a s h i , K. , Y a m a n o , S . , I z a w a , Y. , N a k a m u r a , K. , H a r a s h i oi a K.， ' E l u c i da t i on o f t he E _r_w i _n i a _ u r e _d o v o r a c a r o t e n o i d b i o s yn t h e t i c p a t hway b y f unc t i ona l ana l y s i s o f g e n e p r odu c t s e xp r e s s e d i n E s ch e r i c h i a c o 1 i ' . J . B a c t e r i o 1. , 172, p . 670 - 6712, 1990、 お よ び、 本発明者 ら に よ る 特許出願特願平 3-5Π86 号公報 （特願平 号明細書） ： 「カ ロ チ ノ ィ ド の 合成 に有用 な DNA 鎖」 ） の制限酵素 B s t E I I 消 ィ匕、 K l enow f r a gmen t 処理、 ラ イ ゲー シ ヨ ン反応を行 う こ と に よ り 、 c r t 遺伝子を フ レ ー ム シ フ ト に よ り 失活 さ せ た後、 ゼ ア キ サ ン チ ン 産生 に必要な c r t E、 c r t Y、 1 jj_、 c r t B、 c r t Z 遺伝子を含む 6· 5 k b A s p 718 ( Kp n I ) 一 E c oR I 断片を切 り だ し た。 そ し て、 こ の 断片を大腸 菌ベ ク タ ー pACYC 4 の E c oRV部位 に挿入 し 、 目 的 と す る プ ラ ス ミ ド （ pACCAR25厶 c r tXと 命名） を得た。
p A K 910ま た は p A K 916 (第 1 2 図） を こ の ゼア キ サ ン チ ン産生大腸菌 〗 M1 に導入 し た も の （大腸菌 （pACCAR25 Δ c r t X p AK910ま た は pAK916) ) (橙色を呈 し て い る ） を 150 u g Z m lの Apと 30 β g / mlの Cmを含む 2YT 培 地 2 リ ツ ト ルで、 37 °C、 18時間培養 し た。 培養液か ら 集 菌 し た菌体 を 、 300 ml の ア セ ト ン に よ り 抽 出 し た。 こ れを濃縮後、 200 ml の ク ロ ロ ホ ゾレ ム / メ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) で 2 回抽 出 し 、 濃縮乾固 し た。 さ ら に、 こ れを小 量の ク ロ ロ ホ ソレ ム メ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) に溶解後、 メ ル ク 社製の 分取用 シ リ カ ゲル T L C プ レ ー ト を用 い て、 ク ロ ロ ホ ル ム Z メ タ ノ ー リレ （ 15Z 1 ) で展開す る こ と に よ り 、 薄層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ TLC ) を行 っ た。 元の橙 色色素は、 こ の T L C に よ り 、 Rf 値 0. 54 ( 46% ) 0. 72 ( 53 % ) 、 0. 91 ( 1 % ) の 3 ス ポ ッ ト に分かれた。
R f 0. 5 の色素を、 TLC プ レ ー ト か ら 、 か き と り 後、 小 童の ク ロ ロ ホ ノレ ム / メ タ ノ ー ノレ （ 9 1 ) ま た は メ タ ノ ー ル に溶解 し 、 セ フ ア デ ク ス LH- 20 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ 15 X 300 mm ) に か け 、 ク ロ 口 ホ ル ム / メ タ ノ 一ノレ （ 9 / 1 ) ま た は メ タ ノ 一ノレ で展開溶 出す る こ と に よ り 、 純品を 1. 5 mg 得 o
本物質 に お け る 紫外一可視ス ぺ ク ト ル、 FD-MS ス ぺ ク ト ル （ m ノ e 582 ) 、 お よ び、 シ リ カ ゲル T L C の移動度 ( ク ロ 口 ホ ル ム Zメ タ ノ ー ル （ 15/ 1 ) で展開） が、 4 — ケ ト ゼ ア キ サ ン チ ン の 標準品 、 Agrobac t e r i um aura nt i acus s p . n o v . MK丄 よ り 精製、 特願平 5 - 70335 ) と すべて一致 し た た め、 本物質を 4 ー ケ ト ゼア キ サ ン チ ン -k e t 02 e a i an t h i n - 造式 は第 1 1 図参照） と 同定 し た。 な お、 R ί 0. 72 お よ び Ri 0. 91 の色素 は そ れぞ れ、 ァ ス タ キ サ ン チ ン （実施例 6 ) 、 カ ン タ キ サ ン チ ン (実施例 7 (2) ) で あ る
( 2 ) カ ン タ キ サ ン チ ン の 同定
p A Κ Π 0ま た は p A K 916を β - カ ロ チ ン産生大腸菌 〗 M101 に導入 し た も の （大腸菌 (pACCARl 6厶 c r tX、 pAK910ま た は p A Κ Π 6 ) ) (橙色を呈 し て い る ） を 150 β g Z mlの Αρと 30 β % Zmlの Cmを含む 2 Y T 培地 2 リ ッ ト ル で、 37 °C、 18時間培養 し た。 培養液か ら 集菌 し た菌体を、 300 ml の ア セ ト ン に よ り 抽 出 し た。 こ れ を 濃縮後、 200 ml の ク ロ 口 ホ ル ム メ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) で 2 回抽 出 し 、 濃縮乾固 し た。 さ ら に 、 こ れ を 小量 の ク ロ 口 ホ ル ム メ 夕 ノ ー ル （ 9 / 1 ) に 溶解後、 メ ル ク 社製 の 分取用 シ リ 力 ゲ ル TLC プ レ ー ト を用 い て、 ク ロ 口 ホ ル ム Zメ タ ノ ー ル （ 50 1 ) で展開す る こ と に よ り 、 薄層 ク ロ マ ト ダ ラ フ ィ ー （ TLC ) を 行 っ た。 橙色色素全体 の %に 相 当 す る 最 も 濃 い 色素 を 、 TLC プ レ ー ト か ら 、 と き と つ た 。 さ ら に 小量の ク ロ 口 ホ ル ム / メ タ ノ ー ノレ （ 9 Z 1 ) ま た は ク ロ 口 ホ ル ム Zメ タ ノ ー ノレ （ 1/1 ) に 溶解後、 セ フ ア デ ク ス LH-20 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ 15 X 300 mm ) に か け 、 ク ロ ロ ホ ノレ ム Zメ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) ま た は ク ロ ロ ホ ル ム Zメ タ ノ ー ノレ （ 1/1 ) で展開溶 出 す る こ と に よ り 、 純品 を 3 m g 得 た。
本物質 に お け る 紫外一可視 ス ぺ ク ト ル 、 1H-NMR、 FD-M S ス ぺ ク ト ノレ （ m / e 564 ) 、 お よ び、 シ リ カ ゲ ル T L C の 移動度 （ ク ロ 口 ホ ル ム Zメ タ ノ ー ル （ 5GZ 1 ) で の 展 開 で R f 0. 53 ) が、 カ ン タ キ サ ン チ ン の 標準品 （ B A S F社製） と す べ て一致 し た た め 、 本物質を カ ン タ キ サ ン チ ン （ ca n t li a I a n t h i n 、 構造式 は 第 1 1 図参照） と 同定 し た。 ま た 、 最初 の 抽 出 物 に 見 ら れ た 橙色色素全体 の 6 % に 相 当 す る 色素 は 、 紫外一可視 ス ぺ ク ト ル、 シ リ カ ゲル TLC の 移動度 （ ク ロ 口 ホ ル ム Zメ タ ノ ー ル （ 50 1 ) で の 展開 で R ί 0. 78 ) 、 お よ び、 ノ ノ、 * ノ、。 ッ ク H R 6 β C 18 ( 3. 9 X 30 0 mi) ( ウ ォ ー タ ー ズ社製） を用 い た HPLCの移動度 （ァ セ ト ニ ト リ ル メ タ ノ ー ノレ 2 -プ ロ パ ノ ー ル （ 9GZ 6 Z 4 ) で l. Qml/ mi n の速度で の展開で RT16分） よ り ェキ ネ ノ ン （ e c h i n e n Q n e、 構造式 は第 1 1 図参照） で あ る と 考 り れた
( 3 ) ゼア キ サ ン チ ン の 同定
P AK96NK (第 1 2 図） を β - カ ロ チ ン産生大腸菌 〗 M10 1 に導入 し た も の （大腸菌 （pACCAR16 A cr tX、 p AK96NK) )
(黄色を呈 し て い る ） を 150 g Zmlの Apと 30 β g m 1の C mを含む 2 Y T 培地 2 リ ッ ト ル で 、 Π °C、 18時間培 養 し た。 培養液か ら 集菌 し た菌体を、 3QG ml の ァ セ ト ン に よ り 抽 出 し た。 こ れを濃縮後、 200 ml の ク ロ ロ ホ ル ム Zメ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) で 2 回抽出 し 、 濃縮乾固 し た。 さ ら に、 こ れを小量の ク ロ ロ ホ ノレム /メ タ ノ ー ル
( 9 / 1 ) に溶解後、 'メ ル ク 社製の 分取用 シ リ カ ゲル U C プ レ ー ト を用 い て、 ク ロ ロ ホ ノレ ム メ タ ノ ー ノレ （ 9 / 1 ) で展開す る こ と に よ り 、 薄層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー
( TLC ) を行 っ た。 黄色色素全体の Π%に相当 す る 最 も 濃 い色素を、 T L C プ レ ー ト か ら 、 か き と っ た。 さ ら に小 量の ク ロ 口 ホ ル ム メ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) ま た は メ タ ノ ー ル に溶解後、 セ フ ア デ ク ス LH-20 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ 15 X 300 mm ) に か け、 ク ロ 口 ホ ル ム / メ タ ノ 一ノレ （ 9 / 1 ) ま た は メ タ ノ ー ルで展開溶出す る こ と に よ り 、 純品を 3 m g得た。 一 5 本物質 に お け る 紫外 一 可視ス ぺ ク ト ル、 1H-NMR、 FD-M S ス ぺ ク ト ノレ （ m / e 568 ) 、 お よ び 、 シ リ カ ゲ ル U C の移動度 （ ク ロ 口 ホ ル ム Zメ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) で の展 開で Rf 0. 59) が、 ゼア キサ ン チ ン の標準品 （ BASF社製） と すべて一致 し た た め、 本物質 は ゼア キ サ ン チ ン と 同一 の平面構造を持つ も の であ る こ と が明か に な っ た。 そ こ で 、 ジ ェ チ ノレ エ ー テ ノレ ： 2 -プ ロ パ ノ ー ノレ ： エ タ ノ ー ル
5 ： 5 ： 2 に溶解 し 、 C Dス ペ ク ト ルを測定 し た と こ ろ 、 3R, 3' R の立体構造を と る こ と がわ か っ た た め、 本物質 を ゼ ア キ サ ン チ ン （ zea∑ant n、 構造式 は第 1 1 図参照） と 同定 し た。 ま た、 最初の 抽 出物 に見 ら れた黄色色素全 体の 13%に相当す る 色素は、 紫外 — 可視 ス ぺ ク ト ル、 シ リ カ ゲ ノレ TLC の移動度 （ ク ロ 口 ホ ル ム / メ タ ノ ー ノレ （ 9 Z 1 ) で の展開で R ί 0. 80 ) 、 お よ び、 ノ バパ ッ ク H R 6 β
C 18 ( 3. 9 X 300 mm) ( ウ ォ ー タ ー ズ社製） を用 い た HP LCの移動度 （ァ セ ト ニ ト リ ノレ Zメ タ ノ ー ル Z 2 -プ ロノ、0 ノ ー ル / 4 ) で l. QmlZ mi n の速度での展開で RT 19分 ） よ り yS - ク リ プ ト キ サ ン チ ン （ S -crypto∑anthin、 構造式 は第 1 1 図参照） で あ る と 考え ら れた。
( 4 ) β - カ ロ チ ン の 同定
ΡΑΚ98 を リ コ ピ ン産生大腸菌 】 M101 に導入 し た も の
(大腸菌 （pACCRT-ElB、 pAK98) ) (黄色を呈 し て い る ） を 150 ^ g Zmlの Apと 30 u g Z mlの Cmを含む 2YT 培 地 2 リ ッ ト ルで、 37 °C、 18時間培養 し た。 培養液か ら 集 菌 し た菌体を、 300 ml の ア セ ト ン に よ り 抽 出 し た。 こ れを濃縮後、 2 mlの へ キ サ ン に よ り 2 回抽出 し た。 さ ら に、 へキ サ ン層 を濃縮 し 、 シ リ カ ゲル カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ 15 X 300 im ) に か け、 へキ サ ン 酢酸ェ チ ノレ （ 50 1 ) で展開溶出す る こ と に よ り 、 純品を 3 mg 得た。
本物質 に お け る 紫外一可視ス ぺ ク ト ル、 FD-MS ス ぺ ク ト ル （ m / e 536 ) 、 お よ び、 ノ ノ パ ッ ク H R 6 β C 18 ( 3. 9 X 300 mm) ( ウ ォ ー タ ー ズ社製） を用 い た HPLCの 移動度 （ァ セ ト ニ ト リ ノレノ メ タ ノ ー ル / 2-プ ロ パ ノ ー ル ( 90/ 6 / 4 ) で Z mi n の速度で RT62分） が、 β - カ ロ チ ン の標準品 （オ ー ル ト ラ ン ス型、 シ グマ社製） と すべて一致 し た た め、 本物質を jS - カ ロ チ ン （ ；8 -car 0 t e n e 、 構造式 は第 1 1 図参照） と 同定 し た。
実施例 8 ： キ サ ン ト フ ィ ル合成遺伝子群の 同定
( 1 ) ケ ト 基導入酵素遺伝子の 同定
p AK9 (実施例 4 ) ま た は p A K 92 に含 ま れ る 3. 9 k bの 断 片の う ち 、 リ コ ピ ン か ら ァ ス タ キ サ ン チ ン の 合成 に必要 な すべての 遺伝子 は、 右側 の 2. 9 k b BamHl断片 ( pAK96 、 第 1 2 図） の 中 に含 ま れて い る こ と が実施例 6 の結果 よ り 明 かで あ る 。 し た が っ て、 左側 の 1. Q k b断片 は必要な い。 こ の pAK96 の 2. 9 k b BamHI断片の 中 に 1 ケ所の Nco I 部位 と 1 ケ所の Kpn I 部位が存在す る 。 こ の N c 0 I と Κρη I 部位の 間の 1. 4 k b断片 （ p A K N K ) に は水酸基導 入酵素活性が存在 し 、 ケ ト 基導入酵素活性が存在 し な い こ と が実施例 7 ( 3 ) の結果 よ り わ か る 。 ま た、 2. 9 k b B amH I断片の 中 に 1 ケ所存在 し 上記の N c o l と K p n I 部 位の 間 に あ る S a 1 I 部位 さ ら に は こ の S a 1 I 部位 よ り 左 の H i n c i I 部位か ら 2. 9 k b B amH l断片の 右側の 断片を除 い た断片 （ ρ ΑΚΠ Οお よ び P AK 916) に お い て も 、 β - カ ロ チ ン カヽ ら カ ン タ キ サ ン チ ン を 合成で き る が （実施例 7 ( 2 ) ) 、 ρ ΑΚ 96 の 2. 9 k b B am H I断片か ら H i n c I I 部位 よ り さ ら に左の c o I 部位か ら 右側の 断片を 除 い た断片 に お い て は yS - カ ロ チ ン か ら カ ン タ キ サ ン チ ン を合成す る 活性 は消失 し て い た。 一方、 P AK 916の 0. 9 k bの B amH l 一 H i n c 1 I 断片 に お い て、 そ の 中の左方 に 1 ケ 所存在す る B g 1 I I 部位か ら左側 の 断片を除 い て も 、 上記の BJ H I 一 H i n c I 1 断片 （ p A K 9 ) と 同様の 活性が存在 し た < し た 力く つ て、 p A K 916内の 0. 74 k b の B 1 1 1 一 H i n d i 断片の 中 に ^ - カ ロ チ ン を基質 と し て カ ン タ キ サ ン チ ン を 合成す る 酵素活性を有す る ケ ト 基導入酵素を コ ー ドす る 遺伝子が存在 し 、 こ の遺伝子の 中 に上記の c o I 部位 が存在 し て い る と 考え ら れ る 。 塩基配列決定の結果、 こ' の遺伝子に相当す る 、 開始 コ ド ン の 直前 に リ ボ ソ ー ム結 合部位を有す る 1 つ の オ ー プ ン · リ ー デ ィ ン グ · フ レ ー ム を検出す る こ と がで き た の で、 こ れを c r t W 遺伝子 と 命名 し た。 こ の c r t W 遣伝子の塩基配列 と コ ー ド さ れ る ポ リ ペ プチ ドの ア ミ ノ 酸配列 は第 1 図 （配列番号 1 ) に 示 さ れて い る 。
こ の Ag r o b a c t e r i um a u r a n t i a c u s s p . n o v . MK1の c r t W 遺伝子産物 （ C r tW) は、 β - ィ オ ノ ン 環 （ yS - i onon e r i n ) の 4 位の メ チ レ ン （ me t hy l en e ) 基を ケ ト （ k e t o) 基 に転換す る 酵素活性を有 し て お り 、 そ の具体的な 例の 1 つ が、 β - カ ロ チ ン （ S -c a r o t en e ) を基質 と し てェ キ ネ ノ ン （ e c h i ne non e) を経て カ ン タ キサ ン チ ン （ c an t haxan t h i n ) を合成す る 酵素活性で あ る （実施例 7 ( 2 ) 、 第 1 1 図参照） 。 さ ら に、 c r tWjg伝子産物 は、 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ オ ノ ン環 （ 3- hy d r oxy- yS - i onoii e r i n g ) の 4 位の メ チ レ ン （ me t hy l en e ) 基を ケ ト （ k e t o) 基 に転換す る 酵素活性 も 有 し て お り 、 そ の 具体的な 例 の 1 つ が、 ゼア キ サ ン チ ン （ z e a∑ an t ii) を基質 と し て 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン （ 4-k e t。 z e a∑ aii tli i n) を経て ァ ス タ キ サ ン チ ン （ a s t ax'a n t h i n ) を合成す る 酵素活性で あ る （実施例 7 ( 1 ) 、 第 1 1 図参照） 。 な お、 こ の よ う な酵素活性を有す る ポ リ べ プチ ド お よ び こ れを コ ー ドす る DNA 鎖 は、 従来知 ら れて い な か つ た も の で あ り 、 こ の ポ リ ぺ プチ ド ま た は こ れを コ ー ドす る D N A 鎖 は、 現在ま で に知 ら れて い る どの よ う な ポ リ べ プチ ド ま た は D N A 鎖 と も 全体的 な ホ モ ロ ジ 一 は有 し て い な い。 ま た、 ィ オ ノ ン環や 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ オ ノ ン環 に 限 ら ず、 1 つ の酵素が メ チ レ ン基を い き な り ケ ト 基に変換す る と い う 知見 は 今 ま で無か っ た も の で あ る 。 ( 2 ) 水酸基導入酵素遺伝子の 同定
p AK96 の 2. 9 k b BamHl断片の 中 に 1 ケ所の Sa i l 部位 が存在す る 。 こ の S a 1 I 部位で 2. 9 k b Bam HI 断片を 2 つ の 断片 に切断 し て切 り 出す と 、 2 つ の 断片 （ pAK910と PAK98 ) と も に、 水酸基導入酵素活性 は無 く な っ て し ま う 。 すな わ ち 、 左側の 断片 （ ρΑΚΠΟ) に は ケ ト 基導入酵 素活性 し か存在 し な く （実施例 7 ( 2 ) ) 、 右側の 断片 ( ρ ΑΚ98 ) に は リ コ ピ ン環化酵素活性 し か存在 し な い (実施例 7 ( 4 ) ) 。 一方、 上記の Sa l I 部位を含む 1. 4 の N c 1 一 K p n I 断片 （ pAK96NK ) を β - カ ロ チ ン 産生大腸菌 に導入す る と 、 S - ク リ プ ト キ サ ン チ ン を経 て、 ゼア キ サ ン チ ン を合成す る よ う に な る （実施例 7
( 3 ) ) 0 し た 力く つ て、 こ の 1. 4 の Nco l — K p n I 断 片の 中 に yS - カ ロ チ ン を基質 と し てゼア キ サ ン チ ン を 合 成す る 酵素活性を有する 水酸基導入酵素を コ ー ドす る 遺 伝子が存在 し 、 こ の遺伝子の 中 に上記の S a 1 I 部位が存 在 し て い る と 考え ら れ る 。 塩基配列決定 の結果、 こ の遺 伝子 に相 当 す る 、 開始 コ ド ン の 直前 に リ ボ ソ ー ム結合部 位を有す る 1 つ の オ ー プ ン · リ ー デ ィ ン グ '· フ レ ー ム を 検出す る こ と がで き た の で、 こ れを c r t Z 遗伝子 と 命名 し た。 こ の c r t Z 遺伝子の塩基配列 と コ ー ド さ れ る ポ リ ペ プチ ドの ア ミ ノ 酸配列 は第 2 図 （配列番号 2 ) に 示 さ れて い る 。
こ の Agrobact e r ium a u r a n t i a c u s s . n o v . K 1 © _ c r t ^_遺伝子産物 （ C r t Z) は、 β - ィ オ ノ ン環 （ yS - i on on e r i ng) の 3 位の炭素 に 1 つ の 水酸基を付加す る 酵素活性 を有 し てお り 、 そ の具体的 な例 の 1 つ が、 ；3 - カ ロ チ ン ( β -c a r o t en e ) を基質 と し て ；3 - ク リ プ ト キ サ ン チ ン ( β - c ryp t ox an t li i n) を経て ゼア キ サ ン チ ン （ z e axan t h i n) を合成す る 酵素活性で あ る （実施例 7 ( 3 ) 、 第 1 1 図参照） 。 さ ら に、 m 遺伝子産物 は、 4 - ケ ト - β - ィ オ ノ ン環 ( - k e t 0 - β - i ο η ο η e r i n ) の 3 位の炭素 に 1 つ の水酸基を付加す る 酵素活性 も 有 し て お り 、 そ の 具体的な例 の 1 つ が、 カ ン タ キ サ ン チ ン （ c a n t iia xa n t h i n ) を基質 と し て フ ヱ ニ コ キサ ン チ ン （ plio e ii i c o xa n t h i n ) を経て ァ ス タ キ サ ン チ ン （ a s i a∑an t li i n ) を 合成す る 酵素活性で あ る （実施例 6 、 第 1 1 図参照） 。 な お、 後者の酵素活性を有す る ポ リ べ プチ ドお よ び こ れを コ ー ドす る D N A 鎖 は、 従来知 ら れて い な か っ た も の で あ る 。 ま た、 A g r Q b _a c t e r i u m の C r t Z は、 ア ミ ノ 酸配列 レ ベル で、 E r w i n i a u r e d o τ o r a の C r t 2 と 57% の ア イ デ ン テ ィ テ ィ 一 と い う 意義深 い ホ モ ロ ジ一を示 し た。
( 3 ) リ コ ピ ン環化酵素遺伝子の 同定
p AK96 に お い て 2. 9 k b B amHI断片内 の右方 に あ る Kp n l 部位か ら 右側の 断片を 除 い た断片 （ pAK K) 、 さ ら に は こ の Kpn l 部位 よ り 右 に あ る P s t I 部位か ら 右側 の 断片 を 除 い た断片 （ p A K 94 ) に お い て は、 β - カ ロ チ ン か ら ァ ス タ キサ ン チ ン は合成で き る が （実施例 6 ) 、 リ コ ピ ン か ら は ァ ス タ キ サ ン チ ン を合成す る こ と は で き な く な る 。 一方、 2. 9 kb B amH I断片の 中 に 1 ケ所存在 し 上記の Kpn I 部位 よ り 左に存在す る S a 1 I 部位か ら 右側 の 断片 を含む 1. 6 k b S a 1 I 断片 （ pAK98 ) を リ コ ピ ン 産生大腸 菌 に導入す る と 、 iS _ カ ロ チ ン を合成す る よ う に な る (実施例 7 ( 4 ) ) 。 し たが っ て、 こ の 1. 6 k b S a 1 I 断 片の 中 に リ コ ピ ン を基質 と し て S - カ ロ チ ン を 合成す る 酵素活性を有す る リ コ ピ ン環化酵素を コ ー ドす る 遺伝子 が存在 し 、 こ の遺伝子 は、 上記の Kpn I と P s t 1 部位 に ま た が っ て存在 し て い る と 考え ら れ る 。 塩基配列決定の 結果、 こ の遺伝子 に相当す る 、 開始 コ ド ン の 直前 に リ ボ ソ ー ム結合部位を有す る 1 つ の オ ー プ ン · リ ー デ ィ ン グ • フ レ ー ム を検出す る こ と がで き た の で、 こ れ を t Y 遣伝子 と 命名 し た。 こ の c r t Y 遺伝子の塩基配列 と コ ー ド さ れ る ポ リ ペ プチ ド の ア ミ ノ 酸配列 は第 3 〜 4 図 （配 列番号 3 ) に示 さ れて い る 。
な お、 こ の Ag r o b a c t e r i um a u r a n t i a_c u s_s p. n o v . M K 1 の c r t Y 遺伝子産物 （ C M Y ) は、 ア ミ ノ 酸配列 レ べ ノレ で、 E r w i n i a u r e d_o_v o r a の C r t Y と 44. 3% の ア イ デ ン テ ィ テ ィ ー と い う 意義深 い ホ モ ロ ジ一を有 し て お り 、 酵 素の機能 も 両者で同一で あ る 。
実施例 9 ： 他の 海洋細菌の 染色体 DNA と の サザ ン分析 他の海洋微生物の染色体上に単離 し た c r tWと c r t Zと 相 同性を示す領域が得 ら れ る か否かを検討 し た。 実施例 1 で調製 し た Al ca l i ge n e s s p . PC-1と Al t e romona s sp. S D -402の染色体 0? を制限酵素 B a m H 1 お よ び P s t I で消 化 し、 ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動法で分離 し た。 全ての分 離 し た DNA 断片を 0. 5 N NaOH、 1. 5 M NaClの ア ル カ リ 溶 液で変性 し た後、 一晚か け てナ イ ロ ン メ ン プ レ ン に ト ラ ン ス フ ァ ー さ せ た 。 DNA が吸着 し た ナ イ ロ ン メ ン ブ レ ン をハ イ ブ リ ダ ィ ゼー シ ヨ ン溶液 （ 6∑ D e n h a r d t、 51 S S C 、 100 β g/m 1 s s DNA) に浸 し 、 2 時間、 60 °Cで プ レ ハ イ ブ リ ダィ ゼ ー シ ヨ ン を行な っ た。 次 に、 p A K 96 Kカヽ ら B a 1 I で切 り 出 し た c r t Wと c r t Zを含む 1. 5 kbの DNA 断片を Mega p r i m e T M DNA l a e l l in sys t ems 、ア マ シ ャ ム ) と [a-3 2P] dCTP (〜 110TBq/mmo l) と を用 い て標識化 し 、 上記の プ レ ハ イ ブ リ ダ ィ ゼー シ ヨ ン溶液に加え て 16時間、 6 Q °Cで ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン を行 っ た。
ノヽイ ブ リ ダ ィ ゼー シ ヨ ン後、 2∑ S S C 、 0. \% S D Sで 60。C - 1 時間洗浄 し オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ 一 に よ つ て相 同性を 示す シ グナ ルを検出 し た結果、 A 1 c a 1 i g e n e s s p. P C - 1で は B amH I 消化物で約 13 k b 、 P s t I 消化物で 2. Π k b の 位置 に強 い シ グナ ルが得 ら れ、 Al t e r 0 m 0. n a s s p . S D- 4 02で は B a m HI 消化物で約 5. 6 kb、 P s t 1 消化物で 20 k b 以上の 位置 に 強い シ グナ ルが得 ら れた。
実施例 1 0 ： 他の海洋細菌よ り の キ サ ン ト フ ィ ル合成遺 伝子群の取得
実施例 9 の 結果 よ り 、 A 1 c a 1 i g e n e s s p. P C - 1の 染色体 DN A の P s t I 消ィ匕物で、 2. 35 k b 付近 に A g r o b a c t e r i u m a u r a n t i a c u s s p. no v. MK1の c r tWと c r t Z遺伝子を含む DN A 断片 と ハ イ ブ リ ダィ ズす る 領域が存在す る こ と がわ か つ た の で、 A 1 c a 1 i g e n e s の染色体 D N A を— P s t I で消化 し た後、 2 〜 3. 5k b の サ イ ズの DNA 断片を ァ ガ ロ ー ス ゲル 電気泳動法に よ り 回収 し た。 回収 し た DNA 断片をべ ク タ - p B 1 u e s c r i p t I I SK +の P s t I 部位 に T 4 D N Aリ ガ ー ゼを 用 い て挿入 し 、 大腸菌 DH5 に導入 し て、 A 1 c a 1 i g e n e s の 部分 ラ イ ブ ラ リ ー を作製 し た。 こ の 部分ラ イ ブ ラ リ ー を、 A g r 0 b a c t e r i u m の c r t Wと r t Z遺伝子を含む 1. 5k b の DNA 断片を プ ロ ー ブ と し た コ ロ ニ ー ハ イ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン に供 し た結果、 約 50 Q Qコ ロ ニ ー か ら ポ ジ テ ィ ブな コ ロ ニ ー を 1 つ単離 し た。 な お、 コ ロ ニ ー ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ヨ ン の条件 は、 実施例 9 に示 し た サザ ン分析法 と 同' 条件で行 っ た。 続 い て、 得 ら れた コ ロ ニ ー か ら プ ラ ス ミ ド D N A を単離 し 、 P s t I で消化 し て、 組込ま れた D N A 断 片の サ イ ズを調べ た と こ ろ 、 プ ラ ス ミ ド 中 に は 3 つ の異 な る 断片が含ま れて い る こ と がわ か っ た。 そ こ で、 3 つ の異な る DNA 断片の 中か ら 実施例 9 に 示 し たサザ ン 分析 法でハ イ ブ リ ダィ ズす る 2. 35 kb 断片 1 つ を特定 し 、 ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動法を用 い て こ の 2. 35 k b _P_s t I 断 片を 回収 し 、 再度 pB l u e s e r i p t I I SK +の P s t I 部位 に挿 入 し て、 プ ラ ス ミ ド pPCl l 、 pPC12 を作製 し た。 pPCl l t p P C 12 に お い て は、 上記 2 · 35 k b _P s t I 断片が p B 1 u e s c r i p t I I S K +の P s t I 部位 に互 い に逆向 き に挿入 さ れた も の であ る 。 pPCl l の制限酵素地図を第 1 9 図 に示す。 実施例 1 1 ： A l c a l i g e n e s キ サ ン ト フ ィ ル合成遺伝子群 の塩基配列決定
pPCl l 及び p PC を β - カ ロ チ ン産生大腸菌 に導入 し た と こ ろ 、 前者 は ァ ス タ キ サ ン チ ン等の 合成 （実施例 1 2 ) に よ り 橙色 コ ロ ニ ー に な っ たが、 後者 は新た な 色素 の 合成能を与え な か っ た。 し た が っ て、 プ ラ ス ミ ド p P C 1 1 に お け る ァ ス タ キ サ ン チ ン 合成遺伝子群の 方向 は べ ク タ ー l a e プ ロ モ ー タ ー の 向 き と 同 じ であ る と 考え ら れた。 ま た、 pPC l l を リ コ ピ ン産生大腸菌 に導入 し て も 、 新た な 色素 は産生 さ れな か っ た の で、 p P C 11 に は リ コ ピ ン環 化酵素遺伝子 は含 ま れて い な い こ と がわか っ た。
p P C 11 の 挿入断片の う ち 右側 の 0. Π k b B s t E I I - E c o RV断片を脱落 さ せ た プ ラ ス ミ ド （ P PC17 と 命名、 第 1 9 図） を β - カ ロ チ ン産生大腸菌 に導入 し て も 、 pP C l l を 導入 し た場合 と 同様 に、 そ の 大腸菌形質転換体 は ス タ キ サ ン チ ン 等を 合成す る こ と がわ か っ た た め （実施例 1 2 ) 、 こ の p P C 17 に お け る 1. Π k b P s t卜— B s丄 E l l 断片の塩 基配列 の決定を行 つ た。
欠失変異体作製 は ΡΡΠ 7 と pPC を用 い て、 以下の手 順で行 っ た。 p P C 17 ま た は p P C 12 、 そ れぞれ 10 g を _ p n I と H i n d 1 I 1ま た は K p n 1 と E c o R 1と で分解 し た後、 フ ヱ ノ ー ルノ ク ロ ロ ホ ゾレ ム抽 出 を行い、 エ タ ノ ー ル沈殿 に よ り DNA を 回収 し た。 そ れぞれの DNA を 100 ； z l の Ex o l l lバ ッ フ ァ ー （ 50 mM T r i s -H C 1 , 100 mM N a C 1 , 5 mM Mg C 12, 10 mM 2 - メ ノレ カ プ ト エ タ ノ ー ノレ ， pH8. 0 ) に溶 解 し 、 Q ュニ ッ ト の Ε Σ Ο Ι Ι Ιヌ ク レ ア ー ゼを加え て 37°C で保温 し た。 1 分 ご と に 10 1 を サ ン プ リ ン グ し て、 2 サ ン プ ル分ずつ 、 の MB フ ァ ー （ 40 mM Ν a -A c e t a t e, 100 mM N a C 1 , 2 mM Z n C 12, 10 ¾! グ リ セ ロ ー ル， H'4. 5 ) の 入 っ た氷上の チ ュ ー ブ に移 し た。 サ ン プ リ ン グ終了後、 得 ら れ た 5 本の チ ュ ー ブを 65て、 10分間保温 し て酵素を失活 さ せ た後、 5 ュニ ッ ト の マ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ア ー ゼを加え て Π °C で 3 Q分間保温 し た。 反応後、 ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動 に よ り 、 1 つ の プ ラ ス ミ ド に つ い て 10種の そ れぞれ欠失の程度が異な る DNA 断片を 回収 し た。 回収 し た DNA は K l enow f r a men t に よ り 末端を平滑 化 し 、 1 C、 一晚 ラ イ ゲー シ ヨ ン反応 し た後、 大腸菌 J M 109 を形質転換 し た。 得 ら れた種々 の ク ロ ー ン につ い て ヘ ルパ ー フ ァ 一 ジ M 13 K 07を用 い て 1 本鑌 D N A を調製 し 、 ア プ ラ イ ィ ォ シ ス テ ム （株） の蛍光プ ラ イ マ ー サ イ ク ノレ シ ー ク ェ ン ス キ ッ ト を用 い て シ ー ク ェ ン ス反応を行 い、 自 動 シ ー ク ェ ン サ一を用 い て DNA 配列 を決定 し た。
そ の結果得 ら れた 1631塩基対 （ bp) か ら な る D N A 配列 を第 1 6 〜 1 8 図 （配列番号 7 ) に示す。 開始 コ ド ン の 前 に リ ボ ソ ー ム 結合部位が存在す る オ ー プ ン · リ ー デ ィ ン グ · フ レ ー ム の検索の結果、 2 種の キ サ ン ト フ ィ ル合 成遺伝子 11、 c r t Zの存在が予想 さ れた位置 (実施例 1 3 ) に各々 の タ ン パ ク 質を コ ー ド し う る 2 つ の オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム （第 1 6 〜 1 8 図中 A か ら B ( 配 列番号 7 の塩基位置 99〜 Π4)、 C か ら D ( 塩基位置 824 〜 13 Q 9 ) が見出 さ れた。
実施例 1 2 ： A 1 c a 1 i g e n e s キ サ ン ト フ ィ ル合成遺伝子 群を有す る 大腸菌が生産す る 色素の 同定
( 1 ) ァ ス タ キ サ ン チ ン 、 4 - ケ ト ゼ ア キ サ ン チ ン の 同 定
実施例 1 1 で作製 し た PPC17 の デ レ ー シ ヨ ン プ ラ ス ミ ド の う ち 、 右側 の B s t E I I 末端か ら 第 1 7 図の塩基番号 11 62 (配列番号 7 の塩基位置 1162) ま で欠失 し た デ レ ー ン ヨ ン プ ラ ス ミ ド （mlの み を有す る ） を PPC17- 3 (第 1 9 図） と 名付 け た。
こ の pPCn- 3' を ゼア キ サ ン チ ン産生大腸菌 IM101 (実 施例 7 (1) ) に導入 し た も の （大腸菌 （pACCAR25 A er tX pPCn-3) ) (橙色を呈 し て い る ） を 150 β I Z mlの Αρ と 3 G β g m Iの C mを含む 2 Y T 培地 2 リ ッ ト ル で、 Π °C 時間培養 し た。 培養液か ら 集菌 し た菌体を、 300 ml の ア セ ト ン に よ り 抽出 し た。 こ れを濃縮後、 20β ml の ク ロ 口 ホ ル ム Zメ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) で 2 回抽 出 し 、 濃 縮乾固 し た。 さ ら に、 こ れを小量の ク ロ 口 ホ ル ム Zメ タ ノ ー ル （ 9 ノ 1 ) に溶解後、 メ ル ク 社製の分取用 シ リ カ ゲル TLC プ レ ー ト を用 い て、 ク ロ ロ ホ ノレ ム メ タ ノ ー ル ( 15X 1 ) で展開す る こ と に よ り 、 薄層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ TLC ) を 行 っ た 。 元 の 橙色色素 は 、 こ の TLC に よ り 、 Ri 値 G. 54 (約 25% ) 、 0. 72 (約 30% ) 、 0. 91 (約 25% ) の 3 ス ポ ッ ト に 分かれ た 。 Ri 値 Q. 54 と 0. 72 の 色素 を 、 TLC プ レ ー ト か ら 、 か き と り 後、 小量 の ク ロ ロ ホ ノレ ム / メ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) ま た は メ タ ノ ー ル に 溶解 し 、 セ フ ア デ ク ス LH-20 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ 15 X 300 11 ) に か け 、 ク ロ ロ ホ ノレ ム / メ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) ま た は メ タ ノ ー ル で展開溶 出 す る こ と に よ り 、 各 々 の 純品 を約 1 m gづっ 得 た 。
こ れ ら の 物質 に お け る 紫外 一 可視 ス ぺ ク ト ル、 FD-MS ス ぺ ク ト ル、 お よ び、 シ リ カ ゲ ル T L C の 移動度 （ ク ロ 口 ホ ル ム Zメ タ ノ ー ル （ 15 Z 1 ) で展開） が、 4 — ケ ト ゼ ア キ サ ン チ ン 、 及 び、 ァ ス タ キ サ ン チ ン の 標準品 （実施 例 6 、 7 (1) ) と すべて一致 し た た め 、 こ れ ら の 物質を 4 一 ケ ト ゼ ア キ サ ン チ ン （ Ri 0. 54) 、 及 び、 ァ ス タ キ サ ン チ ン （ Ri 0. 72) と 同定 し た 。 な お、 Ri 値 G. 91 の色素 は カ ン タ キ サ ン チ ン で あ っ た （実施例 12 (2) ) 。
ま た 、 pPCl l ま た は PPC17 を β - カ ロ チ ン 産生大腸菌 JM101 に 導入 し た も の （大腸菌 （pACCAR16A cr tX、 pPCl 1 ま た は pPC17) ) (橙色 を呈 し て い る ） も ァ ス タ キ サ ン チ ン 、 4 一 ケ ト ゼ ア キ サ ン チ ン 及 び カ ン タ キ サ ン チ ン を 産生す る こ と が 同様の 分析 に よ り 確認 さ れ た。 さ ら に 、 こ れ ら は 、 微量 の フ ヱ ニ コ キ サ ン チ ン を生産す る こ と が 実施例 6 で得 ら れ た 標 品 を 用 い て確認 さ れ た 。
( 2 ) カ ン タ キ サ ン チ ン の 同定
pPCU-3 を β - カ ロ チ ン 産生大腸菌 IM1Q1 に 導入 し た も の （大腸菌 （pACCARl 6 Δ c r tX、 pPCH-3) ) (橙色 を 呈 し て い る ） を 150 β g Z m lの Apと 30 β g Z m 1の C mを 含む 2 Y T 培地 2 リ ツ ト ルで、 Π °C、 時間培養 し た。 培 養液か ら 集菌 し た 菌体 を 、 3DQ m l の ア セ ト ン に よ り 抽 出 し た 。 こ れ を濃縮後、 200 ml の ク ロ 口 ホ ル ム メ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) で 2 回抽 出 し 、 濃縮乾固 し た 。 さ ら に こ れを 小量 の ク ロ ロ ホ ノレ ム Z メ タ ノ ー ル （ 9 Z 1 ) に 溶 解後、 メ ソレ ク 社製 の 分取用 シ リ カ ゲル TLC プ レ ー ト を 用 い て、 ク ロ 口 ホ ル ム ズ メ タ ノ ー ル （ 50Z 1 ) で展開す る こ と に よ り 、 薄層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ TLC ) を行 っ た 橙色色素全体 の 40% に 相 当 す る 最 も 濃 い色素を 、 TLC プ レ ー ト か ら 、 か き と っ た 。 さ ら に 小量の ク ロ ロ ホ ル ム Z メ タ ノ ー ノレ （ 9 / 1 ) ま た は ク ロ 口 ホ ル ム Z メ タ ノ ー ル (1/1) に 溶解後、 セ フ ア デ ク ス -20 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ 15 X 300 mm ) に 力、 け 、 ク ロ ロ ホ ノレ ム / メ タ ノ ー ノレ （ 9 / 1 ) ま た は ク ロ ロ ホ ノレ ム Z メ タ ノ ー ル （ 1 / 1 で展開溶 出 す る こ と に よ り 、 純品 を 2 m g 得 た 。
本物質 に お け る 紫外一可視 ス ぺ ク ト ル、 FD-MS ス ぺ ク ト ル （ m / e 564 ) 、 お よ び、 シ リ カ ゲル T L C の 移動度
( ク ロ 口 ホ ル ム Z メ タ ノ ー ノレ （ 50 1 ) で展開） が、 力 ン タ キ サ ン チ ン の 標準品 （ BASF社製） と すべ て 一致 し た た め 、 本物質を カ ン タ キ サ ン チ ン と 同定 し た。 ま た、 最 初の 抽出物 に見 ら れた橙色色素全体の 50% に相当す る 色 素 は、 紫外一可視ス ぺ ク ト ル、 シ リ カ ゲル TLC の移動度
( ク ロ 口 ホ ル ム Zメ タ ノ ー ノレ （ 50 Z 1 ) で展開） 、 お よ び、 ノ ノ ノ、。 ッ ク H R 6 β C 18 ( 3. 9 X 300 mm) ( ウ ォ ー 夕 ー ズ社製） を用 い た HPLCの 移動度 （ ァ セ ト ニ ト リ ル メ 夕 ノ ー ルノ 2 -プ ロ パ ノ ー ル （ 90Z 6 Z 4 ) で展開） （実 施例 7 ( 2 ) 参照） よ り ェ キ ネ ノ ン で あ る と 考え ら れた な お、 抽 出 さ れた色素の残 り の 10% は未反応の S - カ ロ チ ン で あ っ た 。
( 3 ) ゼア キ サ ン チ ン の 同定
p P C 11 に お け る 1. 15 k b S a 1 I 断片を pPCU と 同 じ方 向 に pB l u e s c r i p t I I SK +の Sa i l部位 に挿入 し た プ ラ ス ミ ド （ pPC と 命名、 第 1 9 図参照） を作製 し た。
こ の pPCU を β - カ ロ チ ン 産生大腸菌 】 M101 に導入 し た も の （大腸菌 （pACCAR n A " tX、 pPCl 3) ) (黄色を呈 し て い る ） を 150 g Z mlの Apと 30 β g m lの Cmを 含む 2 Y T 培地 2 リ ッ ト ルで、 Π °C、 18時間培養 し た。 培 養液か ら 集菌 し た菌体を、 300 ml の ア セ ト ン に よ り 抽 出 し た。 こ れを濃縮後、 200 ml の ク ロ ロ ホ ノレ ム Zメ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) で 2 回抽出 し 、 濃縮乾固 し た。 さ ら に . こ れを小量の ク ロ 口 ホ ル ム ノ メ タ ノ ー ノレ （ 9 / 1 ) に溶 解後、 メ ル ク 社製の分取用 シ リ カ ゲル TLC プ レ ー ト を用 い て、 ク ロ ロ ホ ノレムノ メ タ ノ ー ル （ 9 / 1 ) で展開す る こ と に よ り 、 薄層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ UC ) を行 っ た 黄色色素全体の 90% に相 当す る 最 も 濃 い 色素を、 TLC プ レ ー ト 力、 ら 、 力、 き と っ た。 さ ら に小童の ク ロ ロ ホ ル ム
Zメ タ ノ ー ゾレ （ 9 1 ) ま た は メ タ ノ ー ル に溶解後、 セ フ ァ デ ク ス LH-20 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ 15 X 300 mm ) に か け、 ク ロ 口 ホ ル ム Zメ タ ノ ー ノレ （ 9 Z 1 ) ま た は メ タ ノ ー ルで展開溶出す る こ と に よ り 、 純品を 3 m g 得た。
本物質 に お け る 紫外一可視ス ぺ ク ト ノレ 、 FD-MS ス ぺ ク ト ル （ m / e 568 ) 、 お よ び、 シ リ カ ゲル T L C の移動度
( ク α π ホ ル ム Zメ タ ノ ー ル ( 9 Z 1 ) で展開） が、 ゼ ア キ サ ン チ ン の 標準品 （実施例 7 (3) ) と すべて一致 し た た め、 本物質を ゼア キ サ ン チ ン と 同定 し た。 ま た、 最 初の抽 出物 に見 ら れた黄色色素全体の 10%に相 当す る 色 素 は、 紫外 一 可視ス ぺ ク ト ル、 シ リ カ ゲル T L C の移動度
( ク ο ο ホ ゾレ ム Zメ タ ノ ー ル ( 9 Z 1 ) で展開） 、 お よ び、 ノ バ パ ッ ク HR 6 C18 ( 3. 9 X 300 mm) ( ウ ォ ー 夕 一 ズ社製 ) を用 い た HPL Cの移動度 （ ァ セ ト ニ ト リ ル Zメ 夕 ソ ー ル Z 2-プ ロ ノ、0 ノ ー ノレ （ 90Z 6 ノ 4 ) で展開） （実 施例 7 ( 3 ) 参照） ） よ り - ク リ プ ト キ サ ン チ ン で あ る と 考え ら れた
実施例 1 3 ： A 1 c a 1 i g e n e s キ サ ン ト フ ィ ノレ合成遺伝子群 の 同定
( 1 ) ケ ト 基導入酵素遺伝子の 同定 p P C 11 に含 ま れ る 2. 35 k b の P s t I 断片の う ち 、 β - カ ロ チ ン か ら ァ ス タ キサ ン チ ン の 合成 に必要な すべての 遣伝子 は、 左側の 1. kb Ps t I- B s t E I 1 断片 （ pPC17 第 1 9 図） の 中 に含 ま れて い る こ と が実施例 1 1 及び 1 2 ( 1 ) の結果 よ り 明かであ る 。 し たが っ て、 右側 の 0. 7
2 k b B s t E I I - P s t I 断片 は.必要な い。 こ の pPC17 の 1. 6
3 kb P s t I - B s t E I 1 断片の 中 に 1 ケ所の Sma l 部位 と 1 ケ所の S a 1 I 部位が存在す る （第 1 9 図） 。 こ の Sia I お よ び S a 1 I 部位の左の 0. 65 kb お よ び Q. 69 kb の 断片 を取 り 除 く と 、 いずれ も ケ ト 基導入酵素活性が無 く な る こ と は、 こ れ ら の デ レ ー シ ヨ ン プ ラ ス ミ ドを S - カ ロ チ ン産生大腸菌 に導入 し た も の を用 い た色素分析 に よ り 確 認 し た。 ま た、 1. Π k b P s t I - B s t E I I 断片の左側の 0 . 69 kb P s t I - Sa i l 断片を p B 1 u e s c r i p t SK+ の P s t I - S ll 部位 に 挿入 し た プラ ス ミ ド は ケ ト 基導入酵素活性を 持た な い こ と は、 こ の プ ラ ス ミ ドを ；5 - カ ロ チ ン産生大 腸菌 に導入 し た も の を用 い た色素分析 に よ り 確認 し た。
—方、 右側 の B s t E 11 末端か ら 第 1 7 図の塩基番号 116 2 (配列番号 7 の塩基位置 1162 ) ま で欠失 し た デ レ ー シ' ヨ ン プ ラ ス ミ ド pPC17-3 (第 1 9 図） に は ケ ト 基導入酵 素活性が存在す る こ と （実施例 1 2 ( 1 ) (2 ) ) か ら 、 pPCl 7-3 内 の 1162 bp 断片内 に ） 8 - カ ロ チ ン ま た は ゼァ キ サ ン チ ン を基質 と し て カ ン タ キ サ ン チ ン ま た は ァ ス タ キ サ ン チ ン を合成す る 酵素活性を有す る ケ ト 基導入酵素 を コ ー ドす る 遺伝子が存在 し 、 こ の遺伝子の 中 に 上記 の
Se l 部位 と S a i l 部位が存在 し て い る と 考え ら れ る 。 塩基配列決定の 結果、 こ の遺伝子 に相当す る 、 開始 コ ド ン の 直前 に リ ポ ソ ー ム結合部位を有す る オ ー ブ ン · リ ー デ ィ ン グ · フ レ ー ム を検出す る こ と がで き た の で、 こ れ を c r tW 遺伝子 と 命名 し た。 こ の c r t W 遺伝子の塩基配 列 と コ ー ド さ れ る ポ リ べ プチ ド の ア ミ ノ 酸配列 は第 1 3 〜 1 4 図 （配列番号 5 ) に示 さ れて い る 。
こ の A l c a l i g e n e s s p . PC-1の c r t W 遺伝子産物 （ C f tW) は、 β - ィ オ ノ ン環 （ /S - i 0 n 0 n e r i n g) の 4 位の メ チ レ ン ( me t hy l e n e j ¾ ケ ト （ k e t c ) 基 に転換す る 酵素活 性を有 し て お り 、 そ の具体的な 例 の 1 つ が、 β - カ ロ チ ン ( yS -c a r o t e n e ) 質 と し てェキ ネ ノ ン （ e c h i n e n 0 n e) を経て カ ン タ キ サ ン テ ン 、 c a n t l ∑a ii t li i ii ) を 合成 す る 酵素活性であ る （実施例 1 2 ( 2 ) 、 第 1 1 図参照） 。 さ ら に、 c r tW¾伝子産物 は、 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ 才 ノ ン環 ( 3-hy d r oxy- S - i o non e r i n の 4 位の メ チ レ ン ( me t hy l en e ) ¾r ケ ト （ k e t o) 基 に転換す る 酵素活 性 も 有 し て お り 、 そ の 具体的な例の 1 つ が、 ゼ ア キ サ ン チ ン ( z e a x an t h i n) を 質 と し て 4 - ケ ト ゼ ァ キ サ ン チ ン (ト ke t o z e axan t li i i を経て ァ ス タ キサ ン チ ン a s t a X a n t h i n ) を 合成す る 酵素活性で あ る （実施例 1 2 ( 1 ) 、 第 1 1 図参照） 。 な お、 こ の よ う な酵素活性を有す る ポ リ ペ プチ ドお よ び こ れを コ 一 ドす る DNA 鎖 は、 従来 知 ら れて い な か つ た も の で あ り 、 こ の ポ リ べ プチ ド ま た は こ れを コ ー ドす る DNA 鎖 は、 現在 ま で に知 ら れて い る どの よ う な ポ リ ペ プチ ド ま た は D N A 鎖 と も 全体的な ホ モ ロ ジ 一 は有 し て い な い。 な お、 Ag r ob a c t e r i ui a u r a n t i a c u s _ s . n o v. MK1と A 1 c a 1 i g e n e s s . P C - 1 間の c r 遺 伝子産物 （ C r tW ) は、 ア ミ ノ 酸配列 レ ベ ルで Π % の ア イ デ ン テ ィ テ ィ 一 と い う 高 い ホ モ ロ ジ一を有 し て お り 、 酵素の機能 も 両者で同一で あ る 。 こ れ ら の ア ミ ノ 酸配列 の 中で、 ア イ デ ン テ ィ テ ィ ー を有 さ な い 17% の領域の ァ ミ ノ 酸配列 は、 酵素の機能 に そ れ ほ ど重要で は な い と 考 え ら れ る 。 し たが っ て、 特 に、 こ の 領域 に お い て は、 少 し く ら い他の ア ミ ノ 酸 と 置換、 あ る い は、 欠失、 ま た は 他の ァ ミ ノ 酸の付加を行 っ て も 酵素活性 に影響 は与え な い と 考え ら れ る 。
海洋細菌の ケ ト 基導入酵素遺伝子 c r tW は、 3 位の 位 置 に水酸基が付加 し て い る し て い な い に かかわ り な く 、 4 位の メ チ レ ン基を直接ケ ト 基に変換す る /8 - ィ オ ノ ン ま た は 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ オ ノ ン環ケ ト 基導入酵素
( β - ί 0 η 0 n e o r 3 - hyd ro xy- β - i o n o n e r i.n g k e t o 1 a s e ) を コ ー ド し て い る と い う こ と がで き る 。 な お、 β - ィ ォ ノ ン環や 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ オ ノ ン環 に 限 ら ず、 1 つ の酵素が メ チ レ ン基を い き な り ケ ト 基 に変換す る と い う 知見 は今 ま で存在 し な か つ た も の で あ る 。
( 2 ) 水酸基導入酵素遺伝子の 同定 β - カ ロ チ ン か ら ァ ス タ キ サ ン チ ン の 合成 に必要な す ベ て の遺伝子 は、 PPC17 の 1. 63 k b P s t I - B s t E I I 断片 (第 1 9 図） の 中 に含 ま れて い る 。 こ の pPC17 の 1. 63 k b P s t I - B s t E I I 断片 の 中 に 1 ケ所の S a 1 I 部位が存在 す る 。 こ の S a i l 部位の右側の 断片 に水酸基導入酵素活 性が存在す る こ と は実施例 1 2 ( 3 ) の結果 よ り 明かで あ る 。 し たが っ て、 水酸基導入酵素遺伝子 は、 1. 63 kb P s t I - B s t E I I 断片の う ち 右側 の 断片で あ る O. kb_S a l l- B s t E I I 断片 に存在す る こ と がわ か る 。 塩基配列決 定の結果、 こ の遺伝子 に相 当す る 、 開始 コ ド ン の 直前 に リ ポ ソ ー ム 結合部位を有す る 1 つ の オ ー プ ン · リ ー デ ィ ン グ · フ レ ー ム を検出す る こ と がで き た の で、 こ れを c_ r t Z ¾伝子 と 命名 し た。 こ の c r 遺伝子の 塩基配列 と コ 一 ド さ れ る ポ リ べ プチ ドの ア ミ ノ 酸配列 は第 1 5 図 （配 列番号 6 ) に示 さ れてい る o
こ の A l c a l i g e n e s s ρ . PC-1の e r t Z遺伝子産物 ( C f t Z) は、 β - ィ オ ノ ン環 （ /S - i 0 n 0 n e r i ng) の 3 位の炭素 に 1 つ の水酸基を付加す る 酵素活性を有 し て お り 、 そ の 具 体的な例 の 1 つが、 β - カ ロ チ ン ( yS -c a r o t e n e ) を基' 質 と し て - ク リ プ ト キ サ ン チ ン （ yS -c ryp t o∑ an tli i n) を経てゼア キ サ ン チ ン （ z e a∑ a n t i n) を合成す る 酵素活 性であ る （実施例 1 2 ( 3 ) 、 第 1 1 図参照） 。 さ ら に 1 遺伝子産物 は、 4 - ケ 卜 - β - ィ オ ノ ン 環 （ 4-k e t o - β - i 0 η 0 n e r i ng) の ύ 位の炭素 に 1 つ の 水酸基を付加
7 す る 酵素活性 も 有 し てお り 、 そ の 具体的 な例の 1 つ が、 カ ン タ キサ ン チ ン （ c an t ha xa n t h i n ) を基質 と し て フ エ ニ コ キ サ ン チ ン （ phoe n i c Qxan t h i n ) を経て ァ ス タ キサ ン チ ン （ a s t aian t h i n ) を合成す る 酵素活性で あ る （実 施例 1 2 ( 1 ) 、 第 1 1 図参照） 。 な お、 後者の酵素活 性を有す る ポ リ ペ プチ ドお よ び こ れを コ ー ドす る DNA 鎖 は、 従来知 ら れて い な か っ た も の で あ る 。 ま た、 A 1 c a 1 i g e n e s s p. P C- 1 の の C r t Z は、 ア ミ ノ 酸配列 レ ベルで E r w i n i a u r e dov o r a .の C r t Z と 58% の ア イ デ ン テ ィ テ ィ 一 と い う 意義深い ホ モ ロ ジ一を示 し た。 な お、 A g r o b a c t e r i_u m_a u_r a n t i a c u s s p . n o v . MK1と A l c a l i g en e s s . P C-l 間の c r t Z遺伝子産物 （ C r ) は、 ア ミ ノ 酸配列 レ ベ ルで、 90% の ア イ デ ン テ ィ テ ィ ー と い う 高 い ホ モ 口 ジ ー を有 し て お り 、 酵素の機能 も 両者で同一で あ る 。 こ れ ら の ア ミ ノ 酸配列の 中で、 ア イ デ ン テ ィ テ ィ ー を有 さ な い 1 Q %の領域の ア ミ ノ 酸配列 は、 酵素の機能 に そ れ ほ ど重要で は な い と 考え ら れ る 。 し た 力く つ て、 特 に、 こ の 領域 に お い て は、 少 し く ら い他の ア ミ ノ 酸 と 置換、 あ る い は、 欠失、 ま た は他の ア ミ ノ 酸の付加を行 っ て も 酵素 活性 に影響 は与え な い と 考え ら れ る 。
( 3 ) マ イ ナ ー な キサ ン ト フ ィ ル生合成経路の考察
植物常在細菌 E f w i n i a や光合成細菌 R h o d o b a e t e r の 力 口 チ ノ ィ ド合成遺伝子を用 い た我々 の 研究に よ り 、 一般 に、 カ ロ チ ノ ィ ド生合成酵素 は、 基質 と な る カ ロ チ ノ ィ ド分子の半分を認識 し て作用 す る こ と が明か に な っ て き た。 た と え ば、 E rv i n i a の リ コ ピ ン環化酵素遺伝子で あ る c r t Yは リ コ ピ ン分子の半分ずつ を認識 し て環化す る 。 し たが っ て、 R h 0 d 0 b a c t e r の フ ィ ト エ ン デサ チ ユ ラ ー ゼ' 遺伝子 c r t丄を用 い る こ と に よ り リ コ ピ ン の変わ り に ノ ィ ロ ス ポ レ ン を大腸菌 に 合成 さ せ、 こ れに E r w i n i a の c r t Y を作用 さ せ る と 、 ノ ィ ロ ス ポ レ ン に お け る リ コ ピ ン と 共 通な半分の分子構造だ け を c r t Υ遺伝子産物 は認識 し 、 半 分だ け環化 し た S - ゼァ カ ロ チ ン を産生す る （ L i n d e n,
H. , i s a w a , N. , C h a i o v i t z , D . , P e c k e r, I . , H i r s c h b e r g, J . , S a n d m a n n , G . , ' F u n c t i o n a l c omp l e m e n t a t i o n i n E s c h e r i c h i a c o 1 i o f d i f f e r e n t p b y t o e n e d e s a t u r a s e g e n e s a n d a n a l y s i s o f a c c umu l a t e d c a r o t e n e s' .
I N a t u r f o r s c h. , 46 c, p. 1045 - 1051, 1991 ) 。 ま た、 本発明 に お い て も 、 β - カ ロ チ ン ゃ ゼア キ サ ン チ ン に C r tWを作用 さ せ る と 、 ま ず 1 っ ケ ト 基が導入 さ れた ェ キ ネ ノ ン や 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン が合成 さ れ る し 、 β - 力 ロ チ ン や カ ン タ キ サ ン チ ン に C r t Zを作用 さ せ る と 、 ま ず 1 つ水酸基が導入 さ れた yS - ク リ プ ト キ サ.ン チ ン や フ エ ニ コ キ サ ン チ ンが合成 さ れ る 。 こ れ は、 こ れ ら の 酵素が が基質の半分の分子を認識す る か ら と 考え る こ と がで き る 。 し たが っ て、 た と え ば、 E r V i n i a の c r t E、 c r t B、 c r t c r t Y遺伝子 と 海洋細菌の e r t Z を有す る 大腸菌 は、 前述 し た よ う に、 ゼア キ サ ン チ ンを産生す る が、 そ の 中 間代謝産物 と し て、 /3 - カ ロ チ ン に 1 つ 水酸基が導入 さ れた / δ - ク リ プ ト キ サ ン チ ン を検 出す る こ と がで き る 。 こ の こ と は、 そ こ に C r tWが存在す る と 、 β - ク リ プ ト キ サ ン チ ン を基質 と し て 3 ' -ヒ ド ロ キ シ ェキ ネ ノ ン ゃ 3 - ヒ ド ロ キ シ ェキ ネ ノ ン を合成す る こ と がで き 、 さ ら に、 こ れ ら に C r tWが作用 し て フ ヱ ニ コ キサ ン チ ン を合成す る こ と がで き る と 考え る こ と がで き る 。 今回、 我々 は、 培 養物中 に こ れ ら の ケ ト カ ロ チ ノ ィ ドを 同定す る に は至 つ て い な いが、 そ の 理由 は、 今回行わ れた条件で は、 こ れ ら が微量 し か存在 し な い た め で あ る と 思わ れ る 。 事実、 —方の遺伝子源で あ る '海洋細菌 A g r o b a c t e r i um a u r a n t i a c u s s p. n o v. MK 1に お け る マ イ ナ ー な ァ ス タ キ サ ン チ ン 中間代謝産物 と し て、 3 - ヒ ド ロ キ シ ェ キ ネ ノ ン や 3 ' - ヒ ド ロ キ シ ェ キ ネ ノ ン の検 出が報告 さ れて い る （横山昭 裕、 幹渉、 「海洋性細菌 に お け る ァ ス タ キ サ ン チ ン生合 成 に つ い て」 平成 6 年度 日 本水産学会春季大会講演要 旨 集、 p. 252, 1994 ) 。 以上の こ と よ り 、 第 1 1 図 に 示 し た ァ ス タ キ サ ン チ ン の主要代謝経路の他 に、 図 2 0 に示 し た マ イ ナ ー な 代謝経路 も 存在す る と 考え る こ と がで き る
産業上の 利用可能性
本発明 に お い て、 海洋細菌 よ り ァ ス タ キサ ン チ ン や そ の他の ケ ト 基を含むキ サ ン ト フ ィ ノレ （ァ ス タ キ サ ン チ ン， フ エ ニ コ キ サ ン チ ン 、 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン 、 カ ン タ キ サ ン チ ン 、 ェ キ ネ ノ ン） の生合成 に必要な 遺伝子群の 取得に成功 し 、 そ れ ら の遺伝子の構造な い し 塩基配列お よ びそ れ ら の機能を 明か に な っ た。 従 っ て、 本発明 に よ る D N A 鎖 は、 そ れ ら を外来遺伝子 と し て遺伝子工学的 手法に よ り 大腸菌等の微生物を形質転換 し 発現 さ せ る こ と に よ っ て、 大腸菌等の微生物 に ァ ス タ キ サ ン チ ン や そ の他の ケ ト 基を含むキ サ ン ト フ ィ ル の生合成能を付与す る こ と が可能な遺伝子 と し て有用 で あ る 。
I^'J表
配列番号： 1
配列の長さ： 639
配列の型：鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の^ ¾： Genomic DNA
起源：
生物名： Agrobacterium aurant lacus
株名： sp. nov. MKl 配列
GTG CAT GCG CTG TGG TTT CTG GAC GCA GCG GCG CAT CCC ATC CTG GCG 48 Met His Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro lie Leu Ala
1 5 10 15
ATC GCA AAT TTC CTG GGG CTG ACC TGG CTG TCG GTC GGA TTG TTC ATC 96 He Ala Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe He
20 25 30
ATC GCG CAT GAC GCG ATG CAC GGG TCG GTG GTG CCG GGG CGT CCG CGC 144 lie Ala His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg
35 40 45
GCC AAT GCG GCG ATG GGC CAG CTT GTC CTG TGG CTG TAT GCC GGA TTT 192 Ala Asn Ala Ala Met Gly Gin Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe
50 55 60 - LL -
061 S8I 081
S!H siH MD S;H SIH "丄 3 3 H m "：) JU n31 η3Ί J3S
9iS DV3 OVO VV3 DV3 IVO IVl 199 D99111 OVO III 091 30V 913 9ID 33丄
Sil Oil 591
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ΟΖΖίΟ/ί'βΛΓ/ΧΟΛ 0 8I/S6 O . 配列番号： 2
配列の長さ ： 489
配列の型：鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の觀： Genomic DNA 生物名： Agrobacterium aurantiacus
株名： sp. nov. MK1 配列
ATG ACC AAT TTC CTG ATC GTC GTC GCC ACC GTG CTG GTG ATG GAG TTG 48
Met Thr Asn Phe Leu He Val Val Ala Thr Val Leu Val Met Glu Leu
1 5 10 15
ACG GCC TAT TCC GTC CAC CGC TGG ATC ATG CAC GGC CCC CTG GGC TGG 96
Thr Ala Tyr Ser Val His Ai Trp He Met His Gly Pro Leu Gly Trp
20 25 30
GGC TGG CAC AAG TCC CAC CAC GAG GAA CAC GAC CAC GCG CTG GAA AAG 144
Gly Trp His Lys Ser His His Glu Glu His Asp His Ala Leu Glu Lys
35 40 45
AAC GAC CTG TAC GGC CTG GTC TTT GCG GTG ATC GCC ACG GTG CTG TTC 192
Asn Asp Leu Tyr Gly Leu Val Phe Ala Val lie Ala Thr Val Leu Phe
50 55 60 08 —
***
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68 V9I D3V D93
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0rzr0/f6dT/XD<I O 8I/S60AV 翻番号： 3
Figure imgf000083_0001
： 1161
配列の型：鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の顧： Genomic DNA
起源：
生物名： Agrobacterium aurant i acus
株名： sp. nov. MK1 配列
GTG ACC CAT GAC GTG CTG CTG GCA GGG GCG GGC CTT GCC AAC GGG CTG 48
Met Thr His Asp Val Leu Leu Ala Gly Ala Gly Leu Ala Asn Gly Leu
1 5 10 15
ATC GCC CTG GCG CTG CGC GCG GCG CGG CCC GAC CTG CGC GTG CTG CTG 96 lie Ala Leu Ala Leu Arg A Ala Arg Pro Asp Leu Arg Val Leu Leu
20 25 30
CTG GAC CAT GCC GCA GGA CCG TCA GAC GGC CAC ACC TGG TCC TGC CAC 144
Leu Asp His Ala Ala Gly Pro Ser Asp Gly His Thr Trp Ser Cys His
35 40 45
GAC CCC GAC CTG TCG CCG GAC TGG CTG GCG CGG CTG AAG CCC CTG CGC 192
Asp Pro Asp Leu Ser Pro Asp Trp Leu Ala Arg Leu Lys Pro Leu Arg
50 55 60
一 8 - zs -
061 S8I 081
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0ZZZ0IP6d£llDd 0ZZ8I/S6 OAV 配列番号： 4
配列の長さ ： 2 8 8 6
配列の型：鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の ¾S： Genomi c DNA
起源：
生物名： Agrobact e r ium aurant i a cus
株名： s . nov. MK1 配列
GGATCCGGCG ACCTTGCGGC GCTGCGCCGC GCGCCTTTGC TGGTGCCTGG GCCGGGTGGC 60 CCTAGGCCGC TGGAACGCCG CGACGCGGCG CGCGGAAACG ACCACGGACC CGGCCCACCG
CAATGGTCGC AAGCAACGGG GATGGAAACC GGCGATGCGG GACTGTAGTC TGCGCGGATC 120 GTTACCAGCG TTCGTTGCCC CTACCTTTGG CCGCTACGCC CTGACATCAG ACGCGCCTAG
GCCGGTCCGG GGGACAAGAT GAGCGCACAT GCCCTGCCCA AGGCAGATCT GACCGCCACC 180 CGGCCAGGCC CCCTGTTCTA CTCGCGTGTA CGGGACGGGT TCCGTCTAGA CTGGCGGTGG
AGCCTGATCG TCTCGGGCGG CATCATCGCC GCTTGGCTGG CCCTGCATGT GCATGCGCTG 240 TCGGACTAGC AGAGCCCGCC GTAGTAGCGG CGAACCGACC GGGACGTACA CGTACGCGAC
TGGTTTCTGG ACGCAGCGGC GCATCCCATC CTGGCGATCG CAAATTTCCT GGGGCTGACC 300 ACCAAAGACC TGCGTCGCCG CGTAGGGTAG GACCGCTAGC GTTTAAAGGA CCCCGACTGG
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CAGC3TCC
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GTCTGT i
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00
CO
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-< 6—
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配列番号： 5
配列の長さ ： 729
配列の型：鎖の数：二本鎖
トポロジー： ΪΙ 状
翻の^ ϋ： Genomic DNA 生物名： Alcal igenes
株名： sp. PC-1 配列
ATG TCC GGA CGG AAG CCT GGC ACA ACT GGC GAC ACG ATC GTC AAT CTC 48 Met Ser Gly Arg Lys Pro Gly Thr Thr Gly Asp Thr lie Val Asn Leu
1 5 10 15
GGT CTG ACC GCC GCG ATC CTG CTG TGC TGG CTG GTC CTG CAC GCC TTT 96 Gly Leu Thr Ala Ala lie Leu Leu Cys Trp Leu Val Leu His Ala Phe
- 20 25 30
ACG CTA TGG TTG CTA GAT GCG GCC GCG CAT CCG CTG CTT GCC GTG CTG 144 Thr Leu Trp Leu Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Leu Leu Ala Val Leu
35 40 45
TGC CTG GCT GGG CTG ACC TGG CTG TCG GTC GGG CTG TTC ATC ATC GCG 192 Cys Leu Ala Gly Leu Thr Trp Leu Ser Vai Gly Leu Phe lie lie Ala
50 55 60 - 86 -
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SH 0Π 511
iii ill 3JV A o i|9 i]9 SIH ^19 m dsV 01i dsV usv dsy
H DVX 931 D9D 919 330 W V33 DVD 199 Dll 1V3 3D3 IV9 3VV DVD
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ODV 393 339 0V3 93D OVO IVO 93V OIV OVO 9VV 339 3 V 910 9VV D33
S6 06 S8
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88Z 991 931 Oil 909 930 IVl DID 9919XD 909 913 VVO 909 OiV 909 939
08 Si Oi 39 usy 3iy OIJ 3JV O A Λ "S dsV
IVV 030 390 930 993 903 90D 919 919 331999 DVD 91V V33 3V91VD orrz;o/f6dr/X3d: 0ZZ8I/S6 O . GAC CGG CAC AAC GCG AGG TCG ACC GGC ATC GGC GAC CCG TTG TCA CTA 624
Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Thr Gly 11 e Gly Asp Pro Leu Ser Leu
195 200 205
CTG ACC TGC TTC CAT TTC GGC GGC TAT CAC CAC GAA CAT CAC CTG CAT 672
Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Giu His His Leu His
210 215 220
CCG CAT GTG CCG TGG TGG CGC CTG CCT CGT ACA CGC AAG ACC GGA GGC 720
Pro His Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Arg Thr Arg Lys Thr Gly Gly 225 230 235 240
CGC GCA TGA 729 Arg Ala***
配列番号： 6
配列の長さ ： 489
配列の型：鎖の数： Jf- トポロジー：直鎖状
配列の^ ： Genomic DNA 生物名： Alcal igenes
株名： s . PC-1
配列
ATG ACG CAA TTC CTC ATT GTC GTG GCG ACA GTC CTC GTG ATG GAG CTG 48
Met Thr Gin Phe Leu He Val Val Ala Thr Val Leu Val Met Glu Leu
5 10 15
ACC GCC TAT TCC GTC CAC CGC TGG ATT ATG CAC GGC CCC CTA GGC TGG 96
Thr Ala Tyr Ser Val His Aig Trp lie Met His Gly Pro Leu Gly Trp
20 25 30
GGC TGG CAC AAG TCC CAT CAC GAA GAG CAC GAC CAC GCG TTG GAG AAG 144
Gly Trp His Lys Ser His His Glu Glu His Asp His Ala Leu Glu Lys
35 40 45
AAC GAC CTC TAC GGC GTC GTC TTC GCG GTG CTG GCG ACG ATC CTC TTC 192
Asn Asp Leu Tyr Gly Val Val Phe Ala Val Leu Ala Thr lie Leu Phe
50 55 60
*** J3S OJd
■68 V9193X
09Ϊ SSI 05ΐ 5H
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OH SSI OCI
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m 39D Dll IVl 09099099D 9D0 IIV IVl 990111930991393 VV3 IV3
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O 3999XD 3D93IV 90139101301993D 931391 IVl DD93999193DV orrro/f6«ir/XDd: 0 8I/S6 OAV 配列番号： 7
配列の長さ： 1 6 3 1
配列の型：鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
IB^Jの ： Genomi c DNA
起源：
玍物名： Al ca l i genes
株名： sp. PC-1 配列
CTGCAGGCCG GGCCCGGTGG CCAATGGTCG CAACCGGCAG GACTGGAACA GGACGGCGGG 60 GACGTCCGGC CCGGGCCACC GGTTACCAGC GTTGGCCGTC CTGACCTTGT CCTGCCGCCC
CCGGTCTAGG CTGTCGCCCT ACGCAGCAGG AGTTTCGGAT GTCCGGACGG AAGCCTGGCA 120 GGCCAGATCC GACAGCGGGA TGCGTCGTCC TCAAAGCCTA CAGGCCTGCC TTCGGACCGT
CAACTGGCGA CACGATCGTC AATCTCGGTC TGACCGCCGC GATCCTGCTG TGCTGGCTGG 180 GTTGACCGCT GTGCTAGCAG TTAGAGCCAG ACTGGCGGCG CTAGGACGAC ACGACCGACC
TCCTGCACGC CTTTACGCTA TGGTTGCTAG ATGCGGCCGC GCATCCGCTG CTTGCCGTGC 240 AGGACGTGCG GAAATGCGAT ACCAACGATC TACGCCGGCG CGTAGGCGAC GAACGGCACG
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u v一 S3VV -
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Claims

請 求 の 範 囲
1 . β - ィ オ ノ ン環の 4 位の メ チ レ ン基を ケ ト 基に 変換す る 酵素活性を有す る ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩 基配列を有す る D Ν Α 鎖。
2 . ;9 - ィ オ ノ ン環の 4 位の メ チ レ ン基を ケ ト 基に 変換す る 酵素活性を有 し て い てァ ミ ノ 酸配列が実質的 に 配列番号 1 に示 し た ア ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 1 2 ま での ァ ミ ノ 酸配列の ポ リ ぺ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る D N A 鎖。
3 . 請求の範囲第 2 項 に記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダ ィ ズ し 、 かつ請求の範囲第 2 項に記載の酵素活性を有す る ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列を有す る D N A 鎖。
4 . β - ィ オ ノ ン環の 4 位の メ チ レ ン基を ケ ト 基に 変換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実質的に 配列番号 5 に示 し た ア ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 4 2 ま での ァ ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る D N Α 鎖。
5 . 請求の範囲第 4 項 に記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダ ィ ズ し 、 かつ請求の範囲第 4 項に記載の酵素活性を有す る ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列を有す る D N A 鎖。
6 . β - カ ロ チ ン を ェキ ネ ノ ン を経て カ ン タ キサ ン チ ン に変換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実 質的 に配列番号 1 に示 し た ア ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 1 2 ま での ァ ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
7 . 請求の範囲第 6 項 に記載の D N A 鎖 にハ イ ブ リ ダ ィ ズ し 、 かつ請求の範囲第 6 項 に記載の酵素活性を有す る ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列を有す る DNA 鎖。
8 . β - カ ロ チ ン を ェキ ネ ノ ン を経て カ ン タ キ サ ン チ ン に変換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実 質的 に配列番号 5 に示 し た ア ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 4 2 ま で の ァ ミ ノ 酸配列 の ポ リ ぺ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る DN Α 鎖。
9 . 請求の 範囲第 8 項 に記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダ ィ ズ し 、 かつ請求の範囲第 8 項 に記載の酵素活性を有す る ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
1 0 . 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ オ ノ ン 環 の 4 位の メ チ レ ン基を ケ ト 基 に変換す る 酵素活性を有す る ポ リ ぺ プ チ ドを コ 一 ドす る 塩基配列を有す る DNA 鎖。
1 1 . 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ オ ノ ン 環 の 4 位 の メ チ レ ン 基を ケ ト 基 に変換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 1 に示 し た ァ ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 1 2 ま で の ア ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プチ ドを コ 一 ド す る 塩基配列を有す る DNA 鎖。
1 2 . 請求の 範囲第 1 1 項 に記載の DNA 鎖 にハ ィ プ リ ダィ ズ し、 かつ請求の範囲第 1 1 項 に記載の酵素活性 を有す る ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列を有す る DNA 鎖。
1 3 . 3 - ヒ ド ロ キ シ - β - ィ オ ノ ン環の 4 位の メ チ レ ン基を ケ ト 基 に変換す る 酵素活性を有 し て い て ア ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 5 に示 し た ァ ミ ノ 酸番号 1 か ら 2 4 2 ま での ア ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プチ ド を コ 一 ド す る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
1 4 . 請求の 範囲第 1 3 項 に記載の DNA 鎖 に ハ イ ブ リ ダィ ズ し 、 かつ請求の 範囲第 1 3 項 に記載の酵素活性 を有す る ポ リ ぺ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
1 5 . ゼ ア キ サ ン チ ン を 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン を 経て ァ ス タ キ サ ン チ ン に変換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列 が実質的 に配列番号 1 に示 し た ァ ミ ノ 酸番 号 1 か ら 2 1 2 ま での ア ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列を有す る D Ν Α 鎖。
1 6 . 請求の範囲第 1 5 項 に記載の D N A 鎖 に ハ イ ブ リ ダィ ズ し 、 かつ請求の 範囲第 1 5 項 に記載の酵素活性 を有す る ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る
DNA 鎖。
1 7 . ゼ ア キサ ン チ ン を 4 - ケ ト ゼア キ サ ン チ ン を 経て ァ ス タ キ サ ン チ ン に変換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 5 に示 し た ァ ミ ノ 酸番 号 1 か ら 2 4 2 ま での ア ミ ノ 酸配列の ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
03
1 8 . 請求の範囲第 1 7 項 に記載の DNA 鎖 に ハ イ プ リ ダィ ズ し 、 かつ請求の 範囲第 1 7 項 に記載の 酵素活性 を有す る ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列を有す る DNA 鎖。
1 9 . 4 - ケ ト - β - ィ オ ノ ン環の 3 位の炭素 に 1 つ の水酸基を付加する 酵素活性を有す る ポ リ べ プチ ド を コ ー ドす る 塩基配列 を有す る DNA 鎖。
2 0 . 4 - ケ ト - β - ィ オ ノ ン環の 3 位の炭素 に 1 つ の水酸基を付加す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配 列が実質的 に配列番号 2 に示 し た ァ ミ ノ 酸番号 1 か ら 1 6 2 ま での ア ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩 基配列を有す る D Ν Α 鎖。
2 1 . 請求の範囲第 2 0 項に記載の DNA 鎖 に ハ イ プ リ ダ ィ ズ し 、 かつ請求の 範囲第 2 0 項 に記載の酵素活性 を有す る ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列を有す る DNA 鎖。
2 2 . 4 - ケ ト - β - ィ オ ノ ン環の 3 位の炭素 に 1 つ の 水酸基を付加す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配 列が実質的 に配列番号 6 に示 し た ァ ミ ノ 酸番号 1 か ら 1 6 2 ま での ア ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プチ ド.を コ ー ドす る 塩 基配列を有す る D Ν Α 鎖。
2 3 . 請求の範囲第 2 2 項 に記載の DNA 鎖 にハ イ ブ リ ダィ ズ し 、 かつ請求の 範囲第 2 2 項 に記載の 酵素活性 を有す る ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列を有す る
04 DN A 鎖。
2 4 . カ ン タ キ サ ン チ ン を フ エ ニ コ キ サ ン チ ン を経 て ァ ス タ キ サ ン チ ン に転換す る 酵素活性を有 し て い てァ ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 2 に 示 し た ァ ミ ノ 酸番号 1 か ら 1 6 2 ま での ア ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列を有す る DNA 鎖。
2 5 . 請求の範囲第 2 4 項 に記載の DNA 鎖 に ハ イ ブ リ ダィ ズ し 、 かつ請求の 範囲第 2 4 項 に記載の酵素活性 を有す る ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る
DNA m. o
2 6 . カ ン タ キ サ ン チ ン を フ エ ニ コ キ サ ン チ ン を経 て ァ ス タ キ サ ン チ ン に転換す る 酵素活性を有 し て い て ァ ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 6 に 示 し た ァ ミ ノ 酸番号 1 か ら 1 6 2 ま で の ァ ミ ノ 酸配列 の ポ リ べ プ チ ド を コ 一 ドす る 塩基配列を有す る D N A 鎖。
2 7 . 請求の範囲第 2 6 項に記載の DNA 鎖 にハ イ ブ リ ダィ ズ し 、 かつ請求の 範囲第 2 6 項 に記載の 酵素活性 を有す る ポ リ べ プチ ド を コ 一 ドす る 塩基配列 を有す る DN A 鑌 0
2 8 . 請求の範囲第 1 〜 9 項の いずれか 1 の 範囲第 に記載の DNA 鎖を、 β - カ ロ チ ン を産生す る 能力を有す る 微生物 に導入 し て該形質転換微生物を培地で培養 し 、 培養物か ら カ ン タ キサ ン チ ン ま た は ェキ ネ ノ ン を採取す る こ と を特徴 と す る 、 キ サ ン ト フ ィ ルの製造法。
2 9 . 請求の範囲第 1 0 〜 1 8 項の い ずれか 1 の範 囲第に記載の DNA 鎖を、 ゼア キ サ ン チ ン を産生す る 能力 を有す る 微生物 に導入 し て該形質転換微生物を培地で培 養 し 、 培養物か ら ァ ス タ キ サ ン チ ン ま た は 4 - ケ ト ゼァ キ サ ン チ ン を採取す る こ と を特徵 と す る 、 キ サ ン ト フ ィ ル の製造法。
3 0 . 請求の 範囲第 1 9 〜 2 7 項の い ずれか 1 の範 囲第に記載の DNA 鎖を、 カ ン タ キ サ ン チ ン を産生す る 能 力を有す る 微生物 に導入 し て該形質転換微生物を培地で 培養 し 、 培養物か ら ァ ス タ キ サ ン チ ン ま た は フ ヱ ニ コ キ サ ン チ ン を採取す る こ と を特徴 と す る 、 キ サ ン ト フ ィ ル の 製造法。
3 1 . 微生物が細菌 ま た は酵母で.あ る 、 請求の 範囲 第 2 8 〜 3 0 項の いずれか 1 の 範囲第に記載の製造法。
06 一
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