JPH1146770A - β−カロチンハイドロキシラーゼ遺伝子およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 種々の生物由来のβ‐カロチンハイドロキシ
ラーゼと相同性を有さない同酵素活性タンパク質をコー
ドする新規遺伝子およびその使用法を提供する。 【解決手段】 典型的にはラン藻に由来し、β‐イオノ
ン環の３位（または３′位）に水酸基を導入する酵素活
性を有するタンパク質をコードする遺伝子。上記の遺伝
子を宿主（微生物または植物）に導入してこれを発現さ
せ、該宿主中のβ‐イオノン環を有する化合物における
該環の３位（および／または３′位）に水酸基を導入す
ることを特徴とする、キサントフィルの発現もしくは製
造方法。 【効果】 上記遺伝子を微生物や植物に導入することに
より、ゼアキサンチンやβ‐クリプトキサンチン等のキ
サントフィルおよびこれらのキサントフィルの代謝物の
生産量を増やすことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】〔発明の背景〕

【発明の属する技術分野】本発明は、β‐イオノン環を
有する化合物に水酸基を導入する酵素をコードする遺伝
子、代表的にはラン藻に由来する遺伝子、およびその遺
伝子を用いてβ-カロチン等の環状カロチノイドに水酸
基を導入する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】カロチノイド (carotenoid、カロテノイ
ドとも呼ばれる) とは、通常、炭素鎖が40のイソプレン
骨格からなる自然界に豊富に存在する天然色素の総称で
ある。現在までに、約600 種類のカロチノイドが単離さ
れている (Pfander, H., ed.,Key to Carotenoids. Bas
el, Birkhauser, 1987)。カロチノイドは、植物や光合
成微生物では必須の色素であり、光合成の補助色素とし
て機能するほか、光酸化的障害から組織や細胞を保護す
る機能を担っている。本色素は、また、黄色や赤色の天
然着色料として利用され、さらに、癌予防や免疫賦活活
性などを有する栄養価改善剤として食用や飼料用にすで
に一部実用化され、将来の発展が有望視されているもの
である（松野隆男、幹渉、動物におけるカロテノイドの
生理機能と生物活性、化学と生物, 28, 219-227, 199
0)。

【０００３】カロチノイドは、ステロール、キノン、及
びその他のイソプレノイドと共通なイソプレン基本生合
成経路によって合成される。最初のイソプレノイドであ
るC5のイソペンテニルピロリン酸 (IPP) は異性化反応
によりジメチルアリルピロリン酸 (DMAPP) に変換さ
れ、さらに、DMAPP は、C5のIPP と順次、縮合すること
により、C10 のゲラニルピロリン酸 (GPP)、C15 のファ
ルネシルピロリン酸 (FPP)、C20 のゲラニルゲラニルピ
ロリン酸 (GGPP) というふうに、炭素数を5 つづつ延ば
していく。カロチノイドに特異的な生合成経路は、GGPP
においてイソプレン基本生合成経路から分岐する。すな
わち、2 分子のGGPPが縮合して、最初のカロチノイドで
ある無色のフィトエン (phytoene) が合成される。フィ
トエンは、不飽和化反応により、順次、二重結合が導入
されることにより、フィトフルエン(phytofluene ；フ
ィトエンに二重結合1 個) 、ζ- カロチン (ζ-caroten
e ；二重結合2 個) 、ノイロスポレン (neurosporene；
二重結合3 個) 、リコペン(lycopene ；二重結合4 個)
に変換される。さらに、リコペンは環化反応によりβ-
カロチン (β-carotene) やα- カロチン (α-caroten
e) に変換される。そして、β- カロチンやα- カロチ
ンに水酸基やケト基などが導入され、ゼアキサンチン
(zeaxanthin) 、ルテイン (lutein) 、アスタキサンチ
ン (astaxanthin)などの種々のキサントフィルが合成さ
れる。

【０００４】カロチノイドの生合成を担う遺伝子の知見
は、1990年代に入って飛躍的に進展した。現在までに、
多くのカロチノイド生合成遺伝子が、植物常在 (epiphy
tic)細菌Erwinia やトマト、赤ピーマンなどの植物を始
めとして、光合成細菌Rhodob acter 、ラン藻Synechococ
cus sp. strain PCC7942、カビNeurospora crassa な
ど、種々の生物から単離され、それらの機能が明らかに
された (三沢典彦，遺伝子レベルで解明されたカロチノ
イド生合成経路，蛋白質 核酸 酵素, 41, 337-346, 1
996)）。したがって、取得された種々のカロチノイド生
合成遺伝子を利用して、遺伝子工学的手法により大腸菌
や酵母などの微生物、さらには植物などを形質転換し発
現させることによって、種々の生物に、カロチノイドの
生合成能を新たに付与したり、カロチノイドの代謝経路
を変えたりすることが可能となった(三沢典彦，セミナ
ー室 メタボリックエンジニアリングの展開 −2 ．大
腸菌・酵母によるカロテノイド生産，化学と生物，35，
60-68 ，1997、および、三沢典彦，イソプレノイド生合
成遺伝子による植物の代謝工学，第33回 植物化学シン
ポジウム 講演要旨集，22-32 ，1997) 。

【０００５】β- カロチンをβ- クリプトキサンチンを
経てゼアキサンチンに変換する酵素であるβ- カロチン
ハイドロキシラーゼ (β-carotene hydroxylase) をコ
ードする遺伝子 (crtZ またはbhy) は、植物常在細菌
Erwinia 、Flavobacterium属細菌、海洋細菌Agrobacter
ium aurantiacum, Alcaligenes sp. strain PC-1、植
物シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana) から取得さ
れている (N. Misawa, Y. Satomi, K. Kondo, A. Yokoy
ama, S. Kajiwara, T. Saito, T. Ohtani,W. Miki, St
ructure and functional analysis of a marine bacter
ial carotenoid biosynthesis gene cluster and astax
anthin biosynthetic pathway proposed at the gene l
evel. J. Bacteriol., 177, 6575-6584, 1995 、およ
び、Z.Sun, E. Gantt, F. X. Cunningham, Jr., Clonin
g and functional analysis of the β-caortene hydro
xylase of Arabidopsis thaliana, J. Biol. Chem., 27
1, 24349-24352, 1996 、および、L. Pasamontes, D. H
ug, M. Tessier, H.-P.Hohmann, J. Schierle, A. P.
G. A. M. van Loon, Isolation and characterization
of the carotenoid biosynthesis genes of Flavobacte
rium sp. strainR1534, Gene, 185, 35-41, 1997) 。こ
れらのβ- カロチンハイドロキシラーゼは、種を超え
て、アミノ酸配列レベルでよく保存されていた。たとえ
ば、Erwini a と海洋細菌のCrtZは53-56 ％の同一のアミ
ノ酸配列を有しており、これらの細菌と植物Arabidopsi
s のβ- カロチンハイドロキシラーゼは、31-37 ％の同
一のアミノ酸配列を有していた。

【０００６】カロチノイドは、炭素と水素のみからな
る" カロチン" （たとえば、リコペン、β- カロチン、
α- カロチン等）、及び、カロチンに水酸基、ケト基な
どの酸素を含む基が導入された" キサントフィル" （た
とえば、ゼアキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン
等）からなりたっている。一般的に言って、キサントフ
ィルは、カロチンと比べると、水溶性が若干あるため、
癌予防や免疫賦活活性などの生理活性が高いと考えられ
ている（西野輔翼, 食品中のカロテノイドによる発癌抑
制, 農化誌, 67, 39-41, 1993)。

【０００７】〔発明の概要〕

【発明が解決しようとする課題】上記事情に鑑み、カロ
チン、特に食品に最もよく含まれているカロチンである
β- カロチンをβ- クリプトキサンチンやゼアキサンチ
ンに変換する技術の開発が望まれる。本発明の課題は、
前述した種々の生物由来のβ- カロチンハイドロキシラ
ーゼと同様の活性を持ちながら、これらのβ- カロチン
ハイドロキシラーゼとアミノ酸配列レベルで相同性を有
さない酵素をコードする遺伝子を見出し、これを用い
て、β- カロチン等のβ- イオノン環の３位(および／
または３′位)に水酸基を導入し、β-クリプトキサンチ
ンやゼアキサンチン等のキサントフィルを合成する方法
を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】ラン藻Synechocystis s
p. strain PCC6803は、そのゲノム情報が明らかにされ
た唯一のラン藻である (T. Kaneko, S. Sato, H. Kotan
i, A. Tanaka et al., S equence analysis of the geno
me of the unicellular cyanobacterium Synecho cystis
sp. strain PCC6803. II. Sequence determination o
f the entire genome and assignment of potential pr
otein-coding regions. DNA Res. 3, 109-136, 1996)
。一方、Synechocystis PCC6803は、ゼアキサンチ
ン、エキネノン、ミキソキサントフィル等のキサントフ
ィルを生産することができる。それゆえ、本ラン藻はゼ
アキサンチンを作るためのβ- カロチンハイドロキシラ
ーゼ遺伝子を有するはずであるが、相同性検索の結果、
既存のβ- カロチンハイドロキシラーゼと類似性のある
タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
(ORF)は見出されなかった。したがって、Synechocysti
s PCC6803のβ- カロチンハイドロキシラーゼ遺伝子
は、既存のβ- カロチンハイドロキシラーゼとは少なく
とも構造の違う酵素をコードしていると考えられる。発
明者らは、Synechocys tis PCC6803のゲノム上に推定さ
れた3,166 個のタンパク質をコードしうるORFの中か
ら、β- カロチンをβ- クリプトキサンチンを経てゼア
キサンチンに変換するβ- カロチンハイドロキシラーゼ
をコードするORF sll 1468を見出し、本発明を完成する
に至った。

【０００９】すなわち、本発明による遺伝子は、配列番
号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に
おいて１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入も
しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ‐イオノ
ン環の３位（および／または３′位）に水酸基を導入す
る酵素活性を有するポリペプチド（β‐カロチンハイド
ロキシラーゼ）をコードするものである。また本発明
は、上記の遺伝子を用いたキサントフィルの発現もしく
は製造方法をも提供する。すなわち、本発明によるキサ
ントフィルの発現もしくは製造方法は、配列番号１で示
されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１
もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付
加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子を宿主に導入してこれを発現させ、宿主中のβ
‐イオノン環を有する化合物における該環の３位（およ
び／または３′位）に水酸基を導入することを特徴とす
るものであり、好ましい具体的態様は、該遺伝子を宿主
に導入してこれを発現させ該宿主中のβ‐カロチンをβ
‐クリプトキサンチンまたはこれを経てゼアキサンチン
に変換することを特徴とするものである。

【００１０】上記の方法により、たとえば、もともと従
来型のβ- カロチンハイドロキシラーゼ遺伝子を有して
いる微生物や植物に本発明によるβ- カロチンハイドロ
キシラーゼ遺伝子を導入しても、相同組み換えやco-sup
pression 等の問題を気にすることなく、これらの微生
物や植物においてβ- カロチンハイドロキシラーゼ活性
を付与または増大させることができる。

【００１１】〔発明の具体的な説明〕

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は遺伝子は、配列番号１で示されるアミノ酸配
列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸
配列を有するポリペプチド（β‐カロチンハイドロキシ
ラーゼ）をコードするものであることは前記したところ
であり、その典型的な例は配列番号１のアミノ酸配列を
コードするラン藻由来の遺伝子である。また本発明は、
上記遺伝子を用いたキサントフィルの発現もしくは製造
方法にも関し、このキサントフィルの製造方法は、上記
遺伝子を宿主に導入してこれを発現させ、該宿主中のβ
‐イオノン環を有する化合物における該環の３位（およ
び／または３′位）に水酸基を導入することを特徴とす
るものである。本発明方法の好ましい具体的態様は、上
記遺伝子を宿主に導入して発現させ、該宿主中のβ‐カ
ロチンをβ‐クリプトキサンチンまたはこれを経てゼア
キサンチンに変換することを特徴とする方法である。

【００１２】本発明方法において、宿主がβ‐カロチン
を産生している（蓄積している）場合、好適な例として
トマト、ニンジン、トウモロコシ、カンキツ類、タバ
コ、Ｐｈａｆｆｉａ属酵母などでは、β‐カロチン生成
に関与する遺伝子はすでに存在しているため本発明遺伝
子のみを宿主細胞に導入すればよい。また、宿主がβ‐
カロチンを産生していない場合、本発明遺伝子の他に、
β‐カロチン生成に関与する不足の遺伝子、すなわち、
カロチノイド生合成遺伝子ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔ
Ｉ、ｃｒｔＹの全部または一部を導入する必要がある。
例えば、本発明において好ましい宿主である大腸菌、Ｚ
ｙｍｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
属酵母、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母の場合は、上記のカロチ
ノイド生合成遺伝子を保有していないか、ｃｒｔＥと同
様な働きをする遺伝子を保有している場合でもその活性
が弱いのでそれらの遺伝子すべてを導入する必要があ
る。

【００１３】カロチノイド生合成遺伝子であるｃｒｔ
Ｅ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹは、公知の種々の生
物由来、たとえば植物常在細菌Ｅｒｗｉｎｉａ（たとえ
ばＥｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、海洋細菌
（たとえばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔ
ｉａｃｕｍ）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．ｓｔｒ
ａｉｎ ＰＣ−１等に由来するものを用いることがで
き、これらの具体的な配列については、例えばＮ．Ｍｉ
ｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
７２，６７０４−６７１２，１９９０、Ｎ．Ｍｉｓａｗ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７
７，６５７５−６５８４，１９９５等に記載されてい
る。具体的に例示すれば、ｃｒｔＥは本願明細書の配列
番号４のアミノ酸番号１〜３０２、ｃｒｔＢは配列番号
３のアミノ酸番号１〜２９６、ｃｒｔＩは配列番号５の
アミノ酸番号１〜４９２、ｃｒｔＹは配列番号６のアミ
ノ酸番号１〜３８２または配列番号２の１〜３８６、で
それぞれ示されるアミノ酸配列およびそれらの変異体
（例えば１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入
もしくは付加されたアミノ酸配列を有しかつ同じ酵素活
性を有するタンパク質）をコードする遺伝子を使用する
ことができる。

【００１４】本発明遺伝子および上記の各種crt 遺伝子
を取得する一つの手段は、核酸合成の方法に従って、そ
の鎖長の少なくとも一部を化学合成することであるが、
遺伝子のサイズが大きく数が多いということを考えれ
ば、この化学合成法よりも染色体ＤＮＡライブラリーを
作製し、このライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用
されている方法、例えば適当なプローブ（たとえば、化
学合成したＤＮＡプローブなど）によるハイブリダイゼ
ーション法、によりこれを取得するほうが早いといえ
る。

【００１５】＜ラン藻Synechocystis sp. strain PCC68
03のゲノム情報＞Synechocystis sp. strain PCC6803
( 以下 PCC6803) は単細胞性のラン藻で、約3.6 Mb の
環状ゲノムを持っている (金子貴一, 中村保一, 田畑哲
之, ラン藻ゲノムの全構造解明がもたらすもの, 化学と
生物, 34, 786-792, 1996)。1996年の2 月に、光合成生
物としては始めてPCC6803 ゲノムの全塩基配列が決定さ
れ、9 月には、配列データーとコンピューターによる解
析データが公開された (T.Kaneko, S. Sato, H. Kotan
i, A. Tanaka et al., Sequence analysis of thegeno
me of the unicellular cyanobacterium Synechocystis
sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of
the entire genome and assignment of potential pro
tein-coding regions. DNA Res. 3, 109-136, 1996)。
現在では、pCC6803 に関するすべてのゲノム情報は、ft
p://ftp.kazusa.or.jp/pub/cyano/cyano.p.aa.z にてア
クセスすることができる。

【００１６】PCC6803のゲノム上には、3,166 個のタン
パク質をコードしうる遺伝子領域 (ORF) が推定され
た。3,166 個のうち、既知の遺伝子と類似性を示したも
のは 1,742個 (全体の55％) であり、そのうち機能が予
測できるものは 1,402個であった。したがって、既知の
遺伝子と類似性を示さない未知の遺伝子は 1,424個とい
うことになる。β- カロチンをβ- クリプトキサンチン
を経てゼアキサンチンに変換するβ- カロチンハイドロ
キシラーゼをコードするORF sll 1468は、この未知の遺
伝子の中から、思いがけず見いだされたものである。

【００１７】＜ラン藻 PCC6803のβ- カロチンハイドロ
キシラーゼ遺伝子の取得＞β- カロチンをβ- クリプト
キサンチンを経てゼアキサンチンに変換するβ-カロチ
ンハイドロキシラーゼをコードするORF sll 1468は、そ
の塩基配列の情報(T. Kaneko, S. Sato, H. Kotani, A.
Tanaka et al., DNA Res. 3, 109-136,1996)に基づい
て、PCR 反応 (林健志 編、実験医学別冊、PCR 法の最
新技術、羊土社) や化学合成法等の方法により取得する
ことができる。たとえば、発明者らは、化学合成した以
下のDNA 配列をプライマーとして用いたPCR 法により、
PCC6803 の染色体DNA 断片からORF sll 1468の配列を単
離した。5'- TCC TCG AGC GTG TGC CAG GAG TCC G -3'5
'- ACT CTA GAG CTA GGG CTT GTC AGA TG -3'ここで得
られたDNA 断片をXhoI/XbaI で消化後、pBluescript II
KS+ (Stratagene) のXhoI-XbaI 部位に挿入し、大腸菌
でPCC6803 のβ- カロチンハイドロキシラーゼ遺伝子を
発現するプラスミドを得た。

【００１８】＜ラン藻 PCC6803のβ- カロチンハイドロ
キシラーゼを含むプラスミドの作製法、及び各種生物へ
の導入・発現法＞次に、前述の単離したORF （本発明の
遺伝子を含む）を用いた各種生物での発現用プラスミド
の作製法、及びこれらのプラスミドの各種生物への導入
・発現法についてさらに詳しく説明する。

【００１９】微生物の形質転換および遺伝子発現 以下は、好ましい微生物への外来遺伝子の導入・発現法
の概要について記載したものである。外来遺伝子を含む
プラスミドの作製法、大腸菌等の微生物へのプラスミド
の導入および発現のための手順ないし方法は、本発明に
おいて下記したところ以外のものにおいても、遺伝子工
学の分野により慣用されているものを含み、その手法な
いし方法（たとえば、"Vectors for cloning genes", M
ethods in Enzymology, 216, p. 469-631, 1992, Acade
mic Press 、および、"Other bacterial systems", Met
hods in Enzymology, 204, p.305-636, 1991, Academic
Press 参照）に準じて実施すればよい。組換え微生物
の培養は、導入されたプラスミドが有する薬剤耐性等の
形質に合わせて、薬剤を添加したりすること以外は、も
ともとの微生物の親株の培養に準じて行えばよい（たと
えば、Sambrook, J., Fritsch,E. F., Maniatis, T., "
Molecular cloning -A laboratory manual." Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, 1989、または、財団法人
発行研究所, LIST OFCULTURES 10th Edition, 1996
参照）。

【００２０】（1）大腸菌 大腸菌では、本発明遺伝子の他にβ‐カロチンの合成に
関与する遺伝子 crt E、crt B、crt I、crt Y の導入が
必要となる。大腸菌への外来遺伝子の導入法は、ハナハ
ンの方法、ルビジウム法などすでに確立されたいくつか
の効率的方法があり、それを用いて行えばよい（たとえ
ば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, T.Maniatis, "Mol
ecular cloning -A laboratory manual." Cold Spring
HarborLaboratory Press, 1989 参照）。大腸菌での外
来遺伝子の発現は常法に従って行えばよいが（たとえ
ば、前述の "Molecular cloning -A laboratory manua
l."参照）、たとえば、pUC 系やpBluescript 系等のlac
のプロモーター等を有する大腸菌用ベクターを用いて
行うことができる。発明者等は、lac のプロモーターを
有する大腸菌用ベクターpBluescript II KS⁺ (Stratage
ne) を用いて、lac のプロモーターの転写およびlacZ
の翻訳のリードスルーを受ける用に PCC6803のORF sll
1468 遺伝子（本発明の遺伝子を含む）および４種の上
記β‐カロチン合成遺伝子）を挿入し、この遺伝子を大
腸菌で発現させればよい。なお、本発明遺伝子を含む上
記５種の遺伝子を連結する際のそれらの結合順位は特に
限定されない。

【００２１】（2）Zymomonas mobilis Zymomonas mobilis では、本発明遺伝子の他に上記の４
種の crt遺伝子の導入が必要となる。エタノール生産細
菌 Zymomonas mobilis への外来遺伝子の導入法は、グ
ラム陰性菌に共通な接合伝達法により行うことができ、
Zymomonas mobi lis での外来遺伝子の発現は、たとえば
Zymomonas mobilis 用ベクターpZA22を用いて行うこと
ができる（中村克己、「Zymomonas 細菌の分子育種」、
日本農芸化学会誌, 63, p.1016-1018, 1989 、および、
N. Misawa, S. Yamano, H. Ikenaga, Production of β
-carotene in Zymomonas mobilis and Agrobacterium t
umefaciens by introduction of the biosynthesis gen
es from Erwinia uredovora. Appl. Environ. Microbio
l., 57, 1847-1849, 1991参照）。

【００２２】（3）酵母 酵母では、本発明遺伝子の他に上記の４種のcrt遺伝子
の導入が必要となる。酵母Saccharomyces cerevisiae
への外来遺伝子の導入法は、リチウム法などすでに確立
された方法があり、それを用いて行えばよい（たとえ
ば、秋山裕一監修バイオインダストリー協会編集、「酵
母のニューバイオテクノロジー」医学出版センター刊参
照）。酵母での外来遺伝子の発現は、PGK や GPD (GAP)
等のプロモーターおよびターミネーターを用いて、外
来遺伝子（本発明遺伝子および４種の crt遺伝子）をこ
のプロモーターとターミネーターの間に転写のリードス
ルーを受けるように挿入した発現カセットを構築し、こ
の発現カセットを、 S. cere visiae のベクター、たと
えば、YRp 系（酵母染色体のARS 配列を複製起点とする
酵母用マルチコピーベクター）、YEp 系（酵母の２μm
DNA の複製起点を持つ酵母用マルチコピーベクター）、
YIp 系（酵母の複製起点を持たない酵母染色体組込み用
ベクター）等のベクターに挿入することにより行うこと
ができる（前述の「酵母のニューバイオテクノロジー」
医学出版センター刊、日本農芸化学会ABC シリーズ「物
質生産のための遺伝子工学」朝倉書店刊、および、S. Y
amano, T. Ishii, M. Nakagawa, H. Ikenaga, N. Misaw
a, Metabolic engineering for production of β-car
otene and lycopene in Saccharomyces cerevisiae. B
iosci. Biotech. Biochem., 58, 1112-1114, 1994 参
照）。

【００２３】酵母Candida utilis への外来遺伝子の導
入法については、すでに本発明者らにより開示された方
法（近藤、三沢、梶原、特開平8-173170号公報）に従っ
て実施できる。具体的にはシクロヘキシミド耐性遺伝
子、G418耐性遺伝子、あるいはハイグロマイシン耐性遺
伝子などの薬剤耐性マーカー遺伝子を含んだプラスミド
を直鎖状にした後、電気パルス法もしくはリチウム法に
よって、染色体上に組み込むことができる。外来遺伝子
（本発明遺伝子および４種の crt遺伝子）の発現には同
公報に記載されたGAP, PGK, PMA などのプロモーターを
使用することができる。

【００２４】酵母Phaffia rhodozyma への外来遺伝子
（本発明遺伝子および４種の crt遺伝子）の導入法につ
いては、Van Ooyen らにより、開示された方法（Van Oo
yen etal., Transformation of Phaffia rhodozyma,WO9
4/06918, 1994）により、G418耐性遺伝子などの選択マ
ーカー遺伝子を含むプラスミドをリチウム法などによっ
て染色体上に組み込むことができる。

【００２５】微生物からのカロチノイド色素の抽出・精
製法 培養物からのβ‐クリプトキサンチン、ゼアキサンチン
等のカロチノイドの単離・精製は、微生物代謝生産物を
その培養物から単離精製するために常用される方法に従
っておこなわれる。例えば、培養物をろ過や遠心分離に
より培養ろ液と菌体に分け、菌体を有機溶剤（たとえ
ば、アセトン、メタノール、クロロホルムおよびこれら
の２種以上の混合物など）で抽出する。ついで抽出液を
濃縮後、シリカゲル、化学結合型シリカゲル (ODS ゲル
等) 、ゲルろ過剤などを用いた液体クロマトグラフィ−
により精製する。得られたカロチノイドは、着色料、栄
養価改善として食用や飼料用に、あるいは試薬用などに
用いられる。

【００２６】植物の形質転換および遺伝子発現 植物の場合は通常β‐カロチンを産生しているので、本
発明遺伝子のみを導入すればよい。前述のPCC6803 の本
発明β- カロチンハイドロキシラーゼ遺伝子 (ORF sll
1468) を含むプラスミドを作製し、これをトマト、ニン
ジン、トウモロコシ、カンキツ類、タバコなどの適切な
植物に導入し、発現させることにより、ゼアキサンチン
やβ- クリプトキサンチンおよびこれらのカロテノイド
代謝物を得たり、増やしたりすることができる。微生物
の場合は形質転換体で生成したカロチノイドを単離する
ことが主目的である。植物体ではむしろ、果実や花にお
けるカロチノイド含量を増やしたり、カロチノイドの種
類を変化させることにより、栄養価を高めたりカロチノ
イド色を増大させることを主目的とする。

【００２７】以下は、植物への外来遺伝子の導入・発現
法の概要について記載したものである。外来遺伝子を含
むプラスミドの作製法、植物（細胞）へのプラスミドの
導入および発現（植物体）のための手順ないし方法は、
本発明において下記したところ以外のものにおいても、
植物の遺伝子工学の分野により慣用されているものを含
み、その手法ないし方法（たとえば、石田功, 三沢典
彦, 細胞工学実験操作入門, 講談社, 1992 参照）に準
じて実施すればよい。

【００２８】植物への外来遺伝子の導入法は、植物病原
細菌Agrobacterium tumefaciensを介する方法、エレク
トロポレーション法、パーティクルガンを用いる方法等
が知られている。導入したい植物の種類に応じてこれら
の方法を使い分けることができるが、現在では、Agroba
cterium tumefaciens を介する方法が最も多用されてい
る。プロモーターは、全身高発現プロモーターであるカ
リフラワーモザイクウイルス (CaMV) の35S プロモータ
ーを始めとして、種々の器官特異的に発現するものも使
うことができる。CaMV 35S プロモーターを含んだバイ
ナリーベクターpBI121 は Clontech 社より入手でき、
Agrobacterium tumefaciens を介するためのベクターと
して、広く使われているものである。Erwinia のcrtI
などの細菌のカロテノイド生合成遺伝子は、pBI121 を
ベクターとして用いることにより、タバコやトマト等の
植物に導入でき、これらの遺伝子がタバコの葉やトマト
の実などで発現し、機能することがすでに示されている
(三沢典彦, カロテノイド生合成阻害剤抵抗性植物の作
出, 植物の化学調節, 31, 143-149, 1996)。なお、この
際、植物細胞質内で合成されたCrt タンパク質を、カロ
テノイド生産の場である葉緑体や色素体などのプラスチ
ドに移行させるのに、トランジットペプチド配列 (例え
ばRubisco の小サブユニットのトランジットペプチド配
列) をcrt遺伝子（ここでは本発明遺伝子）の開始コド
ンの直前に付与する必要がある (三沢典彦, カロテノイ
ド生合成阻害剤抵抗性植物の作出, 植物の化学調節, 3
1, 143-149, 1996)。

【００２９】配列番号３〜６に関する遺伝子を組み込ん
だ大腸菌は、下記のように工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−２３７７として寄託されてお
り、配列番号２に関する遺伝子を組み込んだ大腸菌はＢ
Ｐ−４５０５として寄託されている。 （１） Escherichia coli JM109(pCAR1) 受託番号：FERM BP-2377 受託年月日：平成元年４月１１日 （２） Escherichia coli JM101(pAccrt-EIB,pAK92) 受託番号：FERM BP-4505 受託年月日：平成５年１２月２０日 菌株（１）は、Erwinia uredovora の crtE(zexA)、crt
B(zexE)、crtI(zexD)、crtY(zexC)等の遺伝子を含んで
おり、菌株（２）は、Agrobacterium aurantia cum の c
rtY 等の遺伝子を含んでいる。

【００３０】

【実施例】以下実施例により本発明を説明するが、本発
明はこれに限定されるものではないことは言うまでもな
い。 〔実施例１〕 プラスミドの作製 植物常在 (epiphytic) 細菌Erwinia uredovora のcrt
E, crtB, crtI, crtY遺伝子を有するプラスミドpACCAR1
6ΔcrtXは大腸菌にβ- カロチンを合成する能力を与え
ることができる (N. Misawa et al., Structure and fu
nctional analysis of a marine bacterial carotenoid
biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynt
hetic pathway proposed at the gene level. J. Bacte
riol., 177, 6575-6584, 1995) 。このプラスミドは、
マーカー遺伝子としてクロラムフェニコール耐性遺伝子
を有しており、よく使われているpBluescript やpUC 等
の大腸菌ベクターと１つの細胞内で共存可能である。
PCC6803 ゲノムのコスミドライブラリーの内 ORF sll 1
468 ( 後にβ- カロチンハイドロキシラーゼ遺伝子, bh
y と同定された) を含むコスミドクローン cs 0827 (T.
Kaneko et al., DNA Res. 3, 109-136, 1996 ) を鋳型
として用いて、以下の１本鎖DNA をプライマーとしてPC
R 反応を行った。 5'- TCC TCG AGC GTG TGC CAG GAG TCC G -3' 5'- ACT CTA GAG CTA GGG CTT GTC AGA TG -3'

【００３１】ここで得られた0. 94 kb のDNA 断片を制
限酵素XhoI／XbaI で消化後、pBluescript II KS+ (ア
ンピシリン耐性, Stratagene社) のXhoI-XbaI 部位に挿
入することによりプラスミドpBS-bhy を得た。塩基配列
の分析等により、pBS-bhy は目的とするORF sll 1468
を含んでいることを確認した。なお、このプラスミドで
は、ORF sll 1468 は、ベクターpBluescript II KS+
のlac プロモーターの転写のリードスルーを受けるだけ
でなく、pBluescript II KS⁺ のlacZ の翻訳のリード
スルーを受けること、すなわち、LacZの最初のN 末領域
と融合タンパク質ができるようにデザインされている。

【００３２】〔実施例２〕 組換え大腸菌が生産するカ
ロテノイドの同定 ２つのプラスミドpACCAR16ΔcrtXおよびpBS-bhy を有す
る大腸菌を、150 μg/ml のアンピシリン、30 μg/ml
のクロラムフェニコール、0.1 mMのイソプロピル- １
- チオ- β-D- ガラクトピラノシド (IPTG) を含むLB培
地 (1 ％ トリプトン、0.5 ％ 酵母エキス、1 ％ NaC
l) で30℃で24時間、定常期まで培養を行った。集菌
後、菌体からカロチノイド色素をアセトンで抽出し、乾
固した後、クロロフォルム−メタノール (9:1) で再抽
出を行った。乾固後、色素を少量のメタノール、2-プロ
パノールまたはアセトンに溶かした後、高速液体クロマ
トグラフィー (HPLC) または薄層クロマトグラフィー
(TLC) のサンプルとした。HPLCは、Nova-pak HR 6 μ
カラム (300 x 3.9 mm, Waters) を用い、１ ml/minの
速度で、アセトニトリル−メタノール−2-プロパノール
(90:6:4) で展開を行った。TLC は、シリカゲル (60F2
54) を用い、クロロフォルム−メタノール (15:1) で展
開を行った。β- カロチン (all-trans 型) はSigma 社
から購入したものを標品として用いた。さらに、ゼアキ
サンチン (all-trans 型) 、β- クリプトキサンチン
(all-trans 型) 、カンタキサンチン (all-trans 型)
、エキネノン (all-trans 型)は、開示された方法 (N.
Misawa et al., J. Bacteriol., 177, 6575-6584, 199
5) に従って、Erwinia 、またはErwinia と海洋細菌のc
rt 遺伝子を有する組換え大腸菌から精製を行った。

【００３３】pACCAR16ΔcrtXおよびpBS-bhy を有する大
腸菌から抽出されたカロチノイド色素は、上記の条件で
HPLCおよびTLC 分析した結果、ゼアキサンチン (all-tr
ans型) (全体の65％) 、β-クリプトキサンチン (all-t
rans 型) ( 全体の5 ％)、β- カロチン (all-trans
型) ( 全体の24％) の混合物であると同定された。な
お、β- カロチンにケト基が導入されたカロチノイドで
あるカンタキサンチン やエキネノンは全く見いだされ
なかった。したがって、プラスミドpBS-bhyに含まれるO
RF sll 1468 は、β- カロチンを基質として、β- カ
ロチンの3 位に水酸基が導入されたカロチノイドである
β- クリプトキサンチンを経て、さらに、β- クリプト
キサンチンの3'位に水酸基が導入されたカロチノイドで
あるゼアキサンチンを合成する酵素β- カロチンハイド
ロキシラーゼ (β-carotene hydroxylase) をコードす
る遺伝子であることがわかった。すなわち、ORF sll 14
68 は、β- イオノン環の 3位 (3'位) に水酸基を導入
する酵素をコードする遺伝子であることがわかる。

【００３４】この結果は全く思いがけないことであっ
た。なぜなら、β- カロチンハイドロキシラーゼをコー
ドする遺伝子 (crtZ またはbhy) は、植物常在細菌Er
winia、Flavobacterium 属細菌、海洋細菌Agrobacteri
um aurantiacum, Alcaligenessp. strain PC-1 、植物
シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana) からすでに取
得されているが (N. Misawa, et. al., J. Bacteriol.,
177, 6575-6584, 1995、および、Z. Sun, et. al., J.
Biol. Chem., 271, 24349-24352, 1996 、および、L.
Pasamontes, et al., Gene, 185, 35-41, 1997)、これ
らのβ- カロチンハイドロキシラーゼは、種を超えて、
アミノ酸配列レベルでよく保存されていることがわかっ
ていた。たとえば、Erwinia と海洋細菌のCrtZは53-56
％の同一のアミノ酸配列を有しており、これらの細菌と
植物Arabidopsis のβ- カロチンハイドロキシラーゼ
は、31-37 ％の同一のアミノ酸配列を有していた。一
方、ラン藻 PCC6803 のβ- カロチンハイドロキシラー
ゼ遺伝子と同定されたORF sll1468がコードするタンパ
ク質は、上記の種々のβ- カロチンハイドロキシラーゼ
とはアミノ酸レベルで相同性を有していなかった。むし
ろ、PCC6803 のORF sll1468がコードするタンパク質
は、海洋細菌Agrobacterium aurantiacum やAlcal igen
es sp. strain PC-1 のCrtW や緑藻Haematococcus pl
uvialis のBKT といったβ- カロチンケトラーゼ (β-
carotene ketolase) (S. Kajiwara, T. Kakizono, T.
Saito, K. Kondo, T. Ohtani, N. Nishio, S. Nagai,
N. Misawa, Isolation and functional identification
of a novel cDNA for astaxanthin biosynthesis from
Haematococcus pluvialis, and astaxanthin synthesi
s in E scherichia coli. Plant Mol. Biol., 29, 343-
352, 1995) とアミノ酸配列レベルで意義深い相同性を
有していた。そこで、発明者らは、ORF sll 1468は、β
- カロチンの4 位にケト基が導入されたエキネノンを経
てエキネノンの3'位に水酸基が導入されたカロチノイド
であるカンタキサンチンを合成する酵素でβ- カロチン
ケトラーゼをコードする遺伝子であろうと考え、β- カ
ロチンを合成できる大腸菌を宿主として用いて、上記の
実験を行ったのである。その結果、予想に反して思いが
けず、ORF sll 1468は、β- カロチンケトラーゼではな
くβ- カロチンハイドロキシラーゼをコードする遺伝子
であることを発見したのであった。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９３９ 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ganomic ＤＮＡ 起源： 生物名：Synechocystis sp. 株名：ＰＣＣ６８０３ 配列の特徴： 他の特徴：β-carotene hydroxylase 遺伝子またはbhy
（遺伝子名） 配列 GTG TGC CAG GAG TCC GTC ATA GTA ATG CAG GCG ACC CAA CCG CTG CAA 48 Met Cys Gln Glu Ser Val Ile Val Met Gln Ala Thr Gln Pro Leu Gln 1 5 10 15 ACC GTT TCC CAA GCT GTC CCA AAA GAG TTT TTA CAG GCG GAC GGC GGC 96 Thr Val Ser Gln Ala Val Pro Lys Glu Phe Leu Gln Ala Asp Gly Gly 20 25 30 TTC AAT CCC AAC GTG GCC ATG TTC GGG ATA GCT ATT CTC TTA ATG CTC 144 Phe Asn Pro Asn Val Ala Met Phe Gly Ile Ala Ile Leu Leu Met Leu 35 40 45 GCT AAC GTT TTT GGC TAC TGG CAA TGG GGG CTG CCC CAC TGG CTT TGT 192 Ala Asn Val Phe Gly Tyr Trp Gln Trp Gly Leu Pro His Trp Leu Cys 50 55 60 TTT AGT TGT TCG GTG CTG GCG CTG CAC CTG TCA GGC ACA GTG ATC CAT 240 Phe Ser Cys Ser Val Leu Ala Leu His Leu Ser Gly Thr Val Ile His 65 70 75 80 GAT GCA TCC CAC AAT GCG GCC CAT CGG AAC ACC ATT ATT AAT GCA GTG 288 Asp Ala Ser His Asn Ala Ala His Arg Asn Thr Ile Ile Asn Ala Val 85 90 95 CTT GGC CAC GGT AGT GCC TTA ATG TTG GGC TTT GCT TTT CCC GTC TTT 336 Leu Gly His Gly Ser Ala Leu Met Leu Gly Phe Ala Phe Pro Val Phe 100 105 110 ACC CGG GTT CAT CTC CAA CAC CAC GCC AAC GTC AAT GAC CCT GAA AAT 384 Thr Arg Val His Leu Gln His His Ala Asn Val Asn Asp Pro Glu Asn 115 120 125 GAC CCA GAC CAT TTT GTT TCC ACC GGC GGT CCC CTC TTC CTC ATT GCC 432 Asp Pro Asp His Phe Val Ser Thr Gly Gly Pro Leu Phe Leu Ile Ala 130 135 140 GCC CGG TTC TTC TAC CAT GAG ATC TTT TTC TTT AAA CGG CGG TTA TGG 480 Ala Arg Phe Phe Tyr His Glu Ile Phe Phe Phe Lys Arg Arg Leu Trp 145 150 155 160 CGC AAA TAT GAG CTA CTA GAG TGG TTC TTA AGT CGG CTT GTG TTG TTC 528 Arg Lys Tyr Glu Leu Leu Glu Trp Phe Leu Ser Arg Leu Val Leu Phe 165 170 175 ACG ATC GTT TTT CTC GGC ATT CAT TAC GGC TTT ATC GGC TTT GTG ATG 576 Thr Ile Val Phe Leu Gly Ile His Tyr Gly Phe Ile Gly Phe Val Met 180 185 190 AAT TAC TGG TTT GTG CCT GCT TTA ATT GTT GGC ATT GCC CTG GGA CTG 624 Asn Tyr Trp Phe Val Pro Ala Leu Ile Val Gly Ile Ala Leu Gly Leu 195 200 205 TTT TTT GAT TAC CTG CCC CAT CGA CCT TTC CAA GAA CGC AAC CGT TGG 672 Phe Phe Asp Tyr Leu Pro His Arg Pro Phe Gln Glu Arg Asn Arg Trp 210 215 220 AAA AAT GCC AGG GTT TAT CCC AGC CCC ATT TTA AAT TGG CTC ATT TTC 720 Lys Asn Ala Arg Val Tyr Pro Ser Pro Ile Leu Asn Trp Leu Ile Phe 225 230 235 240 GGG CAA AAT TAC CAC CTG ATC CAC CAC CTT TGG CCT TCT ATT CCT TGG 768 Gly Gln Asn Tyr His Leu Ile His His Leu Trp Pro Ser Ile Pro Trp 245 250 255 TAT CAG TAC CAA AAC ACC TAT CAC ATC ACC AAG CCC ATT TTG GAT GAG 816 Tyr Gln Tyr Gln Asn Thr Tyr His Ile Thr Lys Pro Ile Leu Asp Glu 260 265 270 AAG GGT TGT GAT CAA TCC CTG GGA TTA CTG GAA GGG AAA AAT TTC TGG 864 Lys Gly Cys Asp Gln Ser Leu Gly Leu Leu Glu Gly Lys Asn Phe Trp 275 280 285 AGC TTC CTC TAT GAT GTT TTC CTT GGT ATT CGT TTT CAC GGC CAT AAT 912 Ser Phe Leu Tyr Asp Val Phe Leu Gly Ile Arg Phe His Gly His Asn 290 295 300 AAT TCT CAA TCA TCT GAC AAG CCC TAG 939 Asn Ser Gln Ser Ser Asp Lys Pro*** 305

【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：１１６１ 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：Agrobacterium aurantiacum 配列の特徴： 他の情報：crtY（遺伝子名） 配列 GTG ACC CAT GAC GTG CTG CTG GCA GGG GCG GGC CTT GCC AAC GGG CTG 48 Met Thr His Asp Val Leu Leu Ala Gly Ala Gly Leu Ala Asn Gly Leu 1 5 10 15 ATC GCC CTG GCG CTG CGC GCG GCG CGG CCC GAC CTG CGC GTG CTG CTG 96 Ile Ala Leu Ala Leu Arg Ala Ala Arg Pro Asp Leu Arg Val Leu Leu 20 25 30 CTG GAC CAT GCC GCA GGA CCG TCA GAC GGC CAC ACC TGG TCC TGC CAC 144 Leu Asp His Ala Ala Gly Pro Ser Asp Gly His Thr Trp Ser Cys His 35 40 45 GAC CCC GAC CTG TCG CCG GAC TGG CTG GCG CGG CTG AAG CCC CTG CGC 192 Asp Pro Asp Leu Ser Pro Asp Trp Leu Ala Arg Leu Lys Pro Leu Arg 50 55 60 CGC GCC AAC TGG CCC GAC CAG GAG GTG CGC TTT CCC CGC CAT GCC CGG 240 Arg Ala Asn Trp Pro Asp Gln Glu Val Arg Phe Pro Arg His Ala Arg 65 70 75 80 CGG CTG GCC ACC GGT TAC GGG TCG CTG GAC GGG GCG GCG CTG GCG GAT 288 Arg Leu Ala Thr Gly Tyr Gly Ser Leu Asp Gly Ala Ala Leu Ala Asp 85 90 95 GCG GTG GTC CGG TCG GGC GCC GAG ATC CGC TGG GAC AGC GAC ATC GCC 336 Ala Val Val Arg Ser Gly Ala Glu Ile Arg Trp Asp Ser Asp Ile Ala 100 105 110 CTG CTG GAT GCG CAG GGG GCG ACG CTG TCC TGC GGC ACC CGG ATC GAG 384 Leu Leu Asp Ala Gln Gly Ala Thr Leu Ser Cys Gly Thr Arg Ile Glu 115 120 125 GCG GGC GCG GTC CTG GAC GGG CGG GGC GCG CAG CCG TCG CGG CAT CTG 432 Ala Gly Ala Val Leu Asp Gly Arg Gly Ala Gln Pro Ser Arg His Leu 130 135 140 ACC GTG GGT TTC CAG AAA TTC GTG GGT GTC GAG ATC GAG ACC GAC CGC 480 Thr Val Gly Phe Gln Lys Phe Val Gly Val Glu Ile Glu Thr Asp Arg 145 150 155 160 CCC CAC GGC GTG CCC CGC CCG ATG ATC ATG GAC GCG ACC GTC ACC CAG 528 Pro His Gly Val Pro Arg Pro Met Ile Met Asp Ala Thr Val Thr Gln 165 170 175 CAG GAC GGG TAC CGC TTC ATC TAT CTG CTG CCC TTC TCT CCG ACG CGC 576 Gln Asp Gly Tyr Arg Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Phe Ser Pro Thr Arg 180 185 190 ATC CTG ATC GAG GAC ACG CGC TAT TCC GAT GGC GGC GAT CTG GAC GAC 624 Ile Leu Ile Glu Asp Thr Arg Tyr Ser Asp Gly Gly Asp Leu Asp Asp 195 200 205 GAC GCG CTG GCG GCG GCG TCC CAC GAC TAT GCC CGC CAG CAG GGC TGG 672 Asp Ala Leu Ala Ala Ala Ser His Asp Tyr Ala Arg Gln Gln Gly Trp 210 215 220 ACC GGG GCC GAG GTC CGG CGC GAA CGC GGC ATC CTT CCC ATC GCG CTG 720 Thr Gly Ala Glu Val Arg Arg Glu Arg Gly Ile Leu Pro Ile Ala Leu 225 230 235 240 GCC CAT GAT GCG GCG GGC TTC TGG GCC GAT CAC GCG GCG GGG CCT GTT 768 Ala His Asp Ala Ala Gly Phe Trp Ala Asp His Ala Ala Gly Pro Val 245 250 255 CCC GTG GGA CTG CGC GCG GGG TTC TTT CAT CCG GTC ACC GGC TAT TCG 816 Pro Val Gly Leu Arg Ala Gly Phe Phe His Pro Val Thr Gly Tyr Ser 260 265 270 CTG CCC TAT GCG GCA CAG GTG GCG GAC GTG GTG GCG GGT CTG TCC GGG 864 Leu Pro Tyr Ala Ala Gln Val Ala Asp Val Val Ala Gly Leu Ser Gly 275 280 285 CCG CCC GGC ACC GAC GCG CTG CGC GGC GCC ATC CGC GAT TAC GCG ATC 912 Pro Pro Gly Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ala Ile Arg Asp Tyr Ala Ile 290 295 300 GAC CGG GCG CGC CGC GAC CGC TTT CTG CGC CTT TTG AAC CGG ATG CTG 960 Asp Arg Ala Arg Arg Asp Arg Phe Leu Arg Leu Leu Asn Arg Met Leu 305 310 315 320 TTC CGC GGC TGC GCG CCC GAC CGG CGC TAT ACC CTG CTG CAG CGG TTC 1008 Phe Arg Gly Cys Ala Pro Asp Arg Arg Tyr Thr Leu Leu Gln Arg Phe 325 330 335 TAC CGC ATG CCG CAT GGA CTG ATC GAA CGG TTC TAT GCC GGC CGG CTG 1056 Tyr Arg Met Pro His Gly Leu Ile Glu Arg Phe Tyr Ala Gly Arg Leu 340 345 350 AGC GTG GCG GAT CAG CTG CGC ATC GTG ACC GGC AAG CCT CCC ATT CCC 1104 Ser Val Ala Asp Gln Leu Arg Ile Val Thr Gly Lys Pro Pro Ile Pro 355 360 365 CTT GGC ACG GCC ATC CGC TGC CTG CCC GAA CGT CCC CTG CTG AAG GAA 1152 Leu Gly Thr Ala Ile Arg Cys Leu Pro Glu Arg Pro Leu Leu Lys Glu 370 375 380 AAC GCA TGA 1161 Asn Ala *** 385

【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：８９１ 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：Erwinia uredovora 配列の特徴： 他の情報：crtB（遺伝子名） 配列 ATG GCA GTT GGC TCG AAA AGT TTT GCG ACA GCC TCA AAG TTA TTT GAT 48 Met Ala Val Gly Ser Lys Ser Phe Ala Thr Ala Ser Lys Leu Phe Asp 1 5 10 15 GCA AAA ACC CGG CGC AGC GTA CTG ATG CTC TAC GCC TGG TGC CGC CAT 96 Ala Lys Thr Arg Arg Ser Val Leu Met Leu Tyr Ala Trp Cys Arg His 20 25 30 TGT GAC GAT GTT ATT GAC GAT CAG ACG CTG GGC TTT CAG GCC CGG CAG 144 Cys Asp Asp Val Ile Asp Asp Gln Thr Leu Gly Phe Gln Ala Arg Gln 35 40 45 CCT GCC TTA CAA ACG CCC GAA CAA CGT CTG ATG CAA CTT GAG ATG AAA 192 Pro Ala Leu Gln Thr Pro Glu Gln Arg Leu Met Gln Leu Glu Met Lys 50 55 60 ACG CGC CAG GCC TAT GCA GGA TCG CAG ATG CAC GAA CCG GCG TTT GCG 240 Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Gly Ser Gln Met His Glu Pro Ala Phe Ala 65 70 75 80 GCT TTT CAG GAA GTG GCT ATG GCT CAT GAT ATC GCC CCG GCT TAC GCG 288 Ala Phe Gln Glu Val Ala Met Ala His Asp Ile Ala Pro Ala Tyr Ala 85 90 95 TTT GAT CAT CTG GAA GGC TTC GCC ATG GAT GTA CGC GAA GCG CAA TAC 336 Phe Asp His Leu Glu Gly Phe Ala Met Asp Val Arg Glu Ala Gln Tyr 100 105 110 AGC CAA CTG GAT GAT ACG CTG CGC TAT TGC TAT CAC GTT GCA GGC GTT 384 Ser Gln Leu Asp Asp Thr Leu Arg Tyr Cys Tyr His Val Ala Gly Val 115 120 125 GTC GGC TTG ATG ATG GCG CAA ATC ATG GGC GTG CGG GAT AAC GCC ACG 432 Val Gly Leu Met Met Ala Gln Ile Met Gly Val Arg Asp Asn Ala Thr 130 135 140 CTG GAC CGC GCC TGT GAC CTT GGG CTG GCA TTT CAG TTG ACC AAT ATT 480 Leu Asp Arg Ala Cys Asp Leu Gly Leu Ala Phe Gln Leu Thr Asn Ile 145 150 155 160 GCT CGC GAT ATT GTG GAC GAT GCG CAT GCG GGC CGC TGT TAT CTG CCG 528 Ala Arg Asp Ile Val Asp Asp Ala His Ala Gly Arg Cys Tyr Leu Pro 165 170 175 GCA AGC TGG CTG GAG CAT GAA GGT CTG AAC AAA GAG AAT TAT GCG GCA 576 Ala Ser Trp Leu Glu His Glu Gly Leu Asn Lys Glu Asn Tyr Ala Ala 180 185 190 CCT GAA AAC CGT CAG GCG CTG AGC CGT ATC GCC CGT CGT TTG GTG CAG 624 Pro Glu Asn Arg Gln Ala Leu Ser Arg Ile Ala Arg Arg Leu Val Gln 195 200 205 GAA GCA GAA CCT TAC TAT TTG TCT GCC ACA GCC GGC CTG GCA GGG TTG 672 Glu Ala Glu Pro Tyr Tyr Leu Ser Ala Thr Ala Gly Leu Ala Gly Leu 210 215 220 CCC CTG CGT TCC GCC TGG GCA ATC GCT ACG GCG AAG CAG GTT TAC CGG 720 Pro Leu Arg Ser Ala Trp Ala Ile Ala Thr Ala Lys Gln Val Tyr Arg 225 230 235 240 AAA ATA GGT GTC AAA GTT GAA CAG GCC GGT CAG CAA GCC TGG GAT CAG 768 Lys Ile Gly Val Lys Val Glu Gln Ala Gly Gln Gln Ala Trp Asp Gln 245 250 255 CGG CAG TCA ACG ACC ACG CCC GAA AAA TTA ACG CTG CTG CTG GCC GCC 816 Arg Gln Ser Thr Thr Thr Pro Glu Lys Leu Thr Leu Leu Leu Ala Ala 260 265 270 TCT GGT CAG GCC CTT ACT TCC CGG ATG CGG GCT CAT CCT CCC CGC CCT 864 Ser Gly Gln Ala Leu Thr Ser Arg Met Arg Ala His Pro Pro Arg Pro 275 280 285 GCG CAT CTC TGG CAG CGC CCG CTC TAG 891 Ala His Leu Trp Gln Arg Pro Leu * 290 295

【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：９０９ 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：Erwinia uredovora 配列の特徴： 他の情報：crtE（遺伝子名） 配列 ATG ACG GTC TGC GCA AAA AAA CAC GTT CAT CTC ACT CGC GAT GCT GCG 48 Met Thr Val Cys Ala Lys Lys His Val His Leu Thr Arg Asp Ala Ala 1 5 10 15 GAG CAG TTA CTG GCT GAT ATT GAT CGA CGC CTT GAT CAG TTA TTG CCC 96 Glu Gln Leu Leu Ala Asp Ile Asp Arg Arg Leu Asp Gln Leu Leu Pro 20 25 30 GTG GAG GGA GAA CGG GAT GTT GTG GGT GCC GCG ATG CGT GAA GGT GCG 144 Val Glu Gly Glu Arg Asp Val Val Gly Ala Ala Met Arg Glu Gly Ala 35 40 45 CTG GCA CCG GGA AAA CGT ATT CGC CCC ATG TTG CTG TTG CTG ACC GCC 192 Leu Ala Pro Gly Lys Arg Ile Arg Pro Met Leu Leu Leu Leu Thr Ala 50 55 60 CGC GAT CTG GGT TGC GCT GTC AGC CAT GAC GGA TTA CTG GAT TTG GCC 240 Arg Asp Leu Gly Cys Ala Val Ser His Asp Gly Leu Leu Asp Leu Ala 65 70 75 80 TGT GCG GTG GAA ATG GTC CAC GCG GCT TCG CTG ATC CTT GAC GAT ATG 288 Cys Ala Val Glu Met Val His Ala Ala Ser Leu Ile Leu Asp Asp Met 85 90 95 CCC TGC ATG GAC GAT GCG AAG CTG CGG CGC GGA CGC CCT ACC ATT CAT 336 Pro Cys Met Asp Asp Ala Lys Leu Arg Arg Gly Arg Pro Thr Ile His 100 105 110 TCT CAT TAC GGA GAG CAT GTG GCA ATA CTG GCG GCG GTT GCC TTG CTG 384 Ser His Tyr Gly Glu His Val Ala Ile Leu Ala Ala Val Ala Leu Leu 115 120 125 AGT AAA GCC TTT GGC GTA ATT GCC GAT GCA GAT GGC CTC ACG CCG CTG 432 Ser Lys Ala Phe Gly Val Ile Ala Asp Ala Asp Gly Leu Thr Pro Leu 130 135 140 GCA AAA AAT CGG GCG GTT TCT GAA CTG TCA AAC GCC ATC GGC ATG CAA 480 Ala Lys Asn Arg Ala Val Ser Glu Leu Ser Asn Ala Ile Gly Met Gln 145 150 155 160 GGA TTG GTT CAG GGT CAG TTC AAG GAT CTG TCT GAA GGG GAT AAG CCG 528 Gly Leu Val Gln Gly Gln Phe Lys Asp Leu Ser Glu Gly Asp Lys Pro 165 170 175 CGC AGC GCT GAA GCT ATT TTG ATG ACG AAT CAC TTT AAA ACC AGC ACG 576 Arg Ser Ala Glu Ala Ile Leu Met Thr Asn His Phe Lys Thr Ser Thr 180 185 190 CTG TTT TGT GCC TCC ATG CAG ATG GCC TCG ATT GTT GCG AAT GCC TCC 624 Leu Phe Cys Ala Ser Met Gln Met Ala Ser Ile Val Ala Asn Ala Ser 195 200 205 AGC GAA GCG CGT GAT TGC CTG CAT CGT TTT TCA CTT GAT CTT GGT CAG 672 Ser Glu Ala Arg Asp Cys Leu His Arg Phe Ser Leu Asp Leu Gly Gln 210 215 220 GCA TTT CAA CTG CTG GAC GAT TTG ACC GAT GGC ATG ACC GAC ACC GGT 720 Ala Phe Gln Leu Leu Asp Asp Leu Thr Asp Gly Met Thr Asp Thr Gly 225 230 235 240 AAG GAT AGC AAT CAG GAC GCC GGT AAA TCG ACG CTG GTC AAT CTG TTA 768 Lys Asp Ser Asn Gln Asp Ala Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Leu Leu 245 250 255 GGC CCG AGG GCG GTT GAA GAA CGT CTG AGA CAA CAT CTT CAG CTT GCC 816 Gly Pro Arg Ala Val Glu Glu Arg Leu Arg Gln His Leu Gln Leu Ala 260 265 270 AGT GAG CAT CTC TCT GCG GCC TGC CAA CAC GGG CAC GCC ACT CAA CAT 864 Ser Glu His Leu Ser Ala Ala Cys Gln His Gly His Ala Thr Gln His 275 280 285 TTT ATT CAG GCC TGG TTT GAC AAA AAA CTC GCT GCC GTC AGT TAA 909 Phe Ile Gln Ala Trp Phe Asp Lys Lys Leu Ala Ala Val Ser * 290 295 300

【００３９】配列番号：５ 配列の長さ：１４７９ 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：Erwinia uredovora 配列の特徴： 他の情報：crtI（遺伝子名） 配列 ATG AAA CCA ACT ACG GTA ATT GGT GCA GGC TTC GGT GGC CTG GCA CTG 48 Met Lys Pro Thr Thr Val Ile Gly Ala Gly Phe Gly Gly Leu Ala Leu 1 5 10 15 GCA ATT CGT CTA CAA GCT GCG GGG ATC CCC GTC TTA CTG CTT GAA CAA 96 Ala Ile Arg Leu Gln Ala Ala Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Glu Gln 20 25 30 CGT GAT AAA CCC GGC GGT CGG GCT TAT GTC TAC GAG GAT CAG GGG TTT 144 Arg Asp Lys Pro Gly Gly Arg Ala Tyr Val Tyr Glu Asp Gln Gly Phe 35 40 45 ACC TTT GAT GCA GGC CCG ACG GTT ATC ACC GAT CCC AGT GCC ATT GAA 192 Thr Phe Asp Ala Gly Pro Thr Val Ile Thr Asp Pro Ser Ala Ile Glu 50 55 60 GAA CTG TTT GCA CTG GCA GGA AAA CAG TTA AAA GAG TAT GTC GAA CTG 240 Glu Leu Phe Ala Leu Ala Gly Lys Gln Leu Lys Glu Tyr Val Glu Leu 65 70 75 80 CTG CCG GTT ACG CCG TTT TAC CGC CTG TGT TGG GAG TCA GGG AAG GTC 288 Leu Pro Val Thr Pro Phe Tyr Arg Leu Cys Trp Glu Ser Gly Lys Val 85 90 95 TTT AAT TAC GAT AAC GAT CAA ACC CGG CTC GAA GCG CAG ATT CAG CAG 336 Phe Asn Tyr Asp Asn Asp Gln Thr Arg Leu Glu Ala Gln Ile Gln Gln 100 105 110 TTT AAT CCC CGC GAT GTC GAA GGT TAT CGT CAG TTT CTG GAC TAT TCA 384 Phe Asn Pro Arg Asp Val Glu Gly Tyr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Ser 115 120 125 CGC GCG GTG TTT AAA GAA GGC TAT CTA AAG CTC GGT ACT GTC CCT TTT 432 Arg Ala Val Phe Lys Glu Gly Tyr Leu Lys Leu Gly Thr Val Pro Phe 130 135 140 TTA TCG TTC AGA GAC ATG CTT CGC GCC GCA CCT CAA CTG GCG AAA CTG 480 Leu Ser Phe Arg Asp Met Leu Arg Ala Ala Pro Gln Leu Ala Lys Leu 145 150 155 160 CAG GCA TGG AGA AGC GTT TAC AGT AAG GTT GCC AGT TAC ATC GAA GAT 528 Gln Ala Trp Arg Ser Val Tyr Ser Lys Val Ala Ser Tyr Ile Glu Asp 165 170 175 GAA CAT CTG CGC CAG GCG TTT TCT TTC CAC TCG CTG TTG GTG GGC GGC 576 Glu His Leu Arg Gln Ala Phe Ser Phe His Ser Leu Leu Val Gly Gly 180 185 190 AAT CCC TTC GCC ACC TCA TCC ATT TAT ACG TTG ATA CAC GCG CTG GAG 624 Asn Pro Phe Ala Thr Ser Ser Ile Tyr Thr Leu Ile His Ala Leu Glu 195 200 205 CGT GAG TGG GGC GTC TGG TTT CCG CGT GGC GGC ACC GGC GCA TTA GTT 672 Arg Glu Trp Gly Val Trp Phe Pro Arg Gly Gly Thr Gly Ala Leu Val 210 215 220 CAG GGG ATG ATA AAG CTG TTT CAG GAT CTG GGT GGC GAA GTC GTG TTA 720 Gln Gly Met Ile Lys Leu Phe Gln Asp Leu Gly Gly Glu Val Val Leu 225 230 235 240 AAC GCC AGA GTC AGC CAT ATG GAA ACG ACA GGA AAC AAG ATT GAA GCC 768 Asn Ala Arg Val Ser His Met Glu Thr Thr Gly Asn Lys Ile Glu Ala 245 250 255 GTG CAT TTA GAG GAC GGT CGC AGG TTC CTG ACG CAA GCC GTC GCG TCA 816 Val His Leu Glu Asp Gly Arg Arg Phe Leu Thr Gln Ala Val Ala Ser 260 265 270 AAT GCA GAT GTG GTT CAT ACC TAT CGC GAC CTG TTA AGC CAG CAC CCT 864 Asn Ala Asp Val Val His Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Ser Gln His Pro 275 280 285 GCC GCG GTT AAG CAG TCC AAC AAA CTG CAG ACT AAG CGC ATG AGT AAC 912 Ala Ala Val Lys Gln Ser Asn Lys Leu Gln Thr Lys Arg Met Ser Asn 290 295 300 TCT CTG TTT GTG CTC TAT TTT GGT TTG AAT CAC CAT CAT GAT CAG CTC 960 Ser Leu Phe Val Leu Tyr Phe Gly Leu Asn His His His Asp Gln Leu 305 310 315 320 GCG CAT CAC ACG GTT TGT TTC GGC CCG CGT TAC CGC GAG CTG ATT GAC 1008 Ala His His Thr Val Cys Phe Gly Pro Arg Tyr Arg Glu Leu Ile Asp 325 330 335 GAA ATT TTT AAT CAT GAT GGC CTC GCA GAG GAC TTC TCA CTT TAT CTG 1056 Glu Ile Phe Asn His Asp Gly Leu Ala Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Leu 340 345 350 CAC GCG CCC TGT GTC ACG GAT TCG TCA CTG GCG CCT GAA GGT TGC GGC 1104 His Ala Pro Cys Val Thr Asp Ser Ser Leu Ala Pro Glu Gly Cys Gly 355 360 365 AGT TAC TAT GTG TTG GCG CCG GTG CCG CAT TTA GGC ACC GCG AAC CTC 1152 Ser Tyr Tyr Val Leu Ala Pro Val Pro His Leu Gly Thr Ala Asn Leu 370 375 380 GAC TGG ACG GTT GAG GGG CCA AAA CTA CGC GAC CGT ATT TTT GCG TAC 1200 Asp Trp Thr Val Glu Gly Pro Lys Leu Arg Asp Arg Ile Phe Ala Tyr 385 390 395 400 CTT GAG CAG CAT TAC ATG CCT GGC TTA CGG AGT CAG CTG GTC ACG CAC 1248 Leu Glu Gln His Tyr Met Pro Gly Leu Arg Ser Gln Leu Val Thr His 405 410 415 CGG ATG TTT ACG CCG TTT GAT TTT CGC GAC CAG CTT AAT GCC TAT CAT 1296 Arg Met Phe Thr Pro Phe Asp Phe Arg Asp Gln Leu Asn Ala Tyr His 420 425 430 GGC TCA GCC TTT TCT GTG GAG CCC GTT CTT ACC CAG AGC GCC TGG TTT 1344 Gly Ser Ala Phe Ser Val Glu Pro Val Leu Thr Gln Ser Ala Trp Phe 435 440 445 CGG CCG CAT AAC CGC GAT AAA ACC ATT ACT AAT CTC TAC CTG GTC GGC 1392 Arg Pro His Asn Arg Asp Lys Thr Ile Thr Asn Leu Tyr Leu Val Gly 450 455 460 GCA GGC ACG CAT CCC GGC GCA GGC ATT CCT GGC GTC ATC GGC TCG GCA 1440 Ala Gly Thr His Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Val Ile Gly Ser Ala 465 470 475 480 AAA GCG ACA GCA GGT TTG ATG CTG GAG GAT CTG ATT TGA 1479 Lys Ala Thr Ala Gly Leu Met Leu Glu Asp Leu Ile * 485 490

【００４０】配列番号：６ 配列の長さ：１１４９ 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：Erwinia uredovora 配列の特徴： 他の情報：crtY（遺伝子名） 配列 ATG CAA CCG CAT TAT GAT CTG ATT CTC GTG GGG GCT GGA CTC GCG AAT 48 Met Gln Pro His Tyr Asp Leu Ile Leu Val Gly Ala Gly Leu Ala Asn 1 5 10 15 GGC CTT ATC GCC CTG CGT CTT CAG CAG CAG CAA CCT GAT ATG CGT ATT 96 Gly Leu Ile Ala Leu Arg Leu Gln Gln Gln Gln Pro Asp Met Arg Ile 20 25 30 TTG CTT ATC GAC GCC GCA CCC CAG GCG GGC GGG AAT CAT ACG TGG TCA 144 Leu Leu Ile Asp Ala Ala Pro Gln Ala Gly Gly Asn His Thr Trp Ser 35 40 45 TTT CAC CAC GAT GAT TTG ACT GAG AGC CAA CAT CGT TGG ATA GCT CCG 192 Phe His His Asp Asp Leu Thr Glu Ser Gln His Arg Trp Ile Ala Pro 50 55 60 CTG GTG GTT CAT CAC TGG CCC GAC TAT CAG GTA CGC TTT CCC ACA CGC 240 Leu Val Val His His Trp Pro Asp Tyr Gln Val Arg Phe Pro Thr Arg 65 70 75 80 CGT CGT AAG CTG AAC AGC GGC TAC TTT TGT ATT ACT TCT CAG CGT TTC 288 Arg Arg Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Phe Cys Ile Thr Ser Gln Arg Phe 85 90 95 GCT GAG GTT TTA CAG CGA CAG TTT GGC CCG CAC TTG TGG ATG GAT ACC 336 Ala Glu Val Leu Gln Arg Gln Phe Gly Pro His Leu Trp Met Asp Thr 100 105 110 GCG GTC GCA GAG GTT AAT GCG GAA TCT GTT CGG TTG AAA AAG GGT CAG 384 Ala Val Ala Glu Val Asn Ala Glu Ser Val Arg Leu Lys Lys Gly Gln 115 120 125 GTT ATC GGT GCC CGC GCG GTG ATT GAC GGG CGG GGT TAT GCG GCA AAT 432 Val Ile Gly Ala Arg Ala Val Ile Asp Gly Arg Gly Tyr Ala Ala Asn 130 135 140 TCA GCA CTG AGC GTG GGC TTC CAG GCG TTT ATT GGC CAG GAA TGG CGA 480 Ser Ala Leu Ser Val Gly Phe Gln Ala Phe Ile Gly Gln Glu Trp Arg 145 150 155 160 TTG AGC CAC CCG CAT GGT TTA TCG TCT CCC ATT ATC ATG GAT GCC ACG 528 Leu Ser His Pro His Gly Leu Ser Ser Pro Ile Ile Met Asp Ala Thr 165 170 175 GTC GAT CAG CAA AAT GGT TAT CGC TTC GTG TAC AGC CTG CCG CTC TCG 576 Val Asp Gln Gln Asn Gly Tyr Arg Phe Val Tyr Ser Leu Pro Leu Ser 180 185 190 CCG ACC AGA TTG TTA ATT GAA GAC ACG CAC TAT ATT GAT AAT GCG ACA 624 Pro Thr Arg Leu Leu Ile Glu Asp Thr His Tyr Ile Asp Asn Ala Thr 195 200 205 TTA GAT CCT GAA TGC GCG CGG CAA AAT ATT TGC GAC TAT GCC GCG CAA 672 Leu Asp Pro Glu Cys Ala Arg Gln Asn Ile Cys Asp Tyr Ala Ala Gln 210 215 220 CAG GGT TGG CAG CTT CAG ACA CTG CTG CGA GAA GAA CAG GGC GCC TTA 720 Gln Gly Trp Gln Leu Gln Thr Leu Leu Arg Glu Glu Gln Gly Ala Leu 225 230 235 240 CCC ATT ACT CTG TCG GGC AAT GCC GAC GCA TTC TGG CAG CAG CGC CCC 768 Pro Ile Thr Leu Ser Gly Asn Ala Asp Ala Phe Trp Gln Gln Arg Pro 245 250 255 CTG GCC TGT AGT GGA TTA CGT GCC GGT CTG TTC CAT CCT ACC ACC GGC 816 Leu Ala Cys Ser Gly Leu Arg Ala Gly Leu Phe His Pro Thr Thr Gly 260 265 270 TAT TCA CTG CCG CTG GCG GTT GCC GTG GCC GAC CGC CTG AGT GCA CTT 864 Tyr Ser Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Asp Arg Leu Ser Ala Leu 275 280 285 GAT GTC TTT ACG TCG GCC TCA ATT CAC CAT GCC ATT ACG CAT TTT GCC 912 Asp Val Phe Thr Ser Ala Ser Ile His His Ala Ile Thr His Phe Ala 290 295 300 CGC GAG CGC TGG CAG CAG CAG GGC TTT TTC CGC ATG CTG AAT CGC ATG 960 Arg Glu Arg Trp Gln Gln Gln Gly Phe Phe Arg Met Leu Asn Arg Met 305 310 315 320 CTG TTT TTA GCC GGA CCC GCC GAT TCA CGC TGG CGG GTT ATG CAG CGT 1008 Leu Phe Leu Ala Gly Pro Ala Asp Ser Arg Trp Arg Val Met Gln Arg 325 330 335 TTT TAT GGT TTA CCT GAA GAT TTA ATT GCC CGT TTT TAT GCG GGA AAA 1056 Phe Tyr Gly Leu Pro Glu Asp Leu Ile Ala Arg Phe Tyr Ala Gly Lys 340 345 350 CTC ACG CTG ACC GAT CGG CTA CGT ATT CTG AGC GGC AAG CCG CCT GTT 1104 Leu Thr Leu Thr Asp Arg Leu Arg Ile Leu Ser Gly Lys Pro Pro Val 355 360 365 CCG GTA TTA GCA GCA TTG CAA GCC ATT ATG ACG ACT CAT CGT TAA 1149 Pro Val Leu Ala Ala Leu Gln Ala Ile Met Thr Thr His Arg * 370 375 380

【００４１】

【発明の効果】本発明による遺伝子は、種々の生物由来
のβ‐カロチンハイドロキシラーゼと同様の活性を持ち
ながら、これらのβ‐カロチンハイドロキシラーゼとア
ミノ酸配列レベルで相同性を有さない酵素をコードする
ものであり、むしろβ‐カロチンケトラーゼとアミノ酸
レベルで意義深い相同性を有していたことからすれば全
く思いがけない配列と機能の関係を有するといえる。本
発明により、β- カロチンを多く蓄積している微生物や
植物に、本発明によるβ- カロチンハイドロキシラーゼ
遺伝子を導入して、あるいはβ‐カロチンを産生しない
微生物や植物に本発明遺伝子をβ‐カロチン生合成に関
与する遺伝子と共に導入して、ゼアキサンチンやβ- ク
リプトキサンチンなどのキサントフィルに変換すること
ができる。また、もともと従来型のβ- カロチンハイド
ロキシラーゼ遺伝子を有している微生物や植物に、本発
明によるβ- カロチンハイドロキシラーゼ遺伝子を導入
しても、相同組み換えやco-suppression 等の問題を気
にすることなく、これらの微生物や植物においてβ- カ
ロチンハイドロキシラーゼ活性を付与または増大させる
ことができ、その結果として、ゼアキサンチンやβ- ク
リプトキサンチン等のキサントフィルおよびこれらのキ
サントフィルの代謝物の生産量を増やすことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１で示されるアミノ酸配列、また
   は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が
   置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有
   し、かつβ‐イオノン環の３位（および／または３′
   位）に水酸基を導入する酵素活性を有するポリペプチド
   をコードする遺伝子。
2. 【請求項２】配列番号１で示されるアミノ酸配列、また
   は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が
   置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有
   するポリペプチドをコードする遺伝子を宿主に導入して
   これを発現させ、宿主中のβ- イオノン環を有する化合
   物における該環の３位(および／または３′位)に水酸基
   を導入することを特徴とする、キサントフィルの発現も
   しくは製造方法。
3. 【請求項３】配列番号１で示されるアミノ酸配列、また
   は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が
   置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有
   するポリペプチドをコードする遺伝子を宿主に導入して
   これを発現させ、宿主中のβ- カロチンをβ- クリプト
   キサンチンまたはこれを経てゼアキサンチンに変換する
   ことを特徴とする、請求項２記載のキサントフィルの発
   現もしくは製造方法。
4. 【請求項４】宿主がβ‐カロチンを産生している植物ま
   たは微生物である、請求項２または３記載の方法。
5. 【請求項５】植物または微生物がトマト、ニンジン、ト
   ウモロコシ、カンキツ類、タバコ、またはＰｈａｆｆｉ
   ａ属酵母である、請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】宿主がβ‐カロチンを産生しない微生物で
   あり、β‐カロチンの産生に関与する遺伝子を該宿主に
   更に導入する請求項２または３記載の方法。
7. 【請求項７】β‐カロチンを産生しない微生物が大腸
   菌、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
   ｃｅｓ属酵母、またはＣａｎｄｉｄａ属酵母である、請
   求項６記載の方法。